KR20120120492A - 시트룰린화된 에피토프에 대해 유도된 소염제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 및 동물에서 염증을 치료 또는 예방하는 분야에 속하며, 다양한 염증 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 시트룰린 관련 염증 질환과 같은 염증 상태를 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 염증 상태의 치료 및 예방에 사용하기 위한 시트룰린-함유 에피토프에 대해 유도된 특이적 결합 분자를 제공한다.

Description

시트룰린화된 에피토프에 대해 유도된 소염제{ANTI-INFLAMMATORY AGENTS DIRECTED AGAINST CITRULLINATED EPITOPES}

본 발명은 인간 및 동물에서 염증을 치료 또는 예방하는 분야에 속하며, 다양한 염증 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 시트룰린 관련 질환, 바람직하게는 염증 질환, 보다 바람직하게는 염증성 관절염, 예를 들면, 류마티스성 관절염과 같은 염증 상태를 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 염증성 관절염, 바람직하게는 류마티스성 관절염과 같은 염증 상태의 치료 및 예방에 사용하기 위한 시트룰린-함유 에피토프에 대해 유도된 특이적 결합 분자를 제공한다.

염증 상태는 만성이든 급성이든 건강관리 산업에서 상당한 문제를 나타낸다. 간략하게, 만성 염증은 활동성 염증, 조직 파괴 및 치료 시도가 동시에 진행되는 연장된 기간(수주 또는 수개월)의 염증인 것으로 간주된다[Robbins Pathological Basis of Disease by R.S. Cotran, V. Kumar, and S. L. Robbins, W. B. Saunders Co., p.75 (1989)]. 만성 염증은 급성 염증 증상에 이어질 수 있지만, 또한 상기 만성 염증은, 예를 들면, 지연성 과민 반응, 내인성(예를 들면, 상승된 혈장 지질) 또는 외인성(예를 들면, 실리카, 석면, 담배 타르, 수술용 봉합사) 독소에 대한 장기 노출, 또는 신체 자기 조직에 대한 자가면역 반응(예를 들면, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 건선)을 야기하는 지속성 감염(예를 들면, 결핵, 매독, 진균 감염)의 결과로서 시간에 따라 진행되는 잠행성 과정으로서 시작될 수 있다.

염증성 관절염은, 특히 증가하는 수의 고령 인구를 고려할 때 선진국에서 심각한 건강상 문제이다. 예를 들면, 염증성 관절염의 한 형태인 류마티스성 관절염(RA)은 전세계 인구의 1 내지 2%에 영향을 미치고 있는 다기관, 만성, 재발성 염증 질환이다.

많은 장기들이 영향을 받을 수 있지만, RA는 기본적으로, 때때로 발병된 관절의 파괴 및 강직을 초래하는 만성 활막염의 중증 형태이다[Robbins Pathological Basis of Disease, by R.S. Cotran, V. Kumar, and S.L. Robbins, W.B. Saunders Co., (1989)]. 병리학적으로, 상기 질환은 관절 공간내로 연장되는 융모 돌기를 형성하는 활막의 현저한 비후, 활막세포 내벽의 다층화(활막세포 증식), 백혈구 세포에 의한 활막의 침윤(대식세포, 림프구, 형질 세포 및 림프 소포; "염증성 활막염"으로 지칭), 및 활막내 세포 괴사에 의한 섬유소 침착을 특징으로 한다. 이러한 과정의 결과로 형성된 조직은 판누스(pannus)로 불리며, 결국 판누스는 커져서 관절 공간을 가득 채우게 된다. 판누스는 활막염의 진전에 필수적인 혈관신생 과정을 통해 새로운 혈관의 광범위한 망을 발생시킨다. 판누스 조직의 세포로부터 소화 효소(매트릭스 메탈로프로테이나제(예를 들면, 콜라게나제, 스트로멜리신)), 및 염증 과정의 다른 매개체(예를 들면, 과산화수소, 초과산화물, 리소좀 효소, 및 아라카돈산 대사 산물)의 배출은 연골 조직의 진행성 파괴를 초래한다. 판누스는 관절 연골을 침범하여 연골 조직의 침식 및 골편화를 유발한다. 결국, 관련된 관절의 섬유성 강직, 및 궁극적으로는 골성 강직과 함께 연골하골의 침식이 존재한다.

일반적으로, RA는 자가면역 질환이며 많은 상이한 관절성 자극이 면역유전학적으로 민감한 숙주에서 면역 반응을 활성화시키는 것으로 생각된다. 외인성 감염원(엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 풍진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 헤르페스 바이러스, 인간 T-세포 림프영양성 바이러스, 마이코플라스마(Mycoplasma) 등) 및 내인성 단백질, 예를 들면, 콜라겐, 프로테오글리칸, 변형된 면역글로불린 및 번역후 변형된 단백질, 예를 들어, 시트룰린화 단백질은 모두 부적절한 숙주 면역 반응을 유발하는 원인 인자로서 관련되었다. 유발 물질과 무관하게, 자가면역은 질환의 진행에 관여한다. 특히, 적절한 항원은 항원-제시 세포(활막의 대식세포 또는 수지상 세포)에 의해 섭취되고, 처리되고, T 림프구에 제공된다. T 세포는 세포 면역 반응을 개시하고 B 림프구의 증식 및 B 림프구의 형질 세포로의 분화를 자극한다. 최종 결과는 숙주 조직에 대해 유도된 과도한 부적절한 면역 반응(예를 들면, II형 콜라겐에 대해 유도된 항체, 자가유래 IgG의 Fc 부분에 대해 유도된 항체("류마티스 인자(Rheumatoid Factor)"로 불림), 및 상이한 시트룰린화된 에피토프에 대해 유도된 항체(항-CCP))의 생성이다. 이것은 면역 반응을 더 증폭시키고 연골 조직의 파괴를 촉진시킨다. 일단 상기 단계적 반응이 개시되면, 연골 파괴의 많은 매개체들이 류마티스성 관절염의 진행의 원인이 된다.

상기 언급한 항-CCP 항체는 RA에 매우 특이적인 것으로 입증되었다. 최근의 증거들은 상기 항체에 혈청반응양성인 각각의 개인이 이미 RA를 가지거나 또는 미래에 상기 질환을 유발할 것임을 보여준다. 항-CCP 항체의 존재(특히 높은 역가가 존재하는 경우)는 미란성 질환 결과를 예측한다[Nijenhuis et al., Clin. Chim. Acta, vol 350, 17-34 (2004)]. 또한, 항-CCP 항체는 염증 부위에서 국소적으로 생성되는 것으로 입증되었다. RA 환자의 활막 물질에서 발견된 전체 IgG에 대한 항-CCP 항체의 비율은 동일 환자의 혈청에서 발견된 값보다 훨씬 더 높은 것으로 나타났다[Masson-Bessiere et al., Clin Exp Immunol, vol 119, 544-552 (2000); Reparon-Schuijt et al., Arthritis Rheum, vol 44, 41-47 (2001)].

활막내 항-CCP 생성 형질 세포의 존재는 염증 부위에서 CCP-특이적 B 세포의 항원-유도된 성숙을 나타낸다. 일단 항-CCp 항체가 생성되면, 활막에서 시트룰린화 단백질과의 면역 복합체의 형성이 염증 과정의 진행을 유발할 수 있다. 상기 및 기타 데이터는 항-CCP 항체가 실제로 RA의 질환 증상의 적어도 일부분을 야기했다는 가설을 뒷받침하였다. RA의 발병과정에서 항-CCP 항체의 역할은 RA를 갖는 환자에서 B 림프구 감소 실험의 결과에 의해 뒷받침된다[Cambridge et al., Arthritis Rheum, vol 48, 2146-2154 (2003)].

진전된 류마티스성 관절염을 갖는 사람들은 일부 형태의 암보다 큰 사망률을 가지며, 이 때문에 치료법은 비가역적 관절 손상 가능성을 감소시키기 위해 고안된 공격적 조기 약물 요법 쪽으로 옮겨졌다. 미국 류마티스 학회(American College of Rheumatology)의 최근의 권장사항[Arthritis and Rheumatism 39(5):713-722 (1996)]은 확정된 진단 및 진행중인 증상을 갖는 임의의 환자에 대해 질환-조절 항-류마티스성 약물(DMARD) 요법의 조기 개시를 포함한다. 항암 약물은 대다수의 환자에게 1차 치료법이 되어왔으며, 화학치료 약물인 메토트렉세이트가 60 내지 70%의 류마티즘학자에게 선택되는 약물이다. 질환의 중증도는 흔히 상기 약물에 의한 무기한의 주 1회 치료를 허가하며, 메토트렉세이트 치료에도 불구하고 질환이 진행되는 환자에서(환자의 50% 이상), 사이클로스포린 및 아자티오프린(단독으로 또는 함께)과 같은 2차적 화학치료 약물이 흔히 사용된다.

염증성 질환, 특히 활막이 관련되는 질환 및 시트룰린 관련 염증 질환의 발병을 억제할 수 있는 염증 질환의 치료 또는 예방을 위한 화합물에 대한 요구가 존재한다.

본 발명은 염증 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, p15 및/또는 p17 상의 시트룰린화된 에피토프와 특이적으로 반응하는 결합 분자를 제공한다.

p15 및 p17은 본원에서 인간 PAD4 및/또는 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 2A 및/또는 히스톤4, 및/또는 인간 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 H3으로 동정된다.

본 발명은 또한 p15 및/또는 p17 상의 시트룰린화된 에피토프와 특이적으로 반응하는 결합 분자를 포함하는 치료효과량의 소염 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물 및 방법은 시트룰린 잔기와 반응하는 특이적 결합 분자의 약학적으로 허용되는 제형을 포함한다. 특히, 상기 결합 분자는 p15 및 p17로 지칭되는, 본원에서 확인된 바와 같은 2개의 폴리펩티드 상의 시트룰린화된 에피토프와 특이적으로 반응한다.

본 발명은 또한 본원에서 동정된 바와 같은 폴리펩티드 및 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 상기 및 기타 측면들은 하기의 상세한 설명, 도면 및 실시예를 참조할 때 명백해질 것이다. 또한, 특정 절차, 장치 또는 조성물을 보다 상세히 기술하고 있는 다양한 참조문헌들이 본원에 언급되어 있으며, 따라서 그 전체로 본원에 참고로 인용된다.

도 1: 콜라겐 항체 유도된 관절염(CAIA) 모델을 사용하여 관절염 증상의 중증도에 대한 8개의 단클론성 항체의 영향을 시험하였다. 평균 관절염 스코어(도 1a, 1c 및 1e) 및 관절염 발병률(도 1b, 1d 및 1f)을 나타내었다. 5 내지 6 마리 마우스의 군들을 제 0 일에 복강내 주사를 통해 항-콜라겐 항체로 처리하였다. 도 1a 및 1b에 나타낸 실험에 사용된 마우스는 1.6 mg의 항-콜라겐 항체 혼합물을 투여받은 반면, 도 1c 내지 1f에 사용된 마우스는 2.4 mg을 투여받았다. 항-시트룰린 또는 대조군 항체(RhmAb2.201)와 함께 LPS(25 ㎍/마우스)를 제 3 일에 복강내 주사에 의해 투여하였다. 모든 항체는 그래프에서 달리 언급되지 않는 한 1 mg/마우스로 투여되었다. 동물들은 제 13 일까지 매일 스코어를 기록하였다.
도 2: 효소 결합 면역흡착 측정법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)을 사용하여 huPAD2 또는 huPAD4로 탈이민화된 인간 재조합 히스톤(H1, H2A, H2B, H3 및 H4)에 대한 a) RhmAb2.101 및 b) RhmAb2.102의 친화도를 검사하였다. 탈이민화 및 비-탈이민화 히스톤을 96-웰 ELISA 플레이트(0.3 ㎍/웰) 상에 고정화시켰다. CFC-1 및 CFC-0을 동일 농도로 코팅하여 각각 특이적 항-시트룰린 반응성에 대한 양성 및 음성 대조군으로 및 코팅 대조군으로 사용하였다. 비코팅 웰을 사용하여 항체의 비특이적 결합에 대해 검사하였다. 코팅된 웰을 실온에서 1 시간동안 10 내지 0.000128 ㎍/웰 범위의 항체 연속 희석물과 함께 배양하였다(z-축). 결합된 항-시트룰린 항체의 검출은 웰을 실온에서 1 시간동안 토끼-항-인간-HRP(1:2000)와 함께 배양한 후 TMB 기질과 함께 배양하여 수행하였다. 수득된 OD(y-축)는 항체 결합에 대한 척도이다. H1 = 재조합 히스톤; H1/p2 = huPAD2 재조합 히스톤 1; H1/p4 = huPAD4 재조합 히스톤 1 등(x-축).
도 3: 효소 결합 면역흡착 측정법(ELISA)을 사용하여 인간 히스톤 H2A로부터 유도된 시트룰린 함유 펩티드에 대한 a) RhmAb2.101, b) RhmAb2.102 및 c) RhmAb2.104의 친화도를 검사하였다. 히스톤 2A로부터 유도된 비오틴 및 시트룰린 함유 펩티드를 뉴트라비딘 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트(0.3 ㎍/웰) 상에 고정화시켰다. CFC-1 및 CFC-0을 동일 농도로 코팅하여 각각 특이적 항-시트룰린 반응성에 대한 양성 및 음성 대조군으로 및 코팅 대조군으로 사용하였다. 비코팅 웰을 사용하여 항체의 비특이적 결합에 대해 검사하였다. 코팅된 웰을 실온에서 1 시간동안 10 내지 0.000128 ㎍/웰 범위의 항체 연속 희석물과 함께 배양하였다(z-축). 결합된 항-시트룰린 항체의 검출은 웰을 실온에서 1 시간동안 토끼-항-인간-HRP(1:2000)와 함께 배양한 후 TMB 기질과 함께 배양하여 수행하였다. 수득된 OD(y-축)는 항체 결합에 대한 척도이다.
도 4: 효소 결합 면역흡착 측정법(ELISA)을 사용하여 피브리노겐 및 비멘틴으로부터 유도된 시트룰린 함유 펩티드에 대한 a) RhmAb2.101 및 b) RhmAb2.102의 친화도를 검사하였다. 피브리노겐 및 비멘틴으로부터 유도된 비오틴 및 시트룰린 함유 펩티드를 뉴트라비딘 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트(0.3 ㎍/웰) 상에 고정화시켰다. CFC-1 및 CFC-0을 동일 농도로 코팅하여 각각 특이적 항-시트룰린 반응성에 대한 양성 및 음성 대조군으로 및 코팅 대조군으로 사용하였다. 비코팅 웰을 사용하여 항체의 비특이적 결합에 대해 검사하였다. 코팅된 웰을 실온에서 1 시간동안 10 내지 0.000128 ㎍/웰 범위의 항체 연속 희석물과 함께 배양하였다(z-축). 결합된 항-시트룰린 항체의 검출은 웰을 실온에서 1 시간동안 토끼-항-인간-HRP(1:2000)와 함께 배양한 후 TMB 기질과 함께 배양하여 수행하였다. 수득된 OD(y-축)는 항체 결합에 대한 척도이다.
도 5: 콜라겐 항체 유도된 관절염(CAIA) 모델을 사용하여 발에서 시트룰린 출현을 조사하였다. 3 마리 마우스의 군들을 제 0 일에 복강내 주사에 의해 2.8 mg 항-콜라겐 항체로 처리한 후, 제 3 일에 LPS(25 ㎍/마우스)로 추가로 복강내 주사하였다. 평균 관절염 스코어 및 관절염 발병률을 도 5a 및 5b에 각각 나타내었다.
도 6: 콜라겐 항체 유도된 관절염(CAIA) 모델을 사용하여 항-콜라겐 항체 주사후 제 7 일에 제공된 경우 RhmAb2.102의 치료 효과를 검사하였다. 모든 발의 평균 관절염 스코어(도 6a) 및 우측 뒷발의 평균 관절염 스코어(도 6b)를 나타내었다. 5 마리 마우스의 군을 제 0 일에 복강내 주사에 의해 2.8 mg의 항-콜라겐 항체로 처리하였다. LPS(25 ㎍/마우스)를 제 3 일에 복강내 주사에 의해 투여하였고, RhmAb2.102(1 mg/마우스) 또는 위약을 제 7 일에 동일한 경로로 주사하였다. 동물들은 제 35 일까지 매일 스코어를 기록하였다. RhmAb2.102는 존재하는 염증을 최소한 안정화시킨 것이 관찰되었다.
도 7: 제 7 일에 RhmAb2.102 또는 위약으로 처리한 모든 CAIA 동물의 우측 뒷발의 헤마톡실린(Haematoxylin)/에오신 및 사프라닌 O 염색된 조직 슬라이드에 조직학적 분석을 수행하였다(도 7). 염색된 조직 슬라이드에 대해 다음의 파라미터를 스코어(0 내지 3의 임의적 스코어)를 기록하였다: 연골 침식(b), 골 침식(c), 염증 세포 유입(d), 연골 PG 감소(e) 및 연골세포 사멸(f). 도 7a는 실험의 최종일(제 35 일)에 실험군들 사이에서 우측 뒷발에 육안으로 보이는 염증을 나타낸 것이다. 각각의 점은 단일 동물을 나타낸다. 수평선은 실험군내의 평균 스코어를 나타낸다. RhmAb2.102 주사는 마우스를 연구적 관절 손상으로부터 보호하는 것으로 결론지을 수 있다.
도 8: 콜라겐 항체 유도된 관절염(CAIA) 모델을 사용하여 항-콜라겐 항체 주사후 제 3, 5, 6 및 7 일에 제공된 경우 RhmAb2.102의 치료 효과를 검사하였다. 5 마리 마우스의 군을 제 0 일에 복강내 주사에 의해 2.8 mg의 항-콜라겐 항체로 처리하였다. LPS(25 ㎍/마우스)를 제 3 일에 복강내 주사에 의해 투여하였다. RhmAb2.102(1 mg/마우스)를 제 3, 5, 6 또는 7 일에 정맥내 주사하였다. 동물들은 제 19 일까지 매일 스코어를 기록하였다. 그래프는 각 실험군에 대한 평균 관절염 스코어를 나타낸다. RhmAb2.102는 치료 개시시 수준에 필적하는 수준에서 염증을 최소한 안정화시키는 것으로 또한 결론지을 수 있다. 다이아몬드: 대조군, 원: 제 7 일, 빈 원: 제 6 일, 사각형: 제 5 일 및 삼각형: 제 3 일.
도 9: 콜라겐 항체 유도된 관절염(CAIA) 모델을 사용하여 항-콜라겐 항체 주사후 제 3 일에 제공된 경우 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112의 소염 효과를 검사하였다. 3 마리 마우스의 군을 제 0 일에 복강내 주사에 의해 2.8 mg의 항-콜라겐 항체로 처리하였다. LPS(25 ㎍/마우스)를 제 3 일에 복강내 주사에 의해 투여하고, RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112(1 mg/마우스) 또는 위약을 같은 날에 정맥내 주사에 의해 주사하였다. 동물들은 제 14 일까지 매일 스코어를 기록하였다. 모든 새로운 항체 RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112는 RhmAb2.102보다 높은 소염 효과를 나타내었다.
도 10: 콜라겐 항체 유도된 관절염(CAIA) 모델을 사용하여 RhmAb2.102, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102의 소염 효과를 검사하였다. 3 마리 마우스의 군을 제 0 일에 2.8 mg의 항-콜라겐 항체의 복강내 주사로 처리하였다. LPS(25 ㎍/마우스), 및 RhmAb2.102, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102(6 mg/마우스) 및 위약을 제 3 일에 복강내 주사에 의해 투여하였다. 모든 동물들은 제 10 일까지 매일 염증에 대해 스코어를 기록하였다.
도 11: 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)을 사용하여 huPAD2 또는 huPAD4로 탈이민화된 인간 재조합 히스톤(H1, H2A, H2B, H3 및 H4)에 대한 a) RhmAb2.102, b) RhmAb2.108, c) RhmAb2.109, d) RhmAb2.110, e) RhmAb2.111, f) RhmAb2.112, g) RmmAb22.101 및 h) RmmAb22.102의 친화도를 검사하였다. 탈이민화 및 비-탈이민화 히스톤, 및 BSA를 96-웰 ELISA 플레이트(0.3 ㎍/웰) 상에 고정화시켰다. CFC-1, CFC-0, 서열번호 21을 동일 농도로 코팅하여 각각 특이적 항-시트룰린 반응성에 대한 양성 및 음성 대조군으로 및 코팅 대조군으로 사용하였다. 비코팅 웰을 사용하여 항체의 비특이적 결합에 대해 검사하였다. 코팅된 웰을 RT에서 1 시간동안 2.5 내지 0.0004 ㎍/웰 범위의 항체 연속 희석물과 함께 배양하였다(z-축). 결합된 항-시트룰린 항체의 검출은 웰을 실온에서 1 시간동안 토끼-항-인간-HRP(1:2000)와 함께 배양한 후 TMB 기질과 함께 배양하여 수행하였다. 수득된 OD(y-축)는 항체 결합에 대한 척도이다. H1 = 재조합 히스톤; H1/p2 = huPAD2 재조합 히스톤 1; H1/p4 = huPAD4 재조합 히스톤 1 등(x-축).

본 발명은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, p15 및/또는 p17 상의 시트룰린화된 에피토프와 특이적으로 반응하는 결합 분자를 제공한다.

용어 "특이적 결합 분자"는 본원에서 특이적으로 결합할 수 있는 분자, 바람직하게는 소분자(small molecule)를 나타내기 위해 사용된다. 이와 관련하여 특이적 결합은 분자가 선택된 표적 분자와 결합할 수 있는 반면에 동일 조건하에서 또 다른 비-관련 표적 분자와는 결합하지 않는 것을 의미하는 것이다. 예를 들면, 결합 분자가 혈청 알부민에 결합하고 혈청에서 발견되는 또 다른 단백질 또는 바람직하게는 어떤 다른 단백질과는 거의 또는 전혀 결합하지 않는 경우 상기 결합 분자는 혈청 알부민에 특이적으로 결합한다고 한다.

이와 관련하여, 용어 "시트룰린과 특이적으로 반응하다" 또는 "시트룰린화된 에피토프와 반응하는" 또는 "시트룰린 에피토프와 반응하는"은 항체가 시트룰린 잔기를 함유하는 펩티드 또는 펩티드-유사 분자와 같은 구조와 반응하는 반면 상기 항체가 시트룰린 잔기 대신 아르기닌 잔기를 함유하는 동일 구조와는 거의 또는 바람직하게는 전혀 반응하지 않는 것을 의미한다. 용어 펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 특이적 결합 분자와의 면역반응성에 대한 정확한 맥락에서, 바람직하게는 인간 또는 동물 체내에서 나타나는 바와 동일한 맥락에서, 바람직하게는 천연 폴리펩티드의 맥락에서 시트룰린 잔기를 제공할 수 있는 구조로 해석되어야 한다. 또한, 시트룰린 잔기는 세포 활성화 또는 보체 결합과 같은 면역계의 다른 성분들을 활성화시키거나 유발하지 않는 천연 폴리펩티드의 맥락에서 제공되는 것이 바람직하다.

"특이적 결합 분자"는 표적 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는, DNA, RNA, 펩티드, 단백질 영역, 전체 단백질 또는 그의 조합 또는 그의 일부로 이루어지는 분자, 바람직하게는 소분자일 수 있다. 특이적 결합 분자의 바람직한 예는 펩티드 또는 항체이다.

천연 항체(면역글로불린으로도 알려져 있음)는 척추동물의 혈액 또는 다른 체액에서 발견될 수 있는 감마 글로불린 단백질이며, 세균 및 바이러스와 같은 외래 물질을 확인하고 무력화시키기 위해 면역계에 의해 사용된다.

천연 항체는 전형적으로, 예를 들면, 하나의 단위를 갖는 단량체, 2개의 단위를 갖는 이량체 또는 5개의 단위를 갖는 오량체를 형성하기 위한 기본 구조 단위(각각 2개의 거대 중쇄 및 2개의 소형 경쇄를 가짐)로 이루어진다. 항체는 B 세포로 불리는 백혈구 세포에 의해 생성된다. 여러 상이한 유형의 중쇄가 존재하여, 상이한 종류의 항체들이 야기된다. 항체는 그들이 갖는 중쇄를 기준으로 상이한 이소타입(isotype)으로 분류될 수 있다. 상이한 역할을 수행하고 그들이 접하는 각 상이한 유형의 외래 물질에 대해 적절한 면역 반응을 유도하는 것을 돕는 5가지의 상이한 항체 이소타입이 포유동물에서 알려져 있다. 카멜리드(예를 들면, 라마) 및 상어와 같은 일부 동물 종은 비정상적 항체 구조를 가질 수도 있다.

모든 항체의 일반 구조는 매우 유사하지만, 단백질 끝부분에서 작은 영역이 매우 가변적이어서 약간 상이한 끝부분 구조를 갖는 수백만의 항체가 존재하게 된다. 상기 영역은 초가변 영역으로 알려져 있다. 이들 변이체 각각은 항원으로 알려진 상이한 표적에 결합할 수 있다. 항체의 이러한 엄청난 다양성은 면역계로 하여금 동일하게 광범위한 다양한 항원을 인식하게 한다.

항체에 의해 인식되는 항원의 독특한 부분을 에피토프로 부른다. 상기 에피토프는 항체로 하여금 유기체를 구성하는 수백만의 상이한 분자들 중에서 그의 유일한 항원만을 식별하고 결합하게 하는 고도로 특이적인 상호작용하에 그의 항체와 결합한다. 항체에 의한 항원의 인식은 항체를 면역계의 다른 부분에 의한 공격에 대해 방어한다. 항체는 또한, 예를 들면, 감염을 일으키기 위해 필요한 병원균의 일부와 결합함으로써 직접 표적을 무력화시킬 수 있다.

항체의 거대하고 다양한 집단은 상이한 항원 결합 부위(또는 파라토프(paratope))를 암호화하는 일련의 유전자 분절의 임의 조합 이후, 항체 유전자의 상기 부위에서의 무작위 돌연변이에 의해 생성되어 추가의 다양성을 야기한다. 항체 유전자는 또한 중쇄의 염기를 또 다른 염기로 교환시키는 부류 전환(class switching)으로 불리는 과정에서 재조직화되어 항원 특이적 가변 영역을 보유하는 상이한 이소타입의 항체를 생성한다. 이것은 단일 항체가 면역계의 여러 상이한 부분에 의해 여러 상이한 이소타입으로 사용되게 한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항체들" 또는 "항체"는 흔히 "항원"으로 지칭되는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 구조, 바람직하게는 단백질 또는 폴리펩티드 구조를 말한다.

항체는 단쇄 항체, 단쇄 가변 단편(scFv), 단편 항원 결합 영역(Fab), 재조합 항체, 단클론성 항체, 천연 항체 또는 압타머의 항원-결합 영역을 포함하는 융합 단백질, VHH 항체로도 또한 알려진 단일 영역 항체(sdab), 나노바디(카멜리드 유래 단일 영역 항체), VNAR로 불리는 상어 IgNAR 유래 단일 영역 항체 단편, 안티칼린, 압타머(DNA 또는 RNA), 및 그의 활성 성분 또는 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 바람직한 태양에서, 항체는 천연 항체 또는 압타머, 예를 들면, DNA 또는 RNA 형태의 압타머의 항원-결합 영역을 포함하는 융합 단백질이다.

항체 또는 다른 특이적 결합 분자의 맥락에서 "또는 그의 일부" 또는 "그의 단편"이란 용어는 항체 또는 특이적 결합 분자의 특이적 결합 부위를 구성하는 항체 또는 특이적 결합 분자의 일부를 말하며, 여전히 전체 항체 또는 특이적 결합 분자와 동일한 에피토프와 반응할 수 있는 항체 또는 특이적 결합 분자의 일부로서 해석될 수 있다.

인간 항체 또는 그의 단편들이 본 발명의 바람직한 태양이다. 바람직하게, IgG1 중쇄 및 람다 경쇄를 갖는 IgG1(예를 들면, IgG1λ) 항체가 유리하게 사용될 수 있다. 그러나, 카파 또는 람다 경쇄와 함께 IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE를 포함하여 다른 인간 항체 이소타입도 또한 본 발명에 포함된다. 또한, 다양한 이소타입의 모든 동물-유래 항체도 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 항체는, Fab, F(ab')2, 단쇄 Fv 단편, 또는 단일 영역 VHH, VH 또는 VL 단일 영역을 포함하여, 전체-크기 항체 또는 항체의 항원-결합 단편일 수 있다.

용어 "시트룰린화된 에피토프와 반응하는 특이적 결합 분자"는 펩티드 또는 펩티드 핵산 또는 압타머 또는 펩티드 모방 구조와 같은 보다 거대 구조의 맥락에서 시트룰린 잔기와 특이적으로 반응하는 특이적 결합 분자로 해석된다.

시트룰린은 정상적인 번역과정동안 단백질내에 혼입되지 않는 아미노산이지만, 펩티딜아르기닌 디이미나제(PAD)에 의한 아르기닌 잔기의 번역후 변형에 의해 생성될 수 있다.

시트룰린화는 펩티딜아르기닌 디이미나제(PAD)에 의해 촉진되는, 아르기닌 잔기의 시트룰린 잔기로의 번역후 전환이다. 펩티딜아르기닌 디이미나제(PAD; EC 3.5.3.15) 효소는 단백질에서 아르기닌 잔기의 시트룰린 잔기로의 전환을 촉진한다. 시트룰린에 대한 tRNA는 존재하지 않으며, 단백질에 시트룰린 잔기의 존재는 전적으로 번역후 변형의 결과이다. 포유동물(인간, 마우스 및 래트)에서, 각각 별개의 유전자에 의해 암호화되는 5 가지의 PAD 이소타입(PAD1 - PAD6; 'PAD4' 및 'PAD5'는 동일한 이소타입에 대해 사용된다)이 확인되었다[Vossenaar et al., Bioessays 25, 1106-1118 (2003)]. 모든 상기 효소들은 활성에 있어 Ca2+의 존재에 매우 의존하며, 유리 L-아르기닌을 유리 L-시트룰린으로 전환시킬 수 없다. 유리 L-아르기닌은 진핵세포에서 산화질소 신타제(EC 1.14.13.39)에 의해 또는 세균에서 아르기닌 디이미나제(EC 3.5.3.6)에 의해 유리 L-시트룰린으로 전환될 수 있다. 이들 효소는 Ca2+ 의존성이 아니다.

매우 상동성인 PAD 효소들 간의 가장 현저한 차이는 그의 조직-특이적 발현이다. 표피에서, PAD1(동의어: PAD I, PAD I형)이 케라틴 비후막(cornified envelope)의 인식에 중요한 케라틴세포 분화의 최종 단계동안 케라틴 필라멘트의 시트룰린화에 수반된다. 표피에서 또 다른 시트룰린화 부위는 PAD3(동의어 PAD III, PAD III형) 및 그의 천연 기질인 트라이코히알린(THH)을 함유하는 모낭이다. THH는 모낭, 및 보다 적게는 다른 특수 상피의 내모근초(inner root sheath) 세포 및 수질층의 주요 구조 단백질이다. 가장 최근에 확인된 PAD 이소타입인 PAD6(동의어: ePAD)은 초기 배아발생에서 중요한 역할을 하는 마우스 난모세포의 세포질 판에서 발견되었다. 그의 인간 오쏠로그(orthologue)의 발현은 난소, 고환 및 말초혈 백혈구로 제한되는 것으로 밝혀졌다[Chavanas et al., Gene vol 330:19-27 (2004)]. 원래, 상기 PAD 이소타입은 ePAD로 지칭되나, 다른 PAD의 체계적 번호지정을 기준으로, 상기 이소타입은 PAD6으로 재명명되었다[Vossenaar et al., Bioessays vol 25, 1106-1118 (2003)]. 가장 광범위하게 발현되는 이소타입인 PAD2(동의어 PAD II, PAD II형, PAD-H19)는 골격근, 뇌, 비장, 분비선 및 대식세포와 같은 많은 상이한 조직에 존재한다. 이러한 광범위한 발현 패턴에도 불구하고, 수초(myelin) 염기성 단백질(MBP) 및 비멘틴 만이 천연 기질로 확인되었다. 다발성 경화증(MS)에서, 환자는 MBP에 대해 자가면역 반응을 나타낸다. MBP는 수초의 풍부한 단백질이며, 그 시트룰린화는 중추신경계의 성장시에 일어난다. 비멘틴의 시트룰린화는 인간 및 마우스 대식세포의 칼슘-이오노포어(ionophore) 유도된 세포사멸(apoptosis)동안 관찰되었으며, 전술한 바와 같이, 시트룰린화 비멘틴은 RA-특이적 항-Sa 자가항체의 표적인 것으로 나타났다. 상기에서 논의한, 모두 세포의 세포질에 주로 편재화되는 PAD와 반대로, PAD4 이소타입(동의어: PAD IV, PAD IV형, HL-60 PAD, PAD V, PAD V형, APDI4)은 핵에 편재화된다. PAD4의 핵 편재화 신호는 단백질의 N-말단 영역에서 발견되었다. PAD4는 주로 말초혈 과립구 및 단구에서 발현된다. 핵에서 PAD4의 기질은 히스톤 코어 단백질(H2A, H3 및 H4), 및 리보솜 조립, 핵세포질 이동 및 중심체 복제에 작용하는 핵인(nucleolar) 단백질인 뉴클레오포스민/B23이다.

본 발명에 따른 특이적 결합 분자는 각각 15 kDa 및 17 kDa의 분자량을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드인 p15 및/또는 p17 상의 시트룰린화된 에피토프에 대해 유도된다.

상기 특이적 결합 분자는 염증 질환의 치료 또는 예방에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.

본원에서 사용된 바와 같이, "염증 상태" 또는 "염증 질환"은 혈관 변화: 부종 및 호중구의 침윤(예를 들면, 급성 염증 반응); 단핵 세포에 의한 조직의 침윤; 염증 세포, 결합 조직 세포 및 그의 세포 산물에 의한 조직 파괴; 및 결합 조직 교체에 의한 복구 시도(예를 들면, 만성 염증 반응)를 특징으로 하는 임의의 많은 상태 또는 질환을 말한다.

상기 상태의 대표적인 예로는 시트룰린 관련 염증 질환 및 자가면역 질환이 포함된다. 시트룰린 관련 염증 질환은 본원에서 시트룰린이 질환의 발병에 관여하는 질환으로 정의된다. 시트룰린화가 질환의 발병에 관여하는지 아닌지 여부는 당해 분야에서 이용되는 통상적인 검사를 이용하여 숙련된 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 질환은 병에 걸리거나 질환이 관련된 조직에서 비정상적 수준의 시트룰린화 단백질의 존재를 특징으로 할 수 있다. 그러한 것은 병에 걸린 조직이 항원으로 사용되고 상기 항원의 시트룰린화가 본원에 기술된 바와 같은 항-시트룰린 항체를 사용하여 검출될 수 있는 웨스턴 블롯(Western blot) 또는 ELISA와 같은 면역학적 검사에 의해 이루어질 수 있다.

또는, 당해 분야에 숙련된 자는 발병 환자로부터 병에 걸린 조직 대 건강한 조직에서 시트룰린화의 수준 및 유형을 비교하기 위해 질량 분석법과 같은 프로테오믹스(Proteomics) 응용프로그램을 이용할 수 있다.

상기 질환은 또한 시트룰린 함유 펩티드 또는 단백질에 대한 면역 반응의 존재를 특징으로 할 수 있다. 이것은 체액성 또는 세포성 면역 반응, 예를 들면, T-세포 또는 B-세포에 의해 매개되는 반응일 수 있다. 항-시트룰린 항체를 검출하기 위한 검사는 당해 분야에서 기술되었으며 상업적으로 시판한다.

그러므로, 본 발명은 시트룰린 관련 염증 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 특이적 결합 분자에 관한 것이다.

상기 질환은, 예를 들면, 류마티스성 관절염 및 골관절염을 포함하여 염증성 관절염, 다발성 경화증, 건선성 관절염, 건선, 알츠하이머(Alzheimer)병, 자가면역성 간염, 소아 특발성 관절염, 척추관절병증, 다운(Down) 증후군, 다계통 위축, 파킨슨(Parkinson)병 및 루이소체(Lewy body) 치매이다. 그러므로, 본 발명은 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 다발성 경화증, 건선성 관절염, 건선, 알츠하이머병, 자가면역성 간염, 소아 특발성 관절염, 척추관절병증, 다운 증후군, 다계통 위축, 파킨슨병 및 루이소체 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 특이적 결합 분자에 관한 것이다.

본 발명은 특히 자가면역 질환, 보다 특히 류마티스성 관절염 또는 골관절염의 치료 또는 예방을 위한 특이적 결합 분자에 관한 것이다.

다발성 경화증 또는 MS는 수초의 자가면역성 매개 파괴를 특징으로 하는, CNS의 만성 염증성 질병이다. 수초의 세포는 약 3:1 비의 지질-단백질 복합체로 이루어진 축색돌기(axon) 주위의 다중이분자막(multibilayer) 구조를 형성한다. 2개의 주 단백질인 MBP 및 단백지질 단백질은 단백질 분획의 85%를 차지한다. MBP는 포스파티딜세린과 같은 음으로 하전된 인지질과 강한 상호작용을 형성할 수 있는 고도의 양이온성 단백질이다. 건강한 성인 인간의 MBP 분자의 약 18%에서, 6개(19개중)의 아르기닌이 시트룰린화된다[Wood et al., J Biol Chem, vol 264, 5121-5127 (1989); Wood et al., Ann Neurol, vol 40, 18-24 (1996)]. 나머지 MBP 분자는 시트룰린을 함유하지 않는다. MS 환자에서, MBP-cit6의 비율은 전체 MBP의 45%로 증가한다. MBP-cit6의 감소된 총 양전하는 MBP 분자의 부분적 풀림(unfolding)을 야기하며 인지질과의 그의 상호작용을 약화시킨다[Boggs et al., J Neurosci Res, vol 57, 529-535 (1999); Pritzker et al., Biochemistry, vol 39, 5374-5381 (2000)]. MBP-cit6이 지질 복합체를 비-시트룰린화 MBP보다 더 신속히 형성할 수 있지만, 형성되는 복합체는 비-시트룰린화 MBP와 형성된 것만큼 치밀하게 채워지지 않는다[Boggs et al., J Neurosci Res, vol 57, 529-535 (1999); Beniac et al., J. Struct Biol, vol 129, 80-95 (2000)]. MBP-cit6은 비-시트룰린화 MBP보다 카텝신 D에 의해 4배 더 신속히 분해된다[Cao et al., Biochemistry, vol 38, 6157-6163 (1999)]. 급성 전격성 MS(마르부르그(Marburg)형)의 희귀한 경우에서, MBP 분자의 80%가 심하게 시트룰린화된다(MBPcit18)[Wood et al., Ann Neurol, vol 40, 18-24 (1996)]. 심하게 풀린 MBP-cit18은 정상 MBP보다 캅테신 D에 의해 45배 더 신속히 분해된다[Cao et al., Biochemistry, vol 38, 6157-6163 (1999)]. 항암 약물 탁솔의 활성 성분인 파클리탁셀을 사용한 임상 실험이 진행중이다[O'Connor et al., Ann Neurol, vol 46, 470 (1999)]. 저용량의 파클리탁셀은 시험관내에서 PAD2에 의한 MBP의 시트룰린화를 억제할 수 있다[Pritzker et al., Biochim Biophys Acta, vol 1388, 154-160 (1998)]. 파클리탁셀에 의한 치료는 임상 증상을 약화시키며 손상된 수초의 재수초화(remyelination)를 유도하여[Moscarello et al., Mult Scler, vol 18, 130-138 (2002)], 탈수초성(demyelinating) 질환에서 후보 인자로서 PAD의 가능한 중요성을 분명히 보여준다[Moscarello et al., J Neurochem, vol 81, 335-343 (2002)].

건선에서, 케라틴세포가 매우 신속히 증식하여 단지 약 4 일만에 기저층으로부터 표면으로 이동한다. 피부는 상기 세포를 충분히 신속히 흘려버릴 수 없으므로, 이들은 두껍고 건조한 얼룩 또는 반점으로 축적된다. 정상적인 케라틴세포에서, 케라틴 K1은 최종 분화시에 PAD1에 의해 시트룰린화된다. 상기 과정은 케라틴 필라멘트가 보다 치밀하게 되도록 만드는데, 이것은 표피의 정상적인 각질화에 필수적이다. 건선성 과증식 반점에서 케라틴세포는 시트룰린화 케라틴 K1을 함유하지 않는다[Ishida-Yamamoto et al., J Invest Dermatol, vol 114, 701-705 (2000)]. 증가된 세포 증식이 PAD에 의한 적절한 시트룰린화를 방지하는지 아니면 PAD의 불활성이 케라틴세포의 과증식 및 축적을 허용하는지는 명확하지 않다. 메카니즘은 알려지지 않았지만, 건선성 표피에서 비정상적 시트룰린화는 명백하게 PAD1과 관련된다.

바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 조성물은 수용액, 겔, 하이드로겔, 필름, 페이스트, 크림, 스프레이, 연고 또는 랩으로 이루어진 군으로부터 선택된 형태이다. 다른 태양에서, 상기 방법을 이용하여 관절내, 복강내, 국소, 직장, 정맥내, 경구, 안구로부터 선택된 경로에 의해 또는 종양 절제 변연부에 본원에 기술된 조성물을 투여한다.

특정 태양에서, 약학적으로 허용되는 담체는 공용매 용액, 리포솜, 미셀(micell), 액정, 나노결정, 나노입자, 유화액, 미세입자, 미소구, 나노구, 나노캡슐, 중합체 또는 중합체성 담체, 계면활성제, 현탁제, 착화제, 예를 들어, 사이클로덱스트린 또는 흡착 분자, 예를 들어, 알부민, 표면 활성 입자, 및 킬레이트화제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 담체를 포함한다. 또 다른 태양에서, 폴리사카라이드는 히알루론산 및 그의 유도체, 덱스트란 및 그의 유도체, 셀룰로스 및 그의 유도체(예를 들면, 메틸셀룰로스, 하이드록시-프로필셀룰로스, 하이드록시-프로필메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스 프탈레이트), 키토산 및 그의 유도체, [베타]-글루칸, 아라비노자일란, 카라기난, 펙틴, 글리코겐, 푸코이단, 콘드로이틴, 더마탄, 헤파란, 헤파린, 펜토산, 케라탄, 알기네이트, 사이클로덱스트린, 및 그의 에스터 및 설페이트를 포함한 염 및 유도체를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 조성물을 표적 부위, 특히 윤활 관절로 전달하는 것을 포함한다.

본 발명의 한 특정 태양에서, 특이적 결합 분자는 p15 및/또는 p17에 결합하기 위해 단클론성 항체 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112, 및 RmmAb22.101과 경쟁한다.

상기 항체들은 그의 중쇄 및 경쇄의 1차 아미노산 서열로 본원에 개시되어 있다(표 10 참조).

[표 10]

본원에 개시된 바와 같은 단클론성 항체와 경쟁하는 결합 분자 또는 항체는 표준 절차에 의해 선택될 수 있다. 간략하게: 본원에 개시된 바와 같은 항원을 고체 지지체 상에 고정화시키는 ELISA와 같은 결합 분석이 개발될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 단클론성 항체는 표지화될 수 있으며, 고정화된 항체에 대한 그의 결합의 방해는 통상적인 분석법에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 상기 및 기타 보다 복잡한 방법들이 숙련된 자에게 공지되어 있으며, 통상적인 실험실 환경에서 통상적으로 수행될 수 있다.

특히, 고체 지지체 상에 고정화된 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 37 및 서열번호 38에 따른 임의의 항원 단백질을 사용하는 분석법들이 용이하게 개발될 수 있다. 단클론성 항체 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112, 및 RmmAb22.101로 이루어진 군으로부터 선택된 단클론성 항체는 표지화되고 시험 항체의 존재 및 부재하에 고정화된 항원과 접촉할 수 있다. 시험 항체가 결합을 방해하는 경우, 즉, 임의의 표지화된 항체에 의해 수득된 신호를 감소시키는 경우, 시험 항체는 표지화된 항체의 결합에 경쟁한다고 결론지을 수 있다. 상기 경쟁 항체는 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다.

그러므로, 본 발명은 류마티스성 관절염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항체에 관한 것으로, 이때 상기 항체는 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 37 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드와 특이적으로 반응한다.

단클론성 항체 RhmAb2.101의 가변 영역의 1차 mRNA 서열은 발표되었으며, 표 1에 나타낸 바와 같은 등록번호 하에 EMBL 데이터베이스에 기탁되었다. 단클론성 항체 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112의 가변 영역의 1차 서열은 본원에서 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 39, 서열번호 20, 서열번호 41, 서열번호 40, 서열번호 19, 서열번호 43 및 서열번호 42에 개시되어 있다.

마우스 단클론성 항체 RmmAb22.101 및 RmmAb22.102는 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(독일 브라운슈바이크 38214 인호펜스트라세 7B 소재)에 기탁된 하이브리도마로부터 유도되었으며, 각각 DSMZ 기탁번호 ACC 3031 및 ACC 3032를 부여받았다. 서열화 후에, 이들은 서열번호 44 및 서열번호 45에 나타낸 동일한 DNA 서열을 갖는 것으로 나타났다.

그러므로, 본 발명은 또한 서열번호 18, 서열번호 17, 서열번호 20, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 19, 서열번호 43, 서열번호 42, 서열번호 44 및 서열번호 45로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 18, 서열번호 17, 서열번호 20, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 19, 서열번호 43, 서열번호 42, 서열번호 44 및 서열번호 45로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 RmmAb22.101 및 RmmAb22.102에 존재하는 바와 같은 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열번호 44 및 서열번호 45에 나타낸 RmmAb22.101 및 RmmAb22.102에 존재하는 바와 같은 가변 중쇄 및 경쇄에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 태양에서, 특이적 결합 분자는 단클론성 항체 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102로 이루어진 군으로부터 선택된 항체이다.

또 다른 바람직한 태양에서, 특이적 결합 분자는 단클론성 항체 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102로 이루어진 군으로부터 선택된 항체로부터 유도되거나 수득된 VH 및/또는 VL 영역을 포함한다.

이와 관련하여 용어 "유도된" 또는 "수득된"은 VH 및/또는 VL 영역의 1차 구조가 본원에 개시된 단백질 및 핵산 서열로부터 결정되고, 클로닝되고, 상이한 맥락으로, 예를 들면, 마우스 VH 또는 VL 영역을 나타내는 인간 항체 맥락으로 재배열될 수 있음을 의미한다. 보다 특히, 이와 관련하여, 용어 "유도된" 또는 "수득된"은 특정 항체에서 VH 및/또는 VL 영역의 특이적 결합성을 담당하는 필수 잔기가 확인된 다음 이들 필수 잔기 또는 그의 구조적 동족체가 또 다른 펩티드의 맥락으로 옮겨지는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 특이적 결합 분자는 필수적으로 2가지 방법으로 생성될 수 있다. 먼저, 이들은 본원에 나타낸 바와 같은 항체 및 그의 서열로부터 유도될 수 있다. 항체들의 반응성은 부위-지향 돌연변이유발, 쇄 셔플링(chain shuffling), 생식 PCR에 의해, 또는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 항체 유도 및 최적화를 위한 다른 방법에 의해 한층 개선될 수 있다. 또는, 특이적 결합 분자, 특히 항체는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 특이적으로 반응하는 에피토프, 특히 PAD4 처리된 히스톤 2A, 펩티드 1(서열번호 21) 및 다른 특히 반응성인 펩티드로 패닝(panning)하여 수득될 수 있다.

당해분야에 숙련된 자는 본원에 기술된 서열을 이용하여, 예를 들면, 하기 실시예에 기술된 바와 같은 cDNA 또는 게놈 서열을 클로닝하거나 제조할 수 있다. pcDNA3(인비트로겐(In Vitrogen))과 같은 적절한 진핵세포 발현 벡터 또는 그의 유도체에 상기 서열의 클로닝, 및 적절한 경쇄 및 중쇄 함유 벡터의 혼합물에 의한 포유동물 세포(예를 들면, CHO 세포)의 후속 형질감염은 열거된 항체 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102의 발현 및 분비를 제공한다. 또한, 마우스 단클론 항체 RmmAb22.101 및 RmmAb22.102는 기탁된 바와 같은 그의 각각의 하이브리도마 세포주에 의해 직접 발현되고 분비될 수 있다(DSMZ 번호 ACC 3031 및 ACC 3032).

당해 분야에 숙련된 자는 또한 항체 서열의 특이적 결합 영역을 사용하여 본원에 기술된 바와 같은 특이적 결합 분자의 유사체를 제조하고, 융합 단백질과 같은 폴리펩티드와 같이 상이한 맥락에서 이들을 발현시킬 수 있다. 이것은 당해 분야에 공지되어 있다.

재조합 인간 및 마우스 단클론성 항-시트룰린 항체는 실시예 1, 13 및 14에 기술된 바와 같이 수득하였다. 단클론성 항체 중쇄 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112는 마우스 리더 서열(서열번호 12) 및 인간 IgG1 Fc 영역(서열번호 14)을 사용하여 수득하였다. 단클론성 항체 경쇄 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112는 마우스 리더 서열(서열번호 12) 및 인간 람다 불변 영역(서열번호 16)을 사용하여 수득하였다. 단클론성 항체 RhmAb2.110은 마우스 리더 서열(서열번호 12) 및 인간 카파 불변 영역(서열번호 11)을 사용하여 수득하였다.

마우스 단클론성 항-시트룰린-펩티드 항체 RmmAb13.101, RmmAb13.102 및 RmmAb13.103은 상업적인 공급처에서 수득하였다(모디퀘스트 리서치 비브이(ModiQuest Research BV), 네덜란드 니즈메젠; 카탈로그 번호 MQ13.101, MQ13.102 및 MQ13.103).

항-시트룰린 항체를 마우스에 항-콜라겐 항체를 주입하여 염증을 유도한 실험 모델에서 시험하였다. 상기 모델은 콜라겐 항체 유도된 관절염(CAIA)으로 알려져 있다[Nandakumar and Holmdahl, J Immunol Methods, vol 304, 126-136 (2005)]. 항-콜라겐 항체는 상업적 공급처에서 수득하였다(모디퀘스트 리서치 BV, 네덜란드 니즈메젠; 카탈로그 번호 MQ18.101).

마우스 단클론성 항-시트룰린 항체 RmmAb13.101, RmmAb13.102 및 RmmAb13.103은 문헌 [Kuhn et al., J. Clin. Invest, vol 116, 961-871 (2006); and Hill et al., J Exp Med, vol 205, 967-979 (2008)]에 또한 기술된 바와 같이, 항-콜라겐 항체 유도된 관절염의 중증도를 높이는 것으로 확인되었다. 이것은 도 1a 및 1b에 나타나 있다.

또한, 인간 환자에서의 여러 연구들은 시트룰린화된 에피토프에 대한 항체가 RA의 발병을 증가시킴을 나타낸다[Masson-Bessiere et al., J. Immunol. vol 166, 4177-4184 (2001); Vossenaar and van Venrooij, Arthritis Res Ther, vol 6, 107-111 (2004)]. 이것은 도 1a 및 b에 나타나 있는데, 이들은 동일 실험의 "평균 관절염 스코어" 및 "관절염 발병률"을 각각 나타낸다.

그러나, 놀랍게도, 인간 단클론성 항체 RhmAb2.102는 실험적 CAIA 모델에서 관절염의 임상 증상을 현저하게 경감시켰다.

RhmAb2.102를 사용하여 수득된 결과는 도 1c 및 1d에 나타내었다. RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112를 사용하여 수득된 결과는 도 9에 나타난 바와 같이, RhmAb2.102와 비교할 때 훨씬 더 우수하였다.

인간 단클론성 항체 RhmAb2.101은 적용된 용량에서 관절염의 임상 증상에 전혀 영향을 미치지 않았다. 상업적으로 시판하는 항체 RhmAb2.201이 상기 실험에서 무관련 항체 대조군으로 사용된다(모디퀘스트 리서치 BV, 카탈로그 번호: MQR2.201). 상기 항체는 시트룰린화된 에피토프를 인식하지 않는다.

인간 항체 RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112와 유사한 하위집합의 에피토프를 인식하는 마우스 단클론성 항체 RmmAb22.101 및 RmmAb22.102를 사용하여서도 동일한 동물 실험을 수행하였다.

CAIA 동물 실험에서 인간 항체 RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112와 유사한 결과가 수득되었다. 마우스 단클론 항체 RmmAb22.101 및 RmmAb22.102는 관절염의 임상 증상이 사라지게 하였다(도 10).

도 1e 및 1f는 RhmAb2.102에 대한 임상 용량을 평가한 독립적인 CAIA 실험을 나타낸다. 최대 억제를 제공한 최저 용량은 0.5 mg Ab/마우스였으며, 이것은 복강내 주사에서 28 mg/kg에 상응한다.

상기 실험으로부터, RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102로 이루어진 군으로부터 선택된 단클론성 항체에 의해 인식되는 특정 에피토프가 염증 질환의 치료 또는 예방에 중요한 역할을 하는 것으로 결론지어진다. 그러므로, 상기 에피토프들의 특정한 은폐는 염증 질환, 특히 류마티스성 관절염의 효과적인 치료법일 수 있다.

상기 단클론성 항체에 의해 인식되는 항원 또는 항원들을 더 분석하기 위해, 이들을 실시예 3에 기술된 바와 같은 펩티딜아르기닌 디이미나제(PAD 효소)를 사용하여 탈이민화된 세포 추출물에 대한 그의 반응성에 대해 시험하였다. 용해후 탈이민화된 hPAD2 또는 hPAD4 형질감염된 COS-1 용해물을 함유하는 웨스턴 블롯 결과물을 단클론성 항체 RhmAb2.101 및 RhmAb2.102와 함께 배양하였다. RhmAb2.102와 함께 배양된 스트립(strip)만이 약 15 및 17 kDa의 분자량을 갖는 한 쌍의 단백질들과의 반응성을 나타내는 것이 관찰되었다.

WO 2004/078098 호는 시트룰린화 펩티드/MHC 부류 II 복합체에 특이적인 항체가 T 세포 활성화를 억제하는 것을 개시하고 있다. 이들 항체는 별도의 펩티드 또는 MHC 부류 II 분자 뿐 아니라 상기 펩티드와 MHC 부류 II 분자의 복합체와도 결합하지 않는다. 본원에 개시된 항체는 본원에 개시된 바와 같이 개개의 펩티드 및 단백질을 인식하므로 WO 2004/078098 호에 개시된 항체와는 상이하다. 또한, 상기 항체는, MHC 분자와 시트룰린화 펩티드 사이의 복합체가 면역블롯 절차에 사용되는 SDS 겔의 환원 상태에서 절대 생존하지 못하므로, 웨스턴 블롯에서 펩티드와 MHC 부류 II 분자 간의 복합체일 수 없는 폴리펩티드를 인식한다. 그러므로, 본원에 개시된 바와 같은 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프는 WO 2004/078098 호에 개시된 항체와 상이하다. 또한, 본원에 개시된 바와 같은 항체는 펩티드 및 MHC 부류 II 분자의 복합체와 특이적으로 반응하지 않는다.

전술한 실험 및 고려사항들로부터 염증 질환의 임상 증상을 예방하는 능력과 p15 및 p17 상의 시트룰린화된 에피토프와의 반응성 사이에 명백한 상관관계가 존재하는 것으로 결론지어진다.

인간 단클론성 항체 RhmAb2.101 및 RhmAb2.102를 실시예 5에 상술한 바와 같은 면역침전 실험에 사용한 경우 유사한 데이터가 수득되었다.

인간 PAD2 및 PAD4 탈이민화 COS-1 용해물 둘 다에 대한 RhmAb2.102를 사용한 면역침전은 현저한 p15 및 p17 단백질 밴드를 나타내었다.

그러므로, p15 및 p17의 인식 강도는 상기 항체들의 치료 성질과 잘 상관되는 것으로 보인다(도 1a 내지 d).

항체가 p15 또는 p17과 반응성인지 아닌지 여부는 실시예 4 및 5에 상술된 바와 같이 면역침전 또는 웨스턴 블롯 분석을 수행함으로써 용이하게 평가될 수 있다. 또는, RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102를 사용한 경쟁 실험을, 웨스턴 블롯 또는 ELISA에서 탈이민화 COS-1 용해물 또는 정제된 탈이민화 p15 및/또는 p17 단백질을 함유하는 웨스턴 블롯 결과물을 사용하여 수행할 수 있다.

단백질 p15 및 p17은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-비행시간 질량 분석법(Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)에 의해 더 특성화되었다. 아프리카 녹색 원숭이(African Green Monkey)의 게놈이 완전히 서열화되지 않았으므로, MALDI-TOF MS에 의해 발견된 펩티드와의 상동성에 대해 모든 다른 포유동물 게놈 데이터베이스를 검색하였다. 고도의 상동성을 갖는 것으로 나타난 단백질은 히스톤인 것으로 나타났다. 이것은 표 3(실시예 6)에 나타내었다.

그러므로, 본 발명은 염증 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 히스톤 상의 시트룰린화된 에피토프와 특이적으로 반응하는 결합 분자에 관한 것이다.

PAD의 효소 작용에 의한 히스톤의 시트룰린화는 잘 입증되어 있으므로 시트룰린화 히스틴은 시험관내에서 매우 잘 생성될 것이다. 이들 시트룰린화 히스톤은 시트룰린화 p15 및 p17, 즉 히스톤 상의 에피토프와 반응하는 펩티드 및 항체와 같은 다른 특이적 결합 분자에 대해 선별하고 선택하기 위한 효소적 결합 분석법에 기질로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, p15 및/또는 p17에 결합하기 위해 항체 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102와 경쟁하는 특이적 결합 분자가 선택된다.

본 출원서 및 특허청구범위에서, "포함하다"라는 동사 및 그의 활용형은 그의 비-제한적 의미에서 그 단어뒤에 오는 항목들이 포함되지만 특별히 언급되지 않은 항목들이 배제되지 않음을 의미하기 위해 사용된다. 또한, 단수 표현에 의한 요소에 대한 언급은 문맥이 하나 및 단지 하나의 요소만이 존재함을 명백히 요하지 않는 한 하나보다 많은 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 단수 표현은 통상적으로 "하나 이상"을 의미한다.

탈이민화된 히스톤 또는 히스톤들이 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102의 치료 작용에 수반되는지를 더 분석하기 위해, 상업적으로 시판하는 히스톤(H1, H2A, H2B, H3 및 H4)을 인간 펩티딜아르기닌 디이미나제(PAD, EC 3.5.3.15) 효소(huPAD2 또는 huPAD4)로 탈이민화시켰다. 탈이민화 및 비-탈이민화 히스톤을 96-웰 ELISA 플레이트 상에 코팅시키고 RhmAb2.101 및 RhmAb2.102의 연속 희석물과 함께 배양하였다. 결과는 표 6 및 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 결과로부터, 탈이민화 히스톤 2A, 히스톤 3 및 히스톤 4가 치료 항체 RhmAb2.102에 의해서는 인식되지만, RhmAb2.101에 의해서는 인식되지 않거나 또는 훨씬 더 낮은 친화도하에 인식되는 것이 명백하다(도 2a, 2b).

또한, 이러한 결과는 RhmAb2.102와 RhmAb2.101 사이의 상기 친화도 차이가 인간 PAD2 및/또는 PAD4 탈이민화 H2A, 인간 PAD2 탈이민화 히스톤 3, 및 인간 PAD4 및/또는 PAD2 탈이민화 히스톤 4에 대해 가장 높음을 보여준다.

이들 데이터는, RhmAb2.102가 관절염의 임상 증상을 사라지게 하는 반면 RhmAb2.101은 관절염의 임상 증상에 아무 영향을 갖지 않는, 실험적 CAIA 모델에서 관절염의 임상 증상에 대한 상기 항체들의 영향과 잘 상관된다(도 1c 및 1d).

그러므로, H2A/p4 및 H2A/p2 또는 그의 구조적 모방체 상의 탈이민화 에피토프가 RA 염증 단계에서 결정적인 역할을 함을 밝혀내었다. H3/p2, H4/p2 및 H4/p4 상의 탈이민화 에피토프에 대해서도 마찬가지인데, 그 이유는 RhmAb2.102가 RhmAb2.101과 비교할 때 상기 히스톤에 대해 더 높은 친화도를 나타내기 때문이다(도 2a, 2b).

모방체는, 예를 들면, 이 경우에 RhmAb2.101과 비교할 때 RhmAb2.102에 의해 더 높은 친화도하에 인식되는 것을 포함하여, 허용되는 수준의 등가의 활성을 갖는 분자이다.

그러므로, 본 발명은 인간 PAD4 또는 인간 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 2A 또는 히스톤 4, 또는 인간 PAD2 탈이민화 히스톤 H3 상의 시트룰린화된 에피토프와 반응하는, 전술한 바와 같은 특이적 결합 분자에 관한 것이다.

RhmAb2.102에 의해 인식되는 H2A 상의 정확한 시트룰린화된 에피토프를 더 정확히 기술하기 위해, 히스톤 2A의 가능한 탈이민화 부위를 함유하는, 표 4에 나타낸 바와 같은 비오틴 표지화된 펩티드를 합성하였다. 이들 펩티드를 96-웰 뉴트라비딘-ELISA 플레이트 상에 코팅하고 RhmAb2.101 및 RhmAb2.102의 연속 희석물과 함께 배양하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.

[표 6A]

도 2a에 나타낸 RhmAb2.101과 탈이민화 히스톤의 반응성

[표 6B]

도 2b에 나타낸 RhmAb2.102와 탈이민화 히스톤의 반응성

[표 7]

[표 8]

펩티드 1(AAASGXGKQGGK)은 치료 항체 RhmAb2.102 및 RhmAb2.104에 의해 인식되지만 RhmAb2.101에 의해서는 인식되지 않는 것으로 관찰되었다(표 4 및 도 3a, 3b). 펩티드 4 및 6(표 4) 상의 탈이민화 에피토프에 대해서도 마찬가지인데, RhmAb2.102가 RhmAb2.101보다 상기 펩티드들에 대해 더 높은 친화도를 나타내기 때문이다(도 3a, 3b). 이와 함께, 펩티드 1, 4 및 6 상의 탈이민화 에피토프 또는 그의 구조적 등가물 또는 모방체가 RA 염증 단계에서 중요한 역할을 하는 것을 밝혀내었다. 상기 항체 인식 패턴은 H2A/p4 및 H2A/p2의 인식 패턴과 매우 유사하다. 그러므로, 본 발명에 따른 특이적 결합 분자는 또한 펩티드 1, 4 및 6: 각각 서열번호 21, 서열번호 24 및 서열번호 26에 대한 그의 반응성에 의해 정의될 수 있는 것으로 결론지었다. 이들 시트룰린 함유 펩티드 또는 그의 유도체는 각각 개별적으로, 또는 상기 펩티드, 또는 하나 이상의 상기 펩티드 서열을 함유하는 구조와 함께 본 발명에 따른 항체와 같은 특이적 결합 분자를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 상기 항체는 최적 반응성에 대해 본원에 개시된 바와 같은 임의의 다른 항원들에 대해 선택될 수 있다.

[표 4]

히스톤 2A 시트룰린 함유 펩티드

비오틴 표지화 및 시트룰린 함유 피브리노겐 및 비멘틴 펩티드(표 5)도 또한 치료 항체들과의 반응성에 대해 검사하였다. 펩티드들을 96-웰 뉴트라비딘-ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 이어서, RhmAb2.101, RhmAb2.102의 연속 희석물을 코팅된 플레이트에 적용하였다. 결과는 표 8 및 도 4에 나타내었다.

[표 5]

피브리노겐 및 비멘틴 시트룰린 함유 펩티드

마우스 피브리노겐 β 펩티드(서열번호 37)는 RhmAb2.101 및 RhmAb2.102에 의해 인식되는 것으로 관찰되었다(도 4a). 또한, RhmAb2.102는 RhmAb2.101에 비해 더 높은 친화도를 나타내었다(도 4a, 4b). 또한, RhmAb2.102만 마우스 비멘틴 펩티드를 인식하였다(실시예 9). 이것은 상기 언급한 펩티드를 제외하고 매우 유사하며, 또한 펩티드 msFibβ(서열번호 37) 및 msVim(서열번호 38) 상의 탈이민화 에피토프는 RA 염증 단계에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 이와함께 피브리노겐 및 비멘틴 상의 다른 에피토프가 본 발명의 치료 항체들의 소염 효과에 관여함도 배제되지 않는다.

그러므로, 본 발명은 또한 펩티드 msFibβ 또는 msVim(서열번호 37 또는 서열번호 38) 상의 에피토프와 특이적으로 반응하는 전술한 바와 같은 특이적 결합 분자 및 그의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명자들은 시트룰린화된 에피토프가 염증이 생긴 조직에서 새로 나타나는 것을 밝혔다. 류마티스성 관절염에 대한 실험적 마우스 모델에서, 인간 단클론성 항체 102(RhmAb2.102)를 사용하여 병에 걸린 마우스의 염증이 생긴 앞발로부터 시트룰린화 펩티드가 면역침전될 수 있음을 밝힐 수 있었다.

그러므로, 마우스(군 당 3 마리 마우스)에게 제 0 일에 8가지 항-콜라겐 항체의 혼합물(2.8 mg/마우스)을 복강내 주사한 전형적인 CAIA 실험을 수행하였다. 3일후에, 마우스에게 25 ㎍의 LPS를 함유하는 추가의 복강내 주사를 제공하였다. 스코어 기록은 전술한 바와 같이 수행하였다. 상기 실험동안 매일 한 군의 마우스를 죽였고, 웨스턴 블롯 분석법 및 면역조직화학 기술에 의해 시트룰린 존재에 대해 발을 분석하였다.

각 군의 마우스에 대해, 앞발을 모아서 추출을 행하였다. 면역침전 당 20 ㎍의 RhmAb2.102를 사용하여 상기 추출물들에 면역침전(immunoprecipitation, IP)을 수행하였다. 침전물을 SDS-page 전기영동에 적용하고 웨스턴 블롯 기술에 의해 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 블롯을 먼저 총 단백질 검출을 위해 폰소(Ponceau) S로 염색하였다. 폰소 S 염색은 각각의 IP에 대해 동일한 양의 항체가 사용되었는 지를 확인하기 위해 수행한다. 현저한 항체 중쇄 및 경쇄가 동일한 양으로 관찰될 수 있었다.

이어서, 블롯상에 존재하는 시트룰린 잔기를 센수(Senshu) 등의 방법에 따라 화학적으로 변형시켰다[Senshu et al., Anal Biochem, vol 203, 94-100 (1992)]. 이어서, 화학적 변형은 시트룰린 잔기의 화학적 변형을 인식하는 항체를 사용하여 가시화될 수 있다[Senshu et al., Anal Biochem, vol 203, 94-100 (1992)]. 상기 실험에서 탈이민화 피브리노겐을 양성 대조군으로 사용하였다. 추출물을 갖지 않는 면역침전물을 상기 실험들에서 음성 대조군으로 사용하였다.

제 4 일에, 50, 15 및 17 kD의 분자량을 갖는 단백질에 상응하는 위치에서 블롯상에 현저한 밴드가 나타났다. 이들 밴드는 제 5 일에 보다 현저하게 되었으며 제 6 일에 가장 강하였다.

상기 실험의 관절염 발병률은 100%였으며, 마우스는 제 6 일에 5+에 달하는 규칙적인 관절염 스코어를 나타내었다(도 5a 및 5b). 침전된 단백질의 양은 시간에 맞춰 증가하며, 이것은 제 4 일로부터 제 6 일까지 눈에 보인다. RhmAb2.102의 시트룰린 특이성 및 항-화학적으로 변형된 시트룰린 항체를 사용하여 수득된 블롯상에 신호의 존재를 근거로, CAIA에 적용된 마우스는 그의 염증이 생긴 관절에 검출가능한 시트룰린 수준을 갖는 것으로 결론지을 수 있다.

전술한 CAIA 실험에서, 마우스의 발의 염증이 여전히 부재하거나 매우 낮은 경우, 항-콜라겐 항체 주사후 제 3 일에 항-시트룰린 항체를 주사하였다. 이것은 임상 증상의 발생을 방지하였으므로, 염증의 치료, 특히 예방적 치료로서 유용하다.

그러므로, 일단 임상 증상이 발생하면 RhmAb2.102가 또한 임상 증상을 치료할 수 있는 지를 연구하고자 하였다. 이것은 모든 마우스의 4개의 발 모두의 평균 관절염 스코어가 약 4의 임의 스코어에 도달했을 때 항-콜라겐 주사후 제 7 일에 동물을 치료함으로써 수행하였다. 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, RhmAb2.102는 관찰된 부종을 없애지 못하고, 오히려 존재하는 염증/부종을 안정화시켰다. 동물들은 35 일동안 추적되었으며, 그 후에 위약 및 RhmAb2.102 처리된 마우스에서 염증 스코어는 동일하였다(도 6b 및 실시예 12). 도 6A는 각 군의 모든 발의 평균 관절염 스코어를 나타내는 반면, 도 6b는 제 35 일에 조직학 분석에 사용된 동물의 우측 뒷발의 평균 관절염 스코어를 나타낸다.

제 7 일에 RhmAb2.102 치료가 마우스를 영구적인 관절 손상으로부터 보호할 수 있는 지를 조사하기 위해 모든 동물의 우측 뒷발에 조직학 분석을 수행하였다(도 7). 도 7a는 실험의 제 35 일에 실험군 사이에 우측 뒷발의 육안으로 보이는 염증이 유사함을 보여준다. 그러나, 가장 놀랍게도, 관절 침식에 대해 모든 알려진 파라미터는 감소하였다. 염증 세포 유입(D), 연골 침식(B), 연골 PG 감소(E), 연골세포 사멸(F) 및 골 침식(C)의 스코어를 기록할 때, 제 7 일에 RhmAb2.102로 치료한 실험군에서 현저한 감소가 관찰되어, RhmAb2.102가 염증동안 관절 손상을 예방하는 것에 있어 강한 치료 가능성을 가짐을 시사한다. 그러므로, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 결합 분자를 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 관절 손상을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

제 5, 6 및 7 일 각각에 RhmAb2.102 치료의 치료 효과를 조사하기 위해 추가의 CAIA 실험을 수행하였다(도 8). 상기 실험에서, RhmAb2.102는 항체를 염증 부위에 신속히 전달하기 위해 정맥내로 주사하였다. 이 실험에서, 제 3 일에 예방적 치료, 및 비치료 대조군이 포함되었다. 실험 절차는 제 3, 5 및 6 일에 마우스당 1 mg의 RhmAb2.102를 주사하는 차이를 제외하고 실시예 12에서와 동일하게 수행하였다. 예상된 바와 같이, 제 3 일에 RhmAb2.102는 염증 반응을 억제하였다. 마우스를 제 5, 6 또는 7 일에 RhmAb2.102의 정맥내 주사에 의해 치료하는 것은 도 6에서도 보여진 바와 같이 염증을 안정화시켰다(도 8). 염증의 증상이 감소하지 않은 반면 관절 침식에 대한 모든 파라미터는 감소된 것은 주목할 만하다. 이것은 관절 침식 및 염증이 별도로 치료될 수 있는 두가지의 별개의 존재임을 보여준다.

RhmAb2.102에 우선적으로 결합하는 또 다른 탈이민화 단백질을 질량 분광 분석법에 의해 확인하였다. 또한, RhmAb2.102에는 우선적으로 결합하지만 RhmAb2.101에는 결합하지 않거나 덜한 정도로 결합하는 탈이민화 단백질도 또한 추가의 질량 분광 분석법으로 확인하였다. 인간 PAD4 탈이민화된 인간 배아 신장 세포(Human Embryonic Kidney cell)(HEK293) 용해물을 RhmAb2.101 또는 RhmAb2.102로 면역침전시키고(실시예 11), 진보된 고성능 LTQ 퓨리에 변환 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass spectrometer)에 커플링된 고속 대량 나노-LC 시스템(nLC LTQ FTMS ULTRA)에 적용하였다(실시예 12). 지수적으로 변형된 단백질 풍도 지수(Exponentially Modified Protein Abundance Index, emPAI) 계산과 함께 그의 초고 질량 분해능, 질량 정확도로 인해 RhmAb2.102에 (우선적으로) 결합하는 탈이민화 단백질을 확인할 수 있었다. 이것은 표 7에 나타내었다(실시예 11 및 12).

따라서, 본 발명은 또한 염증 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 표 7에 나타낸 바와 같은 임의의 단백질 또는 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 결합 분자에 관한 것이다.

요약하면, 본원에서 p15, p17로 이루어진 군으로부터 선택된 분자상의 에피토프, 보다 특히 인간 PAD4 및/또는 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 2A 상의 시트룰린화된 에피토프, 인간 PAD4 탈이민화된 인간 히스톤 4, 인간 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 H4, 인간 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 H3 상의 시트룰린화된 에피토프, 또는 표 9의 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 및 보다 더 특히는 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 37 및 서열번호 38에 따른 펩티드와 특이적으로 반응하는 결합 분자는 본원에 명시된 바와 같이 염증 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 해당 결합 분자가 상기 언급한 분자들과 특이적으로 반응하는지 여부는, 결합 분자가 p15 또는 p17 상의 에피토프 또는 상기 언급한 임의의 시트룰린화된 에피토프에 결합하기 위해 RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 경쟁하는 능력을 분석함으로써 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 결합 조성물의 효능을 밝혔으므로, 이제 당해 분야에 숙련된 자에게 본 발명에 따른 특이적 결합 분자가 환자 자신의 체내(생체내)에서 생성되는 면역 반응을 유도함으로써 염증 질환이 또한 치료되거나 예방될 수 있음이 명백할 것이다. 상기 면역 반응은 염증 질환이 발생하는 것을 방지하기 위해(예방, 예방용 백신), 또는 염증 질환의 결과를 개선 또는 감소하기 위해, 즉 치료를 위해 유도될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한, p15, p17 상의 시트룰린화된 에피토프, 인간 PAD4 및 /또는 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 2A, 인간 PAD4 및/또는 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 4, 인간 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 H3 상의 시트룰린화된 에피토프, 및 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 37 및 서열번호 38에 따른 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프와 반응하는 특이적 결합 분자를 제조하는, 생체내에서 면역 반응을 유도함으로써 염증 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 백신 또는 치료는 효과적으로 본 발명에 따른 결합 분자와 특이적으로 반응하는 시트룰린화된 에피토프를 포함할 수 있다. 보다 특히, 시트룰린화된 에피토프는, 인간 PAD4 및/또는 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 2A, 또는 인간 PAD4 및/또는 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 4, 인간 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 H3 상의 시트룰린화된 에피토프, 또는 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 37 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드일 수 있다.

따라서, 많은 시트룰린 관련 염증 질환이 치료 또는 예방될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 염증 질환이 자가면역 질환, 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 다발성 경화증, 건선성 관절염, 건선, 알츠하이머병, 자가면역성 간염, 소아 특발성 관절염, 척추관절병증, 다운 증후군, 다계통 위축, 파킨슨병 및 루이소체 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전술한 바와 같은 방법에 관한 것이다. 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환의 예방 또는 치료가 특히 바람직하다.

본 발명의 상기 태양은 생체내 면역 반응에 관한 것이므로, 바람직한 특이적 결합 분자는 항체이다.

숙련된 자라면 본 발명에 T-세포 활성화 또는 보체 활성화와 같은 면역계를 활성화시키지 않거나 완전히 활성화시키지 않는 항체를 사용하는 것이 유리하다는 사실을 인지할 것이다. 그러므로, 본 발명을 인간에서 실행하고자 할 경우, 인간 IgG4 또는 IgG2의 Fc 부분을 사용하는 것이 바람직하다.

본원에 언급된 바와 같은 펩티드 및 단백질은 또한 염증 질환, 보다 바람직하게는 류마티스성 관절염을 진단하기 위해 특정 항체의 검출을 위한 항원으로 사용될 수 있다.

실시예

실시예 1: 재조합 인간 및 마우스 단클론성 항체

RA를 갖는 환자의 시트룰린화 항원에 대한 단클론성 항체를 기술된 바와 같이[Raats et al., J Reumatology, vol 30, 1696-1711 (2003)], 파지 디스플레이를 사용하여 초기에 선택하였다. 간략하게, RA를 갖는 3 명의 환자의 자가항체 레퍼토리를 그의 B-세포 레퍼토리에서 분리하고, 항체 단편 라이브러리를 제작하기 위해 사용하였다. 이들 라이브러리는 WO 98/22503 호에 기술된 바와 같은 시트룰린화 사이클릭 펩티드 CFC1-cyc에 대한 4 회의 친화성 선택에 적용하였다. CFC1-cyc와의 강한 반응성 및 비-시트룰린화 CFC0-cyc와의 반응성의 결여를 기준으로 항체 클론을 선택하였다(WO 98/22503 호).

문헌 [Raats et al., J Reumatology, vol 30, 1696-1711 (2003)]에 기술된 항체 암호화 서열을 문헌 [Stemmer et al., Gene, vol 164, 49-53 (1995)]에 따라 합성하고, 계속해서 인간 및 마우스 항체 이소타입을 암호화하는 포유동물 발현 벡터내에 클로닝하였다. 인간 항체는 이소타입 IgG1 람다를 가지며 RhmAb2.101, RhmAb2.102로 명명되었다.

RhmAb2.101은 클론 Ra3의 서열[Raats et al., J Reumatology, vol 30, 1696-1711 (2003)]을 기준으로 문헌 [Stemmer et al., Gene, vol 164, 49-53 (1995)]의 프로토콜에 따라 합성하였으며, 생식세포계열 부류 λ1b로부터 유도된 VL과 함께, 생식세포계열 부류 3-21로부터 유도된 VH로 이루어진다.

RhmAb2.102는 문헌 [Stemmer et al., Gene, vol 164, 49-53 (1995)]에 따라 합성하였으며, 서열번호 9에 의해 암호화된 면역글로불린 경쇄와 함께, 서열번호 8에 의해 암호화된 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 서열번호 8에 의해 암호화된 면역글로불린 중쇄는 서열번호 12에 따른 마우스 리더 글로블린, 그 뒤에 서열번호 13에 따른 가변성 항체 중쇄, 그 뒤에 서열번호 14에 따른 면역글로불린 불변 영역 인간 IgG1을 포함한다. 서열번호 9에 의해 암호화된 면역글로불린 경쇄는 서열번호 12에 따른 마우스 리더 글로블린, 그 뒤에 서열번호 15에 따른 가변성 항체 경쇄, 그 뒤에 서열번호 16에 따른 면역글로불린 인간 람다 불변 영역을 포함한다.

단클론성 항체 RhmAb2.101의 가변 영역(VH 및 VL)의 1차 mRNA 서열은 발표되었으며, 표 1에 나타낸 바와 같은 등록 번호하에 EMBL 데이터베이스에 기탁되었다. 전체 크기 인간 항체 서열은 항체 RhmAb2.102에 대해 기술된 바와 동일한 리더 및 불변 인간 영역을 사용하여 제조하였다.

[표 1]

시트룰린화 피브리노겐에 대한 대조군 항체 RmmAb13.101, RmmAb13.102 및 RmmAb13.103, 및 인간 U1-70k 단백질의 세포사멸 40 kD 분열 생성물에 대한 RhmAb2.201은 네덜란드, 니즈메젠 6525 XV, 샤우트스트라트 58 소재의 모디퀘스트 리서치 BV에서 수득하였다(카탈로그 번호, MQ13.101, MQ13.102, MQ13.103 및 MQ2.201).

실시예 2: 염증에 대한 실험 모델

모디퀘스트 리서치 B.V.로부터 상업적으로 시판하는 콜라겐 항체 유도된 관절염(CAIA) 마우스 모델(카탈로그 번호: MQ18.101)을 제조사의 설명서에 따라 사용하여 마우스에서 관절염을 유도하였다(http://www.modiquestresearch.nl/shop/ files/18.101-50MG%20_2007.08.22.pdf). 상기 목적으로, 제 0 일에 8 주령의 수컷 DBA/J1 마우스(5 내지 6 마리 마우스/군)에 8개 항-콜라겐 항체의 혼합물을 복강내 주사하였다. (도 1a 및 1b에 사용된 마우스는 1.6 mg의 항-콜라겐 항체 혼합물을 투여받은 반면, 도 1c 내지 f에 사용된 마우스는 2.4 mg을 투여받았다). 제 3 일에, 마우스에게 1 mg의 항-시트룰린 항체와 혼합된 25 ㎍ LPS를 함유하는 또 다른 복강내 주사를 제공하였다(달리 언급하지 않는 한). LPS는 염증을 유발한다. 실험 제 13 일까지 동물들을 그들의 발에 염증 증상에 대해 매일 스코어를 기록하였다. 스코어 기록은 표 2에 따라 수행하였다. 동물 당 최대 관절염 스코어는 8이다.

마우스 단클론성 항-시트룰린 항체 RmmAb13.101, RmmAb13.102 및 RmmAb13.103은 콜라겐 항체 유도된 관절염의 중증도를 높일 수 있는 것으로 확인되었다. 이들 항체의 혼합물은 심지어 보다 현저한 반응을 나타내었다. 이것은 필수적으로 항-시트룰린 항체가 관절염을 증가/유도할 수 있다는 초기 결과를 뒷받침한다[Kuhn et al., J. Clin. Invest, vol 116, 961-871 (2006); Hill et al., J Exp Med, vol 205, 967-979 (2008)]. 이러한 결과들은 도 1a 및 1b에 나타내었으며, 이들은 동일한 실험의 "평균 관절염 스코어" 및 "관절염 발병률"을 각각 나타낸다.

그러나, 인간 단클론성 항체 RhmAb2.102는 실험적 CAIA 모델에서 관절염의 임상 증상을 감소시키거나 또는 심지어 사라지게 한 반면, RhmAb2.101은 시험한 용량에서 전혀 영향을 미치지 않았다(도 1c 및 1d).

[표 2]

항-콜라겐 항체 주사후 제 3 일에 항-시트룰린 항체를 투여할 것인지 결정은, 대략 제 4 일에 실험적으로 유도된 관절염을 갖는 마우스의 발에 시트룰린화된 에피토프가 나타났음을 보여주는 본원에서 전술한 실험의 데이터를 기준으로 하였다.

실시예 3: 탈이민화 세포 추출물의 제조, SDS - page 전기영동 및 웨스턴 블로팅

COS-1 세포(8x10⁵)를 V-키트와 함께 아막사(AMAXA) 뉴클레오펙션(nucleofection) 장치(프로그램 D-005)를 사용하여 2 ㎍의 huPAD2 또는 huPAD4 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시키고, 세포를 T75 중에서 20 ml 배지에 시딩(seeding)하였다.

72 시간 후에, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 트립신화시키고, 스핀다운(spin down)시키고, 15 ㎕의 빙냉 용해 완충제(20mM 트리스 pH 7.4, 10mM β-머캅토에탄올, 100mM NaCl, 10% 글리세롤, 프로테아제 억제제)에 재현탁시켰다.

세포 샘플을 얼음 위에서 15 초동안 4회 초음파처리하였다. 용해물을 3,000 rpm에서 5 분간 원심분리하고 상등액을 깨끗한 튜브로 옮겼다. CaCl₂ 및 DTE를 각각 10 및 5 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 세포 용해물을 37 ℃에서 30 분 내지 2 시간동안 탈이민화시켰다. 탈이민화된 세포 용해물을 -20 ℃에서 저장하였다.

10x 샘플 완충제(0.25M 트리스 pH 6.8, 8% SDS, 35% 글리세롤, 2.5% β-머캅토에탄올, 브로모페놀블루)를 탈이민화 세포 용해물에 가하고 5 분간 비등시켰다. 약 5x10⁵ 세포에 상응하는 용해물을 SDS-PAGE(15% 겔)의 각 레인에 로딩하고 분리한 후, 하이본드(Hybond) C 엑스트라 니트로셀룰로스 막(아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))에 일렉트로블로팅(electroblotting)하였다. 블로팅 및 로딩은 폰소 S 염색으로 검사하였다.

실시예 4: 치료용 항- 시트룰린 항체는 p15 및 p17 을 인식한다

실시예 3에서와 같이 준비된 블롯을 스트립으로 절단하고 2 시간동안 RT에서 PBS-트윈(Tween)(세척 완충제) 중의 5%(w/v) 저지방 분유로 차단시켜 모든 비-특이적 부위를 차단하였다. 이어서, 블롯들을 5 분간 세척 완충제로 5회 세척하고 스트립을 RT에서 20 ㎍ 항-시트룰린 항체를 함유하는 4 ml의 세척 완충제와 함께 1 시간동안 더 배양하였다. 그런 후에, 스트립을 10 분간 세척 완충제로 5회 세척하고, 세척 완충제 중의 퍼옥시다제-접합된 토끼 항-인간 IgG(다코(Dako))(1:2000)과 함께 배양하였다(RT에서 1 시간). 이어서, 스트립을 10 분간 세척 완충제로 3회 세척한 후 PBS로 2회 세척하여 모든 비결합 항체를 세척하였다.

면역반응성 밴드를 화학발광 기질(피어스(PIERCE))을 사용하여 가시화시키고, 코닥 바이오맥스 자르(Kodak BioMax XAR) 방사선자동사진 필름(이스트만 코닥 캄파니(Eastman Kodak Co.), 미국 뉴욕주 로체스터)에 노출시켰다.

RhmAb2.102와 함께 배양된 스트립들은 약 15 및 17 kD의 분자량을 갖는 한 쌍의 단백질들과의 반응성을 나타내는 것이 관찰되었다.

실시예 5: 항원의 면역침전

면역침전을 위해, 30 ㎕의 단백질 A-고속 유동 세파로스(아머샴 바이오사이언시즈, 스웨덴 웁살라)와 함께 20 ㎍의 항-시트룰린 항체를 330 ㎕의 세포 용해물에 가하고, 4 ℃에서 회전시키면서 2 시간동안 배양하였다. 이어서, 면역결합된 단백질을 갖는 세파로스 비드를 IPP150(10mM 트리스/HCl, pH 8, 150mM NaCl, 0.1% NP40, 0.1% 트윈-20) 중에서 4회 세척하였다. 2 x 샘플 완충제(100mm 트리스-HCl, pH 6.8, 200 mm 다이티오트레이톨, 4% SDS, 0.2% 브로모페놀 블루, 20% 글리세롤)를 비드에 가하고, 단백질을 15% SDS-PAGE에 적용하였다. 겔을 RT에서 약하게 진동시키면서 염색 용액(10% w/v 황산암모늄, 2% w/v 인산(85%), 0.1% w/v CBB G-250, 20% v/v 메탄올)에 밤새 염색하였다. 모든 염색 트레이는 파라필름으로 밀봉하여 메탄올 증발을 방지하였다. 다음 날, 목적하는 염색이 가시적이 될 때까지 밀리-Q H20 중에서 겔을 배양하여 배경 탈-염색을 수행하였다. 탈-염색 용액(밀리-Q H20)을 겔의 이미지를 취한 후에 2 내지 3회 교환하였다.

인간 PAD2 및 PAD4 탈이민화 COS-1 용해물 둘 다에 대한 RhmAb2.102로 면역침전 결과, RhmAb2.101 침전물에서 검출될 수 없거나 거의 검출될 수 없는 현저한 p15 및 p17 단백질 밴드를 나타내었다. 그러므로, p15 및 p17 단백질의 인식율은 상기 항체들의 치료 성질과 잘 상관된다(도 1a 내지 d).

실시예 6: p15 및 p17 의 질량 분광 분석

실시예 3의 SDS-page 겔의 p15 및 p17에서의 밴드를 겔로부터 절제하고 MALDI-TOF MS로 분석하였다. 간략하게, 절제된 겔 조각을 50 ㎕의 25 mM 중탄산 암모늄으로 2회 세척하고, 각 세척 단계동안 30 분간 배양하였다. 15 분 세척을 30% v/v 아세토니트릴과 함께 상기에서와 같이 반복하였다. 모든 액체를 제거하고, 25 ㎕의 25 mM 중탄산나트륨 + 25 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하고, 15 분간 배양하였다. 다시 모든 액체를 제거하고, 겔을 50 ㎕의 아세토니트릴과 함께 30 분간 배양하였다. 모든 액체를 제거하고, 조각들을 37 ℃에서 2 시간동안 배양하여 탈수시켰다. 탈수후에, 겔 조각을 5 ㎕의 트립신 용액(약 15 ng 트립신/25 mM 중탄산암모늄 중 ㎕/5 mM n-옥틸-Β-D-글루코피라노시드)을 가하여 다시 팽윤시키고 얼음상에서 1 시간동안 배양하였다. 과량의 트립신 용액을 제거하고, 겔 조각을 37 ℃에서 5 ㎕의 25 mM 중탄산암모늄/5 mM n-옥틸-Β-D-글루코피라노사이드와 함께 14 시간동안 배양하였다. 펩티드를 RT에서 1 시간동안 4 ㎕의 50% 아세토니트릴/0.5% 트라이플루오로아세트산(TFA)/5 mM n-옥틸-Ｂ-D-글루코피라노사이드와 함께 배양함으로써 펩티드를 추출하였다. 샘플을 초음파 처리 수조에서 2 분간 초음파 처리하고, 액체를 새 튜브로 옮기고, 추출 단계를 반복하였다. 샘플을 진공 원심분리로 건조시키고 MALDI-TOF MS에 적용하였다.

MALDI-TOF MS 분석에서 확인된 모든 단편들은 히스톤 단백질에 기인하였다(표 3).

[표 3]

MALDI-TOF 데이터

실시예 7: 치료용 항- 시트룰린 항체 RhmAb2 .102는 H2A / p4 를 인식한다

인간 재조합 히스톤 H1, H2A, H2B, H3 및 H4(100 ㎍)를 37 ℃에서 53.4 mU의 huPAD2 또는 huPAD4의 존재 또는 부재하에 3 시간동안 배양하였다. 탈이민화 및 비-탈이민화 히스톤을 4 ℃에서 밤새 배양하여 96-웰 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다(0.3 ㎍/웰). 웰을 PBS-트윈20(PBS-T)으로 5회 세척하고 실온(RT)에서 PBS-T + 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 1 시간동안 배양하여 차단하였다. PBS-T로 5회 이상 세척한 후, 웰을 10 ㎍/웰의 농도에서 시작하여 PBS-T + 1% BSA 중의 RhmAb2.101또는 RhmAb2.102의 연속 희석물과 함께 RT에서 1 시간동안 배양하였다. 웰을 PBS-T로 5회 세척하고 RT에서 1 시간동안 토끼-항-인간-HRP와 함께(1:2000) 배양한 후, PBS-T로 5회 세척 및 PBS로 3회 세척 단계가 이어졌다. RhmAb2.101과 함께 배양된 웰을 15 분간 배양하고, RhmAb2.102와 함께 배양된 웰은 TMB 기질과 함께 10 분간 배양한 후 2M H₂SO₄로 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이것은 사용된 항체의 친화도에 대한 척도이다.

실시예 8: 치료용 항- 시트룰린 항체 RhmAb2 .102는 펩티드 1을 인식한다

96-웰 ELISA 플레이트를 4 ℃에서 밤새 배양하여 뉴트라비딘(0.1 ㎍/웰)으로 코팅하였다. 웰을 PBS-트윈20(PBS-T)으로 5회 세척하고 실온(RT)에서 PBS-T + 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 1 시간동안 배양하여 차단하였다. PBS-T로 5회 이상 세척한 후, 웰을 히스톤 유도된 시트룰린 및 비오틴 함유 펩티드(0.3 ㎍/웰)와 함께 RT에서 1 시간동안 배양하였다. PBS-T로 다시 5 회이상 세척한 후, 웰을 10 ㎍/웰의 농도에서 시작하여 PBS-T + 1% BSA 중의 RhmAb2.101, RhmAb2.102 또는 RhmAb2.104의 연속 희석물과 함께 RT에서 1 시간동안 배양하였다. 웰을 PBS-T로 5회 세척하고 RT에서 1 시간동안 토끼-항-인간-HRP와 함께(1:2000) 배양한 후, PBS-T로 5회 세척 및 PBS로 3회 세척 단계가 이어졌다. 웰을 TMB 기질과 함께 5 분간 배양한 후 2M H₂SO₄로 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이것은 사용된 항체의 친화도에 대한 척도이다.

실시예 9: 치료용 항- 시트룰린 항체는 피브리노겐 및 비멘틴 유도된 시트룰린 펩티드를 인식한다

96-웰 ELISA 플레이트를 4 ℃에서 밤새 배양하여 뉴트라비딘(0.1 ㎍/웰)으로 코팅하였다. 웰을 PBS-트윈20(PBS-T)으로 5회 세척하고 실온(RT)에서 PBS-T + 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 1 시간동안 배양하여 차단하였다. PBS-T로 5회 이상 세척한 후, 웰을 피브리노겐 및 비멘틴 유도된 시트룰린 및 비오틴 함유 펩티드(0.3 ㎍/웰)와 함께 RT에서 1 시간동안 배양하였다. PBS-T로 다시 5 회이상 세척한 후, 웰을 10 ㎍/웰의 농도에서 시작하여 PBS-T + 1% BSA 중의 RhmAb2.101 또는 RhmAb2.102의 연속 희석물과 함께 RT에서 1 시간동안 배양하였다. 웰을 PBS-T로 5회 세척하고 RT에서 1 시간동안 토끼-항-인간-HRP와 함께(1:2000) 배양한 후, PBS-T로 5회 세척 및 PBS로 3회 세척 단계가 이어졌다. 웰을 TMB 기질과 함께 5 분간 배양한 후 2M H₂SO₄로 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이것은 사용된 항체의 친화도에 대한 척도이다.

실시예 10: RhmAb2 .102의 치료 가능성

모디퀘스트 리서치 B.V.으로부터 상업적으로 시판하는 콜라겐 항체 유도된 관절염(CAIA)(카탈로그 번호: MQ18.101)을 제조사의 설명서에 따라 사용하여 마우스에서 관절염을 유도하였다(http://www.modiquestresearch.nl/shop/files/18.101-50MG%20_2007.08.22.pdf). 상기 목적으로, 제 0 일에 8 주령의 수컷 DBA/J1 마우스(5 마리 마우스/군)에 8개 항-콜라겐 항체의 혼합물을 복강내 주사하였다(2.8 mg/마우스). 제 3 일에, 마우스에게 25 ㎍ LPS를 함유하는 또 다른 복강내 주사를 제공하였다. LPS는 염증을 유발한다. 제 7 일에, 평균 관절염 스코어가 약 4(도 6a)가 되었을 때, 한 군은 1 mg RhmAb2.102를 함유하는 정맥내 주사를 투여하였고, 다른 군은 위약을 함유하는 정맥내 주사를 투여하였다.

동물들을 그들의 발에 염증 증상에 대해 매일 스코어를 기록하였다. 스코어 기록은 표 2에 따라 수행하였다. 동물 당 최대 관절염 스코어는 8이다. RhmAb2.102는 염증을 안정화시켰다(도 6a).

모든 우측 뒷발을 조직학 분석에 사용하였다. 조직을 4% 폼알데하이드에 4 일간 고정시키고, 5% 폼산에서 탈석회화시키고, 이어서 탈수시키고 파라핀에 삽입하였다. 7 ㎛의 표준 전두 절편을 슈퍼프로스트(SuperFrost) 슬라이드(멘첼-글라서(Menzel-Glaser), 독일 브라운슈바이크) 상에 고정시켰다. 관절 염증을 연구하기 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행하였다(세포 유입, 도 7d). 관절에서 염증의 중증도는 0 내지 3의 등급으로 스코어를 기록하였다(0 = 세포 없음, 1 = 약간의 세포충실도, 2 = 중간정도의 세포충실도 및 3 = 최대 세포충실도). 도 7a는 제 35 일에 육안으로 보이는 염증을 나타낸다. 연골 기질로부터의 프로테오글리칸(PG) 감소를 연구하기 위해(도 7e), 절편들을 사프라닌 O(SO)로 염색한 후 패스트 그린(fast green)으로 대조염색하였다. PG의 감소는 정상, 즉 완전히 염색된 연골로부터 탈염색된 연골, 즉 PG의 완전한 고갈까지의 범위인 0 내지 3의 임의 등급을 이용하여 측정하였다. 연골세포 사멸(도 7f)은 연골세포 핵의 무소실로부터 완전히 빈 연골 표면까지 범위의 0 내지 3의 등급으로 스코어를 기록하였다. 연골 및 골 침식(도 7b 및 c)은 무손상으로부터 연골 또는 골 구조의 완전한 소실까지 범위의 0 내지 3의 등급으로 등급을 매겼다. 관절에서 조직병리학적 변화는 70 m 이격된 관절의 5개 반연속 절편 상에서 스코어를 기록하였다. 스코어 기록은 실험 조건에 대한 사전 지식없이 블라인드로 수행되었다.

군들 가운데서 우측 뒷발에 육안으로 보이는 염증은 제 35 일에 동일하였지만(도 6a 및 7a), 관절 침식에 대해 하기의 파라미터 중 임의의 파라미터를 보았을 때 대조군에 비해 RhmAb2.102를 투여받은 실험군에서 현저한 감소가 관찰된다: 염증 세포 유입(도 7d), 연골 침식(도 7b), 연골 PG 감소(도 7e), 연골세포 사멸(도 7f) 및 골 침식(도 7c). 상기 결과는 RhmAb2.102의 치료 가능성을 강력하게 뒷받침한다.

실시예 11: huPAD4 탈이민화 HEK293 추출물의 제조 및 RhmAb2 .101 또는 RhmAb2.102를 사용한 면역침전

HEK293 세포를 수거하고, PBS로 1회 세척하고, 스핀 다운시키고, 5.105 세포를 15 ㎕의 빙냉 용해 완충제(20mM 트리스 pH 7.4, 10mM β-머캅토에탄올, 100mM NaCl, 10% 글리세롤, 프로테아제 억제제)에 재현탁하였다.

세포 샘플을 얼음 위에서 15 초동안 4회 초음파처리하였다. 용해물을 3,000 rpm에서 5 분간 원심분리하고 상등액을 깨끗한 튜브로 옮겼다. 단백질(모디퀘스트 리서치 B.V.; 카탈로그 번호: MQ16.203) 2 mg 당 1 U의 인간 PAD4, 10mM CaCl₂ 및 5mM DTT를 첨가함으로써 세포 용해물을 37 ℃에서 2 시간동안 탈이민화시켰다.

용해물의 탈이민화는 탈이민화된 HEK293 용해물을 SDS-Page(12.5% 겔) 전기영동에 이어 웨스턴 블로팅에 적용하여 확인하였다. 웨스턴 블롯들을 항체 RhmAb2.101 또는 RhmAb2.102로 면역염색시켰으며, 양성으로 나타났다. 무관련 항체로 처리된 블롯들은 염색을 나타내지 않았다.

이어서, 항체 RhmAb2.101 또는 RhmAb2.102를 사용하여 탈이민화된 HEK293 용해물에 면역침전(IP)을 수행하였다. 간략하게, 30 ㎕의 단백질 A 고속 유동 세파로스를 1 ml의 IPP500(10mM 트리스/HCl pH 8.0, 500mM NaCl, 0.1% NP40 및 0.1% 트윈-20)으로 5회 세척하고, 20 ㎍의 RhmAb2.101, 20 ㎍의 RhmAb2.102에 커플링시키거나, 커플링시키지 않았다(음성 대조군). 단백질 A 세파로스 비드/항체 혼합물을 일정한 회전하에 실온에서 1 시간동안 배양하였다. 비드를 1 ml의 IPP500으로 3회 세척, 1 ml의 IPP150(10mM 트리스/HCl, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.1% NP40, 0.1% 트윈-20)으로 1회 세척에 적용하고, 이어서 실온에서 일정한 회전하에 300 ㎕의 탈이민화 HEK293 용해물과 함께 2 시간동안 배양하였다. 비드를 1 ml의 IPP150으로 3회 세척한 다음, 소량을 SDS-PAGE 전기영동에 사용하여 HEK293 세포를 사용한 IP 절차가 성공적이었는지 여부를 결정하였다. RhmAb2.101, RhmAb2.102 및 대조군 비드 상의 면역침전된 단백질을 50 l의 용출 완충제(100mM 시트르산나트륨, pH 3.0)로 용출시키고, 10 l의 1M 트리스/HCl(pH 9.04)로 중화시키고, nLC LTQ FTMS ULTRA 질량 분석(실시예 12) 때까지 -20 ℃에서 저장하였다.

실시예 12: RhmAb2 .101 및 RhmAb2 .102 면역침전된 huPAD4 탈이민화 HEK293 단백질의 질량-분광 분석

면역침전된 단백질로부터 PEG를 제거하기 위해, 상기 단백질을 15% SDS-PAGE 겔 상에 로딩하고 바로 운전시켰다. 단백질을 겔로부터 절취하고 실시예 7에 기술된 바와 같이 트립신으로 겔내(in-gel) 절단하였다. 샘플을 nLC LTQ FTMS ULTRA 분석에 적용하기 전에 50 배 희석시켰다.

펩티드 및 단백질 동정물들을 호모 사피엔스(Homo sapiens) 분류체계를 갖는 NCBInr_20081022 데이터베이스를 이용하여 검색 프로그램 마스코트(Mascot)에 의해 데이터로부터 추론하였다. 검색에서 다음의 변화가 허용되었다: 시스테인(C)의 카브아미도메틸화(고정), 메티오닌(M)(가변적)의 산화, 및 아스파라진(N), 아르기닌(R) 및 글루타민(Q)(가변적)의 탈아미드화. 탈이민화는 검색 도구로 사용될 수 없었다. 탈아미드화 및 탈이민화가 둘 다 비-변형 아르기닌에 비해 1 달톤의 질량 차이를 야기하기 때문에 상기 문제는 배제될 수 있었다.

단백질 확인 검증은 사내 개발 스크립트에 의해 수행되었다. 간략하게, 상기 소프트웨어는 유일하게 확인된 펩티드 서열을 기준으로 단백질 동정물을 분류하고, 동일한 세트의 펩티드를 공유하는 단백질을 무리짓고, 단백질을 하기의 기준에 따라 인증한다:

1개의 펩티드를 갖는 단백질은 펩티드 스코어:>49를 가져야 한다

1개보다 많은 펩티드를 갖는 단백질은 펩티드 스코어:>29를 가져야 한다.

사용된 인증 기준에 따라, 펩티드는 모두 3개의 샘플에서 확인되었다(샘플 1: RhmAb2.101에 의한 HEK293 침전물; 샘플 2: RhmAb2.102에 의한 HEK293 침전물; 샘플 3: 빈 비드를 갖는 HEK293 침전물).

emPAI(지수적으로 변형된 단백질 풍도 지수)를 모든 인증 단백질에 대해 계산하였다. emPAI는 데이터베이스 검색 결과에서 펩티드 부합물에 의한 단백질 범위를 기준으로 혼합물중 단백질의 대략적인 비표지 상대적 정량화를 제공한다. 상기 기술로 인해 RhmAb2.102에 (우선적으로) 결합하는 탈이민화 단백질을 확인할 수 있다. 이것은 표 9에 나타내었다.

[표 9]

nLC LTQ FTMS ULTRA 데이터

실시예 13: 한 부류의 소염성 항체의 제조/선택

인간-유래 scFv 라이브러리를 인간 히스톤-2A 히스톤-4, 펩티드 1 (AAASGXGKQGGK, 서열번호 21)의 PAD2- 또는 PAD4-탈이민화 형태에 대해서, 및 CFC-1 펩티드에 대해 라츠 등의 문헌에 기술된 바와 유사한 방법으로 패닝하였다[Raats, J.M.H., Wijnen, E.W., Pruijin, G.J.M., Van den Hoogen, F.H.M., and W.J. van Venrooij, J. Rheum. 30, 1696-1711 (2003)].

CFC-1 및/또는 펩티드 1(AAASGXGKQGGK, 서열번호 21) 및/또는 PAD-탈이민화 히스톤 2a 및/또는 히스톤 4와 시트룰린 의존성 반응성을 나타낸 선택된 항체를 다수의 시트룰린화 단백질 및/또는 그의 유도된 펩티드(실시예 12, 표 9)에 대한 반응성, PAD2 및 PAD4 탈이민화된 인간 히스톤 이소형(isoform)에 대한 반응성, 및 탈이민화된 인간 히스톤-유도된 펩티드에 대한 반응성에 대해 선별하였다. 동시에, PAD2 및 PAD4 탈이민화된 인간 세포 추출물 및 RA 환자로부터의 활막액에 면역침전을 수행하였다.

밴드 p15 및/또는 p17을 면역침전시킨 항체, 및/또는 RhmAb2.102에 필적하는 시트룰린화된 에피토프(PAD2 및 PAD4 탈이민화된 인간 히스톤 이소형, 및/또는 CFC-1, 및/또는 펩티드 1(AAASGXGKQGGK, 서열번호 21), 및/또는 표 9에 열거된 단백질로부터 유도된 시트룰린화된 에피토프)에 대한 ELISA 반응성 프로필을 갖는 항체를 계속해서 인간 IgG1 포맷내에 클로닝하였다. 전체 크기 인간 IgG 항체를 본원에 기술한 바와 같은 CAIA 마우스 모델에서 그의 예방 및/또는 치료적 소염 가능성에 대해 검사하였다.

상기 선별 절차는 고빈도 CAIA 마우스 모델에서 예방 및/또는 치료적 소염 가능성을 갖는 항체를 제공하였다.

상기 방법에 따라 선택된 신규 항체의 예는 RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112이며, 본원에서 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 39, 서열번호 20, 서열번호 41, 서열번호 40, 서열번호 19, 서열번호 43, 서열번호 42에 개시되어 있다. 서열번호 10에 의해 암호화되는 RhmAb2.110 면역글로불린 경쇄는 서열번호 12에 따른 마우스 리더 글로불린, 그 뒤에 서열번호 41에 따른 가변 항체 경쇄, 그 뒤에 서열번호 11에 따른 면역글로불린 인간 카파 불변 영역을 포함한다.

이어서, 콜라겐 항체 유도된 관절염(CAIA) 모델을 사용하여 RhmAb2.102와 비교하여 RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112의 소염 효과를 검사하였다. 이를 위해, 모든 항체를 HEK293 세포에서 일시적으로 생성하였다. 3 마리 DBA/J1 마우스의 군을 제 0 일에 2.8 mg 항-콜라겐 항체(MQ18.101)의 복강내 주사로 처리하였다. LPS(25 ㎍/마우스) 뿐 아니라, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111, RhmAb2.112 및 RhmAb2.102(1 mg/마우스) 및 위약을 제 3 일에 복강내 주사에 의해 투여하였다. 모든 동물은 제 10 일까지 염증에 대해 스코어를 기록하였다.

상기 실험에서, 모든 새로 생성된 항체는 RhmAb2.102에 비해 더 우수한 소염 반응을 나타내었으며, RhmAb2.119, RhmAb2.110은 염증을 완전히 사라지게 한 반면, RhmAb2.112는 거의 사라지게 하였고, RhmAb2.111 및 RhmAb2.108은 시험 동물에서 염증 증상을 강하게 경감시켰다(도 9).

실시예 14: 마우스 단클론성 항체

본 발명에 따른 합성 시트룰린 함유 펩티드에 대한 항체를 DBA/J1 마우스에서 생성하였다. 면역 과정 출발후 제 125 일에, 혈청 샘플을 취하고 시트룰린 특이적 항원 반응에 대해 분석하였다. 모든 마우스는 시험한 시점에서 특이적 항원 특이적 혈청 역가를 나타내었다.

하이브리도마 세포주를 생성하기 위해, 마지막 면역강화(boost)후 비장을 해부하고, 비장으로부터 비장세포를 수거하고 모디퀘스트 B.V. 절차에 따라 마우스 골수종 세포주(NS-1)과 융합시켰다. 하이브리도마 상등액에서 항체 특이성을 시트룰린 함유 항원에 대해서 및 비-시트룰린 등가물에 대해서 선별하였다.

이로부터 하이브리도마 클론(DSMZ 등록번호 ACC 3031 및 ACC 3032)을 수득하여, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102를 각각 생성하였다(서열번호44 및 서열번호 45).

이어서, 콜라겐 항체 유도된 관절염(CAIA) 모델을 사용하여 RhmAb2.102와 비교하여 RmmAb22.101 및 RmmAb22.102의 소염 효과를 검사하였다. 3 마리 DBA/J1 마우스의 군을 제 0 일에 2.8 mg 항-콜라겐 항체(MQ18.101)의 복강내 주사로 처리하였다. LPS(25 ㎍/마우스) 뿐 아니라, RmmAb22.101, RmmAb22.102 및 RhmAb2.102(6 mg/마우스) 및 위약을 제 3 일에 복강내 주사에 의해 투여하였다. 모든 동물은 제 10 일까지 염증에 대해 스코어를 기록하였다.

RhmAb2.102, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102 항체는 마우스를 그들의 발의 염증으로부터 완벽하게 보호하였다(도 10).

실시예 15: 신규 치료용 항- 시트룰린 항체들은 RhmAb2 .102와 비교하여 시트룰린화된 에피토프 에 대해 유사한 인식 패턴을 나타낸다

실시예 7 및 8에서 기술한 실험과 유사하게, 새로 제조된 항체 RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111, RhmAb2.112, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102를 RhmAb2.102와 비교하여 다양한 탈이민화 표적에 대한 그의 반응성에 대해 ELISA로 분석하였다.

인간 재조합 히스톤 H1, H2A, H2B, H3 및 H4(100 ㎍)를 실시예 7에서와 같이 탈이민화시켰다.

탈이민화 및 비-탈이민화 히스톤을 4 ℃에서 밤새 배양하여 96-웰 ELISA 플레이트 상에 코팅시켰다(0.3 ㎍/웰).

다음으로 탈이민화 히스톤 항체들을 또한 일련의 비오티닐화 펩티드, 그의 시트룰린화 및 비-시트룰린화 형태 둘 다에서 시험하였다. 펩티드의 코팅은 실시예 8에 기술된 바와 같이 수행하였다.

모든 코팅된 웰을 PBS-트윈20(PBS-T)으로 5회 세척하고 실온(RT)에서 PBS-T + 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 1 시간동안 배양하여 차단하였다. PBS-T로 5회 이상 세척한 후, 웰을 2.5 ㎍/웰의 농도에서 시작하여 PBS-T + 1% BSA 중의 항체들의 연속 희석물과 함께 RT에서 1 시간동안 배양하였다. 웰을 PBS-T로 5회 세척하고 RT에서 1 시간동안 토끼-항-인간-HRP와 함께(1:2000) 배양한 후, PBS-T로 5회 세척 및 PBS로 3회 세척 단계가 이어졌다. 10 분간 TMB 기질로 염색한 후 2M H₂SO₄로 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이것은 사용된 항체의 친화도에 대한 척도이다. 이것은 모든 치료 항체들이 치료 항체 RhmAb2.102와 비교하여 매우 유사한 염색 패턴을 가짐을 명백히 보여준다. 마우스 단클론 항체만이 Cfc1-펩티드와의 반응성을 나타내지 않는다. 모든 치료 항체들은 서열번호 21에 따른 펩티드 뿐 아니라, 히스톤 2A/p2 히스톤 2A/p4, 및 히스톤 4/p2와도 매우 높은 반응성을 가지며, 히스톤 3/p2와는 약한 반응성을 나타낸다.

DSMZ(독일 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하) ACC03031 20091202 DSMZ(독일 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하) ACC03032 20091202

SEQUENCE LISTING <110> MODIQUEST B.V. <120> ANTI-INFLAMMATORY AGENTS DIRECTED AGAINST CITRULLINATED EPITOPES <130> 134 WO <150> PCT/EP2010/069431 <151> 2010-12-10 <150> EP09178658.2 <151> 2009-12-10 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Lys Ala Met Gly Ile Met Asn Ser Phe Val Asn Asp Ile Phe Glu Arg 1 5 10 15 Ile <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Ile Tyr Val Tyr Lys Val 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Bos Taurus <400> 3 Lys Ala Met Gly Ile Met Asn Ser Phe Val Asn Asp Ile Phe Lys Arg 1 5 10 15 Ile <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> H2bn Bos Taurus <400> 4 Lys Ala Met Gly Asn Met Asn Ser Phe Val Asn Asp Ile Phe Glu Arg 1 5 10 15 Ile <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 5 Arg Lys Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys Arg 1 5 10 15 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Arg Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 12 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cacgatctcc 120 tgctctggaa gcagctccaa cattggcaat aattatgtat cctggtatca gcaagtccca 180 ggaacagccc ccaaactcct catttatgac gacaataaga gaccctccgg aattcccggc 240 cgattctctg gctccaagtc tgccacgtcc gccaccctgg gcatcaccgg actccaggct 300 ggggacgagg ccgattatta ctgcggatca tgggatgata acctgagtgt tgtgcttttc 360 ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg 420 ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 480 gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 540 ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctat 600 ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 660 gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttca 705 <210> 10 <211> 699 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 10 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt gcattccgac 60 atccagatga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag aatcaccatc 120 acttgccggg caagtcagag cattagcaac tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg 180 aaagtcccta agctcctgat ctatgctgca tccagcttgc aaagtggggt cccagcaagg 240 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc agtctcacca tcagcagtct gcaacctgaa 300 gatttcgcaa cttactactg tcaacagagt tacagtaccc ctctgacttt cggcggaggg 360 accaaggtgg aaatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 699 <210> 11 <211> 321 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 11 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 13 <211> 127 <212> PRT <213> human <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Leu Ser Thr Asn 20 25 30 Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Arg Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Trp Thr Gly Asp Asp Ile Tyr Glu Ala Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Arg Gln Tyr Arg Asp Gly Arg Gly Tyr Val Val Asn Asp 100 105 110 Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <211> 330 <212> PRT <213> human <400> 14 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 15 <211> 110 <212> PRT <213> human <400> 15 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Met Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Ala Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Asp Asn Leu 85 90 95 Ser Val Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 16 <211> 106 <212> PRT <213> human <400> 16 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 17 <211> 330 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 17 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcaatg tctgcggccc caggacagaa ggtcacgatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggc aataattatg tatcctggta tcagcaagtc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacgacaata agagaccctc cggaattccc 180 ggccgattct ctggctccaa gtctgccacg tccgccaccc tgggcatcac cggactccag 240 gctggggacg aggccgatta ttactgcgga tcatgggatg ataacctgag tgttgtgctt 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 18 <211> 381 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 18 caggtacagc tgcagcagtc agggggaggc ctggtcaggc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt caacctcagc accaatttta tgaactgggt ccgccagagt 120 cgagggaagg ggctggagtg gatctcatcc attagttgga ctggtgatga tatatatgag 180 gcagactcac tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa cacagtgtat 240 ctgcaactga gcagcctgac accggacgac acggctgtct attactgtgc gagagtgcgc 300 cagtatcgtg atggtagggg gtatgtcgtt aatgacgctc ttgatatttg gggccaaggg 360 acaacggtca ccgtgtcgtc a 381 <210> 19 <211> 330 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 19 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctccgtg tctgcgaccc caggacagaa ggtctccatc 60 tcctgctctg gaagcggcgc caacattggc aatacttatg tctcctggta ccaacaactc 120 ccaggatcag cccccaaact cctcatttac gacgataatc agcgaccctc tgggattcct 180 gaccgattct ctggcgccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcgc cgggctccag 240 actggggacg aggccgacta tttctgcgga gcatgggaca gtagcctgag tgcttttgtc 300 ttcggatctg ggacccagct caccgtttta 330 <210> 20 <211> 366 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 20 caggtgcagc tgcaggagtc tggcccaggg gtggtgaagc cttcggagac gctgtctcta 60 acctgcaatg tctccggtga ctccatcagt gatggctact actggggctg gatccggcag 120 cccccaggga ggggactgga gtggattgga agtgtctatt ataatcgaaa caccttctac 180 aattcgtccc tcgagagtcg agtcagtctt tcacttgaca cttccaagaa ccacctctcc 240 ctgacgatga gcgatgtgac cgccgcagac acagccgttt atttctgttc gagagggcga 300 tccaaatttg gtccaaatga tgcttttgaa atttggggcc aagggaccac ggtcaccgtg 360 tcgtca 366 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 21 Ala Ala Ala Ser Gly Xaa Gly Lys Gln Gly Gly Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 22 Ala Lys Ala Lys Ser Xaa Ser Ser Arg Ala Gly Leu 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 23 Lys Ser Arg Ser Ser Xaa Ala Gly Leu Gln Phe Pro 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 24 Gln Phe Pro Val Gly Xaa Val His Arg Leu Leu Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 25 Val Gly Arg Val His Xaa Leu Leu Arg Lys Gly Asn 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 26 Val His Arg Leu Leu Xaa Lys Gly Asn Tyr Ser Glu 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 27 Gly Asn Tyr Ser Glu Xaa Val Gly Ala Gly Ala Pro 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 28 Ala Gly Asn Ala Ala Xaa Asp Asn Lys Lys Thr Arg 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 29 Asp Asn Lys Lys Thr Xaa Ile Ile Pro Arg His Leu 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 30 Thr Arg Ile Ile Pro Xaa His Leu Gln Leu Ala Ile 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 31 Leu Gln Leu Ala Ile Xaa Asn Asp Glu Glu Leu Asn 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = citrulline <400> 32 Asn Lys Leu Leu Gly Xaa Val Thr Ile Ala Gln Gly 1 5 10 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(17) <223> X = citrulline <400> 33 Leu Ser Glu Gly Gly Gly Val Arg Gly Pro Arg Val Val Glu Xaa His 1 5 10 15 Xaa Ser Gln Cys Lys Asp 20 <210> 34 <211> 22 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X = citrulline <400> 34 Leu Ser Glu Gly Gly Gly Val Xaa Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His 1 5 10 15 Gln Ser Gln Cys Lys Asp 20 <210> 35 <211> 22 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X = citrulline <400> 35 Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Gly Pro Arg Val Val Glu Xaa His 1 5 10 15 Gln Ser Ala Cys Lys Asp 20 <210> 36 <211> 22 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X = citrulline <400> 36 Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Xaa Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His 1 5 10 15 Gln Ser Ala Cys Lys Asp 20 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X = citrulline <400> 37 Glu Pro Thr Asp Ser Leu Asp Ala Xaa Gly His Arg Pro Val Asp Arg 1 5 10 15 Arg <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> human <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(11) <223> X = citrulline <400> 38 Tyr Val Thr Xaa Ser Ser Ala Val Xaa Leu Xaa Ser Ser Val Pro 1 5 10 15 <210> 39 <211> 330 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 39 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagcg tctgggaccc ccggacagag cgtcaccatc 60 tcttgttctg ggggcgactc caacatcggg gcgaatcatg taatctggta ccaccaaatc 120 ccacaaatgg cccccaaact gctcgtccat actagtgatc accggccctc aggggtccct 180 gagcgattct ctggttccaa gtctggcacg tcagcctccc tggccatcac tgggctccag 240 tctgaggatg acggtgatta ttactgttca gcttgggatg acaatctcag tggctggaca 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 40 <211> 354 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 40 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaggaagc ctggggcctc agttaaggtc 60 tcctgtaagg cttcgggtta cagatttgcc agctacggta tcaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcggcggtt acactggtta cacagactat 180 gcacagaagt tcgaggacag aatcaacatg accacagaca catccacgac cacagtttac 240 atggagctga ggagcctgag aactgacgac acagccgtat actattgtac gaggggaatt 300 gggccttccc cgatggacgc ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtgtc gtca 354 <210> 41 <211> 321 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 41 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagaatcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagtcc ctaagctcct gatctatgct gcatccagct tgcaaagtgg ggtcccagca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcagtctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctctgac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 42 <211> 369 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 42 gaggtgcagc tggtggagtc tggcccagga ctggtgaagt cttcggagac cctgtctctc 60 acctgccatg tctccggtta ctccatcagc gatggttact actggggctg gatccggcag 120 tccccaggga agggactgga gtggattggg agtaggcatc atggggggaa cgccaccttc 180 tacaatccgt cacacaagag tcgagtcagc ctcttaattg acacctccaa gaaccagttg 240 tccctgaaga tgcactctgt gaccgccgca gacacggcca tttactactg tgcgagaggg 300 cttcatatcg atggttggaa cgatgctttt gagatctggg gccgagggac cacggtcacc 360 gtgtcgtca 369 <210> 43 <211> 330 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 43 tcctatgtgc tgactcagcc accctcaacg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaggcttctc caacatcgga cttaataatg taaactggta tcagcaactc 120 ccagaaacgg cccccaaact cctcatctat agtagtgatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tggttgggtg 300 ctcggcggag gaaccaagct gaccgtccta 330 <210> 44 <211> 367 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 44 cggatccagt tggtgcagtc tggacctgaa ctgaagaagc ctggtgaggc agtcaagatc 60 tcctgtaagg cttctggata taccttcaca aactatggta tgcactggat gaaacagact 120 ccaggaaagg attttaggtg gatgggctgg ataaacacct acagtggaga ggcaacatat 180 gttgatgact tcaagggacg cttcgccttc tctttgggaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa gaatgacgac acggctacat atttctgttt aagaggctat 300 acttaccaaa gtttcgacga agggggcgac tactggggcc agggcaccgc tctcacagtc 360 tcctcag 367 <210> 45 <211> 338 <212> DNA <213> mus musculus <400> 45 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccactggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctcttg gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgtttcaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatat atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caatttggaa ataaaacg 338

Claims (9)

1. 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 인간 PAD4 및/또는 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 2A 및/또는 히스톤 4, 및/또는 인간 PAD2 탈이민화된 인간 히스톤 H3 상의 시트룰린화된 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체로서, 서열번호 18, 서열번호 17, 서열번호 20, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 19, 서열번호 43, 서열번호 42, 서열번호 44 및 서열번호 45로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열로부터 수득할 수 있는 특이적 결합 영역을 포함하는 항체.
2. 제 1 항에 있어서,
   서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 37 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드와 특이적으로 반응하는 항체.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   재조합 항체, 단쇄 항체, 단쇄 가변 단편(scFv), 단편 항원 결합 영역(Fab), 단일 영역 항체(sdab), VHH 항체, 나노바디, 카멜리드 유래 단일 영역 항체, 상어 IgNAR 유래 단일 영역 항체 단편(VNAR), 안티칼린 및 압타머로 이루어진 군으로부터 선택된 항체.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111 및 RhmAb2.112, RmmAb22.101 및 RmmAb22.102로 이루어진 군으로부터 선택된 단클론성 항체인 항체.
5. 서열번호 18, 서열번호 17, 서열번호 20, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 19, 서열번호 43, 서열번호 42, 서열번호 44 및 서열번호 45로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원 결합 영역을 포함하는 항체를 포함하는 소염 조성물의 치료 효과량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스성 관절염을 예방 또는 치료하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서,
   항체가 서열번호 17, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 19, 서열번호 43 및 서열번호 45로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 영역과 함께, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 40, 서열번호 42 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 영역을 포함하는 방법.
7. 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 17, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 19, 서열번호 43 및 서열번호 45로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 또는 경쇄 영역에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
8. 제 7 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
9. 제 8 항에 있어서,
   서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 17, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 19, 서열번호 43 및 서열번호 45로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.

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