KR20120089407A - 홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 또는 피부 주름 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명의 홍차 추출물은 Melan-a 세포를 대상으로 한 실험과, UVB에 의해 인공색소반을 유도시킨 갈색 기니아 피그(brown guinea-pig) 모델을 이용한 동물실험에서 멜라닌 색소의 합성을 크게 억제하였고, SKH-1 무모(hairless) 마우스를 대상으로 한 실험에서 주름의 형성을 현저하게 저해하였다. 따라서, 본 발명의 조성물을 피부 미백제, 주름 억제제 또는 멜라닌 색소 과다 침착으로 인한 질환, 예컨대 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증 등의 질환을 치료하는 약제로 개발될 수 있다.

Description

홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물{Composition For Improving Skin Condition Comprising Extract From Black Tea As Active Ingredient}

본 발명은 홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 또는 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.

멜라닌 생성과 축적이 증가하면 흑피증(melasma), 염증후흑피증(postinflammatory melanoderma), 일광흑색점(solar lentigo)등과 같은 후천성 과다색소침착을 포함하는 다양한 피부질환을 유발할 수 있다(Cullen 1998; Urabe et al. 1998). 상피 및 피부 과다색소침착은 멜라노사이트(melanocyte)의 수가 증가하거나 또는 멜라닌 생성 효소 활성의 증가에 기인할 수 있다(Ortonne and Nordlund 1998). 자외선광, 만성염증 및 피부 마찰 뿐만 아니라 비정상적 α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone)의 분비도 상기와 같은 질환을 유도하는 인자가 될 수 있다(Im et al. 2002; Kang et al. 2002). 후천성 과다색소침착 증상은 주로 외부에 노출된 부분에 위치하고 있기 때문에 사회심리학과 미용학적 관련성을 가지므로 탈색소화제를 개발하기 위한 많은 연구 및 노력이 경주되어 왔다. 멜라닌생성은 주로 표피 기저층내의 멜라노사이트 세포의 멜라노좀으로 알려진 라이소좀 유사 구조내에서 발생되고(Hearing 2005), 멜라닌의 2가지의 주요 형태인 흑색/갈각 유멜라닌(black/brown eumelanin) 및 황색/적색 페오멜라닌(yellow/red pheomelanin)은 동일한 전구체인 티로신으로부터 공통적인 티로시나아제(tyrosinase)-의존성 경로을 통해 유도된다. 티로시나아제 유전자 패밀리의 3개의 주요 멜라노좀 부속 효소들이 멜라닌 생합성에 관여된다. 티로시나아제는 멜라닌 합성에서 다음의 2가지의 중요한 반응을 촉매하는 핵심 효소이다: 티로신을 DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine)으로 수산화시키는 반응과, DOPA를 도파퀴논(dopaquinone)으로 산화시키는 반응(Tripathi et al. 1992). 도파퀴논은 도파크롬으로 자발적으로 변환된다. TRP-2(Tyrosinase-related protein-2)/DCT(dopachrome tautomerase)은 도파크롬의 DHICA(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)으로의 변환을 촉매한다. TRP-1(Tyrosinase-related protein-1, DHICA oxidase)는 DHICA를 인돌-5,6-퀴논-2-카르복실산으로 산화시키는 반응을 촉매한다. 이들 2개의 밀접하게 관련된 구조, TRP-2/DCT 및 TRP-1은 불안정한 퀴논을 생성하도록 작용하고, 상기 불안정한 퀴논은 추가적인 중합반응을 거쳐 최종적으로 멜라닌을 생성한다(Mallick et al. 2005). 몇몇의 탈색소화제는 티로시나아제 뿐만 아니라 관련된 멜라닌 생성 효소 TRP-1, TRP-2 및/또는 퍼옥시다아제의 전사(transcription)과 활성을 억제함으로써 피부 색소화를 조절한다. 히드로퀴논(hydroquinone), 코직산(kojic acid) 및 아르부틴(arbutin)과 같은 공지된 억제제들이 피부의 과다색소침착질환의 치료에 사용되었으나, 최근에 인간의 건강에 안전하지 않다는 것이 밝혀졌다. 히드로퀴논(Hydroquinone, HQ)은 막 지질 및 단백질의 손상을 가하는 퀴논 및 활성산소종의 생성을 통해, RNA 및 DNA 합성을 저해하고, 효소 활성자리에 위치한 구리(copper)와 상호작용함으로써 멜라노좀의 기능 뿐만 아니라 티로시나아제의 활성을 90％ 까지 감소시킨다(Briganti et al. 2003). 과다색소침착을 14-70％ 정도 개선시키는 이의 비교적 높은 멜라노사이트-특이적 독성 및 이의 일반적인 안전성에도 불구하고, HQ는 피부가려움, 접촉성피부염 및 (드물게) 퇴자병, 잘 치료되지 않은 거무스름한 과다색소침착과 같은 부작용이 있다(Ortonne and Passeron 2005).

California buckeye (Aesculus californica) 열매로부터 분리된 HQ의 천연 β-글리코사이드인 아르부틴(arbutin)은 mRNA 발현에 영향을 미치지 않고 티로시나아제 활성을 감소시킨다(Hori et al. 2004). 이는 또한 멜라노좀 성숙을 저해한다. 저농도를 사용하는 것보다 고농도를 사용하는 것이 더욱 효과적이지만, 염증후 과다색소침착의 결과로 인한 역설적인 색소 검화(pigment darkening)가 발생할 수 있다 (Draelos 2007). Aspergillus 및 Penicillum species 으로부터의 곰팡이 대사성 산물인 코직산(Kojic acid)는 아시아에서 미백제로 많이 사용되고 있으며 다이어트 첨가제로도 사용되고 있고, 효소의 활성부위의 구리와 킬레이팅되어 티로시나아제 저해제로서 작용하는 것으로 알려져 있다(Battaini et al. 2000). 저색소화제로서 효과적이고, 특히 다른 물질과 조합하는 경우에 효과적이지만, 매우 민감한 특성을 가지고 있으며 접촉성 피부염을 일으킬 수 있다(Lim 1999). 인체에 부작용을 일으키지 않으면서 피부 미백효과를 나타내는 식물성 화합물을 탐색하고 개발하는 많은 연구가 진행되고 있다. 차류는 전세계적으로 가장 보편적으로 소비되는 음료중의 하나이다. 폴리페놀류는 신선한 차잎에서 자연적으로 발견되는 화합물이며, 신선한 차잎에서 발견되는 4가지 종류의 주요 폴리페놀은 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG, epigallocatechin gallate), 에피갈로카테킨(epigallocatechin), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate) 및 에피카테킨( epicatechin)이며, EGCG가 가장 풍부하다. 이러한 4가지 종류의 카테킨이 신선한 차잎의 최대 30％ 가량 차지한다(Graham 1992). 녹차(green tea)를 제조하기 위해서는 차를 채집한 후에 신선한 차 잎에 증기를 가하거나 고온에서 팬-건조(pan-dried)를 하여, 차잎속의 천연 카테킨의 산화를 최소화한다. 한편, 홍차(black tea)를 제조하는 과정 동안 발효 공정에서 신선한 차잎을 굴리거나 으깨어줌으로써 폴리페놀의 산화 및 중합화를 촉진시켜, 홍차 특유의 적갈색 및 떫은맛을 내게 하는 차홍소(thearubigins) 및 차황소(theaflavins)와 같은 다른 폴리페놀들을 생성된다(Sun et al. 2006). 차황소 및 녹차 플라보놀은 라디칼 소거능 및 금속 킬레이팅 기능 때문에 항산화 활성을 갖는 것으로 알려져 있다(Serafini et al. 1996).

노화는 외인성 및 내인성 결정자에 의해 구조적 완전성과 생리학적 기능을 점진적으로 소실하여 가는 과정이다(Farage et al. 2008). 자외선 조사에 의해 주름, 햇볕에 탐, 면역억제, 암 및 조숙한 피부노화(광노화)와 같은 다양하고 다수의 임상적 피부 변화가 유도된다. 피부연결조직에 대한 광손상은 광손상된 피부의 특징적인 노화 외관의 주요 요인이다(Fisher et al. 1997). UV에 피부가 노출되면 활성산소종(ROS)가 광범위하게 유도된다. 활성산소종은 과산화수소와 같은 비-라이칼성 종 뿐만 아니라, 수퍼옥사이드(superoxide), 히드록실라디칼, 퍼옥시라디칼과 같은 자유 라디칼을 포함한다(Cerutti 1991). 인 비보에서, 상기 활성산소종의 몇몇은 에너지 생성, 식세포작용, 세포성장 조절 및 세포내 신호전달과 같은 긍정적인 역할을 한다. 반면에, 이들은 DNA, 단백질, 지방산 및 당과 반응하여 산화적 손상을 야기한다. 이러한 손상은 다음과 같은 몇 가지의 유해한 효과를 초래한다: 세포 대사의 혼란, 형태학적 및 초구조적 변화, 조절경로에한 공격, 피부세포의 분화, 증식 및 아폽토시스에서의 변형(Svobodova et al. 2003; Zhaorigetu et al. 2003). 활성산소종(ROS)은 케라티노사이트와 섬유아세포에서 끊임없이 생성되지만 비-효소적 및 효소적 항산화제 물질에 의해 신속하게 제거된다. 이러한 방어 메카니즘은 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 카탈라아제, 및 글루타티온 퍼옥시다아제와 같은 항산화성 효소와 글루타티온 및 비타민 C 및 E와 같은 소분자들을 포함한다(Fridovich 1999).

광손상된 피부는 상피의 비후 및 피부의 생물 기계적 특성의 변형을 유도하여 결국 주름을 형성하게 된다. 이러한 과정에는 피부의 주요 구성성분인 콜라겐에에서 탄성물질의 축적과 면역조직화학적 변화를 포함하는 피부의 세포외기질 구성성분의 질적 및/또는 양적 변형이 관련되어 있다(Chaquer et al. 1995). 피부가 노화됨으로써, 섬유아세포의 수가 감소하고 기능이 퇴화되며, 이에 의해 콜라겐 섬유 및 탄성 섬유과 같은 세포외기질 단백질의 합성이 중지되고, 피부 세포의 함수량도 줄어들게 되며, 각질층(SC, stratum corneum)의 구조도 변화되게 된다. UVB 노출된 피부의 각질층의 산화를 통해 피부 장벽에 손상이 가해짐으로써, 피부의 수분 유지 기능이 약해진다. UV 조사는 콜라겐의 합성에 손상을 가하고, MMPs(matrix metalloproteinases)의 발현이 나타나도록 유도한다(Brennan et al. 2003; Brenneisen et al. 2002). MMPs는 광범위한 기질 특이성을 갖는 아연-의존성 엔도프로테아제(endoprotease) 패밀리로서, 모든 세포외기질(ECMs)을 분해할 수 있다(Kim et al. 2006). 인 비보에서 인간의 피부를 UV 조사에 급성적으로 노출시키면, 피부 콜라겐을 분해하는 MMP-1 (interstitial collagenase), MMP-3 (stromelysin-1), 및 MMP-9 (92-kdgelatinase B)을 포함하는 여러 MMPs의 합성을 상향 조절한다(Honda et al. 2008). UV 조사에 노출시키면 상피내에서 면역억제와 관련된 다양한 변화가 발생한다. UV 조사는 상피 랑게르한스 세포(Langerhans cells, LCs)와 수지상 상피 T 세포의 밀도를 감소시킬 수 있다. 또한, 대식세포(macrophages), 과립구 및 T 세포를 상피세포내로 침투시킨다(Sluyter and Halliday 2000).

레티노이드는 케라티노사이트 및 섬유아세포의 증식을 유도하고, 콜라겐의 함성을 촉진하며, 피부에서의 MMPs 발현 수준을 감소시키는 것으로 알려져 있다(Varani et al. 1991). 레티노이드 패밀리는 비타민 A(레티놀) 및 다수의 합성 유도체 뿐만 아니라 레티날디하이드(retinaldehyde), 레티노인산, 및 레티닐 에스테르와 같은 레티놀의 천연 유도체를 포함한다(Antille et al. 2004).

다양한 천연 및 합성 레티노이드는 노화 치료 용도로 개발되어 왔고 이들의 몇몇은 조직학적 및 임상학적 개선 효과를 갖는 것으로 밝혀졌으나, 이러한 연구의 대부분은 광노화된 피부를 갖는 환자를 대상으로 행해진 것이었다. 레티노이드가 피부 노화 치료에 효과를 보였으나, 레티노이드 치료와 관련된 화상, 스케일링 또는 피부염과 같은 자극반응이 환자의 치료제로 사용하는데 한계점을 두었다(Mukherjee et al. 2006).

식물 추출물은 상처치료, 항노화 및 질병 치료를 위한 국부 적용제로서 광범위하게 사용되어 왔다(Hsu 2005). 페놀산 및 플라보노이드와 같은 허브의 페놀성분의 항산화제 활성이 주목을 받아왔다. 차(Camelia sinensis L.) 잎은 주로 카테킨[(-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), (-)-epicatechin-3-gallte (ECG), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)- epicatechin (EC)]으로서 플라보노이드 성분과 같은 폴리페놀성분을 다량 함유하고 있으며, 홍차의 제조과정에서 산화되어 테아플라빈류(theaflavins) 및 테아루비젠류(thearubigens)을 생성한다(Yen and Chen 1995; Ho et al. 1992). 통상적으로 '폴리페놀류'라고 불리우는 에피카테킨(epicatechin) 유듀체은 녹차의 활성성분이고 항산화능, 항염증 및 항암 특성을 갖는 것으로 알려져 있다(Katiyar et al. 2001). 녹차의 성분인 EGCG는 자와선 조사 또는 발암제에 의해 생성되는 피부암을 억제하고, 세포외기질 분해을 감소시키며, 녹차 폴리페놀성분은 케라티노사이트의 증식을 촉진함으로써 피부 항-노화 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Wang et al. 1991; Lee et al. 2005; Hsu et al. 2003). 백차(white tea)는 차중에서 공정이 가장 덜 가해진 차이고, 폴리페놀성분을 고함량으로 포함하고 있으며 미백효과가 있는 것으로 알려져 있다. 홍차(black tea)는 자외선 조사에 의해 유도되는 햇볕에 탄 세포의 수를 감소시키고(Record and Dreost 1998), 피부암 억제 및 항염증 효과를 가지며(Ratansooriya and Fernancho 2009), 항산화 및 항미생물 활성(Bancirova 2010)을 갖는 것으로 알려져 있다. 그러나 지금까지, 홍차의 피부 노화 억제 효과는 알려져 있지 않다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 피부 상태를 개선할 수 있는 물질을 천연의 재료로부터 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 홍차 추출물이 멜라닌의 합성을 저해함으로써 뛰어난 피부 미백효능을 가지며, 종래의 주름개선제인 레티노인산(retinoic acid)과 대등한 정도의 주름 개선 효과를 가진다는 것을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 홍차(black tea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부의 미백용 또는 주름 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 홍차 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다.

본 발명의 홍차 추출물을 추출하기 위한 추출 용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있는데, 예를 들어 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 홍차 추출물은 물을 용매로 이용한 추출물로서, 가장 바람직하게는 홍차의 열수 추출물이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 홍차추출물은 조성물 총 중량에 대해 0.0001 - 10 중량％으로 포함되어 있다.

하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 홍차 추출물은 Melan-a 세포를 대상으로 한 실험과, UVB에 의해 인공색소반을 유도시킨 갈색 기니아 피그(brown guinea-pig) 모델을 이용한 동물실험에서 멜라닌 색소의 합성을 크게 억제하였고, SKH-1 무모(hairless) 마우스를 대상으로 한 실험에서 주름의 형성을 현저하게 저해하였다.

본 발명의 조성물은 피부 미백용 또는 피부 주름 개선용 화장품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 홍차 추출물의 유효성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 화장품학적 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖다.

본 발명은 상기 홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "멜라닌 색소의 과다침착"은 피부 또는 손발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 현상을 의미한다. 바람직하게는 상기 멜라닌 색소 과다침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 멜라닌 색소 과다 침착으로 인한 질환을 치료 또는 예방을 위해 적용되는 점을 감안하면, 본 발명 조성물은 피부에 국소적으로 도포되어 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부외용 제형을 갖는다. 피부외용 제형은 특별히 한정되지 않으며 바람직하게는 파우더, 젤, 연고, 크림, 로션, 액제 또는 에어로졸 제형이다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 또는 피부 주름 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명의 홍차 추출물은 Melan-a 세포를 대상으로 한 세포 실험과, UVB에 의해 인공색소반을 유도시킨 갈색 기니아 피그(brown guinea-pig) 모델을 이용한 동물실험에서 멜라닌 색소의 합성을 크게 억제하였고, SKH-1 무모(hairless) 마우스를 대상으로 한 실험에서 주름의 형성을 현저하게 저해하였다. 따라서, 본 발명의 조성물을 피부 미백제, 주름 억제제 또는 멜라닌 색소 과다 침착으로 인한 질환, 예컨대 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증 등의 질환을 치료하는 약제로 개발될 수 있다.

도 1은 본 발명의 시료의 총 폴리페놀의 함량의 측정 결과이다.
도 2는 본 발명의 시료의 총 플라보노이드 함량의 측정 결과이다.
도 3은 본 발명의 시료의 전자주기능의 측정 결과이다.
도 4는 Melan-a 세포에 대한 본 발명 시료의 세포 생존능의 영향을 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 시료로 처리한 Melan-a 세포의 형태학적 관찰결과이다. X 200. 패널 A: 비-처리세포, 패널 B: 코직산(kojic acid) 12.5 ㎍/㎖ 처리세포, 패널 C: EGCG (12.5 ㎍/㎖) 처리세포, 패널 D: 아르부틴(arbutin) (12.5 ㎍/㎖) 처리세포, 패널 E: 녹차(12.5 ㎍/㎖) 처리세포, 패널 F: 백차(12.5 ㎍/㎖) 처리세포, 패널 G: 홍차(12.5 ㎍/㎖) 처리세포, 패널 H: 홍차(6.25 ㎍/㎖) 처리세포, 패널 I: 홍차 (3.125 ㎍/㎖) 처리세포.
도 6은 Melan-a 세포에서 본 발명 시료의 멜라닌 합성 억제효능을 측정한 결과이다.
도 7은 Melan-a 세포에서 세포내 티로시나아제 활성에 대한 본 발명의 시료의 억제효과를 시료 처리후 60분에서 측정한 결과이다.
도 8은 Melan-a 세포에서 세포 추출물내 티로시나아제 활성에 대한 본 발명의 시료의 억제효과를 시료 처리후 60분에서 측정한 결과이다.
도 9는 Melan-a 세포에서 티로시나아제 발현에 대한 본 발명의 시료의 효과를 측정한 결과이다.
도 10은 Melan-a 세포에서 티로시나아제, TRP-1, 및 TRP-2의 mRNA 발현에 대한 본 발명의 시료의 효과를 측정한 결과이다.
도 11은 브라운 기니아 피그의 피부에 본 발명의 시료를 4 주간 적용시킨 후, 탈색소화 효과를 전체적으로 관찰한 결과이다. 패널 C: 식염수(saline) 처리군, 패널 VC: 부형제(vehicle) 처리군, 패널 PC: 2％ 히드로퀴논(hydroquinone) 처리군, 패널 E1: 2％ EGCG 처리군, 패널 E2: 2％ 녹차처리군, 패널 E3: 2％ 백차 처리군, 패널 E4: 2％ 홍차 처리군.
도 12는 브라운 기니아 피그 피부에 대해 인공적인 햇볕에 탄 반점을 형성시키고 여기에 본 발명의 시료를 4 주간 적용한 경우에 멜라닌 인덱스를 측정하여 비교한 결과이다.
도 13은 브라운 기니아 피그의 피부에 본 발명의 시료를 4 주간 적용시킨 후, 조직학적으로 관찰한 결과이다. H&E 염색, X 200. 패널 A: 식염수 처리군 (C 군), 패널 B: 부형체 처리군 (VC 군), 패널 C: 2％ 홍차 처리군 (E4 군), 패널 D: 2％ EGCG 처리군 (E1 군), 패널 E: 2％ 녹차 처리군 (E2 군), 패널 F: 2％ 히드로퀴논(hydroquinone) 처리군 (PC 군), 패널 G: 2％ 백차 처리군 (E3 군), 패널 H: 비-처리군 (정상군).
도 14는 브라운 기니아 피그의 피부에 본 발명의 시료를 4 주간 적용시킨 후, 멜라닌 색소침착을 관찰한 결과이다. F-M 염색 X400. 패널 A: 식염수 처리군 (C 군), 패널 B: 부형체 처리군 (VC 군), 패널 C: 2％ 홍차 처리군(E4 군), 패널 D: 2％ EGCG 처리군 (E1 군), 패널 E: 2％ 녹차 처리군(E2 군), 패널 F: 2％ 히드록시퀴논 처리군 (PC 군), 패널 G: 2％ 백차 처리군(E3 군), 패널 H: 비처리군 (정상군).
도 15는 브라운 기니아 피그의 피부에 본 발명의 시료를 4 주간 적용시킨 후, S-100(+) 멜라노사이트를 조직학적으로 관찰한 결과이다. S-100 면역조직화학적 염색 X400. 패널 A: 식염수 처리군 (C 군), 패널 B: 부형제 처리군 (VC 군), 패널 C: 2％ 홍차 처리군 (E4 군), 패널 D: 2％ EGCG 처리군 (E1 군), 패널 E: 2％ 녹차 처리군 (E2 군), 패널 F: 2％ 히드로퀴논 처리군 (PC 군), 패널 G: 2％ 백차 처리군 (E3 군), 패널 H: 비-처리군 (정상군).
도 16은 브라운 기니아 피그의 피부에 본 발명의 시료를 4 주간 적용시킨 후, gp 100(+) 멜라노사이트를 조직학적으로 관찰한 결과이다. HMB-45 면역화학적 염색, X400. 패널 A: 식염수 처리군 (C 군), 패널 B: 부형제 처리군 (VC 군), 패널 C: 2％ 홍차 처리군 (E4 군), 패널 D: 2％ EGCG 처리군 (E1 군), 패널 E: 2％ 녹차 처리군 (E2 군), 패널 F: 2％ 히드로퀴논 처리군 (PC 군), 패널 G: 2％ 백차 처리군 (E3 군), 패널 H: 비처리군 (normal 군).
도 17은 녹차 추출물(GT) 및 홍차 추출물(BT)의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 측정결과이다.
도 18은 녹차 추출물(GT) 및 홍차 추출물(BT)의 전자 주기능을 측정한 결과이다.
도 19는 SKH-1 무모 마우스에 시료를 6주간 적용한 후에 총 주름 영역을 비교한 결과이다.
도 20은 SKH-1 무모 마우스에 시료를 6주간 적용한 후에 피부 주름 영역의 복제 이미지(replica image)를 비교한 결과이다. 패널 A: 정상군, 패널 B: 대조군, 패널 C: 0.01％ 레티노인산 처리군, 패널 D: 2％ 녹차 추출물 처리군, 패널 E: 2％ 백차 추출물 처리군, 패널 F: 2％ 홍차 추출물 처리군.
도 21은 SKH-1 무모 마우스에 시료를 6주간 적용한 후에 피부 조직의 조직학적 관찰을 행한 결과이다. (A): H&E 염색, X200, (B): Masson's trichrome 염색, X200, (C): Verhoeff's 염색, X200, (D): 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색, X200. N: 정상군, C: 대조군, RA 0.01％: 0.01 ％ 레티노인산 처리군, GT 2％: 2％ 녹차 추출물 처리군, WT 2％: 2％ 백차 추출물 처리군, BT 2％: 2％ 홍차 추출물 처리군.
도 22는 SKH-1 무모 마우스에 시료를 6주간 적용한 후에 MMP-3 mRNA의 발현을 비교 분석한 결과이다.
도 23은 SKH-1 무모 마우스에 시료를 6주간 적용한 후에 MMP-2, MMP-9 단백질의 활성을 비교 분석한 결과이다.
도 24는 실험기간동안 SKH-1 무모 마우스의 체중을 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법 및 재료

1. 시약 및 기구

히드로퀴논(Hydroquinone, HQ), EGCG(epigallo-catechin-gallate), L-DOPA(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine), DMSO(dimethyl sulfoxide), BHT(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol), DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl), 아르부틴(arbutin), 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase), 타닌산(tannic acid), L-티로신, 아스코르브산, folin-ciocalteu's phenol reagent, 및 디(에틸렌글리콜)시약은 Sigma Chemical Company (USA)으로부터 구입하였다. TRP1는 Santa Cruz (USA)으로부터 구입하였고, 루틴(rutin)은 ACROS (USA)으로부터 구입하였다. 프로필렌글리콜(Propylene glycol)은 OCI(Korea)으로부터 구입하였고, 케타민하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride)는 Yu-Han Company(Korea)으로부터 구입하였다. 과산화수소는 Junsei (Japan)으로부터 구입하였다. 헤마톡실린(Hematoxylin), BSA(bovine serum albumin), 레티노인산 및 프로필렌글리콜은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA)으로부터 구입하였다. UVB sunlamp (UVM-225D, Mineralight Lamp UVP, USA)를 UVB 조사에 사용하였으며, UV-radiometer (HD 9021, Delta OHM, Italy)는 UV 측정에 사용하였고, 멜라닌 인덱스 측정에는 Mexameter(MX18, CK electronic GmbH, Germany)를 사용하였다. 역상 현미경(CKX41, Olympus, Japan)를 사용하여 세포주를 관찰하였으며, 형태학적 관찰에는 형광 현미경(Axio imager, Carl Zeiss, Germany)을 사용하였으며, 이미지 분석에는 i-solution (IMT i-solution ver. 8.0, Canada)을 사용하였다. Corneometer(CM825, CK electronic GmbH, Germany) 및 Tewameter(TM300, CK electronic GmbH, Germany)는 홍반인덱스(erythma index) 측정, 함수율 측정 및 TEWL(transepidermal water loss) 측정에 사용하였다. Visioline (VL650, CK electronic GmbH, Germany)을 사용하여 주름을 측정하였고, 광학현미경(BX51, Olympus, Japan) 및 디지털 카메라 시스템(C14 plus, Olympus, Japan)을 사용하여 조직학적 관찰에 사용하였다. Auto hematology analyser (Sysmex, XE-2100, Co Ltd., Japan)를 사용하여 조직학적 검사에 사용하였다.

2. 추출물 재료

녹차(green tea, GT), 백차(white tea, WT), 및 홍차(black tea, BT)는 대구에 있는 한약재료시장에서 구입하였다. GT, WT 및 BT 각각 600g 을 6L의 증류수와 함께 가열 추출기(COSMOS-660, Kyungseo Machine Co., Korea)에서 2 시간 동안 끓이고, 농축시켰다. 이어서, 수용성 추출물을 동결건조사여 분말로 만들었다. 이 표본을 다양한 농도의 부형제[프로필렌글리콜 : 에탄올 : 물 (5: 3: 2)]에 녹여 실험에 사용하였다.

3. 항산화능 측정 실험

3-1. 총 폴리페놀 화합물

AT, KA, EGCG, GT, WT, 및 BT의 총 폴리페놀 화합물은 Folin-Denis assay (Folin and Denis, 1912)을 사용하여 측정하였다. DMSO에 용해된 테스트 시약 1 ㎖을 테스트 튜브안에 넣은 후, 1 ㎖의 folin-시약을 첨가하고, 이어서, 튜브를 3 분간 두었다. 1 ㎖의 10％ Na₂CO₃를 혼합물에 가하고 혼합물을 심하게 흔들었다. 튜브를 60분간 둔 후에, 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 탄닌산(tannic acid)를 사용하여 준비하였다.

3-2. 총 플라보노이드 함량

AT, KA, EGCG, GT, WT, 및 BT의 총 플라보노이드 함량은 Davis et al. (1980)의 변형된 방법을 사용하여 측정하였다. 1 ㎖의 테스트 시약을 테스트 튜브에 넣고, 10 ㎖의 디(에틸렌글리콜)시약과 1 ㎖의 1N NaOH를 첨가하였다. 혼합물을 심하게 흔들고 37℃ 온수에서 60 분간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 루틴(rutin)을 사용하여 준비하였다.

3-3. 전자 공여능 (electron donating ability)

DPPH 라디칼 소거효과는 Blois의 방법(1958)에 따라 측정하였다. AT, KA, HQ, EGCG, GT, WT, 및 BT를 DMSO에 용해시켜, 100, 200, 400, 800, 1,600, 및 3,200 ㎍/㎖의 농도가 되도록 하였다. 1 ㎖의 테스트 시약을 테스트 튜브에 넣고, 4 ㎖의 4 X 10^-4 M DPPH를 추가하였다. 혼합물을 심하게 흔든후, 60℃ 온수에서 10초간 둔 후, 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. BHT를 양성 대조군으로 사용하였다. 이어서, 각 용액의 자유라디칼 소거활성을 "％억제"의 표현으로 하기 방정식에 따라 측정하였다: ％ 억제 (％ inhibition) = [1-(A_sample/A_blank)] X 100, 여기에서 A_blank 는 대조군 시약(테스트 시약을 제외한 모든 시약이 포함한 시약)의 흡광도이고, A_sample은 테스트 화합물 시약의 흡광도이다.

4. 세포실험

4-1. 세포배양

본 발명에서 사용한 Melan-a 세포는 Dr. Dorothy Bennett (St. George's Hospital, UK)으로부터 구입하였다. 색소 비율이 높고 불사멸화된 melan-a 세포는 C57BL/6 마우스로부터 유래된 세포이다. 세포는 10％의 FBS(fetal bovine serum), 1％의 P/S (penicillin/streptomycin) 및 200 nM의 TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)가 첨가된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium)-1640 배지를 사용하여 37℃, 10％ CO₂ 인큐베이터에서 72 시간 동안 배양하였다.

4-2. MTT 분석

Melan-a 세포를 96-웰 플레이트(0.5 X 10⁴ 세포/웰)에 분주하고, 37℃, 10％ CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. RPMI-1640 배지를 사용하여 다양한 농도(3.125, 6.25, 12.5, 25, 및 50 ㎍/㎖)로 희석한 200 ㎕의 AT, KA, EGCG, GT, WT 및 BT을 웰에 분주하고, 세포는 37℃, 10％ CO₂ 인큐베이터에서 48 시간 동안 배양하였다. 이어서, 0.5 ㎍/㎖의 MTT를 포함하는 배지에 넣고 37℃, 10％ CO₂ 인큐베이터에서 3 시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 1,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포들을 가라앉히고, 배지를 제거하였다. 200㎕의 DMSO를 첨가하여 세포들을 플레이트 진탕기에서 15 분간 현탁시켰다. ELISA reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존능(％)는 하기식에 따라 산출하였다: ％ 세포 생존능 = (A_sample / A_blank) X 100, 이 식에서, A_blank는 대조군 시약(테스트 화합물을 제외한 모든 시약을 포함한 시약)의 흡광도이고, A_blank는 테스트 화합물의 흡광도이다.

4-3. Melan-a 세포의 형태학적 관찰

AT, KA, EGCG, GT, WT, 및 BT를 1.563, 3.125, 6.25, 및 12.5 ㎍/㎖의 농도로 melan-a에 처리하고, 세포를 37℃, 10％ CO₂ 인큐베이터에서 72 시간 동안 배양하였다. 이어서, 배지를 교환하고, 세포를 역상 현미경하에서 X 200의 배율로 관찰하였다.

4-4. 멜라닌 분석

Melan-a 세포들을 96-웰 플레이트(2 X 10⁴ 세포/웰)으로 분주하고, 37℃, 10％ CO₂ 인큐베이터에 24 시간 동안 배양하였다. 이어서, RPMI-1640 배지를 사용하여 다양한 농도 (1.563, 3.125, 6.25, 및 12.5 ㎍/㎖)로 희석한 200 ㎕의 AT, KA, EGCG, GT, WT 및 BT을 웰에 분주하고, 분주된 세포를 37℃, 10％ CO₂ 인큐베이터에서 72 시간 동안 배양하였다. 세정을 수회 반복하였다. 멜라닌을 1N NaOH으로 용해시키고, ELISA reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. ％ 멜라닌 함량 = (A_sample / A_blank) X 100, 이 식에서, A_blank는 대조군 시약(테스트 화합물을 제외한 모든 시약을 포함한 시약)의 흡광도이고, A_blank는 테스트 화합물의 흡광도이다.

4-5. 세포내 티로시나아제 활성 분석

Melan-a 세포를 60 Φ 세포 배양 디쉬 (4 X 10⁵ 세포/웰)에 분주하고, 세포를 37℃, 10％ CO₂ 인큐베이터내에서 24 시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS으로 세정한 후, 200 ㎕의 1％ triton X-100을 배양 디쉬에 첨가하여 세포를 현탁하고, e-튜브에 옮겨 얼음에 고정하였다. 60 분후에 2-3초간 흔들어준 후, 4℃, 14,000rpm으로 20분간 원심분리하여, 50 ㎕의 단백질을 얻었다. 이를 49 ㎕의 0.1 M 포스페이트 완충액(pH 6.8) 및 1 ㎕의 AT, EGCG, GT, WT, 및 BT (1.563, 3.125, 6.25, 및 12.5 ㎍/㎖)와 혼합하였다. 혼합물을 1 시간 동안 두고, 100 ㎕의 L-DOPA를 가하고, 혼합물을 37℃, 10％ CO₂ 인큐베이터에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 490 ㎚에서 ELISA reader를 사용하여 측정하였다. ％ 억제 = [1-(A_sample / A_blank)] X 100, 이식에서, A_blank는 대조군 시약(테스트 화합물을 제외한 모든 시약을 포함한 시약)의 흡광도이고, A_blank는 테스트 화합물의 흡광도이다.

4-6. 세포-추출된 티로시나아제 활성 분석

Melan-a 세포를 60 Φ 세포 배양 디쉬 (4 X 10⁵ 세포/웰)에 분주하고, 세포를 37℃, 10％ CO₂ 인큐베이터내에서 72 시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS으로 세정한 후, 200 ㎕의 1％ triton X-100을 배양 디쉬에 첨가하여 세포를 현탁하고, e-튜브에 옮겨 얼음에 고정하였다. 60 분후에 2-3초간 흔들어준 후, 4℃, 14,000rpm으로 20분간 원심분리하여, 50 ㎕의 단백질을 얻었다. 이를 49 ㎕의 0.1 M 포스페이트 완충액(pH 6.8) 및 1 ㎕의 AT, EGCG, GT, WT, 및 BT (1.563, 3.125, 6.25, 및 12.5 ㎍/㎖)와 혼합하였다. 혼합물을 1 시간 동안 둔후에, 100 ㎕의 L-DOPA를 가하고, 혼합물을 37℃, 10％ CO₂ 인큐베이터에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 490 ㎚에서 ELISA reader를 사용하여 측정하였다. ％ 억제 = [1-(A_sample / A_blank)] X 100, 이식에서, A_blank는 대조군 시약(테스트 화합물을 제외한 모든 시약을 포함한 시약)의 흡광도이고, A_blank는 테스트 화합물의 흡광도이다.

4-7. 웨스턴 블로팅 분석

6.25 및 12.5 ㎍/㎖의 CSWE으로 처리한 세포 용해물은, Melan-a 세포를 1％ Nonidet P-40, 0.01％ SDS, 및 프로테아제 억제자 칵테일(Roche, Mannheim, Germany)을 포함하는 0.1 M Tris??HCl(pH 7.2) 완충액내에서 초음파분쇄(sonication)하여 준비하였다. 세포용해물의 단백질 농도는 Pierce Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, USA)를 사용하여 BSA를 표준물질로 하여 측정하였다. 동일한 양의 단백질(10 mg)을 각각의 레인(lane)에 로딩하고 10％ 폴리아크릴아마이드젤상에서 전기영동하여 분리하였다. 니트로셀룰로오스막상에 트랜스블로팅한 후, 막을 PEP7 (1:10000 희석, 항-티로시나아제 항체), PEP1 (1:10000 희석, 항-TRP1 항체) 및 PEP8 (1:10000 희석, 항-TRP2 항체)와 인큐베이션하였다. 다음에, 막을 호오스래디쉬 퍼옥시다아제 컨쥬게이트된 항-래빗 IgG (1:1000 희석; Amersham, Bucks, UK)와 인큐베이션하였다. 면역 활성 밴드는 ECL 웨스턴 블로팅 검출기(Amersham, Bucks, UK)을 사용하여 화학발광에 의해 검출하였다. 밴드 강도는 ImageJ program (NIH, Bethesda, USA)을 사용하여 측정하였다. β-액틴은 면역블로팅에 대한 내부 대조군으로 사용하였다.

4-8. RT-PCR 분석

제조자의 지시서에 따라 총 RNA는 Trizol-Reagent (Invitrogen, Caylsbad, CA)을 사용하여 준비하였다. 5 ㎍의 총 RNA를 8㎕의 M-MLV RT 5X 완충액, 3㎕의 10mM dNTPs, 0.45㎕의 10,000 U RNase 억제자, 0.3㎕의 50,000 U M-MLV 역전사효소(Promega, Madison, USA), 및 1.5㎕의 50 pmol/㎕ 올리고 dT(Bioneer, Daejeon, Korea)의 40㎕ 부피에서 역전사 반응시켰다. 단일쇄 cDNA를 4 ㎕의 5X green Go Taq flexi 완충액, 0.4㎕의 10 mM dNTPs, 0.1㎕의 500 U Taq polymerase, 1.2㎕의 25mM MgCl₂(Promega, Madison, USA), 및 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 또는 β-액틴의 각 20 pmol/㎕의 센스 및 안티-센스 프라이머 0.4㎕을 포함하는 반응액을 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다.

PCR에서 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다:

티로시나아제: 전방향 프라이머 (5'-CAT TTT TGA TTT GAG TGT CT-3'), 역방향 프라이머 ( 5'-TGT GGT AGT CGT CTT TGT CC-3');

TRP-1: 전방향 프라이머 (5'-GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC-3'), 역방향 프라이머 (5'-AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT-3');

TRR-2 : 전방향 프라이머 (5'-GGA TGA CCG TGA GCA ATG GCC-3'), 역방향 프라이머 (5'-CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC-3');

β-액틴: 전방향 프라이머 (5'-ACC GTG AAA AGA TGA CCC AG-3'), 역방향 프라이머 (5'-TAC GGA TGT CAA CGT CAC AC-3').

티로시나아제, TRP-1, TRP-2, 및 β-액틴에 대한 PCR 산물의 예상 사이즈는 1192, 268, 1044, 및 528 bp이다. 각 PCR 조건은 다음과 같았다: 티로시나아제 및 TRP-1은 94℃에서 60초간 변성, 56℃에서 60초간 어닐링 및 72℃에서 60초간 연장의 28 싸이클; β-액틴은 94℃에서 30초간 변성, 51℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 60초간 연장의 30 싸이클; PCR 산물은 1.2％ 아가로즈젤상에서 분석하였다. β-액틴은 티로시나아제, TRP-1 및 TRP-2의 상대 발현수준과 비교 평가하기 위해 내부 대조군으로 사용하였다.

5. 동물실험 (미백 효과)

5-1. 실험동물

450-550 g의 3마리의 브라운 기니아-피그는 Oriental Yeast Co. Ltd( Japan (OYC))으로부터 구입하였다. 7일간 실험환경에 적응하도록 하였다. 이들 동물들은 온도 22ㅁ1℃, 상대습도 50ㅁ5％의 환경에서 12시간의 명/암 변경 사이클 하에서 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 개별 케이지에 수용하였다. 테스트 시약을 4-주간 적용한 후, 케타민 하이드로클로라이드로 마취시키고, 멜라닌 색소화 부위를 생검 펀치(Φ 12 mm)에 의해 채취하였다. 채취한 표본을 중성-완충된 10％ 포르말린내에 고정화시키고 조직학적 관찰을 위해 파라핀내에 봉밀하였다.

실험군은 다음과 같았다.

정상(Normal, N): 식염수 적용군

대조군(Control, C): UVB 조사 + 식염수 적용군

부형제 대조군(Vehicle control, VC): UVB 조사 + 부형제 적용군

양성 대조군(HQ): UVB 조사 + 2％ HQ 적용군

실험군 1(EGCG): UVB 조사 + 2％ EGCG 적용군

실험군 2 (GT): UVB 조사 + 2％ GT 적용군

실험군 3 (WT): UVB 조사 + 2％ WT 적용군

실험군 4 (BT): UVB 조사 + 2％ BT 적용군

5-2. UVB 조사

UVB-유도 과다색소침착은 Choi et al (2004)의 방법을 사용하여 갈색 기니아 피그(guinea pig)의 등피부상에 유도하였다. 기니아 피그를 케타민 하이드로클로라이드(100 ㎎/㎏ BW)으로 마취시키고, 가죽으로 커버링된 동물 등 피부상의 24개의 분리된 영역(Φ 12 mm)을 UVB 조사(302 ㎚ sunlamp)에 노출시켰다. 상기 노출 영역은 일주일에 1회 500 mJ/cm² 으로 3주 연속 조사하여 총 조사선량이 1,500 mJ/cm²이 되도록 UVB 조사하였다.

5-3. 테스트 화합물의 적용

최후 UVB 조사후, 10일째에 2％ HQ, EGCG, GT, WT, 및 BT을 과다색소침착된 영역(그룹당 9개 영역)에, 1일 2회, 1주일에 5일간 4주 동안 각 마이크로-피펫으로 30 ㎕ (2％: 1.06 mg/cm²/day)의 양으로 국소적으로 적용하였다. 식염수는 대조군으로서 적용하였고, 부형제 대조군(vehicle control)으로서 프로필렌 글리콜: 에탄올: 물(5:3:2)를 적용하였다.

5-4. 탈색소화의 전반적인 관찰

멜라닌 색소화 영역은 전체적인 관찰(gross observation)에 의해 일주일에 1회 관찰하였고, 각 실험군을 테스트한 시약은 각각의 미백 효과를 조사하기 위해 대조군과 비교하였다. 상기 비교는 실험 4주간 동안 매주일 반복하였고, 매주일 피부 표면의 사진을 찍었다.

5-5. 멜라닌 인덱스의 측정

멕사미터(mexameter)를 사용하여, 테스트 시약의 국소 적용전 및 후에 멜라닌 색소화 변화를 비침습적 방법으로 1주일에 1회씩 3회 측정하였다. 색소화 정도는 측정된 값들의 평균에 의해 분석하였다.

5-6. 피부 조직의 형태학적 관찰

광학 현미경으로 피부조직의 형태학적 변화를 관찰하기 위해, 추출한 피부 조직을 10％ 중성 포르말린 용액내에서 12 시간 동안 고정하고, 흐르는 물에 세척하였다. 70, 80, 95, 및 100％ 에탄올내에서 탈수시킨 후에, 크실렌(xylene)으로 씻은 후에, 파라핀 침투를 통해 봉밀하고, 마이크로톰(microtome)으로 4 ㎛ 두께의 표본을 준비하였다.

5-6-1. 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색

표본을 크실렌(xylene)으로 파라핀을 제거하였다. 표본을 흐르는 물로 세정하였다. 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin) 용액으로 이동시킨 후, 핵을 5 분간 염색하고, 표본을 흐르는 물에 세정하고, 1％ HCl 알코올 용액내에서 3회 침전시키고 1％ 암모니아 용액으로 파란색으로 염색하였다. 세포질은 에오신(eosin) 용액에서 3 분간 염색하고, 탈수를 위해 80, 95, 95, 100, 및 100％ 알코올에 옮겼다. 세정과정 후에, 표본을 현미경 관찰을 위해 캐나다 발삼(Canada balsam) 안에 넣었다.

5-6-2. Fontana-Masson's 은 염색(silver staining)

표본을 크실렌으로 파라핀을 제거하였다. Masson (1928)의 방법에 의해, 표본을 실버나이트레이트(silver nitrate) 용액내에 56℃에서 60분간 염색하고, 세정하고, 0.2％ 금클로라이드 용액내에서 색조를 조화시킨 후, 재차 세정하고 5％ 소디엄 티오설페이트 용액내에서 5 분간 두었다. 이어서, 표본을 다시 한번 세정하고, 핵 패스트 레드 용액(nuclear fast red solution)내에서 대조 염색을 행한 후, 95％, 95％, 100％ 및 100％ 알코올내에서 탈수한 후 크실렌으로 세정한 후, 표본을 캐나다 발삼(Canada balsam)용액에 두어 현미경 관찰하였다. 멜라닌 색소화 영역의 백분율(percentage)는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

5-6-3. 면역조직화학 염색

멜라노사이트 및 멜라노좀의 생성 정도를 관찰하기 위해, 추출된 피부 조직을 10％ 중성 포르말린 용액내에서 12 시간 동안 고정시킨 후, 흐르는 수돗물로 세정하였다. 탈수후에, 크실렌으로 세정하고, 파라핀으로 침투시켜 봉밀하고, 표본을 4 ㎛ 두께로 준비하였다. 표본을 코팅 슬라이드에 부착시키고 파라핀을 제거하였다. 이어서, BenchMark XT automated immunostainer (Ventana Medical Systems, USA)를 사용하여 염색하였다. 자동화된 공정을 위해, 반응 완충액을 사용하여 표본을 세정하고, 퍼옥시다아제(peroxidase)의 활성을 억제하기 위해 3％ H₂O₂ 용액내에서 3 분간 두었다. S-100 및 HMB-45에 대한 1차 항체를 1:100의 비율로 희석시켜 반응시켰다. 이어서, 표본을 반응 완충액을 사용하여 세정하고, 비오틴(biotin)과 20 분간 반응시킨 후, 스트렙타비딘(streptavidin)과 25분간 반응시켰다. DAB(diamino-benzidine) (Ventana Detection kit, USA) 컬러링 이후에, 표본을 광학 현미경 관찰을 위해 염색하였다. 멜라노사이트 및 멜라노좀의 생성 정도를 비교하기 위해, S-100 및 gp 100 단백질의 ％ 영역을 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 산출하였다.

6. 동물실험 (주름 개선 효과)

6-1. 실험동물

7주령 SKH-1 무모 마우스를 Charles River (Japan)으로부터 구입하였다. 동물들은 사용전 1주일간 실험환경에 적응하도록 하였다. 이들 동물들은 온도 22ㅁ1℃, 상대습도 50ㅁ5％의 환경에서 12시간의 명/암 변경 사이클 하에서 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 개별 케이지에 수용하였다. 마우스는 각각 7마리로 구성된 7개의 군으로 나누었다:

정상군(Normal, N): 무적용군(no application);

대조군(Control, C): 식염수 적용군;

양성 대조군(RA): 0.01％ 레티노인산(retinoic acid) 적용군;

실험군 1(GT): 2％ 녹차 적용군;

실험군 2(WT): 2％ 백차 적용군;

실험군 3(BT): 2％ 홍차 적용군;

혈액 샘플은 4주째에 4 시간 절식시킨 후 에테르 마취하에 하대정맥(inferior vena cava)으로부터 수집하였다. 피부를 추출하였고, 피부의 일부분을 조직학적 분석을 위해 완충된 10％ 중성 포르말린 용액으로 고정하고, 피부의 잔여부분은 MMPs 분석을 위해 냉동기(-80℃)에 보관하였다. 흉성 및 비장 추출물은 식염수로 세정하고 잔여 수분을 여과 종이로 제거한 후에 전자 저울상에서 측정하였다.

6-2. UVB 조사

마우스를 UVB(302 nm sunlamp)을 사용하여 등 부분에 1주일에 3회 4주 동안 조사하였다. 조사선량은 최초 1주일에서는 1 MED (minimal erythemal dose: 60 mJ/cm²), 2주째에는 2 MED (120 mJ/cm²), 3주째에는 3 MED (180 mJ/cm²)이었고, 4주째 - 12주째에는 4 MED (240 mJ/cm2)로 조사하였다. 4 MED 조사는 샘플 적용 기간동안에 1주일에 1회 적용하였다.

6-3. 테스트 시료의 적용

주름을 유도한 후, 식염수 및 시료를 각 시간에 200 ㎕를 4 주일 동안 1주일에 5회 (2％: 0.26 g/kg BW/day)으로 적용하였다. RA는 폴리에틸렌글리콜과 함께 0.01％의 농도로 매회 200 ㎕씩 1일 2회, 1주일에 5회로 4 주일간 적용하였다.

6-4. 피부 홍반 인덱스, 함수량 및 경피 수분 소실(transepidermal water loss)의 측정

피부 홍반 인덱스, 수분 보유량 및 경피 수분 소실(transepidermal water loss, TEWL)은 Mexameter, Corneometer, 및 Tewameter을 사용한 비-침습적 방식으로 실험기간 동안 일주일에 1회 측정하였다.

6-5. 물 및 음식 섭취, 음식물 효율 비율 및 체중 변화의 측정

실험동물의 물 및 음식 섭취는 1주일에 1회 측정하였고, 체중은 실험이 시작되기 직전 및 오전 09:00 - 10:00에서 실험기간동안 1주일에 1회 측정하였다.

7. 피부조직의 형태학적 관찰 (주름 개선 효과)

7-1. 주름 측정

피부 복제물을 SILFLO 금형 물질(FLEXICO, England)을 사용하여 무모 마우스의 등쪽 피부로부터 제조하였다. Visioline을 사용하여 피부 표면을 평가하였다. 총 주름 면적(mm²)을 산출하였다.

7-2. 조직학적 분석

7-2-1. 헤마톡실린 및 에오신 염색

10％ 중성 완충 포르말린 용액으로 상온에서 24 시간 동안 고정한 후, 잘라낸 피부 조직을 세정, 탈수, 클리닝(cleaning) 및 침투의 공정으로 처리하고, 파라핀(paraffin)에 봉밀한 후 4 ㎛ 두께의 섹션으로 잘랐다. 섹션을 H&E 염색한 후, 피부 조직에서 변화의 패턴을 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다.

7-2-2. Masson's trichrome 염색

10％ 중성 완충 포르말린 용액으로 상온에서 24 시간 동안 고정한 후, 잘라낸 피부 조직을 세정, 탈수, 클리닝 및 침투의 공정으로 처리하고, 파라핀(paraffin)에 봉밀한 후 4 ㎛ 두께의 섹션으로 잘랐다. 섹션을 상온에서 bouin 용액내에서 하룻밤 침지시킨 후, Masson's trichome으로 염색하고, 피부의 콜라겐 섬유의 양과 형태를 광학 현미경하에서 관찰하였다.

7-2-3. Verhoeff's 염색

10％ 중성 완충 포르말린 용액으로 상온에서 24 시간 동안 고정한 후, 잘라낸 피부 조직을 세정, 탈수, 클리닝 및 침투의 공정으로 처리하고, 파라핀(paraffin)에 봉밀한 후 4 ㎛ 두께의 섹션으로 잘랐다. 섹션을 Verhoeff's 용액으로 염색 및 세척과 2％ 염화제2철(ferric chloride)로의 확인 및 세척한 후에, 섹션을 소디엄 트리설페이트(sodium trisulfate)으로 처리하였다. 피부내의 탄성 섬유의 손실 및 퇴화성 변화는 광학 현미경하에서 관찰하였다.

7-2-4. 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색

10％ 중성 완충 포르말린 용액으로 상온에서 24 시간 동안 고정한 후, 잘라낸 피부 조직을 세정, 탈수, 클리닝 및 침투의 공정으로 처리하고, 파라핀(paraffin)에 봉밀한 후 4 ㎛ 두께의 섹션으로 잘랐다. 섹션을 톨루이딘 블루(toluidine blue) 용액으로 염색하고 세척한 후, 피부 및 하피(hypodermis)내의 비만세포(mast cell)의 분포 패턴 및 탈과립화 정도를 광학 현미경으로 관찰하였다.

8. 피부조직내에서의 유전자 발현 측정

8-1. 역전사 중합효소연쇄반응

마우스의 등쪽 피부 샘플을 저온에서 유지시키고 동결된 등쪽 피부 샘플 50 mg 당 1 ㎖의 Trizol과 함께 균질화하였다. 균질화시킨 샘플을 상온에서 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하여 5 분간 인큐베이션시키고, 15,000 rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리하였다. 새로운 튜브에 상등액을 회수하여 옮기고, 500 ㎕의 이소프로필알코올을 첨가하고, 샘플을 4℃, 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 얻어진 RNA 펠렛을 1㎖의 70％ 에탄올로 세정하고, 4℃, 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하여 최종적으로 얻은 RNA 펠렛을 DEPC(diethylpyrocarbonate)으로 희석시키고, 백색광/UV 트랜스일루미네이터를 사용하여 1.8 < 광학밀도(OD)(A260/A280) < 2.0으로 정량하였다. cDNA는 Cycle Script RT PreMix (dT20) 키트를 사용하여 총 RNA로부터 0.1 - 1 ㎍/㎕의 농도에서 합성하였다. cDNA 합성은 DEPC의 205 ㎕내에서 30℃에서 1분간 및 50℃에서 4분간의 12 싸이클을 행하고, 샘플을 95℃에서 5 분간 가열시켰다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 AccupowerTM PCR PreMix 키트를 사용하여, 2 ㎕의 주형, 10 pmol/㎕의 프라이머를 포함하는 15.2 ㎕의 멸균수내에서 증폭반응을 실시하여 행하였다. 반응은 35 싸이클로 수행하였다. 각 단편을 증폭하는 증폭반응에 사용된 프라이머는 표 1에 나타내었다. 증폭산물은 1.5％ 아가로오스 젤 전기영동에 의해 분리하였고, 에티디움 브로마이드를 사용하여 시각화하였다. DNA 밴드 밀도는 KODAK GEL LOGIC 100 이미지 분석 시스템을 사용하여 산출하였다.

9. MPP-2, MPP-9에 대한 자이모그래피(zymography)

피부조직 50 mg을 중량측정한 후에, 1X PiPA 용해 완충액 400㎖를 가하여 용액을 균질화시켰다. 이어서, 14,000 rpm에서 15 분간 원심분리하고 상등액을 실험에 사용하였다. 단백질의 정량은 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, USA)를 사용하여 행하였다. Invitrogenㄾ에 의해 제공되는 프로토콜에 따라, 조직 샘플의 총량을, 트리스-글리신 SDS 샘플 완충액 5㎕ 및 단백질 부분 0.5㎍/㎕를 포함하여 10 ㎕가 되도록 준비하였다. 전기영동을 위해 10％ 지모그램 젤(zymogram gel (Novex, USA))안으로 샘플을 로딩한 후에, 나머자 부분은 증류수로 채웠고, 1X 재형성 완충액(renaturing buffer)내의 젤내에서 배양하였다. 이어서, 30분간 1X 전개 완충액내에서 인큐베이션하고, 완충액 용액을 버린 후, 37℃에서 21 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후에, 젤을 Simply Blue TM Safe-Stain으로 염색하였다.

10. 혈액학적 분석(Hematological analysis)

수집한 혈액 샘플을 항응고제인 K₂EDTA를 함유하는 혈액 수집 튜브안으로 넣고, 5분이상 혼합하였다. 이어서, 혈액학적 분석기를 사용하여 적혈구(erythrocyte), 백혈구(leucocyte), 호중성백혈구(neutrophil), 호산구(eosinophil), 호염기성백혈구(basophil), 림프구(lymphocyte), 단핵구(monocyte), 혈소판(platelet), 헤모글로빈 농도(hemoglobin concentration) 및 헤마토크리트(hematocrit)를 측정하였다.

11. 통게학적 분석

각 군사이의 수치상의 차이는 일원 변량분석(ANOVA)를 사용하여 통계학적으로 평가하고, SPSS(v 17.0)을 사용하여 사후검정을 위한 Duncan's multiple range test를 행하였다. 통계학적 유의도는 p<0.05, p<0.01, 및 p<0.001으로 정하였다.

실험결과 1: 미백효능

1. 항산화능

1-1. 총 폴리페놀 함량

탄닌산을 표준물질로 사용한 표준곡선에 따라 측정한, EGCG, AT, KA, HQ, GT, WT, 및 BT의 총 폴리페놀 함량은 각각 462, 20, 31, 102, 104, 107, 및 105 mg/g 이었다(도 1 참조).

1-2. 총 플라보노이드 함량

루틴(rutin)을 표준물질로 사용한 표준곡선에 따라 측정한, EGCG, AT, KA, HQ, GT, WT, 및 BT의 총 플라보노이드 함량은 각각 184, 8, 9, 65, 75, 67, 및 75 mg/g 이었다(도 2 참조).

1-3. 전자공여능(electron donating ability)

AT, KA, HQ, BT, WT, GT, 및 EGCG의 전자공여능은 800 ㎍/㎖의 농도에서 각각 44, 19, 93, 84, 84, 86, 및 94％이었다. BHT의 능력은 동일한 농도에서 89％으로 나타났다. KA 및 AT와 비교하여, EGCG, GT, WT, 및 BT의 전자공여능은 훨씬 높았고, HQ의 값과 유사한 수준이었다(도 3 참조).

2. 세포실험결과

2-1. 세포 생존능 측정 결과

AT, KA 및 BT는 3.125 및 50 ㎍/㎖의 농도에서 Melan-a 세포에 대해 세포생존능의 영향을 미치지 않았고, 최대 허용가능한 수준(maximum permissible level, MPL)이 50 ㎍/㎖ 초과임을 알 수 있었다. 반면엣, GT 및 WT는 각각 38％ 및 24％의 세포 생존능 감소효과를 나타내어, MPL이 25 ㎍/㎖임을 알 수 있었다. EGCG의 MPL은 12.5 ㎍/㎖임을 나타내었다(도 4 참조).

2-2. Melan-a 세포에 대한 형태학적 관찰 결과

대조군 세포의 경우 멜라닌 합성에 의해 유도되는 다수의 멜라노사이트 수지상(melanocyte dendrite)와 흑색 침전이 관찰되었으나, GT, WT, 및 BT으로 처리한 군에서는 멜라닌 합성이 저해되어 수지상 형태가 용량-의존적 방식으로 감소되었다(도 5 참조). 억제적 영향의 순서는 BT>WT>GT 이었다.

2-3. 멜라닌합성능

대조군과 비교하여, AT, KA, EGCG, GT, WT, 및 BT의 12.5㎍/㎖ 농도 처리군의 멜라닌 함량은 각각 18％(p<0.00l), 7％(p<0.05), 29％(p<0.00l), 20％(p<0.00l), 31％(p<0.00l), 및 52％(p<0.00l) 감소하였다(도 6 참조).

2-4. 티로시나아제 활성

대조군과 비교하여, AT, EGCG, GT, WT, 및 BT의 12.5 ㎍/㎖ 농도 처리군의 세포내(intra-cellular) 티로시나아제 활성은 각각 12, 61, 45, 58, 및 52％(p<0.00l) 감소하였다(도 7 참조). 대조군과 비교하여, AT, EGCG, GT, WT, 및 BT의 12.5 ㎍/㎖ 농도 처리군의 세포추출물(cell-extraction)내 티로시나아제 활성은, 각각 13, 18, 16, 15 및 25％(p<0.00l) 감소하였다(도 8 참조).

2-5. 웨스턴 블로팅 분석

홍차, 녹차 및 백차 처리된 실험군의 티로시나아제 단백질 발현은 용량 의존적 방식으로 감소하였다(도 9 참조). 대조군과 비교하여, 12.5 ㎍/㎖의 농도로 홍차, 녹차 및 백차를 처리한 군에서, 티로시나아제 단백질의 발현은 각각 72, 18, 25％ 감소하였다(P<0.001). 그러나, 아르부틴(arbutin) 처리된 군은 발현을 크게 감소시키지 않았다.

2-5. RT-PCR 분석

대조군과 비교하여, 테스트한 모든 시료들은 티로시나아제, TRP-1, 및 TRP-2의 mRNA 발현에 눈에 띄는 영향을 나타내지는 않았다(도 10 참조).

3. 동물실험(Animal experimentation) 결과

3-1. 탈색소 효과에 대한 전반적인 관찰 결과

UVB를 조사하여, 모든 실험군 및 대조군에서, 기니아 피그의 피부의 멜라닌 색소화를 1주 부터 3주 까지 연속적으로 진행시켰다. 실험기간동안, 테스트 시료를 적용하는 것에 의한 어떠한 부정적인 부작용도 관찰되지 않았다. PC 및 E 군내에서 국부적용 2주 째에 과다색소침착부분이 탈색소화되기 시작하였고, 4주 째에 영역이 시각적으로 탈색소화되었다(도 11 참조).

3-2. 멜라닌 인덱스(melanin index) 변화

최초 1주에서, VC를 제외한 모든 군에서 멜라닌 인덱스가 현저하게 감소하였다(p<0.05). 2주째에서, PC 및 모든 E 군에서 C 군과 비교하여 멜라닌 인덱스가 크게 감소하였다(p<0.001). 4주째에서 HQ, EGCG, GT, WT, 및 BT군의 멜라닌 인덱스는 C 군과 비교하여 각각 17, 17, 16, 18, 및 15％ 감소하였다(p<0.001) (하기 표 2 참조, 도 12 참조). VC 군은 3％ 감소하였다(p<0.05).

3-3. 피부조직내에서 조직학적 변화

3-3-1. 헤마톡실린 및 에오신 염색

대조군의 상피는 다른 실험군들과 비교하여 약간 두꺼운 것으로 관찰되었다. 그러나, 테스트 시료 적용에 의한, 피부 조직내에서 염증이나 다른 바람직하지 않은 효과는 관찰되지 않았다(도 13 참조).

3-3-2. Fontana-Masson's 은 염색(silver staining)

실험 4주째에, 과립성 멜라닌의 분포도는 N 군의 것과 비교하여 C 및 VC 군 의 것은 매우 크게 증가되어 있었다. 과립성 멜라닌은 기저층으로부터 각질층까지 분포되어있었다. 한편, PC 및 E 군은 상피에서의 과립성 멜라닌이 C 및 VC 군과 비교하여 크게 감소된 것으로 나타났다(도 14 참조). 상피내에서의 색소침착된 영역을 보다 객관적으로 분석하기 위해 이미지-분석 소프트웨어를 사용하였다.

C 군(20％) 및 VC 군(18％)은 N 군과 비교하여 멜라닌 색소화가 크게 증가되었다(p<0.001). 그러나, PC, EGCG, GT, WT, 및 BT 군에서의 멜라닌 색소화 영역은 대조군과 비교하여 각각 53, 48, 51, 66, 및 42％ 크게 감소되었다. VC 군은 12％으로 크게 감소하였다(p<0.05)(하기 표 3 참조).

3-3-3. 면역조직화학 염색

실험 4주째에, C 및 VC 군의 S-100 단백질 및 gp100 단백질의 발현은 N 군과 비교하여 증가되어 있고 밀집화되어 있었다. 그러나, PC 군 및 E 군에서의 것은 C 및 VC 군과 비교하여 명확히 감소되어 있었다(도 15-16 참조). 상피내에서의 S-100 및 gp100 단백질의 발현된 영역을 보다 객관적으로 분석하기 위해, 이미지-분석 소프트웨어를 사용하였다. C 군(14％) 및 VC 군(12％)은 N 군과 비교하여 S-100 단백질의 발현된 영역이 크게 증가된 것을 보여주었고(p<0.001), VC 군의 것은 C 군과 비교하여 16％ 감소된 것으로 나타났다(p<0.001). HQ, EGCG, GT, WT, 및 BT 군에서의 값들은 대조군들의 것과 비교하여 69, 62, 69, 73, 및 58％ 감소한 것으로 나타났다(p<0.001)(하기 표 4 참조).

C군 및 VC군은 gp 100 단백질의 발현된 영역이 N 군의 것(3％)과 비교하여 각각 14％ 및 11％ 크게 증가하였고(p<0.001), VC 군의 것은 C 군과 비교하여 18％ 크게 감소한 것으로 나타났다(p<0.001). HQ, EGCG, GT, WT, 및 BT 군들의 값은 C 군의 값과 비교하여 각각 68, 61, 70, 71, 및 59％ 감소한 것으로 나타났다(표 5 참조).

실험결과 2: 주름 개선

1. 항산화능

1-1. 총 폴리페놀 함량

GT, WT 및 BT의 총 폴리페놀 함량은 각각 103.5, 106.7, 및 104.7 mg/g이었다(도 17 참조).

1-2. 총 플라보노이드 함량

GT, WT, 및 BT의 총 플라보노이드 함량은 각각 74.7, 66.9, 및 74.8 mg/g 이었다(도 17 참조).

1-3. 전자공여능(Electron donating ability)

GT, WT, 및 BT의 전자공여능은 1,000 ㎍/㎖의 농도에서 96, 91, 및 90％인 것으로 나타났다. BHT의 전자공여능은 동일한 농도에서 55％를 나타내었다. BHT와 비교하여 GT, WT 및 BT의 전자공여능은 더 높았다(도 18 참조).

2. 홍반 인덱스 변화

피부 홍반 인덱스의 변화를 측정한 결과를 표 6에 나타내었다. 모든 실험군의 피부 홍반 인덱스는 실험 전체 기간 동안에 대조군과 비교하여 크게 낮았다(p<0.001). 실험개시 후 4주째에서, RA, GT, WT 및 BT 군에서 피부 홍반 인덱스는 대조군과 비교하여 각각 32, 41, 46, 및 42％ 낮았다 (p<0.001).

3. 수분 함유량의 변화

피부 수분 함유량의 변화의 측정 결과는 표 7에 나타내었다. 모든 실험군의 수분 함유량은 실험 전체 기간 동안에 대조군과 비교하여 크게 높았다(p<0.001). 실험개시 후 4주째에서, RA, GT, WT 및 BT 군에서 피부 함유량은 대조군과 비교하여 각각 207, 196, 231 및 241％ 높았다(p<0.001).

4. TEWL의 변화

피부 TEWL에서의 변화 측정은 하기 표 8에 나타내었다. 실험후 2주째에서 RA군을 제외한 모든 실험군의 피부 TEWL은 대조군과 비교하여 크게 낮아졌다 (p<0.001). 실험후 4주째에서, RA, GT, WT, 및 BT군의 피부 TEWL은 대조군과 비교하여 각각 58, 82, 87, 및 86％ 크게 낮아졌다(p<0.001).

5. 피부 조직내에서 형태학적 변화

5-1. 주름의 관찰

피부 주름의 관찰결과는 도 19에 나타내었다. 대조군과 비교하여 RA, GT, WT 및 BT 적용군은 얕은 주름 및 가늘고 좁은 마루(crest) 패턴으로 주름 형성이 개선되었다(도 20 참조). 결과적으로, 대조군은 정상군과 비교하여 주름 영역이 110％ 확장되었고, RA, GT, WT 및 BT 군은 대조군과 비교하여 주름의 영역이 각각 49, 37, 46, 및 45％ 감소되었다(p<0.001).

6. 조직학적 관찰

6-1. 헤마톡실린 및 에오신 염색

피부 조직과 염증세포의 관찰결과는 도 21에 나타내었다. 대조군의 상피 및 피부는 현저하게 두꺼워졌으며, 상당한 수의 림프구, 호중성백혈구(neutrophil) 및 대식세포(macrophage)를 포함하는 염증성 세포가 피부내로 침투되었다. 반면에, RA 및 GT, WT 및 BT 군의 피부내에서는 소수의 염증성 세포만이 발견되었다. 또한, 대조군에서는 두꺼워진 상피층이 발견되었다.

6-2. Masson's trichome 염색

피부내의 콜라겐 섬유의 양과 형태를 관찰한 결과는 도 21에 나타내었다. 정상군에서의 콜라겐 섬유는 규칙적으로 배열되어 있고, 이들의 밀도는 높았다. 대조군의 피부내에서 콜라겐 섬유은 심하게 끊어져 있었으며, 밀도가 낮은 형태였다. RA 및 GT, WT 및 BT 군의 피부내에서의 콜라겐 섬유는 거의 완전한 형태로 규치적인 배열을 이루고 있었다.

6-3. Verhoeff's 염색

피부내의 탄성 섬유(elastic fiber)의 양과 형태를 관찰한 결과는 도 21에 나타내었다. 정상군에서의 탄성 섬유는 규칙적으로 배열되어 있었다. 이와 대조적으로, 대조군의 피부내에서는 변성되고 엉킨 탄성섬유에 의해 발생되는 탄력섬유증(elastosis)이 관찰되었다. RA 및 GT, WT 및 BT 군에서는 대조군과 비교하여 탄성섬유의 변성은 적게 나타났다.

6-4. 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색

피부 및 진피내에서 비만세포(mast cell)의 분포 패턴을 관찰한 결과와 탈과립화 정도를 관찰한 결과는 도 21에 나타내었다. 대조군에서는 다수의 비만세포가 발견되었으며, 탈과립화도가 심하게 나타났다. 반면에, RA 및 GT, WT 및 BT 군에서는 비교적 적은 수의 비만세포가 발견되었고, 탈과립화 정도는 매우 약하게 나타났다.

7. 피부조직내에서 유전자 발현

7-1. MMP-3

피부조직내에서 MMP-3 mRNA 발현은 RT-PCR을 사용하여 분석하였다(도 22 참조). RA, GT, WT, 및 BT 군에서의 MMP-3 mRNA 발현수준은 대조군과 비교하여 77, 49, 60 및 80％으로 낮았다(p<0.001).

7-2. MMP-2 및 MMP-9의 단백질 활성도

피부조직내에서 MMP-2 및 MMP-9 단백질 활성도는 지모그래피(zymography)를 사용하여 분석하였다(도 23 참조). RA, GT, WT, 및 BT군은 대조군과 비교하여 현저하게 낮은 활성을 보였다.

8. 물 및 음식의 섭취, 음식효율성비율 및 체중변화

체중, 음식섭취, 물섭취 및 음식효율비율의 측정결과는 표 9 및 도 24에 표시하였다. RA군의 물섭취는 대조군에 비해 크게 높았다(p<0.05). 모든 실험군에서 음식섭취, 체중증가 및 음식효율성비율은 대조군과 비교하여 크게 다르지 않았다.

9. 기관(organ) 중량 변화

비장 및 흉선에 대한 체중 측정결과는 표 10에 나타내었다. 정상군과 비교하였을때, 비장에 대한 절대중량 및 비교중량은 크게 다르지 않았다. 대조군, RA 및 GT 군의 상대중량은 정상군과 비교하였을때, 크게 낮았다(p<0.05).

10. 혈액학적 변화

혈액학적 분석 결과는 표 11에 나타내었다. GT, WT, 및 BT군은 백혈구, 호중성백혈구 및 림프구의 수가 대조군과 비교하여 낮은 수치를 보였다(p<0.05). 대조군에서의 적혈구, 헤모글로빈 농도, 헤마토크리트, 혈소판은 다른 모든 군과의 비교에서 크게 낮은 값을 나타내었다(p<0.05).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (7)

1. 홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 또는 주름 개선용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 홍차추출물은 조성물 총 중량에 대해 0.0001 - 10 중량％으로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 화장품학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 화장품학적 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 홍차 추출물을 유효성분으로 포함하는 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines)의 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 홍차 추출물은 조성물 총 중량에 대해 0.0001 - 10 중량％으로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 5 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 파우더, 젤, 연고, 크림, 로션, 액제 및 에어로졸으로 이루어지는 군에서 선택되는 피부 외용 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
   

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