KR20120103621A

KR20120103621A - 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성 방법

Info

Publication number: KR20120103621A
Application number: KR1020127014798A
Authority: KR
Inventors: 찰스 포레스터 버드; 조균 라; 안토니 존 신스키
Original assignee: 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
Priority date: 2009-11-11
Filing date: 2010-11-10
Publication date: 2012-09-19
Also published as: WO2011060048A3; EP2499235A2; WO2011060048A2; JP2013510572A; AU2010319594A1; US20130017583A1; WO2011060048A8; CN102822349A

Abstract

본 발명은 재조합 유전자 발현을 통한, 고함량의 3-히드록시헥사노에이트 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성에 관한 것이다.

Description

고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성 방법{METHODS FOR PRODUCING POLYHYDROXYALKANOATE COPOLYMER WITH HIGH MEDIUM CHAIN LENGTH MONOMER CONTENT}

관련 출원

본 출원은 2009년 11월 11일에 제출된, "고함량의 중쇄(medium chain) 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성 방법"의 명칭을 갖는 미국 가출원 일련 번호 61/260,164 (그 개시내용 전문이 본원에 참고로 포함됨)의 이익을 미국 특허법 제120조(35 U.S.C. § 120)하에 주장한다.

본 발명의 분야

본 발명은 재조합 유전자 발현을 통한, 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성에 관한 것이다.

상업적으로 유용한 복합 생중합체인 폴리히드록시부티레이트는 다수의 박테리아에 의해 생성되는 세포내 물질이다. 폴리히드록시부티레이트 (PHB)는 중합체의 화학적 및 물리적 특성 둘 모두를 기재로 하는 유용한 생물질이다. PHB는 생분해성/열가소성 재료, 특정 항생제의 유기 합성을 위한 키랄 중심의 공급원, 및 약물 전달 및 골 대체용 매트릭스로서의 유용성을 비롯하여, 다양한 잠재적 응용성을 갖는다. 생체내에서, 중합체는 인간 혈액의 기본 구성성분인 히드록시부티레이트로 내부적으로 분해된다. 폴리히드록시알카노에이트 (PHA (PHB 포함)) 및 공중합체의 생성에 관한 다양한 측면이, 예를 들어 미국 특허 제5,534,432호, 미국 특허 제5,663,063호, 미국 특허 제5,798,235호 및 미국 특허 제7,202,064호에 기재되어 있다.

한 예로서, 박테리아 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)는 높은 수준의 폴리히드록시알카노에이트 (PHA) 바이오플라스틱을 축적하는 것으로 널리 공지되어 있다. 야생형 유기체는 전형적으로 동종중합체인 폴리히드록시부티레이트 (PHB)를 생성한다. 이러한 중합체는 β-케토티올라제 (PhaA), 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (PhaB) 및 폴리히드록시알카노에이트 신타제 (PhaC)의 작용에 의해, 아세틸-CoA로부터 생성된다. PHB는 취성이 있고 이의 분해 온도에 근접한 용융 온도를 갖기 때문에, 유용한 바이오플라스틱은 아니다.

중합체 사슬로의 3-히드록시헥사노에이트 단량체의 도입은 인성이 더 강하고 PHB보다 더 낮은 용융 온도를 갖는 물질을 만들어 내어, 플라스틱의 성능을 증가시키고 이 물질을 PHB보다 더 많은 응용에 적합하게 만든다는 것이 이전에 증명되었다.

미국 특허 제7,235,621호는 매우 특정한 조건하에서의 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체의 생성을 기재하고 있다. 미국 특허 제7,235,621호는, 공중합체를 생성하는 미생물을 위한 탄소 공급원으로서 고함량의 라우르산을 갖는 특정 식물성 오일이 요구된다는 것을 기재하고 있다. 상기의 요구되는 오일은 보다 흔한 오일, 예컨대 팜유, 대두유 및 평지씨유에서 발견되는 것보다 더 짧은 지방산을 갖는다. 이러한 제한적인 탄소 공급원의 요건에도, 미국 특허 제7,235,621호에 개시된 공중합체 내 3-히드록시헥사노에이트의 최고량은 13.8 mol％이다.

미국 특허 공보 제2009/0130731호는, PHA 신타제 유전자 (phaC) 및 3-케토아실-ACP 리덕타제 유전자 (fabG)를 재조합적으로 발현하는 박테리아에서의 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체의 생성을 기재하고 있다. 그러나, 미국 특허 공보 제2009/0130731호에 개시된 공중합체 내 3-히드록시헥사노에이트의 최고량은 4 mol％이다.

본 발명의 요약

일부 측면에서, 탄소 공급원으로서 임의의 식물성 오일을 사용하여 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 중쇄 길이 단량체 함량을 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체를 생성하는 세포 또는 유기체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 유기체는 탄소 공급원으로서 임의의 식물성 오일을 사용하여, 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 HHx 함량을 갖는, 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체 (폴리(HB-코-HHx))를 생성한다. 일부 실시양태에서, 세포 내 3-히드록시부티레이트의 정상적인 합성이 파괴된다. 일부 실시양태에서, 아세토아세틸-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 랄스토니아 유트로파 세포이고, phaB1, phaB2 및 phaB3 유전자 중 하나 이상이 파괴되어 있다. 일부 실시양태에서, phaB3 유전자가 파괴되어 있다.

일부 실시양태에서, 세포 또는 유기체는 비내인성 PHA 신타제 유전자를 재조합적으로 발현한다. 일부 실시양태에서, 비내인성 PHA 신타제 유전자는 에어로모나스 카비애(Aeromonas caviae) PHA 신타제 유전자 또는 로도코쿠스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) PHA 신타제 유전자이다. 일부 실시양태에서, 로도코쿠스 에테리보란스 PHA 신타제 유전자는, 서열 4를 코딩하는 로도코쿠스 에테리보란스 I24 D12 PHA 신타제 유전자 또는 서열 2를 코딩하는 로도코쿠스 에테리보란스 I24 C09 PHA 신타제 유전자이다. 일부 실시양태에서, 로도코쿠스 에테리보란스 I24 D12 PHA 신타제 유전자는 서열 3을 포함하거나 이로 이루어지고/거나, 로도코쿠스 에테리보란스 I24 C09 PHA 신타제 유전자는 서열 1 또는 개시 코돈이 TTG에서 ATG로 변경된 서열 1을 포함하거나 이로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 세포 또는 유기체는 에노일-CoA 히드라타제 유전자를 재조합적으로 발현한다. 일부 실시양태에서, 에노일-CoA 히드라타제 유전자는 에어로모나스 카비애 에노일-CoA 히드라타제 유전자 또는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 에노일-CoA 히드라타제 유전자이다. 일부 실시양태에서, 슈도모나스 에어루지노사 에노일-CoA 히드라타제 유전자는 슈도모나스 에어루지노사 phaJ1 유전자 (유전자 PA3302) 또는 슈도모나스 에어루지노사 phaJ2 유전자 (유전자 PA1018)이다.

일부 실시양태에서, 비내인성 PHA 신타제 유전자 및/또는 에노일-CoA 히드라타제 유전자는 증폭된다. 일부 실시양태에서, 단량체 함량은 적어도 약 5 mol％, 적어도 약 6 mol％, 적어도 약 7 mol％, 적어도 약 10 mol％, 적어도 약 15 mol％ 또는 적어도 약 20 mol％이거나, 또는 그보다 많다.

일부 실시양태에서, 단량체 함량은 적어도 약 6 wt％, 적어도 약 8 wt％, 적어도 약 10 wt％, 적어도 약 15 wt％, 적어도 약 10 wt％ 또는 적어도 약 25 wt％이거나, 또는 그보다 많다.

일부 실시양태에서, 세포 또는 유기체는 박테리아 세포, 진균 세포 (효모 세포 포함), 식물 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 랄스토니아 종, 에어로모나스 종, 리조비움(Rhizobium) 종, 알칼리게네스(Alcaligenes) 종 또는 슈도모나스 종 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 랄스토니아 유트로파, 에어로모나스 카비애, 리조비움 제포니큠(Rhizobium japonicum), 알칼리게네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus) 또는 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) 세포이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 세포는 랄스토니아 유트로파 세포이다.

일부 실시양태에서, 비내인성 PHA 신타제 유전자 및/또는 에노일-CoA 히드라타제 유전자는 플라스미드로부터 발현된다.

일부 실시양태에서, 비내인성 PHA 신타제 유전자 및/또는 에노일-CoA 히드라타제 유전자는 세포의 게놈에 통합된다.

다른 측면에서, 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성 방법이 제공된다. 상기 방법은, 상기 세포 또는 유기체를 배양하여 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 중쇄 길이 단량체 함량을 갖는 공중합체를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 또는 유기체를 배양하여 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 HHx 함량을 갖는, 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체인 폴리(HB-코-HHx)를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 또는 유기체로부터 공중합체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 생성된 공중합체의 양은 세포 건조 중량의 적어도 약 20％, 세포 건조 중량의 적어도 약 30％, 세포 건조 중량의 적어도 약 40％, 세포 건조 중량의 적어도 약 50％, 세포 건조 중량의 적어도 약 60％이거나, 또는 그보다 많다.

다른 측면에서, 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 중쇄 길이 단량체 함량을 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체를 생성하는 세포의 생산 방법이 제공된다. 상기 방법은 세포 내에서 적어도 하나의 로도코쿠스 에테리보란스 PHA 신타제 유전자를 재조합적으로 발현하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 HHx 함량을 갖는, 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체 (폴리(HB-코-HHx))를 생성한다. 일부 실시양태에서, 로도코쿠스 에테리보란스 PHA 신타제 유전자는, 서열 4를 코딩하는 로도코쿠스 에테리보란스 I24 D12 PHA 신타제 유전자 및/또는 서열 2를 코딩하는 로도코쿠스 에테리보란스 I24 C09 PHA 신타제 유전자이다. 일부 실시양태에서, 로도코쿠스 에테리보란스 I24 D12 PHA 신타제 유전자는 서열 3을 포함하거나 이로 이루어지고/거나, 로도코쿠스 에테리보란스 I24 C09 PHA 신타제 유전자는 서열 1 또는 개시 코돈이 TTG에서 ATG로 변경된 서열 1을 포함하거나 이로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 에노일-CoA 히드라타제 유전자를 재조합적으로 발현하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 에노일-CoA 히드라타제 유전자는 에어로모나스 카비애 에노일-CoA 히드라타제 유전자 또는 슈도모나스 에어루지노사 에노일-CoA 히드라타제 유전자이다. 일부 실시양태에서, 슈도모나스 에어루지노사 에노일-CoA 히드라타제 유전자는 슈도모나스 에어루지노사 phaJ1 유전자 (유전자 PA3302) 또는 슈도모나스 에어루지노사 phaJ2 유전자 (유전자 PA1018)이다.

일부 실시양태에서, 비내인성 PHA 신타제 유전자 및/또는 에노일-CoA 히드라타제 유전자는 증폭된다.

일부 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포, 진균 세포 (효모 세포 포함),식물 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 랄스토니아 종, 에어로모나스 종, 리조비움 종, 알칼리게네스 종 또는 슈도모나스 종 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 랄스토니아 유트로파, 에어로모나스 카비애, 리조비움 제포니큠, 알칼리게네스 유트로푸스 또는 슈도모나스 올레오보란스 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 랄스토니아 유트로파 세포이다.

일부 측면에서, 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 중쇄 길이 단량체 함량을 갖는 하나 이상의 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성 방법이 제공된다. 상기 방법은, 상기 방법들 중 임의의 방법에 따라 세포를 생산하는 단계 및 세포 집단을 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공중합체 중 하나 이상은 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체 (폴리(HB-코-HHx))이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 집단으로부터 하나 이상의 공중합체를 수집하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 단량체 함량은 적어도 약 5 mol％, 적어도 약 6 mol％, 적어도 약 7 mol％, 적어도 약 10 mol％, 적어도 약 15 mol％, 적어도 약 20 mol％이거나, 또는 그보다 많다.

일부 실시양태에서, 단량체 함량은 적어도 약 6 wt％, 적어도 약 8 wt％, 적어도 약 10 wt％, 적어도 약 15 wt％, 적어도 약 20 wt％, 적어도 약 25 wt％이거나, 또는 그보다 많다.

다른 측면에서, 서열 2 또는 서열 4를 코딩하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 1 또는 서열 3으로서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 1 또는 서열 3으로서 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80％의 동일성, 적어도 90％의 동일성, 적어도 95％의 동일성 또는 적어도 98％의 동일성, 또는 그 초과의 동일성을 갖는다.

일부 실시양태에서, 상기 단리된 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드가 제공된다.

일부 실시양태에서, 상기 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다.

일부 실시양태에서, 상기 단리된 핵산 분자 중 하나 이상을 재조합적으로 발현하는 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 벡터로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 세포의 게놈에 통합된다.

본 발명의 상기 및 다른 측면뿐만 아니라 이의 다양한 실시양태는, 도면 및 본 발명의 상세한 설명과 관련하여 더욱 명백해질 것이다.

첨부된 도면은 축소된 비율로 그려지도록 의도된 것은 아니다. 도면에서, 다양한 도면에서 예시된 각각의 동일한 또는 거의 동일한 성분은 유사 수치로 나타낸다. 명확성을 위해, 모든 성분이 모든 도면에 표지된 것은 아닐 수 있다.
도 1은 PHA 중합체의 구조 및 특성을 나타낸다. 상위, 폴리(HB); 하위, 폴리(HB-코-HHx)
도 2는 PHA 공중합체 합성 경로에서의 PhaA, PhaB 및 PhaC의 관여를 나타낸다.
도 3은 PHA 공중합체 합성 경로와의 지방산 β-산화의 상호작용, 및 단량체가 지방산 이화작용의 부산물로서 생성됨을 도식적으로 나타낸다.
도 4는 PHA 공중합체 합성 경로에 대한 PhaA 및 PhaB 차단의 영향, 및 단량체가 지방산 이화작용의 부산물로서 생성됨을 도식적으로 나타낸다.
도 5는 과당 제한 배지(defined medium)에서의 phaB1, phaB2 및/또는 phaB3의 결실을 갖는 다수의 균주에 의한 PHB 합성을 나타낸다. 야생형 및 단일, 이중 및 삼중 돌연변이를 갖는 균주의 결과를 나타낸다.
도 6은 과당 제한 배지 내의 phaB1, phaB2 및/또는 phaB3의 결실을 갖는 다수의 균주에서의, NADPH를 이용한 리덕타제 활성을 나타낸다. 야생형 및 단일, 이중 및 삼중 돌연변이를 갖는 균주의 결과를 나타낸다.
도 7은 과당 제한 배지 내의 phaB1, phaB2 및/또는 phaB3의 결실을 갖는 다수의 균주에서의, NADH를 이용한 리덕타제 활성을 나타낸다. 야생형 및 단일, 이중 및 삼중 돌연변이를 갖는 균주의 결과를 나타낸다.
도 8은 phaB 결실을 갖는 균주에 대한 상보적 리덕타제 돌연변이체의 효과를 나타낸다. phaB1, phaB2 및 phaB3 유전자를 다시 각각 균주 Re2115의 게놈 (ΔphaB123)에 부가하였다. 또다른 균주는 Re2115에 다시 부가된 fabG를 가졌다. 야생형, 돌연변이체 및 상보적 균주에서의 PHB 합성의 결과를 나타낸다.
도 9는 도 8에 기재된 균주의 PhaA 활성을 나타낸다.
도 10은 도 8에 기재된 균주에 의해 생성된 PHB 중합체의 분자량을 나타낸다.
도 11은 PhaB 기질 특이성을 나타낸다.
도 12는 PhaJ 기질 특이성을 나타낸다.
도 13은 문헌으로부터의 몇몇의 균주를, 사용된 PHA 신타제, 탄소 공급원, PHA 함량 및 mol％ HHx를 도시하면서 열거한다.
도 14는 구축된 균주 및 이러한 균주로부터의 결과를, 유전자형 (사용된 PHA 신타제 포함), PHA 함량 (세포 건조 중량에 대한 ％로서) 및 wt％ HHx를 도시하면서 열거한다.
도 15는, 생성된 PHA 오페론 (phaC _D12 -phaA-phaJ1 _Pa )을 증폭시키고 이를 플라스미드 내로 클로닝하며 이를 균주 Re2133으로 형질전환시키느, 균주 구축의 절차를 나타낸다.

본 발명은 부분적으로 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 바이오플라스틱, 예컨대 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성 방법, 및 박테리아 발효, 및 다른 세포 및 유기체에서의 바이오플라스틱의 생성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 공중합되어 폴리히드록시알카노에이트 공중합체를 생성할 수 있는 단량체에는 3-히드록시부티레이트, 및 5개 이상의 탄소 쇄 길이를 갖는 3-히드록시알칸산 (예를 들어, 미국 특허 7,341,856 및 그 안에서 언급된 참조문헌 참조; 상기 개시내용은 각각 그 교시내용이 참조로 포함됨)이 포함된다. 이의 한 예로서, 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체 (폴리(HB-코-HHx)), 및 특히 고함량의 HHx를 갖는 공중합체가 그의 물리적 특성으로 인해 유용하다. 또한, 본 발명은 부분적으로, 균주가 탄소 공급원으로서 지방산 또는 임의의 식물성 오일을 사용하여 성장하는 경우에 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체, 예컨대 폴리(3-히드록시부티레이트-코-3-히드록시헥사노에이트)를 높은 수준으로 축적할 수 있는 세포, 예컨대 랄스토니아 유트로파 균주에 관한 것이다. 이러한 세포에 의해 생성된 공중합체의 3-히드록시헥사노에이트 함량은 문헌에 기재된 식물성 오일로부터 생성된 임의의 물질에 필적하거나 또는 그를 초과한다. 반면, 미국 특허 제7,235,621호에 기재된 방법은, 허용되는 HHx 함량을 갖는 공중합체를 생성하기 위하여 지방산 성분 중 라우르산을 포함하는 특정 식물성 오일의 사용을 요구한다. 그렇다 하더라도, 미국 특허 제7,235,621호에 기재된 방법을 사용하여 생성된 공중합체의 HHx 함량은 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 공중합체의 HHx 함량에 비해 더 낮다.

하기 특징들은 개별적으로 및 조합하여 본 발명에 포함된다.

일부 실시양태에서, 세포에서의 PHB의 정상적인 합성이 파괴된다. 예를 들어, 하기 실시예에서 나타낸 것과 같이, PHB는 아세토아세틸-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자의 결실에 의해 랄스토니아 유트로파에서 파괴된다. 본 발명의 특정의 실시양태에서, phaB3이 파괴되고; phaB3은 이전에 문헌에서 특성화되지 않았으며, 이러한 특정 목적을 위해 사용되지 않았던 유전자이다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시양태로 제한되지 않으며, 따라서 아세토아세틸-CoA 리덕타제의 발현의 감소를 비롯하여 정상적인 PHB 생합성을 파괴하는 다른 방법을 포함한다.

일부 실시양태에서, 내인성 PHA 신타제 유전자가 파괴되며, 신규 PHA 신타제로 대체된다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시양태로 제한되지 않으며, 따라서 내인성 PHA 신타제의 발현의 감소를 비롯하여 정상적인 내인성 PHA 신타제 활성을 파괴하는 다른 방법을 포함한다. 예를 들어, 하기 실시예에서 나타낸 것과 같이, 랄스토니아 유트로파에서의 야생형 PHA 신타제 유전자가 결실되고 신규 신타제 유전자가 균주에 부가된다. 신규 PHA 신타제는 대부분의 3-히드록시헥사노에이트 단량체를 도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신규 신타제 유전자는 유기체 로도코코스 에테리보란스 I24 (본원에서 "로도코쿠스 CO9 신타제" (서열 1 및 서열 2) 또는 "로도코쿠스 D12 신타제" (서열 3 및 서열 4)로도 지칭됨)로부터 비롯된다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시양태로 제한되지는 않으며, 따라서 대부분의 중쇄 길이 단량체, 특히 3-히드록시헥사노에이트 단량체를 도입하는 유사한 능력을 갖는 다른 PHA 신타제 유전자 또한 유사한 방식으로 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 특이적 에노일-CoA 히드라타제 유전자를 세포에 도입하여 공중합체에 도입되는 단량체의 생성을 증가시킨다. 예를 들어, 하기 실시예에서 나타낸 것과 같이, phaJ1로도 불리는 슈도모나스 에어루지노사 PAO1로부터의 (R)-특이적 에노일-CoA 히드라타제 유전자 (유전자 PA3302)를 랄스토니아 유트로파 균주에 도입하였다. 효소 PhaJ1은 3-히드록시부티릴-CoA 및 3-히드록시헥사노일-CoA 단량체를 생성하고, 이를 이후 PHA 신타제로 중합한다. 또한, 슈도모나스 에어루지노사 PAO1 phaJ2 유전자 (유전자 PA1018)를 사용할 수 있다. 슈도모나스 에어루지노사 PAO1 게놈의 진뱅크(GenBank) 기탁 번호는 AE004091이다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시양태로 제한되지 않으며, 따라서 3-히드록시부티릴-CoA 및 3-히드록시헥사노일-CoA 단량체를 생성하는 유사한 능력을 갖는 하나 이상의 다른 에노일-CoA 히드라타제 유전자 또한 유사한 방식으로 사용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자의 카피수를 조절하여 세포에 의해 축척되는 PHA의 양을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예에서 나타낸 것과 같이, 초기에 로도코쿠스 D12 신타제 및 슈도모나스 에어루지노사 phaJ1 유전자를 랄스토니아 유트로파 게놈에 도입하였다. 이후, 유전자를 플라스미드에 클로닝하고 플라스미드를 랄스토니아 유트로파 균주에 도입하여 유전자의 카피수를 증가시켰으며, 여기서 아세토아세틸-CoA 리덕타제 유전자 및 천연 PHA 신타제 유전자가 게놈으로부터 결실되었다. 플라스미드를 갖는 균주는 유전자가 게놈에만 있는 균주에 비해 유의하게 더 많은 중합체를 생성하였다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시양태로 제한되지 않으며, 따라서 유전자의 카피수를 조절하는 (바람직하게는 증가시키는) 다른 방법이 포함된다.

본 발명의 측면은, 세포에서의 재조합 유전자 발현을 통해 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체, 예컨대 고함량의 HHx를 갖는, 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체 (폴리(HB-코-HHx))의 생성을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 비내인성 PHA 신타제 및 에노일-CoA 히드라타제 유전자를 재조합적으로 발현하며 아세토아세틸-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자가 결실된 세포에서의, 탄소 공급원으로서의 식물성 오일로부터 5 wt％ 초과 (4 mol％ 초과)의 HHx 함량을 갖는 폴리(HB-코-HHx)의 생성이 본원에 기재되어 있다. 이 시스템은 광범위한 용도를 갖는 분자인, 고함량의 HHx를 갖는 폴리(HB-코-HHx))의 생성을 위한 효율적인 신규 방법을 나타낸다.

본 발명의 측면에 따르면, 하나 이상의 효소를 재조합적으로 발현하는 세포(들) 및 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체, 예컨대 고함량의 HHx를 갖는 폴리(HB-코-HHx))의 생성에서의 이러한 세포의 용도가 제공된다. PHA 신타제 유전자(들)을 비롯한, 상기 효소를 코딩하는 유전자는 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다는 것을 알 것이다. 당업자들은 이들 효소에 대한 상동 유전자를 다른 종으로부터 얻을 수 있으며, 상동성 조사, 예를 들어 단백질 BLAST 조사 (NCBI 인터넷 사이트 (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 이용가능함)에 의해 확인할 수 있다는 것을 알 것이다. 이러한 유전자는 특정 유전자를 함유하는 임의의 DNA 공급원으로부터의 DNA로부터 PCR 증폭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 서열은 합성되고/거나, 도입되는 세포에 대하여 코돈 최적화된다. 본원에 기재된 것과 같은 효소를 코딩하는 유전자를 얻는 임의의 수단은 본 발명과 부합한다.

또한, 단백질 발현의 최적화는 일부 실시양태에서, 효소를 코딩하는 유전자를 변형하고 이후, 예컨대 박테리아 세포에서의 발현을 위한 코돈 최적화를 통해 세포에 도입하는 것을 요구할 수 있다. 다양한 유기체에 대한 코돈 사용은 코돈 사용 데이터베이스(Codon Usage Database; www.kazusa.or.jp/codon/)에서 접속할 수 있다.

본원에 기재된 방법, 효소, 세포 및 유기체는 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성을 제공한다. 단량체 함량은 종종 몰 퍼센트 (mol％)로 표현된다. 일부 실시양태에서, 공중합체는 적어도 4 mol％, 5 mol％, 6 mol％, 7 mol％, 8 mol％, 9 mol％, 10 mol％, 11 mol％, 12 mol％, 13 mol％, 14 mol％, 15 mol％, 16 mol％, 17 mol％, 18 mol％, 19 mol％, 20 mol％, 21 mol％, 22 mol％, 23 mol％, 24 mol％, 25 mol％, 26 mol％, 27 mol％, 28 mol％, 29 mol％, 30 mol％, 31 mol％, 32 mol％, 33 mol％, 34 mol％, 35 mol％ 또는 그 초과 함량의, 3-히드록시헥사노에이트와 같은 중쇄 길이 단량체로 생성된다. 이러한 중쇄 길이 단량체 함량을 갖는 공중합체는, 예를 들어 탄소 공급원으로서 임의의 지방산 또는 오일 (예를 들어, 식물성 오일)을 사용하여 생성될 수 있다.

단량체 함량을 표현하는 또다른 방식은 중량 퍼센트 (wt％)이다. 몰 퍼센트는 중량 퍼센트 값에 0.8을 곱하여 중량 퍼센트로부터 근사치로 구할 수 있으며; 유사하게, 중량 퍼센트는 몰 퍼센트 값에 1.25를 곱하여 몰 퍼센트로부터 근사치로 구할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 공중합체는 적어도 5 wt％, 6 wt％, 7 wt％, 8 wt％, 9 wt％, 10 wt％, 11 wt％, 12 wt％, 13 wt％, 14 wt％, 15 wt％, 16 wt％, 17 wt％, 18 wt％, 19 wt％, 20 wt％, 21 wt％, 22 wt％, 23 wt％, 24 wt％, 25 wt％, 26 wt％, 27 wt％, 28 wt％, 29 wt％, 30 wt％, 31 wt％, 32 wt％, 33 wt％, 34 wt％, 35 wt％ 또는 그 초과 함량의, 3-히드록시헥사노에이트와 같은 중쇄 길이 단량체로 생성된다. 이러한 중쇄 길이 단량체 함량을 갖는 공중합체는, 예를 들어 유기체 또는 세포에 대한 탄소 공급원으로서 임의의 지방산 또는 오일 (예를 들어, 식물성 오일)을 사용하여 생성될 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포 또는 유기체에 의해 생성되는 공중합체의 양은 세포 또는 유기체의 건조 중량 (세포 건조 중량)의 적어도 약 20％, 22％, 24％, 26％, 28％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％ 또는 그 초과이다.

상기 언급된 것과 같이, 미국 특허 제7,235,621호에 기재된 방법은, 허용되는 HHx 함량을 갖는 공중합체의 생성을 위하여 지방산 성분 중 소정량의 라우르산을 포함하는 특정 식물성 오일의 사용을 요구한다. 미국 특허 제7,235,621호에서 보고된 공중합체의 최대 HHx 함량은 13.8 mol％이다. 본원에 기재된 방법, 효소, 세포 및 유기체를 사용하여, 미국 특허 제7,235,621호에 의해 요구되는 것과 같은 오일 또는 지방의 지방산 성분 중 라우르산 함량을 갖는 탄소 공급원의 사용을 고려하지 않고 보다 큰 HHx 함량의 공중합체를 생성하였다.

중합체의 유용한 분자량은 10,000 달톤 초과, 예컨대 약 10,000 내지 4,000,000 달톤, 바람직하게는 약 50,000 내지 1,500,000 달톤인 것을 포함한다.

본 발명에 따르면, 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체가 생성된다. 단량체 단위는 당업계에 알려져 있으며, 히드록시부티레이트, 히드록시발레레이트, 히드록시헥사노에이트, 히드록시헵타노에이트, 히드록시옥타노에이트, 히드록시노나노에이트, 히드록시데카노에이트, 히드록시운데카노에이트 및 히드록시도데카노에이트 단위가 포함된다. 일부 실시양태에서, 생성되는 공중합체에는 히드록시부티레이트 및 히드록시헥사노에이트 단량체, 예컨대 폴리(3-히드록시부티레이트-코-3-히드록시헥사노에이트)가 포함된다.

본 발명은 원핵 세포 및 진핵 세포를 비롯하여, PHA 신타제에 의해 중합되는 단량체의 생성을 위한 유전자를 발현하는 임의 유형의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 세포는 랄스토니아 종, 에어로모나스 종, 리조비움 종, 알칼리게네스 종 또는 슈도모나스 종 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 랄스토니아 유트로파, 에어로모나스 카비애, 리조비움 제포니큠, 알칼리게네스 유트로푸스 또는 슈도모나스 올레오보란스 세포이다. 한 바람직한 실시양태에서, 세포는 랄스토니아 유트로파 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 진균 세포, 예컨대 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스(Saccharomyces) 종, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 종, 피치아(Pichia) 종, 파피아(Phaffia) 종, 한세눌라(Hansenula) 종, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 종, 칸디다(Candida) 종, 탈라로마이세스(Talaromyces) 종, 브레타노마이세스(Brettanomyces) 종, 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 종, 파치솔렌(Pachysolen) 종, 데바리오마이세스(Debaryomyces) 종, 야로위아(Yarrowia) 종, 및 공업용 배수체 효모 균주이다. 공중합체 생성에 유용한 효모 종 및 균주의 예는 미국 특허 제7,083,972호에 기재되어 있으며, 상기 개시내용은 그 교시내용이 참조로 포함된다. 진균의 다른 예에는 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 페니실리움(Pennicilium) 종, 푸사륨(Fusarium) 종, 리조푸스(Rhizopus) 종, 아크레모늄(Acremonium) 종, 뉴로스포라(Neurospora) 종, 소르다리아(Sordaria) 종, 마그나포르테(Magnaporthe) 종, 알로마이세스(Allomyces) 종, 우스틸라고(Ustilago) 종, 보트리티스(Botrytis) 종 및 트리코데르마(Trichoderma) 종이 포함된다. 다른 실시양태에서, 세포는 조류 세포, 포유동물 세포 또는 식물 세포이다.

본 발명에 부합하는 몇몇 세포는 본 발명과 관련된 하나 이상의 유전자의 내인성 복제체, 뿐만 아니라 재조합 복제체를 발현할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일부 실시양태에서, 세포가 본 발명과 관련된 하나 이상의 유전자의 내인성 복제체를 갖는 경우에, 방법은 내인성 발현되는 유전자(들)의 재조합 복제체의 추가를 반드시 요구하지는 않을 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 경로로부터 하나 이상의 효소를 내인성 발현할 수 있으며, 본원에 기재된 경로로부터 하나 이상의 다른 효소를 재조합적으로 발현할 수 있다.

본 발명에 부합하는 몇몇 세포는 내인성 생화학적 경로, 뿐만 아니라 상기 경로, 유사한 경로 또는 상보적 경로 중 하나 이상의 재조합 유전자를 발현할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 알. 유트로파(R. eutropha)는 단량체 생성을 위한 유전자를 발현한다. 실시예에서 나타낸 것과 같이, phaJ가 이들 세포에서 추가적으로 발현되어, PHA 신타제에 의해 중합되는 단량체 생성을 향상시킨다.

조직-선호 프로모터의 사용을 비롯하여, 단량체 생성 및/또는 중합을 위한 관련된 효소의 식물에서의 발현에 의한 PHA 중합체 및 공중합체의 생성을 위한 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,534,432호 및 미국 특허 제7,341,856호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 교시내용이 본원에 참조로 포함된다.

유기체 또는 세포의 게놈에 삽입된 유전자(들)로부터의 발현 및/또는 하나 이상의 염색체외 핵산, 예컨대 벡터, 예를 들어 플라스미드 상의 유전자(들)로부터의 발현을 비롯하여, 유기체 및 세포에서의 유전자의 발현은 당업계에 널리 공지되어 있다. 변형 게놈, 염색체외 핵산, 및 이러한 변형 게놈 또는 염색체외 핵산을 함유하는 유기체 또는 세포의 구축을 위한 방법, 재료 및 기법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이러한 방법, 재료 및 기법의 일부는 본원 다른 부분에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 하나 이상의 폴리히드록시알카노에이트 공중합체, 예컨대 폴리(HB-코-HHx) 공중합체의 생성에 최적화된 세포의 사용이 유리할 수 있다. 예를 들어, 생화학적 경로 중의 하나 이상의 요소를 변형시켜 경쟁 경로를 제거하고 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체, 예컨대 폴리(HB-코-HHx) 공중합체를 더 많이 생성하는 것이 최상일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 예컨대 3HB-CoA 합성에 기여하는 하나 이상의 유전자를 돌연변이화 시키거나 또는 결실시켜 3HB-CoA 합성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 이는 아세토아세틸-CoA 리덕타제 활성을 감소시켜 달성할 수 있다. 예를 들어, 알. 유트로파에서, 예를 들어 하나 이상의 phaB 유전자의 돌연변이화 또는 (부분적으로 또는 완전한) 결실에 의해 phaB 발현을 감소시켜 아세토아세틸-CoA 리덕타제 활성 (PhaB)을 감소시킬 수 있다. 본원에서 예시된 것과 같이, 이는 알. 유트로파 게놈으로부터 phaB1, phaB2 및 phaB3 유전자를 결실시켜 달성되었다.

일부 실시양태에서, 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 하나 이상의 폴리히드록시알카노에이트 공중합체, 예컨대 폴리(HB-코-HHx) 공중합체의 향상된 생성을 유발하는 돌연변이에 대한 스크리닝은 무작위 돌연변이유발 스크리닝 또는 알려진 돌연변이의 스크리닝을 통해 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈 단편의 샷건 클로닝(shotgun cloning)을 사용하여, 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 하나 이상의 폴리히드록시알카노에이트 공중합체, 예컨대 폴리(HB-코-HHx) 공중합체의 증가된 생성을 위한 이들 단편을 갖는 세포 또는 유기체의 스크리닝을 통해 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 하나 이상의 폴리히드록시알카노에이트 공중합체, 예컨대 폴리(HB-코-HHx) 공중합체의 생성의 증가를 유발하는 게놈 영역을 확인할 수 있었다. 몇몇 경우에서, 하나 이상의 돌연변이를 동일한 세포 또는 유기체에서 조합할 수 있다.

본원에 기재된 다양한 세포의 성장을 위한 배지는 당업자들에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 그 교시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,534,432호는 박테리아 세포의 성장에 적합한 이러한 배지의 예를 제공한다.

당업자들에 의해 이해되는 것으로서, 하나 이상의 히드록시산 및 그의 공중합체의 생성을 위한 최적의 배양 조건은 세포의 유형, 성장 배지 및 성장 조건을 비롯한 여러 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 배양 온도는 유기체 또는 세포가 성장할 수 있는 온도이고, 바람직하게는 20℃ 내지 40℃이다. 예를 들어, 이는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40℃, 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다. 배양 기간은 특별히 한정되지 않지만, 대략 1일 내지 10일 일 수 있다.

고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성, 예컨대 폴리(HB-코-HHx) 생성을 최적화하기 위하여 통상의 실험을 통해 달라질 수 있는 다른 비-제한적인 인자로는, 사용되는 구체적인 탄소 공급원, 배양 배지의 유형, 배양 배지의 pH, 및 폴리(HB-코-HHx)를 수확하기 이전의 세포가 배양되는 시간이 포함된다. 일부 실시양태에서, 세포를 수 일, 예컨대 3일 내지 4일 동안 배양한 후에 최적의 생성이 달성된다. 그러나, 상기 언급된 파라미터 및 다른 그러한 유사한 파라미터를 변경하고 최적화하기 위한 통상적인 실험이 있을 수 있다는 것을 이해해야 한다.

유기체 또는 세포는 공중합체의 생성을 허용하는 탄소 공급원을 함유하는 배양 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 임의의 오일 및/또는 지방산, 예컨대 임의의 식물성 오일, 지방산 또는 지방산 유도체, 또는 이들의 조합물을 탄소 공급원으로서 사용한다. 식물성 오일의 예에는 야자 오일, 대두 오일, 평지씨 오일, 옥수수 오일, 면실 오일, 땅콩 오일, 코코넛 오일 및 홍화 오일이 포함되며, 추가의 오일 및 지방산은 당업계에 널리 공지되어 있다. 공중합체의 최적의 생성을 위한 탄소 공급원의 조성은 사용되는 유기체 또는 세포의 특정 균주에 따를 수 있다. 일부 실시양태에서 배양 배지의 다른 성분에는 질소 공급원(들), 무기 염(들), 선택적 성분 (예컨대, 항생제) 또는 다른 영양소 공급원(들) 등의 다양한 조합물이 포함되며, 당업자들에게 공지되어 있다.

본 발명과 관련된 세포의 성장에 사용되는 액체 배양물은 당업계에 공지되어 있고 사용되는 임의의 배양 용기에 보관할 수 있다. 일부 실시양태에서, 통기 반응 용기(aerated reaction vessel), 예컨대 교반 탱크 반응기에서의 대규모 생성을 사용하여 본 발명과 관련된 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체, 예컨대 폴리(HB-코-HHx) 중합체를 대량으로 생성할 수 있다.

또한, 연속식 기반의 PHA 중합체 및 공중합체의 생성을 위한 방법이 당업자들에게 공지되어 있으며, 이러한 방법은 예를 들어 그 교시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,534,432호에 기재되어 있다.

PHA 공중합체는 유기체, 세포 또는 배양물로부터 단리될 수 있으며, 여기서 이는 당업계에 공지된 방법에 의해 생성된다. 이의 한 예는 하기 실시예에 기재되어 있으며, 여기서 중합체는 클로로포름 중에서 48시간 동안 동결건조된 세포로부터 추출된다. 예를 들어, 각각 그 교시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,942,597호, 제5,918,747호, 제5,899,339호, 제5,849,854호 및 제5,821,299호; EP 859858A1; WO 97/07229; WO 97/07230; 및 WO 97/15681 또한 참조한다.

하나의 비-제한적인 예로서, 미국 특허 출원 2009/0130731에 기재된 방법을 이용할 수 있다. 배양 후, 박테리아 세포를 원심 분리기 등에 의해 배양 배지로부터 분리하고, 박테리아 세포를 증류수 및 메탄올 등으로 세척하고, 건조시킨다. 건조된 박테리아 세포로부터, 유기 용매, 예컨대 클로로포름을 사용하여 폴리에스테르를 추출한다. 박테리아 세포 성분을 여과 등에 의해 폴리에스테르를 포함하는 상기 유기 용매 용액으로부터 제거하고, 빈용매, 예컨대 메탄올 또는 헥산을 여액에 첨가하여 폴리에스테르의 침전을 허용한다. 추가적으로, 상층액을 여과 또는 원심 분리에 의해 제거하고, 건조시킨다. 다른 방법은 당업자들에게 공지되어 있을 것이다.

본 발명에 따라 생성된 공중합체는 당업계에 알려진 여러 용도 중 어느 하나로 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,455,999호는 "조성물에 대한 용도" 제목의 섹션 및 그 안에서 언급된 참조문헌 (각각의 개시내용은 그 교시내용이 참조로 포함됨)에서의 PHA 중합체에 대한 수많은 용도 및 상기 중합체의 물리적 특성을 기재한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 단리 또는 실질적으로 정제된 PHA 신타제 핵산 또는 폴리펩티드, 이러한 핵산 또는 폴리펩티드를 함유하거나 또는 발현하는 구축물 및 벡터, 및 이러한 핵산, 폴리펩티드, 구축물 또는 벡터를 함유하는 세포 또는 유기체를 포함한다. 본원에 개시된 것과 같이, 대부분의 3-히드록시헥사노에이트 단량체를 도입할 수 있는 로도코쿠스 에테리보란스 I24로부터의 PHA 신타제가 분자 클로닝 절차에 의해 확인 및 단리되었다. 또한, 단리된 PHA 신타제는 본원에서 "로도코쿠스 CO9 신타제" (서열 1 및 서열 2) 또는 "로도코쿠스 D12 신타제" (서열 3 및 서열 4)로도 지칭된다.

"단리된" 또는 "정제된" 핵산 분자 또는 단백질, 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분은 재조합 기법에 의해 제조되는 경우에 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우에 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 바람직하게는, "단리된" 핵산은 핵산이 유도되는 유기체의 게놈 DNA에서의 핵산 (즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치된 서열)을 자연적으로 플랭킹(flanking)하는 서열 (바람직하게는, 단백질 코딩 서열)이 없다. 예를 들어, 여러 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 핵산이 유도되는 세포의 게놈 DNA에서의 핵산 분자를 자연적으로 플랭킹하는, 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 미만의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 세포 물질이 실질적으로 없는 폴리펩티드 (단백질로도 지칭됨)는 약 30％, 20％, 10％, 5％ (건조 중량) 미만의 오염 폴리펩티드를 갖는 폴리펩티드의 생성물을 포함한다. 폴리펩티드 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분이 재조합적으로 제조되는 경우에, 바람직하게는 배양 배지는 약 30％, 20％, 10％ 또는 5％ (건조 중량) 미만의 폴리펩티드가 아닌 화학적 전구체 또는 다른 성분을 나타낸다.

개시된 핵산 분자 및 그에 의해 코딩된 폴리펩티드의 단편 및 변이체 또한 본 발명에 포함된다. "단편"은 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 그에 의해 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 부분인 것을 의도한다. 뉴클레오티드 서열의 단편은 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩티드 단편을 코딩할 수 있다. 다르게는, 하이브리드화 프로브로서 유용한 뉴클레오티드 서열의 단편은 일반적으로 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩티드 단편을 코딩하지 않는다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 단편은 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 내지 최대 본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 전장 뉴클레오티드 서열의 범위일 수 있다.

폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 부분을 코딩하는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 단편은 적어도 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 또는 550개 연속 아미노산, 또는 최대 전장 폴리펩티드에 존재하는 아미노산의 전체 수 (예를 들어, 서열 2에 대하여 562개 아미노산 또는 서열 4에 대하여 561개 아미노산)를 코딩할 수 있다. 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 부분은 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열 중 하나의 부분을 단리하고, 폴리펩티드의 코딩된 부분을 (예를 들어, 시험관내 재조합 발현에 의해) 발현하고, 폴리펩티드의 코딩된 부분의 활성을 평가하여 제조할 수 있다. 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열의 단편인 핵산 분자 (폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 단편을 코딩하는지와는 관계 없음)는 적어도 15, 20, 30, 45, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 또는 1600개 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 최대 본원에 개시된 전장 뉴클레오티드 서열에 존재하는 뉴클레오티드의 수 (예를 들어, 서열 1에 대하여 1689개 뉴클레오티드 또는 서열 3에 대하여 1686개 뉴클레오티드)를 포함한다.

"변이체"는 본원에 개시된 서열과 실질적으로 유사한 서열을 의도한다. 뉴클레오티드 서열에 대하여, 보존적 변이체는 유전자 코드의 축중성(degeneracy)으로 인해 본 발명의 공중합체 합성에 관여하는 폴리펩티드 또는 다른 효소 중 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 이들과 같은 자연 발생 대립유전자 변이체는 예를 들어 하기 요약된 것과 같은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 하이브리드화 기법과 같은 잘 알려진 분자 생물학 기법의 사용으로 확인할 수 있다. 또한, 변이체 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 생성된 것들과 같은 합성에 의해 유도된 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이는 여전히 본원에 개시된 것과 같이 폴리펩티드를 코딩한다. 일반적으로, 본 발명의 특정 뉴클레오티드 서열의 변이체는 디폴트 파라미터를 사용하여 본원의 다른 부분에 기재된 서열 정렬 프로그램에 의해 측정된 것과 같은 특정 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 50％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 그 초과의 서열 동일성을 가질 것이다.

본원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 사용하여 다른 유기체, 특히 다른 박테리아, 뿐만 아니라 본원에 기재된 것과 같은 다른 유기체 또는 세포로부터 상응하는 서열을 단리할 수 있다. 이 방식에서, PCR, 하이브리드화 등과 같은 방법을 사용하여, 본원에 제시된 서열과의 그의 서열 상동성을 기초로 이러한 서열을 확인할 수 있다. 본원에 제시된 전체 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편과의 그의 서열 동일성을 기초로 단리된 서열이 본 발명에 포함된다. 이러한 서열에는 개시된 서열의 이종상동(ortholog)인 서열이 포함된다. "이종상동"은 공통의 조상 유전자로부터 유래되며, 종 분화의 결과로서 상이한 종에서 발견되는 유전자를 의도한다. 상이한 종에서 발견되는 유전자는 그의 뉴클레오티드 서열 및/또는 그의 코딩된 폴리펩티드 서열이 본원의 다른 곳에서 정의된 것과 실질적 동일성을 공유하는 경우에 이종상동으로 고려된다. 이종상동의 기능은 종 간에 종종 크게 보존된다.

PCR-계 방법에서, 관심있는 임의의 유기체로부터 추출된 cDNA 또는 게놈 DNA로부터 상응하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 PCR 반응에서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계할 수 있다. PCR 프라이머 및 PCR 클로닝을 설계하기 위한 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)]에 개시되어 있다. 또한, 문헌 [Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)]; [Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York)]; 및 [Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)]을 참조한다. 알려진 PCR 방법으로는 프라이머 쌍, 내포된 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 축중 프라이머(degenerate primer), 유전자-특이적 프라이머, 벡터-특이적 프라이머, 부분-미스매치된 프라이머 등을 사용한 방법이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

하이브리드화 기법에서, 알려진 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 선택된 유기체 또는 세포로부터 클로닝된 게놈 DNA 단편 또는 cDNA 단편 (예컨대, 게놈 또는 cDNA 라이브러리)의 집단에 존재하는 다른 상응하는 뉴클레오티드 서열과 선택적으로 하이브리드화하는 프로브로서 사용한다. 하이브리드화 프로브는 게놈 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편, 또는 다른 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 그 자체로 당업계에 널리 공지되어 있는 임의의 검출가능한 마커로 표지될 수 있다. 따라서, 예를 들어 하이브리드화를 위한 프로브는 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열(들) 또는 그의 축중물을 기초로 한 합성 올리고뉴클레오티드의 표지에 의해 제조할 수 있다. 하이브리드화, 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구축을 위한 프로브의 제조를 위한 방법은 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)]에 개시되어 있다.

이러한 서열의 하이브리드화는 엄격한 조건 하에서 수행할 수 있다. "엄격한 조건" 또는 "엄격한 하이브리드화 조건"은 그 조건 하에서 프로브가 다른 서열에 비해 검출가능하게 보다 큰 정도 (예를 들어, 배경에 비해 적어도 2배)로 그의 표적 서열과 하이브리드화하는 조건을 의도한다. 엄격한 조건은 서열-의존성이며, 여러 상황에서 상이할 것이다. 하이브리드화 및/또는 세척 조건의 엄격함의 조절에 의해, 프로브와 100％ 상보적인 표적 서열을 확인할 수 있다 (상동성 프로빙). 다르게는, 엄격함 조건을 조절하여 서열에서 일부 미스매칭을 가능하게 하여, 보다 낮은 정도의 유사성이 검출되도록 한다 (이종 프로빙). 일반적으로, 프로브는 길이가 약 1000개 뉴클레오티드 미만, 바람직하게는 길이가 500개 뉴클레오티드 미만이다. 엄격한 하이브리드화 조건 하의 하이브리드화에서 사용되는 여러 기법, 방법, 조건 및 조성물은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 문헌 [Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, N.Y.)]; 및 [Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)]과 같은 참조문헌에서 찾아볼 수 있다. 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)]을 참조한다.

본원에 개시된 PHA 신타제 서열 또는 그의 단편과 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 단리된 서열이 본 발명에 포함된다. 일부 실시양태에서, 이러한 서열은 개시된 서열과 적어도 약 50％, 60％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 초과의 상동성일 것이다. 즉, 서열의 서열 동일성은 개시된 서열과 적어도 약 50％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 초과의 서열 동일성을 공유할 수 있다.

비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 2개 서열 사이의 서열 동일성 (％)의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 수학적 알고리즘의 비-제한적인 예는 문헌 [Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17]의 알고리즘; 문헌 [Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]의 국부 상동성 알고리즘; 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453]의 상동성 정렬 알고리즘; 문헌 [Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448]의 유사성 조사 방법; 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된, 문헌 [Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268]의 알고리즘이 있다.

이러한 수학적 알고리즘의 컴퓨터 실행을 서열 비교에 이용하여 서열 동일성을 결정할 수 있다. 이러한 실행에는 PC/유전자 프로그램 (인텔리제네틱스(Intelligenetics, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)로부터 이용가능함)의 CLUSTAL; 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지, 버젼 8 (제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group (GCG), 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재)으로부터 이용가능함)의 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0) 및 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, BLAST 및 관련 프로그램도 (다른 서열 비교 프로그램과 같이) 미국 국립생물기술정보센터의 웹사이트 (NCBI; 예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov 또는 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 참조)에서 인터넷을 통해 이용가능하다. 이러한 프로그램을 이용한 정렬은 디폴트 매개변수를 이용하여 수행될 수 있다. 문헌 [Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403]의 BLAST 프로그램은 문헌 [Karlin and Altschul (1990)]의 알고리즘에 기초한다. 예를 들어, 스코어=100, 단어길이=12의 BLASTN 프로그램을 이용하여 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행함으로써, 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. 스코어=50, 단어길이=3의 BLASTX 프로그램을 이용하여 BLAST 단백질 검색을 수행함으로써, 본원에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭이 있는 정렬(gapped alignment)을 얻기 위해서는, 갭트 BLAST(Gappeed BLAST) (BLAST 2.0에 있음)를 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. 별법으로, PSI-BLAST (BLAST 2.0에 있음)를 이용하여 분자 간의 먼 관련성을 발견하는 반복 검색을 수행할 수 있다. 문헌 [Altschul et al. (1997)]을 참조한다. BLAST, 갭트 BLAST, PSI-BLAST를 이용하는 경우, 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 경우 BLASTN, 단백질의 경우 BLASTX)를 이용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 중 하나 이상이 하나 이상의 재조합 발현 벡터에서 발현된다. 이러한 벡터는 개별 유전자 또는 오페론 배열과 같은 조합 유전자를 함유할 수 있다. 본원에서 사용된 "벡터"는 상이한 유전자 환경 사이의 수송이나 숙주 세포에서의 발현을 위해서 목적하는 서열 또는 서열들이 제한 및 라이게이션에 의해 삽입될 수 있는 다수의 핵산 중 임의의 것일 수 있다. 벡터는 통상 DNA로 이루어져 있지만, RNA 벡터도 또한 이용가능하다. 벡터에는 플라스미드, 포스미드, 파지미드, 바이러스 게놈 및 인공 염색체가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

클로닝 벡터는 숙주 세포에서 자발적으로 복제되거나 그의 게놈에 통합될 수 있는 벡터이며, 이는 벡터를 결정가능한 방식으로 절단할 수 있고 여기에 목적하는 DNA 서열을 라이게이션하여 새로운 재조합 백터가 숙주 세포에서 복제되는 그의 능력을 보유하게 하는 하나 이상의 엔도뉴클라제 제한 부위에 의해 추가로 특성화된다. 플라스미드의 경우, 목적하는 서열의 복제는 숙주 세포, 예컨대 숙주 박테리아 내에서 플라스미드의 카피수가 증가함에 따라 여러 번 일어날 수 있거나, 또는 숙주가 유사분열로 번식하기 전에 숙주 당 단 한 번 일어날 수 있다. 파지의 경우, 복제는 용균 단계 중에 능동적으로 일어날 수 있거나, 또는 용원 단계 중에 수동적으로 일어날 수 있다.

발현 벡터는, 목적하는 DNA 서열이 조절 서열과 작동가능하게 연결되도록 제한 및 라이게이션에 의해 삽입될 수 있어 RNA 전사체로 발현될 수 있는 벡터이다. 벡터는 세포가 본 벡터로 형질전환 또는 형질전환되었는지 여부를 확인하는데 사용하기에 적합한 하나 이상의 마커 서열을 추가로 함유할 수 있다. 마커에는, 예를 들어 항생제 또는 다른 화합물에 대한 내성 또는 민감성을 증가 또는 감소시키는 단백질을 코딩하는 유전자, 당업계에 공지된 표준 검정법에 의해 검출될 수 있는 활성을 갖는 효소 (예를 들어, β-갈락토시다제, 루시퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제)를 코딩하는 유전자, 및 형질전환 또는 형질감염된 세포, 숙주, 콜로니 또는 플라크의 표현형에 시각적으로 영향을 미치는 (예를 들어, 녹색 형광 단백질) 유전자가 포함된다. 바람직한 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 DNA 세그먼트에 존재하는 구조 유전자 산물의 자율 복제 및 발현이 가능한 벡터이다.

본원에서 사용된 코딩 서열 및 조절 서열은, 이들이 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 코딩 서열의 발현 또는 전사를 일으키는 방식으로 공유 결합된 경우에 "실행가능하게" 연결된 것으로 나타내어진다. 코딩 서열이 기능성 단백질로 번역되기를 원한다면, 5' 조절 서열에서의 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 유발하는 경우와, 2개의 DNA 서열 사이의 연결기의 특성이 (1) 프레임-이동 돌연변이의 도입을 유발하지 않거나, (2) 프로모터 영역의 코딩 서열의 전사를 지시하는 능력을 방해하지 않거나 또는 (3) 상응하는 RNA 전사체의 단백질로 번역되는 능력을 방해하지 않는 경우에 2개의 DNA 서열이 작동가능하게 연결된 것으로 나타내어진다. 따라서, 프로모터 영역이 DNA 서열의 전사에 영향을 미쳐 생성된 전사체가 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있는 경우에 프로모터 영역은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것일 것이다.

청구된 본 발명의 효소 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 분자가 세포에서 발현되는 경우, 다양한 전사 조절 서열 (예를 들어, 프로모터/인핸서 서열)을 이용하여 그의 발현을 지시할 수 있다. 프로모터는 천연 프로모터, 즉, 내인성 환경의 유전자의 프로모터일 수 있고, 이는 유전자 발현의 일반적인 조절을 제공한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구조적일 수 있고, 즉, 프로모터는 조절되지않아 그의 관련 유전자의 계속적인 전사가 가능해진다. 또한, 다양한 조건부 프로모터, 예컨대 분자의 존재 또는 부재에 의해 제어되는 프로모터도 사용될 수 있다.

유전자 발현에 필요한 조절 서열의 명확한 특성은 종 또는 세포 유형 간에 다양할 수 있지만, 일반적으로 필요에 따라, 각각 전사 및 번역의 개시에 관여하는 5' 비-전사 서열 및 5' 비-번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등이 포함된다. 특히, 이러한 5' 비-전사 조절 서열은 작동가능하게 연결된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절 서열은 또한 원한다면 인핸서 서열 또는 상류 활성인자 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 임의로 5' 리더 또는 신호 서열을 포함할 수 있다. 적합한 벡터의 선택 및 고안은 당업자의 능력 및 재량에 속한다.

발현에 필요한 모든 요소를 함유하는 발현 벡터가 시판되고 있으며, 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]을 참조한다. 세포에 이종 DNA (RNA)를 도입함으로써 세포를 유전자 조작한다. 이러한 이종 DNA (RNA)를 작동가능한 전사 요소의 제어 하에 두어 숙주 세포에서 이종 DNA의 발현을 허용한다. 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체, 특히 고함량의 HHx를 갖는 폴리(HB-코-HHx)의 생성을 용이하게 하는 유전자 서열의 이종 발현을 실시예 섹션에서 입증한다. 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체, 예컨대 고함량의 HHx를 갖는 폴리(HB-코-HHx)를 생성하는 신규 방법이 또한 다른 박테리아 세포, 고세균 세포, 균류 (효모 세포 포함), 포유동물 세포, 식물 세포 등에서 수행될 수 있다.

본원에 기재된 효소를 코딩하는 핵산 분자를 당업계에서 표준인 방법 및 기술을 이용하여 세포 또는 세포들에 도입할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 표준 프로토콜, 예컨대 화학적 형질전환을 비롯한 형질전환 및 전기천공, 형질도입, 입자 충격 등에 의해 도입될 수 있다. 또한, 청구된 본 발명의 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 세포의 게놈에 통합시켜 상기 분자의 발현을 수행할 수 있다.

실시예

실시예 1: PhaB 활성이 감소된 균주

단량체 3-히드록시부티릴-CoA (3HB-CoA)는 β-케토티올라제 (PhaA) 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (PhaB)에 의해 아세틸-CoA로부터 합성된다. 랄스토니아 유트로파 게놈 내 단백질 서열의 분석은 이들 단백질의 널리 연구된 버젼 (PhaA, H16_A1438; PhaB1, H16_A1439)에 대한 수많은 잠재적 상동체를 예측하였다. 3HB-CoA 합성을 막기 위해서 본 발명자들은 알. 유트로파 게놈으로부터 유전자 phaB1, phaB2 및 phaB3을 깨끗이 결실시켰다.

참고문헌 York [1]로부터 변형된 방법을 이용하여 마커가 없는 결실을 수행하였다. 흥미있는 유전자의 DNA 서열 상류 및 하류를 PCR로 증폭시켰다. 상기 서열을 중첩 PCR을 통해 하나의 인접한 DNA 스트레치로 합하였다. 상기 절차 중에 사용되는 프라이머는, BamHI 부위가 DNA의 말단에 추가되고 SwaI 부위가 상류 및 하류 영역 사이에 삽입되도록 고안되었다. 상기 구축물을 BamHI 부위에서 pGY46의 주쇄 내로 클로닝하여, 알. 유트로파에서 흥미있는 유전자의 마커가 없는 결실을 수행하는데 사용될 수 있는 플라스미드를 생성하였다 [2]. 상기 플라스미드를 이. 콜라이(E. coli) S17-1로 형질전환시키고, 메이팅(mating)을 통해 알. 유트로파로 도입하였다. 흥미있는 유전자의 상류 및 하류를 혼성화하는 진단 프라이머를 사용하는 PCR로 결실을 확인하였다.

모든 phaB 유전자가 개별적으로 및 조합하여 결실된 일련의 균주를 구축하였다 (하기 표 1 참조). 이어서, 이들 균주를 프럭토스가 단독 탄소 공급원인 제한 배지에서 성장시켰다. 질소 제한으로 PHB 축적을 유도하였다.

<표 1>

상기 배양물로부터 샘플을 다양한 시점에 취하고, 크로톤산 검정법으로 폴리(3-히드록시부티레이트) (PHB) 함량에 대해 검정하였다 [3] (도 5). 그 결과, phaB1 및 phaB3이 둘 다 결여된 균주 (즉, Re2113 및 Re2115)가 야생형 균주보다 PHB를 유의하게 덜 생성하는 것으로 밝혀졌다. 확립된 방법으로 NADPH 및 NADH 의존성 아세토아세틸-CoA 리덕타제 활성을 측정하였다 [4] (도 6, 7). 본 발명자들은 소량의 PHB를 생성하는 균주가 유의하게 감소된 NADPH 의존성 리덕타제 수준을 갖는다는 것을 발견하였고, 이는 PHB 축적의 감소가 사실상 3HB-CoA 합성의 결여 및 PhaB 활성의 제거로 인한 것이었음을 제시한다.

본 발명자들은 phaB 결실을 갖는 균주에 대한 상보적 리덕타제 돌연변이의 효과를 조사하였다. phaB1, phaB2 및 phaB3 유전자를 phaB1 좌위에서 균주 Re2115의 게놈 (ΔphaB123)에 각각 다시 부가하여 균주 Re2139, Re2140 및 Re2143을 생성하였다. 상기 실험 중에 phaB3 개시 코돈에 주석이 잘못 달려 있음을 발견하였고; 주석이 정확히 달린 서열을 이용하였다 (표 2에서 정확한 phaB3으로 나타냄). 지방산 합성에 관여하는 리덕타제를 코딩하는 fabG 유전자를 또한 phaB1 좌위에서 균주 Re2115 (ΔphaB123)에 부가하여 균주 Re2142를 생성하였다. 모든 삽입된 유전자는 동일한 리보솜 결합 부위를 가졌다.

<표 2>

상기 배양물로부터 샘플을 다양한 시점에 취하고, 크로톤산 검정법으로 폴리(3-히드록시부티레이트) (PHB) 함량에 대해 검정하였다 [3] (도 8).

각각 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같은, 상기 균주에 의해 생성된 PhaA 활성 및 PHB 중합체의 분자량을 측정하였다. PhaA 활성은 참고문헌 [6]에 기재된 방법으로 측정하였다.

공중합체의 분자량은 폴리스티렌 표준물을 이용한 겔-침투 크로마토그래피로 측정하였다. PHB를 48시간 동안 클로로포름에서 동결건조된 세포로부터 추출하였다. 3 mg/mL의 농도의 PHB 용액을 제조하였다. 추출 후, 용액을 여과하여 용해되지 않은 바이오매스를 제거하였다. 1개의 피엘겔 올렉시스(PLgel Olexis) 가드 컬럼 (폴리머 래보러토리즈(Polymer Laboratories) 파트 번호 PL1110-1400) 및 일련의 2개의 피엘겔 올렉시스 분석 컬럼 (폴리머 래보러토리즈 파트 번호 PL1110-6400)이 구비된 애질런트(Agilent) 1100 HPLC를 이용하여 용해된 중합체를 분석하였다. 각각 용액 100 μL를 주입하고, 이들이 컬럼으로부터 용리될 때 시차 굴절률 검출기로 중합체를 검출하였다. 애질런트 GPC 분석 소프트웨어를 이용하여 생성된 크로마토그램으로부터 분자량을 측정하였다. 1,110 내지 13,155,000 g/mol 크기의 일련의 폴리스티렌 표준물 (폴리머 래보러토리즈 파트 번호 PL2010-0104)을 이용하여 상기 시스템을 교정하였다. 이소프로판올을 모든 교정용 표준물 및 실험 샘플에 내부 표준물로서 포함시켰다.

실시예 2: 폴리 (3- 히드록시부티레이트 -코-3- 히드록시헥사노에이트 ) 생성을 위한 균주

본 발명자들은, 3HB-CoA를 합성하는 제한된 능력을 갖는 균주가 고함량의 HHx를 갖는 3-히드록시헥사노에이트 (폴리(HB-코-HHx))와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체를 합성할 수 있는 균주의 고안에 있어서 양호한 출발점이 될 것으로 예측하였다. 이러한 예측은, 신타제가 3HB-CoA 및 3HHx-CoA를 합성할 수 있을지라도 야생형 알. 유트로파 내 3HB-CoA의 높은 세포내 농도가 중합체로의 HHx 혼입을 억제할 것이라는 본 발명자들의 믿음에 기초하였다. 게다가, 알. 유트로파 신타제는 단지 3HB-CoA 및 3HV-CoA만을 합성한다. PhaB 기질 특이성은 도 11에 도시되어 있다 (또한, 참고문헌 [4]를 참조한다).

본 발명자들의 이러한 예측을 시험하기 위해서, 먼저 pGY46을 이용하여 천연 PHA 신타제 (phaC1)를 Re2115로부터 결실시켜 [2] 균주 Re2133을 생성하였다. 이어서, 본 발명자들은 에어로모나스 카비애 및 로도코코스 에테리보란스 I24로부터의 다른 신타제 (D12 및 C09 신타제)를 시험하였다. 예를 들어, 로도코코스 에테리보란스 I24로부터의 D12 신타제를 이어서 참고문헌 [2]로부터 변형된 절차를 이용하여 phaC1 좌위에서 Re2133 게놈에 삽입하였다. 이는 먼저 부위-지정 돌연변이유발을 통해 pGY46 내 DNA의 상류 및 하류 영역 사이에 SwaI 부위를 삽입하고, 이어서 SwaI 부위에서 D12 신타제 유전자를 클로닝함으로써 수행되었고, 그 결과 균주 Re2135가 생성되었다.

균주 Re2135를 플라스크에서 탄소 공급원로서 야자유를 사용하여 성장시켰다. 본 발명자들은 3HHx-CoA 단량체가 지방산 이화작용의 부산물로서 생성되므로 (도 4 참조), 공중합체 생성에 필수적인 탄소 공급원로서 오일/지방산을 사용해야 하는 것으로 생각하였다. 질소 제한으로 상기 배양물에서 PHA 축적을 유도하였다. 세포 및 중합체의 조성물 내 중항체 함량을 표준 메탄올첨가분해 절차에 의해 측정하였다 [5] (도 14). 상기 방법으로 PHA 단량체를 관련 메틸 에스테르로 전환시킨 후, 기체 크로마토그래피로 분리 및 정량화하였다. 본 발명자들은 Re2135가 소량의 PHA를 축적하지만, 이러한 PHA는 높은 수준의 HHx 단량체를 함유한다는 것을 발견하였다.

이어서, 본 발명자들은 상기 균주에서 단량체 합성을 증가시키는 유전자를 연구하였다. 문헌으로부터의 몇몇 균주를, 사용된 PHA 신타제, 탄소 공급원, PHA 함량 및 mol％ HHx를 도시하면서 도 13에 기재하였다.

본 발명자들은 에노일-CoA 히드라타제를 코딩하는 유전자 (phaJ 유전자)에 집중하였다. 몇몇 phaJ 유전자를 phaB1 좌위에서 Re2135 게놈에 삽입하였다: 에어로모나스 카비애 및 슈도모나스 에어루지노사로부터의 에노일-CoA 히드라타제 (phaJ1 및 phaJ2). PhaJ 기질 특이성을 도 12에 도시하였다 (또한, 참고문헌 [7] 참조).

상기 유전자를 상류 및 하류 DNA 영역 사이의 SwaI 부위에서 원래 phaB1 결실 벡터 (pCB42)인 벡터 내로 클로닝하였다. 이어서, 상기 유전자를 상술한 절차를 이용하여 게놈으로 삽입하고, 단독 탄소 공급원로서 야자유를 사용하는 규정된 배지에서 성장시켰다. 본 발명자들은 슈도모나스 에어루지노사 PAO1로부터의 유전자 phaJ1이 여전히 높은 HHx 함량을 함유하는 보다 많은 양의 중합체 생성을 유도한다는 것을 발견하였다. 게놈 내에 phaJ1을 함유하는 균주를 Re2152로 명명하였다.

균주 구축 및 결과를, 유전자형 (사용된 PHA 신타제 포함), PHA 함량 (세포 건조 중량의 ％) 및 wt％ HHx를 도시하면서 도 14에 기재하였다. mol％ HHx로 측정된 HHx 함량은 항상 wt％로 측정된 HHx 함량보다 수가 적었다. Mol％는 wt％ 값에 0.8을 곱하여 wt％로부터 근사치를 구할 수 있었다. 예를 들어, 25 wt％ HHx는 20 mol％ HHx에 해당하고, 30 wt％ HHx는 24 mol％ HHx에 해당하였다.

본 발명자들은 본 발명에서 신규 개발된 PHA 오페론 (phaC _D12 - phaA - phaJ1 _Pa ) 내 효소 단계 중 하나가 PHA 생성을 제한할 수 있다는 가설을 세웠다. 유전자 발현을 증가시키기 위해서, 본 발명자들은 상기 오페론을 Re2152로부터 PCR로 증폭시키고, KpnI 및 HindIII 사이에서 플라스미드 pBBR1MCS-2 내로 클로닝하였다. 신규 플라스미드 (pCB81)를 Re2133으로 형질전환시키고, 생성된 균주를 300 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 야자유 규정된 배지에서 성장시켰다. 상기 절차를 도 15에 기재하였다. 상기 방식으로 유전자 발현을 증폭시키는 것이 PHA 생성 또는 생성된 PHA의 단량체 조성에 부정적인 영향을 미치는 지를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 얻어진 균주에 의해 생성되는 중합체 내 PHA 및 HHX 함량을 분석하였다. 예상치 않게, 세포가 PHA 함량이 높으면서 중합체 내 HHx의 수준이 높은 공중합체를 생성한다는 것이 배양물의 분석으로 밝혀졌다.

본 발명자들은 통상 25 내지 30 wt％의 HHx를 갖는 공중합체를 수득하였고, 이는 20 내지 24 mol％ HHx에 해당하였다. 균주를 야자유에서 성장시킨 경우, HHx 값이 최대 33 wt％ (27 mol％)인 공중합체를 수득하였다.

실시예 3: 중합체 특성화

신규 개발된 PHA 오페론 (phaC _D12 - phaA - phaJ1 _Pa )을 갖는 균주에 의해 생성된 PHA 공중합체의 특성을 측정하였다. PHA 공중합체의 분자량은 겔-투과 크로마토그래피에 의해 폴리스티렌 표준물과 관련하여 120,000 내지 150,000 g/mol인 것으로 밝혀졌다.

PHA 공중합체의 열적 특성을 시차 주사 열량계를 이용하여 측정하였다. 샘플을 알루미늄 팬에 로딩하고, 퍼킨 엘머 파이리스(Perkin Elmer Pyris) 1 DSC를 이용하여 분석하였다. 이용된 온도 프로그램은 다음과 같았다: (1) 50℃에서 1분 유지, (2) 20℃/분의 속도로 -40℃로 냉각시킴, (3) -40℃에서 3분 유지, (4) 20℃/분의 속도로 200℃로 가열시킴, (5) 200℃에서 1분 유지, (6) 20℃/분의 속도로 -40℃로 냉각시킴, (7) -40℃에서 3분 유지, (8) 20℃/분의 속도로 50℃로 가열시킴. 유리 전이 온도는 흡열 기울기의 변화가 발생하는 온도로 확인하였다. 융점은 가장 높은 흡열 피크로 확인하였다. DSC 분석 결과, 상술한 균주에 의해 생성된 27 mol％ HHx를 함유하는 공중합체는 -4℃의 유리 전이 온도를 갖는 것으로 밝혀졌다.

실시예 4: 로도코코스 에테리보란스 I24 PHA 신타제의 서열 데이터

로도코코스 에테리보란스 I24 게놈 서열에 대해 공지된 신타제 펩티드 서열을 BLAST하여 가능성 있는 신타제 유전자를 확인하였다. 로도코코스 에테리보란스 I24 게놈에서 예상된 단백질 서열의 분석에 기초하여, 2종의 PHA 신타제를 상기 게놈으로부터 클로닝하였고, 이를 또한 본원에서 CO9 신타제 및 D12 신타제라 지칭하였다. 2종의 PHA 신타제 둘 다 알. 유트로파에서 (상술한 바와 같이) 발현시 활성인 것으로 측정되었다.

널리 연구된 신타제의 BLAST 서열 분석 결과, 클로닝된 PHA 신타제 둘 다에 대한 유전자는 슈도모나드(pseudomonad)로부터의 신타제와 가장 밀접한 것으로 밝혀졌다. 이러한 슈도모나드 신타제는 매우 광범위한 기질 특이성을 갖는 것으로 공지되어 있다. CO9 신타제 및 D12 신타제는 최대 C7-C8의 기질을 중합할 것이며, 이는 알. 유트로파로부터의 신타제보다 광범위한 기질 특이성이다.

A. CO9 신타제

B. D12 신타제

참고문헌

당업자는 단지 통상의 실험을 이용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 수많은 동등물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 하기 특허청구범위에 포함된다.

본원에 개시된 모든 참고문헌은 본원에서 언급된 목적을 위해 이들의 전문이 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Massachusetts Institute of Technology Budde, Charles Rha, ChoKyun Sinskey, Anthony <120> METHODS FOR PRODUCING POLYHYDROXYALKANOATE COPOLYMER WITH HIGH MEDIUM CHAIN LENGTH MONOMER CONTENT <130> M0656.70198WO00 <150> US 61/260,164 <151> 2009-11-11 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1689 <212> DNA <213> Rhodococcus aetherivorans I24 <400> 1 ttgctcgacc acgtgcacaa gaagttgaag tcgaccctgg acccgatcgg ctggggtccc 60 gcggtgaagt cggtggccgg acgcgccgtc cgcaaccccc aggccgtcac cgccgccacg 120 acggaatacg cgggccggct ggtgaagatc cccgcggcgg ccacccgcgt gttcaacgcc 180 gacgatccca agccgccgat gccgctcgac ccgcgggacc gccgtttctc cgacaccgcc 240 tggcgggaga accccgcgta cttctcgctc ctgcagagtt atctcgcgac gcgggcctac 300 gtcgaggaac tcaccgacgc cggcgccggc gatccgctgc aggacggcaa ggcccgccag 360 ttcgcgaacc tgatgctcga cgtgctggcc ccgtcgaact tcctgtggaa tccgggcgtg 420 ctcacccgtg cattcgagac gggcggggca agcctgctgc gcggcgcccg atatgccgtg 480 cacgacgtgc tcaaccgcgg cggcctgccg ctgaaggtgg actcggacgc 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Val Pro Pro Pro Ala Met 530 535 540 Gly Ser Ala Ala His Pro Pro Leu Glu Asp Ala Pro Gly Thr Tyr Val 545 550 555 560 Phe Ser <210> 3 <211> 1686 <212> DNA <213> Rhodococcus aetherivorans I24 <400> 3 atgatggccc aggcacgaac cgtgatcggt gagagcgtcg aggagtcgat cgggggtggc 60 gaggacgtcg cgccaccgag gctcgggccg gccgtcggcg ccctggccga cgtgttcggt 120 cacggccggg cggtggcccg gcacggcgtg tcgttcggca gggaactggc gaagatcgcc 180 gtcggccggt cgacggtggc tccggcgaag ggagaccgcc ggttcgccga ctcggcgtgg 240 agtgcgaacc ccgcctaccg ccggctcggg cagacctacc tggcggcaac cgaggccgtc 300 gacggagtcg tcgacgaggt cggtcgcgcg atcggcccgc gacgcacggc cgaggccagg 360 ttcgccgccg acatcctcac cgcggccctg gccccgacga actacctgtg gaccaacccc 420 gcggcgctga aggaggcgtt cgacaccgcc ggactcagcc tcgcacgcgg caccaagcac 480 ttcgtctccg atctgatcga gaaccggggc atgccgtcga tggtccagcg cggcgccttc 540 accgtcggga aggaccttgc ggtgaccccg ggtgcggtga tctcccgcga cgaggtcgcc 600 gaggtgctgc agtacacccc gaccacggag acggtccgcc gccggccggt gctcgtggtg 660 cccccgccga tcggccggta ctacttcctg 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Claims

탄소 공급원으로서 임의의 식물성 오일을 사용하여 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 중쇄(medium chain) 길이 단량체 함량을 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체를 생성하는 세포.
제1항에 있어서, 탄소 공급원으로서 임의의 식물성 오일을 사용하여 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 HHx 함량을 갖는, 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체 (폴리(HB-코-HHx))를 생성하는 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 내 3-히드록시부티레이트의 정상적인 합성이 파괴된 것인 세포.
제3항에 있어서, 아세토아세틸-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자가 결실된 것인 세포.
제4항에 있어서, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 세포이며, phaB1, phaB2 및 phaB3 유전자 중 하나 이상이 파괴된 것인 세포.
제5항에 있어서, phaB3 유전자가 파괴된 것인 세포.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 비내인성 PHA 신타제 유전자를 재조합적으로 발현하는 세포.
제7항에 있어서, 비내인성 PHA 신타제 유전자가 에어로모나스 카비애(Aeromonas caviae) PHA 신타제 유전자 또는 로도코쿠스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) PHA 신타제 유전자인 세포.
제8항에 있어서, 로도코쿠스 에테리보란스 PHA 신타제 유전자가 서열 4를 코딩하는 로도코쿠스 에테리보란스 I24 D12 PHA 신타제 유전자 또는 서열 2를 코딩하는 로도코쿠스 에테리보란스 I24 C09 PHA 신타제 유전자인 세포.
제9항에 있어서, 로도코쿠스 에테리보란스 I24 D12 PHA 신타제 유전자가 서열 3을 포함하거나 이로 이루어지고/거나 로도코쿠스 에테리보란스 I24 C09 PHA 신타제 유전자가 서열 1 또는 개시 코돈이 TTG에서 ATG로 변경된 서열 1을 포함하거나 이로 이루어진 것인 세포.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 에노일-CoA 히드라타제 유전자를 재조합적으로 발현하는 세포.
제11항에 있어서, 에노일-CoA 히드라타제 유전자가 에어로모나스 카비애 에노일-CoA 히드라타제 유전자 또는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 에노일-CoA 히드라타제 유전자인 세포.
제12항에 있어서, 슈도모나스 에어루지노사 에노일-CoA 히드라타제 유전자가 슈도모나스 에어루지노사 phaJ1 유전자 (유전자 PA3302) 또는 슈도모나스 에어루지노사 phaJ2 유전자 (유전자 PA1018)인 세포.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 비내인성 PHA 신타제 유전자 및/또는 에노일-CoA 히드라타제 유전자가 증폭된 것인 세포.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 5 mol％인 세포.
제15항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 6 mol％인 세포.
제16항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 7 mol％인 세포.
제17항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 10 mol％인 세포.
제18항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 15 mol％인 세포.
제19항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 20 mol％인 세포.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 6 wt％인 세포.
제21항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 8 wt％인 세포.
제22항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 10 wt％인 세포.
제23항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 15 wt％인 세포.
제24항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 20 wt％인 세포.
제25항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 25 wt％인 세포.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 세포, 진균 세포 (효모 세포 포함), 식물 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포인 세포.
제27항에 있어서, 박테리아 세포 또는 진균 세포인 세포.
제28항에 있어서, 랄스토니아 종, 에어로모나스 종, 리조비움(Rhizobium) 종, 알칼리게네스(Alcaligenes) 종 또는 슈도모나스 종 세포인 세포.
제29항에 있어서, 랄스토니아 유트로파, 에어로모나스 카비애, 리조비움 제포니큠(Rhizobium japonicum), 알칼리게네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus) 또는 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) 세포인 세포.
제30항에 있어서, 랄스토니아 유트로파 세포인 세포.
제7항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 비내인성 PHA 신타제 유전자 및/또는 에노일-CoA 히드라타제 유전자가 플라스미드로부터 발현된 것인 세포.
제7항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 비내인성 PHA 신타제 유전자 및/또는 에노일-CoA 히드라타제 유전자가 세포의 게놈에 통합된 것인 세포.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 세포를 배양하여 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 중쇄 길이 단량체 함량을 갖는 공중합체를 생성하는 단계를 포함하는, 고함량의 중쇄 길이 단량체를 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성 방법.
제34항에 있어서, 제2항 내지 제33항 중 어느 한 항의 세포를 배양하여 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 HHx 함량을 갖는, 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체 (폴리(HB-코-HHx))를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서, 세포로부터 공중합체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제35항 또는 제36항에 있어서, 생성된 공중합체의 양이 세포 건조 중량의 적어도 약 20％인 방법.
제37항에 있어서, 생성된 공중합체의 양이 세포 건조 중량의 적어도 약 30％인 방법.
제38항에 있어서, 생성된 공중합체의 양이 세포 건조 중량의 적어도 약 40％인 방법.
제39항에 있어서, 생성된 공중합체의 양이 세포 건조 중량의 적어도 약 50％인 방법.
제40항에 있어서, 생성된 공중합체의 양이 세포 건조 중량의 적어도 약 60％인 방법.
세포 내에서 적어도 하나의 로도코쿠스 에테리보란스 PHA 신타제 유전자를 재조합적으로 발현시키는 단계를 포함하는, 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 중쇄 길이 단량체 함량을 갖는 폴리히드록시알카노에이트 공중합체를 생성하는 세포의 생성 방법.
제42항에 있어서, 세포가 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 HHx 함량을 갖는, 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체 (폴리(HB-코-HHx))를 생성하는 것인 방법.
제42항 또는 제43항에 있어서, 로도코쿠스 에테리보란스 PHA 신타제 유전자가 서열 4를 코딩하는 로도코쿠스 에테리보란스 I24 D12 PHA 신타제 유전자이고/거나 서열 2를 코딩하는 로도코쿠스 에테리보란스 I24 C09 PHA 신타제 유전자인 방법.
제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 로도코쿠스 에테리보란스 I24 D12 PHA 신타제 유전자가 서열 3을 포함하거나 이로 이루어지고/거나 로도코쿠스 에테리보란스 I24 C09 PHA 신타제 유전자가 서열 1 또는 개시 코돈이 TTG에서 ATG로 변경된 서열 1을 포함하거나 이로 이루어진 것인 방법.
제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 에노일-CoA 히드라타제 유전자를 재조합적으로 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제46항에 있어서, 에노일-CoA 히드라타제 유전자가 에어로모나스 카비애 에노일-CoA 히드라타제 유전자 또는 슈도모나스 에어루지노사 에노일-CoA 히드라타제 유전자인 방법.
제47항에 있어서, 슈도모나스 에어루지노사 에노일-CoA 히드라타제 유전자가 슈도모나스 에어루지노사 phaJ1 유전자 (유전자 PA3302) 또는 슈도모나스 에어루지노사 phaJ2 유전자 (유전자 PA1018)인 세포.
제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 비내인성 PHA 신타제 유전자 및/또는 에노일-CoA 히드라타제 유전자가 증폭된 것인 방법.
제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 박테리아 세포, 진균 세포 (효모 세포 포함), 식물 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포인 방법.
제50항에 있어서, 세포가 박테리아 세포 또는 진균 세포인 방법.
제51항에 있어서, 세포가 랄스토니아 종, 에어로모나스 종, 리조비움 종, 알칼리게네스 종 또는 슈도모나스 종 세포인 방법.
제52항에 있어서, 세포가 랄스토니아 유트로파, 에어로모나스 카비애, 리조비움 제포니큠, 알칼리게네스 유트로푸스 또는 슈도모나스 올레오보란스 세포인 방법.
제53항에 있어서, 세포가 랄스토니아 유트로파 세포인 방법.
제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 비내인성 PHA 신타제 유전자 및/또는 에노일-CoA 히드라타제 유전자가 플라스미드로부터 발현된 것인 방법.
제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 비내인성 PHA 신타제 유전자 및/또는 에노일-CoA 히드라타제 유전자가 세포의 게놈에 통합된 것인 방법.
제34항 내지 제56항 중 어느 한 항의 방법에 따라 세포를 생산하는 단계 및 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 적어도 약 4 mol％ 또는 5 wt％의 중쇄 길이 단량체 함량을 갖는 하나 이상의 폴리히드록시알카노에이트 공중합체의 생성 방법.
제57항에 있어서, 공중합체 중 하나 이상이 3-히드록시헥사노에이트와의 3-히드록시부티레이트의 공중합체 (폴리(HB-코-HHx))인 방법.
제57항 또는 제58항에 있어서, 세포 집단으로부터 하나 이상의 공중합체를 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 5 mol％인 방법.
제60항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 6 mol％인 방법.
제61항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 7 mol％인 방법.
제62항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 10 mol％인 방법.
제63항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 15 mol％인 방법.
제64항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 20 mol％인 방법.
제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 6 wt％인 방법.
제66항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 8 wt％인 방법.
제67항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 10 wt％인 방법.
제68항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 15 wt％인 방법.
제69항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 20 wt％인 방법.
제70항에 있어서, 단량체 함량이 적어도 약 25 wt％인 방법.
제57항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 공중합체의 양이 세포 건조 중량의 적어도 약 20％인 방법.
제72항에 있어서, 생성된 공중합체의 양이 세포 건조 중량의 적어도 약 30％인 방법.
제73항에 있어서, 생성된 공중합체의 양이 세포 건조 중량의 적어도 약 40％인 방법.
제74항에 있어서, 생성된 공중합체의 양이 세포 건조 중량의 적어도 약 50％인 방법.
제75항에 있어서, 생성된 공중합체의 양이 세포 건조 중량의 적어도 약 60％인 방법.
서열 2를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
서열 1 또는 개시 코돈이 TTG에서 ATG로 변경된 서열 1로서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
서열 1로서 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80％의 동일성을 갖는 단리된 핵산 분자.
제79항에 있어서, 서열 1로서 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90％의 동일성을 갖는 단리된 핵산 분자.
제80항에 있어서, 서열 1로서 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95％의 동일성을 갖는 단리된 핵산 분자.
제81항에 있어서, 서열 1로서 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 98％의 동일성을 갖는 단리된 핵산 분자.
제77항 내지 제82항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드.
제77항 내지 제82항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제77항 내지 제82항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자를 재조합적으로 발현하는 세포.
제85항에 있어서, 핵산 분자가 벡터로부터 발현된 것인 세포.
제85항에 있어서, 핵산 분자가 세포의 게놈에 통합된 것인 세포.
서열 4를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
서열 3으로서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
서열 3으로서 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80％의 동일성을 갖는 단리된 핵산 분자.
제90항에 있어서, 서열 3으로서 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90％의 동일성을 갖는 단리된 핵산 분자.
제91항에 있어서, 서열 3으로서 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95％의 동일성을 갖는 단리된 핵산 분자.
제92항에 있어서, 서열 3으로서 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 98％의 동일성을 갖는 단리된 핵산 분자.
제88항 내지 제93항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드.
제88항 내지 제93항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제88항 내지 제93항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자를 재조합적으로 발현하는 세포.
제96항에 있어서, 핵산 분자가 벡터로부터 발현된 것인 세포.
제96항에 있어서, 핵산 분자가 세포의 게놈에 통합된 것인 세포.