KR20120054037A

KR20120054037A - 돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신 및 그러한 백신의 수득 방법

Info

Publication number: KR20120054037A
Application number: KR1020127005761A
Authority: KR
Inventors: 헨리쿠스 레오 베르나르두스 마리아 클라센
Original assignee: 인터벳 인터내셔널 비.브이.
Priority date: 2009-08-06
Filing date: 2010-08-05
Publication date: 2012-05-29
Also published as: US20120128712A1; TW201109439A; BR112012002583A2; JP5847713B2; TWI548746B; EP2461823B1; MX2012001577A; CN102481350A; WO2011015614A1; RU2012108227A; ES2492675T3; BR112012002583B1; EP2461823A1; EP2769734A1; JP2013501028A; KR101790357B1; MX336974B; RU2554812C2; CN102481350B; US20160213768A1

Abstract

본 발명은 리포폴리사카라이드를 포함하는, 돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신에 관한 것이며, 여기서, 백신은 리포폴리사카라이드에서 생긴 내독소 쇼크의 증상을 감소시키기 위하여 폴리믹신을 포함한다. 또한 본 발명은 그러한 백신을 수득하는 방법 및 백신을 대상체 동물에게 투여하는 방법에 관한 것이다.

Description

돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신 및 그러한 백신의 수득 방법{A VACCINE DIRECTED AGAINST PORCINE PLEUROPNEUMONIA AND A METHOD TO OBTAIN SUCH A VACCINE}

본 발명은 양돈 산업에 상당한 경제적 손실을 야기하는 전 세계적인 질환인 돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신에 관한 것이다. 돼지 흉막폐렴의 병인체는 파스테우렐라세아에 (Pasteurellaceae) 과에 속하는 그람-음성 박테리아인 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에 (Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)이다. 이 질환은 에어로졸 경로에 의해 또는 감염된 돼지와의 직접적인 접촉에 의해 전파되며, 출혈성, 섬유소성 및 괴사성 폐 병변을 특징으로 한다. 임상상은 과급성 내지 만성의 범위일 수 있으며, 무증상 보균 돼지는 감염되지 않은 짐승의 무리 내로 도입될 경우 상기 질환을 전파할 수 있다. 캡슐 폴리사카라이드 및 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS) O-사슬 성분을 기반으로 하여 15가지의 혈청형 (serovar)이 기술되었다. 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에에 대한 혈청형 결정 및 기타 유전자형 결정 방법은 감시 및 유행병 연구에 크게 기여하였다. 이들 도구는 상기 박테리아의 병독성 유형의 박멸을 지향하는 구제 프로그램에 있어서 의사 결정에 대하여 중요한 정보를 제공한다. 북미에서는 혈청형 1, 5 및 7이 가장 만연한 것으로 보고된 반면, 혈청형 2 및 9는 유럽에서 가장 일반적으로 단리되고, 혈청형 15는 오스트레일리아 돼지 유래의 우세한 단리체이다.

에이. 플레우로뉴모니아에에 대하여 기술된 병독 인자는 LPS, 캡슐 폴리사카라이드, Apx 독소 I-IV (소위 독소 또는 RTX 독소 내의 반복체), 외막 단백질 (outer membrane protein, OMP) 및 다양한 철 획득 시스템을 포함한다. 그러나, 이 박테리아의 발병 기작이 그러하듯이 감염 과정에 대한 각각의 성분의 전체 기여도는 여전히 불분명하다. 에이. 플레우로뉴모니아에에 대한 현재 이용가능한 백신들 중 거의 모두는 임의로 외막 분획물과 조합된, Apx 독소 및 단백질의 불활성화된 전세포 박테린 또는 서브유닛 조합물이다. 어떠한 경우에서든, 바람직하게는 상이한 혈청형들을 교차하여 적당한 보호를 수득하기 위해서는, 리포폴리사카라이드 (LPS)가 백신에 존재하여야 한다는 것이 일반적으로 이해되었다 (문헌[Julien Goure et al., BMC Genomics 2009, 10:88, published 24 February 2009]; [Dubreuil et al., Animal Health Research Reviews 1(2): 73-93, 2000 December]). 훨씬 더 강력하게는, 1980년대 이래로, 리포폴리사카라이드 단독을 기반으로 하는 백신은 이미 질환의 임상 징후 또는 감염 수준의 감소에서 긍정적인 영향을 주며 교차 보호를 유도함이 공지되었다 (문헌[Fenwick et al., the American Journal of Veterinary Research, Volume 47, No 9, September 1986]; 문헌[Rapp et al., Canadian Veterinary Journal, 1988, Volume 29, Number 7, pp 585-587]; 문헌[Rioux et al., Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases 20(1):63- 74, January 1997]).

리포폴리사카라이드의 심각한 약점은 그의 내독소 성질이며, 따라서 이는 무기력증, 설사, 구토, 식욕 상실 또는 심지어 사망과 같은 다수의 원하지 않는 부작용과 결부된다. 따라서, 일견, 백신 중 LPS의 양을 저하시키거나 LPS를 독소제거하려고 하는 중이다. 그러나, 적절한 APP 백신은 LPS의 존재에 의존적이며, 따라서 일반적으로 공지된 바와 같이 LPS의 양의 저하는 백신의 효능을 본질적으로 감소시킨다. 또한, LPS의 내독소 성질을 감소시키기 위하여 그리고 여전히 효과적인 APP 백신에 도달하기 위하여 다양한 시도가 있어 왔다. 리욱스 (Rioux) 등 (본원에서 상기에 언급됨)은 APP에 대한 백신의 효능에 대한 LPS 독소제거의 영향을 조사하였으며, (독소제거되지 않은) LPS로 면역화된 마우스는 보호되고 반면 독소제거 LPS를 기반으로 한 백신은 마우스를 보호하지 못한다는 결론을 내렸다 (리욱스의 간행물의 제71면, 세 번째 단락 참조). 이 연구는 돼지에서 반복되었다 (문헌[Research in Veterinary Science 1998, 65, 165-167]). 시판 박테린 백신 (독소제거되지 않은 LPS를 함유함)은 야생형 APP를 이용한 챌린지 (challenge)에 대하여 우수한 보호를 제공함이 밝혀졌다. 독소제거 LPS를 기반으로 한 백신은 훨씬 덜 효과적인 것으로 보였다 (돼지의 60%가 여전히 폐 병변을 가짐). 실제, 이는 LPS가 독소제거될 경우 훨씬 덜한 면역원성을 가진다는 일반적인 이해와 일치한다.

본 발명의 목적은 돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신을 제공하는 것으로서, 이는 상업적으로 획득가능한 백신과 비견되는 효능을 갖지만 내독소 쇼크의 증상이 유의하게 감소되고, 특히 유효 용량의 백신의 투여 후 돼지에서 설사, 구토 및 증가된 호흡의 임의의 징후를 전혀 나타내지 않거나 거의 나타내지 않는다.

이를 위하여, 백신은 리포폴리사카라이드를 포함하는 것을 기반으로 하여 고안되었으며, 여기서, 백신은 리포폴리사카라이드에서 생긴 내독소 쇼크의 증상을 감소시키기 위하여 폴리믹신을 추가로 포함한다. 놀랍게도, 폴리믹신에 의한 LPS의 독소제거는 LPS의 면역원성에 상당한 부정적인 영향을 미치지 않으며, 따라서 백신의 효능에 대하여 그러한 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 폴리믹신의 사용에 의해 내독소 쇼크의 증상, 예컨대 설사, 구토 및 증가된 호흡은 백신의 효능을 적당한 수준으로 유지하면서 유의하게 감소시킬 수 있는 것으로 보인다. 특히, 백신은 심지어 폴리믹신이 첨가되지 않은 백신과 동일한 효능을 가질 수 있는 것으로 보인다.

본 발명의 의미에서의 백신은 숙주에 있어서 미생물 또는 그의 대사 과정 (미생물 내의 과정 또는 미생물에 의해 유도된 과정)을 방해하는 항체의 유도를 통하여 미생물에 의한 감염에 의해 야기된 질환 또는 장애의 임상 증상 또는 미생물에 의한 감염을 예방하거나 감소시키는 것을 지향하는 구성이다. 백신은 기본 항원으로서 (예를 들어 LPS와 같은) 미생물의 서브유닛을 포함할 수 있지만, 약독화 또는 사멸된 전 미생물, 또는 예를 들어 당해 유기체의 대사산물 (예컨대 분비된 독소)을 또한 포함할 수 있다. 백신은 면역촉진제 (아주반트 (adjuvant)), 안정제, 점도 조절제 또는 백신의 사용 의도 또는 필요한 특성에 따라 기타 성분들을 임의로 포함하는, 물을 포함하는 액체 (흔히, 인산염 완충 염수)와 같은 제약상 허용되는 담체와 전형적으로 조합된 항원의 면역학상 유효량 (즉, 야생형 미생물을 이용한 챌린지의 부정적인 영향을 적어도 감소시키기에 충분하도록 표적 동물의 면역계를 자극할 수 있는 양)을 함유한다. 또한, 백신이 다수의 야생형 유기체에 대하여 보호하도록 다른 미생물의 추가의 항원이 존재할 수 있다.

폴리믹신은 바실루스 폴리믹사 (Bacillus polymyxa) (비. 아에로스포라 (B. aerospora))로부터 단리되거나, 인공적으로 생성될 수 있는, 항균 특성을 갖는 화합물, 및 그로부터 직접적으로 유도가능한 항균 특성을 갖는 화합물이다. 비. 폴리믹사에 의해 생성된 폴리믹신은 긴 소수성 테일 (tail)을 갖는 시클릭 펩티드로 이루어진 일반 구조를 갖는다. 전형적인 폴리믹신류는 폴리믹신 A (아에로스포린으로도 칭해짐). 폴리믹신 B (흔히 폴리믹신으로도 지칭됨), 폴리믹신 E (콜리스틴으로도 칭해짐), 폴리믹신 M (마타신으로도 공지됨) 및 폴리믹신 노나펩티드이다.

폴리믹신류는 그람 음성균을 함유하는 면역원성 조성물에서 리포폴리사카라이드를 성공적으로 독소제거하기 위하여 사용될 수 있음이 이전에 기술되었음을 주목한다. 예를 들어, 쿠퍼스톡 (Cooperstock) 등은 문헌["Infection and Immunity", July 1981, pp 315-318]에서 폴리믹신 B의 사용에 의해 몇몇 그람 음성균 (즉, 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 헤모필루스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae) 및 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa))의 내독소 활성이 두드러지게 감소하였음을 개시하고 있다. 그러나, 쿠퍼스톡은 또한 "폴리믹신-처리된 박테리아의 면역원성 특성이 온전하게 남아있는지는 여전히 불확실하다"라고 명백하게 나타내고 있으며 또한 "면역전기영동 시스템에서 사전형성된 항체에 결합하는 몇몇...외막 성분들의 능력은 고농도의 폴리믹신 B를 이용한 단리된 막 또는 전 박테리아의 처리 후 부분적으로 상실되었다"라고 명백하게 나타내고 있다. 환언하면, 독소제거된 LPS의 면역원성 특성은 심각하게 의심이 되며, 이들 특성의 적어도 일부의 상실이 예견되었다.

실제, 반나타인 (Bannatyne) 등은 문헌[Journal of Hygiene (Cambridge), 1981, 87, pp 377-381]에서 ml 당 5000 μg의 농도의 폴리믹신 (폴리믹신 B 황산염) (이는 백신 용량 당 약 42.000 국제 단위 (International Unit, IU)와 동일함)이 LPS의 독성 효과의 억제에 성공적이었음을 개시하고 있다. 그러나, 그는 또한 "그러나, 그러한 폴리믹신 함유 백신에 관한 유보 사항이 남아있다. 가장 중요한 것은 내독소 함량 감소가 보호 항원의 양 감소를 동반하며, 보호 효능의 강하와 결부된다"라고 진술한다. 몇 년 후, 문헌[Larter et al., the American Journal of Diseases of Children, VoI 138, March 1984)]에서는 실제로 백일해 백신에서, 백일해 백신을 받은 동물에서의 항체 역가 및 폴리믹신이 동시에 (용량 당 150.000 IU 초과) 더욱 적었으며 더욱 서서히 증가하거나 심지어 전혀 존재하지 않았음이 발견되었다.

1980년대 초반의 이러한 발견은 백신 LPS가 지배적인 역할을 하는 효과적인 APP 백신에 있어서 폴리믹신을 이용한 독소제거가 안전하지만 여전히 효과적인 백신을 수득하는 합리적인 성공 기회를 갖지 못하는 것으로 생각된 이유를 설명할 수 있다. 이는 LPS를 필수 구성성분으로서 포함하는 APP 백신에서 폴리믹신의 본 발명에서의 적용까지는 본원에서 상기에 언급된 관찰 이래로 25년 초과의 세월이 흘렀다는 사실에 의해 강력하게 지지된다.

일 실시양태에서, 백신은 박테리아 배양물로부터 정제된 리포폴리사카라이드 (즉, 세포 기관, 세포 핵, 세포벽 성분 등과 같은 기타 세포 성분에 비하여 농축됨)가 독소 내의 하나 이상의 반복체와 복합체화된 것을 포함한다. 박테린을 기반으로 한 APP 백신은 복합체 형태의 LPS- 및 Apx 서브유닛의 조합을 기반으로 한 백신보다 덜한 보호를 제공함이 공지되어 있다. 따라서, 박테리아 배양물로부터 정제된 LPS가 하나 이상의 Apx 독소와 복합체화된 것을 포함하는, 그러한 조합 서브유닛 백신이 바람직하다. LPS와 이들 독소 사이의 특이적 결합은 독소의 개선된 면역원성에서 중요한 역할을 함이 공지되어 있는데 (즉, 문헌[Ramjeet et al., Molecular Biology, 2008, 70(1), pp 221-235] 참조), 이는 그러한 조합 서브유닛 백신의 개선된 보호를 설명할 수 있다. 놀랍게도, 폴리믹신은 그의 강력한 LPS 결합 특성에도 불구하고 이러한 LPS-독소 복합체를 부정적으로 방해하지 않는 것으로 보이며 그 이유는 폴리믹신을 포함하는 조합 서브유닛 백신이 폴리믹신을 포함하지 않는 동일 조합 서브유닛 백신과 동일한 보호를 제공하기 때문임이 지금에 와서야 밝혀졌다. 독소 내의 반복체는 예를 들어 EP 제453 024호에 공지된 것일 수 있다. 또한, 독소 내의 다른 반복체, ApxII 또는 ApxIV 중 임의의 것이 존재할 수 있다. 이는, 즉 보호하기를 원하는 APP 혈청형(들)에 의존적일 수 있다. 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에 다음에, Apx 독소 (I 및 II)가 악티노바실루스 수이스 (Actinobacillus suis)에 의해서 또한 생성됨이 공지되어 있다. 후자의 독소는 이 실시양태에 따른 백신에서 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 독소 Apx I, Apx II 및 Apx III 중 하나 이상이 백신에, 더 바람직하게는 이들 각각이 백신에 포함된다.

일 실시양태에서, 백신은 용량 당 2000 IU 미만의 폴리믹신을 포함한다. 놀랍게도, 2000 IU/용량 (이는 예를 들어 4 ml의 용량에 있어서 백신 ml 당 약 60 μg의 폴리믹신 B 황산염을 첨가함으로써 도달될 수 있음)만큼 적은 것을 사용함으로써 내독소 증상의 유효한 감소가 도달될 수 있음이 밝혀졌다. 본원에서 상기에 인용된 참고 문헌에서, 백신 접종시의 유효량은 용량 당 42.000 - 160.0000 IU의 폴리믹신의 범위 내에 있으며, 이는 보존제로서의 폴리믹신의 사용에 있어서의 대략적인 범위이다 (10 kg 동물에 있어서 용량 당 50.000 IU 이상의 용량을 권장하는 문헌[Merck Veterinary Manual, ed. 2005]의 제9판을 또한 참조). 놀랍게도 본 출원인은 단지 일부 (5% 미만)가 내독소 쇼크의 증상의 감소에 충분한 것으로 보임을 밝혀냈다. 일반적으로 폴리믹신은 무기한 안정한 것은 아니기 때문에, 백신 내에 존재하는 양은 첨가되는 양보다 적으며, 전형적으로 제형화 후 최대 1년까지 측정할 경우 50 내지 80%이다. 임상 증상을 감소시키는 데 필요한 만큼의 적은 폴리믹신이 사용될 수 있음이 주목된다. 예를 들어, 백신 중 LPS로부터 덜 고통받는 돼지 품종에서, 용량 당 약 15-30 IU의 양이 내독소 쇼크의 증상의 적당한 감소에 효과적일 수 있다. 그러한 낮은 양의 긍정적인 영향이 실험적으로 확인되었다. 최소 유효량은 돼지 품종에 의존적일 뿐만 아니라 필요한 임상 증상의 감소, 백신 중 LPS의 양, 폴리믹신의 유형 등에도 의존적일 수 있음이 주목된다. 일 실시양태에서, 백신은 용량 당 1000 IU 미만, 또는 심지어 500 IU 미만을 포함한다.

일 실시양태에서, 리포폴리사카라이드는 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에로부터 유래된다. 실제로, 일반적으로 공지된 바와 같이, 백신 중 LPS는 APP 박테리아로부터 추출되어 돼지 흉막폐렴에 대한 백신에서 효과적일 필요는 없다. 이것은 예를 들어 에스케리키아 콜라이로부터 유래되고, 숙주 박테리아, 동물 세포 또는 기타 유형의 숙주에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 그러나, 본 출원인은 APP로부터 유래되는 LPS가 매우 우수한 백신접종 결과를 제공함을 밝혀냈다. 그러한 LPS는 APP 박테리아로부터 직접적으로 추출될 수 있지만 또한 적합한 숙주에 의해 발현될 수 있다.

일 실시양태에서, 백신은 EP 제453 024호에 공지된 바와 같이 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에의 42 kD의 외막 단백질을 포함한다.

또한 본 발명은 리포폴리사카라이드를 수득하고, 리포폴리사카라이드를 제약상 허용되는 담체와 혼합하고, 폴리믹신을 첨가하여 리포폴리사카라이드를 독소제거하는 것을 포함하는, 돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신을 수득하는 방법에 관한 것이다. 이 의미에서 독소제거는 내독소 쇼크의 증상, 특히 설사, 구토 및 증가된 호흡을 적어도 감소시키기에 적합한 양의 폴리믹신을 첨가함을 의미한다. 바람직하게는 백신의 의도된 용량 당 2000 IU 미만, 또는 심지어 1000 또는 500 IU 미만의 폴리믹신이 사용된다. 일 실시양태에서, 리포폴리폴리사카라이드가 담체와 혼합될 때 폴리믹신이 첨가된다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, 리포폴리사카라이드를 함유하는, 돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신을 투여할 때 내독소 쇼크의 증상을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

이제 본 발명을 하기 실시예를 이용하여 예시한다.

실험 설계

첫 번째 연구에서, 6주령의 150마리의 특정 병원체가 없는 (specific pathogen-free, SPF) 돼지를 이용하였으며, 각각 50마리의 세 군을 형성하였다. 각각의 군은 6주령에 4 ml의 용량으로 근육내로 1회 백신접종하였다. 1군은 폴리믹신이 없는 표준 App 백신 (포실리스 (Porcilis) APP, 인터벳 인터내셔널 비브이 (Intervet International BV), 네덜란드 복스미어)을 받았다. 이 백신은 (ml 당) 42 kD의 외막 단백질 뿐만 아니라 독소 ApxI, II 및 III 내의 반복체 25 단위도 함유한다. LPS는 약 5-6 x 10⁵ IU/ml의 양으로 존재한다. 2군은 폴리믹신 B (황산염으로서)를 첨가한 것을 제외하고는 동일한 백신을 30 μg/ml (약 250 IU/ml)의 양으로 받았다. 3군은 폴리믹신 E (황산염으로서)를 첨가한 것을 제외하고는 동일한 표준 백신을 또한 30 μg/ml (약 250 IU/ml)의 양으로 받았다. 폴리믹신은 백신 제형화의 마지막 단계에 첨가하였으며, 즉, 모든 다른 항원을 담체 딜루박 포르테 (Diluvac Forte) (인터벳 인터내셔널 비브이, 네덜란드 복스미어)와 혼합하고 있을 때 첨가하였다.

직장 온도를 백신접종 20시간 전, 백신접종 직후, 및 백신접종한지 2시간 후, 4시간 후, 7시간 후 및 24시간 후에 측정하였다. 모든 군 당 동물을 백신접종한 후 30분, 및 1시간, 2시간, 4시간, 7시간 및 24시간에 특정 임상 증상 (내독소 쇼크를 나타냄)에 대하여 모니터링하였다. 특히 동물을 하기 증상에 대하여 체크하였다: 더 적은 활동성, 떨림, 기침, 설사, 구토, 증가된 호흡 속도, 복식 호흡, 호흡 곤란 및 사망. 백신접종한 후 2-6일에, 단지 매일 체크를 수행하였다. 2군 및 3군의 임상 증상 및 온도 값을 1군의 것과 비교하였다.

두 번째 연구에서, 두 가지 상이한 농도의 폴리믹신을 첨가하였다. 이 연구를 42마리의 돼지를 이용하여 수행하였으며, 이는 14마리 돼지의 각각의 3개의 처리군에 랜덤하게 할당하였다. 1군은 포실리스 APP (폴리믹신을 포함하지 않음)를 받았으며, 2군은 백신 ml 당 30 μg의 폴리믹신 B를 포함하는 동일 백신을 받았고, 3군은 백신 ml 당 60 μg의 폴리믹신 B를 포함하는 동일 백신을 받았다. 추가의 실험 셋업은 첫 번째 연구와 동일하였다.

세 번째 연구에서, LPS를 기반으로 하고 폴리믹신 B를 함유하는 APP 백신의 효능을 시험하였다. 폴리믹신 B는 최상의 LPS 결합 특성을 갖는 폴리믹신으로 일반적으로 공지되어 있으며, 따라서, 이론적으로 폴리믹신 B는 백신 효능에 대하여 가장 강력한 부정적인 영향을 미친다. 그래서, 이러한 폴리믹신을 이용하여 제형화한 백신이 효과적일 경우, 이는 또 다른 폴리믹신을 이용하여 적어도 동일하게 효과적인 백신을 수득할 수 있다는 것에 대한 증거이다. 이 연구를 위한 백신은 백신 ml 당 30 μg의 폴리믹신 B를 표준 포실리스 APP 백신에 첨가함으로써 제형화하였다. 14마리의 돼지는 6주령 및 10주령에 2 ml의 백신을 이용하여 근육내로 백신접종하였으며, 따라서 이는 약 500 IU의 폴리믹신의 용량을 받은 것이었다. 7마리의 돼지는 위약 백신 (40 mM 트리스-HCl 완충액)을 받았다. OMP뿐만 아니라 RTX 독소 ApxI, ApxII 및 Apx III에 대한 항체 역가도 13주에 결정하였다. 두 번째 백신접종한지 3주 후에, 돼지를 모두 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에 혈청형 2로 챌린징하였다.

네 번째 연구에서, 백신의 안전성을 시험하였으며, 여기서, 폴리믹신은 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에 발효 배치의 하류 프로세싱 동안 첨가하여, 궁극적으로는 백신 중의 훨씬 더 낮은 함량의 폴리믹신에 도달하였다 (약 2-4 μg/ml). 이 연구에서, 백신은 42 kD OMP 및 LPS와 복합체화된 독소 ApxI, II, III을, 각각의 배양물의 발효 브로쓰의 상청액으로부터 단리한 후 상기 상청액 ml 당 30 μg의 폴리믹신 B 또는 폴리믹신 E 황산염을 첨가함으로써 제조하였다. 이들 단리된 서브유닛을 딜루박 포르테에서 제형화하여 백신 ml 당 OMP 및 독소의 경우 약 25 단위, 그리고 LPS 약 1x10⁶ IU에 도달하였다. 이들 백신에서, ml 당 폴리믹신 E의 경우 약 22 IU (2.6 μg/ml), 그리고 폴리믹신 B의 경우 약 35 IU (4.2 μg/ml)의 폴리믹신 농도가 발견되었다. 안전성 시험을 위하여, 10마리의 6주령의 SPF 돼지의 두 군은 4 ml의 각각의 백신을 받았다. 임상 증상을 첫 번째 연구에서와 같이 평가하였다.

결과

직장 온도에 대한 폴리믹신들 중 어느 하나의 영향은 유의하지 않았다. 그러나, 내독소 쇼크의 증상과 관련해서는 유의한 영향이 있었다. 하기에서 본원의 표 1에서 군 당 증상에 대한 요약이 제공되어 있다. 1군에서는 구토 (60%), 및 증가된 호흡 속도 (66%)와 같은 전형적인 임상 증상이 절반 초과의 동물에서 관찰되었다. 이 군에서, 2마리의 돼지 (4%)가 내독소 쇼크의 결과로 사망하였다. 이와는 대조적으로, 단지 매우 경증의 증상이 2군 및 3군에서 관찰되었다. 두 군에서 돼지의 2% (50마리의 동물 중 1마리)가 구토를 하였다. 게다가, 3군의 돼지의 2%는 호흡 속도가 증가하였다. 따라서, 폴리믹신은 APP 백신 중 LPS에 의해 야기되는 중증 내독소 쇼크 증상의 감소에 적합하다는 결론을 내렸다.

다양한 APP 백신을 이용한 백신접종 후 내독소 쇼크의 증상

백신	설사	구토	증가된 호흡 속도	사망
포실리스 APP	10%	60%	66%	4%
포실리스 APP + 30 μg/ml의 폴리믹신 B	0%	2%	0%	0%
포실리스 APP + 30 μg/ml의 폴리믹신 E	0%	2%	2%	0%

표 2에는 두 번째 연구의 결과를 나타냈다. 1군 (표준 백신)에서 구토 (54%) 및 증가된 호흡 속도 (15%)와 같은 전형적인 임상 증상이 관찰되었다. 2군 및 3군에서 경증 증상 내지 거의 없는 증상이 관찰되었다. 이들 결과에 기반하면, 백신 ml 당 60 μg만큼 적은 또는 심지어 30 μg/ml만큼 적은 폴리믹신의 첨가는 내독소 쇼크의 중증 증상의 유도에 있어서 LPS를 거의 완전히 차단하는 데 효과적이라는 결론을 내렸다.

다양한 APP 백신을 이용한 백신접종 후 내독소 쇼크의 증상

백신	설사	구토	증가된 호흡 속도	사망
포실리스 APP	15%	54%	15%	0%
포실리스 APP + 30 μg/ml의 폴리믹신 B	0%	0%	8%	0%
포실리스 APP + 60 μg/ml의 폴리믹신 B	0%	0%	0%	0%

세 번째 연구에서, 우수한 효능에 대한 결과 (폴리믹신을 제외하고는 동일한 제형을 갖는 표준 포실리스 APP 백신을 이용하여 수득가능한 결과와 동일함)를 폴리믹신 B를 함유하는 백신에서 수득하였다. 그 결과가 표 3에 요약되어 있다. 대조군에서, 동물의 거의 60%가 사망하였으며, 반면에 백신접종군의 동물은 챌린지에 대하여 모두 보호되었다. 후자의 군에서의 역가는 폴리믹신을 함유하지 않는 표준 포실리스 APP 백신을 이용하여 수득가능한 것과 비견되었다 ("n.d."는 이용한 시험에서 검출가능하지 않음을 의미함). 폴리믹신 B를 함유하는 APP 백신에서 극히 우수한 결과가 주어진다면, 그리고 이 폴리믹신이 가장 강력한 LPS 결합 특성을 갖는다는 사실이 주어진다면, 적어도 동일하게 효과적인, 다른 폴리믹신을 이용한 백신이 수득될 수 있음이 이해된다.

폴리믹신 B를 함유하는 백신의 평균 효능 결과

백신	ApxI 역가	ApxII 역가	ApxIII 역가	OMP 역가	사망
포실리스 APP + 30 μg/ml의 폴리믹신 B	9.3	10.1	8.5	9.1	0/14
대조	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	4/7

네 번째 연구에서, 심지어 ml 당 약 20 IU만큼 적은 폴리믹신을 포함하는 백신을 이용해서도 우수한 안전성 결과를 수득할 수 있음이 밝혀졌다. 평균 데이타가 표 4에 예시되어 있다. 심지어 유의하게 더 높은 폴리믹신 함량 (연구 3 참조)을 이용해서도 여전히 우수한 효능 결과를 수득할 수 있다는 효과가 주어진다면, 네 번째 연구의 백신을 이용하여 우수한 효능 결과를 또한 수득할 수 있음이 명백하였다.

다양한 APP 백신을 이용한 백신접종 후 내독소 쇼크의 증상

백신	설사	구토	증가된 호흡 속도	사망
포실리스 APP	50%	90%	70%	0%
포실리스 APP ctg 4.2 μg/ml의 폴리믹신 B	0%	10%	10%	0%
포실리스 APP ctg 2.6 μg/ml의 폴리믹신 E	0%	20%	30%	0%

Claims

백신이 리포폴리사카라이드에서 생긴 내독소 쇼크의 증상을 감소시키기 위하여 폴리믹신을 포함하는 것을 특징으로 하는, 리포폴리사카라이드를 포함하는, 돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신.
제1항에 있어서, 독소 내의 하나 이상의 반복체와 복합체화된, 박테리아 배양물로부터 정제된 리포폴리사카라이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제2항에 있어서, 독소 내의 반복체가 ApxI, ApxII 및 ApxIII인 것을 특징으로 하는 백신.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 용량 당 2000 IU 미만의 폴리믹신을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제4항에 있어서, 용량 당 1000 IU 미만의 폴리믹신을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제5항에 있어서, 용량 당 500 IU 미만의 폴리믹신을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리믹신이 폴리믹신 B인 것을 특징으로 하는 백신.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 리포폴리사카라이드가 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에 (Actinobacillus pleuropneumoniae)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 백신.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에의 42 kD 외막 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
리포폴리사카라이드를 수득하고, 리포폴리사카라이드를 제약상 허용되는 담체와 혼합하고, 폴리믹신을 첨가하여 리포폴리사카라이드를 독소제거하는 것을 포함하는, 돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신을 수득하는 방법.
제10항에 있어서, 폴리믹신을 백신 용량 당 최대 2000 IU에 도달하도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 폴리믹신을 백신 용량 당 최대 1000 IU에 도달하도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 폴리믹신을 백신 용량 당 최대 500 IU에 도달하도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리믹신을, 리포폴리사카라이드를 담체와 혼합할 때 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
대상체 동물에게 투여하기 전에 폴리믹신을 백신에 첨가하는 것을 특징으로 하는, 돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신을 투여할 경우 내독소 쇼크의 증상을 감소시키기 위한 폴리믹신의 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 백신을 투여하는 것을 포함하는, 리포폴리사카라이드를 함유하는, 돼지 흉막폐렴에 대하여 유도된 백신을 투여할 경우 내독소 쇼크의 증상을 감소시키는 방법.