BR112012002583B1 - Vacina e metodo para obter uma vacina direcionada contra pleuropneumonia porcina - Google Patents

Abstract

VACINA, METODO PARA OBTER UMA VACINA DIRECIONADA CONTRA PLEUROPNEUMONIA PORCINA, USO DE UMA POLIMIXINA, E, METODO PARA REDUZIR SINTOMAS DE UM CHOQUE ENDOTOXICO A presente INVENÇÃO se refere a uma vacina direcionada contra pleuropneumonia porcina, compreendendo lipopolissacarfdeo, em que a vacina compreende uma polimixina para reduzir sintomas de um choque endotdxico que surge do lipopolissacarideo. A invengao tambem se refere a um mdtodo para obter uma vacina como esta e um mhtodo para administrar a vacina a um sujeito animal.

Description

A presente invengao se refere a uma vacina direcionada contra pleuropneumonia porcina, uma doenga mundial que causa perda economica substantial a industria sufna. O agente etiologico da pleuropneumonia porcina e Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), uma bacteria gram-negativa que pertence a famflia Pasteurellaceae. A doenga e transmitida pela via aerossol ou contato direto com um porco infectado, e e caracterizada por lesoes dos pulmoes hemorragicas, fibrinosas e necroticas. O quadro clmico pode variar de peragudos a cronico e porcos carreadores assintomaticos podem transmitir a doenga quando introduzido em vara nao infectados. Com base nos componentes de cadeia-0 de polissacandeos capsulares e lipopolissacandeo (LPS), 15 sorovares foram descritos.

Sorotipagem e outros metodos de tipagem genetica para Actinobacillus pleuropneumoniae contribuiram enormemente para a fiscalizagao e estudos epidemiologicos. Estas ferramentas fomecem importante informagao para tomada de decisao em programas de controle reivindicados na erradicagao de tipos virulentos da bacteria. Na America do Norte, sorovares 1, 5 e 7 sao reportados como mais prevalentes, enquanto que sorovares 2 e 9 sao acima de tudo comumente isolados na Europa, e sorovar 15 e o isolados predominante de porcos Australianos.

Os fatores de virulencia descritos para A. pleuropneumoniae incluem LPS, polissacandeos capsulares, Apx toxinas LIV (entao chamadas repetigoes em toxinas ou RTX toxinas), protemas de membrana externa (OMPs) e varios sistemas de aquisigao de ferro. Entretanto, a contribuigao geral de cada componente para o processo de infecgao permanece obscuro, assim como os mecanismos de patogenese desta patogenese. Quase todas as vacinas atualmente disponiveis contra A. pleuropneumoniae sao tanto bacterinas de celula total inativada quanto combinagbes de subunidade de toxinas Apx e protelnas, opcionalmente em combinagao com fragoes de membrana externa. Em qualquer caso, comumente entende-se que para obter protegao adequada, preferivelmente por meio de sorovares diferentes, lipopolissacarideo (LPS) tern que estar presente em uma vacina (Julien Goure et al. em: BMC Genomics 2009, 10:88, publicado em 24 de fevereiro de 2009; Dubreuil et al. em: Animal Health Research Reviews 1 (2): 73-93, dezembro de 2000). Ainda mais forte, sabe-se desde os anos 80 que uma vacina a base de lipopolissacarideo somente ja tern um efeito positive na redugao do nivel de infeegao ou dos sinais clinicos da doenga e induzem protegao cruzada (Fenwick et al. em: the American Journal of Veterinary Research, Volume 47, No 9, setembro de 1986; Rapp et al. em: Canadian Veterinary Journal, 1988, Volume 29, Numero 7, pp 585-587; Rioux et al. em: Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Desease 20(1 ):63-74, Janeiro de 1997).

Uma desvantagem seria de lipopolissacarideo e sua natureza endotoxica, assim sendo associado a multiples efeitos colaterais indesejados, tais como letargia, diarreia, vomito, perda de apetite ou mesmo morte. Num primeiro momento, desta forma, tenta-se diminuir a quantidade de LPS em uma vacina ou desentoxicar o LPS. Entretanto, uma vacina APP adequada depende da presenga de LPS e, assim, conforme comumente se sabe, a diminuigao da quantidade de LPS inerentemente diminuiu a eficacia da vacina. Tambem, foram feitas varias tentativas para reduzir a natureza endotoxica de LPS e ainda chegar em uma vacina APP efetiva. Rioux et al. (mencionado aqui anteriormente) investigou o efeito de desentoxicagao de LPS na eficacia de uma vacina contra APP e concluiu-se que camundongos imunizados com LPS (nao desentoxicados) foram protegidos, enquanto que uma vacina a base de LPS desintoxicado nao protegeu o camundongo (ver pagina 71 do Rioux publication, terceiro paragrafo). Este estudo foi repetido em porcos (Research in Veterinary Science 1998, 65, 165-167). Mostrou-se que uma vacina bacteriana comercial (contendo LPS nao desintoxicado) fomeceu boa protegao contra um teste com APP tipo selvagem. Uma vacina a base de LPS desintoxicado pareceu ser muito menos efetiva (60 % dos porcos ainda tinham lesoes no pulmao). De fato, isto esta alinhado com o entendimento comum que LPS, quando desintoxicado, e muito menos imunogenico.

Objetivo da presente invengao e fornecer uma vacina direcionada contra pleuropneumonia porcina, tendo uma eficacia comparavel com vacinas comercialmente obtidas, mas tendo sintomas de choque endotoxico significativamente menores, em particular nao mostrando ou dificilmente mostrando algum sinal de diarreia, vomito e maior respiragao em porcos depois da administragao de uma dose efetiva da vacina.

Com esta fmalidade, foi criada uma vacina compreendendo lipopolissacarfdeo, em que a vacina adicionalmente compreende uma polimixina para reduzir sintomas de um choque endotoxico que surge do lipopolissacarfdeo. Surpreendentemente observou-se que a desentoxicagao de LPS por uma polimixina nao tem um efeito negative significative na imunogenicidade do LPS e, assim, na eficacia de o vacina. Parece que usando uma polimixina os sintomas de um choque endotoxico, tais como diarreia, vomito e maior respiragao podem ser significativamente menores, mantendo ao mesmo tempo a eficacia da vacina em um nfvel adequado. Em particular, parece que a vacina pode ainda ter a mesma eficacia que uma vacina sem polimixina adicionada.

Uma vacina no sentido da presente invengao e uma constituigao que reivindica a prevengao ou redugao de uma infeegao por um microrganismo ou dos sintomas clinicos da doenga ou desordem causada por esta infeegao por meio da indugao de anticorpos que interferem com o microrganismo ou seus processos metabolicos (tanto no microrganismo quanto induzido por ele) no hospedeiro. Uma vacina pode center uma subunidade (tai como, por exemplo, LPS) como o antigeno basico, mas tambem pode compreender microrganismos totais atenuados ou mortos ou, por exemplo, um metabolite do organismo (tai como uma toxina excretada). A vacina contem uma quantidade imunologicamente efetiva do antigeno (isto e, uma quantidade capaz de estimular o sistema imune do animal alvo suficientemente para, pelo menos, reduzir os efeitos negatives de um teste e com microrganismos tipo selvagem), tipicamente combinado com um carreador farmaceuticamente aceitavel, tai como um liquido contendo agua (frequentemente salina tamponada com fosfato), opcionalmente compreendendo agentes imunoestimulantes (adjuvantes), estabilizantes, modificadores de viscosidade ou outros componentes dependendo do uso pretendido ou das propriedades requeridas da vacina. Tambem, antigenos adicionais de outros microrganismos podem estar presentes, de maneira tai que a vacina proteja contra multiples organismos tipo selvagem.

Polimixinas sao compostos com propriedades antibacterianas que podem ser isolados de Bacillus polymyxa (S. aerospora), ou artificialmente produzidos, e compostos com propriedades antibacterianas diretamente derivados destes. As polimixinas produzidas por B. polymyxa tern uma estrutura geral que consiste em um peptideo ciclico com uma cauda hidrofobica longa. Polimixinas tipicas sao: polimixina A (tambem chamada aerosporina), polimixina B (frequentemente tambem referida como polimixina), polimixina E (tambem chamada colistina), polimixina M (tambem conhecida como matacina) e nanopeptideo de polimixina.

Nota-se que descreveu-se antes que polimixinas podem ser usadas para desintoxicar com exito lipopolissacarideos em composiqoes imunogenicas contendo bacterias gram-negativas. Por exemplo, Cooperstock et al descreve em o journal "Infection and Immunity", Julho de 1981, pp 315- 318 que usando polimixina B, atividade endotoxica em suspensbes de varias bacterias gram-negativas (viz. Bordetella pertussis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae e Pseudomonas aeruginosa} foi acentuadamente diminuido. Entretanto, Cooperstock tambem claramente nota que “permanece incerto se as propriedades imunogenicas de bacterias tratadas com polimixina permanecem intactas” e tambem que “a capacidade de varios... componentes de membrana externa se ligam a anticorpos em um sistema de eletroforese foi parcialmente perdido depois do tratamento tanto de bacteria total quanto de membranas isoladas com altas concentrates de Polimixina B”. Em outras palavras: as propriedades imunogenicas do LPS desintoxicado foram seriamente questionada, e perda de pelo menos parte destas propriedades foi previsto.

De fato, tambem Bannatyne et al. descrevem no Journal of Hygiene (Cambridge), 1981, 87, pp 377-381, que polimixina em uma concentragao de 5000 pg (sulfato de polimixina B) por mL (que iguala cerca de 42.000 unidades intemacionais por dose da vacina) tiveram exito na supressao do efeito toxico de LPS. Entretanto, tambem estabeleceu que “Permanece, entretanto, reservas sobre uma vacina contendo polimixina como esta. Acima de tudo e se a redugao no teor de endotoxina e acompanhado por uma redugao na quantidade de antigeno protetor e associado a uma gota na eficacia protetora.” Poucos anos depois Larter et al. (no American Journal of Deseases of Children, Vol 138, Margo de 1984), de fato, observou-se que em uma vacina de pertussis, os titulos de anticorpo em animais que recebem vacina de pertussis e polimixina concomitantemente (acima de 150.000 IU por dose) foram inferiores e subiram mais lentamente ou ainda nao estiveram presentes.

Estes ensinamentos no inicio dos anos 80 devem explicar porque para uma vacina APP efetiva, em que vacina LPS exerce um papel dominante, nunca acreditou-se que desentoxicagao com uma polimixina foi tem uma chance razoavel de sucesso para obter uma vacina segura, mas efetiva. Isto e fortemente suportado pelo fato de que se passaram 25 anos desde que as observances mencionadas aqui anteriormente, ate a presente aplicagao de uma polimixina em uma vacina APP compreendendo LPS como um constituinte essencial.

Em uma modalidade a vacina compreende lipopolissacarfdeo purificado de uma cultura bacteriana (isto e, sendo concentrado relativamente para outros componentes celulares, tais como organelas, o nucleo, componentes da parede celular etc.) complexada com uma ou mais repetigbes em toxinas. Sabe-se que uma vacina APP a base de bacterinas oferece menos protegao que uma vacina a base de uma combinagao de subunidades de LPS- e Apx na forma de um complexo. Desta forma, uma vacina de subunidade de combinagao como esta, compreendendo LPS purificado de uma cultura bacteriana complexada com uma ou mais toxinas Apx e preferida. Sabe-se que a ligagao especifica entre LPS e estas toxinas exerce um papel principal na melhor imunogenicidade das toxinas (ver i.a. Ramjeet et al. em Molecular Biology, 2008, 70(1 ), pp 221-235) que pode explicar a melhor protegao de uma vacina de subunidade de combinagao como esta. Surpreendentemente observou-se agora que polimixina, a despeito de suas fortes propriedades de ligagao ao LPS, nao pareceu negativamente interferir com este complexo LPS-toxina, uma vez que uma vacina de subunidade de combinagao compreendendo polimixina oferece protegao igual a mesma vacina de subunidade de combinagao nao compreendendo uma polimixina. As repetigbes em toxinas podem, por exemplo, ser as conhecidas de EP 453 024. Tambem, qualquer uma das outras repetigbes em toxinas Apxll ou ApxlV pode estar presente. Isto pode depender, i.a., do sorovar(es) APP que se deseja proteger. Sabe-se que depois de Actinobacillus pleuropneumoniae, toxinas Apx (I e II) tambem sao produzidas por Actinobacillus suis. As ultimas toxinas tambem podem ser usadas na vacina de acordo com esta modalidade. Preferivelmente uma ou mais das toxinas Apx I, Apx II e Apx III sao compreendidas na vacina, mais preferivelmente cada um destes.

Em uma modalidade a vacina compreende menos que 2000 IU da polimixina por dose. Surpreendentemente observou-se que uma redugao efetiva dos sintomas endotoxicos pode ser alcangada usando desde 2000 ILJ/dose (que pode ser alcangado, por exemplo, adicionando cerca de 60 pg de sulfato de polimixina B por mL de vacina por uma dose de 4 mL). Nas referencias citadas anteriormente, quantidades efetivas na vacinagao caem na faixa de 42.000 - 160.0000 IU de polimixina por dose, que e cerca de na faixa para uso de polimixina como um conservante (ver tambem 9a edigao do Merck Veterinary Manual, ed. 2005, que recomenda uma dose de pelo menos 50.000 IU por dose por um animal de 10 kg). O requerente surpreendentemente observou que somente uma fragao (menos que 5 %) parece ser suficiente para reduzir sintomas de um choque endotoxico. Uma vez que polimixinas geralmente nao sao indefinitivamente estaveis, a quantidade presente na vacina sera menor que a quantidade adicionada, tipicamente entre 50 e 80% quando medido ate um ano depois da formulagao. Nota-se que o minimo de polimixina necessario para reduzir sintomas clinicos pode ser usado. Por exemplo, pode ser que em uma criagao de sumo que sofre menos de LPS em uma vacina, uma quantidade de cerca de 15-30 IU por dose e efetiva na redugao adequada dos sintomas de um choque endotoxico. O efeito positive de uma quantidade baixa como esta foi confirmado experimentalmente. Nota-se que quantidade efetiva minima pode depender nao somente da criagao de porcos, mas tambem da redugao dos sintomas clinicos requeridos, da quantidade de LPS na vacina, do tipo de polimixina etc. Em uma modalidade, a vacina compreende menos que 1000, ou ainda menos que 500 IU por dose.

Em uma modalidade o lipopolissacarideo origina de Actinobacillus pleuropneumoniae. De fato, conforme comumente se sabe, o LPS na vacina nao precisa ser extraido da bacteria APP para ser efetivo em uma vacina contra pleuropneumonia porcina. Ele pode originar, por exemplo, de Escherichia coli, ser recombinantemente expresso em uma patogenese de hospedeiro, celula animal ou outro tipo de hospedeiro. Entretanto, observou- se que LPS que origina de APP da resultados de vacinagao muito bons. Tai LPS pode ser extraido diretamente de bacterias APP, mas tambem pode ser expresso por um hospedeiro adequado.

Em uma modalidade, a vacina compreende proteina de membrana externa de 42 kD de Actinobacillus pleuropneumoniae conforme conhecido de EP 453 024.

A presente invengao tambem se refere a um metodo para obter uma vacina direcionada contra pleuropneumonia porcina, compreendendo obter lipopolissacarfdeo, misturar o lipopolissacarfdeo com um carreador farmaceuticamente aceitavel e desentoxicar o lipopolissacarfdeo adicionando uma polimixina. Desentoxicagao neste sentido significa que uma quantidade de polimixina e adicionada adequadamente para pelo menos reduzir sintomas de um choque endotoxico, em particular diarreia, vomito e maior respiragao. Preferivelmente menos que 2000, ou ainda menos que 1000 ou 500 IU das polimixina sao usadas por dose pretendida da vacina. Em uma modalidade a polimixina e adicionada quando o lipopolissacarfdeo e misturado com o carreador.

A invengao tambem se refere a um metodo para reduzir sintomas de um choque endotoxico administrando uma vacina direcionada contra pleuropneumonia porcina contendo lipopolissacarfdeo, compreendendo administrar uma vacina de acordo com a presente invengao.

A invengao sera agora ilustrada usando os seguintes exemplos.

Projeto experimental

Em um primeiro estudo, 150 porcos sem patogeno especifico (SPF) de 6 semanas de idade foram usados e tres grupos de 50 animais cada foram formados. Cada grupo foi vacinado uma vez intramuscularmente com uma dose de 4 mL na idade de 6 semanas. Grupo 1 recebeu uma vacina App padrao (Porcilis APP, disponivel da Intervet International BV, Boxmeer, Holanda), sem polimixina. Esta vacina contem (por mL) 25 unidades das repetipbes em toxinas Apxl, Il e III, bem como uma proteina de membrana externa de 42 kD. LPS esta presente em uma quantidade de cerca de 5-6 xlO5 Ill/mL. Grupo 2 recebeu a mesma vacina, mas com polimixina B adicionada (na forma de um sal de sulfato), na quantidade de 30 pg/mL (cerca de 250 IU por mL). Grupo 3 recebeu a mesma vacina padrao, mas com polimixina E adicionada (na forma de um sal de sulfato), tambem na quantidade de 30 pg/mL (cerca de 250 IU por mL). As polimixinas foram adicionadas no estagio final da formulapao da vacina, isto e, quando todos os outros antfgenos foram misturados com o carreador Diluvac Strong (disponivel da Intervet International BV, Boxmeer, The Netherlands).

Temperaturas retais foram medidas 20 horas antes da vacinapao, logo antes da vacinapao, e 2, 4, 7 e 24 horas depois da vacinapao. Todos os animais por grupo foram monitorados para os sintomas clinicos especificos (indicative de cheque endotoxico) a 30 min e 1, 2, 4, 7 e 24 horas depois da vacinapao. Em particular, os animais foram checados para os seguintes sintomas: menor atividade, tremores, tosse, diarreia, vomito, maior taxa de respirapao, respirapao abdominal, dispneia e morte. Nos dias 2-6 pos-vacinapao somente uma checagem diaria foi realizada. Valores de temperaturas e sintomas clinicos dos grupos 2 e 3 foram comparados com os do grupo 1.

Em um segundo estudo, duas diferentes concentrapbes de polimixina foram testadas. Este estudo foi realizado com 42 porcos, que foram aleatoriamente preparados para 3 grupos de tratamento de 14 porcos cada. Grupo 1 recebeu Porcilis APP (sem polimixina), grupo 2 a mesma vacina com 30 pg de polimixina B por mL de vacina e grupo 3 a mesma vacina com 60 pg de polimixina B por mL de vacina. Ajuste experimental adicional foi o mesmo que no primeiro estudo.

Em um terceiro estudo a eficacia de uma vacina APP, com base em LPS e contendo polimixina B foi testada. Polimixina B e comumente conhecida como a polimixina com as melhores propriedades de ligagao ao LPS e, assim, teoricamente polimixina B tern o impacto negative mais forte na eficacia da vacina. Entao, se uma vacina formulada com esta polimixina for efetiva, isto e prova de que com uma outra polimixina pelo menos uma vacina igualmente efetiva pode ser obtida. A vacina para este estudo foi formulada adicionando 30 pg de polimixina B por mL de vacina a vacina APP Porcilis padrao. Quatorze porcos foram vacinados intramuscularmente no estagio de 6 e 10 semanas com 2 mL da vacina, recebendo assim uma dose de cerca de 500 IU de polimixina. Sete porcos receberam uma vacina placebo (tampao tris-HCl 40 mM). Titulos de anticorpo contra as toxinas RTX Apxl, Apxll e Apx III, bem como OMP foram determinados em 13 semanas. Tres semanas depois da segunda vacinagao, porcos foram todos desafiados com Actinobacillus pleuropneumoniae sorovar 2.

Em um quarto estudo testou-se a seguranga de uma vacina em que a polimixina e adicionada durante o processamento da corrente descendente de um lote de fermentagao de Actinobacillus pleuropneumoniae, flnalmente atingindo um teor muito menor de polimixina na vacina (cerca de 2-4 pg/mL). Neste estudo a vacina foi preparada adicionando 30 pg de polimixina B ou sulfato de polimixina E por mL de sobrenadante do caldo de fermentagao das respectivas culturas, depois de que as toxinas Apxl, II, III complexadas com LPS, e o 42 kD OMP foram isoladas destes sobrenadantes. Estas subunidades isoladas foram formuladas em Diluvac forte para atingir, por mL de vacina, cerca de 25 unidades para as toxinas e OMP e cerca de IxlO6 IU de LPS. Nestas vacinas uma concentragao de polimixina de cerca de 22 IU (2,6 pg/mL) para polimixina E e cerca de 35 IU (4,2 pg/mL) para polimixina B por mL foi observada. Para testar a seguranga, dois grupos de porcos SPF de dez 6 semanas de idade cada recebeu 4 mL da respectiva vacina. Sintomasclinicos foram estimados como no primeiro estudo.

Resultados

Nao houve nenhum efeito significativo de nenhuma das polimixinas nas temperaturas retais.

Entretanto, houve efeitos significativos com relagao aos sintomas de choque endotoxico. Na tabela 1 a seguir e dado um sumario dos sintomas por grupo. No grupo 1 sintomas clinicos tipicos foram observados em mais que metade dos animais, como vomito (60 %) e maior taxa de respiragao (66 %). Neste grupo dois porcos (4 %) morreram como um resultado do choque endotoxico. Ao contrario, somente sintomas muito brandos foram observados nos grupos 2 e 3.

Em ambos os grupos 2 % dos porcos (um dos 50 animais) tiveram vomito. Alem do mais, 2 % dos porcos do grupo 3 tiveram uma maior taxa de respiragao. Desta forma, conclui-se que polimixinas sao adequadas para reduzir sintomas severos de choque endotoxico causado pelo LPS na vacina APP. Tabela 1. Sintomas de choque endotoxico depois da vacinagao com varias vacinas APP

Tabela 2 mostra os resultados do segundo estudo. No grupo 1 (vacina padrao) sintomas clinicos tipicos como vomito (54 %) e uma maior taxa de respiragao (15 %) foram observados. Nos grupos 2 e 3 sintomas brandos a quase nenhum foram observados. Com base nestes resultados, conclui-se que a adigao de desde 60 pg de uma polimixina por mL de vacina, ou ainda desde 30 pg/mL e efetiva para quase completamente bloquear o LPS em induzindo sintomas de choqueendotoxico severos. Tabela 2. Sintomas de choque endotoxico depois da vacinapao com varias vacinas APP

No terceiro estudo, bons resultados de eficacia (igual aos resultados obtidos com vacina Porcilis APP padrao tendo a mesma formulapao exceto para a polimixina) foram obtidos com a vacina contendo polimixina B. Os resultados sao sumarizados na tabela 3. No grupo controle quase 60 % dos animais morreram, enquanto que os animais no grupo vacinado foram todos protegidos contra o teste. Titulos no ultimo grupo foram comparaveis aos obtidos com vacina Porcilis APP padrao nao contendo uma polimixina (“n.d.” significa nao detectavel no teste usado). Dados os resultados extremamente bons com uma vacina APP contendo polimixina B, e o fato de que esta polimixina tem as propriedades de ligapao ao LPS mais fortes, entende-se que com outras polimixinas uma vacina pode ser obtida que e pelo menos igualmente efetiva. Tabela 3. Resultados de eficacia media de uma vacina contendo polimixina B

No quarto estudo mostrou-se que mesmo com uma vacina compreendendo cerca de 20 IU de polimixina por mL, bons resultados de seguranpa podem ser obtidos. Os dados medios sao apresentados na tabela 4. Dado o efeito que mesmo com um teor de polimixina significativamentemaior (ver estudo 3) resultados de eficacia ainda bons podem ser obtidos, e evidente que com as vacinas do quarto estudo bons resultados de eficacia podem igualmente ser obtidos. Tabela 4. Sintomas de choque endotoxico depois da vacinagao com varias vacinas APP

Claims (3)

1. Vacina direcionada contra pleuropneumonia porcina, compreendendo lipopolissacarfdeo purificado de uma cultura bacteriana, complexado com uma ou mais repetipoes nas toxinas Apxl, ApxII e ApxIII, caracterizada pelo fato de que a vacina compreende 25 unidades das repeti^oes em toxinas Apxl, ApxII e ApxIII, uma proteina de membrana externa de 42 kDa, 5-6xl05 U/mL de LPS e 30 pg de polimixina B ou 30 pg de polimixina E (250 lU/dose).

2. Metodo para obter uma vacina direcionada contra pleuropneumonia porcina, caracterizado pelo fato de que compreende obter lipopolissacarfdeo purificado de uma cultura bacteriana complexado com uma ou mais repeti^oes nas toxinas Apxl, ApxII e ApxIII, misturar 25 unidades das repeti^oes em toxinas Apxl, ApxII e ApxIII, uma proteina de membrana externa de 42 kDa e 5-6x105 U/mL de lipopolissacarfdeo com um carreador farmaceuticamente aceitavel e desintoxicar o lipopolissacarfdeo adicionando 30 pg de polimixina B ou 30 pg de polimixina E (250 lU/dose).

3. Metodo de acordo com a reinvindicação 2, caracterizado pelo fato de que a polimixina e adicionada quando o lipopolissacarfdeo e misturado com o carreador.