KR20120074308A

KR20120074308A - Ｅｇｆｒ 유전자 다형 검출용 프로브 및 그 용도

Info

Publication number: KR20120074308A
Application number: KR1020127012782A
Authority: KR
Inventors: 모에코 이주인
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2012-07-05
Also published as: EP2495335B1; EP2495335A4; KR101472940B1; EP2495335A1; CN102597271A; JPWO2011052754A1; WO2011052754A1; CN102597271B; US20120214166A1; JP5635496B2; US8748095B2

Abstract

본 발명은, EGFR 유전자의 다형을, 간편하고 뛰어난 신뢰성으로 판별 가능한, 다형 검출용 프로브 및 그를 사용한 다형 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 다형 검출용 프로브는, 하기 (P1)의 올리고뉴클레오티드 및 (P2)의 올리고뉴클레오티드의 적어도 한쪽을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFR 유전자의 다형 검출용 프로브이다.
(P1) 염기 길이가, 22?50염기 길이이며, 서열 번호1에 있어서의 염기 번호334?355를 포함하는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 상기 염기 번호334의 염기에 상보적인 염기를, 3' 말단 영역에 갖는 올리고뉴클레오티드
(P2) 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드

Description

ＥＧＦＲ 유전자 다형 검출용 프로브 및 그 용도{PROBE FOR DETECTING POLYMORPHISM IN EGFR GENES, AND USAGE THEREFOR}

본 발명은, EGFR 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브 및 그 용도에 관한 것이다.

상피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor : EGFR)는, 상피 성장 인자(EGF)의 티로신키나제형 수용체이다. EGFR은, 많은 고형암(固形癌)에서 고빈도로 발현되고, 그 과잉 발현은 암의 악성도 및 예후와 관련하는 것이 알려져 있다. 그래서, 예를 들면, EGFR의 티로신키나제 저해제인 게피티닙 등이, 암치료약으로서 사용되고 있다. 그러나, 환자 중에는, 게피티닙에 내성을 나타내어, 치료 효과를 얻을 수 없는 경우가 있다. 그리고, 근래, 이 약제내성이, EGFR의 변이와 관련하는 것이 명백하게 되어 있다(비특허문헌 1 및 2). 상기 변이는, EGFR의 790번째의 아미노산인 트레오닌(T)이 메티오닌(M)으로 치환된 변이이며, EGFR 유전자의 CDS에 있어서는, 엑손20의 염기 번호2369의 염기 시토신(c)이 티민(t)으로 변이하고 있다. 따라서, EGFR 유전자의 엑손20에 있어서의, 이 변이의 유무, 즉, 다형을 검출하면, 치료 전에, 게피티닙 내성인가 아닌가를 판단할 수 있다. 이에 의해, 또한 효율적인 테일러메이드(tailor-made) 암치료가 가능하게 된다.

한편, 유전자의 다형을 검출하는 방법으로서는, 다양한 방법이 보고되고 있고, 예를 들면, PCR(Polymerase Chain Reaction)-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)법 등을 들 수 있다.

상기 PCR-RFLP법은, 시료의 표적 DNA에 대해, 검출 목적의 영역을 PCR로 증폭시켜, 그 증폭물을 제한 효소 처리하고, 다형에 의한 제한 단편 길이의 변화를, 서던하이브리다이제이션에 의해 타이핑하는 방법이다. 유전자에 목적의 변이가 존재하면, 제한 효소의 인식 부위가 소실하기 때문에, 절단의 유무, 즉, 제한 단편 길이의 변화에 의해서, 변이의 유무를 검출할 수 있다.

그러나, 상기 PCR-RFLP법은, 예를 들면, PCR 후, 얻어진 증폭물을 각종의 제한 효소로 처리하고, 해석할 필요가 있어, 수고가 든다. 또한, 얻어진 증폭물의 제한 효소 처리는, 일단, 반응기에서 증폭물을 취출하여 행할 필요가 있다. 이 때문에, 1회째의 반응으로 얻어진 증폭물이 비산하고, 2회째의 다른 반응에 혼입할 우려가 있다. 이러한 문제로부터, 다형의 검출을 자동화하기 어렵다.

이러한 문제로부터, 근래, 다형의 검출 방법으로서, Tm(Melting Temperature) 해석이 주목되고 있다. 이는, 우선, 검출 목적의 다형을 포함하는 영역에 상보적인 프로브를 사용하여, 피검 핵산과 상기 프로브의 하이브리드(2본쇄 핵산)를 형성시킨다. 그리고, 얻어진 하이브리드에 가열 처리를 실시하여, 온도 상승에 수반하는 상기 하이브리드의 1본쇄 핵산으로의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 측정에 의해 검출한다. 이 검출 결과에 의거하여 Tm값을 결정하는 것에 의해, 다형을 판단하는 방법이다. Tm값은, 상기 하이브리드에 있어서의 양 1본쇄 핵산의 상보성이 높을수록 높고, 상보성이 낮을수록 낮아진다. 그래서, 검출 대상 부위의 다형이 X 또는 Y의 경우, 목적의 다형(예를 들면, Y)을 포함하는 핵산과 그에 100% 상보적인 프로브의 하이브리드에 대해서, 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 둔다. 이어서, 상기 피검 핵산과 상기 프로브의 Tm값(측정값)을 측정한다. 그리고, 이 측정값이, 상기 평가 기준값과 같으면, 상기 피검 핵산과 상기 프로브는 퍼펙트 매치인, 즉, 상기 피검 핵산의 검출 대상 부위가 목적의 다형(Y)이라고 판단할 수 있다. 한편, 상기 측정값이 상기 평가 기준값보다도 낮을 경우, 상기 피검 핵산과 상기 프로브는 미스 매치인, 즉, 상기 피검 핵산의 검출 대상 부위가 다른 쪽의 다형(X)이라고 판단할 수 있다. 이러한 방법이면, 예를 들면, 상기 프로브를 첨가한 PCR 반응액에 온도 처리를 실시하고, 시그널 측정을 행하는 것만으로, 다형을 검출할 수 있다. 이 때문에, 검출 장치의 자동화도 가능하다.

그러나, 이러한 Tm 해석을 이용한 검출 방법은, 예를 들면, 1염기의 차이를 Tm값에 의해 판단하지 않으면 안된다. 이 때문에, 특히, 정상형의 다형과 변이형의 다형이 혼재하고 있는 경우 등이어도, 변이의 유무를 정확히 검출하는 것이 요구되고 있다.

파오(Pao) 등, PLoS Medicine, 2005년, Vol.2, No.3, p.225-235 린치(Lynch) 등, New England Journal of Medicine, 2004년, Vol.350, No.21, p.2129-2139

그래서, 본 발명은, EGFR 유전자에 대해, 다형을, 간편하고 뛰어난 신뢰성으로 판별 가능한, 다형 검출용 프로브 및 그 용도의 제공을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 다형 검출용 프로브는, 하기 (P1)의 올리고뉴클레오티드 및 (P2)의 올리고뉴클레오티드 적어도 한쪽을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFR 유전자의 다형 검출용 프로브이다.

(P1) 염기 길이가, 22?50염기 길이이며, 서열 번호1에 있어서의 염기 번호334?355를 포함하는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 상기 염기 번호334의 염기에 상보적인 염기를, 3' 말단 영역에 갖는 올리고뉴클레오티드

(P2) 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드

본 발명의 다형 검출용 시약은, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFR 유전자의 다형 검출용 시약이다.

본 발명의 다형 검출 방법은, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용하여, EGFR 유전자의 다형을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFR 유전자의 다형 검출 방법이다.

본 발명의 다형 검출용 프로브에 의하면, 예를 들면, EGFR 유전자의 다형을, Tm 해석에 의해, 간편하고 뛰어난 신뢰성으로 판별할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 시료 중에, 목적의 다형이 정상형인 EGFR 유전자와, 변이형인 EGFR 유전자가 공존하고 있는 경우여도, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용한 Tm 해석을 행함으로써, 다형의 종류 또는 변이의 유무를, 간편하고 뛰어난 신뢰성으로 검출할 수 있다. 이 때문에, 본 발명은, 야생형(정상형이라고도 한다)의 EGFR 유전자와 변이형의 EGFR 유전자를 양쪽 포함하는 시료에 대해, 특히 유용하다. 이와 같이, 본 발명에 의하면, EGFR 유전자의 다형을, 간편하고 뛰어난 신뢰성으로 판별할 수 있으므로, 예를 들면, 검출 결과를 상술과 같은 항암제의 투여에 의한 치료에 반영할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 의료 분야 등에 있어서 극히 유용하다고 할 수 있다.

[도 1] 본 발명의 실시예1에 있어서의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
[도 2] 본 발명의 실시예2에 있어서의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.

본 발명에 있어서, EGFR 유전자에 있어서의 검출 목적의 다형은, 상술한 엑손20에 있어서의 다형이다. 상기 다형은, 예를 들면, 서열 번호1에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서의 염기 번호347의 염기에 있어서의 다형이다. 야생형의 상기 다형은, 서열 번호1에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서, 염기 번호347의 염기(y)가 시토신(c)이며, EGFR 단백질의 790번째의 아미노산은, 트레오닌이 된다. 변이형의 상기 다형은, 서열 번호1에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서, 염기 번호347의 염기(y)가 티민(t)이며, EGFR 단백질의 790번째의 아미노산은, 메티오닌이 된다. EGFR 유전자에 있어서, 상기 염기의 다형이 야생형이면, 게피티닙 등의 티로신키나제 저해제에 감수성이며, 상기 염기의 다형이 변이형이면, 상기 티로신키나제 저해제에 내성이라고 판단할 수 있다.

상기 EGFR 유전자의 염기 서열은, 예를 들면, GenBank 액세션 No.NG_007726으로서 등록되어 있고, 상기 액세션 번호의 염기 서열에 있어서, 염기 번호5001?193307의 영역이, EGFR 유전자의 전장 염기 서열이다. 서열 번호1에 나타내는 염기 서열은, 상기 EGFR 유전자의 부분 서열이며, 예를 들면, 상기 액세션 번호의 염기 서열에 있어서의 염기 번호167001?168020의 영역이다. 서열 번호1의 염기 서열에 있어서, 염기 번호262?447이, 엑손20이다.

본 발명에 있어서, 이하, 상기 염기가 변이형인 상기 EGFR 유전자를 「변이형 EGFR 유전자」, 상기 염기가 야생형인 상기 EGFR 유전자를 「야생형 EGFR 유전자 또는 정상형 EGFR 유전자」라고 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 다형이 발생하는 부위, 즉, 서열 번호1의 염기 서열(센스쇄)에 있어서 염기 번호347의 염기, 또는, 상보 서열(안티센스쇄)에 있어서 상기 센스쇄의 염기 번호347에 대응하는 염기를 「검출 대상 부위」라고 한다. 서열 번호1의 서열(센스쇄) 또는 그 상보 서열(안티센스쇄)에 있어서, 상기 검출 대상 부위를 포함하고, 상기 다형 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능한 영역을, 「하이브리다이즈 영역 또는 검출 대상 서열」이라고 한다. 상기 검출 대상 서열 중에서도, 검출 대상 부위가 아닌 임의의 부위를 제외하고, 상기 다형 검출용 프로브와 퍼펙트 매치하는 검출 대상 서열을 「퍼펙트 매치 서열」, 검출 대상 부위 및 임의의 부위가, 상기 다형 검출용 프로브와 미스 매치하는 검출 대상 서열을 「미스 매치 서열」이라고 한다. 본 발명에 있어서, 퍼펙트 매치는, 상기 검출 대상 부위의 염기가 상기 다형 검출용 프로브에 있어서의 대응 염기와 상보적인 것을 의미하고, 바람직하게는, 상기 검출 대상 서열에 있어서 상기 검출 대상 부위가 아닌 임의의 부위를 제외하고, 상기 검출 대상 서열과 상기 다형 검출용 프로브가, 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 미스 매치는, 상기 검출 대상 부위의 염기가 상기 다형 검출용 프로브에 있어서의 대응 염기와 비상보적인 것을 의미하고, 바람직하게는, 상기 검출 대상 서열에 있어서 상기 검출 대상 부위 및 임의의 부위를 제외하고, 상기 검출 대상 서열과 상기 다형 검출용 프로브가, 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 EGFR 유전자를 증폭시켜, 또한, 얻어진 증폭물과 본 발명의 다형 검출용 프로브를 하이브리다이즈시킬 경우, 상기 EGFR 유전자에 있어서의 증폭 영역을, 이하, 「증폭 대상 영역」이라고 한다. 상기 증폭 대상 영역은, 예를 들면, 상기 EGFR 유전자의 센스쇄에 있어서의 영역이여도 되며, 그에 대응하는 안티센스쇄에 있어서의 영역이여도 되며, 양쪽이어도 된다. 본 발명에 있어서, 센스쇄 및 안티센스쇄는, 예를 들면, 센스쇄의 증폭물, 안티센스쇄의 증폭물의 의미도 포함한다.

본 발명에 있어서, 염기 서열의 말단은, 염기 서열에 있어서의 5'측 및 3'측의 가장 끝 염기를 의미한다. 또한, 5' 말단 영역은, 염기 서열에 있어서의 5' 말단으로부터 수(數) 염기의 영역이며, 3' 말단 영역은, 염기 서열의 3' 말단으로부터 수 염기의 영역이다. 상기 수 염기는, 예를 들면, 상기 말단 염기를 포함하는 1?10염기, 1?4염기, 1?3염기, 1?2염기이다. 본 발명에 있어서, 염기 서열의 말단으로부터 Z번째의 염기(Z는 양의 정수)는, 말단의 염기를 1번째로 한 순번이며, 예를 들면, 말단으로부터 1번째의 염기는, 말단의 염기, 말단으로부터 2번째의 염기는, 말단의 이웃 염기를 의미한다.

<다형 검출용 프로브>

본 발명의 다형 검출용 프로브는, 상술과 같이, 하기 (P1)의 올리고뉴클레오티드 및 (P2)의 올리고뉴클레오티드의 적어도 한쪽을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFR 유전자의 다형 검출용 프로브이다.

본 발명의 다형 검출용 프로브는, 서열 번호1에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서, 염기 번호347의 염기(y)의 다형(c/t)을 검출하기 위한 프로브이다. 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 EGFR 유전자의 센스쇄에 상보적이며, 상기 센스쇄와의 하이브리다이제이션에 의해, 다형을 확인할 수 있다. 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 EGFR 유전자의 센스쇄에 상동적이며, 안티센스쇄의 하이브리다이제이션에 의해, 다형을 확인할 수 있다.

상기 (P1) 및 (P2)의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상보적이란, 완전히 상보적이어도 되며, 임의의 염기를 제외하고, 완전히 상보적이어도 된다. 상기 임의의 염기는, 예를 들면, 상기 검출 대상 부위에 하이브리다이즈하는 부위 이외의 염기이며, 그 수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 1개이다.

상기 (P1) 및 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 그 염기 길이가, 상술과 같이, 22?50염기 길이이다. 상한은, 예를 들면, 40염기 길이가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 30염기 길이이다.

상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 서열 번호1에 있어서의 염기 번호347의 염기에 상보적인 염기는, r로 나타내고, 아데닌(a) 또는 구아닌(g)이다.

상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 염기 번호334의 염기에 상보적인 염기를, 상기 3' 말단 영역에 갖고, 바람직하게는, 3' 말단으로부터 세어 1?4번째의 위치, 보다 바람직하게는, 1?3번째, 특히 바람직하게는 1번째(3' 말단) 또는 2번째에 갖는다. 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 서열 번호2, 서열 번호15, 서열 번호16 및 서열 번호17 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 예시할 수 있다.

tgagctgcrtgatgaggtgcac(서열 번호2)

tgagctgcrtgatgaggtgcacg(서열 번호15)

tgagctgcrtgatgaggtgcacgg(서열 번호16)

tgagctgcrtgatgaggtgcacggt(서열 번호17)

서열 번호2, 15?17에 나타내는 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1로 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호334?355를 포함하는 영역과 대응시켰을 경우, 5' 말단으로부터 17번째의 염기(g)를 제외하고, 상기 영역에 완전히 상보적인 염기 서열이다. 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 5' 말단으로부터 9번째의 염기r은, 상기 센스쇄의 검출 대상 부위, 즉 서열 번호1의 염기 서열에 있어서의 염기 번호347의 염기(y)에 상보적인 염기이다. 상기 r은, 아데닌(a) 또는 구아닌(g)이다.

서열 번호2, 15?17에 나타내는 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 5' 말단으로부터 9번째의 염기r이 구아닌(g)의 경우, 5' 말단으로부터 17번째의 염기(g)를 제외하고, 서열 번호1의 염기 서열에 있어서 염기 번호347의 염기(y)가 시토신(c)인 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치한다. 또한, 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 9번째의 염기r이 구아닌(g)의 경우, 서열 번호1의 염기 서열에 있어서 염기 번호347의 염기(y)가 티민(t)인 검출 대상 서열과 미스 매치가 된다. 이 경우, 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 9번째의 염기(g) 및 상기 17번째의 염기(g)가, 상기 검출 대상 서열의 대응 부위의 염기와 미스 매치가 된다. 한편, 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 9번째의 r이 아데닌(a)의 경우, 상기 17번째의 염기(g)를 제외하고, 서열 번호1에 있어서 염기 번호347의 염기(y)가 티민(t)인 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치한다. 또한, 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 9번째의 r이 아데닌(a)의 경우, 상기 17번째의 염기(g)를 제외하고, 서열 번호1에 있어서 염기 번호347의 염기(y)가 시토신(c)인 검출 대상 서열과 미스 매치가 된다. 이 경우, 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 9번째의 염기(a) 및 상기 17번째의 염기(g)가, 상기 검출 대상 서열의 대응 부위의 염기와 미스 매치가 된다. 따라서, 상기 EGFR 유전자의 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치인가 아닌가에 따라, EGFR 유전자의 다형을 검출할 수 있다.

서열 번호2, 15?17에 나타내는 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 서열 번호3, 4, 18?23에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있고, 바람직하게는, 서열 번호3, 18, 20, 23에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드이다.

tgagctgcatgatgaggtgcac(서열 번호3)

tgagctgcgtgatgaggtgcac(서열 번호4)

tgagctgcatgatgaggtgcacg(서열 번호18)

tgagctgcgtgatgaggtgcacg(서열 번호19)

tgagctgcatgatgaggtgcacgg(서열 번호20)

tgagctgcgtgatgaggtgcacgg(서열 번호21)

tgagctgcatgatgaggtgcacggt(서열 번호22)

tgagctgcgtgatgaggtgcacggt(서열 번호23)

상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 상술과 같이 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 염기 길이가, 22?50염기 길이이며, 서열 번호1에 있어서의 염기 번호334?355를 포함하는 염기 서열에 상동적인 염기 서열로 이루어지고, 상기 염기 번호334의 염기를, 5' 말단 영역에 갖는 올리고뉴클레오티드라고 할 수도 있다. 상기 상동적이란, 완전히 상동적이어도 되며, 임의의 염기를 제외하고, 완전히 상동적이어도 된다. 상기 임의의 염기는, 예를 들면, 상기 검출 대상 부위에 하이브리다이즈하는 부위 이외의 염기이며, 그 수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 1개이다. 구체예로서는, 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 서열 번호1에 있어서의 염기 번호339번째의 염기(g)를 제외하는 염기 번호334?355를 포함하는 영역에, 상동적인 염기 서열로 이루어진다. 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 서열 번호1에 있어서의 염기 번호347의 염기는, y로 나타낸다. 상기 y는, 티민(t) 또는 시토신(c)이다.

본 발명의 다형 검출용 프로브는, 예를 들면, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브여도 되며, 상기 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브여도 된다.

본 발명의 다형 검출용 프로브는, 표지 물질을 갖는 표지 프로브인 것이 바람직하고, 예를 들면, 상기 올리고뉴클레오티드가, 상기 표지 물질로 표지화(수식)되어 있는 것이 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표지 물질에 의해 표지화되는 부위는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 5' 말단 영역 또는 3' 말단 영역인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5' 말단 또는 3' 말단이다. 후술하는 바와 같이, 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표지 물질에 의해 표지화되는 염기는, 예를 들면, 시토신(c) 또는 구아닌(g)이 바람직하다. 상기 표지 물질은, 예를 들면, 염기를 직접 표지화해도 되며, 상기 염기를 간접적으로 표지화해도 된다. 후자의 경우, 예를 들면, 상기 염기를 포함하는 뉴클레오티드 잔기의 어느 부위를 표지하는 것에 의해, 상기 염기를 간접적으로 표지화할 수 있다.

상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 3' 말단 영역에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 예를 들면, 3' 말단으로부터 세어 1?4번째의 염기의 위치에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 3' 말단으로부터 세어 1?4번째의 염기이며, 더 바람직하게는, 3' 말단으로부터 세어 1?3번째의 염기, 특히 바람직하게는, 3' 말단으로부터 세어 2번째 또는 3' 말단의 염기이다. 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 상기 염기 번호334?337의 염기에 상보적인 어느 염기가, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 상기 염기 번호334의 염기에 상보적인 염기(c)가, 상기 표지 물질을 갖는다.

상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 5' 말단 영역에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 예를 들면, 5' 말단으로부터 세어 1?4번째의 염기의 위치에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 5' 말단으로부터 세어 1?4번째의 염기이며, 더 바람직하게는, 5' 말단으로부터 세어 1?3번째의 염기, 특히 바람직하게는, 5' 말단으로부터 세어 2번째 또는 5' 말단의 염기이다. 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 상기 염기 번호334?337의 어느 염기에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 상기 염기 번호334의 염기(g)에, 상기 표지 물질을 갖는다.

상기 표지 물질은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 표지 프로브가 단독인지, 하이브리드를 형성하고 있는지에 따라, 시그널을 발하는 것이 바람직하다. 상기 시그널의 종류는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 형광, 정색(呈色) 등을 들 수 있다. 상기 정색은, 예를 들면, 발색이여도 되며, 변색이여도 된다. 상기 시그널이 형광의 경우, 시그널값은, 예를 들면, 형광 강도를 들 수 있다. 상기 시그널이 정색의 경우, 상기 시그널값은, 예를 들면, 반사율, 흡광도, 투과율 등을 들 수 있다. 상기 시그널은, 예를 들면, 상기 표지 물질로부터 직접 발해도 되며, 간접적으로 발해도 된다.

상기 표지 물질은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 형광단 등의 형광 표지 물질 등을 들 수 있다. 상기 형광 물질은, 예를 들면, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있다. 시판의 형광 물질은, 예를 들면, Pacific Blue(등록 상표, 몰레큘러프로브사제), BODIPY FL(등록 상표, 몰레큘러프로브사제), FluorePrime(상품명, 아머샴파마시아사제), Fluoredite(상품명, 밀리포어사제), FAM(등록 상표, ABI사제), Cy3 및 Cy5(상품명, 아머샴파마시아사제), TAMRA(등록 상표, 몰레큘러프로브사제) 등을 들 수 있다. 상기 형광 물질의 검출 조건은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 사용하는 형광 물질의 종류에 따라 적절히 결정할 수 있다. 구체예로서, Pacific Blue는, 예를 들면, 검출 파장 450?480㎚, TAMRA는, 예를 들면, 검출 파장 585?700㎚, BODIPY FL은, 예를 들면, 검출 파장 515?555㎚으로 검출할 수 있다. 이러한 표지 프로브를 사용하면, 예를 들면, 시그널로서 형광을 검출하고, 시그널값으로서 형광 강도를 측정하는 것에 의해, 형광 강도의 변동으로부터, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.

상기 표지 프로브는, 예를 들면, 단독으로 시그널을 나타내며, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지 프로브, 또는, 단독으로 시그널을 나타내지 않으며, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지 프로브가 바람직하다. 상기 표지 물질이 형광 물질인 경우, 상기 표지 프로브는, 예를 들면, 상기 형광 물질로 표지화되어, 단독으로 형광을 나타내며, 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예를 들면, 소광)하는 프로브가 바람직하다. 이러한 현상은, 일반적으로, 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)이라고 불린다. 이 현상을 이용한 프로브는, 일반적으로, 형광 소광 프로브라고 불린다. 그 중에서도, 상기 형광 소광 프로브는, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 혹은 5' 말단이 상기 형광 물질로 표지화되어 있는 것이 바람직하고, 표지화되는 상기 말단의 염기는, 시토신(c) 또는 구아닌(g)이 바람직하다. 상기 말단의 염기가 시토신(c)의 경우, 상기 형광 소광 프로브는, 예를 들면, 피검 핵산과 하이브리드를 형성했을 때, 상기 피검 핵산에 있어서의, 표지화된 말단의 시토신(c)과 쌍을 이루는 염기 또는 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1?3염기 떨어진 염기가 구아닌(g)이 되도록, 상기 형광 소광 프로브의 염기 서열을 설계하는 것이 바람직하다. 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1염기 떨어진 염기는, 상기 쌍을 이루는 염기의 이웃 염기를 의미한다. 이러한 프로브는, 일반적으로 구아닌 소광 프로브라고 불리고, 소위 Q Probe(등록 상표)로서 알려져 있다. 상기 구아닌 소광 프로브가 상기 피검 핵산에 하이브리다이즈하면, 예를 들면, 상기 형광 물질로 표지화된 말단의 시토신(c)이, 상기 피검 핵산에 있어서의 구아닌(g)에 가까워지는 것에 의해, 상기 형광 물질의 형광이 약해지는, 즉 형광 강도가 감소하는 현상을 나타낸다. 상기 프로브를 사용하면, 예를 들면, 형광 강도의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 마찬가지로, 상기 말단의 염기가 구아닌(g)의 경우, 상기 형광 소광 프로브는, 예를 들면, 상기 피검 핵산과 하이브리드를 형성했을 때, 상기 피검 핵산에 있어서의, 표지화된 말단의 구아닌(g)과 쌍을 이루는 염기 또는 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1?3염기 떨어진 염기가 시토신(c)이 되도록, 상기 형광 소광 프로브의 염기 서열을 설계하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다형 검출용 프로브는, 예를 들면, 3' 말단에 인산기가 부가되어도 된다. 후술하는 바와 같이, 피검 핵산은, 예를 들면, PCR 등의 핵산 증폭법에 의해 조제할 수 있다. 이때, 본 발명의 다형 검출용 프로브를, 핵산 증폭 반응의 반응계에 공존시켜도 된다. 이와 같은 경우, 상기 다형 검출용 프로브의 3' 말단에 인산기를 부가시켜 두면, 상기 핵산 증폭 반응에 의해 상기 다형 검출용 프로브 자체가 신장하는 것을 충분히 방지할 수 있다. 또한, 상기 다형 검출용 프로브의 3' 말단에, 상술과 같은 표지 물질을 부가하는 것에 의해서도, 같은 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용한 다형의 검출에 있어서, 검출 방법은 조금도 제한되지 않고, 상기 검출 대상 서열과 프로브의 하이브리다이즈를 이용하는 방법이면 된다. 상기 다형의 검출 방법으로서, 이하에, 본 발명의 다형 검출 방법을 설명한다.

<다형 검출 방법>

본 발명의 다형 검출 방법은, 상술과 같이, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용하여, EGFR 유전자의 다형을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFR 유전자의 다형 검출 방법이다.

본 발명의 다형 검출 방법은, 예를 들면, 하기 (A)공정 및 (B)공정을 포함하는 것이 바람직하다.

(A) 피검 핵산과 본 발명의 다형 검출용 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 변화시켜, 상기 피검 핵산과 상기 다형 검출용 프로브의 하이브리드의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정

(B) 상기 온도 변화에 수반하는 상기 시그널값의 변동으로부터, 상기 피검 핵산에 있어서의 상기 다형을 검출하는 공정

본 발명의 다형 검출 방법은, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용하는 것이 특징으로서, 그 외의 구성이나 조건 등은, 이하의 기재에 제한되지 않는다. 본 발명의 다형 검출용 프로브는, 상술과 같이 표지 프로브가 바람직하다. 본 발명에 있어서, 상기 반응계는, 예를 들면, 반응액이다.

본 발명에 있어서, 상기 피검 핵산은, 1본쇄 핵산이어도 되며, 2본쇄 핵산이어도 된다. 상기 피검 핵산이 상기 2본쇄 핵산의 경우, 예를 들면, 후술하는 바와 같이, 상기 (A)공정에 있어서, 상기 반응계를 가열하여, 2본쇄의 피검 핵산을 해리시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 2본쇄 핵산을 1본쇄 핵산으로 해리하는 것에 의해, 본 발명의 다형 검출용 프로브와 상기 1본쇄 핵산이 하이브리다이즈한다.

본 발명에 있어서, 상기 피검 핵산은, 예를 들면, 시료 중에 원래 포함되는 핵산이어도 되며, 상기 핵산의 증폭물이어도 된다. 후자는, 예를 들면, 검출 정밀도를 향상할 수 있으므로 바람직하고, 상기 증폭물은, 예를 들면, 상기 시료 중의 상기 핵산을 주형 핵산으로 하여, 핵산 증폭법에 의해 증폭시킴으로써 조제할 수 있다. 상기 증폭물은, 예를 들면, 상기 시료 중의 DNA를 주형으로 한 증폭물이어도 되며, 상기 시료 중의 RNA로부터 합성한 cDNA를 주형으로 한 증폭물이어도 된다. 상기 시료 중의 RNA는, 예를 들면, 토털 RNA, mRNA 등의 RNA를 들 수 있고, 상기 cDNA는, 예를 들면, 상기 RNA로부터, RT-PCR(Reverse Transcription PCR)에 의해 합성할 수 있다.

본 발명의 다형 검출 방법은, 상기 피검 핵산이 상기 증폭물의 경우, 예를 들면, 하기 (X)공정을 더 포함해도 된다. 상기 (X)공정은, 예를 들면, 상기 (A)공정에 앞서 행하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 (X)공정은, 예를 들면, 상기 다형 검출용 프로브의 존재하, 반응계에 있어서, 상기 주형 핵산으로부터 상기 증폭물을 생성하는 공정이어도 된다.

(X) 주형 핵산으로부터 상기 증폭물을 생성하는 공정

상기 (A)공정에 있어서, 상기 다형 검출용 프로브는, 예를 들면, 상기 반응계에 포함되어 있으면 되며, 그 첨가의 타이밍은, 특별히 제한되지 않는다. 상기 피검 핵산이 상기 증폭물의 경우, 상기 (A)공정에 있어서의 상기 반응계는, 예를 들면, 상기 (X)공정에서 얻어진 상기 증폭물과 상기 다형 검출용 프로브를 사용하여, 새로 조제해도 되며, 상기 (X)공정에 있어서의 상기 증폭 반응의 반응계이어도 된다. 후자의 경우, 상기 다형 검출용 프로브는, 예를 들면, 상기 (X)공정 전 또는 도중에, 상기 증폭 반응의 반응계에 첨가되어도 되며, 상기 (X)공정 후, 상기 증폭 반응의 반응계에 첨가되어도 된다.

상기 핵산 증폭법은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)법, TMA(Transcription-Mediated Amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있고, 그 중에서도, PCR법이 바람직하다. 상기 핵산 증폭법의 조건은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

상기 주형 핵산으로부터의 상기 핵산 증폭물의 생성에는, 상기 EGFR 유전자에 있어서의 검출 목적의 다형을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머의 서열은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 검출 대상 부위를 포함하는 검출 대상 서열을 증폭할 수 있으면 되며, 상기 검출 대상 서열 및 그 주변 서열 등에 따라, 종래 공지의 방법에 따라 적절히 설정할 수 있다. 상기 프라이머의 길이는, 특별히 제한되지 않고, 일반적인 길이로 설정할 수 있고, 예를 들면, 10?30염기 길이를 들 수 있다.

상기 프라이머는, 예를 들면, 유전자의 센스쇄를 증폭하는 포워드 프라이머(이하, 「F프라이머」라고도 한다) 및 안티센스쇄를 증폭하는 리버스 프라이머(이하, 「R프라이머」라고도 한다)의 어느 한쪽을 사용할 수 있지만, 양자를 한쌍으로 하는 프라이머 세트를 사용하는 것이 바람직하다. 이하에, F프라이머 및 R프라이머를 예시하지만, 이들은 일례로서, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

F프라이머

5'-tccaggaagcctacgtgatggccag-3'(서열 번호5)

R프라이머

5'-ccaatattgtctttgtgttcccggacatagtc-3'(서열 번호6)

5'-cgaagggcatgagctgcg-3'(서열 번호7)

5'-ccgaagggcatgagctgca-3'(서열 번호8)

상기 서열 번호7에 나타내는 R프라이머는, 예를 들면, 야생형 EGFR 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머이며, 상기 서열 번호8에 나타내는 R프라이머는, 예를 들면, 변이형 EGFR 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머다. 상기 서열 번호7에 나타내는 프라이머 및 상기 서열 번호8에 나타내는 프라이머는, 예를 들면, 병용해도 된다. 상기 서열 번호에 나타내는 프라이머를, 본 발명의 프라이머라고도 한다.

상기 프라이머의 조합은, 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서는, 서열 번호5에 나타내는 프라이머와 서열 번호6에 나타내는 프라이머의 조합, 서열 번호7에 나타내는 프라이머와 서열 번호8에 나타내는 프라이머의 조합 등을 들 수 있다.

상기 반응계에 있어서, 상기 프라이머의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 1종류의 프라이머에 대해, 예를 들면, 0.1?2μ㏖/L이며, 바람직하게는, 0.25?1.5μ㏖/L이며, 특히 바람직하게는, 0.5?1μ㏖/L이다. 또한, F프라이머와 R프라이머를 사용하는 경우, 상기 F프라이머(F)와 R프라이머(R)의 첨가 비율(몰비 F:R)은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 1:0.25?1:4가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 1:0.5?1:2이다.

상기 (A)공정에 있어서, 상기 피검 핵산에 대한 상기 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 특별히 제한되지 않고, 검출 시그널을 충분히 확보할 수 있으므로, 1배 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 0.1배 이하이다. 이때, 상기 피검 핵산은, 예를 들면, 퍼펙트 매치 서열을 갖는 퍼펙트 매치 핵산과 미스 매치 서열을 갖는 미스 매치 핵산의 합계여도 되며, 퍼펙트 매치 서열을 포함하는 증폭물과 미스 매치 서열을 포함하는 증폭물의 합계여도 된다. 피검 핵산에 있어서의 퍼펙트 매치 핵산의 비율은, 통상, 불분명하지만, 결과적으로, 상기 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 퍼펙트 매치 핵산(퍼펙트 매치 서열을 포함하는 증폭물)에 대해 10배 이하가 되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5배 이하, 더 바람직하게는 3배 이하이다. 또한, 그 하한은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 0.001배 이상이며, 바람직하게는 0.01배 이상이며, 보다 바람직하게는 0.1배 이상이다. 상기 피검 핵산에 대한 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 핵산에 대한 몰비여도 되며, 1본쇄 핵산에 대한 몰비여도 된다.

상기 반응계에 있어서의 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 다형 검출용 프로브를 10?1000n㏖/L의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20?500n㏖/L이다. 또한, 예를 들면, 충분한 시그널값을 확보할 수 있으므로, 상기 반응계에 있어서, 상기 피검 핵산에 대한 상기 다형 검출용 프로브의 몰비는, 예를 들면, 1배 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 0.1배 이하이다. 상기 피검 핵산에 대한 상기 다형 검출용 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 핵산에 대한 몰비여도 되며, 1본쇄 핵산에 대한 몰비여도 된다.

본 발명의 다형 검출 방법을 적용하는 시료는, 특별히 제한되지 않고, 생체 시료를 들 수 있다. 상기 생체 시료의 구체예는, 예를 들면, 전혈, 백혈구 세포 등의 혈구, 구강 점막 등의 구강내 세포, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 객담, 양수, 파라핀 포매 조직, 요, 위액, 위세정액 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 시료의 채취 방법, 상기 시료로부터의 피검 핵산의 조제 방법 등은, 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다.

본 발명의 다형 검출 방법은, 상술과 같은, 소위 Tm 해석에 이용할 수 있다. Tm 해석에 있어서의 Tm값에 대하여 설명한다. 예를 들면, 2본쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이는, 2본쇄 DNA에 있어서의 양쇄간의 수소 결합이 가열에 의해 풀어지고, 1본쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는, 가열 개시시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타낸다. 이에 의해, 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. 이 현상에 의거하여, 융해 온도Tm은, 일반적으로, 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다.

상기 (A)공정에 있어서, 상기 피검 핵산과 상기 다형 검출용 프로브의 하이브리드의 융해 상태를 나타내는 시그널의 측정은, 예를 들면, 상술한, 260㎚에 있어서의 흡광도 측정이어도 되며, 상기 표지 물질의 시그널 측정이어도 된다. 구체적으로는, 상기 다형 검출용 프로브로서, 상술한 바와 같이, 상기 표지 물질로 표지화된 표지 프로브를 사용하고, 상기 표지 물질의 시그널 측정을 행하는 것이 바람직하다. 상기 표지 프로브는, 예를 들면, 단독으로 시그널을 나타내며, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지 프로브, 또는, 단독으로 시그널을 나타내지 않으며, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 상기 증폭물과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않고, 가열에 의해 상기 증폭물로부터 상기 프로브가 해리하면 시그널을 나타낸다. 또한, 후자의 프로브이면, 상기 증폭물과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하는 것에 의해 시그널을 나타내고, 가열에 의해 상기 증폭물로부터 상기 프로브가 해리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 상기 표지 물질의 시그널의 검출에 의해, 상기 260㎚에 있어서의 흡광도 측정과 같이, 하이브리드의 융해의 진행의 검출, Tm값의 결정 등을 행할 수 있다. 상기 표지 물질의 시그널 검출은, 예를 들면, 상기 표지 물질의 시그널에 특유한 조건으로 검출하면 된다. 상기 조건은, 예를 들면, 여기 파장, 검출 파장 등을 들 수 있다. 상기 표지 프로브 및 상기 표지 물질은, 상술과 같다.

다음으로, 본 발명의 다형 검출 방법에 대해, 일례를 들어서 설명한다. 본 예는, 본 발명의 다형 검출용 프로브로서, 형광 물질로 표지된 표지 프로브를 사용하고, 상기 다형 검출용 프로브의 존재하, 주형 핵산의 증폭을 행하고, 얻어진 증폭물을, 상기 피검 핵산으로 하는 예이다. 본 발명의 다형 검출 방법은, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용하는 것 자체가 특징이며, 그 외의 공정 및 조건에 대해서는 조금도 제한되지 않는다.

우선, 상기 생체 시료로부터 게놈 DNA를 단리한다. 상기 생체 시료로부터의 게놈 DNA의 단리는, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 구체예로서는, 예를 들면, 시판의 게놈 DNA 단리 키트(상품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE헬스케어바이오사이엔스사제) 등을 사용할 수 있다.

다음으로, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 시료에 표지 프로브를 첨가하여, 반응액을 조제한다. 상기 표지 프로브는, 예를 들면, 상술과 같이, Q Probe(등록 상표)가 바람직하다.

상기 표지 프로브는, 예를 들면, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 시료에 첨가해도 되며, 용매 중에서 게놈 DNA와 혼합해도 된다. 상기 용매는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, Tris-HCl 등의 완충액, KCl, MgCl₂, MgSO₄, 글리세롤 등을 포함하는 용매, PCR용의 반응액 등의 핵산 증폭용 반응액 등, 종래 공지의 것을 들 수 있다.

상기 표지 프로브의 첨가의 타이밍은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 핵산 증폭 반응 전, 도중 또는 후에 첨가할 수 있다. 그 중에서도, 예를 들면, 상기 표지 프로브의 첨가를 위해 상기 반응액을 외부 환경에 노출할 필요가 없으며, 또한, 상기 핵산 증폭 반응과 시그널값의 측정을, 연속적으로 행하는 것이 가능하기 때문에, 상기 핵산 증폭 반응 전에 상기 반응액에 첨가하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 표지 프로브는, 상술과 같이, 그 3' 말단이 표지 물질 또는 인산기로 수식되어 있는 것이 바람직하다.

이어서, 단리한 게놈 DNA를 주형으로서, 상기 표지 프로브의 존재하, PCR 등의 핵산 증폭법에 의해, 검출 목적의 다형을 포함하는 검출 대상 서열을 증폭시킨다. 이하, 핵산 증폭법으로서 PCR을 예로 들어 설명하지만, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다. 또한, PCR의 조건은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

구체적으로는, 상기 게놈 DNA, 상기 표지 프로브 및 상기 프라이머를 포함하는 상기 반응액에 대해, PCR을 행한다. 상기 반응액의 조성은, 특별히 제한되지 않고, 당업자라면 적절히 설정할 수 있다. 상기 반응액은, 예를 들면, 상기 게놈 DNA, 상기 표지 프로브 및 상기 프라이머 외에, DNA 폴리머라제 등의 폴리머라제, 뉴클레오티드 3인산, 완충액, 각종 촉매 등을 포함해도 된다. 상기 반응액에 있어서의 상기 표지 프로브 및 상기 프라이머의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 각각, 상술의 범위를 들 수 있다.

상기 DNA 폴리머라제는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 종래 공지의 내열성 세균 유래의 폴리머라제를 사용할 수 있다. 구체예로서, 예를 들면, 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래 DNA 폴리머라제(미국 특허 제4,889,818호 및 동(同) 제5,079,352호)(상품명 Taq 폴리머라제), 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) 유래 DNA 폴리머라제(WO 91/09950)(rTth DNA polymerase), 파이로코쿠스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 DNA 폴리머라제(WO 92/9689)(Pfu DNA polymerase : Stratagenes사제), 테르모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) 유래 폴리머라제(EP-A455 430(상표 Vent) : New England Biolabs사제) 등이 상업적으로 입수 가능하며, 그 중에서도, 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래의 내열성 폴리머라제가 바람직하다.

상기 반응액에 있어서의 DNA 폴리머라제의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 1?100U/㎖이며, 바람직하게는, 5?50U/㎖이며, 보다 바람직하게는, 20?40U/㎖이다. DNA 폴리머라제의 활성 단위(U)는, 일반적으로, 활성화 연어 정자 DNA를 주형 프라이머로서, 활성 측정용 반응액 중, 74℃에서, 30분 간에 10n㏖의 전 뉴클레오티드를 산불용성 침전물에 취입하는 활성이 1U이다. 상기 활성 측정용 반응액의 조성은, 예를 들면, 25m㏖/L TAPS buffer(pH9.3, 25℃), 50m㏖/L KCl, 2m㏖/L MgCl₂, 1m㏖/L 메르캅토에탄올, 200μ㏖/L dATP, 200μ㏖/L dGTP, 200μ㏖/L dTTP, 100μ㏖/L 「α-³²P」dCTP, 0.25mg/㎖ 활성화 연어 정자 DNA이다.

상기 뉴클레오티드 3인산은, 통상, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 또는 dUTP)를 들 수 있다. 상기 반응액 중의 dNTP의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 0.01?1m㏖/L이며, 바람직하게는, 0.05?0.5m㏖/L이며, 보다 바람직하게는, 0.1?0.3m㏖/L이다.

상기 완충액은, 예를 들면, Tris-HCl, Tricine, MES, MOPS, HEPES, CAPS 등을 들 수 있어, 시판의 PCR용 완충액 및 시판의 PCR 키트의 완충액 등을 사용할 수 있다.

상기 반응액은, 또한, 헤파린, 베타인, KCl, MgCl₂, MgSO₄, 글리세롤 등을 포함해도 되며, 이들 첨가 비율은, 예를 들면, PCR 반응을 저해하지 않는 범위에서 설정하면 된다.

상기 반응액의 전체적은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 서멀사이클러 등의 사용하는 기기 등에 따라 적절히 설정할 수 있지만, 통상, 1?500㎕이며, 바람직하게는 10?100㎕이다.

다음으로, PCR을 행한다. 상기 PCR의 사이클 조건은, 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서, 예를 들면, (1) 피검 핵산인 2본쇄 DNA의 1본쇄 DNA로의 해리, (2) 상기 1본쇄 DNA로의 프라이머의 어닐링, (3) 폴리머라제 반응에 의한 상기 프라이머의 신장은, 각각, 하기 표 1의 조건을 예시할 수 있다. PCR의 사이클수는, 특별히 제한되지 않고, 하기 (1)?(3)의 3스텝을 1사이클로 하여, 예를 들면, 30사이클 이상이 바람직하다. 상기 사이클수의 합계의 상한은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 100사이클 이하, 바람직하게는 70사이클 이하, 더 바람직하게는, 50사이클 이하이다. 각 스텝의 온도 변화는, 예를 들면, 서멀사이클러 등을 사용하여 자동적으로 제어할 수 있다.

[표 1]

상기 반응액에 있어서의 상기 표지 프로브의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 표지 프로브를 10?1000n㏖/L의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20?500n㏖/L이다. 예를 들면, 충분한 시그널값을 확보할 수 있으므로, 상기 반응액에 있어서, 상기 피검 핵산에 대한 상기 표지 프로브의 몰비는, 예를 들면, 1배 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 0.1배 이하이다. 상기 피검 핵산에 대한 상기 표지 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 핵산에 대한 몰비여도 되며, 1본쇄 핵산에 대한 몰비여도 된다.

다음으로, 얻어진 증폭물(2본쇄 DNA)의 해리, 및, 해리에 의해 얻어진 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브의 하이브리다이즈를 행한다. 이는, 예를 들면, 상기 표지 프로브의 존재하, 상기 반응액의 온도를 변화시키는 것으로 행할 수 있다. 이 경우, 상술과 같이, 미리 상기 표지 프로브를 첨가한 상기 반응액에 대해, 증폭 반응을 행한 후, 상기 반응액을 온도 변화시키는 것이 바람직하다.

상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도는, 예를 들면, 2본쇄의 상기 증폭물을 1본쇄로 해리할 수 있는 온도를 들 수 있다. 상기 가열 온도는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 85?95℃이다. 가열 시간은, 특별히 제한되지 않고, 통상, 1초?10분이며, 바람직하게는 1초?5분이다.

해리한 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브의 하이브리다이즈는, 예를 들면, 상기 해리 공정 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시키는 것에 의해 행할 수 있다. 온도 조건은, 예를 들면, 40?50℃이다. 상기 온도에서의 처리 시간은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 1?600초이다.

그리고, 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 증폭물과 상기 표지 프로브의 하이브리드의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정한다. 구체적으로는, 예를 들면, 상기 반응액을 가열하고, 즉, 상기 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브의 하이브리드를 가열하고, 온도 상승에 수반하는 시그널값의 변동을 측정한다. 상술과 같이, 구아닌 소광 프로브, 즉, 말단의 시토신(c)이 표지화된 프로브를 사용했을 경우, 1본쇄 DNA와 하이브리다이즈한 상태에서는, 형광이 감소(또는 소광)하고, 해리한 상태에서는, 형광을 발한다. 따라서, 예를 들면, 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드를 서서히 가열하고, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

상기 형광 강도의 변동을 측정할 때, 그 온도 범위는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 개시 온도는, 예를 들면, 실온?85℃이며, 바람직하게는, 25?70℃이며, 종료 온도는, 예를 들면, 40?105℃이다. 온도의 상승 속도는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 0.1?20℃/초이며, 바람직하게는, 0.3?5℃/초이다.

다음으로, 상기 시그널값의 변동을 해석하여 Tm값을 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터, 각 온도에 있어서의 단위 시간당의 형광 강도 변화량(-d형광 강도 변화량/dt 또는 d형광 강도 변화량/dt)을 산출하고, 가장 변화한 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 상기 표지 프로브가 상기 형광 소광 프로브의 경우, 예를 들면, 형광 강도의 증가량을 측정하고, 단위 시간당의 형광 강도 증가량(-d형광 강도 증가량/dt)이 가장 낮은 값을 나타내는 온도, 또는, 단위 시간당의 형광 강도 증가량(d형광 강도 증가량/t)이 가장 높은 값을 나타내는 온도를, Tm값으로서 결정할 수도 있다. 한편, 상기 표지 프로브로서, 상기 형광 소광 프로브가 아니라, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 프로브를 사용한 경우는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.

상기 Tm값은, 예를 들면, 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/) 등에 의해 산출할 수 있으며, 또한, 최근접 염기쌍법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있다.

그리고, 상기 Tm값으로부터, 상기 검출 대상 서열에 있어서, 서열 번호1에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서의 염기 번호347의 염기가, 상기 야생형인지, 상기 변이형인지를 결정한다. 상기 Tm 해석에서는, 예를 들면, 완전히 상보인 하이브리드(매치)는, 1염기 이상이 다른 하이브리드(미스 매치)보다도, 해리를 나타내는 Tm값이 높아진다고 하는 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 미리, 상기 표지 프로브에 대해, 퍼펙트 매치의 하이브리드의 Tm값과, 미스 매치의 하이브리드의 Tm값을 결정해 둔다. 전자는, 상기 표지 프로브가, 서열 번호2에 있어서의 17번째의 염기(g)를 제외하고, 상기 검출 대상 서열과 완전히 상보인 퍼펙트 매치의 하이브리드의 Tm값이다. 후자는, 상기 표지 프로브가, 서열 번호2에 있어서의 9번째의 염기(r) 및 17번째의 염기(g)를 제외하고, 상기 검출 대상 서열과 완전히 상보인 미스 매치의 하이브리드의 Tm값, 즉, 상기 표지 프로브의 상기 9번째의 염기(r) 및 상기 17번째의 염기(g)에 있어서 상기 미스 매치가 되는 미스 매치 하이브리드의 Tm값이다. 이에 의해, 상기 검출 대상 서열의 염기가, 상기 야생형인지, 상기 변이형을 포함하는지를 결정할 수 있다.

본 발명은, 상술과 같이, 상기 다형 검출용 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 상승시키고, 즉, 하이브리드를 가열하여, 온도 상승에 수반하는 시그널 변동을 측정하는 방법 대신에, 예를 들면, 하이브리드 형성시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 다형 검출용 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 강하시켜서 하이브리드를 형성할 때에, 상기 온도 강하에 수반하는 시그널 변동을 측정해도 된다.

구체예로서, 단독으로 시그널을 나타내며, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지 프로브(예를 들면, 구아닌 소광 프로브)를 사용했을 경우를 예로 든다. 이 경우, 상기 표지 프로브는, 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브가 해리하고 있는 상태에서는 형광을 발하고 있지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 상기 반응액의 온도를 서서히 강하시켜서, 온도 하강에 수반하는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다. 한편, 단독으로 시그널을 나타내지 않으며, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지 프로브를 사용했을 경우, 상기 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브가 해리하고 있는 상태에서는 형광을 발하고 있지 않지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광을 발하게 된다. 따라서, 예를 들면, 상기 반응액의 온도를 서서히 강하시켜서, 온도 하강에 수반하는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

<다형 검출용 시약>

본 발명의 다형 검출용 시약은, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFR 유전자의 다형 검출용 시약이다. 본 발명에 있어서는, 상술의 본 발명의 다형 검출용 프로브를 포함하는 것이 특징이며, 그 외의 구성 및 조건은 조금도 제한되지 않는다.

본 발명의 다형 검출용 시약은, 또한, EGFR 유전자에 있어서의 상기 검출 목적 부위를 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머 또는 프라이머 세트를 포함해도 된다. 상기 프라이머는, 예를 들면, 상기의 것을 들 수 있다.

본 발명의 다형 검출용 시약은, 이 외에도, 예를 들면, 핵산 증폭 반응에 필요한 성분을 포함해도 된다. 구체예로서는, 예를 들면, DNA 폴리머라제 등의 폴리머라제, 뉴클레오티드 3인산, 완충액, 각종 촉매 등을 들 수 있다. 본 발명의 다형 검출용 시약에 있어서, 각 성분은, 예를 들면, 동일한 용기에 수용되어도 되며, 다른 용기에 수용되어도 된다.

본 발명의 다형 검출용 시약은, 예를 들면, EGFR 유전자의 다형의 검출에 사용하는 프로브 키트라고도 할 수 있다. 본 발명의 다형 검출용 키트에 있어서, 각 성분은, 예를 들면, 동일한 용기에 수용되어도 되며, 다른 용기에 수용되어도 된다. 본 발명의 다형 검출 키트는, 또한, 사용 설명서를 포함해도 된다.

본 발명의 EGFR 유전자 증폭용 프라이머는, 상술과 같으며, 서열 번호5?8에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머의 적어도 하나이다. 본 발명의 증폭 방법은, 반응계에 있어서, 시료 중의 핵산을 주형으로서, 본 발명의 EGFR 유전자 증폭용 프라이머를 사용하여, 상기 EGFR 유전자의 증폭을 행하는 증폭 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFR 유전자의 증폭 방법이다. 본 발명의 증폭물의 검출 방법은, 본 발명의 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하고, 본 발명의 EGFR 유전자의 증폭 방법에 의해, EGFR 유전자를 증폭시키는 증폭 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFR 유전자의 증폭물을 검출하는 증폭물 검출 방법이다. 본 발명의 검출 방법은, 예를 들면, 또한, 본 발명의 프로브를 사용하여, 상기 EGFR 유전자의 증폭물을 검출하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 프라이머 및 이를 사용한 각종 방법은, 상술의 기재를 참조할 수 있다.

다음으로, 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다. 본 발명은, 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다. 하기 실시예에 있어서, 특별히 나타내지 않는 한, ％는, w/v%를 나타낸다.

[실시예]

[실시예1]

본 예에서는, 야생형 플라스미드와, 변이형 플라스미드의 공존 하에서, Tm 해석을 행하고, EGFR 유전자 다형을 검출했다.

야생형 플라스미드(wt) 및 변이형 플라스미드(mt)를 제작했다. 상기 wt는, 서열 번호1의 염기 번호347의 염기y가 시토신(c)인 야생형 EGFR 유전자의 부분 서열(서열 번호1의 염기 번호197?496)을 삽입한 플라스미드로 했다. 상기 mt는, 상기 염기 번호347의 염기y가 티민(t)으로 변이한 변이형 EGFR 유전자의 부분 서열(서열 번호1의 염기 번호197?496)을 삽입한 플라스미드로 했다. 양자를 소정의 비율로 혼합하고, 복수의 핵산 시료를 조제했다. 상기 핵산 시료에 있어서의 상기 mt 함유 비율은, 각각, 5%, 3% 및 0%로 했다.

튜브 내에, 상기 핵산 시료 1㎕(1×10³?1×10⁴카피/㎕) 및 하기 표 2의 반응 시약 49㎕를 첨가하고, PCR 반응액으로 했다. 상기 PCR 반응액에 대해, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(등록 상표), 아크레이사제)를 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 상기 PCR은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃ 1초 및 62℃ 15초를 1사이클로 하여 50사이클 반복, 또한, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리했다. 그리고, 이어서, 온도의 상승 속도를 1℃/3초로 하여, 상기 PCR 반응액을 40℃부터 75℃로 가열해 가고, 경시적인 형광 강도의 변화(검출 파장 565?605㎚)를 측정하고, Tm 해석을 행했다.

[표 2]

상기 F프라이머 및 R프라이머는, 하기 서열의 프라이머를 사용했다.

F프라이머1(서열 번호5)

5'-tccaggaagcctacgtgatggccag-3'

R프라이머1(서열 번호6)

5'-ccaatattgtctttgtgttcccggacatagtc-3'

상기 다형 검출용 프로브는, 하기 서열의 프로브를 사용했다. 상기 다형 검출용 프로브는, 서열 번호1의 염기 번호347의 염기y가 티민(t)으로 변이한 변이형 EGFR 유전자의 센스쇄에, 17번째의 염기(g)를 제외하고, 퍼펙트 매치하는 서열이다. 하기 서열에 있어서, 대문자에서 나타낸 염기A는, 상기 염기 번호347의 염기 티민(t)에 대응한다. 또한, 3' 말단의 TAMRA는, 형광 물질이다.

다형 검출용 프로브1(서열 번호3)

5'-tgagctgcAtgatgaggtgcac-(TAMRA)-3'

이들 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1은, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 1에 있어서, (A)는 wt 100%(mt 0%), (B)는 mt 3%, (C)는 mt 5%의 결과이다. 가로축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 세로축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 한다)를 나타내고, 단위는 「d형광 강도 증가량/dt」로 했다. 형성되는 하이브리드가, 상기 다형 검출용 프로브에 있어서의 17번째의 염기(g)를 제외하고, 퍼펙트 매치의 경우, 평가 기준이 되는 Tm은, 이하와 같다. wt의 Tm값은, 59℃, mt의 Tm값은, 66℃이다.

도 1(A)에 나타낸 바와 같이, wt 100%의 시료에 대해서는, wt의 Tm값에서만 피크가 확인되었다. 그리고, 도 1(B) 및 (C)에 나타낸 바와 같이, 변이형 플라스미드를 포함하는 반응액은, wt의 Tm값 및 mt의 Tm값의 양쪽에서, 피크가 확인되었다. 이와 같이, 본 실시예의 다형 검출용 프로브를 사용하면, wt 및 mt가 공존하는 시료에 있어서도, 양쪽의 다형을 검출 가능한 것을 알 수 있었다. 또한, 상기 시료에 있어서, mt의 함유량이 적은 경우에도, mt의 Tm값에 있어서, 피크를 확인할 수 있었다. 이 때문에, 본 실시예의 다형 검출용 프로브에 의하면, mt의 함유량이 적은 경우여도, 변이형의 다형을 감도 좋게 검출 가능한 것을 알 수 있었다.

[실시예2]

본 예에서는, 야생형 플라스미드(wt)와, 또한 저농도의 변이형 플라스미드(mt)의 공존 하에서, Tm 해석을 행하고, EGFR 유전자 다형을 검출했다.

본 예에서는, 상기 핵산 시료에 있어서의 mt의 함유 비율을, 각각, 0.5%, 0.3% 및 0%로 하고, 상기 R프라이머로서, 100μ㏖/L의 하기 R프라이머2 및 R프라이머3을, 각각 0.125㎕ 첨가하고, PCR의 조건을, 95℃에서 60초한 후, 95℃ 1초 및 64℃ 15초를 1사이클로 하여 50사이클 반복, 또한, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리한 이외는, 상기 실시예1과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.

R프라이머2(서열 번호7)

5'-cgaagggcatgagctgcG-3'

R프라이머3(서열 번호8)

5'-ccgaagggcatgagctgcA-3'

상기 R프라이머2는, 야생형 EGFR 유전자를 증폭하는 프라이머이며, 상기 R프라이머3은, 변이형 EGFR 유전자를 증폭하는 프라이머이다. 양자 모두, 3' 말단의 염기가, 각각, 서열 번호1에 나타내는 서열의 염기 번호347의 염기(y=c, t)에 대응한다.

이들 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2는, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 2에 있어서, (A)는 wt 100%(mt 0%), (B)는 mt 0.3%, (C) mt 0.5%의 결과이다. 가로축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 세로축은 형광 강도의 변화(형광 변화량)를 나타내고, 단위는 「d형광 강도 증가량/dt」로 했다. 평가 기준이 되는 Tm은, 상기와 같고, wt의 Tm값은, 59℃, mt의 Tm값은, 66℃이다.

도 2(A)에 나타낸 바와 같이, wt 100%의 시료에 대해서는, wt의 Tm값에서만 피크가 확인되었다. 그리고, 도 2(B) 및 (C)에 나타낸 바와 같이, 변이형 플라스미드를 포함하는 반응액은, wt의 Tm값 및 mt의 Tm값의 양쪽에서, 피크가 확인되었다. 이와 같이, 본 실시예의 다형 검출용 프로브를 사용하면, wt 및 mt가 공존하는 시료에 있어서도, 양쪽의 다형을 검출 가능했다. 또한, 상기 시료에 있어서, mt 함유량이 더 적은 경우에도, mt의 Tm값에 있어서, 피크를 확인할 수 있었다. 즉, 본 실시예에서는, 변이형 플라스미드가, 상기 실시예1보다 더 저농도여도, 고감도로 해석 가능했다.

[비교예]

본 예에서는, 상기 다형 검출용 프로브로서, 하기 다형 검출용 프로브2?7을 각각 사용한 이외는, 상기 실시예1과 같이 하여, Tm 해석에 의해, EGFR 유전자의 다형을 검출했다.

다형 검출용 프로브2(서열 번호9)

5'-(TAMRA)-catgagctgcAtgatgag-P-3'

다형 검출용 프로브3(서열 번호10)

5'-(TAMRA)-catgagctgcAtgatgaggtgca-P-3'

다형 검출용 프로브4(서열 번호11)

5'-ctgcAtgatgaggtgcac-(TAMRA)-3'

다형 검출용 프로브5(서열 번호12)

5'-(TAMRA)-catcaTgcagctcat-P-3'

다형 검출용 프로브6(서열 번호13)

5'-(TAMRA)-catcaTgcagctca-P-3'

다형 검출용 프로브7(서열 번호14)

5'-(TAMRA)-ctcatcaTgcagct-P-3'

상기 다형 검출용 프로브로서, 상기 다형 검출용 프로브2?7을 사용했을 경우, wt 100%, mt 3% 및 mt 5%의 핵산 시료를 포함하는, 모든 PCR 반응액에 대해, 형광이 소광하지 않고, 형광 변화량의 피크를 확인할 수 없었다. 즉, 본 예의 프로브를 사용했을 경우, Tm 해석에 의해, EGFR 유전자의 다형을 검출할 수 없었다.

이상과 같이, 본 발명에 의하면, EGFR 유전자의 다형을, 예를 들면, Tm 해석에 의해, 간편하고 뛰어난 신뢰성으로 판별할 수 있다. 본 발명은, 정상형 EGFR 유전자와 변이형 EGFR 유전자를 양쪽 포함하는 시료에 대해, 특히 유용하다. 이와 같이, 본 발명에 의하면, EGFR 유전자의 다형을, 간편하고 뛰어난 신뢰성으로 판별할 수 있으므로, 예를 들면, 검출 결과를 상술과 같은 항암제의 투여에 의한 치료에 반영할 수도 있다. 따라서, 본 발명은, 의료 분야 등에 있어서 극히 유용하다고 할 수 있다.

이상, 실시 형태 및 실시예를 참조하여, 본 발명을 설명했지만, 본 발명은, 상기 발명의 스코프 내에서 당업자가 이해할 수 있는 다양한 변경을 할 수 있다.

이 출원은, 2009년 10월 30일에 출원된 일본 출원 특원2009-251184를 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시의 전부를 여기에 편입한다.

SEQUENCE LISTING <110> Arkray, Inc. <120> PROBE FOR DETECTING POLYMORPHISM IN EGFR GENES, AND USAGE THEREFOR <130> TF10045-00WO <150> JP 2009-251184 <151> 2009-10-30 <160> 23 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1020 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tggccactgt tgcctgggcc tctctgtcat ggggaatccc cagatgcacc caggaggggc 60 cctctcccac tgcatctgtc acttcacagc cctgcgtaaa cgtccctgtg ctaggtcttt 120 tgcaggcaca gcttttcctc catgagtacg tattttgaaa ctcaagatcg cattcatgcg 180 tcttcacctg gaaggggtcc atgtgcccct ccttctggcc accatgcgaa gccacactga 240 cgtgcctctc cctccctcca ggaagcctac gtgatggcca gcgtggacaa cccccacgtg 300 tgccgcctgc tgggcatctg cctcacctcc accgtgcagc tcatcaygca gctcatgccc 360 ttcggctgcc tcctggacta tgtccgggaa cacaaagaca atattggctc ccagtacctg 420 ctcaactggt gtgtgcagat cgcaaaggta atcagggaag ggagatacgg ggaggggaga 480 taaggagcca ggatcctcac atgcggtctg cgctcctggg atagcaagag tttgccatgg 540 ggatatgtgt gtgcgtgcat gcagcacaca cacattcctt tattttggat tcaatcaagt 600 tgatcttctt gtgcacaaat cagtgcctgt cccatctgca tgtggaaact ctcatcaatc 660 agctaccttt gaagaatttt ctctttattg agtgctcagt gtggtctgat gtctctgttc 720 ttatttctct ggaattcttt gtgaatactg tggtgatttg tagtggagaa ggaatattgc 780 ttcccccatt caggacttga taacaaggta agcaagccag gccaaggcca ggaggaccca 840 ggtgatagtg gtggagtgga gcaggtgcct tgcaggaggc ccagtgagga ggtgcaagga 900 gctgacagag ggcgcagctg ctgctgctat gtggctgggg ccttggctaa gtgtccccct 960 ttccacaggc tcgctccaga gccagggcgg ggctgagaga gcagagtggt caggtagccc 1020 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 2 tgagctgcrt gatgaggtgc ac 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 3 tgagctgcat gatgaggtgc ac 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 4 tgagctgcgt gatgaggtgc ac 22 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 tccaggaagc ctacgtgatg gccag 25 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 6 ccaatattgt ctttgtgttc ccggacatag tc 32 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 cgaagggcat gagctgcg 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 ccgaagggca tgagctgca 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 9 catgagctgc atgatgag 18 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 10 catgagctgc atgatgaggt gca 23 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 11 ctgcatgatg aggtgcac 18 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 12 catcatgcag ctcat 15 <210> 13 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 13 catcatgcag ctca 14 <210> 14 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 14 ctcatcatgc agct 14 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 15 tgagctgcrt gatgaggtgc acg 23 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 16 tgagctgcrt gatgaggtgc acgg 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 17 tgagctgcrt gatgaggtgc acggt 25 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 18 tgagctgcat gatgaggtgc acg 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 19 tgagctgcgt gatgaggtgc acg 23 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 20 tgagctgcat gatgaggtgc acgg 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 21 tgagctgcgt gatgaggtgc acgg 24 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 22 tgagctgcat gatgaggtgc acggt 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 23 tgagctgcgt gatgaggtgc acggt 25

Claims

하기 (P1)의 올리고뉴클레오티드 및 (P2)의 올리고뉴클레오티드의 적어도 한쪽을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFR 유전자의 다형 검출용 프로브.
(P1) 염기 길이가, 22?50염기 길이이며, 서열 번호1에 있어서의 염기 번호334?355를 포함하는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지고, 상기 염기 번호334의 염기에 상보적인 염기를, 3' 말단 영역에 갖는 올리고뉴클레오티드
(P2) 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
제1항에 있어서,
상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드가, 상기 염기 번호334의 염기에 상보적인 염기를, 3' 말단으로부터 세어 1?4번째의 위치에 갖는 다형 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호2, 서열 번호15, 서열 번호16 및 서열 번호17 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드인 다형 검출용 프로브.
tgagctgcrtgatgaggtgcac(서열 번호2)
tgagctgcrtgatgaggtgcacg(서열 번호15)
tgagctgcrtgatgaggtgcacgg(서열 번호16)
tgagctgcrtgatgaggtgcacggt(서열 번호17)
제1항에 있어서,
상기 프로브가, 형광 표지 물질을 갖는 표지 프로브인 다형 검출용 프로브.
제4항에 있어서,
상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드가, 3' 말단 영역에, 상기 형광 표지 물질을 갖고, 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단 영역에, 상기 형광 표지 물질을 갖는 다형 검출용 프로브.
제4항에 있어서,
상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드가, 3' 말단으로부터 세어 1?4번째의 염기의 위치에, 상기 형광 표지 물질을 갖고,
상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단으로부터 세어 1?4번째의 염기의 위치에, 상기 형광 표지 물질을 갖는 다형 검출용 프로브.
제4항에 있어서,
상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드가, 상기 염기 번호334의 염기에 상보적인 염기에, 상기 형광 표지 물질을 갖고,
상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호1에 있어서의 염기 번호334의 염기에, 상기 형광 표지 물질을 갖는 다형 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 다형 검출용 프로브가, Tm 해석용의 프로브인 다형 검출용 프로브.
제1항에 기재된 다형 검출용 프로브를 사용하여, EGFR 유전자의 다형을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, EGFR 유전자의 다형 검출 방법.
제9항에 있어서,
하기 (A)공정 및 (B)공정을 포함하는 다형 검출 방법.
(A) 피검 핵산과 제1항에 기재된 다형 검출용 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 변화시켜, 상기 피검 핵산과 상기 다형 검출용 프로브의 하이브리드의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정
(B) 상기 온도 변화에 수반하는 상기 시그널값의 변동으로부터, 상기 피검 핵산에 있어서의 상기 다형을 결정하는 공정
제10항에 있어서,
상기 (A)공정에 있어서, 상기 피검 핵산이, 주형 핵산으로부터의 증폭물인 다형 검출 방법.
제11항에 있어서,
상기 주형 핵산으로부터 핵산 증폭물을 생성하는 공정을 더 포함하는 다형 검출 방법.
제12항에 있어서,
상기 (A)공정이, 상기 다형 검출용 프로브의 존재하, 반응계에 있어서, 상기 주형 핵산으로부터 상기 핵산 증폭물을 생성하는 공정을 더 갖고, 상기 생성 공정에 있어서의 상기 반응계의 온도를 변화시켜, 상기 시그널값의 측정을 행하는 다형 검출 방법.