KR20120085601A

KR20120085601A - 백절유신탕 및 그 활성성분을 이용한 퇴행성관절염의 치료 방법

Info

Publication number: KR20120085601A
Application number: KR1020110007034A
Authority: KR
Inventors: 정현석; 전창선; 김형민
Original assignee: 정현석
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2011-01-24
Publication date: 2012-08-01

Abstract

본 발명은 백절유신탕 및 그 활성성분을 이용한 MMP-3의 활성 억제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인터루킨-1β에 의해 염증이 촉진된 연골세포에 백절유신탕 또는 그 활성성분인 베르베린을 가함으로써 백절유신탕 및 베르베린이 MMP-3의 활성을 억제함을 확인하고 퇴행성관절염의 새로운 발병 메커니즘 규명에 기여할 수 있으며 MMP-3을 모니터링 함에 따라 퇴행성관절염의 예측 및 진단이 가능한 MMP-3의 활성 억제 방법에 관한 것이다.

Description

백절유신탕 및 그 활성성분을 이용한 퇴행성관절염의 치료 방법 {TREATING METHOD FOR DEGENERATIVE ARTHRITIS USING BAEKJEOLYUSINTANG AND ITS ACTIVE COMPONENT}

본 발명은 전통 한방 약재인 백절유신탕 및 그 유효성분의 퇴행성 관절염에 대한 치료 효과와 관련된 것이다.

퇴행성 관절염(degenerative arthritis)은 관절 연골이 닳아 없어지면서 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환으로서, 진행성이며 비염증성 질환으로 골관절염(osteoarthritis)또는 골 관절증이라고도 한다. 퇴행성 관절염은 노령화와 밀접한 연관을 갖는 대표적인 퇴행성 질환으로 전 인구의 10~15%정도가 앓고 있으며, 특히 65세 이상의 고령인구 중 60~80% 정도가 퇴행성 관절염을 앓고 있다. 퇴행성 관절염의 원인은 노화 현상이나 과다한 체중과 관계가 깊으며, 나이가 많아질수록 여성에게서 더 많이 그리고 더 심하게 나타난다. 초기 증상은 한 개 또는 두 개의 관절이 강직과 함께 나타나는 쑤시는 듯한 통증이며 장기화되면 연골 하골의 경화, 관절 주변에 골이 과잉형성 또는 관절의 변형 등을 초래하게 된다.

퇴행성 관절염은 일차성 또는 이차성으로 분류할 수 있다.

우선, 일차성 퇴행성 관절염은 확실한 원인이 아직 밝혀져 있지 않지만, 나이, 성별, 유전적 요소 또는 비만증 등이 원인이라고 생각되고 있다. 일차성 퇴행성 관절염은 중년 이후 나이가 많을수록 발병빈도가 높아지고 여성에게서 더 많이 나타나며 가족력과 관계가 있다. 비만증이 있는 경우는, 정상인보다 약 2배 정도로 발생률이 높고, 이때는 주로 체중부하 관절에 나타난다.

다음으로, 이차성 퇴행성 관절염은 관절 연골에 손상을 줄 수 있는 외상, 질병 또는 기형이 모두 원인이 될 수 있다. 선천적 기형으로는 고관절 발육부전이나 내반슬 같은 관절의 정렬이 틀어진 경우이고, 결핵성 관절염 후 관절 연골이 파괴된 경우 무혈성 괴사, 심한 충격 또는 반복적이면서 가벼운 외상 등으로 인해 퇴행성 관절염이 속발될 수 있다.

한편, 관절 연골은 주로 콜라겐(collagen)과 프로테오글리칸(proteoglycan, PG)으로 이루어진 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 구조적 완전함과 생화학적 구성요소에 의해 정상적으로 기능을 하게 되며 위 프로테오글리칸은 코어프로테인(core protein)과 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)으로 구성된다. 관절 연골섬유는 스펀지와 같은 조직으로 상하좌우 수많은 접물질로 이루어져 망상구조와 유사하고 단단한 점액성의 콜라겐 물질로 구성되며 서로 직각으로 놓여진 십자 형태로 4개의 층을 형성하고 있다.

한편, 건강한 관절을 유지하는 데에는 세 가지가 필수적인데 윤활과 성장을 위한 액체, 액체를 흡수하고 유지하기 위한 프로테오글리칸 및 프로테오글리칸을 제 위치에 유지시키기 위한 콜라겐이 그것이다. 프로테오글리칸은 관절을 윤활하고 영양을 공급하는 액체 속에서 자신 무게의 몇 배의 액체를 잡아놓기 때문에 건강한 연골에 절대적으로 필요하며 콜라겐 섬유로 둘러싸여 있는 콜라겐 망상구조 내에 안전하게 고정되어 있다. 만약 연골이 손상되거나 연골을 분해하는 효소들이 분비되면 콜라겐 망상구조는 약해지고 망상구조의 형태가 망가져 이것이 사방으로 흩어지면 프로테오글리칸도 느슨해져 떠돌아 다니게 된다. 즉, 연골섬유에 액체를 포함하게 하는 물질인 프로테오글리칸이 없으면 연골은 충격을 흡수할 수 없어 부딪히는 경우 쉽게 금이 가거나 부서지고 진행이 계속되는 경우에는 연골이 완전히 없어져 버리게 된다.

관절 연골의 퇴행성 변화의 원인은 정확히 알려져 있지 않으나, 관절 연골에 노화 등의 퇴행이 발생하여 연골세포에서 관절의 기질 물질인 유형 2 콜라겐 및 프로테오글리칸 등의 합성이 저해됨과 동시에, 인터루킨-1β 및 종양괴사인자α등의 염증성 사이토카인이 생성됨에 따라 관절의 기질 물질을 분해하는 기질금속단백질분해효소(MMPs)의 합성 및 이의 활성이 증가되어 관절조직이 파괴됨으로써 유발된다. 퇴행성 관절염의 진행 초기에는 프로테오글리칸이 활액속으로 유실되면서 연골구조가 약화되어 충격 및 흡수작용이 원활하지 못하고 이어 연골이 섬유화되면서 연골성분을 합성하는 콘드로사이트가 손상을 받아 연골세포의 괴사가 시작된다. 연골의 섬유화와 함께 지속적인 프로테오글리칸의 유실로 인하여 연골표면에 미세한 균열이 발생하고 이것이 점차 연골의 깊은 곳까지 확산됨과 동시에 이 유실물들이 활액 속에 쌓여 활액 성분의 여러 변화를 일으켜서 히아루론산 등의 생성을 포함한 정상적인 대사가 이루어지지 않아 결국 활막염으로 진행된다. 또한 퇴행성 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소의 생성과 생성된 일산화질소에 의한 자가 증폭적인 염증성 사이토카인의 생성으로 인해 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되고 관절 기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화 된다. 이와 동시에 염증성 사이토카인은 지질 대사산물인 프로스타글란딘 E2의 생성을 증가시켜 관절에서 염증반응을 계속 유발시킨다.

최근에는 히프투알파(HIF-2α) 유전자가 연골세포에서 연골퇴행을 유발하는 다양한 인자들의 활성을 조절해 퇴행성관절염을 근원적 결정적으로 유발한다는 사실을 밝혀냈으며 전사인자(transcription factor)HIF-2α가 사람이나 동물의 퇴행연골에서 과 발현되면 연골퇴행을 직접적으로 유발하는 연골기질분해효소인 MMPs와 ADAMTS 및 염증을 유발하는 단백질을 활성화시킴으로서 연골조직을 퇴행시켜 퇴행성관절염을 일으킨다는 사실이 밝혀졌다.

본 발명은 퇴행성관절염의 새로운 치료 메커니즘을 규명하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 기질 금속성 단백질분해효소(Matrix Metalloproteinase) MMP-3의 활성 억제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 인터루킨-1β에 의해 염증이 촉진된 연골세포에 백절 유신탕 또는 그 활성성분인 베르베린을 가하는 것을 포함하는 기질 금속성 단백질분해효소(Matrix Metalloproteinase, MMP)MMP-3의 활성 억제 방법을 제공한다.

본 발명은 위 MMP-3의 활성 억제 방법을 포함하는 프로테오글리칸(PG)의 분해 억제 방법을 제공한다.

본 발명은 위 MMP-3의 활성 억제 방법을 포함하는 콜라겐의 분해 억제 방법을 제공한다.

본 발명은 백절유신탕 또는 그에 포함된 베르베린을 포함하는 MMP-3 억제제를 제공한다.

본 발명은 백절유신탕 또는 그 활성성분이 MMP-3의 활성을 억제함을 증명한다.

본 발명은 코어 단백질과 그에 결합된 글리코사미노글리칸(GAG)으로 구성된 프로테오글리칸을 분해시키는 MMP-3의 활성 억제를 확인함으로써 퇴행성관절염의 새로운 발병 메커니즘 규명에 기여한다.

본 발명은 콜라겐을 분해하는 프로콜라게나제를 초활성화시키는 MMP-3의 활성 억제를 확인함으로써 퇴행성관절염의 새로운 발병 메커니즘 규명에 기여한다.

본 발명에 따라 MMP-3을 모니터링 함으로써 퇴행성관절염의 예측 및 진단이 가능하다.

본 발명은 퇴행성관절염을 비롯하여 연골세포의 분해에 의해 발생 또는 심화되는 유사질환 관련 연구에 기여한다.

도 1a는 백절유신탕(BYT) 및 그 활성성분인 베르베린이 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 mRNA 발현을 억제함을 나타낸다.
도 1b는 백절유신탕(BYT) 및 그 활성성분인 베르베린이 MMP-3의 억제제인 TIMP-1의 활성을 증가시킴을 나타낸다.
도 1c는 백절유신탕(BYT) 및 그 활성성분인 베르베린이 프로테오글리칸(PG)의 분해를 억제함을 나타낸다.
도 1d는 백절유신탕(BYT) 및 그 활성성분인 베르베린이 콜라겐의 분해를 억제함을 나타낸다.
도 2는 백절유신탕(BYT) 및 그 활성성분인 베르베린이 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 분비를 억제함을 나타낸다.
도 3은 백절유신탕(BYT) 및 그 활성성분인 베르베린이 분비된 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 활성을 억제함을 나타내는 도면이다.
도 4a는 백절유신탕(BYT) 및 그 활성성분인 베르베린이 콜라겐의 분해를 억제함을 나타내는 도면이다.
도 4b는 백절유신탕(BYT) 및 그 활성성분인 베르베린이 글리코사미노글리칸(GAG)의 분해를 억제함을 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 인터루킨-1β에 의해 염증이 촉진된 연골세포에 백절유신탕 또는 그 활성성분인 베르베린을 가하는 것을 포함하는 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 활성 억제 방법을 제공한다.

백절유신탕은 녹각교, 구판교, 별갑교, 황백, 창출 및 고삼 등의 약재를 포함한다.

녹각교(鹿角膠)는 녹각(鹿角)을 물로 끓여서 농축하여 만든 아교질 덩어리로 녹각은 보혈, 노수, 지혈, 안태, 요통, 임질, 대하 및 화상 등에 효과가 있다고 알려져 있다. 녹각교는 퇴행성관절염의 치료 또는 예방에 효과가 있는데, 퇴행성관절염의 치료 또는 예방 기작은 구체적으로 밝혀져 있지 않다.

구판교(龜板膠)는 거북의 배인 구판(龜板)을 교제의 형태로 만든 것으로 구판은 자음잠양, 익신건골, 양혈보심의 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 구판교는 퇴행성관절염의 치료 또는 예방에 효과가 있는데, 퇴행성관절염의 치료 또는 예방 기작은 구체적으로 밝혀져 있지 않다.

별갑교(鱉甲膠)는 자라의 등딱지인 별갑(鱉甲)을 교제의 형태로 만든 것으로 별갑은 보신자음의 효능이 강하다. 별갑교 역시 퇴행성관절염의 치료 또는 예방에 효과가 있는데, 퇴행성관절염의 치료 또는 예방 기작은 구체적으로 밝혀져 있지 않다.

녹각교, 구판교 및 별갑교는 교제 형태인데, 이와 같이 동물의 가죽, 뼈 등을 약한 불로 10시간 이상 고아 만든 한약 제제인 교제 형태로 포함됨으로써 백절유신탕이 극심한 피로나 노화로 인한 살의 탄력 저하 방지, 요통이나 관절통 등에 대한 탁월한 효과, 관절 연골, 힘줄 및 인대 등의 관절 주변조직을 구성하는 콜라겐의 분해 산물인 젤라틴을 공급하는데 기여한다.

황백(黃柏)은 황경피 나무껍질로 청열조습, 사회해독 및 퇴허혈한 것으로 알려져 있고, 본 발명에서는 백절유신탕에 베르베린이 포함된 황백을 포함되어 있어 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 활성 억제 효과를 나타낸다.

창출(蒼朮)은 조습건비, 거풍산한 및 명목한 것으로 알려져 있다.

고삼(苦蔘)은 청열조습, 거풍살충 및 이뇨의 효능을 가지는 것으로 알려져 있다.

녹각교, 구판교, 별갑교, 황백, 창출 및 고삼은 백절유신탕에 특정의 중량비로 포함될 필요는 없으나, 기재 순으로 10~40 : 10~40 : 10~40 : 8~32 : 4~16 : 2~8 (중량비)가 되도록 하는 것이 바람직하고, 5~15 : 5~15 : 5~15 : 4~12 : 2~6 : 1~3(중량비)이 되도록 하는 것이 보다 바람직하며, 10 : 10 : 8 : 4 : 2(중량비)로 포함하는 것이 보다 더 바람직하다.

백절유신탕을 제조할 때 사용하는 추출 용매는 증류수, 알콜 또는 유기용매 등이 바람직하다. 알콜은 탄소수 1 내지 5인 것이 좋고 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 부탄올이 더욱 좋으며 유기용매로는 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트가 사용될 수 있다.

백절유신탕은 특정의 방법으로 제조된 것으로 한정되지 않으며, 예컨대 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다. 녹각교, 구판교, 별갑교, 황백, 창출 및 고삼을 깨끗이 씻고 위 기재 순으로 10~40 : 10~40 : 10~40 : 8~32 : 4~16 : 2~8의 중량비로 1차 혼합하는 단계, 1차 혼합물 총 중량의 10 내지 15배의 물을 1차 혼합물과 혼합하는 2차 혼합 단계, 2차 혼합물 부피의 1/6 내지 1/5이 남을 때까지 2차 혼합물을 가열하는 단계, 얻어진 추출물을 여과하는 단계, 여관된 추출물을 감압 농축하는 단계, 농축된 추출물을 건조하는 단계 및 건조된 추출물을 분말화하는 단계를 포함하여 구성될 수 있다. 또한, 위와 같이 6가지 약재들을 혼합한 후 한번에 추출하는 것이 아니라 약재들을 개별적으로 추출한 후 얻은 추출물을 위 중량비로 혼합하는 것도 가능하다.

추출은 통상적인 조건 하에서 수행될 수 있고 예컨대 20-100℃의 온도로 30-5시간 동안 수행될 수 있다.

베르베린은 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 갖는 화합물이다.

베르베린은 합성된 것도 사용될 수 있으나 본 발명의 백절유신탕에 포함된 황백에서 분리한 것도 사용될 수 있다.

황백에서 베르베린을 분리하는 방법은 통상의 식물 추출방법을 사용할 수 있으며, 예컨대 황백 분쇄물을 증류수, 알콜 또는 유기용매에 혼합하고 여과하여 용매를 건조시켜 제조할 수 있다. 알콜은 탄소수 1 내지 5가 바람직하며 더욱 바람직하게는 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 부탄올이며 유기용매로는 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트가 바람직하다.

예컨대, 황백피를 그늘에서 충분히 건조한 다음 분쇄기로 분쇄하거나 세절기로 절단하여 베르베린 추출물의 출발 물질을 제조한다. 위 출발물질을 실온에서 추출용매를 가하고 20 내지 90℃의 온도에서 1시간 이상 환류시켜 유효성분을 추출한다. 이때 고형물은 여과하여 제거하고 여액은 회전증발기로 농축시킨 다음 동결 건조하여 베르베린 추출물을 얻는다. 위 추출용매로는 물, 에탄올, 부탄올, 이소프로판올, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 또한, 환류 추출법 대신 속슬레 추출법, 액체크로마토그래피 등을 사용하여 추출할 수도 있다.

위의 백절유신탕 또는 베르베린을 인터루킨-1β에 의해 염증이 촉진된 연골세포에 가한다. 이들 유효성분이 연골 세포에 작용하면 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 mRNA 발현이 억제되고, 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 저해제인 TIMP-1의 mRNA 발현이 증가되며, 타입 2 콜라겐과 글리코사미노글리칸의 분해 및 분비가 억제된다.

백절유신탕 또는 베르베린은 MMP-1 및 MMP-13의 활성은 저해하지 않으나 MMP-3의 활성은 억제한다.

이하 실시예와 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예와 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예와 실험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

실시예 1 : 베르베린의 추출

황백피를 그늘에서 충분히 건조시킨 다음, 분쇄기로 절단하여 베르베린 추출물의 출발 물질을 제조하였다. 위 출발물질을 실온에서 에탄올을 가하여 60℃에서 1시간 동안 환류시켜 유효성분을 추출하였다. 이때 고형물은 여과하여 제거하고 여액은 회전증발기로 농축시킨 다음 동결건조하여 베르베린 추출물을 얻었다.

실시예 2 : 백절유신탕의 제조

녹각교 10g, 구판교 10g, 별갑교 10g, 황백 8g, 창출 4g, 고삼 2g의 혼합물에 약 600㎖의 정제수를 넣고 약 150분 동안 열수 추출하였다. 추출액을 여과하고 감압하에 약 120㎖로 농축하였다. 농축액을 동결건조하여 분말상태의 백절유신탕을 제조하였다.

실험예 1. 베르베린 및 백절유신탕의 MMP -3, TIMP -1, 타입 2 콜라겐 및 어그레칸의 mRNA 발현 여부 측정

베르베린 및 백절유신탕이 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3, 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3 저해제 TIMP-1, 타입 2 콜라겐과 어그레칸의 mRNA발현조절에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 이하 실험을 수행하였다.

생후 2주된 토끼를 이산화탄소로 질식사시키고, 무릎관절을 절취하였다. 절취한 무릎관절에서 연골조직을 수술용 칼로 절취하여 0.2% 콜라게나이즈로 분해시켜 단독 연골세포를 획득한 다음 75㎠ 배양 플라스크(10⁵세포/㎠)로 옮기고 10% FBS, 100 유닛/㎖ 페니실린과 스트렙토마이신이 포함된 12㎖의 DMEM배양액에서 배양하였다. 배양된 세포를 수차례 세척한 뒤 세포를 안정화시키기 위하여 5% 이산화탄소, 95% 공기를 함유한 37℃조건에서 2일 동안 배양한다. 대략 30mg의 연골조직을 48개의 웰 플레이트에 분배하고 배양된 연골조직에 실시예 1에서 제조된 베르베린을 1,5,10 μM농도로 각각 처리하였다.

또한, 실시예 2에서 제조된 백절유신탕을 증류수 1㎖당 각각 0.01, 0.1, 1.0 mg씩을 첨가하여, 백절유신탕 수용액이 각각 0.01, 0.1, 1.0 ㎎/㎖가 되도록 하여 배양된 연골조직에 이를 각각 가하였다. 37℃에서 2시간 동안 위 베르베린과 백절유신탕을 각각 처리한 다음 인터루킨-1β 5ng/㎖를 처리하고 24시간 동안 이를 배양하였다. 이후 easy-BLUE^TM RNA 추출키트를 이용하여 세포로부터 총 RNA를 분리한 다음 총 RNA(2.0 ㎍)를 10분 동안 65℃에서 열처리 한 뒤 냉동 보관하였다. 역 전사효소를 이용하여 cDNA를 합성한 뒤 다음의 프라이머와 반응시켜 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

이에 MMP-3은 (5` ATG GAC CTTCTT CAG CAA 3` ; 5`TCA TTA TGT CAG CCT CTC 3`), TIMP-1은 (5`GCA ACT CCG ACC TTG TCA TC 3`), 어그레칸은 (5`GAG GTC GTG GTG AAA GGT GT 3`; 5`GTG TGG ATG GGG TAC CTG AC 3`), 타입 2콜라겐은 (5`AAC ACT GCC AAC GTC CAG AT 3`;5`CTG ACG CAC GGT ATA GGT GA 3`)의 프라이머를 사용하였다. 이후 1.5% 아가로스젤로 전기영동하여 분석하였으며 이를 도 1에 나타내었다.

그 결과 실시예 1에서 제조된 베르베린의 농도를 증가시킬수록 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 mRNA발현이 억제되고 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 저해제인 TIMP-1의 mRNA발현이 증가시키며, 타입 2 콜라겐과 어그레칸의 mRNA발현이 증가됨을 알 수 있었다.

또한, 실시예 2에서 제조된 백절유신탕의 양을 증가시킬수록 위와 유사한 효과가 나타남을 알 수 있는바, 이를 통하여 베르베린과 백절유신탕은 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 mRNA발현을 저해함을 알 수 있었다. 또한, 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 저해제인 TIMP-1의 mRNA발현이 증가시키며, 타입 2 콜라겐과 어그레칸의 mRNA발현이 증가시킴에 따라 연골분해를 억제함과 동시에 연골기질의 생성을 촉진함을 알 수 있었다.

실험예 2. 베르베린과 백절유신탕의 기질 금속성 단백질분해효소 MMP -3의 분비 억제 여부 측정

베르베린 및 백절유신탕이 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 분비 억제에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 이하 실험을 수행하였다.

생후 2주된 토끼를 이산화탄소로 질식사시키고, 무릎관절을 절취하였다. 절취한 무릎관절에서 연골조직을 수술용 칼로 절취하여 0.2% 콜라게나이즈로 분해시켜 단독 연골세포를 획득한 다음 75㎠ 배양 플라스크(10⁵세포/㎠)로 옮기고 10% FBS, 100 유닛/㎖ 페니실린과 스트렙토마이신이 포함된 12㎖의 DMEM배양액에서 배양하였다. 배양된 세포를 수차례 세척한 뒤 세포를 안정화시키기 위하여 5% 이산화탄소, 95% 공기를 함유한 37℃조건 에서 2일 동안 배양한다.

이후 배양된 연골조직에 실시예 1에서 제조된 베르베린을 10μM로 처리하고, 실시예 2에서 제조된 백절유신탕을 증류수 1㎖당 1.0㎎을 첨가하여 처리하였다. 37℃에서 2시간 동안 베르베린과 백절유신탕을 처리한 다음 인터루킨-1β 5ng/㎖를 처리하고 24시간 동안 이를 배양하였다. 이후 세포 배양액에서 분비된 MMP-3에 대한 단클론항체를 PBS(pH 7.4)로 희석하여 96 웰 플레이트에 100㎕씩 각각 코팅한 다음 4℃에서 12시간 동안 유지하였다. 이후 플레이트를 0.05% 트윈이 함유된 PBS로 세정한 다음 1% BSA, 5% 수크로스 및 0.05% 아지드화나트륨을 함유한 PBS로 1시간 동안 유지하였다.

이후 수차례 세정한 다음 원심분리하여 얻은 세포 상층액과 이에 표준 사이토카인을 첨가한 뒤, 37℃에서 2시간 동안 유지하였다. 이후 각 웰을 다시 세정한 다음 비오틴이 결합된 2차 항체를 첨가하여 다시 37℃에서 2시간 동안 유지하였다. 이후 웰을 다시 세정하고 아비딘 퍼옥시다아제를 첨가한 뒤 37℃에서 30분 동안 유지하였다. 웰을 다시 세정한 다음 기질인 ABTS용액을 첨가하였고 엘리사 리더를 이용하여 405㎚에서 발색반응을 측정하였으며 이는 도 2에 도시하였다.

그 결과 10μM 농도의 베르베린 처리를 한 연골세포와 실시예 2에서 제조된 백절유신탕을 1mg/1㎖ 처리한 연골세포는 인터루킨-1β를 5ng/㎖처리하여 자극시킨 연골세포에 비하여 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 분비가 유의하게 억제됨을 확인할 수 있었다. 베르베린과 백절유신탕은 위 농도에서 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3를 억제함을 알 수 있었다.

실험예 3. 베르베린과 백절유신탕의 분비된 MMP -3의 활성 억제 여부 측정

베르베린 및 백절유신탕이 분비된 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 이하 실험을 수행하였다.

생후 2주된 토끼를 이산화탄소로 질식사시키고, 무릎관절을 절취하였다. 절취한 무릎관절에서 연골조직을 수술용 칼로 절취하여 0.2% 콜라게나이즈로 분해시켜 단독 연골세포를 획득한 다음 75㎠ 배양 플라스크(10⁵세포/㎠)로 옮기고 10% FBS, 100 유닛/㎖ 페니실린과 스트렙토마이신이 포함된 12㎖의 DMEM배양액에서 배양하였다. 배양된 세포를 수차례 세척한 뒤 세포를 안정화시키기 위하여 5% 이산화탄소, 95% 공기를 함유한 37℃에서 2일 동안 배양한다. 이후 배양된 연골조직에 실시예 1에서 제조된 베르베린을 10μM로 처리하고, 실시예 2에서 제조된 백절유신탕을 증류수 1㎖당 1.0㎎을 첨가하여 처리하였다. 37℃에서 2시간 동안 베르베린과 백절유신탕을 처리한 다음 인터루킨-1β 5ng/㎖를 처리하고 24시간 동안 이를 배양하였다.

이후 세포배양액의 단백질 량을 정량한 후 카제인이 함유된 젤을 제조하고 각 홈에 동량의 단백질이 들어가도록 세포배양액을 넣었다. 전기영동으로 단백질들을 분리시킨 후 2회 씻어내고 2.5% 트리톤 엑스-100에 20분간 방치하였다. 이후 2회 세척하고 지모그래피 리액션 버퍼에 12시간 동안 반응시킨 다음 젤을 염색시키고 destaining 버퍼로 염료를 씻어내었다. 젤을 건조시킨 후 투명하게 나타나는 MMP-3밴드를 스펙트럼 측정하여 세포배양액에서 분비된 MMP-3의 활성을 측정하였으며 도 3에 도시하였다.

그 결과 10μM 농도의 베르베린 처리를 한 연골세포와 실시예 2에서 제조된 백절유신탕을 1mg/1㎖ 처리한 연골세포는 인터루킨-1β를 5ng/㎖처리하여 자극시킨 연골세포에 비하여 분비된 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 활성이 유의하게 억제됨을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 베르베린과 백절유신탕은 위 농도에서 분비된 MMP-3의 활성을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 4. 베르베린과 백절유신탕의 타입 2 콜라겐과 어그레칸의 분해 억제 여부 측정

베르베린 및 백절유신탕이 타입 2 콜라겐과 어그레칸의 분해에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 이하 실험을 수행하였다.

이후 세포배양액을 원심분리하여 획득하고 남은 연골조직에 새로운 배양액을 넣었다. 1시간 동안 연골조직을 안정화시키고 2시간 동안 베르베린을 10μM로 처리하고, 실시예 2에서 제조된 백절유신탕을 증류수 1㎖당 1.0㎎을 첨가하여 전처리하였다. 2시간 후, 인터루킨-1β 5ng/㎖을 처리하고 96시간 후 위와 같은 방법으로 배양액을 교환하였다. 14일 후에 세포배양액을 획득하고 연골의 구성성분인 콜라겐과 글리코사미노글리칸을 정량하였다. 이후 각 인자들의 측정 키트를 이용하여 본 발명의 백절유신탕의 효과를 분석하였으며 도 4에 도시하였다.

그 결과 백절유신탕을 1mg/1㎖ 처리한 연골세포는 인터루킨-1β를 5ng/㎖처리하여 자극시킨 연골세포에 비하여 콜라겐과 글리코아미노글리칸의 분해가 유의하게 감소함을 확인할 수 있으며, 더욱이 10μM 농도의 베르베린 처리를 한 연골세포는 MMP-3억제제인 NNGH처리를 한 연골세포에 비하여 콜라겐과 글리코아미노글리칸의 분해가 덜 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 베르베린과 백절유신탕은 위 농도에서 타입 2 콜라겐과 어그레칸의 분해를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

이로써 본 발명은 백절유신탕 또는 그 활성성분이 MMP-3의 활성을 억제함을 증명하고 프로테오글리칸을 분해시키는 MMP-3의 활성 억제를 확인함으로써 퇴행성관절염의 새로운 발병 메커니즘 규명에 기여할 수 있으며, MMP-3을 모니터링 함에 따라 퇴행성관절염의 예측 및 진단이 가능할 뿐만 아니라 연골세포의 분해에 의해 발생 또는 심화되는 유사질환 관련 연구에 기여할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

인터루킨-1β에 의해 염증이 촉진된 연골세포에 백절유신탕 또는 그 활성성분인 베르베린을 가하는 것을 포함하는 기질 금속성 단백질분해효소 MMP-3의 활성 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 MMP-3의 활성 억제는 MMP-3의 억제제인 TIMP-1의 활성 증가에 의한 것인 MMP-3의 활성 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 백절유신탕은 녹각교, 구판교, 별갑교, 황백, 창출 및 고삼의 혼합물의 추출물 또는 그 분말인 MMP-3의 활성 억제 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 혼합물은 녹각교, 구판교, 별갑교, 황백, 창출 및 고삼이 중량비를 기준으로 10~40 : 10~40 : 10~40 : 8~32 : 4~16 : 2~8로 포함된 것인 MMP-3의 활성 억제 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 추출물은 상기 혼합물 중량의 10-15배의 물 용매 하에서 추출된 것인 MMP-3의 활성 억제 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 베르베린은 상기 백절유신탕을 구성하는 황백에 포함된 것인 MMP-3의 활성 억제 방법.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 MMP-3의 활성 억제 방법을 포함하는 프로테오글리칸(PG)의 분해 억제 방법.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 MMP-3의 활성 억제 방법을 포함하는 콜라겐의 분해 억제 방법.
백절유신탕 또는 그에 포함된 베르베린을 포함하는 MMP-3 억제제.