KR20120051737A - 세포의 보존 방법 - Google Patents

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KR20120051737A
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KR1020127006383A
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마사시게 다나베
도모미 이소노
다츠지 에노키
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다카라 바이오 가부시키가이샤
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents

Abstract

나트륨염, 칼륨염, 당류, 동해 보호제, 그리고 탄산수소염 및/또는 탄산염을 포함하는 필수 성분을 함유하고, 임의로 단백질, 마그네슘염 및 칼슘염으로 이루어지는 군에서 선택되는 성분을 추가로 함유하는 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 세포의 동결 보존 방법. 본 발명에 의해, 융해 후에 높은 생존율을 유지할 수 있는 세포의 동결 보존 방법, 그리고 당해 동결 보존에 사용하는 동결용 보존액이 제공된다. 또, 당해 동결 보존 방법에 사용함으로써, 융해 후에도 높은 생존율을 유지하고, 그 생리 기능도 유지하고 있는 상태로 세포를 장시간 보존할 수 있으며, 또한 동결 융해 후의 세포 세정 공정도 불필요한 점에서, 세포의 기초 연구, 의료에 대한 응용 연구에 있어서 매우 유용하다.

Description

세포의 보존 방법{CELL PRESERVATION METHOD}
본 발명은 세포의 동결 보존 방법, 및 당해 방법에 사용하기 위한 동결용 보존액에 관한 것이다.
최근, 의학의 진보에 수반하여, 생세포를 사용한 기초 연구나 치료가 활발히 실시되게 되었다. 이 때문에, 세포를 안전하게 또한 세포의 활성을 유지한 채로 보존하는 기술이 필요해져, 여러 가지 연구가 이루어져 오고 있다. 세포를 보존하는 방법으로는, 단시간 보존의 경우에는 동결을 실시하지 않고 현탁 상태에서 보존하는 방법이 알려져 있고 (예를 들어, 특허문헌 1), 또 장시간 보존의 경우에는 동결을 실시하는 보존 방법이 알려져 있다 (예를 들어, 특허문헌 2). 예를 들어, 암에 대한 면역 요법인 양자 면역 요법이나 도너 임파구 수주(輸注) (DLI) 요법에서는, 세포를 조제 후 곧바로 사용 (투여) 하는 것은 작업상 곤란한 경우가 있기 때문에, 당해 세포를 사용할 때까지의 기간, 동결 보존할 것이 요구된다. 동결 보존 방법으로는, 약 40 종류의 성분으로 이루어지는 세포 배양용 배지에 동해(凍害) 보호제를 첨가한 것을 세포 보존액으로서 사용하는 방법이 알려져 있다.
그러나, 종래의 방법은 상기와 같이 약 40 종류의 성분이 함유되어 있는 배지를 사용하고 있고, 이들 성분 중에는 세포나 생체에 바람직하지 않은 것이 함유될 가능성이 있다. 또한 동결 보존한 세포를 융해 후, 생체 내에 투여하는 경우에는 투여될 때까지 동안, 액체 상태에서 세포를 보존할 필요가 있지만, 종래의 동결용 보존액에서는, 그 보존 시간의 경과와 함께, 세포의 생존율, 즉 생존 세포수가 현저하게 저하된다는 문제가 있다. 또, 융해 후에 세포를 세정하는 공정이 필요한 경우에는, 더욱 세포의 생존율이 저하된다는 문제도 있다.
일본 공개특허공보 2006-230396호 일본 공개특허공보 2002-233356호
본 발명의 과제는 높은 생존율을 유지할 수 있는 세포의 동결 보존 방법, 그리고 당해 동결 보존에 사용하기 위한 필수적인 조성을 갖는 동결용 보존액을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위하여, 세포의 동결 보존에 있어서 종래 사용되고 있는 배지 중의 약 40 종류의 성분으로부터, 생체에 무해하고, 또한 세포를 동결 보존할 때에 필수적인 성분을 찾아내기 위하여, 방대한 조합을 하나하나 검증한 결과, 나트륨염, 칼륨염, 당, 동해 보호제, 그리고 탄산수소염 및/또는 탄산염을 함유하는 용액을 사용함으로써, 융해 후에 있어서도 높은 생존율을 유지한 세포가 얻어지는 것을 알아냈다. 또한 당해 용액을 사용함으로써, 상기 동결 보존한 세포를 융해 후, 액체 현탁 상태에서 장기 보존한 경우에 있어서도, 놀랍게도, 한 번 동결되었음에도 불구하고, 높은 생존율을 유지한 채로 세포를 보존할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉 본 발명을 개설(槪說)하면,
[1] 나트륨염, 칼륨염, 당류, 동해 보호제, 그리고 탄산수소염 및/또는 탄산염을 필수 성분으로서 함유하고, 단백질, 마그네슘염 및 칼슘염으로 이루어지는 군에서 선택되는 성분을 추가로 임의로 함유해도 되는 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 세포의 동결 보존 방법,
[2] 당류가 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 만노오스, 자일로오스, 및 아라비노오스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종류의 당류인 [1] 의 방법,
[3] 동해 보호제가 디메틸술폭사이드, 하이드록시에틸 스타치, 에틸렌글리콜, 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종류의 보호제인 [1] 의 방법,
[4] 단백질이 혈액 유래 단백질인 [1] 의 방법,
[5] [1] 의 방법에 의해 동결 보존된 세포 용액을 융해시키고, 액체 현탁 상태로 추가로 보존하는 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법,
[6] 나트륨염, 칼륨염, 당류, 동해 보호제, 그리고 탄산수소염 및/또는 탄산염을 필수 성분으로서 함유하고, 단백질, 마그네슘염 및 칼슘염으로 이루어지는 군에서 선택되는 성분을 추가로 임의로 함유해도 되는 것을 특징으로 하는 세포의 동결용 보존액
에 관한 것이다.
본 발명에 의해, 융해 후에 높은 생존율을 유지한 세포가 얻어지는 동결 보존이 가능하고, 또한 융해 후의 액체 현탁 상태에서 보존하는 경우에 있어서도, 당해 세포는 높은 생존율을 유지하고, 그 생리 기능도 유지하고 있는 점에서, 세포의 기초 연구, 의료에 대한 응용 연구 및 적용에 있어서 매우 유용하다.
도 1 은 본 발명의 보존 방법에 사용하는 용액의 필수 성분을 검토했을 때의 세포 생존 활성의 일례를 나타내는 도면이다.
도 2 는 동결 보존한 세포의 반복 동결 융해 후의 세포 생존 활성을 비교한 도면이다.
도 3 은 동결 보존한 세포를 융해 후, 장시간 액체 현탁 상태에서 보존한 경우의 세포 생존 활성을 비교한 도면이다.
도 4 는 동결 보존한 상이한 세포를 융해 후, 장시간 액체 현탁 상태에서 보존한 경우의 세포 생존 활성을 비교한 도면이다.
도 5 는 동결 보존한 세포의 반복 동결 융해 후의 세포 생존 활성을 비교한 도면이다.
도 6 은 동결 보존한 세포를 융해 후, 장시간 액체 현탁 상태에서 보존한 경우의 세포 생존 활성을 비교한 도면이다.
이하에 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명은 나트륨염, 칼륨염, 당류, 동해 보호제, 그리고 탄산수소염 및/또는 탄산염을 함유하는 용액 중에 세포를 현탁시키고, 얻어진 세포 현탁액을 동결 보존하는 것을 특징으로 하는 세포의 동결 보존 방법을 제공한다. 즉, 나트륨염, 칼륨염, 당류, 동해 보호제, 그리고 탄산수소염 및/또는 탄산염은, 본 발명에 있어서의 세포의 동결 보존에 필요하고 또한 충분한 성분 [본 발명의 동결 보존 방법에 사용하는 용액 (본 발명의 동결용 보존액) 의 필수 성분이라고도 한다] 이다.
본원 명세서에 있어서 「나트륨염」은 용매에 용해시켰을 때에 나트륨 이온을 발생시키는 것이면 특별히 한정되지 않고, 옥소산염, 할로겐화물, 산화물, 수산화물, 무기염 또는 유기산염 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 옥소산염으로는 과탄산나트륨 (Na2CO4), 아이티온산나트륨 (아디티온산나트륨, 나트륨하이드로술파이트) (Na2S2O4), 아황산나트륨 (Na2SO3), 아황산수소나트륨 (NaHSO3), 황산나트륨 (망초 : Na2SO4), 티오황산나트륨 (하이포) (Na2S2O3), 아질산나트륨 (NaNO2), 질산나트륨 (NaNO3), 할로겐화물로는 불화나트륨 (NaF), 염화나트륨 (NaCl), 브롬화나트륨 (NaBr), 요오드화나트륨 (NaI), 산화물로는 산화나트륨 (Na2O), 과산화나트륨 (Na2O2), 수산화물로는 수산화나트륨 (가성 소다 : NaOH), 무기염으로는 수소화나트륨 (NaH), 황화나트륨 (Na2S), 황화수소나트륨 (수황화나트륨) (NaHS), 규산나트륨 (Na2SiO3), 인산삼나트륨 (Na3PO4), 붕산나트륨 (Na3BO3), 수소화붕소나트륨 (NaBH4), 테트라클로로금산나트륨 (Na[AuCl4]), 유기산염으로는 아세트산나트륨 (CH3COONa), 시트르산나트륨 등을 들 수 있다. 이들 나트륨염은 1 종류 또는 복수 종류를 조합하여도 된다. 본 발명에 있어서, 1 종류로는 염화나트륨이 복수 종류로는 염화나트륨 및 시트르산나트륨이 바람직하게 사용된다. 나트륨염 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 동결용 보존액에 함유되는 전체 나트륨 이온의 최종 농도로서, 바람직하게는 0.01 ? 5000 m㏖/ℓ, 보다 바람직하게는 0.1 ? 1000 m㏖/ℓ, 더욱 바람직하게는 1 ? 300 m㏖/ℓ 이다.
본원 명세서에 있어서 「칼륨염」은 용매에 용해시켰을 때에 칼륨 이온을 발생시키는 것이면 특별히 한정되지 않고, 옥소산염, 할로겐화물, 산화물, 수산화물, 무기염 또는 유기산염 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 옥소산염으로는, 질산칼륨 (KNO3), 황산칼륨 (K2SO4), 과탄산칼륨 (K2CO4), 할로겐화물로는 불화칼륨 (KF), 불화수소칼륨 (KHF2), 염화칼륨 (KCl), 브롬화칼륨 (KBr), 요오드화칼륨 (KI), 산화물로는 과산화칼륨 (K2O2), 산화칼륨 (K2O), 수산화물로는 수산화칼륨 (KOH), 무기염으로서 수소화칼륨 (KH), 황화칼륨 (K2S), 황화수소칼륨 (수황화칼륨 : KSH), 과망간산칼륨 (KMnO4), 크롬산칼륨 (K2CrO4), 염소산칼륨 (KClO3) 등을 들 수 있다. 이들 칼륨염은 1 종류 또는 복수 종류를 조합하여도 된다. 본 발명에 있어서, 염화칼륨이 바람직하게 사용된다. 칼륨염 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 동결용 보존액에 함유되는 전체 칼륨 이온의 최종 농도로서, 바람직하게는 0.01 ? 5000 m㏖/ℓ, 보다 바람직하게는 0.1 ? 1000 m㏖/ℓ, 더욱 바람직하게는 1 ? 100 m㏖/ℓ 이다.
본 명세서에 있어서 「탄산수소염」은 용매에 용해시켰을 때에 탄산수소 이온을 발생시키는 것이면 특별히 한정되지 않고, 여러 가지 양이온과의 염을 사용할 수 있다. 예를 들어, 탄산수소암모늄 (NH4HCO3), 탄산수소칼륨 (KHCO3), 탄산수소칼슘 (Ca(HCO3)2), 탄산수소나트륨 (NaHCO3), 탄산수소마그네슘 (Mg(HCO3)2) 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「탄산염」은 용매에 용해시켰을 때에 탄산 이온을 발생시키는 것이면 특별히 한정되지 않고, 여러 가지 양이온과의 염을 사용할 수 있다. 예를 들어, 탄산암모늄 ((NH4)2CO3), 탄산칼륨 (K2CO3), 탄산칼슘 (CaCO3), 탄산나트륨 (Na2CO3), 탄산바륨 (BaCO3), 탄산마그네슘 (MgCO3), 탄산리튬 (Li2CO3), 탄산구리 (II) (CuCO3), 탄산철 (II) (FeCO2), 탄산은 (I) (Ag2CO3) 등을 들 수 있다.
이들 탄산수소염 및/또는 탄산염은 1 종류 또는 복수 종류를 조합하여도 된다. 본 발명에 있어서, 탄산수소나트륨이 바람직하게 사용된다. 탄산수소염 및/또는 탄산염의 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 동결용 보존액에 함유되는 탄산수소 이온과 탄산 이온의 합계의 최종 농도로서, 바람직하게는 0.01 ? 1000 m㏖/ℓ, 보다 바람직하게는 0.1 ? 500 m㏖/ℓ, 더욱 바람직하게는 1 ? 100 m㏖/ℓ 이다.
본원 명세서에 있어서 「당류」는 단당, 올리고당 또는 당알코올을 사용할 수 있다. 예를 들어, 단당으로는 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 만노오스, 자일로오스, 아라비노오스, 올리고당으로는 트레할로오스, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 셀로비오스, 당알코올로는 자일리톨, 소르비톨 등을 들 수 있다. 이들 당류는 1 종류 또는 복수 종류를 조합하여도 되는데, 본 발명에 있어서는 바람직하게는 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 만노오스, 자일로오스, 및 아라비노오스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종류의 당류이고, 보다 바람직하게는 글루코오스이다. 당류의 함유량은, 동결용 보존액 중, 바람직하게는 0.01 ? 100 g/ℓ, 보다 바람직하게는 0.1 ? 100 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 0.25 ? 50 g/ℓ 이다.
본원 명세서에 있어서 「동해 보호제」란, 디메틸술폭사이드 (DMSO), 하이드록시에틸 스타치 (HES), 에틸렌글리콜, 글리세롤 등을 들 수 있다. 또, 시판품으로는 CP-1〔HES 17.65 % (W/V), DMSO 14.71 % (V/V) 를 함유하는 생리 식염수, 교쿠토 제약 공업사 제조〕을 들 수 있다. 이들 동해 보호제는 1 종류 또는 복수 종류를 조합하여도 된다. 본 발명에 있어서, DMSO 및 하이드록시에틸 스타치가 바람직하게 사용된다. 동해 보호제의 함유량은, 동결용 보존액 중, 바람직하게는 0.01 ? 50 %, 보다 바람직하게는 1 ? 40 %, 더욱 바람직하게는 3 ? 30 % 이다. 또, 동해 보호제로서 DMSO 및 하이드록시에틸 스타치를 병용하는 경우, 총함유량은 상기 범위 내에 포함되는 것이 바람직하고, 또한, 각각의 농도가, DMSO 농도는 바람직하게는 0.01 ? 50 %, 보다 바람직하게는 1 ? 30 %, 더욱 바람직하게는 2 ? 15 % 이고, 하이드록시에틸 스타치 농도는 바람직하게는 0.01 ? 50 %, 보다 바람직하게는 1 ? 30 %, 더욱 바람직하게는 2 ? 15 % 이다.
본 발명의 바람직한 양태에 있어서는, 상기의 본 발명의 세포의 동결 보존 방법에 사용되는 용액의 필수 성분에 더하여, 임의로 단백질, 마그네슘염 및 칼슘염으로 이루어지는 군에서 선택되는 성분을 추가로 함유시켜도 된다.
본원 명세서에 있어서 「단백질」은 특별히 한정되지 않고, 단리된 단백질, 또는 입수할 수 있는 재조합 단백질을 들 수 있다. 예를 들어, 혈액 유래 단백질을 들 수 있다. 혈액 유래 단백질로는 혈장 유래 단백질, 혈청 유래 단백질 를 들 수 있고, 구체적으로는 혈청 알부민, 혈청 글로블린 등을 들 수 있다. 또 혈청 알부민으로는, 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민을 들 수 있다. 시판품으로는 부미네이트 정주액(靜注液) 25 % (25 % 인간 혈청 알부민, 박스터사 제조) 등을 들 수 있다. 이들의 단백질은 1 종류 또는 복수 종류를 조합하여도 된다. 본 발명에 있어서, 인간 혈청 알부민이 바람직하다. 단백질의 함유량은, 동결용 보존액 중, 바람직하게는 0.01 ? 50 %, 보다 바람직하게는 1 ? 30 %, 더욱 바람직하게는 2 ? 15 % 이다.
본원 명세서에 있어서 「마그네슘염」이란, 용매에 용해시켰을 때에 마그네슘 이온을 발생시키는 것이면 특별히 한정되지 않고, 옥소산염, 할로겐화물, 산화물, 수산화물, 무기염 또는 유기산염 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 옥소산염으로는 질산마그네슘 (Mg(NO3)2), 황산마그네슘 (MgSO4), 과탄산마그네슘 (MgCO4), 할로겐화물로는 불화마그네슘 (MgF2), 불화수소마그네슘 (Mg(HF2)2), 염화마그네슘 (MgCl2), 브롬화마그네슘 (MgBr2), 요오드화마그네슘 (MgI2), 산화물로는 과산화마그네슘 (MgO2), 산화마그네슘 (MgO), 수산화물로는 수산화마그네슘 (Mg(OH)2), 무기염으로서 수소화마그네슘 (MgH2), 황화마그네슘 (MgS), 황화수소마그네슘 (수황화마그네슘 : Mg(SH)2), 과망간산마그네슘 (Mg(MnO4)2), 크롬산마그네슘 (MgCrO4), 염소산마그네슘 (Mg(ClO3)2) 등을 들 수 있다. 이들 마그네슘염은 1 종류 또는 복수 종류를 조합하여도 된다. 본 발명에 있어서, 염화마그네슘이 바람직하게 사용된다. 마그네슘염 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 동결용 보존액에 함유되는 전체 마그네슘 이온의 최종 농도로서, 바람직하게는 0.01 ? 10 m㏖/ℓ, 보다 바람직하게는 0.1 ? 5 m㏖/ℓ 이다.
본원 명세서에 있어서 「칼슘염」이란, 용매에 용해시켰을 때에 칼슘 이온을 발생시키는 것이면 특별히 한정되지 않고, 옥소산염, 할로겐화물, 산화물, 수산화물, 무기염 또는 유기산염 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 옥소산염으로는 질산칼슘 (Ca(NO3)2), 황산칼슘 (CaSO4), 과탄산칼슘 (CaCO4), 할로겐화물로는 불화칼슘 (CaF2), 불화수소칼슘 (Ca(HF2)2), 염화칼슘 (CaCl2), 브롬화칼슘 (CaBr2), 요오드화칼슘 (CaI2), 산화물로는 과산화칼슘 (CaO2), 산화칼슘 (CaO), 수산화물로는 수산화칼슘 (Ca(OH)2), 무기염으로서 수소화칼슘 (CaH2), 황화칼슘 (CaS), 황화수소칼슘 (수황화칼슘 : Ca(SH)2), 과망간산칼슘 (Ca(MnO4)2), 크롬산칼슘 (CaCrO4), 염소산칼슘 (Ca(ClO3)2) 등을 들 수 있다. 이들 칼슘염은 1 종류 또는 복수 종류를 조합하여도 된다. 본 발명에 있어서, 염화칼슘이 바람직하게 사용된다. 칼슘염 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 동결용 보존액에 함유되는 전체 칼슘 이온의 최종 농도로서, 바람직하게는 0.01 ? 10 m㏖/ℓ, 보다 바람직하게는 0.1 ? 5 m㏖/ℓ 이다.
본 발명의 방법에 사용하는 동결용 보존액의 성분 중 나트륨염과 칼륨염의 농도비로서, 나트륨 이온과 칼륨 이온의 농도비 (나트륨 이온/칼륨 이온) 는, 바람직하게는 1/1000 ? 1000/1, 보다 바람직하게는 1/100 ? 100/1, 더욱 바람직하게는 1/10 ? 100/1, 더욱 바람직하게는 1/1 ? 100/1, 더욱 바람직하게는 10/1 ? 50/1이다.
또, 본 발명의 동결용 보존액은, 상기의 성분 이외에, 세포에 대한 상해성이 없는 물질, 예를 들어, 비타민류, 아미노산류 등을 추가로 함유시켜도 된다.
또한, 본 발명의 동결용 보존액은, 상기의 성분 이외에, pH 조정이나 완충 작용을 발휘하는 관점에서, 인산 이온을 함유해도 되지만, 융해 후의 세포를 그대로 생체에 사용한다는 관점에서 구성 성분을 적게 하는 것이 바람직하고, 함유하지 않는 것으로 해도 된다.
본 발명의 동결용 보존액 중, 나트륨염, 칼륨염, 당류, 동해 보호제, 그리고 탄산수소염 및/또는 탄산염은, 각각 필요량 칭량하여, 모든 성분을 순수 또는 생리 식염수에 용해시켜 조제할 수 있다. 또, 각각의 성분을 따로따로 순수 또는 생리 식염수에 용해시켜 조제하고, 각각의 성분 용액을 필요량 혼합함으로써 조제 해도 된다. 상기 동결용 보존액을 조제할 때에는, 각 성분을 순수 또는 생리 식염수에 용해 후에 제균 공정 (예를 들어 제균 여과 공정) 을 넣어도 된다. 또한, 임의로, 단백질, 마그네슘염, 칼슘염을 동일하게 조제하여 첨가해도 된다. 또는, 나트륨염, 칼륨염, 당류, 동해 보호제, 그리고 탄산수소염 및/또는 탄산염을 함유하는 시판되고 있는 용액을 여러 종류 조합하여 사용해도 된다. 시판품으로는 예를 들어, 비카본 수액 (아지노모토사 제조), 일본 약국방 포도당액 (예를 들어, 닛신 제약사 제조), 일본 약국방 염화나트륨액 (예를 들어, 오오츠카 제약사 제조), 일본 약국방 염화칼륨액 (예를 들어, 오오츠카 제약사 제조), 일본 약국방 탄산수소나트륨액 (예를 들어, 오오츠카 제약사 제조), CP-1 (교쿠토 제약사 제조), 부미네이트 정주액 25 % (25 % 인간 혈청 알부민, 박스터사 제조) 를, 본 발명의 필요 농도를 함유하도록 무균 조건 하에서 혼합해도 된다.
본 발명의 동결용 보존액을 사용할 때의 삼투압에 대해 특별히 한정되지 않지만, 세포에 대해 손상을 주지 않는 삼투압비인 것이 바람직하고, 예를 들어, 인간 임파구 세포의 보존에 사용하는 경우, 120 ? 1500 mOsm/ℓ 가 바람직하고, 250 ? 300 mOsm/ℓ 가 보다 바람직하다. 삼투압의 조정에는, 본 발명의 세포의 동결 보존 방법에 사용되는 용액의 필수 성분 중 어느 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 동결용 보존액의 pH 에 대해 특별히 한정되지 않지만, 세포에 대해 손상을 주지 않는 pH 인 것이 바람직하고, 예를 들어, 인간 임파구 세포의 보존에 사용하는 경우, 3.0 ? 10.0 이 바람직하고, 4.5 ? 9.0 이 보다 바람직하다. pH 조정에는, 본 발명의 세포의 동결 보존 방법에 사용되는 용액의 필수 성분 중 어느 것을 사용할 수 있다.
상기의 본 발명의 세포의 동결 보존 방법에 사용되는, 나트륨염, 칼륨염, 당류, 동해 보호제, 그리고 탄산수소염 및/또는 탄산염을 포함하는 필수 성분을 함유 하고, 임의로 단백질, 마그네슘염 및 칼슘염으로 이루어지는 군에서 선택되는 성분을 추가로 함유하는 동결 보존용 용액도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 동결 보존 방법에 사용할 수 있는 세포로는, 인간을 포함하는 포유 동물로부터 단리한 여러 가지 세포나 세포 집단, 이들로부터 유도된 세포 등을 들 수 있다. 단리된 여러 가지 세포로는 예를 들어, 말초혈 단핵구 (PBMC), 조혈 간세포, 제대혈 단핵구, 혈구계 세포, 임파구, T 세포, B 세포, 나이브 세포, 메모리 세포 등을 들 수 있고, 유도된 세포로는, 세포 상해 활성을 갖는, 림포카인 활성화 킬러 세포 (LAK 세포), 세포 상해성 T 세포 (CTL), 종양 침윤 임파구 (TIL), NK 세포 등을 들 수 있는데, 이들 세포에 한정되는 것은 아니다. 이들 세포는 공지된 방법으로 조제하면 된다.
목적으로 하는 세포를 동결용 보존액에 균일하게 현탁시킬 때의 세포 농도는 특별히 한정되지 않고, 세포의 종류, 세포의 사용 용도, 세포의 크기, 보존 용기의 사이즈, 보존 기간 등에 따라 적절히 결정하면 되는데, 예를 들어, 바람직하게는 1×104 ? 1×109 cells/㎖, 보다 바람직하게는 1×105 ? 1×109 cells/㎖, 더욱 바람직하게는 2×105 ? 5×108 cells/㎖ 이다. 보존 용기로는, 세포의 동결 보존이 가능하면 특별히 한정되지 않고, 동결 보존백, 알루미늄 프로텍터, 미러클 백, 크라이오제닉 바이알 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포의 동결 보존 방법이란, 목적으로 하는 세포를 본 발명의 동결용 보존액에 현탁시켜 세포 현탁액을 조제 후, 초저온으로 유지된 프리저 내에 넣어 방치하고, 세포 현탁액을 동결시킨 상태에서 보존하는 방법을 말한다. 여기에서 말하는 초저온이란, 세포 현탁액이 완전하게 동결되는 온도이면 특별히 한정되지 않고, 통상 마이너스 60 ℃ 이하이면 된다. 또, 액체 질소를 사용한 세포의 동결 보존 방법도, 본 발명에 포함된다. 바람직하게는 액체 질소를 충전한 프리저 중, 마이너스 70 ℃ 이하의 온도에서 세포 현탁액이 보존된다. 본 발명의 방법에 의한 세포의 동결 보존 기간은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 5 분 ? 48 개월 사이, 바람직하게는 1 일 ? 12 개월 사이이다.
본 발명의 방법에 의해 동결 보존된 세포 현탁액은, 그 후 융해시켜, 비동결 상태에서 추가로 보존할 수 있다. 즉, 본 발명은, 상기 동결 보존된 세포 현탁액을 융해시켜, 비동결 상태, 즉 액체 현탁 상태로 추가로 보존하는 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법도 제공한다. 동결 보존된 세포 현탁액을 융해시키는 방법은 특별히 한정되지 않고, 동결 상태의 세포 현탁액을 바람직하게는 0 ? 40 ℃, 보다 바람직하게는 20 ? 37 ℃ 에서 융해시키면 된다. 융해 후의 보존 온도는 바람직하게는 0 ? 40 ℃, 보다 바람직하게는 4 ? 37 ℃ 이다. 당해 비동결 상태의 세포 현탁액의 보존 기간은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 0 ? 18 일간, 바람직하게는 0 ? 10 일간, 보다 바람직하게는 0 ? 3 일간이다.
본 발명의 방법에 의해 동결 보존한 세포는 융해 후에도 높은 생존율을 유지하고 있고, 추가로 융해 후, 계속된 보존도 가능하다. 또, 융해 후의 세포의 세정 공정을 거치지 않고 그대로 생체에 투여할 수 있다.
실시예
이하에 실시예로서 본 발명을 더욱 구체적으로 나타내지만, 본 발명은 이하의 실시예의 범위만으로 전혀 한정되는 것이 아니다. 또한, 본 실시예에서, 「실온」이란 20 ? 30 ℃ 이다.
실시예 1 보존액의 검토
(1) 검토 용액의 조제
스크리닝용 보존액으로서 표 1 에 나타내는 용액을 조제하였다.
용액
No.
1 생리 식염수 (비교예 : 오오츠카 제약사 제조)
2 질산칼슘사수화물 100 ㎎/ℓ, 황산마그네슘 44.8 ㎎/ℓ, 탄산수소나트륨 2 g/ℓ, 인산수소이나트륨 800 ㎎/ℓ, 염화칼륨 400 ㎎/ℓ, 염화나트륨 6 g/ℓ, 포도당 2 g/ℓ 를 함유하는 수용액 (최종 농도 : 칼슘 이온 0.42 m㏖/ℓ, 마그네슘 이온 0.37 m㏖/ℓ, 탄산수소 이온 23.81 m㏖/ℓ, 나트륨 이온 137.78 m㏖/ℓ, 인산 이온 5.64 m㏖/ℓ, 칼륨 이온 5.37 m㏖/ℓ ; 나트륨 이온/칼륨 이온 = 25.66/1)
3 용액 2 로부터 질산칼슘을 제거한 수용액 (최종 농도 : 마그네슘 이온 0.37 m㏖/ℓ, 탄산수소 이온 23.81 m㏖/ℓ, 나트륨 이온 137.78 m㏖/ℓ, 인산 이온 5.64 m㏖/ℓ, 칼륨 이온 5.37 m㏖/ℓ ; 나트륨 이온/칼륨 이온 = 25.66/1)
4 용액 2 로부터 황산마그네슘을 제거한 수용액 (최종 농도 : 칼슘 이온 0.42 m㏖/ℓ, 탄산수소 이온 23.81 m㏖/ℓ, 나트륨 이온 137.78 m㏖/ℓ, 인산 이온 5.64 m㏖/ℓ, 칼륨 이온 5.37 m㏖/ℓ ; 나트륨 이온/칼륨 이온 = 25.66/1)
5 용액 2 로부터 탄산수소나트륨을 제거하고, 침투압 조정을 위해, 염화나트륨 농도를 7.38 g/ℓ 로 한 수용액 (최종 농도 : 칼슘 이온 0.42 m㏖/ℓ, 마그네슘 이온 0.37 m㏖/ℓ, 나트륨 이온 137.55 m㏖/ℓ, 인산 이온 5.64 m㏖/ℓ, 칼륨 이온 5.37 m㏖/ℓ ; 나트륨 이온/칼륨 이온 = 25.61/1)
6 용액 2 로부터 인산수소이나트륨을 제거하고, 침투압 조정을 위해, 염화나트륨 농도를 6.6 g/ℓ 로 한 수용액 (최종 농도 : 칼슘 이온 0.42 m㏖/ℓ, 마그네슘 이온 0.37 m㏖/ℓ, 탄산수소 이온 23.81 m㏖/ℓ, 나트륨 이온 136.75 m㏖/ℓ, 칼륨 이온 5.37 m㏖/ℓ ; 나트륨 이온/칼륨 이온 = 25.47/1)
7 용액 2 로부터 염화칼륨을 제거하고, 침투압 조정을 위해, 염화나트륨 농도를 6.3 g/ℓ 로 한 수용액 (최종 농도 : 칼슘 이온 0.42 m㏖/ℓ, 마그네슘 이온 0.37 m㏖/ℓ, 탄산수소 이온 23.81 m㏖/ℓ, 나트륨 이온 142.88 m㏖/ℓ, 인산 이온 5.64 m㏖/ℓ)
(2) 세포의 조제
인폼드?컨센트가 얻어진 인간 건강인 도너로부터, 60 ㎖ 분량의 헤파린 가채혈을 실시하였다. 얻어진 혈액을 약 15 ㎖ 씩 코니컬 튜브 (벡톤?디킨슨사 제조 또는 그레이너사 제조) 에 분주 후, 700×g, 실온에서 20 분간 원심하고, 원심 후의 상청인 혈장 획분과 인간 말초혈 단핵구 (PBMC) 를 함유하는 세포 획분으로 분리하였다. PBMC 를 함유하는 세포 획분은 둘베코 PBS (인비트로젠사 제조 또는 닛스이 제약사 제조) 를 사용하여 20 ㎖ 에 필업하여 희석하였다. 얻어진 희석 세포액을, Ficoll-Paque PREMIUM (GE 헬스케어 바이오 사이언스사 제조) 20 ㎖ 상에 중층(重層)하고, 700×g, 실온에서 20 분간 원심하였다. 원심 후, 분리한 층 중, PBMC 층을 피펫으로 회수하고, RPMI 1640 배지를 사용하여 30 ㎖ 에 필업한 후, 650×g, 4 ℃ 에서 10 분간 원심하여, 상청을 제거하였다. 동일하게, 600×g, 500×g 으로 단계적으로 원심 G 를 떨어뜨리면서 순차 원심 조작을 실시하여, 합계 3 회 세정을 반복하였다. 얻어진 PBMC 의 생세포 수 및 생존율 (%) 을 자동 혈구 계측 장치 (뉴클레오 카운터 Chemometec 사 제조) 를 사용하여 산출하였다.
이렇게 하여 얻어진 PBMC 를 사용하여, 국제 공개 제2009/019450호 팜플렛에 기재된 방법에 의해 인간 T 임파구 세포를 조제하였다. 얻어진 인간 T 임파구 세포로부터 배지를 제거하고, 세포 농도를 3×108 세포/㎖ 의 농도가 되도록 생리 식염수에 현탁하여, 세포액을 조제하였다.
(3) 세포액의 미온 (37 ℃) 처리에 의한 스크리닝
실시예 1-(1) 에서 조제한 각 검토 용액 40 ㎕ 와 실시예 1-(2) 에서 조제한 세포액 10 ㎕ 를, 검토 용액마다 1.5 ㎖ 플라스틱 튜브 (트레프사 제조) 에 넣고 혼화하여 세포 현탁액을 조제하였다. 그 후, 37 ℃ 로 설정한 항온기 내에서 3 시간 가만히 정지시켰다.
(4) MTT 어세이에 의한 세포 생존 활성의 측정
실시예 1-(3) 에 기재된 처리 후의 각 세포 현탁액은, 이하에 기재된 MTT 어세이를 사용하여, 세포의 대사 (호흡) 를 세포 생존 활성으로 하여 측정을 실시하였다.
먼저, 각 세포 현탁액 50 ㎕ 에 대해, 둘베코 PBS (-) (닛스이 제약사 제조) 로 5 ㎎/㎖ 로 조제한 MTT〔브롬화 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨, 나카라이테스크사 제조〕50 ㎕, 및 10 % 소태아 혈청 (기브코사 제조) 과 1 % 페니실린?스트렙토마이신 혼합 용액 (나카라이테스크사 제조) 을 함유하는 RPMI 1640 배지 (와코 쥰야쿠사 제조) 400 ㎕ 를 첨가하여, 혼화하였다. 다음으로, 혼화한 용액을 100 ㎕ 씩, 96 구멍 멀티 플레이트 (코스터사 제조 또는 벡톤?디킨슨사 제조) 의 4 웰로 파종하고, 37 ℃, 이산화탄소 농도 5 % 의 조건 하에서 90 분간 배양하였다. 배양 종료 후, 염산?2-프로판올 시액 [제 15 개정 일본 약국방에 준하여 조제 : 2-프로판올 (특급, 나카라이테스크사 제조) 과 염산 (나카라이테스크사 제조) 을 100 : 0.33 의 비율로 혼합한 것] 100 ㎕ 를 첨가하여, 색소를 완전하게 용해시켰다. 용해 후의 용액을, 측정 파장 570 ㎚, 대조 파장 655 ㎚로 하여, 마이크로 플레이트 흡광도계 (680 XR, 바이오 라드사 제조) 로 흡광도를 측정하였다. 얻어진 흡광도의 값을 세포의 대사 (호흡) 의 세포 생존 활성 (MTT 활성치) 으로 하였다. 그 결과를 도 1 에 나타낸다. 즉 도 1 은 측정치 (4 웰 측정) 의 흡광도의 평균치를 용액의 종류마다 나타낸 도면이다. 도면 중, 가로축은 MTT 활성치를 나타낸다. 또, 도면 중, 「Error Bar = S.E.」 는 4 웰의 측정치의 표준 오차를 나타낸다.
도 1 로부터 명확한 바와 같이 7 종류의 성분을 함유하는 용액 2 에 비하여, 탄산수소나트륨을 함유하지 않는 용액 5 및 염화칼륨을 함유하지 않는 용액 7 에서는 MTT 활성치가 낮아져 있어, 이들 성분이 세포의 안정화에 필수인 것이 명확해졌다. 한편, 질산칼슘, 황산마그네슘, 또는 인산수소이나트륨을 함유하지 않는 용액 (각각, 용액 3, 용액 4, 용액 6) 에서는, MTT 활성치가 낮아져 있지 않아, 세포의 안정화에 필수가 아닌 것이 명확해졌다.
동일한 시험을 RPMI 1640 배지에 있어서 밝혀져 있는 전체 40 종류의 성분에 대해, 여러가지 조합 및 여러 가지의 농도로 실시하고, 또한 동해 보호제로서 DMSO, 하이드록시에틸 스타치, 단백질로서 알부민의 이들 성분 중 1 종류 또는 여러 종류와 조합한 시험을 실시하였다. 합계 100 종류 이상의 용액에 대해 스크리닝을 실시하여, 세포의 안정화에 필수적인 성분인지를 비교 검토한 결과, 상기 40 종류의 성분 중, 나트륨염, 칼륨염, 탄산수소염 및/또는 탄산염, 그리고 당류의 4 성분이 필요하고 또한 충분한 것을 밝혔다.
실시예 2 동결 융해에 대한 영향
(1) 검토 용액의 조제
동결 융해 조작에 대한 안정성 검토용 보존액으로서, 표 2 에 나타내는 3 종류의 용액을 조제하였다.
용액
No.
8 RPMI 1640 배지 (비교예 : 와코 쥰야쿠사 제조)
9 생리 식염수 (비교예 : 오오츠카 제약사 제조) (최종 농도 : 나트륨 이온 154.00 m㏖/ℓ)
10 염화나트륨 6.6 g/ℓ, 염화칼륨 0.40 g/ℓ, 탄산수소나트륨 2.0 g/ℓ, 포도당 2.0 g/ℓ 를 함유하는 수용액 (최종 농도 : 탄산수소 이온 23.81 m㏖/ℓ, 나트륨 이온 136.75 m㏖/ℓ, 칼륨 이온 5.37 m㏖/ℓ ; 나트륨 이온/칼륨 이온 = 25.47/1)
(2) 시험 세포의 조제
실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 세포액을 조제하였다. 단, 세포는 6×108 cells/㎖ 의 농도가 되도록 생리 식염수에 현탁하여 조제하였다.
(3) 세포의 보존 (세포 용액의 동결 융해 처리)
실시예 2-(1) 에서 조제한 각 검토 용액 40 ㎕, 실시예 2-(2) 에서 조제한 세포액 10 ㎕, CP-1 (교쿠토 제약사 제조) 34 ㎕ (세포 현탁액 중의 동해 보호제 함유량 34 %), 및 부미네이트 정주액 25 % (25 % 인간 혈청 알부민, 박스터사 제조) 16 ㎕ [세포 현탁액 중의 단백질 함유량 4 % (W/V)] 를, 검토 용액마다 크라이오제닉 바이알 (날젠사 제조) 에 넣고 혼화하여 세포 현탁액을 조제하였다. 또한, 세포 현탁액은 각각 3 개씩 조제하였다. 그 후, 마이너스 85 ℃ 로 설정한 초저온조 내에서 18 시간 이상 가만히 정지시켜 세포 현탁액을 완전하게 동결시켰다. 완전 동결 확인 후, 37 ℃ 항온조로 옮겨 5 분 동안 융해시켰다. 이 조작을 1, 3, 7 회 반복한 것을 다음의 측정에 사용하였다.
(4) MTT 어세이에 의한 세포 생존 활성의 측정
실시예 2-(3) 에 기재된 처리 후의 각 세포 현탁액은 실시예 1-(4) 와 동일한 MTT 어세이를 사용하여 세포 생존 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 2 에 나타낸다. 즉 도 2 는 측정치 (4 웰 측정) 의 흡광도의 평균치를 용액의 종류 및 동결 융해 횟수마다 나타낸 도면이다. 도면 중, 가로축은 동결 융해 횟수를 나타내고, 세로축은 MTT 활성치를 나타낸다. 또, 용액 8 의 결과는 백색 사각을 점선으로 연결한 것으로 나타낸다. 용액 9 의 결과는 흑색 사각을 점선으로 연결한 것으로 나타낸다. 용액 10 의 결과는 흑색 원을 실선으로 연결한 것으로 나타낸다.
도 2 로부터 명확한 바와 같이, 염화나트륨, 염화칼륨, 탄산수소나트륨, 및 포도당의 4 성분만을 함유하는 용액 10 은, 1 회, 3 회 및 7 회의 동결 융해 중 어느 경우에 있어서나, 40 종류의 다수 성분을 함유하는 용액 8 (RPMI 1640 배지) 과 동등한 세포 생존 활성을 갖고 있는 것이 명확해졌다. 한편, 생리 식염수에 대해서는, 동결 융해 조작을 반복함으로써 활성이 현저하게 낮아져 있어, 이 성분만으로는 불충분하다는 것이 명확해졌다.
실시예 3 세포 융해시 및 융해 전후의 가공시에 있어서의 미온 상태 (37 ℃) 에 대한 안정성
(1) 검토 용액의 조제
실시예 2-(1) 에 기재된 용액과 동일한 용액을 조제하였다.
(2) 시험 세포의 조제
실시예 2-(2) 와 동일한 방법으로 세포액을 조제하였다.
(3) 세포액의 미온 (37 ℃) 처리
실시예 3-(1) 에서 조제한 각 검토 용액 40 ㎕, 실시예 3-(2) 에서 조제한 세포액 10 ㎕, CP-1 (교쿠토 제약사 제조) 34 ㎕, 및 부미네이트 정주액 25 % (25 % 인간 혈청 알부민, 박스터사 제조) 16 ㎕ 를, 검토 용액마다 크라이오제닉 바이알 (날젠사 제조) 에 넣고 혼화하여 세포 현탁액을 조제하였다. 그 후, 실시예 2-(3) 과 동일한 방법으로 세포 현탁액의 동결 융해를 실시하였다. 단, 동결 융해는 1 회 실시하고, 융해 후의 각 세포 용액은 37 ℃ 로 설정한 항온기 내에서 3 시간 가만히 정지시켰다. 또한, 세포 현탁액 중의 동해 보호제 함유량 및 단백질 함유량은 실시예 2-(3) 과 동일하다.
(4) MTT 어세이에 의한 세포 생존 활성의 측정
실시예 3-(3) 에 기재된 처리 후의 각 세포 현탁액은, 실시예 1-(4) 와 동일한 MTT 어세이를 사용하여, 세포 생존 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 3 에 나타낸다. 즉 도 3 은 측정치 (4 웰 측정) 의 흡광도의 평균치를 용액의 종류마다 나타낸 도면이다. 도면 중, 가로축은 MTT 활성치를 나타낸다.
또, 인폼드?컨센트가 얻어진 실시예 1-(2) 와 상이한 인간 건강인 도너의 혈액으로부터 실시예 1-(2) 와 동일하게 조제한 세포를 사용하여, 실시예 2-(1) 에 기재된 용액과 이하의 용액 11 을 조제하고, 동일한 검토를 실시하였다. 단, 실시예 3-(3) 에서 사용한 부미네이트 정주액 대신에, 생리 식염액 (오오츠카 제약사 제조) 16 ㎕ 를 각각 혼화하였다. 생리 식염수는 삼투압 조절을 위해 필요하고, 또, 음성(陰性) 대조에서도 사용되기 때문에 첨가가 필요하다. 첨가에 의해 이온 농도는 증가하지만, 그것에 의한 특별한 안정화 효과는 없는 것으로 생각된다.
?용액 11 : 6.6 g/ℓ 염화나트륨, 0.40 g/ℓ 염화칼륨, 2.0 g/ℓ 포도당을 함유하는 수용액 (최종 농도 : 나트륨 이온 112.94 m㏖/ℓ, 칼륨 이온 5.37 m㏖/ℓ ; 나트륨 이온/칼륨 이온 = 21.03/1)
그 결과를 도 4 에 나타낸다. 즉 도 4 는 측정치 (4 웰 측정) 의 흡광도의 평균치를 용액의 종류마다 나타낸 도면이다. 도면 중, 가로축은 MTT 활성치를 나타낸다.
도 3 및 4 로부터 명확한 바와 같이, 염화나트륨, 염화칼륨, 탄산수소나트륨, 및 포도당을 함유하는 4 성분과 동해 보호제, 단백질을 함유하는 용액 10 은, 동결 융해 후, 미온 상태에서 장시간 가만히 정지시킨 경우에 있어서도, 종래법에서 사용되는 40 종류의 다수 성분과 동해 보호제, 단백질을 함유하는 용액 8 (RPMI 1640 배지) 과 동등한 활성을 갖고 있는 것이 명확해졌다. 한편, 용액 9 (생리 식염수), 용액 11 (탄산수소나트륨을 함유하지 않는 용액 10) 에 대해서는, 동결 융해 후에 미온 상태에서 장시간 가만히 정지시키면 활성은 현저하게 낮아져, 이 성분만으로는 불충분하다는 것이 명확해졌다. 또, 보존하는 세포에 대해서는, 도 3 및 4 의 용액 8 ? 10 에서 동일한 경향을 나타내고 있는 점에서, 도너의 상이에 의한 영향은 받지 않는 것이 명확해졌다.
실시예 4 정주 실적이 있는 의약품에 의한 구성의 가부 1
(1) 검토 용액의 조제
실시예 2 및 3 에서 동결 융해에 의한 세포 생존 활성이 높은 용액이, 일본 내에 있어서 의약품 등록되어, 정주 실적이 있는 용액으로 구성한 경우라도 동일한 결과가 얻어지는지의 여부를 검토하기 위하여, 표 3 에 나타내는 용액을 조제하였다.
용액
No.
12 RPMI 1640 배지 (비교예 : 와코 쥰야쿠사 제조)
13 생리 식염수 (의약품 : 오오츠카 제약사 제조) (최종 농도 : 나트륨 이온 154.00 m㏖/ℓ)
14 비카본 수액 (의약품 : 아지노모토사 제조) 과, 일본 약국방 5 % 포도당 주사액 「닛신」(의약품 : 닛신 제약사 제조) 을 25 : 1 로 혼화한 용액 (최종 농도 : 탄산수소 이온 24 m㏖/ℓ, 나트륨 이온 130 m㏖/ℓ, 칼륨 이온 4 m㏖/ℓ, 당 함유량 1.9 g/ℓ ; 나트륨 이온/칼륨 이온 = 33.75/1)
(2) 시험 세포의 조제
실시예 2-(2) 와 동일한 방법으로 세포액을 조제하였다.
(3) 세포액의 동결 융해 처리
실시예 4-(1) 에서 조제한 각 검토 용액 40 ㎕, 실시예 4-(2) 에서 조제한 세포액 10 ㎕, CP-1 (교쿠토 제약사 제조) 34 ㎕, 및 부미네이트 정주액 25 % (25 % 인간 혈청 알부민, 박스터사 제조) 16 ㎕ 를, 검토 용액마다 크라이오제닉 바이알 (날젠사 제조) 에 넣고 혼화하여 세포 현탁액을 조제하였다. 또한, 세포 현탁액은 각각 3 개씩 조제하였다. 그 후, 실시예 2-(3) 과 동일한 동결 융해 조작을 실시하고, 동결 융해를 1, 3, 7 회 반복한 것을 다음의 측정에 사용하였다. 세포 현탁액 중의 동해 보호제 함유량 및 단백질 함유량은 실시예 2-(3) 과 동일하다.
(4) MTT 어세이에 의한 세포 생존 활성의 측정
실시예 4-(3) 에 기재된 처리 후의 각 세포 현탁액은, 실시예 1-(4) 와 동일한 MTT 어세이를 사용하여, 세포 생존 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 5 에 나타낸다. 즉 도 5 는 측정치 (4 웰 측정) 의 흡광도의 평균치를 용액의 종류 및 동결 융해 횟수마다 나타낸 도면이다. 도면 중, 가로축은 동결 융해 횟수를 나타내고, 세로축은 MTT 활성치를 나타낸다. 또, 용액 12 의 결과는 백색 사각을 점선으로 연결한 것으로 나타낸다. 용액 13 의 결과는 흑색 사각을 점선으로 연결한 것으로 나타낸다. 용액 14 의 결과는 흑색 원을 실선으로 연결한 것으로 나타낸다.
도 5 로부터 명확한 바와 같이, 용액 14 는 용액 12 (RPMI 1640 배지) 와 동등한 활성을 갖고 있었다. 이 결과로부터 염화나트륨, 염화칼륨, 탄산수소나트륨, 및 포도당의 4 성분을 함유하는 정주 실적이 있는 의약품을 사용하여 보존액을 구성함으로써, 종래법에서 사용되는 다수의 비의약품 성분을 함유하는 용액을 사용하여 얻어지는 보존액과 동등한 성능이 얻어지는 것이 명확해졌다.
실시예 5 정주 실적이 있는 의약품에 의한 구성의 가부 2
(1) 검토 용액의 조제 실시예 4-(1) 에 기재된 용액과 표 4 의 용액을 조제하였다.
용액
No.
15 비카본 수액 (의약품 : 아지노모토사 제조) 과, 일본 약국방 5 % 포도당 주사액 「닛신」(의약품 : 닛신 제약사 제조) 를 24 : 1 로 혼화한 용액 (최종 농도 : 탄산수소 이온 24 m㏖/ℓ, 나트륨 이온 130 m㏖/ℓ, 칼륨 이온 4 m㏖/ℓ, 당 함유량 1.9 g/ℓ ; 나트륨 이온/칼륨 이온 = 33.75/1)
16
 비카본 수액 (의약품 : 아지노모토사 제조) (최종 농도 : 탄산수소 이온 25 m㏖/ℓ, 나트륨 이온 135 m㏖/ℓ, 칼륨 이온 4 m㏖/ℓ ; 나트륨 이온/칼륨 이온 = 33.75/1)
(2) 시험 세포의 조제
실시예 2-(2) 와 동일한 방법으로 세포액을 조제하였다.
(3) 세포액의 미온 (37 ℃) 처리
실시예 5-(1) 에서 조제한 각 검토 용액 40 ㎕, 실시예 5-(2) 에서 조제한 세포액 10 ㎕, CP-1 (교쿠토 제약사) 34 ㎕, 및 부미네이트 정주액 25 % (25 % 인간 혈청 알부민, 박스터사 제조) 16 ㎕ 를 크라이오제닉 바이알 (날젠사 제조) 에 넣고 혼화하여 세포 현탁액을 조제하였다. 그 후, 실시예 2-(3) 과 동일한 방법으로 세포 현탁액의 동결 융해를 실시하였다. 단, 동결 융해는 1 회 실시하고, 융해 후의 각 세포 용액은 37 ℃ 로 설정한 항온기 내에서 3 시간 가만히 정지시켰다. 또한, 세포 현탁액 중의 동해 보호제 함유량 및 단백질 함유량은 실시예 2-(3) 과 동일하다.
(4) MTT 어세이에 의한 세포 생존 활성의 측정
실시예 5-(3) 에 기재된 온도 처리 후의 각 세포 용액은, 실시예 1-(4) 와 동일한 MTT 어세이를 사용하여, 세포 생존 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 6 에 나타낸다. 즉 도 6 은 측정치 (4 웰 측정) 의 흡광도의 평균치를 용액의 종류마다 나타낸 도면이다. 도면 중, 가로축은 MTT 활성치를 나타낸다.
도 6 으로부터 명확한 바와 같이, 용액 14 와 15 는 용액 12 (RPMI 1640 배지) 와 동등한 활성을 갖고 있었다. 이 결과로부터 염화나트륨, 염화칼륨, 탄산수소나트륨, 및 포도당의 4 성분을 함유하는 정주 실적이 있는 의약품을 사용하여 보존액을 구성함으로써, 종래법에서 사용되는 다수의 비의약품 성분을 함유하는 용액을 사용하여 얻어지는 보존액과 동등한 성능이 얻어지는 것이 명확해졌다.
산업상 이용 가능성
본 발명에 의해, 융해 후에 높은 생존율을 유지할 수 있는 세포의 동결 보존 방법, 그리고 당해 동결 보존에 사용하는 동결용 보존액이 제공된다. 또, 당해 동결 보존 방법에 사용함으로써, 융해 후에도 높은 생존율을 유지하고, 그 생리 기능도 유지하고 있는 상태로 세포를 장시간 보존할 수 있으며, 또한 동결 융해 후의 세포 세정 공정도 불필요한 점에서, 세포의 기초 연구, 의료에 대한 응용 연구에 있어서 매우 유용하다.

Claims (6)

  1. 나트륨염, 칼륨염, 당류, 동해 보호제, 그리고 탄산수소염 및/또는 탄산염을 필수 성분으로서 함유하고, 단백질, 마그네슘염 및 칼슘염으로 이루어지는 군에서 선택되는 성분을 추가로 임의로 함유해도 되는 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 세포의 동결 보존 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    당류가 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 만노오스, 자일로오스, 및 아라비노오스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종류의 당류인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    동해 보호제가 디메틸술폭사이드, 하이드록시에틸 스타치, 에틸렌글리콜, 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종류의 보호제인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단백질이 혈액 유래 단백질인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 동결 보존된 세포 용액을 융해시키고, 액체 현탁 상태로 추가로 보존하는 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
  6. 나트륨염, 칼륨염, 당류, 동해 보호제, 그리고 탄산수소염 및/또는 탄산염을 필수 성분으로서 함유하고, 단백질, 마그네슘염 및 칼슘염으로 이루어지는 군에서 선택되는 성분을 추가로 임의로 함유해도 되는 것을 특징으로 하는 세포의 동결용 보존액.
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