KR20120130119A - 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 이용한 약물 전달 시스템 - Google Patents

히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 이용한 약물 전달 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 포함하는 약물 전달용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 약물 전달용 조성물 및 상기 약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀 제조 방법에 따르면, 수성 용매와 유기 용매의 혼합 용매 상에서 충진 반응을 진행할 수 있어, 불수용성인 다양한 활성 성분에 적용 가능하고, 생체적합성, 생분해성 유도체에 충진되어, 인체에 적용하기에 안전한 약물이 충진된 마이셀을 얻을 수 있다. 또한, 상기 마이셀은 그 자체에 포함된 펩타이드로 인한 치료효과도 가지므로, 마이셀 내부에 충진되는 약물과 함께 복합적인 효과의 발휘가 가능한 효과가 있다. 따라서 상기 약물 전달용 조성물 및 이의 제조방법은 약효 시간이 증대된 불수용성 의약품 서방성 제형의 제조에 관한 산업 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 이용한 약물 전달 시스템{DRUG DELIVERY SYSTEM USING HYALURONIC ACID-PEPTIDE CONJUGATE MICELLE}
본 발명은 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 포함하는 약물 전달용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 다양한 불수용성 의약품의 약물 전달 시스템에 적용 가능하고, 생체적합성, 생분해성 마이셀 전달체에 충진 하여 인체에 안전하게 적용할 수 있으며, 약효 시간을 증대할 수 있고, 또한 마이셀 전달체 자체의 치료효과와 복합적으로 작용할 수 있는 약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀에 관한 것이다.
친양쪽성의 고분자는 친수성과 소수성 부위의 수용성에 큰 차이가 나서 수용액 상에서 마이셀 구조를 형성한다. 이러한 마이셀은 수용액 상에서 소수성 부위가 안쪽 핵을 형성하고 친수성 부위가 바깥쪽 껍질을 형성하는 독특한 핵-껍질 구조를 가진다. 이러한 마이셀의 안쪽 핵 부위에는 불수용성 의약품을 충진시킬 수 있는데, 마이셀에 충진된 이후에는 수용성이 크게 증가하고, 약효 지속 시간이 연장되며, 마이셀의 크기에 따라 체내 분포를 조절할 수 있으며, 또한 마이셀의 표면 특성에 따라 표적전달 또한 가능하기 때문에 최근 마이셀을 불수용성 의약품의 약물전달체로 개발하려는 연구가 지속되고 있다.
다양한 친수성 고분자를 바깥쪽 껍질을 형성하는 부위에 적용시키려는 연구가 진행되고 있는데, 대표적으로 폴리에틸렌 글리콜(poly ethylene glycol, PEG)이 많이 쓰이고 있다. PEG는 FDA에서 공인한 대표적인 생체용 고분자 재료 중의 하나지만, 약물전달체로 활용되는 PEG-Liposome 접합체를 반복 주사하게 되면 체내에서 투여된 약물의 소실이 빨리 일어나는 "accelerated blood clearance" (ABC) 현상이 일어나는 것으로 보고된 바 있다.
이에 본 발명은 불수용성 의약품 등의 불수용성 유효 약효 성분에 적용 가능한 약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 포함하는 약물 전달용 조성물, 상기 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 이용하여 약물을 전달하는 방법 및 상기 약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 구현예는 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 쉘(shell) 영역과, 말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드를 포함하는 코어(core) 영역으로 이루어지며, 상기 불수용성 펩타이드는 상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 결합된 것인 마이셀; 및 상기 마이셀 내부에 충진된 불수용성 약물을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 구현예는 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드 (Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시켜 하기 화학식 1의 HA-TBA 를 제조하는 단계;
말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드를 준비하는 단계;
상기 제조된 HA-TBA의 카르복실기와 상기 불수용성 펩타이드의 말단 아민기를 유기 용매 존재 하에 반응시켜 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 제조하는 단계; 및
상기 제조된 마이셀에 불수용성 약물을 충진하는 단계를 포함하는
약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 쉘(shell) 영역과, 말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드를 포함하는 코어(core) 영역으로 이루어지며, 상기 불수용성 펩타이드는 상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 결합된 것인 마이셀을 이용하여 약물을 전달하는 방법을 제공한다.
Figure pat00001
상기 화학식 1에서, n은 한 분자당 단위체 수를 나타내는 것으로서 50 내지 10,000의 정수이다.
이하, 본 발명의 일 구현 예에 따른 약물 전달용 조성물 및 이의 제조방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 쉘 영역과, 말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드를 포함하는 코어 영역으로 이루어지며, 상기 불수용성 펩타이드는 상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 결합된 것인 마이셀; 및 상기 마이셀 내부에 충진된 불수용성 약물을 포함하는 약물 전달용 조성물이 제공된다.
또한 본 발명의 다른 일 구현예에 따라, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드 (Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시켜 상기 화학식 1의 HA-TBA 를 제조하는 단계;
말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드를 준비하는 단계;
상기 제조된 HA-TBA의 카르복실기와 상기 불수용성 펩타이드의 말단 아민기를 유기 용매 존재 하에 반응시켜 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 제조하는 단계; 및
상기 제조된 마이셀에 불수용성 약물을 충진하는 단계를 포함하는
약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따라, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 쉘(shell) 영역과, 말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드를 포함하는 코어(core) 영역으로 이루어지며, 상기 불수용성 펩타이드는 상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 결합된 것인 마이셀을 이용하여 약물, 바람직하게는 불수용성 약물을 전달하는 방법이 제공된다.
상기 약물 전달 방법은 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 쉘(shell) 영역과, 말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드를 포함하는 코어(core) 영역으로 이루어지며, 상기 불수용성 펩타이드는 상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 결합된 것인 마이셀을 준비하는 단계; 상기 마이셀의 내부에 약물을 충진하는 단계; 및 상기 약물이 충진된 마이셀을 상기 약물을 필요로 하는 대상에게 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 약물의 전달은 상기 마이셀에 의약 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제 등을 더욱 포함하여 제조된 조성물의 형태로 이루어질 수 있다.
상기 약물 전달용 조성물, 상기 약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조방법, 및 상기 마이셀을 이용한 약물 전달 방법은 활성 성분인 불수용성 약물을 생체적합성, 생분해성 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀에 충진함으로써, 인체에 안전하게 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 흡수율이 낮은 불수용성 약물을 수용액 상에서 효과적으로 분산시킬 수 있어 수용성이 크게 증가되고, 약효 지속 시간이 연장되어, 상기 불수용성 약물 등을 포함한 불수용성 활성 성분의 약물 전달 시스템에 관한 산업분야에 널리 적용될 수 있다.
상기 마이셀의 바깥쪽 껍질에 해당하는 쉘(shell) 영역을 형성하는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 생체적합성, 생분해성을 가진 천연 고분자로서 친수성이면서 소수성 부위를 결합시킬 수 있는 작용기를 갖고 있어 마이셀의 바깥쪽 껍질을 형성하는 부위로 사용되기에 적합하다.
상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(HA-TBA)일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 화학식 1에서, n은 한 분자당 단위체 수를 나타내는 것으로서 50 내지 10,000의 정수이다.
참고로, 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법을 간단히 나타낸 것이다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 히알루론산은 수용액 상에서 TBA-OH와 반응하여 HA-TBA를 형성한다. 그 후 도 1b에 나타난 바와 같이, 상기 HA-TBA 및 말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드를 유기 용매 존재 하에 반응시켜 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 생성한다.
상기 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 수용액 상에 분산되면 소수성 부분인 코어 영역의 소수성 상호작용으로 인해 물과의 접촉을 최소화하고 자유 에너지를 안정화하기 위해 자발적으로 마이셀을 형성함으로써 바깥쪽 껍질 부분인 쉘 영역에 의해 수용액에 대한 용해도가 증가하게 된다. 따라서, 도 1c에 나타난 바와 같이, 상기 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 소수성 안쪽 코어(핵) 부위에 불수용성 약물을 충진시켜 약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 제조할 수 있다.
상기 불수용성 약물은 물에 용해 내지 분산되지 않는 특성으로 인하여 생체 이용률이 감소하여 목적으로 하는 효과의 발휘가 충분히 이루어지지 못하고, 제제화 또한 용이하지 못한 문제가 있었으나, 본 발명자들은 상술한 바와 같이, 불수용성 약물을 마이셀 내부에 충진시켜 전달함으로써 불수용성 약물의 생체 이용률을 현저히 향상시킬 수 있으며 또한 약효 시간을 보다 증대할 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 상기 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀은 그 자체에 포함된 펩타이드의 치료효과가 더해져 내부에 충진된 약물과 함께 복합적으로 작용할 수 있어 치료효과를 더욱 높일 수 있다.
상기 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 분자량이 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)인 것을 사용할 수 있다. 상기와 같은 범위의 분자량을 가짐으로써 약물 전달을 위한 컨쥬게이트에 적합하게 사용될 수 있다.
상기 말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드는, 펩타이드 N 말단 자체에 포함된 아민기를 별도의 준비 과정을 거치지 않고 사용할 수 있음은 물론이며, 펩타이드의 말단에 아민기를 포함하고 있지 않은 C 말단이나, 또는 아민기를 포함하고 있는 N 말단에서도 포함된 아민기의 반응성이 낮은 펩타이드의 경우 별도로 아민기를 도입하여 사용할 수 있으며, 반응성이 낮지 않더라도 보다 좋은 효과를 달성하기 위해 펩타이드의 C 말단 또는 N 말단에 별도로 아민기를 도입하여 사용할 수 있다.
상기 말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드를 구성하는 아미노산의 개수는 특별히 제한되지 않고 단백질도 사용할 수 있다. 다만 아미노산의 개수가 많아지면 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 한 분자당 결합가능한 펩타이드의 개수가 감소하게 된다. 따라서 바람직하게는 5 내지 10 개의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 바람직하게는 C 말단 또는 N 말단에 라이신 또는 글라이신을 포함하는 것일 수 있다.
말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드의 준비는 특별한 제한없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 펩타이드의 C 말단 또는 N 말단에 라이신 또는 글라이신을 추가로 도입하여 진행할 수 있다. 펩타이드의 말단에 라이신 또는 글라이신을 사용하여 아민기를 도입하면, 도입된 아민기에 의해 컨쥬게이션 반응성을 증가시킬 수 있다.
또한, 말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드는 수용액 상에서 용해되지 않고, 유기 용매상에서 용해될 수 있는 것이면, 그 구성의 한정이 없이 선택될 수 있다. 특히, VEGFR1 (Flt1)에 대한 길항제 펩타이드인 anti-Flt1 peptide를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 GNQWFI(SEQ ID NO: 1), KGNQWFI (SEQ ID NO: 2), GGNQWFI (SEQ ID NO: 3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기 anti-Flt1 peptide는 트립토판, 페닐알라닌, 아이소루신을 포함하여 이루어지며, 상기 트립토판, 페닐알라닌, 아이소루신은 마이셀 형성시 소수성 상호작용에 관여하며 낮은 pH에서도 강한 소수성을 가지는 특성상, 온도 또는 pH 등의 조건에 무관하게 수용액 상에서 항상 마이셀 구조를 형성할 수 있어 특히 바람직하다.
또한 바람직하게는 상기 불수용성 펩타이드는 상기 화학식 1의 화합물(HA-TBA) 한 분자당 단위체(n=50~10,000의 정수) 수의 4 내지 15%의 정수에 해당하는 펩타이드 분자수로 결합된 것일 수 있다. 상기와 같은 범위 내의 분자수의 펩타이드가 결합된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 원하는 약효 지속 시간 및 생체 이용률을 나타낼 수 있다. 상기 범위에 미달할 경우, 코어 영역의 소수성 상호작용이 충분하지 못해 마이셀의 형성이 제대로 이루어지지 못하고, 상기 범위를 초과할 경우 수용액 내에서의 용해성이 떨어지는 문제가 있어 바람직하지 않다.
상기 불수용성 펩타이드가 상술한 범위의 분자수로 결합하도록 하기 위해, 바람직하게는 상기 불수용성 펩타이드를 상기 HA-TBA 한 분자당 단위체 수의 5 내지 20%의 정수에 해당하는 분자수로 반응시킬 수 있다. 상기 범위에 미달할 경우, 마이셀 형성이 효과적으로 이루어지기 어려우며, 펩타이드 자체가 가지는 약효가 충분히 발휘되지 못하므로 바람직하지 않고, 상기 범위를 초과하는 펩타이드 분자수로 반응시킬 경우, 반응은 가능하나 접합 효율이 감소하는 문제가 있어 바람직하지 않다.
한편, 상기 HA-TBA를 제조하는 단계는 양이온 교환수지를 이용하여 진행할 수 있다. 구체적으로, 상기 HA-TBA 제조단계는 양이온 교환수지에 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide)를 반응시키는 단계, 및 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 추가로 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것일 수 있다.
상기 양이온 교환수지는 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드와 반응하여, TBA-OH의 양이온을 교환할 수 있는 것이면, 그 구성의 한정이 없이 사용될 수 있다.
바람직하게는 상기 양이온 교환수지는 Dowex 50WX2-200, Dowex 50WX4-400, Dowex 50WX2-100, Dowex 50WX2-400, Dowex 50WX8-100, Dowex 50WX8-200, Dowex 50WX8-400로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 상기와 같은 양이온 교환수지를 HA-TBA 형성에 사용하는 경우, HA의 카르복실기에 있던 Na+ 이온을 TBA 이온으로 교환하여 HA-Na를 HA-TBA로 변환시킬 수 있는 점에서 유리하다.
상기 HA-TBA의 카르복실기 및 상기 불수용성 펩타이드의 말단 아민기를 반응시켜 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 제조하는 단계는 유기 용매 상에서 진행할 수 있다.
상기 유기 용매는 HA-TBA 및 불수용성 펩타이드를 용해시킬 수 있는 것이면, 구성의 한정이 없이 사용될 수 있으며, 구체적으로, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 마이셀 제조단계는 N, N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine, DIPEA), 2,2,6,6,-테트라메틸피페리딘(2,2,6,6-tetramethylpiperidine), 또는 이들의 혼합물을 추가로 첨가하여 상기 HA-TBA의 카르복실기와 상기 불수용성 펩타이드의 말단 아민기를 반응시키는 것일 수 있다.
한편, 상기 마이셀 제조단계를 수행하기 전에, 바람직하게는 상기 HA-TBA를 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포니움 헥사플로로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate, BOP), 1, 3-디시클로헥실카르보디이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 및 1, 3-다이아이소프로필카보다이이미드(1,3-Diisopropylcarbodiimide, DIC) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 활성제에 첨가하여 활성화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀에 불수용성 약물을 충진하는 단계는 수성 용매와 유기 용매의 혼합 용매 상에서 진행할 수 있다.
상세하게는 상기 불수용성 약물의 충진 단계는 상기 제조된 마이셀을 수성 용매에 용해시켜 마이셀 용액을 제조하는 단계; 상기 불수용성 약물을 유기 용매에 용해시켜 불수용성 약물 용액을 제조하는 단계; 및 상기 마이셀 용액 및 상기 불수용성 약물 용액을 혼합하는 단계를 포함하여 이루어지는 것일 수 있다.
상기 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀은 바람직하게는 수성 용매에 대해 0.5mg/ml 내지 5 mg/ml로 용해시킬 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.5mg/ml 내지 2 mg/ml로 용해시킬 수 있다. 상기 범위를 초과하여 컨쥬게이트의 수용액 내 농도가 지나치게 높아질 경우, 마이셀의 분산이 용이하지 못해 응집 현상이 일어날 수 있으므로 바람직하지 않다.
상기 불수용성 약물은 유기 용매 내 충분히 용해될 수 있는 양으로 사용되는 것이 바람직하며, 바람직하게는 유기 용매에 대해 0.5mg/ml 내지 15 mg/ml로 용해시킬 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.5mg/ml 내지 10 mg/ml로 용해시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않고 약물 또는 용매의 종류에 따라 상기 유기 용매에 충분히 용해되기에 적합한 양으로 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
상기 유기 용매는 불수용성 약물을 용해시킬 수 있는 것이면, 구성의 한정이 없이 사용될 수 있으며, 구체적으로, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA), 에탄올 (ethanol), 및 클로로포름 (chloroform)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
상기 수성 용매는 물, 증류수, 주사용 증류수, 생리 식염수, 완충액(예컨대 인산염 완충액 등) 등일 수 있다.
상기 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀에 불수용성 약물을 충진하는 단계는, 예컨대 상기 마이셀 용액 및 상기 불수용성 약물 용액을 단순히 혼합하는 방법, 초음파 처리 방법, 주사기 펌프를 이용한 혼합법, 투석에 의한 용매치환방법, 휘발성 용매를 이용한 O/W 에멀젼법 등을 이용하여 수행할 수 있다.
바람직하게는 초음파처리 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 초음파처리 방법을 이용할 경우, 바람직하게는 상기 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트가 용해된 마이셀 용액 및 상기 불수용성 약물이 용해된 용액을 혼합한 혼합용액을 25 내지 35℃의 온도에서 3 내지 30 분 동안 처리하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.
상세하게는 제니스테인을 충진할 경우, 바람직하게는 20 내지 30분간 초음파처리 공정을 수행할 수 있고, 덱사메타손, 독소루비신 또는 이피루비신의 경우 3 내지 10분간, 더욱 바람직하게는 4 내지 8분간 수행할 수 있다. 이처럼 상기 초음파 처리 시간은 충진되는 약물의 종류에 따라 충진 효율 향상을 위해 다르게 적용할 수 있다.
이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 불수용성 약물이 충진된 마이셀은 100 내지 300nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 상기 범위의 직경을 가짐으로써 마이셀이 혈액 내를 순환하면서 수용체 매개 식세포작용(receptor-mediated endocytosis)에 의해 세포 내에 효과적으로 유입될 수 있다. 상기 마이셀의 직경은 동적광산란광도계(Dynamic Light Scattering, DLS) 측정 또는 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM) 관찰을 통해 확인할 수 있다.
상기 불수용성 약물은 수용액 상에서 용해되지 않고, 유기 용매 상에서 용해될 수 있는 것이면, 그 구성의 한정이 없이 선택될 수 있다.
바람직하게는 상기 불수용성 약물은 신생혈관생성 억제제, 당뇨병성 망막증에 따른 혈관 과투과성 억제제, 천식치료제, 또는 항암제를 갖는 것일 수 있다.
상기 신생혈관생성 억제제는 바람직하게는 각막 또는 망막 등의 안구의 신생혈관생성에 대한 억제 효과를 갖는 것이며, 상기 항암제는 바람직하게는 백혈병, 방광암, 유방암, 위암, 폐암, 난소암, 또는 갑상선암 등 다양한 종류의 암에 대한 것일 수 있다
바람직하게는 신생혈관생성 억제효과를 가지는 제니스테인 (genistein), 염증치료효과를 가지는 덱사메타손 (dexamethasone), 항암효과를 가지는 독소루비신 (doxorubicin) 또는 이피루비신(Epirubicin)을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한 바람직하게는 상기 불수용성 약물은 각 질병에서 유효한 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 투여량과 상기 약물의 유효 투여량을 고려할 때, 마이셀 전체 중량에 대해 0.1 내지 70 중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 50 중량% 로 충진될 수 있다.
상기 약물 전달용 조성물은 바람직하게는 의약 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제 등을 더욱 포함할 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제는 예컨대 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 등이 될 수 있다.
상기 의약 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 예컨대 경구 투여시에는 산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 제형으로 사용될 수 있다. 또한 비경구 투여시에는 정맥, 근육, 피하주사 등으로 투여될 수 있으나 이에 제한 되지 않고, 가능한 모든 방식의 투여경로가 적용될 수 있다.
바람직한 투여량은 투여대상 및/또는 질환의 치료 또는 예방에 적합한 함량이 될 수 있으며, 이는 투여대상의 연령, 성별, 일반 건강 상태 및 체중, 질병의 종류 및 중증도, 제형의 종류, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 조성물의 분비율, 투여경로 및 기간 등을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 투여대상은 인간을 포함하는 포유류가 될 수 있으며, 치료학적 유효량 즉, 유효 투여량은 약물이 충진된 마이셀에 포함된 약물을 기준으로 하였을 때 1 회 성인 체중 1 ㎏을 기준으로 하여, 예컨대 신생혈관생성 관련 안질환 치료를 위한 경우 제니스테인 1~5 ㎎(단위체의 10%에 펩타이드가 접합된 컨쥬게이트 기준시 5~15mg, 펩타이드 함량 기준시 1~5mg)의 용량으로 1회 이상 투여 가능하다. 또한 천식질환의 치료를 위해서는 덱사메타손이 충진된 마이셀을 덱사메타손 1~5mg(펩타이드 함량 기준시 10~20mg)의 용량으로 1회 이상 비강으로 투여 가능하다. 그러나 상기한 투여량은 예시하기 위한 일예에 불과하며 상기 범위에 한정되지는 않는다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 구현예에 따른 약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조 방법은 컨쥬게이션 반응이 수용액과 유기 용매의 혼합 용매 상에서 진행되므로, 유기 용매에 용해 가능한 불수용성 의약품의 약물 전달 시스템 준비에 응용 가능하다.
본 발명의 약물 전달용 조성물 및 상기 약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀 제조 방법에 따르면, 수성 용매와 유기 용매의 혼합 용매 상에서 충진 반응을 진행할 수 있어, 불수용성인 다양한 활성 성분에 적용 가능하고, 생체적합성, 생분해성 유도체에 충진되어, 인체에 적용하기에 안전한 약물이 충진된 마이셀을 얻을 수 있다. 또한, 상기 마이셀은 그 자체에 포함된 펩타이드로 인한 치료효과도 가지므로, 마이셀 내부에 충진되는 약물과 함께 복합적인 효과의 발휘가 가능한 효과가 있다.
상기 약물 전달용 조성물 및 이의 제조방법은 약효 시간이 증대된 불수용성 의약품 서방성 제형의 제조에 관한 산업 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조 방법에 관한 화학적 스킴(도 1a: HA-TBA 제조단계; 도 1b: HA-TBA를 이용한 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조단계) 및 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 소수성 안쪽 핵 부위에 소수성 약물을 충진 시키는 과정 (도 1c)을 간략히 도시한 것이다.
도 2는 히알루론산 (도 2a) 및 제조예 3의 히알루론산-펩타이드 컨쥬케이트 (도 2b)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3a는 페닐알라닌, 트립토판, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI) (SEQ ID NO: 3), 제조예 3에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬케이트의 형광 분석 결과를 나타낸 것이며, 도 3b는 트립토판의 형광 표준 곡선을 나타낸 것이다
도 4는 펩타이드 말단의 아민기 도입에 사용된 아미노산의 종류에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬케이트 내의 펩타이드 함량(생접합 효율)을 나타낸 것이다 (* P = 0.046 및 ** P = 0.070).
도 5는 제조예 3의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 내에서 하나의 히알루론산 체인에 결합된 펩타이드 분자수 (●) 및 생접합 효율 (○)을 나타낸 것이다.
도 6a는 제조예 3의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 화학적 구조 및 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 구조를 간략히 도시한 것이다.
도 6b는 anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3) 용액과 제조예 3의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 용액을 가시광선 (위) 및 UV (아래) 상에서 관찰한 사진이다.
도 6c는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 TEM 이미지이다.
도 6d는 HA-TBA 한 분자당 25개의 펩타이드가 접합되었을 때, DLS 결과이다.
도 6e는 HA-TBA 한 분자당 6개의 펩타이드가 접합되었을 때, DLS 결과이다.
도 7은 제니스테인(도 7a), 및 덱사메타손(도 7b)의 고속액체 크로마토그래피 측정 결과로 검정 선이 컨쥬게이트와 소수성 약물의 정제 전 혼합 용액, 파란 선이 충진되지 않은 약물이 정제된 후의 결과이다. 도 7c는 독소루비신의 UV spectrum 측정 결과이다.
도 8은 제니스테인 (도 8a), 덱사메타손 (도 8b), 독소루비신 (도 8c), 이피루비신(도 8d)이 각각 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 TEM 이미지이다.
도 9는 제니스테인 (도 9a), 덱사메타손 (도 9b), 독소루비신 (도 9c), 이피루비신(도 9d)이 각각 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 DLS 이미지이다.
도 10은 제조예 3의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트가 Flt1-Fc와 VEGF165의 결합을 억제시키는 효과를 나타낸 것이다 (양성대조군에 대해 * P < 0.05 및 ** P < 0.01, n = 3).
도 11은 in vitro 상에서 실시예 1의 제니스테인과 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀(HA-(anti-Flt1)/genistein)에서 각각 제니스테인이 방출되는 경향을 나타낸 것이다.
도 12는 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀이 HUVEC 세포의 증식을 억제하는 효과를 나타낸 것이다 (대조군에 비해 *P < 0.01 및 **P < 0.005, n=4).
도 13은 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 각막 신생혈관생성 억제효과를 나타낸 것이다. 정상 대조군(Normal), 음성 대조군(NV control), Avastin 을 처리한 양성 대조군, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3) 실험군, 제조예 3의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI)의 각막 사진이다.
도 14는 도 13의 각막 신생혈관생성 억제효과를 Image J 프로그램으로 정량 분석한 결과이다 (* P = 0.002 및 ** P = 0.028).
도 15는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 망막 맥락막 신생혈관생성 (CNV) 억제효과를 나타낸 것이다. 도 15a는 음성 대조군, 히알루론산 실험군, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3) 실험군, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군을 처리한 망막의 형광 현미경 사진이다. 원래 배율은 100배였다. 도 15b는 CNV lesion의 형광세기를 Image J 프로그램으로 정량 분석한 결과이다 (음성 대조군에 대해 ** P < 0.01, n = 6).
도 16은 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 당뇨병성 망막증에 따른 혈관 과투과성 억제효과를 나타낸 것이다. 도 16a는 히알루론산, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3), 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(HA-GGNQWFI), 높은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(HA-GGNQWFI(2))를 처리한 망막의 형광 현미경 사진이다. 원래 배율은 100배였다. 도 16b는 망막의 형광세기를 Image J 프로그램으로 정량 분석한 결과이다 (히알루론산 실험군에 대해 ** P < 0.01, n =10).
도 17은 당뇨병성 망막증의 정상 대조군, 음성 대조군, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3) 실험군, 높은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI(2))의 망막 전자 현미경 사진이다. (L: 혈관내경(lumen of vessel), *: 내피세포(endothelial cell), RBC: 적혈구(red blood cell), WBC: 백혈구(white blood cell)). 스케일바는 2 μm이다.
도 18은 SD 래트(rats)의 유리체에 히알루론산, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3), 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(HA-GGNQWFI)를 유리체내 주사로 1회 투여한 후의 anti-Flt1 peptide 농도를 나타낸 것이다 (n = 6).
도 19는 정상 대조군, 음성 대조군, 히알루론산 실험군, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3) 실험군, 제조예 3의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군의 메타콜린 기도과민성 (AHR)을 나타낸 것이다.
도 20은 정상 대조군, 음성 대조군, 제조예 3의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군의 기관지 폐포세척 세포수 (BAL cellularity)를 나타낸 것이다.
도 21은 실시예 1의 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 각막 신생혈관생성 억제효과를 나타낸 것이다. 정상 대조군, 음성 대조군, 제조예 3의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트, 제니스테인, 실시예 1의 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀 실험군, Avastin 을 처리한 양성 대조군의 각막 사진이다.
도 22는 도 21의 각막 신생혈관생성 억제효과를 Image J 프로그램으로 정량 분석한 결과이다.
도 23은 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 당뇨병성 망막증에 따른 혈관 과투과성 억제효과를 나타낸 것이다. 도 23a는 정상 대조군, 음성 대조군(untrated)과 Avastin, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(HA-(anti-Flt1)), 증류수와 DMSO에 분산시킨 제니스테인, 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀(HA-(anti-Flt1)/genistein)을 처리한 망막의 형광 현미경 사진이다. 도 23b는 상기 도 23a에 나타난 망막의 형광세기를 Image J 프로그램으로 정량 분석한 결과이다 (*P = 0.0002 및 ** P = 0.020, n = 5).
도 24는 실시예 3의 독소루비신이 충진된 히알루론산-펩타이드 마이셀을 이용하여 종양조직 표적지향능력을 바이오 이미징을 통해, 평가한 것이다. 형광 이미징을 통하여 종양조직에 마이셀이 축적되어 있다는 결과을 얻었다.
도 25는 실시예 4의 이피루비신이 충진된 히알루론산-펩타이드 마이셀을 이용하여 간 조직내에 있는 PCNA level을 측정한 western blot 결과이다. 이를 통하여 이피루비신이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 항암효과가 다른 그룹에 비해 월등히 뛰어남을 확인할 수 있었다.
이하, 발명의 다양한 실시예에 대해 설명하기로 한다. 다만, 이는 발명의 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 발명의 권리 범위가 제한되는 것은 아니다.
제조예 1. 히알루론산- 펩타이드 ( GNQWFI ) 컨쥬게이트의 제조
Dowex 50WX-8-400 ion-exchange resin (12.5 g)을 250 mL의 증류수로 3회 세척한 후, 상기 Dowex resin에 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH) (24.5 mL)를 넣어 30분간 반응 후, 필터를 통해 여과하였다. 히알루론산(HA)(MW=100kDa) 1g을 100 mL의 증류수에 녹인 후, 상기의 DOWEX-TBA resin (10g)을 첨가해 3시간 동안 반응시켰다. 상층액을 0.45 μm 필터로 걸러 3일간 동결건조 시켜 HA-TBA 유도체를 얻었다.
이후, 상기 HA-TBA 유도체 132.8mg을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 16ml에 녹인 후(100.5% 치환된 HA-TBA에 펩타이드 20mg을 한 분자당 25개를 반응시킬 경우 기준), HA unit에 대해 2.5 몰배의 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (Benzotriazole-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, BOP) 를 첨가해 30분간 교반(stirring)하여 HA의 카르복시기를 활성화 시켰다. 말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드 (anti-Flt1 peptide) GNQWFI(SEQ ID NO: 1) 20mg를 마찬가지로 DMSO 4ml에 녹인 후 상기 제조된 HA-TBA 용액과 혼합하고, HA unit과 같은 몰량의 N,N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine, DIPEA)를 첨가한 후, 밤새 반응시켰다. 이후 상기 반응용액에 같은 부피의 1M NaCl 수용액을 첨가하고, pH를 3.0으로 내렸다가 7.0으로 올려 반응을 종결시켰다. 상기의 용액을 과량의 100 mM NaCl 수용액, 25%(v/v) ethanol, 증류수에 대해 투석시킨 후 3일간 동결건조 시켜, HA-TBA 한 분자당 펩타이드가 20개 접합된 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 얻었다.
또한, 상기 DMSO에 용해되는 불수용성 펩타이드의 양을 28mg(HA-TBA 한 분자당 펩타이드 35개 반응시킴)으로 한 것 외에는 상술한 방법과 동일하게 제조하여 HA-TBA 한 분자당 펩타이드가 28개 접합하도록 제조한 높은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 제조하였다.
제조예 2. 히알루론산- 펩타이드 ( KGNQWFI ) 컨쥬게이트의 제조
Anti-Flt1 펩타이드로 GNQWFI (SEQ ID NO: 1)서열을 갖는 펩타이드 말단에, 라이신(lysine, K)을 도입해, HA의 카르복시 그룹과의 반응성이 좋은 말단 아민기를 갖는 펩타이드(KGNQWFI) (SEQ ID NO: 2)를 사용한 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 낮은 펩타이드 함량 및 높은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 얻었다.
제조예 3. 히알루론산- 펩타이드 ( GGNQWFI ) 컨쥬게이트의 제조
Anti-Flt1 펩타이드로 GNQWFI (SEQ ID NO: 1)서열을 갖는 펩타이드 말단에, 글리신(glycine, G)을 도입해, HA의 카르복시 그룹과의 반응성이 좋은 말단 아민기를 갖는 펩타이드(GGNQWFI) (SEQ ID NO: 3)를 사용한 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 낮은 펩타이드 함량 및 높은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 얻었다.
상기 제조예 3에서 얻어진 히알루론산-펩타이드(GGNQWFI) 컨쥬게이트를 1H-NMR (DPX500, Bruker, Germany) 및 분광형광계 (Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer, Varian, Australia)를 이용해 분석하였다.
실험예 1. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 NMR 분석
1-1) 분석 방법
제조예 3에 따라 얻어진 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(HA-GGNQWFI)를 1H-NMR (DPX500 또는 DPX300, Bruker, Germany)로 분석하였다. HA 및 제조예 3에 따라 얻어진 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 1H-NMR 스펙트럼을 각각 도 2a 및 도 2b에 도시하였다.
1-2) 분석 결과
도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 3에 따라 얻어진 히알루론산-펩타이드(GGNQWFI) 컨쥬게이트의 1H-NMR 스펙트럼에서는 히알루론산의 피크(peak) 외에도, 펩타이드의 피크가 나타났다. 특히 d = 7.10 ~ 7.65 ppm의 피크는 페닐알라닌(phenylalanine)과 트립토판(tryptophan)의 방향족 고리(aromatic ring)에 의한 것이고, d = 0.866 ppm의 피크는 아이소류신(isoleucine)의 두 메틸기(methyl groups)에 의한 것이다. 정량분석을 위해 d = 1.85 ~ 1.95 ppm의 히알루론산의 아세토아미도 관능기의 메틸 공명(methyl resonance of acetamido moiety of HA)을 내부표준(internal standard)으로 정했다 (도 2a 및 도 2b의 a). 제조예 3 에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 내의 펩타이드 함량은 d = 1.85 ~ 1.95 ppm의 피크 면적과 d = 0.866 ppm의 피크 면적을 비교해서 구했다 (도 2b의 ß). 1H-NMR 스펙트럼 분석을 통해 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 합성을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 형광 분석
1) 형광분석을 위한 트립토판 표준 곡선 결정
히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 형광 분석을 통하여 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 형성 여부를 확인하기 위해, 우선 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), anti-Flt1 peptide (GGNQWFI) (SEQ ID NO: 3), 및 제조예 3에 따라 얻어진 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(HA- GGNQWFI)를 각각 0.5 M HCl에 녹였다. 280 nm에서 여기(excitation) 시킨 후, 각 샘플의 광루미네선스(photoluminescence)를 스펙트로플루오로미터(spectrofluorometer)(Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer, Varian, Australia)로 측정하여 도 3a에 나타내었다.
도 3a에서 볼 수 있는 바와 같이, 페닐알라닌은 280 nm에서 여기시켰을 때 형광이 나타나지 않은 반면 트립토판은 350 nm에서 선명한 방출 피크(sharp emission peak)를 보였다. Anti-Flt1 펩타이드 (GGNQWFI) (SEQ ID NO: 3)와 제조예 3에 따라 얻어진 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트도 350 nm에서 선명한 방출 피크를 보였고, 접합 전후의 방출 패턴(emission pattern)에 차이가 없었다.
즉, Anti-Flt1 펩타이드를 구성하고 있는 아미노산 중 트립토판이 생접합 이후에도 큰 변성 없이 구조 및 형광 특성을 유지하고 있음을 확인하여 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 형광분석을 위해 트립토판 표준 곡선을 구하여 후술할 각 실험예의 정량 분석에 사용하였다.
구체적으로 0.5 M HCl에 6.4 mg/mL의 농도로 트립토판 표준 용액(stock solution)을 준비한 뒤, 희석시켜 각각 0.5, 1, 2, 4, 8 μg/mL 농도의 트립토판 표준용액을 준비했다. 상기 준비된 다양한 농도로 희석된 트립토판 표준 용액 (n=3)를 이용해 도 3b와 같이 트립토판의 농도에 따른 형광성 세기를 나타낸 표준 곡선(standard curve)을 구할 수 있었다.
2) 펩타이드 말단의 아민기 도입에 사용된 아미노산의 종류에 따른 생접합 효율 측정
제조예 1 내지 3에 따른 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 시료 0.5 mg을 0.5 M HCl 3 mL에 녹여 280 nm에서 여기(excitation) 시킨 후, 샘플의 광루미네선스(photoluminescence)을 스펙트로플루오로미터(spectrofluorometer)(Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer, Varian, Australia)로 형광을 측정하였고, 그 결과를 트립토판 형광성 분석을 통해 정량하여 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 라이신 (lysine)을 GNQWFI (SEQ ID NO: 1)의 말단에 도입(KGNQWFI) (SEQ ID NO: 2)하여, 컨쥬게이션 반응을 진행하여 제조된 컨쥬게이트의 경우(제조예 2: HA-KGNQWFI), 평균 생접합 효율(average bioconjugation efficiency)은 라이신을 도입하지 않은 펩타이드를 사용한 경우(제조예 1: HA-GNQWFI)에 비해 10% 증가한 것을 확인할 수 있었다. 한편, 글라이신(Glycine)을 GNQWFI (SEQ ID NO: 1)의 말단에 도입(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3)하여, 컨쥬게이션 반응을 진행하여 제조된 컨쥬게이트의 경우(제조예 3: HA-GGNQWFI), 평균 생접합 효율은 글라이신을 도입하지 않은 펩타이드를 사용한 경우(제조예 1)에 비해 40% 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 이후의 실시예 및 실험예에서는 가장 높은 생접합 효율를 보인 GGNQWFI (SEQ ID NO: 3)와 상기 펩타이드가 HA-TBA 한 분자당 20개로 접합되어 있는 낮은 펩타이드 함량의 HA의 컨쥬게이트(제조예 3)를 사용했다.
3) 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 내 펩타이드 함량 및 생접합 효율 분석
제조예 3에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 내 결합된 펩타이드 함량을 여기 파장(excitation wavelength) 280 nm, 방출 파장(emission wavelength) 350 nm에서 형광 세기(fluorescence intensity)를 측정해 구하고, 트립토판 형광성 분석을 통해 정량하여 생접합 효율 분석 결과와 함께 도 5에 도시하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 내의 펩타이드 함량은 feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수에 따라 증가했다. Feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수를 4, 8, 16, 33, 55로 변화시켰을 때, HA 한 분자 당 결합한 펩타이드의 평균 분자수는 3에서 30까지 조절 가능했다. 생접합 효율 (%)은 반응용액에 첨가한 펩타이드에 대한 반응한 펩타이드의 몰 비로 표시했다. Feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수가 33 이하일 때는 생접합 효율이 약 65 %로 일정했다. Feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수가 55일 때는 생접합 효율이 53 %까지 감소했다.
실험예 3. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 특성분석
3-1) 분석 방법
Anti-Flt1 peptide(GGNQWFI) (SEQ ID NO: 3)와 제조예 3에 따라 얻어진 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 각각 최종 펩타이드 농도가 1.25 mg/mL이 되도록 400 μL의 PBS에 용해시켰다. 각 용액에 포함된 anti-Flt1 펩타이드의 양은 changeable UV transilluminator (DUT-260, Core Bio System, Korea)로 312nm의 광원을 이용해 측정하였다. 수용액상에서 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 형성은 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope, TEM)(Hitachi, Tokyo, Japan)으로 확인하였다. TEM 분석을 위해, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 용액 10 μL를 탄소 피막 300 메쉬(mesh) 쿠퍼 TEM 그리드(300 mesh copper TEM grids with a carbon film)에 떨어뜨린 후 건조시켰다. 평균 입자 크기는 30개의 입자 이미지의 지름을 이용해 구했다.
또한, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 수력학적(hydrodynamic) 지름을 동적광산란광도계(Dynamic Light Scattering, DLS)(Zetasizer Nano, Malvern Instrument Co., UK)로 분석하여 접합된 펩타이드 분자 수에 따른 마이셀 형성 여부를 확인하였다. 구체적으로 접합된 펩타이드의 분자 수 외에는 제조예 3과 동일한 방법으로 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 1mg/ml 농도로 수용액에 용해시키고, PMMA cell에 담아 수력학적 지름에 따른 분포를 측정하였다.
3-2) 분석 결과
도 6a에서 볼 수 있는 바와 같이, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI) (SEQ ID NO: 3)는 친수성 부위 (GNQ)와 강한 소수성 부위(WFI)를 모두 갖고 있었다. 따라서 제조예 3에 따라 anti-Flt1 peptide을 히알루론산과 결합시키면 수용액상에서 anti-Flt1 peptide의 소수성 부위가 소수성 안쪽 핵을 형성하고, 히알루론산이 친수성 바깥 껍질을 형성해 도 6a의 모식도와 같은 마이셀 구조를 형성하게 됨을 확인할 수 있었다.
도 6b에서 볼 수 있는 바와 같이, anti-Flt1 peptide는 불수용성이기 때문에 수용액 상에서 혼탁한 상태로 보였다. 하지만 제조예 3에 따라 얻어진 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 수용성이 크게 증가해 맑은 상태로 보였다. 그러나 두 용액을 UV 상으로 보았을 때, 같은 정도의 형광이 나타나 두 용액에 포함된 anti-Flt1 peptide의 양은 동일함을 확인할 수 있었다.
도 6c에서 볼 수 있는 바와 같이, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 투과전자현미경 (TEM) 상으로 관찰하였을 때 구형 입자로 존재하였으며, 평균 지름은 234.5 ± 20.6 nm (n = 30)였다.
도 6d와 도 6e에서 볼 수 있듯이 HA-TBA 한 분자당 25개의 펩타이드가 접합된 컨쥬게이트에서는 222.0±8.5nm (n=5) 위치에 하나의 피크가 관찰되어 마이셀 형성을 확인할 수 있었지만 한 분자당 6개의 펩타이드가 접합된 컨쥬게이트에서는 여러 개의 피크가 산발적으로 관찰되어 마이셀 구조가 형성되지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 마이셀 구조의 형성에 있어서, HA-TBA 한 분자당 결합하는 펩타이드 분자수가 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었으며, 구체적으로 HA-TBA 한 분자당 12개 이상의 펩타이드가 접합된 컨쥬게이트의 경우 마이셀 형성이 확인되었으나, 6개 이하로 접합된 컨쥬게이트의 경우 마이셀 구조가 형성되지 않음을 확인할 수 있었다(데이터 미도시).
실시예 1. 제니스테인이 충진된 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조
상기 제조예 3에서 제조된 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드(GGNQWFI) 컨쥬게이트 1mg을 PBS 0.8ml에 용해시키고, 제니스테인 (genistein) 0.5mg을 DMSO 0.2ml에 용해시킨 후, 두 용액을 혼합하여 30℃의 물 속에서 25분간 초음파처리(sonication)(JAC 2010, KODO, Korea)시켰다. 이후 초음파 처리된 반응용액을 과량의 PBS에 대해 투석시켜 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 제조하였다.
실시예 2. 덱사메타손이 충진된 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조
상기 제조예 3에서 제조된 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드(GGNQWFI) 컨쥬게이트 1mg을 증류수 1ml에 용해시키고, 덱사메타손 (dexamethasone) 0.5mg을 에탄올 0.2ml에 용해시킨 후, 두 용액을 혼합하여 30℃의 물 속에서 6분간 초음파처리(sonication)(JAC 2010, KODO, Korea)시켰다. 이후 초음파 처리된 반응용액을 과량의 증류수에 대해 투석시켜 덱사메타손이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 제조하였다.
실시예 3. 독소루비신이 충진된 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조
독소루비신 (Doxorubicin·HCl) 1mg을 증류수 0.5ml에 용해시킨 후, 클로로포름 0.5ml과 트리에탄올아민(triethanolamine, TEA) 1μl를 첨가해 층분리를 일으켰다. 상기 제조예 3에서 제조된 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드(GGNQWFI) 컨쥬게이트 2mg을 PBS 1ml에 용해시키고, 상기 층분리된 용액 중 아래층 용액 0.1ml을 혼합하여 Digital Sonifier 500 (Fisher Scientific) 장비를 이용하여 100W로 5분간 팁 초음파처리(tip sonication) 시켰다). 이후 초음파 처리된 반응용액을 공기 중에서 밤새 교반(stirring)하여 클로로포름(chloroform)을 제거하고 과량의 PBS에 대해 투석시켜 덱사메타손이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 제조하였다.
실시예 4. 이피루비신이 충진된 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조
이피루비신 (Epirubicin·HCl) 1mg을 증류수 0.5ml에 용해시킨 후, 클로로포름 0.5ml과 트리에탄올아민(triethanolamine, TEA) 1μl를 첨가해 층분리를 일으켰다. 상기 제조예 3에서 제조된 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드(GGNQWFI) 컨쥬게이트 2mg을 PBS 1ml에 용해시키고, 상기 층분리된 용액 중 아래층 용액 0.1ml을 혼합하여 Digital Sonifier 500 (Fisher Scientific) 장비를 이용하여 100W로 5분간 팁 초음파처리(tip sonication) 시켰다.이후 초음파 처리된 반응용액을 공기 중에서 밤새 교반(stirring)하여 클로로포름(chloroform)을 제거하고 과량의 PBS에 대해 투석시켜 덱사메타손이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 제조하였다.
실험예 4. 약물이 충진된 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 특성분석
4-1) 분석 방법
실시예 1 및 2에 따라 얻어진 제니스테인, 및 덱사메타손이 각각 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 고속액체 크로마토그래피 (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)로 분석하였다. 분석 시스템은 다음과 같았다. Waters 1525 binary HPLC pump, Waters 2487 dual λ absorbance detector, Waters 717 plus auto-sampler, Waters Symmetry 300 C18 column. 이동상은 73 vol% 50 mM ammonium formate / 27 vol% acetonitrile (ACN)이고, 유속은 1 mL/min 이었다. 측정 파장대는 260 nm 이었다.
실시예 3 및 4에 따라 얻어진 독소루비신, 및 이피루비신이 각각 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀은 자외선 분광광도계 (UV spectrophotometer)로 파장대 490nm에서 분석하였다.
투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope, TEM)(Hitachi, Tokyo, Japan) 분석을 위해, 약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀 용액 10 μL를 300 메쉬(mesh) 쿠퍼 TEM 그리드(300 mesh copper TEM grids with a carbon film)에 떨어뜨린 후 건조시켜 사용하였다.
약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 수력학적(hydrodynamic) 지름은 동적광산란광도계(Dynamic Light Scattering, DLS)(Zetasizer Nano, Malvern Instrument Co., UK)로 분석하였다.
4-2) 분석 결과
고속액체 크로마토그래피 (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 또는 자외선 분광광도계 (UV spectrophotometer) 분석에서 제니스테인, 덱사메타손, 독소루비신, 이피루비신이 각각 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀에 충진된 것을 확인하고, 충진 효율 (%)을 측정하였다.
충진 효율(%)은 충진을 위해 첨가한 약물에 대한 실제 충진된 약물의 몰 비로 구하였으며, 도 7에 나타난 바와 같이, 제니스테인(도 7a)은 약 20%, 덱사메타손(도 7b)은 약 2%, 독소루비신은 약 30%(도 7c), 이피루비신은 약 25%의 충진 효율을 나타냈다(데이터 미도시). 구체적으로 제니스테인의 경우, 약 2분, 및 3분 정도(약물 정제 후의 경우는 약 3분, 및 6분 정도)에 용매에 관한 피크가 나타났고, 약 21분 정도(약물 정제 후의 경우 약 20분 정도)에 충진된 약물에 관한 피크가 관찰되었으며, 덱사메타손의 경우, 약 3분 정도(약물 정제 후의 경우도 동일함)에 용매에 관한 피크가 나타났고, 약 16분 정도(약물 정제 후의 경우도 비슷한 시점에 관찰됨)에 충진된 약물에 관한 피크가 관찰되었다.
한편, 도 8의 TEM 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이, 제니스테인 (도 8a), 덱사메타손 (도 8b), 독소루비신 (도 8c), 이피루비신 (도 8d)이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀은 구형의 형태를 가지며 잘 분산되어 있었고, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀 내부에 충진된 약물 입자는 도 8a 내지 도 8c 우측의 확대된 이미지 및 도 8d에서 나타난 바와 같이, 구형의 마이셀 이미지 내부에 짙은 검정색으로 나타나 각 마이셀 내부에 약물 입자가 충진되어 있음을 확인할 수 있었다.
각 마이셀 입자의 지름은 100 ~ 300 nm의 범위에 존재해 동적광산란광도계 (Dynamic Light Scattering, DLS)로 측정한 결과와 비슷하게 나타났다. 구체적으로 DLS 측정 결과를 살펴보면, 도 9a 내지 도 9d에 나타난 바와 같이 상기 TEM 이미지에 나타난 것과 비슷한 크기 및 좁은 분자량 분포(narrow PDI)를 가진 단분산(monodispersed)된 마이셀이 형성됨을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 in vitro 생물학적 활성( biological activity ) 분석
5-1) 분석 방법
VEGF165 용액 (PBS 내의 농도 0.5 μg/mL)(R&D System)을 96-black well-plate에 넣고 4℃에서 밤새 반응시켜 VEGF165 코팅된 웰(well)을 준비하였다. PBS로 세척한 후 블로킹 버퍼(blocking buffer) (pH 7.4인 PBS 완충액 내 BSA(Sigma-Aldrich)가 3 wt%로 용해된 BSA 용액)로 well을 block하고 (실온에서 2시간) PBS로 다시 세척하였다. PBS(pH 7.4) 내 BSA(Sigma-Aldrich)가 1 wt% 로 용해된 용액에 20, 200, 2000, 20000 nM의 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3)와 500 ng/mL의 Flt1-Fc(R&D systems(Minneapolis, MN))를 함유한 anti-Flt1 peptide (GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3), 또는 제조예 3의 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI)(HA-TBA 한 분자당 펩타이드가 20개 접합하도록 제조된 것) 용액을 VEGF165 코팅된 웰에 첨가한 후 실온에서 한 시간 배양시켰다. 이후 0.05 wt% 의 Tween 20를 함유한 PBS로 세 번 세척한 후, anti-human IgG-HRP-Fc(Pierce(Rockford, IL))를 포함하는 BSA(Sigma-Aldrich) 용액(PBS 내 BSA가 0.3 wt% 로 용해된 용액)을 넣고 실온에서 한 시간 배양시켰다. 이후 0.05 wt% 의 Tween 20를 함유한 PBS로 세 번 세척하고 PBS로 한 번 세척한 후, 결합한 Flt1-Fc의 양을 BM chemiluminescence ELISA substrate system (Victor 3 luminometer, PerkinElmer, MA)으로 측정하였다. 음성 대조군은 Flt1-Fc를 처리하지 않은 것, 양성 대조군은 anti-Flt1 peptide를 처리하지 않고 Flt1-Fc를 처리한 것을 각각 사용하였다.
5-2) 분석 결과
Anti-Flt1 peptide를 처리하지 않은 양성 대조군의 발광값(luminescence value)을 100%로 설정한 후 다른 data는 표준화(normalize) 시켜 도 8에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 200nM까지도 anti-Flt1 peptide는 VEGF165와 Flt1-Fc의 결합을 억제시키지 않았고, 더 높은 농도(2000nM, 20000nM)에서도 약 68%의 VEGF165가 Flt1-Fc와 결합했다. 대조적으로, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 농도 의존적(dose-dependent)으로 약 32%까지 VEGF165와 Flt1-Fc의 결합을 억제시켜 in vitro 생물학적 활성이 있음을 알 수 있었으며, VEGF165와 Flt1-Fc의 결합 억제 효과가 히알루론산과 결합하지 않은 펩타이드에 비해 현저히 뛰어남을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 제니스테인이 충진된 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 in vitro 방출 테스트
6-1) 분석 방법
실시예 1의 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀 용액 2mL와 같은 양의 제니스테인이 2mL DMSO에 녹아 있는 용액을 각각 투석용 튜브(MWCO: 10kDa)에 넣고 10mL의 pH 7.4 PBS 용액에 담근 뒤, 37℃에서 in vitro 방출 실험을 진행하였다. 정해진 시간에 제니스테인이 방출된 PBS 용액을 채취하고 HPLC 분석으로 제니스테인의 농도를 측정하여 방출된 제니스테인의 양을 정량하여 도 11에 나타내었다.(Biomaterials 26 (2005) 5064-5074 )
6-2) 분석 결과
도 11에서 볼 수 있듯이 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀에 충진된 제니스테인은 3시간 동안 충진된 양의 반이 방출되고, 이후 21시간에 걸쳐 남은 제니스테인이 모두 방출되어 아무 것도 처리하지 않은 제니스테인과 비교하였을 때 천천히 방출됨을 알 수 있었다. 이처럼 제니스테인을 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀에 충진하여 사용할 경우, 마이셀로부터 제니스테인이 서서히 방출되기 때문에 제니스테인만을 처리한 경우에 비해 체내 잔류시간이 증가하게 되고 이에 따라 상승된 약효를 얻을 수 있게 된다.
실험예 7. 제니스테인이 충진된 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 in vitro 혈관생성억제 효과 분석
7-1) 분석 방법
혈관 내피 세포인 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)(이노파마스크린, 한국)을 EGM?-2 배지(Lonza)에서 키운 뒤 2×104/ml의 세포 용액을 한 well당 100μL씩 뿌려 16시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 16시간 후, 배지를 교체하고 일곱 가지 종류의 샘플을 처리하였다. 일곱 가지 샘플은, 배지만 처리한 대조군, 50μM, 100μM, 200μM의 제니스테인 용액과 각각 50μM, 100μM, 200μM의 제니스테인을 함유한 실시예 1의 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 용액이었으며, 샘플 10μL와 배지 100μL를 섞어서 처리하였다. 샘플을 처리한 후 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 하루에 한 번 샘플이 섞여 있는 배지를 갈아주었다. 3일 후, 배지를 제거하고 110μL의 MTT solution(Amresco Co. (Solon, OH))을 처리한 뒤, 37℃ 배양기에서 두 시간 동안 배양하였고, 50μL의 DMSO를 첨가하여 540nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도를 대조군의 흡광도와 비교하여 세포가 증식한 정도를 계산하였다.
7-2) 분석 결과
도 12에 나타난 것과 같이, 제니스테인이 충진된 실시예 1의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(HA-Flt1 Peptide/Genistein)는 투여 농도에 의존하는 신생혈관생성 억제 효과를 보였으며, 마이셀에 충진되지 않은 제니스테인에 비하여 뛰어난 신생혈관생성 억제 효과를 보였다.
즉 대조군의 세포 수를 100%로 두었을 때, 마이셀에 충진되지 않은 제니스테인을 처리한 군에서 유의적인 세포 증식 억제 효과(70.5 ± 3.5%)를 나타낸 농도인 100μM에서, 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 처리한 경우 증식한 세포 수는 대조군의 44.6 ± 2.8%정도로 나타나, 대조군에 비해서는 약 55.4%, 제니스테인만을 실험한 처리군에 비해서는 약 26% 가량 세포 증식이 감소한 것으로 나타났다. 또한 제니스테인만을 처리한 군에서 가장 우수한 효과를 나타낸 농도인 200uM에서조차 가장 낮은 농도(50uM)의 제니스테인이 충진된 마이셀에 비해 낮은 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
따라서. 본 발명의 일 실시예에 따른 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 신생혈관 생성 억제 효과는 대조군은 물론이고, 마이셀에 충진되지 않은 제니스테인에 비해서도 현저히 높게 나타남을 확인할 수 있었다.
실험예 8. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 각막 신생혈관생성 억제효과 분석
8-1) 분석 방법
평균 몸무게 250 g의 Albino Sprague Dawley 수컷 래트(rat)를 그룹당 5마리씩 실험에 사용하였다. 본 실험을 비롯한 모든 동물실험 과정은 대한민국의 카톨릭대학교의 가이드라인 및 실험동물 관리 원칙(guidelines of the Catholic University of Korea and the principles of laboratory animal care; NIH publication No. 85-23 revised in 1985)을 따랐다.
래트는 케타민 하이드로클로라이드 (ketamine hydrochloride) 20 mg/kg과 자일라진 하이드로클로라이드(xylazine hydrochloride) 2.5 mg/kg의 혼합용액을 래트의 복강내 주입(intra-peritoneal injection)해 마취시켰다. 오른쪽 각막의 가운데 지점을 75%(v/v)의 질산은(silver nitrate) 및 25%(v/v) 질산칼륨(potassium nitrate)으로 구성된 질산은 면봉(silver nitrate applicator stick)(직경 1mm)을 10 초 동안 각막(cornea)에 접촉시켜 마비(cauterize)시켰다. 마비 3일 후, 각 20 μL의 샘플 용액(정상 대조군, NV control(neovascularization control: 신생 혈관을 유발한 뒤, 아무 약물도 처리하지 않은 대조군), 10mg/ml 농도로 PBS에 용해시킨 Avastin (Roche) 용액, 2.5mg/ml의 농도로 PBS 내 용해시킨 anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3) 용액, 및 anti-Flt1 peptide 함량을 기준으로 2.5mg/ml의 농도로 PBS 내 용해시킨 제조예 3에 따라 얻어진 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 용액의 네 가지 샘플)을 결막하(subconjunctiva)에 투여했다. 각막 신생혈관생성 억제효과는 디지털 카메라가 장착된 안과용 현미경(ophthalmic microscope)(Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 얻어진 이미지는 Image J program (Ver. 1.38, National Institute of Health, MD)으로 정량 분석했다.
8-2) 분석 결과
도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 3에 따라 얻어진 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트가 가장 효과적으로 각막 신생혈관생성을 억제했고, 다음이 anti-Flt1 peptide, 다음이 Avastin 이었다.
상기 각 샘플의 각막 신생혈관생성 억제 결과를 정량 분석하여 도 14에 나타냈다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 신생혈관생성 면적의 평균 비율은 control은 90.8 ± 5%, 양성 대조군인 Avastin 은 35.4 ± 6.6%, anti-Flt1 peptide는 27 ± 5.7%, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트은 17.4 ± 5.6%였다.
실험예 9. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 망막 맥락막 신생혈관생성 억제효과 분석
9-1) 분석 방법
평균 몸무게 250 g의 Brown-Norway (BN) 수컷 래트를 그룹당 6마리씩 실험에 사용하였다. 각 그룹은 음성 대조군, 히알루론산 실험군, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3) 실험군, 제조예 3에 따라 높은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI(2))으로 구성된 네 그룹으로 구성되었으며, anti-Flt1 peptide 샘플과 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 샘플 내의 펩타이드 농도는 10 mg/mL로 동일하게 맞췄다. 먼저 래트에 케타민 하이드로클로라이드 100 mg/mL와 자일라진 하이드로클로라이드 20 mg/mL의 1/1 혼합용액 0.2 mL를 처리해 마취시켰다. 0.8 %(w/v) 트로픽아미드(tropicamide)를 국소처리해 동공을 확장시킨 후, 532 nm의 레이저 광응고화 (Visulas 532, Carl Zeiss, Germany)로 맥락막 신생혈관생성 (choroidal neovascularization, CNV)을 유도하였다 (spot size 100 μm, power 260 mA, exposure time 30 ms). 레이저 손상 사흘 후, 각 10 μL의 샘플 용액을 유리체내 주사로 투여했다. 망막 맥락막 신생혈관생성 억제효과는 레이저 손상 2주 후에 dextran-FITC (MW = 40,000)를 이용한 형광 현미경 분석으로 확인했다. 마취 후에 500 μL의 dextran-FITC 용액 (25 mg/mL)을 래트의 꼬리정맥으로 투여하고, 5분 후에 망막을 분리하여 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경으로 관찰하였다 (Olympus, Tokyo, Japan). 얻어진 이미지는 Image J program (NIH, Bethesda, MD)으로 분석했다.
9-2) 분석 결과
도 15a에서 볼 수 있는 바와 같이, 음성 대조군과 히알루론산 실험군에서는 높은 형광세기와 브루크막(Bruch's membrane)의 큰 손상이 관찰되었고, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3)와 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군에서는 낮은 형광세기와 작은 손상이 관찰되었다. 또한 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군은 히알루론산에 접합시키지 않은 anti-Flt1 peptide 실험군보다 더 효과적으로 망막 맥락막 신생혈관생성을 억제했다.
도 15a에 나타난 결과를 음성 대조군의 형광 세기를 100 %로 정한 후, 상대적인 세기를 비교해 정량분석 하여 도 15b에 나타내었다. 평균 형광 세기 퍼센트는 히알루론산 실험군은 97.1 ± 4.7%, anti-Flt1 peptide 실험군은 61.4 ± 4.4%, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군은 48.9 ± 3.9%였다. t-test를 통한 통계학적 분석에서, anti-Flt1 peptide와 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군에서는 음성 대조군 및 히알루론산 실험군과 비교했을 때 형광 세기가 유의한 수준으로 감소했으며 (**P < 0.01), 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 망막 맥락막 신생혈관생성 억제 효과가 anti-Flt1 peptide보다 더욱 효과적임을 확인할 수 있었다 (P = 0.0004).
실험예 10. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 당뇨병성 망막증에 따른 혈관 과투과성 억제효과 분석
10-1) 분석 방법
평균 몸무게 250 g의 Sprague Dawley (SD) 수컷 래트를 그룹당 10마리씩 실험에 사용하였다. 각 그룹은 히알루론산(HA) 실험군, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3) 실험군, 제조예 3의 낮은 펩타이드 함량(HA-TBA 한 분자당 펩타이드 20개 접합)의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI), 제조예 3의 높은 펩타이드 함량(HA-TBA 한 분자당 펩타이드 28개 접합)의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI(2)) 으로 구성된 네 그룹으로 구성되었으며, anti-Flt1 peptide 샘플과 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 샘플 내의 펩타이드 농도는 5 mg/mL로 동일하게 맞췄다. 먼저 10 mM 구연산염 버퍼(citrate buffer at pH 4.5)에 녹인 스트렙토조토신(streptozotocin) 60 mg/kg을 각 래트에 대해 1회 복강 내 주사로 투여하여 당뇨병을 유발하였다. 스트렙토조토신 투여 3일 후 혈장 포도당 농도가 300 mg/dL 이상이면 당뇨가 유발된 것으로 판단하였다. 스트렙토조토신 투여 일주일 후, 각 10 μL의 샘플 용액을 유리체내 주사로 투여했다. 당뇨병성 망막증에 따른 혈관 과투과성 억제효과는 스트렙토조토신 투여 4주 후에 dextran-FITC (MW = 10,000)를 이용한 형광 현미경 분석으로 확인했다 (상기 실험예 7-1의 방법과 동일함).
또한 망막 혈관 구조의 변화는 전자 현미경으로 관찰하였다. 망막을 적출하여 4 wt% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 1 wt% 4산화오스뮴(osmium tetroxide)에서 고정시키고, 에탄올로 탈수시킨 후 포매제의 혼합(Epon mixture)에 포매(embed)시켰다. 그 후, 샘플을 절단하여 투과전자현미경 (JEM-1010, JEOL, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
10-2) 분석 결과
도 16a에서 볼 수 있는 바와 같이, 히알루론산 실험군에서는 당뇨병성 망막증에 따른 혈관 과투과성 때문에 dextran-FITC의 형광이 망막 실질(retinal parenchyma)로 확산되었다. Anti-Flt1 peptide와 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI, (HA-GGNQWFI(2))에서는 retinal parenchyma에서 dextran-FITC의 형광이 거의 관찰되지 않고, 대부분이 혈관 내에서 관찰되었다. 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI, (HA-GGNQWFI(2))은 히알루론산에 접합시키지 않은 anti-Flt1 peptide보다 더 효과적으로 당뇨병성 망막증에 따른 혈관 과투과성을 억제했다.
도 16a의 결과는 히알루론산 실험군(HA)의 형광 세기를 100 %로 정한 후, 상대적인 세기를 비교해 정량분석 하여 도 16b에 나타내었다. 평균 형광 세기 퍼센트는 anti-Flt1 peptide 실험군은 79.0 ± 9.2%, 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI)은 58.4 ± 7.8%, 높은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI(2))은 51.3 ± 10.8%였다 (도 16b). t-test를 통한 통계학적 분석에서, anti-Flt1 peptide와 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군에서는 히알루론산 실험군과 비교했을 때 형광 세기가 유의한 수준으로 감소했으며 (**P < 0.01), 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 억제 효과가 anti-Flt1 peptide보다 더욱 효과적이었다 (**P < 0.01). 게다가 높은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 억제 효과가 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트보다 더욱 효과적이었다 (P = 0.1).
도 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 당뇨병성 망막증의 음성 대조군에서는 혈관 기저막이 얇은 혈관 내피세포 층으로 둘러싸인 불규칙하고 주름진 형태를 가졌으나, anti-Flt1 peptide 실험군에서는 혈관 내피세포 층은 얇았지만 혈관이 둥근 형태를 가졌다. 제조예 3의 높은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI(2))에서는 혈관 내피세포 층이 정상 대조군과 마찬가지로 두꺼웠으며, 혈관 형태 또한 둥근 형태였다.
실험예 11. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 안구내 약리 ( PK ) 특성 분석
11-1) 분석 방법
평균 몸무게 250 g의 Sprague Dawley (SD) 수컷 래트를 그룹당 6마리씩 실험에 사용하였다. 그룹은 히알루론산 실험군(HA), anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3) 실험군, 제조예 3의 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-GGNQWFI)으로 구성된 세 그룹으로 구성되었으며, anti-Flt1 peptide 샘플과 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 샘플 내의 펩타이드 농도는 5 mg/mL로 동일하게 맞췄다. 각 10 μL의 샘플 용액을 유리체내 주사로 투여한 후, 6시간, 1, 3, 7, 10, 14일이 되었을 때 유리체를 샘플링해 분석 전까지 -20 ℃에서 보관했다. 유리체 내의 anti-Flt1 peptide 농도는 형광분석으로 측정했다. 구체적으로 유리체를 200 μL의 RIPA buffer로 분해시킨 후, 14,000 g, 4 ℃에서 10분간 원심분리해 상층액을 얻었다. 분광형광계 (Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer, Varian, Australia)로 280nm의 여기(excitation) 파장대와 350nm의 방출(emission) 파장대에서 각 샘플의 광루미네선스를 측정했다. 아무것도 처리하지 않은 SD 래트의 유리체를 blank control로 사용하였다.
11-2) 분석 결과
도 18에서 볼 수 있는 바와 같이, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3) 실험군의 유리체 내 농도는 10일 내에 기준선까지 떨어졌고 Tmax는 24시간이었지만, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 농도는 14일 이상 유지되었으며 Tmax는 6시간이었다. Anti-Flt1 peptide의 Tmax가 상대적으로 긴 이유는 anti-Flt1 peptide의 불수용성 때문인 것으로 보인다. 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 Cmax는 1.6 ± 0.6 mg/mL로 anti-Flt1 peptide (0.8 ± 0.7 mg/mL)보다 높았다. 동일한 농도(dose)임에도 불구하고 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 AUC 또한 anti-Flt1 peptide보다 높아 히알루론산에 접합된 후 anti-Flt1 peptide의 생체이용률(bioavailability, AUC/dose)이 향상되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 12. 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트의 천식치료효과 분석
12-1) 분석 방법
제조예 3에 따른 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(HA-GGNQWFI)의 생물학적 활성도를 메타콜린(methacholine)에 대한 반응을 통해 측정하였다. 구체적으로 기도과민반응(airway hyper-responsiveness, AHR)을 in vivo 상태에서, 실험용 쥐를 마취하지 않고 자연상태의 운동을 유지하면서 체적변동 측정기(plethysmography)를 사용하여 하기 수학식 1로 표현되는 기도의 폐식을 반영하는 수치인 enhanced pause(Penh)를 측정하였다. 본 실험에서는 실험용 쥐를 보정하거나 마취하지 않은 상태에서 측정하는 비침습적 방법(non-invasive method)을 사용하였다.
[수학식 1]
Penh=[(Te/RT-1)X(PEF/PIF)]
상기 수학식 1에서, Te는 expiratory time (seconds), RT는 relaxation time (seconds), PEF는 peak expiratory flow (ml), PIF는 peak inspiratory flow (ml/s)을 의미한다.
실험용 쥐로는 BALB/c 마우스(암컷, 6주령, 그룹당 5마리)를 사용하였다. 그룹은 정상 대조군(PBS-PBS: 천식을 유발하지 않고 PBS를 처리한 것), 음성 대조군(OVA/LPS10-OVA: OVA과 LPS로 천식을 유발한 뒤, PBS만 처리한 것), 히알루론산 실험군, anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3) 실험군, 제조예 3에 따라 얻어진 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군으로 구성된 다섯 그룹으로 구성되었으며, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 농도(dose)는 10 ~ 1,000 μg/head로 변화시켰다.
먼저 마우스 천식 모델을 만들기 위해 각 마우스 에 75 μg의 오브알부민(ovalbumin, OVA)(Calbiochem(La Jolla, CA))과 10 μg의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)(Calbiochem(La Jolla, CA))를 0, 1, 2, 7일에 비강 내 투여하여 감작(sensitize)하였다. 다음으로 OVA(50ug/head), 히알루론산(500 μg/head), anti-Flt1 peptide(GGNQWFI)(SEQ ID NO: 3)(10, 30, 100, 300, 1000μg/head), 제조예 3에 따라 얻어진 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(펩타이드 함량을 기준으로 10, 30, 100, 300, 1000μg/head)를 14, 15, 21, 22일에 비강 내 투여하여 유발(challenge)하였다. 음성대조군으로는 모든 기간에 OVA만을 투여하였으며, 정상 대조군의 경우 14, 15, 21, 22일 째에 PBS만 투여하였다. 메타콜린 기도과민성과 폐 염증 평가는 각각 마지막 알러지원 유발(allergen challenge)의 24, 48 시간 후에 실시하였다.
폐 기능은 23일째에 비 마취 상태의 마우스를 비침습성 전신 체적기록진단법을 이용하여 측정하였다. 실험용 쥐를 체적 기록 진단기 chamber에 놓고, PBS 에어로졸 (기본 측정)과 각각 6.25, 12.25, 25, 50 mg/mL의 농도의 메타콜린(metahcholine) 에어로졸에 노출시켰다. 에어로졸은 초음파 흡입기를 이용하여 제조되었으며, 실험용 쥐는 메타콜린(Methacholine)에 3분간 노출시키고 이후 5분간 Penh 를 측정하였다.
12-2) 분석 결과
도 19에서 볼 수 있는 바와 같이, 마지막 알러지원 유발 24시간 이후의 메타콜린 기도과민성 (AHR)은 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군에서 크게 감소하여 천식이 유발되지 않은 정상 대조군과 비슷한 수준까지 낮아졌다. 히알루론산 및 히알루론산에 접합시키지 않은 anti-Flt1 peptide도 메타콜린 기도과민성을 감소시켰지만 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트보다는 그 효과가 적었다.
도 20에서 볼 수 있는 바와 같이, 폐의 염증의 지표인 기관지 폐포세척 세포수 (BAL cellularity)도 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군에서 크게 감소하였으며, 이는 농도 의존적(dose-dependent)으로 나타났다. 특히 농도가 1,000 μg/head인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군의 기관지 폐포세척 세포수는 음성 대조군의 절반보다도 더 적게 나타났다.
실험예 13. 제니스테인이 충진된 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 각막 신생혈관생성 억제 효과 분석
13-1) 분석 방법
평균 몸무게 250 g의 Albino Sprague Dawley 수컷 래트를 그룹당 5마리씩 실험에 사용하였다.
각 그룹은 정상 대조군, 음성 대조군(NV control: neovascularization control로 신생혈관을 유도한 후 아무 약물도 처리하지 않은 음성 대조군), PBS 에 10mg/ml 농도로 용해시킨 Avastin (Roche) 용액, 펩타이드 함량을 기준으로 3.2mg/ml 농도로 PBS 내 용해시킨 제조예 3의 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(HA-GGNQWFI) 용액, 두 가지 다른 용매(PBS, DMSO)에 각각 6.2mg/ml의 양으로 분산된 제니스테인, 실시예 1에 따라 얻어진 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀)을 펩타이드 함량을 기준으로 3.2mg/ml 농도로 PBS에 용해시킨 샘플용액으로서 사용한 것 외에는 상기 실험예 8과 동일한 방법으로 각막 신생혈관생성 억제효과를 분석하였다.
13-2) 분석 결과
도 21에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 1에 따라 얻어진 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀 실험군이, 제니스테인(2가지 용매 실험군), 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트, Avastin 실험군보다 뛰어난 효과를 보여 가장 효과적으로 각막 신생혈관생성을 억제함을 알 수 있었다.
상기 각 샘플의 각막 신생혈관생성 억제 결과를 정량 분석하여 도 22에 나타냈다. 구체적으로 신생혈관생성 면적의 평균 비율은 control은 86%, positive control인 Avastin 은 23%, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 30%, 물에 분산시킨 제니스테인은 68%, DMSO에 용해된 제니스테인은 38%, 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 20%였다.
실험예 14. 제니스테인이 충진된 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 당뇨병성 망막증에 따른 혈관 과투과성 억제효과 분석
14-1) 분석 방법
평균 몸무게 250 g의 Sprague Dawley (SD) 수컷 래트를 그룹당 5마리씩 실험에 사용하였다. 각 그룹은 정상 대조군, 음성대조군(당뇨병을 유발하였지만 샘플을 처리하지 않은 음성 대조군), PBS에 10mg/ml 용해시킨 Avastin 용액, 제조예 3의 낮은 펩타이드 함량(HA-TBA 한 분자당 펩타이드 20개 접합)의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-(anti-Flt1(GGNQWFI))), 두 가지 다른 용매(DIW, DMSO)에 각각 6.2mg/ml의 양으로 분산된 제니스테인, 실시예 1에 따라 얻어진 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀(HA-(anti-Flt1)/genistein)을 펩타이드 함량을 기준으로 3.2mg/ml 농도로 PBS에 용해시킨 샘플용액으로서 사용하였다. 상기 실험예 10과 같은 방법으로 당뇨병을 유발하고 샘플 용액을 처리하였으며, 당뇨병성 망막증에 따른 혈관 과투과성 억제효과는 스트렙토조토신 투여 4주 후에 dextran-FITC (MW = 10,000)를 이용한 형광 현미경 분석으로 확인했다 (상기 실험예 10의 방법과 동일함).
14-2) 분석 결과
도 23a에서 볼 수 있는 바와 같이, 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀 실험군에서는 retinal parenchyma에서 dextran-FITC의 형광이 거의 관찰되지 않고, 대부분이 혈관 내에서 관찰되었다. 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 이러한 혈관 과투과성 억제 효과는 제니스테인이 충진되지 않은 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트, 아무 처리도 하지 않은 제니스테인, 양성 대조군으로 사용한 Avastin보다 더 효과적인 것으로 관찰되었다.
상기 도 23a에 나타난 결과를 토대로 정상 대조군의 형광 세기를 1로 정한 후, 이에 대한 각 실험군의 상대적인 세기를 비교해 정량분석 하여 도 23b에 나타내었다. 평균 형광 세기는 음성 대조군에서 2.54 ± 0.20으로 크게 증가하였으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀 실험군은 1.23 ± 0.20으로 평균 형광 세기를 가장 많이 감소시켰다. 그 외에 Avastin은 1.49 ±0.17, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 실험군(HA-(anti-Flt1))은 1.58 ± 0.17, DMSO에 용해된 제니스테인은 2.00 ± 0.16, 물에 분산된 제니스테인은 2.38 ±0.20의 평균 형광 세기를 나타내었다 (도 23b). t-test를 통한 통계학적 분석에서, 제니스테인이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀 실험군은 제니스테인 대조군(DMSO)과 비교했을 때 형광 세기가 유의한 수준으로 감소했으며(*P = 0.02), 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트와 비교하였을 때도 더욱 뛰어난 억제 효과가 관찰되었다 (**P = 0.0002).
실험예 15. 독소루비신이 충진된 히알루론산- 펩타이드 마이셀의 종양조직 표적지향능력 평가
15-1) 분석 방법
실험용 쥐로는 Balb/c 누드 마우스(nude mice)를 사용하였다(4주령 25g, male, 그룹당 1마리). 먼저 마우스 흑색종(melanoma) B16F10 세포(1 × 106 cells)(한국 세포주 은행)를 마우스의 오른쪽 등 피하에 주입해 종양 조직을 생성시킨 후, 약 14일이 지난 뒤, 실시예 3에 따라 얻어진 독소루비신이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 정맥주사로 투여하였으며, 농도는 100μg/head 였다. 투여 후 6 시간 뒤, 형광 imaging을 통해, 각 조직에 분포된 마이셀 형광세기를 측정하였다(참고문헌 : ACS Nano, 4, 3005-3014 (2010)).
15-2) 분석 결과
도 24에서 볼 수 있는 바와 같이 간(liver), 신장(bladder), 종양조직(tumor)에 독소루비신이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀이 축적된 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 간 조직 표적지향, 간암 조직 표적지향 약물전달체를 개발할 수 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 간과 종양 조직에 있는 히알루론산 유도체의 수용체 매개 식세포 작용(receptor mediated endocytosis)에 의해 조직 내에 축적되어 도 24와 같은 결과를 얻을 수 있었다. (관련문헌:PCT/KR2010/006270, ACS Nano, 4, 3005-3014 (2010))
실험예 16. 이피루비신이 충진된 히알루론산- 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 간암 항암효과 분석
16-1) 분석 방법
평균 몸무게 250 g의 Sprague Dawley 수컷 래트를 그룹당 5마리씩 사용하여 진행되었다. 그룹은 각각 PBS, 제조예 3의 낮은 펩타이드 함량의 히알루론산 펩타이드 컨쥬게이트(HA-GGNQWFI), 이피루비신, 및 실시예 4의 이피루비신이 충진된 히알루론산 펩타이드 컨쥬게이트 마이셀(HA-micell) 실험군으로 설정하여 실험을 진행하였다.
우선 각 래트에 대해 디에틸니트로사민(diethylnitrosamine, DEN)을 복강내 (intra-peritoneal injection) 50mg/kg로 주입하여, 10주간 간암 모델을 만들었다. 이후 상기 준비된 간암 모델에 상기 각 샘플을 PBS 내 용해시킨 용액을 5일에 1번씩 3회 정맥주사로 투여하였다. 각 샘플의 투여량은 우선 이피루비신의 투여량을 2mg/head로 맞춘 다음, 이에 맞추어 이피루비신이 충진된 마이셀에 사용된 히알루론산 펩타이드 컨쥬게이트의 투여량을 결정하고, 컨쥬게이트를 기준으로 각 샘플을 2mg/ml의 농도로 PBS에 용해시켜 투여 하였다. 투여 후 20일 뒤, 웨스턴 블랏(western blot)을 통하여, 간 조직내에 있는 증식성 세포핵항원(proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 레벨을 각각의 밴드의 굵기를 측정하여 확인하였다.
16-2) 분석 결과
도 25에서 볼 수 있는 바와 같이 이피루비신이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 경우 PCNA level이 다른 그룹에 비해 월등히 큼을 확인할 수 있었다. 상기 PCNA는 암세포 증식에 의해 손상된 DNA를 회복시키는 효과가 있는 것으로서 PCNA 레벨이 월등히 높게 나타난 이피루비신이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 항암효과가 다른 그룹에 비해 월등히 뛰어남을 확인할 수 있었다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> DRUG DELIVERY SYSTEM USING HYALURONIC ACID-PEPTIDE CONJUGATE MICELLE <130> DPP20115586KR <150> KR10-2011-0047497 <151> 2011-05-19 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Flt1 peptide <400> 1 Gly Asn Gln Trp Phe Ile 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Flt1 peptide <400> 2 Lys Gly Asn Gln Trp Phe Ile 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Flt1 peptide <400> 3 Gly Gly Asn Gln Trp Phe Ile 1 5

Claims (27)

  1. 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 쉘 영역과,
    말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드를 포함하는 코어 영역으로 이루어지며, 상기 불수용성 펩타이드는 상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 결합된 것인 마이셀; 및
    상기 마이셀 내부에 충진된 불수용성 약물을 포함하는
    약물 전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 분자량이 10,000내지 3,000,000 달톤(Da)인, 약물 전달용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인, 약물 전달용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00003

    상기 화학식 1에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 불수용성 펩타이드는 상기 화학식 1의 화합물 한 분자당 단위체 수의 4 내지 15%의 정수에 해당하는 분자수로 결합된 것인, 약물 전달용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 불수용성 펩타이드는
    N 말단에 라이신 또는 글라이신을 포함하는 것이거나, 또는
    N 말단 또는 C 말단에 라이신 또는 글라이신이 추가로 도입된 것인, 약물 전달용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 불수용성 펩타이드는 VEGFR1 수용체(receptor)에 대한 길항제 펩타이드(antagonist peptide, anti-Flt1)인, 약물 전달용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 불수용성 펩타이드는 GNQWFI(SEQ ID NO: 1), KGNQWFI(SEQ ID NO: 2), 및 GGNQWFI(SEQ ID NO: 3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약물 전달용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 불수용성 약물은 신생혈관생성 억제제, 당뇨병성 망막증에 따른 혈관 과투과성 억제제, 천식치료제, 또는 항암제인, 약물 전달용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 불수용성 약물은 제니스테인 (genistein), 덱사메타손 (dexamethasone), 독소루비신 (doxorubicin) 및 이피루비신 (epirubicin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약물 전달용 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 불수용성 약물은 마이셀 전체 중량에 대해 0.1 내지 70 중량% 로 충진된 것인, 약물 전달용 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 불수용성 약물이 충진된 마이셀은 100 내지 300nm의 직경을 갖는 것인, 약물 전달용 조성물.
  12. 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드 (Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시켜 하기 화학식 1의 HA-TBA 를 제조하는 단계;
    말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드를 준비하는 단계;
    상기 제조된 HA-TBA의 카르복실기와 상기 불수용성 펩타이드의 말단 아민기를 유기 용매 존재 하에 반응시켜 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀을 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 마이셀에 불수용성 약물을 충진하는 단계를 포함하는
    약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00004

    상기 화학식 1에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 HA-TBA 제조단계는
    이온 교환수지에 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시키는 단계; 및
    히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 추가로 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하여 이루어지는, 제조 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 말단 아민기를 갖는 불수용성 펩타이드는, N 말단 또는 C 말단에 라이신 또는 글라이신을 추가로 도입한 것인, 제조방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 유기 용매는 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 제조방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 마이셀 제조단계를 수행하기 전에,
    상기 HA-TBA를 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포니움 헥사플로로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate, BOP), 1, 3-디시클로헥실카르보디이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 및 1, 3-다이아이소프로필카보다이이미드(1,3-Diisopropylcarbodiimide, DIC) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 활성제에 첨가하여 활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 마이셀 제조단계는,
    N, N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine, DIPEA), 2,2,6,6,-테트라메틸피페리딘(2,2,6,6-tetramethylpiperidine), 또는 이들의 혼합물을 추가로 첨가하여 상기 HA-TBA의 카르복실기와 상기 불수용성 펩타이드의 말단 아민기를 반응시키는 것인, 제조방법.
  18. 제12항에 있어서,
    상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 분자량이 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)인, 제조 방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 마이셀 제조단계는
    상기 불수용성 펩타이드를 상기 HA-TBA 한 분자당 단위체 수의 5 내지 20%의 정수에 해당하는 분자수로 반응시키는 것인, 제조 방법.
  20. 제12항에 있어서,
    상기 불수용성 펩타이드는 VEGFR1 수용체(receptor)에 대한 길항제 펩타이드(antagonist peptide)인 anti-Flt1 펩타이드인 약물이 충진된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 마이셀의 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 불수용성 펩타이드는 GNQWFI(SEQ ID NO: 1), KGNQWFI(SEQ ID NO: 2), 및 GGNQWFI(SEQ ID NO: 3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 제조 방법.
  22. 제12항에 있어서, 상기 불수용성 약물을 충진하는 단계는,
    상기 제조된 마이셀을 수성 용매에 용해시켜 마이셀 용액을 제조하는 단계;
    상기 불수용성 약물을 유기 용매에 용해시켜 불수용성 약물 용액을 제조하는 단계; 및
    상기 마이셀 용액 및 상기 불수용성 약물 용액을 혼합하는 단계를 포함하여 이루어지는 것인, 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 유기 용매는 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA), 에탄올 (ethanol), 및 클로로포름 (chloroform)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 제조 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 마이셀 용액 제조단계는 상기 마이셀을 수성 용매에 0.5mg/ml 내지 5 mg/ml로 용해시키는 것인, 제조 방법.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 불수용성 약물 용액 제조단계는 상기 불수용성 약물을 유기 용매에 0.5mg/ml 내지 15mg/ml로 용해시키는 것인, 제조방법.
  26. 제12항에 있어서,
    상기 불수용성 약물은 마이셀 전체 중량에 대해 0.1 내지 70 중량% 로 충진하는 것인, 제조 방법.
  27. 제12항에 있어서,
    상기 불수용성 약물은 제니스테인 (genistein), 덱사메타손 (dexamethasone), 독소루비신 (doxorubicin), 및 이피루비신 (epirubicin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 제조 방법.


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