CN111748016A

CN111748016A - 一种基于非典型疏水性氨基酸的自组装短肽及其应用

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Publication number: CN111748016A
Application number: CN202010638716.XA
Authority: CN
Inventors: 邱峰; 彭飞; 张文胜; 刘静
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2040-07-03
Also published as: CN111748016B; WO2022001701A1; CN116333049B; CN116425833B; CN116425833A; CN116333049A

Abstract

本发明涉及一种短肽及其作为疏水药物的载体的应用。所涉及的短肽氨基酸序列为由2～10个谷氨酰胺以及0～5个氨基酸X组成，其中X可以为酪氨酸、苏氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或色氨酸。本发明的短肽，能够通过分子自组装的机制装载多种疏水药物，形成粒径均匀的纳米球，从而将药物有效地转运进入细胞或组织发挥其药效，安全无明显细胞毒性，制剂工艺简单，是一种极具开发前景的疏水药物的载体。

Description

一种基于非典型疏水性氨基酸的自组装短肽及其应用

技术领域

本发明属于药物载体领域，更具体的，本发明涉及一种基于非典型疏水性氨基酸的自组装短肽及其作为疏水性药物载体的应用。

背景技术

在当前的药物研发中，许多有潜力的小分子药物本身为疏水性物质，水溶性很差，在制剂中一般需要采用载体将其分散、溶解在水溶液或水性溶液中，才能通过注射给药。目前在临床上广泛使用的疏水药物载体主要包括脂质等材料。以最常用的抗癌药物紫杉醇为例，上市药物

紫杉醇注射液Taxol中含有约527mg/mL的聚氧乙烯蓖麻油以及49.7％的无水乙醇作为溶媒；最常用的全身麻醉药物如丙泊酚，是以天然大豆油、蛋黄卵磷脂等脂质分子为载体的脂肪乳制剂；血管舒张药前列地尔采用了大豆油、卵磷脂、油酸等脂质分子为载体的脂肪乳注射液；高血压治疗药物丁酸氯维地平也含有注射用油和磷脂成分。但是，脂质成分在临床上的应用仍存在一些问题，例如稳定性较差(Anesth Analg 2003,97:769-771)、引起注射痛(Acta Anaesthesiol Scand 2001,45:839-841)、诱发高血脂(Lancet2001,357:606-607)以及容易引起细菌快速生长而诱发感染等(Anesth.Analg.1999,88:209-212)。紫杉醇注射液Taxol在临床使用过程中也出现了较多不良反应，如急性超敏反应(Allergy Asthma Immunol Res 2016,8:174-177)，神经毒性(Nanomedicine 2015,11:1925-1938)等；丙泊酚脂肪乳注射液存在丙泊酚输注综合征(propofol infusionsyndrome,PRIS)的问题(Crit Care 2015,19:398)；丁酸氯维地平注射液限制了严重脂质代谢紊乱的患者的使用(见丁酸氯维地平注射液说明书)，等等。上述问题基本都与脂质成分相关。因此，开发不含脂质成分的疏水药物载体材料极具前景。

目前已有一些非脂质材料已应用在临床上，如人血白蛋白包载紫杉醇的制剂Abraxane已于2005年在美国上市，其副作用小，给药时间短，不良反应降低(Int JNanomedicine 2009,4:99-105)。但是，该剂型受限于白蛋白载体的人血来源及相应的微生物和病毒污染风险，价格昂贵。采用聚合物mPEG-PLLA材料载紫杉醇制剂Cynviloq已于2007年在韩国上市(Adv Drug Deliver Rev 2017,122:20-30)，但是聚合物材料价格较高，合成工艺较复杂，同时聚合物纳米毒性还需要继续关注。在生物安全性方面，人工合成的短肽具有其独特的优势，也是一种很有潜力的药物载体材料。例如中国发明专利(ZL专利号00105625.5，授权公告号CN1148227C，题为“治疗化合物及其应用”)公开了一种基于短肽载体的治疗化合物及其应用。然而该发明专利是将紫杉醇与谷氨酸、天冬氨酸通过化学结合的方式形成治疗化合物，而非利用短肽自组装形成的纳米粒对药物直接进行装载。

人工设计的自组装短肽作为近年来国际上新兴的一类材料受到越来越多的重视(Nano Today 2016,11:41-60)。这是一类通过人工设计、合成的由天然氨基酸组成的短肽分子，能够在水溶液中自组装形成纳米管、纳米纤维、纳米囊泡或纳米粒等结构。由于其成份为短肽，降解产物为天然L-型氨基酸，自组装短肽具有良好的生物相容性和安全性。而人工设计、合成的方式，又使这类材料来源清楚、质量可控、便于功能化修饰。

然而在作为疏水药物载体时，现有的自组装短肽存在其自身的不足。目前报道的用于装载疏水药物的自组装短肽有两大类，一类是形成具有疏水面的片层结构对药物颗粒进行包裹，得到的药物-短肽复合体多为不规则的微米级颗粒，均一性、稳定性较差(Int JNanomed 2011,6:2143-2153)；另一类则形成纳米级的具有紧凑疏水性内核的胶束来装载药物，粒径均匀且分散性较好，但载药量非常有限(Int J Nanomed 2015,10:847-858)。

文献报道的自组装短肽载药量较低，制剂稳定性较差，载药能力显著不如大多数的天然脂质分子，这些问题是目前自组装短肽类载体尚未普及的主要原因。要想开发具有转化价值的自组装短肽疏水药物载体，就必须在保证形成均一而稳定的载药纳米粒的同时，尽量提高其载药量。

现有的自组装短肽都含有大量的疏水性氨基酸来驱动其自组装并实现对疏水药物的装载，而大量疏水性氨基酸的存在又导致短肽自身的水溶性比较有限，在高浓度下容易聚集沉淀。短肽材料自身的溶解性，和材料对疏水药物的装载能力，似乎成为了一组无法调和的矛盾，极大地限制了自组装短肽作为疏水药物载体的应用。

发明内容

本发明目的是提供一种新的载药效果可与脂质载体相比拟，基于非典型疏水性氨基酸的自组装短肽，其技术方案如下：

一种短肽，它由2～10个谷氨酰胺(Q)和0～5个氨基酸X组成；

X为酪氨酸、苏氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或色氨酸。

为了便于说明，将这样的短肽以如下通式表示：QmXn；其中m和n分别表示谷氨酰胺和氨基酸X的个数，m＝2～10，n＝0～5。

如前述的短肽，所述短肽的N端和/或C端带有化学修饰；

N端化学修饰择一地选自：烷酰基化，生物素标记，脂肪酸修饰，苯甲酰化，2-氨基苯甲酰化，马来酰亚胺，卤代烷酰基化，琥珀酰化，联肼尼克酰胺，荧光基团标记；优选地，所述荧光基团为FAM、FITC或TAMRA。

C端化学修饰择一地选自：酰胺化，酯化，醛基化，醇基化，琥珀酰化，荧光基团标记；优选地，所述荧光基团为AMC，CMK，FMK。

如前述的短肽，X为酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)、甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)和丝氨酸(S)的任意一种或几种。

如前述的短肽，X为酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)和甘氨酸(G)中的任意一种或几种。

如前述的短肽，短肽中，谷氨酰胺的数量为3～7；

和/或，X的数量为1～4。

如前述的短肽，所述短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3、5、6、7或8所示；优选地，如SEQ ID NO.1、2、3所示。

如前述的短肽，所述N端化学修饰为乙酰化；和/或，C端化学修饰为酰胺化。

前述的短肽在制备疏水药物载体中的用途。

如前述的用途，所述载体是由所述短肽经自组装形成的纳米球。

如前述的用途，所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、姜黄素、多西他赛、多柔比星、长春新碱、喜树碱、羟基喜树碱、依托泊苷、维甲酸、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、替尼泊苷、柔红霉素、阿克拉霉素、索拉非尼、甲基泼尼松、米诺环素、顺铂、阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、胺碘酮、卡马西平、卡维地洛、氯丙嗪、西沙必利、氯苯砜、阿奇霉素、新霉素、两性霉素B、灰黄霉素、塞来昔布、雷洛昔芬、氯比洛芬、吲哚美辛、布洛芬、他莫昔芬、双氯芬酸、萘普生、吡罗昔康、拉替拉韦、依非韦伦、奈非那韦、阿扎那韦、利托那韦、西罗莫司、安体舒通、他克莫司、他林洛尔、特非那定、雌二醇、维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、丙泊酚、依托咪酯、全氟碳、地西泮、前列地尔、复合脂溶性维生素、地塞米松、氟比洛芬酯、丁酸氯维地平、鸦胆子油、环孢素、胰岛素、瑞德西韦、氯喹、羟氯喹、法匹拉韦、洛匹那韦、利托那韦等中的任意一种或几种的混合物；

优选地，所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、依托咪酯或丙泊酚。

一种疏水药物载体，所述载体是前述短肽自组装形成的纳米球。

一种纳米载体制剂，所述制剂以疏水药物为活性成分，以前述短肽自组装形成的纳米球为载体。

如前述的纳米载体制剂，短肽与疏水药物的含量比为5μmol：1～100mg。

如前述的纳米载体制剂，所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、姜黄素、多西他赛、多柔比星、长春新碱、喜树碱、羟基喜树碱、依托泊苷、维甲酸、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、替尼泊苷、柔红霉素、阿克拉霉素、索拉非尼、顺铂、甲基泼尼松、米诺环素、阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、胺碘酮、卡马西平、卡维地洛、氯丙嗪、西沙必利、氯苯砜、阿奇霉素、新霉素、两性霉素B、灰黄霉素、塞来昔布、雷洛昔芬、氯比洛芬、吲哚美辛、布洛芬、他莫昔芬、双氯芬酸、萘普生、吡罗昔康、拉替拉韦、依非韦伦、奈非那韦、阿扎那韦、利托那韦、西罗莫司、安体舒通、他克莫司、他林洛尔、特非那定、雌二醇、维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、丙泊酚、依托咪酯、全氟碳、地西泮、前列地尔、复合脂溶性维生素、地塞米松、氟比洛芬酯、丁酸氯维地平、鸦胆子油、环孢素、胰岛素、瑞德西韦、氯喹、羟氯喹、法匹拉韦、洛匹那韦、利托那韦等中的任意一种或几种的混合物；

优选地，当疏水药物为紫杉醇时，短肽与疏水药物的含量比为1μmol：1mg；

优选地，当疏水药物为阿霉素时，短肽与疏水药物的含量比为1μmol：1mg；

优选地，当疏水药物为依托咪酯时，短肽与疏水药物的含量比为5μmol：20mg。

优选地，当疏水药物为丙泊酚时，短肽与疏水药物的含量比为9.9μmol:100mg。

谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)和苏氨酸(T)这三个氨基酸，虽然在教科书上通常被分类为极性氨基酸(亲水性氨基酸)，但是因其侧链分别含有二亚甲基、苯环和甲基等疏水性基团，理论上也具有一定的疏水性，可作为一类非典型疏水性氨基酸为自组装提供疏水作用。同时，谷氨酰胺(Q)和天冬酰胺(N)侧链末端的酰胺基还可形成氢键促进自组装的发生。另一方面，谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)和甘氨酸(G)这些氨基酸侧链基团不带电荷，因此不会产生静电排斥作用，这一点也非常有利于自组装的发生。下表总结了上述这些不属于传统的疏水性氨基酸、但可能有利于短肽自组装发生的氨基酸的特征。

不同于传统的自组装短肽以典型疏水性氨基酸(丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P))为主要成分，本发明的短肽是主要由非典型疏水性氨基酸Q、Y、T组成的自组装短肽，是一种全新的设计。本发明的短肽，载药能力相比目前的短肽载体有明显提升，又能在水溶液中具有较好的分散性和稳定性；将本发明的短肽用作疏水性药物的载体制备成制剂，能够使药效达到接近现有脂质载体药物制剂的水平。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1Q5Y(a)、Q6TY(b)和Q7GY(c)装载芘后形成纳米球的TEM图像。比例尺＝100nm。

图2为Q5Y装载芘形成纳米粒悬液在14天之内的荧光光谱图。

图3为A5Y装载芘后形成不均匀纳米颗的TEM图像。比例尺＝100nm。

图4为A5Y装载芘形成纳米粒悬液在14天之内的荧光光谱图。

图5为Q5Y装载的紫杉醇(Q5Y-PTX)抑制卵巢癌细胞skov3的增殖效果图。

图6为Q6TY装载的阿霉素(Q6TY-DOX)抑制卵巢癌细胞skov3的增殖效果图。

图7为Q5Y、Q6TY和Q7GY对卵巢癌细胞skov3的作用效果图。

图8为Q5Y、Q6TY和Q7GY装载紫杉醇形成纳米球的TEM图像。

图9为Q5Y、Q6TY和Q7GY装载阿霉素形成纳米球的TEM图像。

图10为Q7GY装载依托咪酯形成纳米球的TEM图像。

图11为Q7GY装载丙泊酚形成纳米球的TEM图像。

图12为短肽Q5Y、Q3TY2、Q4GY2、Q4NY2、Q5A2SG结合硫磺素T后的荧光光谱，显示它们具有相似的自组装行为。

图13为短肽N5Y、S5Y、D5Y、E5Y、K5Y、R5Y和H5Y结合硫磺素T后的荧光光谱，显示它们不具有自组装行为。

图14为短肽Q3TY2、Q4GY2、Q4NY2、Q5A2SG装载模式疏水药物芘形成纳米球的TEM图像。

具体实施方式

实施例1:短肽对模式疏水化合物芘的装载

本发明材料：Ac-Gln-Gln-Gln-Gln-Gln-Tyr-NH₂，缩写为Q5Y，Ac表示乙酰基，在氨基酸序列表中为SEQ ID NO.1；Ac-Thr-Gln-Gln-Gln-Gln-Gln-Gln-Tyr-NH₂，缩写为Q6TY，在氨基酸序列表中为SEQ ID NO.2；Ac-Gly-Gln-Gln-Gln-Gln-Gln-Gln-Gln-Tyr-NH₂，缩写为Q7GY，在氨基酸序列表中为SEQ ID NO.3，委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成。

芘购置于Sigma-Aldrich公司。

将Q5Y，Q6TY，Q7GY分别按照5mM溶解于水中，超声5min。将20mg芘加入10mL短肽母液中，置于室温以2000rpm/min磁力搅拌4小时，再超声30min，形成稳定的乳白色悬液，置于4℃保存。

通过高分辨率透射电子显微镜观察形态特征。将上述悬液用水稀释5倍后，取10μL的样品溶液加在400目的铜网上5min，然后用一片滤纸吸干。再加入10μL 2％的磷钨酸染色3min。最终染色溶液用滤纸吸干并晾干。再采用透射电镜成像。

将上述Q5Y装载芘形成的悬液在室温静置，分别在第0天、7天和14天从顶层取出50μL悬液，用水稀释至500μL，然后用荧光分光光度计测量其在336nm波长激发下的荧光光谱。

结果：

从图1可以看出Q5Y，Q6TY，Q7GY装载芘后可形成粒径小于100nm，大小均匀、形状规则的纳米球。

从图2可以看出，Q5Y装载芘所得悬液的荧光光谱，其480nm处来自芘纳米粒的荧光在14天内基本保持不变，说明Q5Y装载芘形成的纳米粒悬液能在较长时间内保持其稳定性和均匀性。

实施例1的结果表明：Q5Y，Q6TY，Q7GY能够装载难溶的模式疏水化合物芘形成大小均匀的纳米球，使其在浓度高达2mg/mL时仍能形成性状稳定的乳液，说明这些短肽能够对疏水性化合物进行有效装载。

实施例2:短肽对模式疏水化合物芘的装载

短肽Ac-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Tyr-NH₂，缩写为A5Y，Ac表示乙酰基，在氨基酸序列表中为SEQ ID NO.4，委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成。

芘购置于Sigma-Aldrich公司。

将A5Y按照其最大溶解度(约0.5mM)溶解于水中，超声5min。将20mg芘加入10mL短肽母液中，置于室温以2000rpm/min磁力搅拌4小时，再超声30min，形成乳白色悬液，置于4℃保存。

将上述A5Y装载芘形成的悬液在室温静置，分别在第0天、7天和14天从顶层取出50μL悬液，用水稀释至500μL，然后用荧光分光光度计测量其在336nm波长激发下的荧光光谱。

结果：

从图3可以看出A5Y装载芘后形成的颗粒粒径大于100nm，大小不均匀、形状不规则。

从图4可以看出，A5Y装载芘所得悬液的荧光光谱，其480nm处来自芘纳米粒的荧光峰迅速下降，说明A5Y装载芘形成的悬液不很稳定，在静置过程中迅速发生沉淀。

实施例2的结果表明：主要由典型疏水性氨基酸组成的A5Y短肽虽然能够将模式疏水化合物芘分散形成纳米级的颗粒，但由于短肽自身溶解度有限，载药能力较差。具体表现为，形成的药物颗粒更大且大小不均匀，形状不规则，这使得形成的乳液性状极其不稳定，很快发生沉淀。上述结果说明，与本发明材料相比，由典型疏水性氨基酸组成的短肽不能装载疏水药物形成良好的制剂。

实施例3：短肽对紫杉醇的装载

材料：Q5Y委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；紫杉醇购置于大连美仑生物技术有限公司；无水乙醇购置于成都市科龙化工试剂厂。

短肽母液配置：将QSY按照1mM溶解于水中，超声5min。

紫杉醇母液配置：将紫杉醇粉末按照20mg/mL溶解于无水乙醇中。

将短肽母液10mL置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，将500μL紫杉醇母液用移液器逐滴加入短肽母液中(QSY与紫杉醇用量比为1μmol∶1mg)，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min，置于4℃保存。

实施例4：短肽对紫杉醇的装载

Q6TY委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；紫杉醇购置于大连美仑生物技术有限公司；无水乙醇购置于成都市科龙化工试剂厂。

短肽母液配置：将Q6TY按照1mM溶解于水中，超声15min。

将紫杉醇母液500μL置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，将10mL短肽母液用移液器逐滴加入紫杉醇母液中(Q6TY与紫杉醇用量比为1μmol∶1mg)，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min，置于4℃保存。

实施例5：短肽对紫杉醇的装载

Q7GY委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；紫杉醇购置于大连美仑生物技术有限公司；无水乙醇购置于成都市科龙化工试剂厂。

将Q7GY按照5mM和紫杉醇粉末5mg/mL共溶于2mL DMSO中(Q7GY与紫杉醇用量比为1μmol∶1mg)，超声5min；采用真空干燥器将有机溶剂去除，用10mL水复溶，再超声10min，置于4℃保存

实施例6：紫杉醇-短肽制剂对卵巢癌细胞的抑制作用

将人卵巢癌细胞skov3以5×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，孵育24小时。移除上清，加入不同浓度的紫杉醇-短肽制剂(按实施例2的方法制备)，以及相应浓度的泰素(市售紫杉醇药物制剂)作为对照，孵育48h后，用cck-8试剂法测定细胞活率。反映细胞活率的OD值采用微板荧光测定仪在490nm波长进行测定。

结果：

如图5所示，在PTX浓度在0.01μg/mL时，相比市售紫杉醇制剂泰素(Taxol)，本发明的紫杉醇-短肽制剂(Q5Y-PTX)对肿瘤细胞有更为显著的抑制作用；随着浓度的提升，药物抑制作用趋于饱和，但本发明制剂对卵巢癌细胞仍有更强的抑制作用。

实施例7：短肽对阿霉素的装载

试剂：盐酸阿霉素购置于大连美仑生物技术有限公司，三乙胺购置于成都市科龙化工试剂厂。

短肽母液配置：将Q5Y按照1mM溶解于水中，超声5min。

盐酸阿霉素脱盐：将盐酸阿霉素粉末10mg溶于10ml甲醇中，加入10μL三乙胺，磁力搅拌过夜，在真空装置下蒸干有机溶剂，获得阿霉素粉末。

阿霉素母液配置：将阿霉素粉末按照20mg/mL溶解于无水乙醇中。

将短肽母液10mL置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，将500μL阿霉素母液用移液器逐滴加入短肽母液中(Q5Y与阿霉素用量比为1μmol∶1mg)，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min，置于4℃保存。

实施例8：短肽对阿霉素的装载

短肽母液配置：将Q6TY按照1mM溶解于水中，超声5min。

将阿霉素母液500μL置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，将10mL短肽母液用移液器逐滴加入阿霉素母液中(Q6TY与阿霉素用量比为1μmol∶1mg)，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min，置于4℃保存。

实施例9：短肽对阿霉素的装载

将Q7GY按照5mM和阿霉素粉末5mg/mL(即Q7GY与阿霉素用量比为1μmol∶1mg)共溶于2mL DMSO中，超声5min；采用真空干燥器将有机溶剂去除，用10mL水复溶，再超声10min，置于4℃保存。

实施例10：阿霉素-短肽制剂对卵巢癌细胞的抑制作用

将人卵巢癌细胞skov3以5×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，孵育24小时。移除上清，加入不同浓度的阿霉素-短肽制剂(使用实施例7的方法制备)，以及相应浓度的盐酸阿霉素作为对照，孵育48h后，采用cck-8试剂法测定细胞活率。反映细胞活率的OD值采用微板荧光测定仪在490nm波长进行测定。

结果：

通过实验组和对照组的比较可以看出阿霉素-短肽制剂(Q6TY-DOX)对肿瘤细胞有显著的抑制作用，与对照组药物盐酸阿霉素相当(图6)。

实施例11：短肽对依托咪酯的装载

Q7GY委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；依托咪酯购置于大连美仑生物技术有限公司；无水乙醇购置于成都市科龙化工试剂厂。

短肽母液配置：Q7GY按照0.5mM溶解于0.9％生理盐水中，涡旋后超声10min。

称取20mg依托咪酯，加入10mL短肽母液(Q7GY与依托咪酯用量之比为5μmol∶20mg)中，涡旋后超声20min，再置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，搅拌40min，室温保存。

实施例12：大鼠尾静脉单次注射依托咪酯-短肽制剂的麻醉效果

使用健康成年雄性SD大鼠(体重：295±14g)。将大鼠放置于固定器，露出尾巴，找到侧边的尾静脉，酒精擦拭后留置针置管给药(依托咪酯-短肽制剂使用实施例10的方法制备)。按照0.1mL/s给药速度匀速给予0.6mL药物，给药完毕后，推0.05mL空气以保证药物完全进入尾静脉后拔出留置针，棉签按压止血。快速取出大鼠并将其放置于空笼位中，观察大鼠反应进行镇静评分并记录不良反应。镇静评分(Psychopharmacology 1996，125：105-112)：四肢肌张力正常，能保持自主活动且反应灵敏0分；明显的趋触性运动(大鼠趋向于停留在靠近笼子边缘的位置)1分；后退平衡失调2分；前肢直立不到60度，共济失调3分；俯卧，不能站立，只能靠腹部支撑4分；翻正反射消失5分。翻正反射消失的观察(Anesthesiology2000，93(3)：837-843)：翻正反射消失且持续超过30秒记为“+”，否则记为“-”。

从1mg/kg剂量开始进行爬坡实验，分别找出一个“+”和“-”的剂量，作为ED₅₀(半数有效量，能引起50％最大反应强度的药量)实验的给药参考范围。序贯法测定ED₅₀，从低剂量开始给药，观察大鼠镇静效果，若为“-”，则下一只给药剂量减小(r＝1.5，等比)，若为“+”则下一只给药剂量等比加大；从“-”到“+”或“+”到“-”为一个交叉，出现5次同向交叉实验终止。采用dixon-mood法(ED₅₀＝lg-1(∑C/∑t))计算出药物在大鼠体内的ED₅₀。并算出95％可信区间95％CI＝lg-1(lgED₅₀±1.96slgED₅₀)，slgED₅₀＝{[∑M-(∑C)2/∑t]/(∑t·(∑t-1)}1/2。

根据测得的ED₅₀，按照上述给药方法对大鼠进行单次尾静脉注射2ED₅₀药物，观察大鼠的镇静效果。

结果：

通过与临床使用的依托咪酯脂肪乳制剂(福尔利)对比，可以看出依托咪酯-短肽制剂与依托咪酯市售制剂(福尔利)的麻醉效果相当，且无明显不良反应发生(表1)。

表1依托咪酯-短肽制剂与依托咪酯(福尔利)的药效对比

实施例13：短肽对丙泊酚的装载

Q7GY委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；丙泊酚购置于Sigma-Aldrich公司。

短肽母液配置：Q7GY按照1mM溶解于0.9％生理盐水中，涡旋后超声10min。

将丙泊酚取100mg，滴加至9.9mL短肽母液中，涡旋后超声20min，再置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，搅拌40min，室温保存。

实施例14：大鼠尾静脉单次注射丙泊酚-短肽制剂的麻醉效果

使用健康成年雄性SD大鼠(体重：295±14g)。将大鼠放置于固定器，露出尾巴，找到侧边的尾静脉，酒精擦拭后留置针置管给药(丙泊酚-短肽制剂使用实施例11的方法制备)。按照0.1mL/s给药速度匀速给予0.6mL药物，给药完毕后，推0.05mL空气以保证药物完全进入尾静脉后拔出留置针，棉签按压止血。快速取出大鼠并将其放置于空笼位中，观察大鼠反应进行镇静评分并记录不良反应(CFDA“药物单词给药毒性指导原则”(征求意见稿2013-05-26))。镇静评分(Psychopharmacology 1996，125：105-112)：四肢肌张力正常，能保持自主活动且反应灵敏0分；明显的趋触性运动(大鼠趋向于停留在靠近笼子边缘的位置)1分；后退平衡失调2分；前肢直立不到60度，共济失调3分；俯卧，不能站立，只能靠腹部支撑4分；翻正反射消失5分。翻正反射消失的观察(Anesthesiology 2000，93(3)：837-843)：翻正反射消失且持续超过30秒记为“+”，否则记为“-”。

从1mg/kg剂量开始进行爬坡实验，分别找出一个“+”和“-”的剂量，作为ED₅₀实验的给药参考范围。序贯法测定ED₅₀，从低剂量开始给药，观察大鼠镇静效果，若为“-”，则下一只给药剂量减小(r＝1.5，等比)，若为“+”则下一只给药剂量等比加大；从“-”到“+”或“+”到“-”为一个交叉，出现5次同向交叉实验终止。采用dixon-mood法(ED₅₀＝lg-1(∑C/∑t))计算出药物在大鼠体内的ED₅₀。并算出95％可信区间95％CI＝lg-1(lgED₅₀±1.96slgED₅₀)，slgED₅₀＝{[∑M-(∑C)2/∑t]/(∑t·(∑t-1)}1/2。

结果：

通过与临床使用的丙泊酚脂肪乳制剂(得普利麻)对比ED₅₀，可以看出丙泊酚-短肽制剂比临床丙泊酚市售制剂(得普利麻)的麻醉效果略好(表2)。

表2丙泊酚-短肽制剂与丙泊酚(得普利麻)的ED₅₀对比

实施例15：短肽对卵巢癌细胞的作用

将人卵巢癌细胞skov3以5×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，孵育24小时。移除上清，加入不同浓度的Q5Y、Q6TY和Q7GY短肽，孵育48h后，采用cck-8试剂法测定细胞活率。反映细胞活率的OD值采用微板荧光测定仪在490nm波长进行测定。

通过结果可以看出Q5Y、Q6TY和Q7GY短肽对肿瘤细胞没有显著的抑制，证明其没有明显的细胞毒性(图7)。

实施例16：纳米结构表征

通过高分辨率透射电子显微镜(TEM)观察Q5Y、Q6TY、Q7GY装载紫杉醇、阿霉素、依托咪酯、丙泊酚等疏水性药物形成的纳米球形态特征。

10μL的样品溶液加在400目的铜网上5min，然后用一片滤纸吸干。再加入10μL 2％的磷钨酸染色3min。最终染色溶液用滤纸吸干并晾干。再采用透射电镜成像。

从图8～图11可以看出短肽包载药物成为纳米级球状胶束。

该结果表明：疏水性氨基酸的数目可以在一定范围中变化，不会从本质上改变短肽自组装形成纳米载体的能力。

另外，以非典型疏水性氨基酸Q为主要成份，Q、Y、T按照不同排列组合组成的多肽，再辅N、S、G等其它不带电荷的氨基酸和A、V、L、I、F等传统的疏水性氨基酸，不会从本质上改变本发明短肽自组装形成纳米载体的能力。以下将对此举例说明：

实施例17：不同短肽自组装能力的表征

Q5Y、Q3TY2、Q4GY2、Q4NY2、Q5A2SG、N5Y、S5Y、D5Y、E5Y、K5Y、R5Y和H5Y短肽委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成。

Q3TY2、Q4GY2、Q4NY2、Q5A2SG、N5Y、S5Y、D5Y、E5Y、K5Y、R5Y和H5Y序列如表3所示。

表3 Q3TY2、Q4GY2、Q4NY2和Q5A2SG的氨基酸序列

注：Ac表示乙酰基。

将各短肽配成0.5mM的水溶液，在每500μL短肽溶液中加入终浓度为10μM的硫磺素T(thioflavin T，ThT，购自Sigma-Aldrich公司)，用荧光分光光度计测定其460～600nm范围内的荧光光谱(激发波长设定为450nm)，从而判断其是否存在与Q5Y相似的自组装行为。

结果：

如图12所示，所有以Q、Y、T为主要成分的短肽均在490nm附近出现典型的ThT荧光峰，表明这些短肽都与Q5Y一样具有相似的自组装行为。而当Q5Y中所有的Q都被替换为同样为极性氨基酸、但不含有疏水基团的N、S、D、E、K、R或H后，如图13所示，得到的N5Y、S5Y、D5Y、E5Y、K5Y、R5Y和H5Y短肽均没有显示出典型的ThT荧光峰，表明由这些不含疏水基团的极性氨基酸组成的短肽不具有自组装行为。

实施例18：不同短肽装载模式疏水药物芘形成纳米球的表征

Q3TY2、Q4GY2、Q4NY2、Q5A2SG短肽委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；芘购自Sigma-Aldrich公司。

短肽母液配置：将各短肽按照1mM溶解于水中，超声5min。

将短肽母液10mL置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，将20mg芘加入短肽母液中，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min，置于4℃保存。

通过高分辨率透射电子显微镜观察形态特征。10μL的样品溶液加在400目的铜网上5min，然后用一片滤纸吸干。再加入10μL 2％的磷钨酸染色3min。最终染色溶液用滤纸吸干并晾干。再采用透射电镜成像。

结果：

从图14可以看出各短肽均能包载芘形成大小均匀的纳米球结构。

实施例17～18的结果表明，具有本发明通式Q_mX_n(m为2～10，n为0～5)所述结构的各种短肽具有相似的自组装行为，可包裹疏水性药物形成纳米球结构。因此可以合理推断：具有本发明通式具有通式Q_mX_n(m为2～10，n为0～5)所述结构的短肽包裹疏水性药物形成的复合物，均能产生与Q5Y包裹疏水性药物所形成复合物类似的药效。

综上，本发明的短肽可以有效包裹疏水性药物，形成纳米球，其药效与市售的以脂质为载体的制剂相当。同时，以本发明的短肽为载体开发的制剂，由于不含有传统的脂质材料，因此能够避免脂质载体引起的高血脂、脂质代谢异常等副作用，具有更好的安全性。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种基于非典型疏水性氨基酸的自组装短肽及其应用

<130> GYKH1533-2020P0110203CC

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Gln Gln Gln Gln Gln Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Tyr

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Tyr

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Ala Ala Ala Ala Ala Tyr

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

Thr Gln Gln Tyr Gln Tyr

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

Gln Gln Gly Tyr Gln Gln Tyr

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

Gln Gln Asn Tyr Tyr Gln Gln

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

Gln Gln Gly Ala Ala Gln Gln Gln Ser

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

Asn Asn Asn Asn Asn Tyr

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

Ser Ser Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

Asp Asp Asp Asp Asp Tyr

1 5

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

Glu Glu Glu Glu Glu Tyr

1 5

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

Lys Lys Lys Lys Lys Tyr

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

Arg Arg Arg Arg Arg Tyr

1 5

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

His His His His His Tyr

1 5

Claims

1.一种短肽，其特征在于：它由2～10个谷氨酰胺和0～5个氨基酸X组成；

2.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于：所述短肽的N端和/或C端带有化学修饰；

N端化学修饰择一地选自：烷酰基化，生物素标记，脂肪酸修饰，苯甲酰化，2-氨基苯甲酰化，马来酰亚胺，卤代烷酰基化，琥珀酰化，联肼尼克酰胺，荧光基团标记；优选地，所述荧光基团为FAM、FITC或TAMRA；

3.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于：X为酪氨酸、苏氨酸、甘氨酸、天冬酰胺和丝氨酸的任意一种或几种；

优选地，X为酪氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的任意一种或几种。

4.根据权利要求3所述的短肽，其特征在于：短肽中，谷氨酰胺的数量为3～7；

和/或，X的数量为1～4。

5.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于：所述短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3、5、6、7或8所示；优选地，如SEQ ID NO.1、2、3所示。

6.根据权利要求1-5任一所述的短肽，其特征在于：所述N端化学修饰为乙酰化；和/或，C端化学修饰为酰胺化。

7.权利要求1-6任一所述的短肽在制备疏水药物载体中的用途。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述载体是由所述短肽经自组装形成的纳米球。

9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于：所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、姜黄素、多西他赛、多柔比星、长春新碱、喜树碱、羟基喜树碱、依托泊苷、维甲酸、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、替尼泊苷、柔红霉素、阿克拉霉素、索拉非尼、甲基泼尼松、米诺环素、顺铂、阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、胺碘酮、卡马西平、卡维地洛、氯丙嗪、西沙必利、氯苯砜、阿奇霉素、新霉素、两性霉素B、灰黄霉素、塞来昔布、雷洛昔芬、氯比洛芬、吲哚美辛、布洛芬、他莫昔芬、双氯芬酸、萘普生、吡罗昔康、拉替拉韦、依非韦伦、奈非那韦、阿扎那韦、利托那韦、西罗莫司、安体舒通、他克莫司、他林洛尔、特非那定、雌二醇、维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、丙泊酚、依托咪酯、全氟碳、地西泮、前列地尔、复合脂溶性维生素、地塞米松、氟比洛芬酯、丁酸氯维地平、鸦胆子油、环孢素、胰岛素、瑞德西韦、氯喹、羟氯喹、法匹拉韦、洛匹那韦、利托那韦等中的任意一种或几种的混合物；

10.一种疏水药物载体，其特征在于：所述载体是权利要求1-6任一所述短肽自组装形成的纳米球。

11.一种纳米载体制剂，其特征在于：所述制剂以疏水药物为活性成分，以权利要求1-6任一所述短肽自组装形成的纳米球为载体。

12.根据权利要求11所述的纳米载体制剂，其特征在于：短肽与疏水药物的含量比为5μmol：1～100mg。

13.根据权利要求11或12所述的纳米载体制剂，其特征在于：所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、姜黄素、多西他赛、多柔比星、长春新碱、喜树碱、羟基喜树碱、依托泊苷、维甲酸、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、替尼泊苷、柔红霉素、阿克拉霉素、索拉非尼、顺铂、甲基泼尼松、米诺环素、阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、胺碘酮、卡马西平、卡维地洛、氯丙嗪、西沙必利、氯苯砜、阿奇霉素、新霉素、两性霉素B、灰黄霉素、塞来昔布、雷洛昔芬、氯比洛芬、吲哚美辛、布洛芬、他莫昔芬、双氯芬酸、萘普生、吡罗昔康、拉替拉韦、依非韦伦、奈非那韦、阿扎那韦、利托那韦、西罗莫司、安体舒通、他克莫司、他林洛尔、特非那定、雌二醇、维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、丙泊酚、依托咪酯、全氟碳、地西泮、前列地尔、复合脂溶性维生素、地塞米松、氟比洛芬酯、丁酸氯维地平、鸦胆子油、环孢素、胰岛素、瑞德西韦、氯喹、羟氯喹、法匹拉韦、洛匹那韦、利托那韦等中的任意一种或几种的混合物；

优选地，所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、依托咪酯或丙泊酚；

优选地，当疏水药物为依托咪酯时，短肽与疏水药物的含量比为5μmol：20mg；