KR20120047270A

KR20120047270A - 황색포도상구균 유래 알파-톡신에 대한 인간 단일클론 항체 및 그의 농양 형성 치료 또는 예방의 용도

Info

Publication number: KR20120047270A
Application number: KR1020127004737A
Authority: KR
Inventors: 미카엘 루돌프; 홀거 코흐
Original assignee: 켄타 바이오테크 아게
Priority date: 2009-08-10
Filing date: 2010-08-10
Publication date: 2012-05-11
Also published as: EP2284193A1; ES2651762T3; RU2529946C2; CN102549013A; ES2529175T3; JP2013501506A; EP2860191B1; IN2012DN00797A; US9249215B2; EP2860191A1; EP2464665A1; KR101836130B1; US20120201829A1; RU2529946C9; CA2769394A1; CN102549013B; RU2012105045A; EP2464665B1; CA2769394C; IL217746A

Abstract

본 발명은 황색포도상구균의 알파-톡신에 대해 특이적인 인간 단일클론 항체 및 상기 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 적어도 하나의 항체 또는 적어도 하나의 상기 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 농양 형성을 치료 또는 예방하기 위한 상기 단일클론 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

황색포도상구균 유래 알파-톡신에 대한 인간 단일클론 항체 및 그의 농양 형성 치료 또는 예방의 용도{Human monoclonal antibody against S. aureus derived alpha-toxin and its use in treating or preventing abscess formation}

본 발명은 황색포도상구균(S. aureus)의 알파-톡신(alpha-toxin)에 특이적인 인간 단일클론 항체, 그것을 생산하는 하이브리도마(hybridoma), 그것을 암호화하는 핵산, 및 그것으로 형질전환된 숙주 세포(host cells)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단일클론 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 최소 하나의 항체 또는 최소 하나의 상기 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 농양 형성(abscess formation)의 치료 또는 예방을 위한 상기 단일클론 항체의 용도에 관한 것이다.

황색포도상구균(Staphylococcus aureus; S. aureus)은 기회 감염균(opportunistic pathogen)으로 여겨지는 조건적 혐기성(facultative anaerobic), 그람 양성(gram positive), 구형 세균(spherical bacterium)이다. 황색포도상구균은 일반적으로 건강한 사람의 코, 피부 및 위장관(gastrointestinal tract)의 점막 표면에 서식한다. 인구의 거의 20 내지 30%가 언제든지 황색포도상구균과 함께 서식한다. 이 세균은 종종 여드름(pimples) 및 종기(boils)와 같은 심각하지 않은 감염을 건강한 개인에게 야기한다. 보통 때는, 점막(mucosal) 및 상피(epidermal) 방어막(피부)가 황색포도상구균 감염을 방어한다. 화상(burns), 트라우마(trauma) 또는 수술 과정과 같은 손상의 결과로서 이러한 자연 방어막의 중단은 극적으로 감염의 위험을 증가시키고 심각한 및/또는 전신 감염(systemic infections)을 야기할 수 있다. 면역 시스템(예를 들어, 당뇨(diabetes), 말기 신장 질환(end-stage renal disease), 암, AIDS 및 다른 바이러스 감염)을 포함한 질병뿐만 아니라 예를 들어, 방사선요법(radiation), 화학(chemotherapeutic) 및 이식(transplantation) 요법과 같은 면역 억제요법(immunosuppressive therapies)은 감염의 위험을 증가시킨다. 황색포도상구균 기회 감염은 꽤 심각하게 될 수 있고, 심각한 사망률(morbidity) 또는 치사율(mortality)의 결과를 낳는 심장내막염(endocarditis), 균혈증(bacteremia), 골수염(osteomyelitis) 및 농양 형성(abscess formation)을 야기할 수 있다. 황색포도상구균 감염은 폐렴(pneumonia)와 같은 국부 감염(localized infection) 및 멀리 떨어진 장기 시딩(organ seeding)에 의해 야기되는 혈류 감염(blood stream infections) 및 농양 형성(abscess formation)과 같은 임상적으로 더욱 복합적인 황색포도상구균 감염으로 나뉠 수 있다.

황색포도상구균은 전세계적으로 혈류, 피부, 연조직, 및 하기도관(lower respiratory tract) 감염의 중요한 원인이다. 병원 내(nosocomial) 및 지역사회-획득(community-acquired) 감염 모두 여러 해 동안 빈도는 꾸준히 증가되어 왔다. 또한, 이러한 감염의 치료는 다중-약물 내성 균주(multi-drug resistant strains)의 출현 때문에 더욱 도전적으로 되어왔다. 미국과 같은 선진국에서, 메티실린-내성 황색포도상구균 균주(methicillin-resistant S. aureus strains, MRSA)에서의 β-락탐(lactam)계 항생제 내성은 병원 및 다른 의료서비스 기관(healthcare settings)에서 심각한 문제이다. 특히, 병원 외의 발생률을 포함한 모든 침습성의 MRSA 감염의 발생률(incidence rate)은 다른 세균성 병원체보다 높으며 이런 감염의 20%가 사망에 이른다. 또한, 반코마이신(vancomycin) 내성 획득의 발생은 심각한 황색포도상구균 감염에 대한 치료의 선택을 더욱 제한하였다.

황색포도상구균은 다양한 질병의 발병에 기여하는 독성 인자(virulence factors)의 무기를 갖는다. 이것은 대략적으로 표면 단백질 및 세포외 방출된 단백질로 세분될 수 있다. 표면 단백질은 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 리포테이코산(lipoteichoic acid)와 같은 세균 세포벽의 구조 성분을 포함하며, 단백질 A(protein A), 피브로넥틴-결합 단백질(fibronectin-binding protein) 및 응고 인자(clumping factor)를 포함하는 표면 단백질은 지수함수적 증식(exponential growth) 동안 우선적으로 발현된다. 분비 단백질은 일반적으로 세균 성장의 정지기 동안 세균 세포로부터 배출되고 알파-톡신(용혈소(hemolysin) 알파로도 알려진), 엔테로톡신(enterotoxin) B, 류코시딘(leukocidins)(팬톤-발렌타인 류코시딘(Panton-Valentine Leukocidine) PVL을 포함한), 리파아제(lipase) 및 V8 프로테아제(protease)와 같은 여러 톡신들을 포함한다. 그러나 이런 톡신에 대한 생화학 및 분자 특성에 대한 폭넓은 지식에도 불구하고, 황색포도상구균 감염의 발병에서의 톡신의 정확한 역할은 완전히 이해되지 않았다.

실험적 증거 및 유행병학적(epidemiological) 데이터는 다른 세포독소 중에 알파-톡신이 폐렴의 발병에 관련되었을 것이라고 제안했다(Mc Elroy et al, 1999). 알파-톡신은 감각 숙주 세포의 표면 수용체에 연관되었을 것이고 그러므로 상기 세포 표면에 부착한다고 생각되었다. 이런 사건은 톡신의 헵타머릭 프리-포어(heptameric pre-pore)로의 올리고머화(oligomerization) 및 2-nm 포어 직경의 β-통형 구조(β-barrel structure)의 원형질막으로의 삽입을 촉진한다. 포어의 형성은 막의 완전성의 손실을 야기하고, 세포를 불안정하게 만들며 결국 세포사멸(apoptosis) 및 세포 용해(cell lysis)를 초래한다. 특히, 림프구(lymphocytes), 대식세포(macrophages), 폐포 상피 세포(alveolar epithelial cells), 폐 내피(pulmonary endothelium), 및 적혈구(erythrocytes)들은 알파-톡신에 의한 포어 형성에 민감하나; 과립구(granulocytes) 및 섬유아세포(fibroblasts)는 용해에 저항성을 보인다(McElroy et al., 1999).

염증 반응(inflammatory response) 및 세균 감염에 대한 선천적 면역 반응(innate immune response)에서의 알파-톡신의 정확한 역할은 완전히 이해되지 않았다. 황색포도상구균은 다수의 다른 독성 인자들을 발현하며 지금까지 각 독성 인자의 질병 징후(manifestation)에의 기여는 완전히 이해되지 않았으며 임상적으로 복합적인 황색포도상구균 감염의 예방(prophylaxis) 및 치료 발전에 대한 도전을 제기한다. 알파-톡신은 숙주세포에서의 황색포도상구균 감염의 수립을 위한 독성인자 중에 하나로 알려져 있으며 다수의 연구들은 질병에서의 알파-톡신의 중요성을 강조해왔다. 예를 들어, 정제된 알파-톡신의 토끼 또는 쥐 폐 세포로의 점적 주사(instillation)는 혈관 누출(vascular leakage) 및 폐 고혈압(pulmonary hypertension)을 유발하였고, 이는 다른 신호 분자(예를 들어, 포스파티딜 이노시톨(phosphatidyl inositol), 산화질소(nitric oxide), 프로스타노이드(prostanoids), 및 트롬복산(thromboxane A₂)들의 방출의 탓이라고 보여져 왔다. 문헌에서, 항-알파-톡신 면역성이 톡신의 해로운 효과에 대해 방어적임을 보여주었으나, 알파-톡신에 대해 설계된 백신은 중요한 도전으로 남아있다.

바르덴버그 및 슈니윈드(2008)은 분리된 특정 황색포도상구균으로부터 생산된 알파-톡신의 수준과 연관성이 있는 마우스에서 폐 질환의 심각성을 입증했다. 또한 저자들은 비포어(nonpore)-형성 알파-톡신 변이체에 대한 면역화가 황색포도상구균에 의해 야기된 폐렴에 대해 면역성을 유발함을 보여줬다. 이러한 발견들은 알파-톡신이 CA-MRSA 폐렴(지역사회-관련 메티실린-내성 황색포도상구균(community-associated methicillin-resistant S. aureus))의 발병에 중요하다는 것을 입증한 같은 그룹의 연구와 일관된다. 다른 조건에서 저자들은 알파-톡신에 대한 항체들이 또한 인간 폐 상피 세포를 황색포도상구균-유도 용해로부터 보호함을 입증했다(Wardenburg 및 Schneewind (2008)).

이러한 결과들이 알파-톡신이 폐 조직 파손에 기여함을 나타낼지라도, 상기 기재된 실험에서의 동물들의 죽음이 톡신에 의한 폐 세포의 직접적인 파괴, 과도한 염증 반응, 또는 둘 다에 의한 결과인지 아닌지 아직 확실하지 않다. 알파-톡신 항체의 수동 전달은 급성 폐 손상에 동반된 것으로 알려진 인터루킨(interleukin) 1β, 사이토카인(cytokine)의 순환 수준을 상당히 감소시켰다. 따라서, 염증 반응이 알파-톡신 매개 폐 손상에 기여할 것이라는 결론을 내리는 것이 합당하다.

인간에서의 폐렴과 같은 국소 감염 동안, 황색포도상구균 폐렴에 걸린 환자의 거의 40%가 혈류 감염 및 전신 합병증(disseminated disease)으로 발전한다. 세균 감염의 전이는 혈류 감염 및 멀리 떨어진 장기 시딩에 이를 수 있다. 상기 혈류 감염은 패혈증(septicemia), 빠른 진행 및 흔한 황색포도상구균 감염의 치명적인 합병증(fatal complication)에 이를 수 있다.

또한, 황색포도상구균의 전이는 일반적으로 포도상구균 폐렴 동물 모델에서 보이며, 다시 조직 손상 및 상피층을 통한 혈류 및 림프조직(lymphatic tissue)으로의 감염 전이 때문에 전이된 균혈증으로 발전된 동물의 거의 40%에서 보였다. 그럼에도 불구하고 상기 전이는 성장을 조절하기 위해 사용된 동물 계통(strain)의 유전적 백그라운드 및 호중구(neutrophil) 활성화와 같은 선천성 면역 체계의 잠재력에 많이 의존한다. 예를 들어, 면역 적격(immune competent) 동물들은 감염에 저항한 반면, 호중구 결핍된 C57B/L 동물들은 황색포도상구균에 의한 신장 감염에 매우 걸리기 쉬웠다. 반면, 신장으로의 호중구의 모집이 주로 지연되었기 때문에 A/J 동물들은 매우 민감했다(von Kokritz-Blickwede, 2008).

황색포도상구균 단백질의 구조 및 기능에서의 데이터가 더욱 포괄적이지만 효과적인 백신의 개발은 도전으로 남았다.

황색포도상구균 알파-톡신 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 다른 세균성 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 조합을 포함하는 조성물을 이용한 알파-톡신 및 황색포도상구균 세균에 대한 면역력을 안전하게 수여하려는 시도가 있었다(WO 2007/145689). 상기 조성물들은 그들 자신엔 효과적이지 않은 항체의 양을 포함하는 반면, 그럼에도 불구하고 항체들의 조합의 시너지적인 활성(synergistic activity)으로 감염에 대한 감염을 중화(neutralize) 및/또는 보호(protection)한다.

각각 중화 또는 옵소닌 항체 혼자로 면역화한 것의 보호력과 비교해봤을 때의 황색포도상구균 분리주에 도전한 72시간째의 포스트-세균에서의 상기 황색포도상구균 톡신-중화 및 옵소닌 항체(opsonic antibodies)의 조합의 보호력은 입증되었다. 옵소닌 항체 및 톡신-중화 항체의 조합은 피부 및 연조직 감염 및 장기 시딩 예방에서 보호력을 입증했다. 그러나, 항-알파-톡신 항체 중화는 환자 적용 자체는 기관 시딩/농양 형성의 예방 또는 감염 중화에 충분하지 않음이 밝혀졌다.

또 다른 시도는 인간 및 쥐 단일클론 항체가 황색포도상구균 알파-톡신에 대해 직접적으로 중화하는 것을 기재한 Heveker 등(1994a, 1994b)에 의해 수행되었다. IgG/람다(lambda) 아형(subtype)의 상기 인간 단일클론 항체는 서열에 의해 특징지어지며 중화를 보인다.

Heveker(1994a)에 의해 기재된 상기 항-알파 톡신 항체를 생산하는 인간 하이브리도마(hybridoma)는 말초혈(peripheral blood) 림프구를 이용하여 그 이전에 황색포도상구균 알파 톡소이드(toxoid) 시험 백신으로 면역화된 건강한 자원자로부터 분리되었다. Heveker 연구에서 사용된 상기 알파-톡소이드가 화학적으로 변형된 알파-톡신으로 존재하는 반면, 알파-톡소이드는 변형이 더 적은 면역성의(immunogenic) 또는 비-면역성의 항원결정기(antigenic determinants)를 만드는 것으로 추정될 수 있고 콜레라 톡신과 같은 다른 세균성 톡신에 대해 입증된 것처럼 그런 접근은 똑같은 효과적인 면역성을 생성하지 않을 것이고, 톡소이드 백신은 감염에 면역력을 수여하지 않은 항-톡신 항체를 자극했다(Levine (1983)).

톡신, 펩티도글리칸, 세포 외 인자(extracellular factors) 및 효소(enzymes)와 같은 다양한 인자들이 문헌에서 농양 형성에 대해 중요한 독성 인자로서 확인되었다. 농양 형성에서 알파-톡신의 잠재적인 역할은 Kapral et al. (1980)에 의해 상정되었다. 알파-톡신이 농양 형성에 필수적임을 입증될 수 없었을지라도 알파-톡신은 농양의 성숙에서 농양에 극적으로 쌓이는 것이 보고되었다. Adlam et al (1977)에 의한 두 번째 발행은 농양 형성에서의 알파-톡신에 대한 중요한 역할을 부인했다. 상기 저자들은 알파-톡신이 자연 발명에서 보이는 푸른-가슴(blue-breast) 토끼 유방염(mastitis)의 용혈 형태(hemorrhagic form)의 스프레딩에서 중요한 역할을 함을 입증하였다. 그들은 실험실에서 두 관련 없는 포도상구균 균주(staphylococcal strain)로 임상상(clinical picture)을 재현하였다. 항-알파-톡신-역가(titer)의 높은 순환은 상기 유방염의 치사 형태(lethal form)에 대해 보호효과를 수여하였다. 따라서, 중화 역가는 덜 심각한 농양 상태로의 임상상 변형에 의한 치명적인 결과(fatal outcome)를 방지할 수 있다. 그러나, 알파-톡신의 중화는 토끼에서 농양 형성을 영향/방해하지 않는다. 보다 최근 발행된 Kielian et al (2001)에서 마우스 모델의 뇌 농양 형성에서의 알파-톡신의 역할을 조사하였다. 상기 저자들은 야생형 황색포도상구균 균주 및 그것의 돌연변이를 뇌 전두엽(frontal lobe brain) 조직에 실험적으로 이식하였고 각 균주의 뇌 농양 유도 능력을 평가하였다. 상기 저자들은 예를 들어, 중요한 독성 인자의 전반적인 조절과 관련된 sarA 자리(locus) 및 agr 자리와 같은 알려진 독성 인자의 발현에 관련 있는 자리에 돌연변이가 있는 균주를 이용하였다. 알파-톡신이 sarA/agr 조절 시스템의 조절 하에 있는 것처럼, 상기 저자들은 또한 알파-톡신 돌연변이 균주를 그들의 실험에 포함하였다. 상기 실험적 데이터는 두개골로의 세균 세포의 주입에서 알파-톡신 또는 sarA/agr 자리 돌연변이 세균 균주의 복제(replication)가 검출된 동물의 뇌에서 그것의 동질유전자(isogenic) 대조 균주 RN6390 를 받은 마우스들에서 잘-형성된 큰 농양에 비해, 더 적은 세균 수 및 작은 염증소(inflammatory foci)를 야기하여 독성을 감소시킴을 입증하였다. 그러나, 상기 돌연변이 균주는 실험의 뇌 농양 모델에서 완전히 독성이 없지 않았고 알파-톡신 외의 뇌 농양 형성에서 중요한 역할을 하는 추가적인 인자(들)을 배재할 수 없었다.

농양 형성에서의 알파-톡신의 역할은 Schwan et al (2003)에 의해 대략적으로 그려진 또 다른 실험 조건으로 국소, 전신 및 농양을 형성하는 황색포도상구균 감염 모델의 분석에서 평가되었다. 저자들은 비용혈성(nonhemolytic) 황색포도상구균 균주가 쥐 농양 및 상처 모델에서 시간이 지날수록 더욱 풍부해지는 것에 주목하였으나, 전신 감염(systemic infections)과 관련된 장기 조직 내에서는 아니었다. 예를 들어, 농양 모델에서 모든 다양한 황색포도상구균 균주 RN6390(과용혈성(hyperhemolytic), 용혈성(hemolytic), 및 비용혈성(nonhemolytic))을 이용한 혼합된 감염에서, 상기 과용혈성 그룹은 감염 7일 후에 현저하게 감소된 반면, 비용혈성 개체군은 상당히 증가되었다. 여러 특정말단(signature-tagged) 돌연변이의 시퀀싱은 agrC 유전자 또는 agrA-agrC 유전자 사이(intergenic region) 내의 돌연변이를 나타냈고, 알파-톡신 및 델타-톡신(delta-toxin) 활성 모두에서의 축소를 야기했다. 농양, 상처 및 감염의 전신 모델에서의 agr 활성(agr-) 및 알파-톡신(hla-)에 대한 특정한 돌연변이 균주 분석에서, agr- 돌연변이 균주 및 hla- 돌연변이 균주는 양친 야생형 균주(RN6390)에 비해 4일째에 쥐 농양에서의 세균 수의 차이가 없음을 보였다. 국소 감염(상처 모델)과 마찬가지로, hla 돌연변이 균주 및 agr 돌연변이 균주의 상당한 제거가 감염의 전신 모델에서 발생했다. 상기 결과는 알파-톡신의 전신 감염에서의 중요성을 명백히 나타냈으나, 국소 감염 또는 농양 형성에서는 아니었다. 사실 농양 모델에서의 hla-돌연변이 및 야생형 균주의 혼합된 감염은 야생형 균주보다 hla 돌연변이 개체군에 주어진 경미한 이득을 보였다. 저자들은 agr 돌연변이도 결국 농양 및 상처에 거주하는 황색포도상구균 세포의 혼합된 개체군(population) 내의 상기 agr 돌연변이 그룹의 성장 이득에 기여하는 알파- 및 델타-톡신의 발현 감소를 야기한다고 결론을 내렸다. 상기 결과는 알파-톡신 생산의 결핍이 세균 독성을 감소시킨다는 Kielian et al에 의해 기재된 결과를 외관상 부정한다. 따라서 농양 형성에서의 알파-톡신의 역할은 명확하지 않다.

종합적으로 농양 형성에서의 주요 촉진자로서의 한 단일 독성 인자를 가리키는 증거가 없다. 그런 연구는 농양 형성에서 일반적인 중요 인자로서 환경적 인자, 또는 주어진 구조 모티브와 같은 황색포도상구균에 의해 완전히 조절되지 않는 추가적인 인자의 존재에 초점을 두었다. 예를 들어, 독성 인자를 농양 형성에 영향을 미치는 것으로 여기는 가장 최근의 데이터는 Mn⁺⁺ 및 Ca⁺⁺와 같은 킬레이트되지 않은(unchelated) 이가(bivalent) 금속 이온의 농양 형성 및 농양 내의 세균 성장에서의 영향을 시사한다. 동물에서의 금속 이온의 킬레이션(Chelation)은 간 농양의 형성을 억제했고 농양에서의 황색포도상구균의 성장을 억제했다(Corbin 2008). 반면 Tzianabos et al. (2001)은 황색포도상구균과 같은 유기체는 조직에서 농양과 같은 병원성 구조(pathological structures)를 수립하기 위해 세균 세포에 존재하는 독성 인자를 필요로 한다고 가설을 세웠다. 그들은 농양의 임상적 케이스와 매우 관련된 균주들이 하나 또는 그 이상의 쌍성이온 전하 모티브(zwitterionic charge motif)를 가진 세포 벽-관련 다당류(polysaccharides)를 가질 수 있다고 입증했다(0의 총 순전하를 가진 화학 화합물, 따라서 다른 원자에 전자적으로 중성(electrically neutral)이나 정규 양 및 음 전하(formal positive and negative charges)를 가진다). 쌍성 전하 모티브의 부재에서 농양 형성이 관찰되지 않았다. 저자들은 이런 다당류 복합체들이 이 유기체에 의해 농양 유도를 조절할 것이라고 결론지었다. 또한 그들은 주요 다당류인 CP5 및 CP8 뿐만 아니라 세포 벽 내의 잘 특징지어진 추가적인 독성인자인 리포테이코산(lipoteichoic acid, LTA)에 대한 확인 데이타를 보여줬다. 그들은 또한 LTA 내의 쌍성 이온 전하 모티브를 확인하였고 따라서 그들의 농양 형성에 대한 어떤 중심이 되는 독성 인자 내의 쌍성 이온 전하 모티브의 존재에 대한 가설을 일반화하였다.

다양한 인자들이 황색포도상구균 매개 농양 형성에 기여하는 것을 나타내는 상기 결과에 기초하여, 당업계에 종사하는 당업자는 단일 인자의 중화가 농양 형성을 방지할 것이라고 기대하지 않을 것이다.

WO2007/145689 Use of Alpha-Toxin for treating and preventing Staphylococcus infections.

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따라서, 본 발명의 목적은 농양 형성과 같은 임상적으로 복합적인 황색포도상구균 감염의 예방(prophylaxis) 및 치료(therapy)를 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 잠재적인 한 기술적인 문제는 황색포도상구균에서 유래한 알파-톡신에 특이적인 단일클론 항체를 제공하기 위함이며, 여기에서 항체는 생체내에서 농양 형성과 같은 임상적으로 복합적인 황색포도상구균 감염에 대한 보호능(protective capacity)을 갖는다.

상기 기술적인 문제는 하기에서 정의된 단일클론 항체에 의해 해결된다.

본 발명은 항체의 경쇄의 가변 영역은 적어도 하나의 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하며, 항체의 중쇄의 가변 부위는 적어도 하나의 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR3 영역을 포함하는 243-4로 일컬어지는 황색포도상구균의 알파-톡신에 대해 특이적인 단일클론 항체, 또는 황색포도상구균의 알파-톡신에 결합 가능한 그의 단편 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR 영역 중 어느 하나에 적어도 하나의 보존적 치환(conservative substitution)을 가지는 돌연변이 단백질(mutein)을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 경쇄의 가변 영역은 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하며, 중쇄의 가변 영역은 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR3 영역을 포함하는 황색포도상구균의 알파-독신에 특이적인 인간 단일클론 항체, 또는 황색포도상구균(S. aureus)의 알파-톡신에 결합 가능한 그것의 단편 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR 영역 중 어느 하나에 최소한 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 항체의 돌연변이 단백질이 제공된다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 단일클론 항체가 농양 형성에 대해 높은 보호능(protective capacity)을 나타내는 것이 밝혀져 왔다. 농양 형성의 방지는 마우스-신장 모델에서 알파-톡신에 특이적인 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체의 투여에 의해 보여져 왔다. 세포 벽 관련된 성분(다당류)보다는 즉 분비되는 단백질인 톡신의 특성에 기초하여, 예를 들어, 세균 세포의 죽임과 같은 어떤 직접적인 살균 효과(bactericidal effect), 또는 보체(complement) 매개된 옵소노파고사이토시스(opsonophagocytosis)와 같은 간접적인 면역 시스템 관련된 효과기 기능(effector function)이 배재될 수 있고 농양 형성의 부족에 대해 설명하지 않을 수 있다.

본 발명에서 사용한 상기 용어 "단일클론 항체"는 단일클론 항체가 얻어진 출처와는 별도로 어떤 부분적인 또는 완전한 인간 단일클론 항체를 포함한다. 완전한 인간 단일클론 항체가 바람직하다. 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체가 바람직하다. 상기 하이브리도마는 쥐, 소 또는 인간과 같은 포유류의 하이브리도마일 것이다. 바람직한 하이브리도마는 인간 기원이다. 또한 상기 단일클론 항체는 청구항에 정의된 바와 같이 유전공학(genetic engineering) 및 특히 백그라운드 항체(background antibody)의 CDR 영역(CDR regions)을 특정 CDR 부분(CDR segments)으로 대체하는 CDR 부분의 CDR 그라프팅(CDR grafting)에 의해 사용 가능한 단일클론 항체로 얻어질 수 있다.

상기 용어 "CDR 영역(CDR region)"은 항체의 상보성 결정 영역(complementarity determining region) 즉, 특정 항원(antigen)에 대한 항체의 특이성 결정 영역을 의미한다. 경쇄 및 중쇄 모두 위의 세 CDR 영역들(CDR1 내지 CDR3)은 항원 결합에 책임을 진다.

중쇄 내의 CDR 영역의 자리들은 하기와 같다:

CDR1 영역 V_H 엑손(exon) 내의 아미노산 26 내지 33,

CDR2 영역 V_H 엑손 내의 아미노산 51 내지 58,

CDR3 영역 V_H 엑손 내의 아미노산 97 내지 110.

CDR 영역의 자리들은 항체의 클래스(class), 즉, IgM, IgG의 IgA로부터 독립적이다.

람다 타입(lambda type) 경쇄 내의 CDR 영역의 자리들은 하기와 같다:

CDR1 영역 Vλ 엑손 내의 아미노산 26 내지 33,

CDR2 영역 Vλ 엑손 내의 아미노산 51 내지 53,

CDR3 영역 Vλ 엑손 내의 아미노산 90 내지 101.

V_H, Vχ 및 Vλ 엑손의 아미노산 얼라인먼트(alignment)는 V Base 데이타베이스(http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/)로부터 얻어질 수 있다.

상기 용어 ＂단편(fragment)˝은 황색포도상구균의 알파-톡신에 결합 가능한 항체의 어떤 단편을 의미한다. 상기 단편은 최소한 10, 바람직하게는 20, 더욱 바람직하게는 50 아미노산의 길이를 갖는다. 상기 단편은 항체의 결합 영역(binding region)을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 단편은 Fab, F(ab')₂, 단쇄(single chain) 또는 도메인 항체(domain antibody)인 것이 바람직하다. Fab 또는 F(ab')₂ 단편 또는 그것의 혼합이 가장 바람직하다. 항체 단편들은 예를 들어, 항체 가변 영역에 탄수화물 성분(carbohydrate moieties)들을 포함하는 글리코실화가 될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명에서 정의된 바와 같이 Fab, F(ab')₂, 단쇄(single chain) 또는 도메인 항체(domain antibody) 단편인 단일클론 항체를 제공한다.

상기 용어 ＂돌연변이 단백질(mutein)˝은 적어도 하나의 아미노산의 첨가(addition), 삭제(deletion), 및/또는 치환(substitution)에 따라 다른 단일클론 항체의 어떤 돌연변이 단백질을 포함한다. 바람직하게, 상기 단일클론 항체의 돌연변이 단백질은 청구항에서 개시한 바와 같이 중쇄 및/또는 경쇄 CDR의 어느 부분에 적어도 하나의 보존적 치환을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 상기 돌연변이 단백질은 4보다 많지 않은, 바람직하게 3보다 많지 않은, 특히 바람직하게는 2보다 많지 않은 보존적 치환을 갖는다. 항체의 단편 또는 돌연변이 단백질의 황색포도상구균의 알파-톡신에 결합할 수 있는 능력은 실시예에서 기재한 바와 같이 ELISA에 의해 직접적으로 측정된다: 정제된 알파-톡신은 ELISA 플레이트의 고체상(solid phase) 위에 고정된다. 항체의 단편 또는 돌연변이 단백질은 고정된 알파-톡신과 인큐베이션되었고, 결합한 항체 또는 그의 돌연변이 단백질은 적합한 효소-컨쥬게이션된 이차 항체(enzyme-conjugated secondary antibody)에 의해 가시화되었다.

상기 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 특정 이-화학적 그룹(physico-chemical group)에 속한 한 아미노산의 같은 이-화학적 그룹에 속한 아미노산으로의 대체를 의미한다. 상기 이-화학적 그룹은 하기와 같이 정의된다:

비-극성(non-polar) 아미노산 이-화학적 그룹은: 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 메티오닌(methionine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 및 트립토판(tryptophan)을 포함한다. 비하전된 극성 측쇄(uncharged polar side chains)를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 티로신(tyrosine), 시스테인(cysteine), 및 시스틴(cystine)을 포함한다. 양전하를 띄는 극성 측쇄(positively charged polar side chain)를 갖는 아미노산의 이-화학 그룹은 라이신(lysine), 아르기닌(arginine), 및 히스티딘(histidine)을 포함한다. 음전하를 띄는 극성 측쇄(negatively charged polar side chain)를 갖는 아미노산의 이-화학 그룹은 아스파르트산(aspartic acid) 및 글루탐산(glutamic acid)을 포함하고, 또한 그들의 카르복실레이트 음이온(carboxylate anion)과 함께 아스파테이트(aspartate) 및 글루타메이트(glutamate)이라고 불린다.

추가적인 실시태양에 따르면, 본 발명은 황색포도상구균의 알파-톡신에 특이적인 항체의 경쇄의 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖고 중쇄의 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 단일클론 항체, 또는 황색포도상구균의 알파-톡신에 결합 가능한 그의 단편, 또는 황색포도상구균의 알파-톡신에 결합 가능한 상기 항체의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7과 최소 85% 동일하고 항체의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 8과 최소 85% 동일한 변이체(variant)를 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 "변이체(variants)"는 폴리펩타이드를 말하며, 여기에서 아미노산 서열은 서열 목록(sequence listing)에 나와 있는 것과 같이 아미노산 서열과 어느 정도 상동성(identity)을 보인다.

당업계에 종사하는 당업자에게 알려져 있는 상기 용어 "% 상동성(% indentity)"은 서열들 사이의 얼라인먼트에 의해 측정되는 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드(polypeptide) 분자 사이의 관련 정도를 표시한다. "상동성(indentity)"의 백분율은 갭(gaps) 또는 다른 서열 특성(sequence features)의 평가되는 둘 또는 그 이상의 서열들에서 동일한 영역의 백분율(percentage)으로부터 알게 된다.

서로 관련된 폴리펩티드들의 상기 상동성 퍼센트는 알려진 과정을 이용해서 측정될 수 있다. 대체로, 특수사항 요구 검사를 고려한 알고리즘(algorithms)과 특별한 컴퓨터 프로그램이 사용되었다. 상동성의 측정을 위한 바람직한 과정은 첫째로 연구된 서열들 사이에 가장 큰 일치(agreement)를 만든다. 두 서열 사이의 상동성 측정을 위한 컴퓨터 프로그램은 GAP (Devereux J et al., (1984)); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison (WI); BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul S et al., (1990))를 포함한 GCG 프로그램 패키지를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 BLAST X 프로그램은 미국국립생물정보센터(National Centre for Biotechnology Information, NCBI) 및 다른 출처에서 얻어질 수 있다(BLAST Handbook, Altschul S et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul S et al.,1990 ). 잘-알려진 스미스 워터맨 알고리즘(Smith Waterman algorithm) 또한 상동성의 퍼센트의 측정을 위해 사용될 수 있다.

서열 비교를 위해 바람직한 파라미터(parameter)들은 하기를 포함한다:

알고리즘: Needleman S.B. 및 Wunsch, C.D. (1970)

비교 행렬(Comparison matrix): Henikoff S. 및 Henikoff J.G. (1992)로부터의 BLOSUM62

갭 패널티(Gap penalty): 12

갭-길이(Gap-length) 패널티: 2

또한 상기 GAP 프로그램은 상기 파라미터들과의 이용에 적합하다. 상기 파라미터들은 아미노산 서열 비교를 위한 끝에 위치한 갭들이 상동성 값(identity value)을 증가시키지 않는 표준 파라미터들(디폴트 파라미터(default parameters))이다. 참고 서열과 비교된 매우 작은 서열은 기대값(expectancy value)을 100,000까지 증가시키는데 추가적으로 필요할 수 있고 몇몇의 경우 단어 길이(단어 사이즈)를 2까지 감소시킬 수 있다.

프로그램 핸드북(Program Handbook), 위스콘신 패키지(Wisconsin Package), 버전 9, 9월 1997에 지명된 것들을 포함하는 추가적인 알고리즘 모델, 갭 열림 패널티(gap opening penalties), 갭 확장 패널티(gap extension penalties) 및 비교 행렬(comparison matrices)들이 이용될 수 있다. 수행될 비교 및 추가적인 비교가 GAP 또는 Best Fit가 바람직한 두 쌍의 서열 사이인지, 또는 FASTA 또는 BLAST가 바람직한 한 서열 및 큰 서열 데이터베이스 사이인지에 따라 선택될 것이다. 상술한 알고리즘으로 측정된 85%의 일치는 85%의 상동성으로 기재된다. 더 높은 상동성 정도에도 상기와 같이 적용된다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 상기 변이체들은 85%의 또는 그 이상, 바람직하게는 90% 또는 그 이상, 및 더욱 바람직하게는 95% 또는 그 이상의 상동성을 갖는다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 따르면, 단일클론 항체는 인간 항체이다. 본 발명에서 사용된 상기 용어 "인간(human)"은 인간 단일클론 항체가 외래 종(foreign species)의 아미노산 서열이 실질적으로(substantially) 없음을 의미하며, 바람직하게는 상기 인간 단일클론 항체는 완전히 인간 아미노산 서열로 구성된다.

본 발명에 따른 상기 단일클론 항체의 경쇄는 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 타입일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 경쇄는 람다 타입이다. 상기 경쇄는 자연적으로 재배열된(naturally rearranged) 것을 포함한 자연적으로 발생한 체인(naturally occurring chain), 유전적으로 변형된 또는 경쇄의 합성된 타입일 수 있다.

본 발명의 단일클론 항체의 중쇄는 아형(isotypes) IgM, IgA 또는 IgG, 바람직하게는 IgG로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 더 바람직한 실시태양에 따르면, 단일클론 항체의 상기 중쇄는 IgG 타입이다.

본 발명에서 사용된 상기 용어 "결합능(capable of binding)"은 항체 및 그것에 대해 생산된 항체가 인식하는 항원(antigen) 사이의 결합에 대한 것을 말한다. 이런 타입의 결합은 항원의 부재 하에 발생하는 비-특이적인(non-specific) 결합과는 대조적으로 특이적인(specific) 결합이다.

알파-톡신에 결합 가능한 항체는 하이브리도마 기술(hybridoma technology)을 이용하여 제조되며, 여기에서 B-세포는 쥐(murine), 소(cattle) 또는 인간과 같은 포유류의 B-세포(B-cell)이다. 상기 B-세포는 인간 B-세포인 것이 바람직하다. 또는, 알파-톡신에 결합 가능한 상기 단일클론 항체는 청구항에서 기재된 것과 같이 CDR 영역의 CDR 그라프팅에 의해 이용 가능한 단일클론 항체로 얻어질 수 있으며, 그렇게 함으로써 본 발명에 따라 황색포도상구균의 알파-톡신에 특이적인 단일클론 항체를 생산할 수 있다.

본 발명의 추가적인 실시태양에서, 쥐, 소 또는 인간과 같은 포유류의 B-세포, 바람직하게는 인간 B 세포 또는 상기 인간 B 세포와 미엘로마(myeloma) 또는 헤테로미엘로마(heteromyeloma) 세포의 융합에 의해 얻어진 하이브리도마로부터 얻어질 수 있는 황색포도상구균의 알파-톡신에 결합가능한 단일클론 항체가 제공된다.

추가적인 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에서 정의한 바와 같이 황색포도상구균의 알파-톡신에 결합 가능한 단일클론 항체를 생산 가능한 하이브리도마를 제공한다.

본 발명에서 사용된 상기 용어 ＂알파-톡신(alpha-toxin)˝은 황색포도상구균에 의해 생산된 세균 단백질(bacterial protein)을 말한다. 상기 알파-톡신은 숙주 세포의 세포 표면과의 결합 후에 헵타머릭 프리-포어(heptameric pre-pore)로 올리고머화(oligomerization)를 겪었다. 포어의 형성은 세포 사멸(apoptosis) 및 세포 용해(cell lysis)의 결과를 초래한다. 단일클론 항체의 황색포도상구균 유래의 알파-톡신의 모노머릭(monomeric) 및 올리고머릭(oligomeric) 형태 모두와 결합하는 능력은 그러므로 강력한 보호를 위해 핵심적으로 중요하다.

본 발명의 바람직한 추가적인 실시태양에 따르면, 본 발명의 상기 단일클론 항체는 황색포도상구균의 알파-톡신의 모노머릭 및 올리고머릭 형태에 특이적으로 결합 가능하다. 본 발명의 추가적인 실시태양에 따르면, 본 발명의 단일클론 항체 또는 그의 단편(fragment) 또는 돌연변이 단백질(mutein)은 황색포도상구균의 알파-톡신의 모노머릭 또는 올리고머릭 형태 각각에 또는 그들 모두에 특이적으로 결합 가능하다.

본 발명에서 사용된 상기 용어 "올리고머릭 형태(oligomeric form)"는 알파-톡신의 모노머릭 형태 외에 다이머릭(dimeric), 트라이머릭(trimeric), 테트라머릭(tetrameric), 펜타머릭(pentameric), 헥사머릭(hexameric), 헵타머릭(heptameric) 등의 형태와 같은 또는 알파-톡신의 헵타머릭 프리-포어(heptameric pre-pore) 형태와 같은 폴리머릭(polymeric) 형태를 포함한다.

추가적인 바람직한 실시태양에 따르면, 본 발명의 단일클론 항체는 N-말단(N-terminally), 내부(internally) 또는 C-말단(C-terminally)이 변형되었다. 상기 변형은 예를 들어, 디사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide)를 이용한 교차-결합(cross-linking)에 의한 모노머릭 형태의 디-(di-), 올리고-(oligo-), 또는 중합체(polymerization)을 포함한다. 이와 같이 생산된 디-, 올리고-, 또는 중합체는 겔 여과(gel filtration)에 의해 각각 분리될 수 있다. 추가적인 변형은 예를 들어, ε-아미노-라이신 잔기, 또는 아미노 및 카르복시-말단 변형 각각과 같은 측쇄(side chain) 변형을 포함한다. 추가적인 변형은 예를 들어, 글리코실화(glycosylation) 및/또는 단백질의 부분적 또는 전체 당쇄 제거(deglycosylation), 및 이황화 결합(disulfide bond) 형성과 같은 번역-후(post-translational) 변형을 포함한다. 또한, 상기 항체는 효소(enzymatic), 형광(fluorescent) 또는 방사성(radioactive) 라벨과 같은 라벨(label)에 컨쥬게이션될 수 있다. 바람직하게는, 상기 변형은 올리고머화(oligomerization), 글리코실과(glycosylation) 또는 약물(drug) 또는 라벨(label)로의 컨쥬게이션 중에 최소 하나 이상으로부터 선택된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산을 각각 제공한다. 상기 핵산은 생식세포계열(germ line) 또는 B-세포에서 발생한 재배열(rearrangement) 중 어느 하나로부터 유래된 자연적으로 발생한 핵산일 수 있고, 또한 상기 핵산은 합성된 것일 수 있다. 또한, 합성된 핵산은 분해(degradation)로부터의 핵산의 저항을 증가시키기 위해 포스포티오에스터(phosphothioester)를 포함한 변형된 뉴클레오시드 사이(internucleoside)의 결합을 가지는 핵산을 포함한다. 상기 핵산은 유전적으로 설계(genetically engineered)되거나 뉴클레오티드 합성(nucleotide synthesis)에 의해 완전히 합성되어 생산될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 단일클론 항체의 경쇄를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 및/또는 본 발명의 단일클론 항체의 중쇄를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 벡터를 추가적으로 제공한다. 상기 핵산은 같은 벡터에 존재 또는 바이너리(binary) 벡터의 형태 중 어느 하나로 존재할 수 있다. 상기 벡터는 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 핵산의 발현을 가능하게 하기 위하여 핵산에 조작적으로 연결된 프로모터(promoter)를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 벡터는 또한 숙주세포(host cell)에서의 복제(replication) 및 유지(maintenance)를 위한 오리진(origin)을 포함한다. 또한, 상기 벡터는 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 핵산의 5'에 위치하는 신호 서열(signal sequence)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 신호 서열은 암호화된 체인(chain)의 배지(medium)로의 분비를 가능하게 할 수 있다.

바람직하게는, 상기 벡터는 아데노바이러스(adenoviruses), 우두바이러스(vaccinia viruses), 바큘로바이러스(baculoviruses), SV 40 바이러스, 레트로바이러스(retroviruses), 식물 바이러스 또는 람다 파생물들(lambda derivatives) 또는 M13과 같은 박테리오 파지(bacteriophages)로부터 파생된다. 특별히 바람직한 벡터는 Persic et al., 1987에서 기재된 면역 글로불린(immunoglobulins)의 진핵세포 발현을 위한 통합적인 벡터 시스템과 같은 인간 Ig 중쇄의 및 인간 경쇄의 불변 영역(constant regions)을 포함하는 벡터이다.

또한, 본 발명은 벡터 및/또는 벡터의 발현을 위해 적합한 핵산을 포함하는 숙주세포를 제공한다. 당업계에서, 많은 원핵세포 및 진핵세포 발현 시스템들이 알려져 있고, 여기에서 효모 세포(yeast cells), 곤충 세포(insect cells), 식물 세포(plant cells) 및 HEK293-세포들, PerC6-세포들, CHO-세포들, COS-세포들 또는 HELA-세포들과 같은 포유동물 세포와 같은 진핵세포 숙주 세포 및 그의 파생물이 바람직하다. 인간에게서 생산된 세포주가 특히 바람직하다. 형질 도입된 숙주 세포가 생산된 항체를 배양 배지로 분비하는 것이 바람직하다. 세포 내 발현이 되면, 그 후에 예를 들어, Benetti et al., 1998에 기재된 것과 같은 표준 과정에 따라 복원(renaturation)이 수행된다.

본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는 회복기 환자(convalescent patient)의 혈액 림프구(blood lymphocytes)로부터 생성되고 그 후 감염에 대한 중화(neutralization) 및 효과적인 방어를 위해 자연적으로 정제 및 선별되어 높은 친화력(affinity)을 가진 항체를 초래한다.

또한, 본 발명은 단일클론 항체를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 상기 단일클론 항체는 상기 기재된 하이브리도마 배양에 의해 생산된다. 상기 생산된 단일클론 항체는 상등액(supernatant)으로 분비되고 종래의 크로마토그래피 기술(chromatographic techniques)을 적용하여 상기 상등액으로부터 정제될 수 있다..

또는, 상기 단일클론 항체는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 암호화된 항체 체인의 재조합 발현(recombinant expression)을 위해 적합한 조건하에 숙주세포의 배양에 의해 생산된다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 경쇄를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 및 중쇄를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하고 상기 숙주 세포는 포유동물, 바람직하게는 인간 B-세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 3-차 구조(3-dimensional structure)와 같은 3-차 구조가 생성될 정도로 단일클론 항체의 조립이 가능하다. 경쇄가 중쇄와 분리되어 생산되면, 그리고는 두 체인들이 정제될 수 있고 그 뒤에 조립되어 필수적으로 포유동물, 바람직하게는 인간 B-세포에 의해 생산된 것과 같은 단일클론 항체의 3-차 구조를 가지는 단일클론 항체를 생산할 수 있다.

또한 상기 단일클론 항체는 암호화된 경쇄 및/또는 중쇄의 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있고, 여기에서 핵산은 청구항에서 정의된 바와 같이 알려진 조건에서 단일클론 항체를 암호화하는 핵산을 분리하고 CDR 서열을 암호화하는 핵산 서열을 분리된 핵산으로 그라프팅하여 생산된다.

또한, 본 발명은 적어도 하나의 단일클론 항체 및/또는 단일클론 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 약학적 조성물(pharmaceutical compositions)을 제공한다.

또한, 상기 약학적 조성물은 스트렙토마이신(streptomycin), 페니실린(penicillin) 및 반코마이신(vancomycin) 등등과 같은 항생물질 제제(antibiotic drugs), 바람직하게는 본 발명의 단일클론 항체에 결합된 항생물질 제제(antibiotic drugs)를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 투여 용량(dosage range) 0.1 내지 100 mg/kg 체중의 단일클론 항체를 포함한다.

상기 약학적 조성물은 정맥 주사의(intravenous), 근육내(intra-muscular), 피내(intra-dermal), 피하의(subcutaneous), 복강내의(intra-peritoneal), 국부의(topical), 비강내의(intra-nasal) 투여, 또는 흡입 스프레이(inhalation spray)와 같은 어떤 알려진 조건으로 투여될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 약학적 조성물은 소, 돼지, 고양이, 개, 말, 인간과 같은 포유동물 환자의 장기에서의 농양 형성의 예방(prophylaxis) 또는 치료(treatment)를 위해 이용된다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 약학적 조성물은 인간 환자에 적용된다. 본 발명의 추가적인 실시태양에서, 농양 형성은 황색포도상구균(S. aureus) 감염에 의해 야기된다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물로 치료될 상기 황색포도상구균 감염은 예를 들어 유방염(mastitis)과 같은 유방의 감염일 것이다.

따라서, 본 발명은 본 발명에서 정의된 바와 같이 포유동물의, 바람직하게는 인간 환자의 장기에서의 농양 형성의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 제제를 위한 단일클론 항체 또는 경쇄의 및/또는 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 핵산의 용도를 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에서 정의된 바와 같이 상기 약학적 조성물을 위한 상기 단일클론 항체 또는 경쇄의 또는 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 핵산은 신장(kidney), 심장(heart), 간(liver), 담낭(gallbladder), 췌장(pancreas), 소장(small intestine), 대장(large intestine), 폐(lung), 뇌(brain), 피부(skin), 눈(eye), 림프조직(lymphatic tissue) 또는 비장(spleen)과 같은 장기에서의 농양 형성의 예방 또는 치료를 위해 적용된다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 치료될 상기 농양은 복부 농양이다. 따라서, 치료될 상기 복부 장기(abdominal organ)는 간, 담낭, 비장, 췌장, 소장, 신장, 및 대장이다.

본 발명에서 사용된 상기 용어 "농양 형성(abscess formation)"은 신장(kidney), 심장(heart), 간(liver), 담낭(gallbladder), 췌장(pancreas), 소장(small intestine), 대장(large intestine), 폐(lung), 뇌(brain), 피부(skin), 눈(eye), 림프조직(lymphatic tissue) 또는 비장(spleen)과 같은 장기에서의 농양 형성을 말한다. 본 발명에서 사용된 상기 용어 "농양(abscess)" 감염 과정(종종 세균(bacteria) 또는 기생충(parasites)에 의해 야기된다)에 기초하여 조직에 의해 형성된 공동(cavity) 내에 쌓인 고름(pus)의 더미(collection)를 의미한다. 이러한 세균 증식(multiplying bacteria)에 의한 톡신 방출은 세포를 파괴하고 많은 수의 백혈구 세포(white blood cells)를 그 장소로 이끌고 그 지역 혈류를 증가시키는 염증 반응(inflammatory response)을 유발한다. 이러한 백혈구들(leukocytes)은 죽은 세포들을 부수고 식세포 작용(phagocytosis)의 도움으로 세균을 흡수한다. 녹색 또는 누르스름한 고름은 부숴진(broken-down) 조직, 죽은 세균 및 백혈구들, 및 쌓인 세포 외액(extracellular fluid)으로부터 형성된다. 농양은 인접한 건강한 세포에 의해 형성된 농양 벽(abscess wall)에 의한 피막형성(encapsulation)에 의해 고름을 감염된 주위 구조로부터 보호하려는 시도로 특징지어진다. 감염 물질(infectious materials)이 몸의 다른 부위로 퍼지는 것을 방지하기 위한 조직의 방어 반응(defensive reaction)이다. 농양은 고형 조직의 어느 종류에서 발생할 수 있으나 가장 흔하게는 피부 표면에서(표면의 농포(superficial pustules)(종기(boils)) 또는 피부 깊은 농양(deep skin abscesses)일 수 있다), 폐, 뇌, 신장 및 편도선(tonsils)에서 발생할 수 있다. 주요 합병증들은 근접한 또는 멀리 떨어진 조직으로의 장기 시딩(organ seeding)과 같은 농양 물질의 전이(spreading) 및 광범위한 지역적 조직 사멸(괴저(gangrene))이다. 농양 형성은 장기 내의 세균 부하(bacterial load)를 평가하여 검출된다.

본 발명에서 사용한 상기 용어 "복부 농양(abdominal abscess)"은 복강(abdominal cavity)의 기관에서의 농양을 말한다. 상기 복강은 흉강(thoracic cavity) 아래에(또는 더 아래에), 및 골반강(pelvic cavity) 위에 위치한 내장(viscera)의 대부분을 갖는 체강(body cavity)이다. 복강은 복부골반강(abdominopelvic cavity)의 일부이다. 복강의 장기들은 위(stomach), 간, 담낭, 비장, 췌장, 소장, 신장, 및 대장을 포함한다.

본 발명에서 사용한 "장기 시딩(Organ seeding)"은 감염의 국소 부위(local site)로부터 멀리 떨어진 조직 및 장기로의 살아있는 세균의 보급(dissemination)을 의미한다. 장기 시딩은 살아있는 감염 세균 세포의 건강한 조직에서 피막 형성된 세균 세포가 거시적인 콜로니(macroscopic colonies) 형성 없이 존재하는 것에 의해 특징지어진다.

본 발명에서 사용된 "세균 부하(Bacterial load)"는 아가 플레이트(agar plates)와 같은 고형 성장 배지 위에서 콜로니로 자라나는 세균 세포의 양으로 표현되는 잘 정의된 해부학적 조직(anatomical tissue) 내에 살아있는 세균 세포의 양으로 정의된다. 장기 내의 세균 부하 평가의 목적을 위하여, 상기 장기는 주위 조직으로부터 수술적으로 적출되고 상기 장기 조직은 조직의 잘 구조화된 유기체를 부고 세균 세포를 포유동물의 조직으로부터 분리하기 위해 멸균 상태하에서 멸균 식염수 용액에서 갈아진다. 확인된 세포 상등액(또는 그의 멸균 식염수로 순차적 희석한 용액)의 양은 고체 세균 성장 배지 위에 펼쳐진다. 세균 부하는 신장 당 "콜로니 형성 단위(colony forming units)"(예를 들어, cfu/신장)로 나타난다.

또한, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 단일클론 항체 및 진단 시험을 수행하기에 적합한 추가 성분(ingredients)을 선택적으로 포함하는 황색포도상구균 감염의 진단을 위한 시험 키트를 제공한다.

진단 시험을 수행하기 위해 적합한 성분들은 예를 들어 280 내지 320 mOsm/Liter의 범위 내의 삼투압(osmolality) 및 pH 6 내지 8의 범위 내의 pH 값을 가진 버퍼 용액; 킬레이트제(chelating agents)를 포함한 버퍼 용액; 일가(monovalent) 또는 이가(bivalent) 양이온(cations)을 포함한 약 0.02 M 내지 약 2.0 M 범위의 버퍼 조성물의 총 양이온 농도를 가진 버퍼 용액; 및/또는 동물 또는 인간 유래 혈청(serum)을 0.01% 및 20% 사이의 농도로 포함한 버퍼 용액.

상기 시험 키트는 믿을 수 있는 특이적인 황색포도상구균 감염의 진단에 적합하다. 시험 분석은 종래의 액체 또는 막-결함 형태의 ELISA 시험에 기초할 수 있다. 상기 검출은 당업계에 자명한 것과 같이 직접적 또는 간접적일 수 있고, 여기에서 항체는 효소, 형광 또는 방사성 라벨에 선택적으로 컨쥬게이션된다.

따라서, 본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명에 따른 단일클론 항체의 시료에서 알파-톡신과의 결합 측정을 위한 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 항체의 알파-톡신과의 결합은 예를 들어, HRP-컨쥬게에션된 염소 항 인간 IgG 이차 항체(HRP-conjugated goat anti human IgG secondary antibody)로 검출될 수 있다.

도 1은 인간 단일클론 항체 243-4 중쇄의 가변 영역(heavy chain variable region)의 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. 243-4의 CDR1 영역은 26 내지 33에 위치하며, 243-4의 CDR2 영역은 51 내지 58에 위치하고, 243-4의 CDR3 영역은 97 내지 110에 위치한다.
도 2는 인간 단일클론 항체 243-4 경쇄의 가변 영역(light chain variable region)의 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. 243-4의 CDR1 영역은 26 내지 33에 위치하며, 243-4의 CDR2 영역은 51 내지 53에 위치하고, 243-4의 CDR3 영역은 90 내지 101에 위치한다.
도 3은 인간 단일클론 항체 243-4의 항원 특이성을 보여준다. 항체 243-4의 항원 특이성은 세균 톡신의 패널에의 결합으로 ELISA 분석에 의해 평가되었다. ELISA는 정제된 톡신으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트(microtiter plates) 위에서 수행되었다. 상온에서의 하룻밤 인큐베이션 후에 상기 마이크로타이터 플레이트는 BSA로 차단되었고 고정된 톡신으로의 mAb 243-4의 결합은 HRP-컨쥬게이션된 염소 항 인간 IgG 이차 항체(HRP-conjugated goat anti human IgG secondary antibody)로 검출되었다. 인간 단일클론 항체 243-4의 황색포도상구균 알파-톡신과의 결합은 시험된 모든 다른 톡신들과의 결합보다 확실히 선호되었다.
도 4는 인간 단일클론 항체 243-4의 유행성 황색포도상구균 균주(epidemic S. aureus strains)의 알파-톡신과의 결합을 웨스턴 블롯(Western Blot) 실험으로 보여준다. 열두 유행성 황색포도상구균 균주의 알파-톡신 생성은 정체기(stationary growth phase)의 세균 배양으로부터 관찰되었다. 재배 후에 평균화된 세균 상등액(supernatants) 및 정제된 알파-톡신은 SDS-PAGE 겔에 로딩되었고 일렉트로블로팅(electroblotting)에 적용되었다. 차단 후에 니트로셀룰로오스 막은 정제된 인간 단일클론 항체 243-4와 함께 인큐베이션 되었다. 유행성 균주로부터 매번 평가된 두 모노머릭 및/또는 헵타머릭 알파-톡신의 생산 및 인식은 인간 단일클론 항체 243-4의 결합에 의해 증명되었다.
도 4에서, M은 사이즈 마커를 의미하고, 1 내지 12의 숫자는 유행성 황색포도상구균 균주이며 aTox는 정제된 알파-톡신이다.
도 5는 인간 단일클론 항체 243-4의 BIAcore에 의한 친화성(affinity) 측정을 보여준다. 인간 단일클론 항체 243-4의 결합 역학(binding kinetics)은 BIAcore 2000 기기를 이용하여 분석되었다. 다른 알파-톡신 농도들은 mAb 243-4와 함께 고정된 유세포(flow cell)에 적용되었다. 결합(Association) 및 해리(dissociation) 상은 항체의 해리 상수(dissociation constant)를 계산하기 위하여 기록되었다. 상기 역학 데이터는 BIAevaluation 4.1 소프트웨어를 이용하여 포괄 맞춤(global fitting)에 의해 평가되었다.
도 6은 인간 폐포 세포(alveolar cell) 손상의 조직 배양 모델에서 인간 단일클론 항체 243-4에 의한 알파-톡신 중화를 보여준다. 인간 A549 폐포 상피 세포는 알파-톡신과 함께 16시간 동안 다른 아형 대조군 항체 또는 단일클론 항체 243-4의 존재하에 배양되었다. 그 후에 상기 세포들은 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 분석에 의해 분석되었고, 알파-톡신에 의해 야기되는 세포의 손상의 판독을 제공하고 적용된 항체로 얻어질 수 있는 보호 정도를 나타낸다. 결과를 해석하기 위해, 세포 용해는 가장 높은 알파-톡신 농도로 미리 인큐베이션한 것을 100%로 놓은 것의 결과이다. 톡신을 처리한 세포들은 오직 적용된 알파-톡신 농도에 따른 용해의 역가를 보였다. 상기와 같은 역가는 알파-톡신이 아형 대조군 항체와 미리 인큐베이션 되었을 때 관찰되었고, 상기 아형 대조군의 보호 효과가 없음을 나타낸다. 반면에, 인간 폐포 상피 세포들은 인간 단일클론 항체 243-4와 인큐베이션하여 알파-톡신 의존적인 용해로부터 보호되었다. 상기 실험은 세 독립적인 횟수로 수행되었고, 각각의 경우 항체 243-4의 보호력(protectivity)이 확인되었다.
도 7은 다수장기(multiorgan) 감염의 중심 정맥 카테터(central venous catheter) 관련 마우스 모델에서 인간 단일클론 항체 243-4의 보호 효과를 보여준다. 카테터 설치 24시간 후, 상기 마우스들은 황색포도상구균 균주 US300 1x10e7 CFU 및 mAb 243-4 7.5 mg/kg 또는 PBS 각각을 카테터를 통해 받았다. 이틀 뒤에, 대조군 마우스들은 PBS만을 받은 반면, 실험군 마우스들은 5 mg/kg 투여량의 이차 항체를 받았다. 오일 후에 수술받은 마우스들은 신장 세균 부하(bacterial load) 및 신장 농양 형성을 관찰하기 위해 안락사되었다(euthanized). 모든 대조군 마우스들은 높은 신장 세균 부하 및 강한 농양 형성을 가진 반면에, 단일클론 항체 243-4로 면역화된 마우스들은 세균 부하의 강한 감소를 보였고 신장 농양 형성이 없음이 관찰되었다.

본 발명에서 설명하는 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 추가적인 실시태양은 명세서(specification)를 연구할 때 및 일반적인 공유 지식(common general knowledge)을 참작할 때 당업계에 종사하는 당업자에게 자명할 것이다.

실시예

실시예 1

243-4의 DNA 및 아미노산 서열

상기 항체특이성(antibody specificity)은 DNA- 및 아미노산-서열 각각에 의해 측정된다. 중쇄의 및 경쇄의 가변 단편의 DNA 서열이 측정되었다.

RNA 분리를 위해 5x10e5 하이브리도마 세포들이 원심분리에 의해 펠릿화되었고 Qiashredder 컬럼(#79654, Qiagen)을 이용해 파쇄되었다. 상기 mRNA는 그 후에 파쇄된 하이브리도마 세포 펠릿으로부터 RNeasy-Kit(#74124, Qiagen)를 이용하여 공급자의 설명서(instruction handbook) 에 따라 분리되었다. 분리된 mRNA를 토대로, cDNA가 Superscript II 역전사 효소(reverse transcriptase)(#18064-022, Invitrogen)를 이용하여 역전사되어 합성되었다. 항체 243-4의 유전자는 합성된 cDNA로부터 Advantage 2 PCR Kit(#639206, Clontech)를 사용하여 공급자의 설명서에 따라 증폭되었다. 항체 유전자의 특이적인 증폭은 인간 재배열 IgG 가변 영역 유전자의 증폭을 설계된 프라이머 조합(primer combinations)(Welschof et al., 1995)의 적용에 의해 보증되었다. 중쇄의 가변 도메인(VH) 및 경쇄의 가변 도메인(VL) 모두의 증폭을 위해, 한 벌의 체인-특이적 포워드 프라이머(forward primer)는 한 중쇄 또는 경쇄 각각의 불변 도메인에 특이적으로 어닐링하는 백워드 프라이머(backward primer)와 조합되어서 사용되었다(CH IgG와 VH1, VH2, 및 VH3를 조합하여 VH 증폭; CL λ와 VLλ 1, VLλ 2/5, VLλ 3, VLλ 4a, VLλ 4b, 및 VLλ 6를 조합하여 VL 증폭; 표 1 참고). PCR 증폭산물들은 그 후에 TOPO TA Cloning Kit for Sequencing(#K457540, Invitrogen)의 플라스미드에 클로닝되었고 정제된 플라스미드 DNA는 최종적으로 TOPO Cloning Kit의 특이적인 플라스미드 특이적인 프라이머를 이용한 시퀀싱 분석(Microsynth, Balgach, Switzerland)을 위해 보내졌다(T3 및 T7, 표 1 참고). 얻어진 상기 DNA 서열들은 가공되었고 클론 매니져 소프트웨어 패키지(clone manager software package)(#875-501-1787, Scientific&Educational Software)를 이용하여 얼라인되었다. 수행된 얼라인먼트(alignments) 결과, 공통 서열(consensus sequence)이 밝혀졌고 그 다음에 모든 인간 생식계열 가변 영역 서열 V Base 데이타베이스(http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/)를 이용하여 분석되었다. 초기 시퀀싱 결과에 기초하여 추가적인 체인-특이적 내부 프라이머(internal primer) 서열(VL-atox as 및 VH-atox as, 표 1 참고)이 설계되었으며 이전에 사용된 프라이머 조합의 어닐링된 지역에서 식별된 항체 서열을 확인하기 위하여 적용되었다. 그렇게 함으로써 생성된 항체 유전자들은 상기에 기재된 바와 같이 시퀀싱에 적용되었고, 도 1 및 2에 나타낸 바와 같다.

증폭 및 항체 243-4의 가변 영역의 시퀀싱을 위해 사용된 프라이머 서열

프라이머	출처	서열번호	서열 (5'-3')	적용
CH IgG	Welschof et al., J Immunol Met, 179, 1995	9	GAC C(G⁵⁰)GA TGG GCC CTT GGT GGA^*	PCR, 시퀀싱
VH1		10	C(G⁵⁰)AG GTG CAG CTG GTG CAG TCT^*	PCR, 시퀀싱
VH2		11	CAG GTG(A⁵⁰) CAG CTG CAG G(C⁵⁰)AG TC^*	PCR, 시퀀싱
VH3		12	GAG GTG CAG CTG G(T⁵⁰)TG GAG TCT^*	PCR, 시퀀싱
CL λ		13	AGA GGA G(C⁵⁰)GG GAA CAG AGT GAC^*	PCR, 시퀀싱
VLλ 1		14	CAG TCT GTG T(C⁵⁰)TG ACG(T⁵⁰) CAG CCG CCC TCA^*	PCR, 시퀀싱
VLλ 2/5		15	CAG TCT GCG CTG ACT CAA(G⁵⁰) CCG G(C⁵⁰)CC TCT^*	PCR, 시퀀싱
VLλ 3		16	TCC TAT GAA CTG ACT CAG CCA CCC(T⁵⁰) T	PCR, 시퀀싱
VLλ 4a		17	TCT GAA CTG ACT CAG CCG(A³³T³³) C(G⁵⁰)CC TC^*	PCR, 시퀀싱
VLλ 4b		18	TCT GAA CTG ACT CAG GAC CCT GC(T⁵⁰)T^*	PCR, 시퀀싱
VLλ 6		19	A(G⁵⁰)AT TTT ATG CTG ACT CAG CCC CAC TCT^*	PCR, 시퀀싱
T3	#K457540 Invitrogen	20	ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA	시퀀싱
T7	#K457540 Invitrogen	21	TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG	시퀀싱
VL-atox as	Internal design	22	AGG CTG TCA TCC CAT GTT GCA CAG	PCR, 시퀀싱
VH-atox as	Internal design	23	CTG CTG CTC CCA GAT CGT CTC GC	PCR, 시퀀싱

^* 괄호는 이전 자리에 치환을 나타내고 숫자는 뉴클레오티드들이 치환된 백분율을 나타낸다.

실시예 2:

인간 단일클론 항체 243-4의 항원 특이성( ELISA )

항체 243-4의 항원 특이성이 세균 톡신(알파-톡신: #120, List Biological Laboratories;다른 모든 톡신들: 자체 제작, Kenta Biotech AG)의 패널에 대한 결합으로 ELISA 분석에서 평가되었다. ELISA는 각각 1 ㎍/ml의 농도로 정제된 톡신으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트(#439454, Nunc MaxiSorp) 위에서 수행되었다. 상온에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후에 마이크로타이터 플레이트는 0.5 % BSA로 2시간 동안 차단되었고 고정된 톡신과 mAb 243-4(1 ㎍/ml)의 결합이 1:2000으로 희석된 HRP-컨쥬게이션된 염소 항 인간 IgG 이차 항체(#62-8420, Zymed Laboratories, Invitrogen)로 검출되었다. 반응은 HCL로 멈춰졌다.

흡광도(Optical density)는 도 3에 나타낸 바와 같이 ELISA 리더에서 490 nm에서 Softmax Pro^®소프트웨어를 이용하여 읽어졌다.

실시예 3:

웨스턴 블롯 실험에서의 유행성 황색포도상구균 균주( epidemic S. aureus strains )의 알파 톡신에 대한 결합

열두 유행성 황색포도상구균 균주로부터 알파-톡신 생산이 37 ℃에서 BHI 배지(#255003, Becton Dickinson)에서 성장 16시간 후에 관찰되었다. 상기 균주는 German S. aureus reference center (Robert Koch Institute, Wernigerode)에서 얻었으며 최근에 황색포도상구균 감염을 야기하는 가장 일반적인 유행성 균주이다. 이런 균주들 중 몇몇은 다른 신호 강도를 야기한 다른 균주들에 비해 알파-톡신을 적게 생산한다.

평가된 균주들의 다른 유전자형(genotypes)은 표 2에 나타냈다. 재배(cultivation) 후 세균들은 원심분리로 펠릿화되었고 상등액은 초기 세균 배양의 OD₆₀₀ = 0.6으로 평균화되었다. 각각 상등액의 25 ㎕는 4 내지 20% SDS-PAGE 겔(#EC60252, Invitrogen)에 로딩되었고 그 다음에 일렉트로블로팅이 1시간 동안 수행되었다. 정제된 알파-톡신(#120, List Biological Laboratories) 1 mg이 로딩되었고 참고문헌과 같이 블롯팅되었다. 5% 밀크 파우더로 1시간 동안 차단한 후,

니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)(# LC2000, Invitrogen)은 정제된 인간 단일클론 항체 243-4 50 ㎍/ml와 인큐베이션 되었다. 항체 243-4의 알파-톡신과의 결합은 1:2000으로 희석된 HRP-컨쥬게이션된 염소 항 인간 IgG 이차 항체(#62-8420, Zymed Laboratories, Invitrogen)로 도 4에 나타낸 바와 같이 최종적으로 검출되었다.

원내 및 지역사회 획득 메티실린 저항성 황색포도상구균 균주( Methicillin resistant S. aureus strains , MRSA )의 대표적인 클론 세포주 패널

웨스턴 블롯 명칭	Robert Koch Institute 분리 번호	MLST 타입^*1	CC^*2	Spa 서열 타입^*3
1	93-00134	ST247	8	t051
2	06-00842	ST8	8	t008
3	06-02222	ST9	8	t008
4	06-01579	ST239	8	t031
5	06-00219	ST5	5	t002
6	06-00409	ST225	5	t003
7	06-01019	ST45	45	t1384
8	06-02182	ST22	22	t965
9	03-02773	ST1	1	t175
10	06-00373	ST8	8	t008
11	05-01089	ST22	22	t310
12	06-00300	ST80	80	t044

^*1) 다좌위 서열 타이핑(Multi locus sequence typing)

^*2) 클론 복합체(Clonal complex)

^*3) 단백질 A 유전자(spa) 가변 반복 영역(variable repeat region) 분석

실시예 4:

친화도( Affinity ) 측정( by BIAcore )

표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)이 BIAcore 2000 기기(BIAcore)를 이용하여 측정되었다. 모든 실험들은 20 mM 몹스 버퍼(Mops buffer), pH 7.0, 150 mM NaCl, 및 0.1 mg/ml BSA에서 수행되었다. 우선, 염소 항 인간 IgG((#81-7100, Zymed Laboratories, Invitrogen)은 BIAapplications 설명서에 기재된 바와 같이 CM5 칩(BIAcore) 위에 거의 13200 RU까지 아민-커플링에 의해 고정되었다. 항체 243-4는 초기 공유결합 코팅(covalent coating) 이외에도 상호작용을 통해 미리 고정된 항 인간 IgG 항체와 센서 칩(sensor chip)에 결합되었고, 최종적으로 거의 240 RU의 추가적인 고정 정도(immobilization level)를 산출하였다. 항원-항체(antigen-antibody)의 역학적 특성(kinetic characterization)을 위해 증가하는 알파-톡신 농도(3.9 nM, 7.8 nM, 15.62 nM, 31.25 nM, 62.5 nM, 125 nM, 250 nM, 및 500 nM; #120, List Biological Laboratories)의 상호작용(interaction) 펄스(pulses)는 50 ㎕/분의 유속(flow rate)으로 주입되었다. 각각의 측정 사이클(결합(association) 5분에 뒤이어 해리(dissociation) 30분) 후에 상기 항체-항원 복합체는 pH 1.7의 10 mM 글리신(glycine)-HCl을 이용한 표면의 재생(regeneration)에 의해 분해되었다. 항체 243-4의 해리 상수(dissociation constant)의 계산을 위해 결합 및 해리 상(phases)이 기록되었고 소프트웨어 BIAevaluation 4.1(BIAcore AB, 도 5에서 보여준 것과 같이)를 이용한 포괄 맞춤(global fitting)으로 평가되었다. 포괄 맞춤 분석을 위해 BIAcore 매뉴얼에 명시된 대로 하기 랭뮤어(Langmuir) 1:1 결합 모델 분석을 허용한 오직 세 항원 농도들(≤ 125 nM, 표 2) 만이 고려되었다.

알파- 톡신 -항체 243-4 양적 상호작용의 역학 상수

항원 농도	k_ass (l mol^-1 s^-1)	k_diss (s^-1)	K_D (in M)
3.9 nM	5.7 * 10⁴	8.2 * 10^-5	1.4 * 10^-9
7.8 nM	6.1 * 10⁴	1.0 * 10^-5	1.6 * 10^-9
15.62 nM	6.2 * 10⁴	8.0 * 10^-5	1.3 * 10^-9
31.25 nM	6.3 * 10⁴	9.7 * 10^-5	1.5 * 10^-9
62.5 nM	6.6 * 10⁴	9.0 * 10^-5	1.4 * 10^-9
125 nM	6.2 * 10⁴	8.9 * 10^-5	1.4 * 10^-9
평균값	6.2 * 10⁴ ± 0.3 * 10⁴	8.9 * 10^-5 ± 0.7 * 10^-5	1.4 * 10^-9 ± 0.1 * 10^-9

실시예 5:

인간 폐포 세포 손상 조직 배양 모델

인간 A549 폐포 상피 세포(alveolar epithelial cells)는 웰당 3x10e5 세포의 밀도로 RPMI 배지(#R0883, Sigma-Aldrich)에 분주되었다. 평행 증가하는 알파-톡신의 농도(5 mg/ml 내지 50 mg/ml; #120, List Biological Laboratories)이 미리 오직 배지, 아형 대조군 항체(인간 IgG1 람다, 정제된 미엘로마 단백질; #I 5029, Sigma-Aldrich) 20 ㎍/ml 또는 정제된 단일클론 항체 243-4 20 ㎍/ml와 인큐베이션되었다. 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후 알파-톡신 또는 알파-톡신 항체 용액은 세포에 첨가되었고 16시간 동안 추가적으로 인큐베이션되었다. 그 시간 후 상기 세포들은 도 6에 나타낸 바와 같이 세포내에서 배양 배지로의 LDH 방출을 판독을 제공하는 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 분석(#04744934001, Roche)으로 분석되었다

실시예 6:

다장기 ( multiorgan ) 감염 마우스 모델

무게가 27 내지 31 g인 암컷 Balb/c 마우스들(Charles River, Sulzfeld, Germany)은 수술에 앞서 14일 동안 적응시켜졌다. 상기 마우스들은 병원체가 없다고 명시된 공급자로부터 얻어졌다. 카테터(catheter)의 설치를 위해 상기 마우스들은 자일라진(xylazin)(8 mg/kg 체중)/케타민(100 mg/kg 체중)으로 복막내(intraperitoneally) 마취되었다. 상대정맥(superior vena cava)에 단일 루멘 폴리에틸렌 카테터(single lumen polyethylene catheter)(외부 직경 0.6 mm, Fohr Medical Instruments, Seeheim, Germany)를 설치하기 위하여 면도된 목의 왼쪽 피부가 최소한으로 횡 절개되었다. 카테터 설치 24시간 후, 상기 마우스들은 1x10e7 CFU의 황색포도상구균 균주 US300(100 ㎕) 및 7.5 mg/kg의 정제된 mAb 243-4 또는 PBS(50 ㎕)를 카테터를 통해 받았다. 이틀 뒤에, 대조군 마우스들이 PBS만을 받은 반면, 실험군 마우스들은 이차 항체 복용량(5 mg/kg)을 받았다. 수술 오일 후 신장 세균 부하 및 신장 농양 형성을 관찰하기 위해 마우스들을 안락사시켰다. 그런 이유로 신장은 안락사한 동물들로부터 무균적으로 수득되었고 식염수(saline)에서 파쇄되었다. 장기 회수 전에, 상대정맥에서의 카테터의 위치가 확인되었고 신장 파쇄에 앞서 장기들은 농양 형성에 대해 육안으로(macroscopically) 조사되었다. 최종적으로, 장기 파쇄물의 계열 희석물(serial dilutions)은 MPK 플레이트에서 최소 37 ℃에서 48시간 동안 배양되었다. 콜로니 형성 단위(colony forming units, CFU)는 도 7에 나타낸 것과 같이 CFU/신장으로 계산 및 기록되었다.

실험군 및 대조군 동물에서 신장 농양 형성의 차이

MAb 실험군	마우스 1	양쪽 신장에 농양형성 없음
	마우스 2	양쪽 신장에 농양형성 없음
	마우스 3	양쪽 신장에 농양형성 없음
대조군	마우스 4	양쪽 신장에 강력한 농양형성
	마우스 5	양쪽 신장에 강력한 농양형성
	마우스 6	실험 종료 전에 마우스가 사망하여 측정 불가

Claims

경쇄(light chain)의 가변 영역(variable region)은 서열번호 1의 CDR1 영역(CDR1 region), 서열번호 2의 CDR2 영역(CDR2 region) 및 서열번호 3의 CDR3 영역(CDR3 region)을 포함하며, 중쇄(heavy chain)의 가변 영역(variable region)은 서열번호 4의 CDR1 영역(CDR1 region), 서열번호 5의 CDR2 영역(CDR2 region) 및 서열번호 6의 CDR3 영역(CDR3 region)을 포함하는 황색포도상구균(S. aureus)의 알파-독신(alpha-toxin)에 특이적인 단일클론 항체, 또는 황색포도상구균(S. aureus)의 알파-톡신에 결합 가능한 그의 단편(fragment) 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR 영역 중 어느 하나에 적어도 하나의 보존적 치환(conservative substitution)을 갖는 항체의 돌연변이 단백질(mutein).
제 1항에 있어서, 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖고 중쇄의 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체(monoclonal antibody), 또는 황색포도상구균의 알파-톡신에 결합 가능한 그의 단편, 또는 황색포도상구균의 알파-톡신에 결합 가능한 상기 항체의 경쇄의 가변 부위의 아미노산 서열은 서열번호 7과 최소 85%의 상동성을 갖고 중쇄의 가변 부위의 아미노산 서열은 서열번호 8과 최소 85%의 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 변이체(variant).
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 단편(fragment)은 Fab, F(ab')₂, 단쇄(single chain) 또는 항체 도메인인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄는 람다 타입(lambda type)인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄는 IgG 타입인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 황색포도상구균의 알파-톡신의 모노머릭(monomeric) 및 올리고머릭(oligomeric) 형태에 특이적으로 결합 가능한 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 N-말단(N-terminally), 내부(internally) 또는 C-말단(C-terminally)이 변형된 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 8항에 있어서, 상기 변형은 적어도 하나의 올리고머화(oligomerization), 글리코실화(glycosylation) 또는 약물(drug) 또는 라벨(label)로의 컨쥬게이션으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
포유류의 B 세포 또는 상기 포유류 B 세포와 미엘로마(myeloma) 또는 헤테로 미엘로마(heteromyeloma) 세포의 융합으로 얻어진 하이브리도마(hybridoma)로부터 얻어질 수 있는 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 8항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 단일클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마.
제 1항 내지 제 8항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 단일클론 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산.
제 1항 내지 제 8항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 단일클론 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산.
적어도 하나의 제 12항의 경쇄를 암호화하는 핵산 또는 적어도 하나의 제 13항의 중쇄를 암호화하는 핵산, 또는 적어도 하나의 제 12항의 경쇄를 암호화하는 핵산 및 적어도 하나의 제 13항의 중쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터.
제 14항에 있어서, 상기 벡터는 그것의 발현을 가능하게 하기 위해 핵산과 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터(vector).
제 15항의 벡터 또는 제 12항 또는 제 13항의 핵산을 포함하는 숙주 세포(host cell).
제 11항의 하이브리도마를 항체의 분비를 위해 허용하는 조건 하에서 배양하거나 제 16항의 숙주세포를 단일클론 항체의 발현을 위해 적합한 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는 제 1항 내지 제 8항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 단일클론 항체를 생산하는 방법.
적어도 하나의 제 1항 내지 제 8항의 단일클론 항체 또는 적어도 하나의 제 12항 또는 제 13항의 핵산 및 약학적으로 허용되는 담체(carrier) 또는 성분(ingredient)을 포함하는 약학적 조성물.
장기에서의 농양 형성(abscess formation)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 제 12항 또는 제 13항의 핵산.
장기에서의 농양 형성의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 제 12항 또는 제 13항의 핵산의 용도.
제 19항 또는 제 20항에 있어서, 상기 장기에서의 농양은 복부 농양(abdominal abscess)인 것을 특징으로 하는 용도.
제 19항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장기는 신장(kidney), 심장(heart), 간(liver), 폐(lung), 뇌(brain), 피부(skin) 또는 비장(spleen)인 것을 특징으로 하는 용도.
제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농양 형성은 황색포도상구균 감염(S. aureus infection)에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 용도.
적어도 하나의 제 1항 내지 제 10항의 단일클론 항체 또는 제 12항 또는 제 13항의 핵산을 포함하는, 시료에서 황색포도상구균 감염의 진단을 위한 시험 키트(test kit).
시료에서 알파-톡신과의 결합을 검출하기 위한 적어도 하나의 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 단일클론 항체의 용도.