BR112012002892B1 - Anticorpo monoclonal específico para a alfa-toxina de s. aureus, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo monoclonal, composição farmacêutica, uso de um anticorpo monoclonal e kit de teste para o diagnóstico de uma infecção de s. aureus - Google Patents

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL ESPECÍFICO PARA A ALFA-TOXINA DE S. AUREUS, HIBRIDOMA, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR O ANTICORPO MONOCLONAL, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL E KIT DE TESTE PARA O DIAGNÓSTICO DE UMA INFECÇÃO DE S. AUREUS A presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal específico para a alfa-toxina de S. aureus e um hibridoma produzindo o dito anticorpo monoclonal. Adicionalmente, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreendem, pelo menos, um anticorpo ou, pelo menos, uma codificação de ácido nucléico do dito anticorpo. Adicionalmente, a presente invenção relaciona-se com o uso do dito anticorpo monoclonal para tratamento ou prevenção de formação de abscesso.

Description

[0001] A presente invenção relaciona-se com um anticorpo monoclonal humano específico para a alfa-toxina de S. aureus, um hibridoma produzindo o mesmo, ácidos nucleicos codificando o mesmo, e células hospedeiras transfectadas com o mesmo. Adicionalmente, a presente invenção relaciona aos métodos para produzir o referido anticorpo monoclonal. Adicionalmente, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreendem, pelo menos, um anticorpo ou, pelo menos, um ácido nucleico codificando o dito anticorpo. Do mesmo modo, a presente invenção relaciona-se com o uso do referido anticorpo monoclonal para tratamento ou prevenção de formação de abscesso.

[0002] Staphylococcus aureus (S. aureus) é uma bacteria anaeróbia facultativa, gram positiva, esférica, considerada para ser um patógeno oportunista. S. aureus coloniza comumente as superfícies da pele, nariz e da mucosa do trato gastrointestinal de seres humanos saudáveis. Aproximadamente 20-30% da população é colonizada com S. aureus, em algum momento. Estas bactérias frequentemente causam infecções secundárias, como espinhas e furúnculos em indivíduos saudáveis. Normalmente, as barreiras das mucosas e epiderme (pele) protegem contra infecções por S. aureus. Interrupção destas barreiras naturais como um resultado de ferimentos - tais como queimaduras, trauma, ou procedimentos cirúrgicos - aumenta dramaticamente o risco de infecção e pode causar infecções graves e / ou sistêmicas. Doenças que comprometem o sistema imunológico (por exemplo, diabetes, estágio final de doença renal, câncer, AIDS e outras infecções virais), mas também terapias imunossupressoras - por exemplo, como a radiação, terapias quimioterápicas e de transplante - aumentam o risco de infecção. Infecções por S. aureus oportunistas podem se tornar bastante graves, causando endocardite, bacteremia, osteomielite e formação de abscesso, que pode resultar em morbidade severa ou mortalidade. Infecções por Staphylococcus podem ser divididas em infecção localizada, tais como pneumonia, e infecções clinicamente mais complexas por S. aureus, como infecções da corrente sanguínea e formação de abscessos causados por órgãos distantes.

[0003] S. aureus é uma das principais causas de infecções no sangue, pele, tecidos moles e trato respiratório inferior em todo o mundo. As frequências de ambas infecções hospitalares e adquiridas na comunidade têm aumentado progressivamente ao longo dos anos. Adicionalmente, o tratamento destas infecções tornou- se mais desafiador devido à emergência de cepas resistentes à multi-drogas. Em países desenvolvidos, tais como os Estados Unidos, resistência a antibióticos e-lactâmicos em cepas de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) é um grande problema em hospitais e outros locais para cuidados da saúde. Notavelmente, a taxa de incidência de todas as infecções invasivas por MRSA, incluindo aquelas que estão fora dos hospitais, é elevada em comparação com outras bactérias patogênicas e 20% dessas infecções resultam em morte. Adicionalmente, a ocorrência de resistência adquirida à vancomicina, ainda, limitou as opções de tratamento para infecções graves por S. aureus.

[0004] S. aureus tem um arsenal diverso de fatores de virulência que contribuem para a patogênese da doença. Estes podem ser amplamente subdivididos em proteínas secretadas na superfície e extracelulares. Proteínas de superfície incluem ambos os componentes estruturais da parede celular bacteriana, tais como peptidoglicano e ácido lipoteicóico, e proteínas de superfície preferencialmente expressas durante o crescimento exponencial, incluindo proteína A, proteína ligada à fibronectina e fator de aglutinação. Proteínas secretadas são geralmente expulsas a partir das células bacterianas durante a fase estacionária de crescimento bacteriano e incluem várias toxinas, tais como alfa-toxina (também conhecida como alfa hemolisina), enterotoxina B, leucocidinas (incluindo Panton-Valentine Leucocidina PVL), lipase e protease V8. No entanto, apesar do amplo conhecimento sobre as propriedades bioquímicas e moleculares dessas toxinas, o papel preciso das toxinas na patogênese de infecções por S. aureus não é totalmente compreendido.

[0005] Evidência experimental e dados epidemiológicos têm sugerido que entre outras citotoxinas, alfa-toxina pode estar envolvida na patogênese de pneumonia (Mc Elroy et al, 1999). Alfa-toxina é conhecida por empenhar receptores de superfície de células hospedeiras sensíveis e, portanto, inerentes à superfície da célula. Este evento promove a oligomerização da toxina em um pré-poro heptamérico e de inserção de uma estrutura em barril β com um diâmetro de poro de 2-nm para a membrana plasmática. A formação do poro está causando perda da integridade da membrana, desestabilizando as células e, em última análise, levando à apoptose e lise celular. Em linfócitos particulares, macrófagos, células epiteliais alveolares, endotélio pulmonar, e eritrócitos são sensíveis à formação de poros por alfa-toxina; no entanto, granulócitos e fibroblastos aparecem resistentes à lise (McElroy et al, 1999.).

[0006] O papel exato da alfa-toxina na resposta inflamatória e a indução de resposta imune inata a infecções bacterianas não se encontram plenamente compreendidos. S. aureus expressa um número de outros fatores de virulência e até hoje a contribuição de cada fator de virulência para manifestação da doença não é totalmente estudado e coloca um desafio para o desenvolvimento de profilaxia e terapia de infecção clínica do complexo S. aureus.

[0007] Alfa-toxina é conhecida por ser um dos fatores de virulência para o estabelecimento de infecções por S. aureus no hospedeiro e um número de estudos têm destacado a importância da alfa-toxina na doença, por exemplo, em instilação de alfa-toxina purificada em tecido de pulmão de coelho ou rato desencadeia extravasamento vascular e hipertensão pulmonar, o que tem sido atribuído à liberação de moléculas de sinalização diferentes (por exemplo, fosfatidil inositol, óxido nítrico, prostanóides, e tromboxano A2). Na literatura tem sido mostrado que a imunidade anti-alfa-toxina é protetora contra efeitos prejudiciais da toxina, mas projetar vacinas contra a alfa-toxina continua a ser um desafio significativo.

[0008] Wardenburg e Schneewind (2008) demonstraram que a gravidade da doença de pulmão em camundongos se correlaciona com os níveis de alfa-toxina produzida por um S. aureus particular, isolado. Adicionalmente os autores mostraram que a imunização contra uma alfa-toxina variante não formadora de poro induziu à pneumonia causada por S. aureus. Esses achados são consistentes com um estudo a partir do mesmo grupo demonstrando que a alfa-toxina é importante para a patogênese da pneumonia CA-MRSA (comunidade associada à S. aureus resistente à meticilina). Em outra configuração os autores demonstraram que os anticorpos contra alfa-toxina também protegeram células epiteliais pulmonares humanas a partir de S. aureus - por lise induzida (Wardenburg e Schneewind (2008)).

[0009] Embora estes resultados indiquem que a alfa- toxina contribui para a destruição do tecido do pulmão, não é ainda claro se a morte dos animais nos experimentos acima descritos resultou a partir da destruição direta de células do pulmão pela toxina, a partir de uma resposta inflamatória excessiva, ou a partir de ambos. Transferência passiva de anticorpos alfa-toxina reduziu significativamente os níveis de interleucina 1β circulantes, uma citocina conhecida por acompanhar lesão pulmonar aguda. Portanto, é razoável concluir que a resposta inflamatória pode contribuir para danos nos pulmões mediados por alfa-toxina.

[0010] Durante uma infecção localizada, tal como pneumonia em seres humanos, aprox. 40% dos pacientes com pneumonia por S. aureus desenvolveram infecções nda corrente sanguínea e doenças disseminadas. A disseminação da infecção bacteriana pode levar à infecção da corrente sanguínea e contaminação de órgãos distantes. A infecção na corrente sanguínea pode levar a septicemia, uma complicação progredindo rapidamente e frequentemente sendo fatal de infecções por S. aureus.

[0011] A disseminação de uma infecção por S. aureus também é comumente vista em modelos animais de pneumonia por S. aureus, novamente com aproximadamente 40% dos animais desenvolvendo bacteremia disseminada devido à lesão tecidual e disseminação da infecção através de camadas epiteliais na corrente sanguínea e no tecido linfático. Não obstante, a disseminação depende em grande medida do pano de fundo genético da cepa animal utilizada e o potencial do sistema imunológico inato, tal como ativação de neutrófilos, para controlar o crescimento de, por exemplo, animais que sofreram depleção de neutrófilos C57B / L são altamente suscetíveis a infecções renais com S. aureus enquanto que animais imuno competentes são resistentes a infecções. Em contraste animais A/J foram muito suscetíveis, principalmente devido ao recrutamento de neutrófilos para o rim (von Kockritz-Blickwede, 2008).

[0012] Embora dados sobre estrutura e função de proteínas de S. aureus tenham tornado mais abrangente o desenvolvimento de uma vacina eficaz permanece um desafio.

[0013] Uma tentativa foi feita de forma segura para conferir imunidade a alfa-toxina e bactéria S. aureus pelo uso de composições que compreendem uma combinação de anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno à alfa-toxina de S. aureus e anticorpos que se ligam especificamente a outro antígeno bacteriano (WO 2007/145689). Estas composições, enquanto compreendem montantes de anticorpos que não são eficazes sobre as mesmas, não obstante neutralizam infecção e / ou fornecem proteção contra infecção pela atividade sinérgica da combinação de anticorpos.

[0014] A eficácia protetora da dita combinação da toxina-neutralizante de S. aureus e anticorpos opsônicos a 72 horas da mudança pós-bacteriana com um S. aureus isolado é demonstrada como em comparação com o efeito protetor da imunização com anticorpos, quer neutralizantes ou opsônicos sozinho. A combinação dos anticorpos opsônicos e toxina- neutralizantes demonstraram um efeito protetor na prevenção de infecção da pele e do tecido mole e contaminação de órgãos. No entanto, o anticorpo neutralizante anti-alfa-toxina divulgado pelo pedido de patente em si não é suficiente para impedir a contaminação do órgão / formação de abscesso ou neutralizar a infecção.

[0015] Uma tentativa a mais foi feita por Heveker et al (1994a, 1994b) que descreve como neutralizar anticorpos monoclonais humanos e de murinos dirigidos contra alfa-toxina de S. aureus. O anticorpo monoclonal humano de IgG / subtipo lambda é caracterizado pela sequência e apresenta neutralização.

[0016] O anticorpo da toxina anti-alfa que produz hibridoma humano descrito por Heveker (1994a) foi isolado utilizando leucócitos do sangue periférico a partir de um voluntário saudável previamente imunizado com uma vacina teste contra S. aureus alfa-toxóide. Enquanto o alfa-toxóide utilizado no estudo de Heveker representa uma alfa-toxina quimicamente modificada poderia ser assumido que a modificação não rende determinantes antigênicos menos imunogênicos ou até mesmo não- imunogênicos e, como tal, a abordagem não poderia produzir uma imunidade igualmente eficaz, como foi demonstrado para outras toxinas bacterianas, tais como a cólera toxina, onde as vacinas toxóides estimularam anticorpos anti-toxina o que não confere imunidade a infecções (Levine (1983)).

[0017] Vários fatores têm sido identificados na literatura como fatores de virulência crítica para a formação de abscesso, tais como toxinas, peptidoglicanos, fatores extracelulares e enzimas. Um papel potencial da alfa-toxina na formação de abscessos foi postulado por Kapral et al. (1980). Alfa-toxina é relatada para acumular dramaticamente no abscesso sob maturação de abscessos embora não se pudesse ser demonstrado de que a alfa-toxina é necessária para a formação de abscesso. Uma segunda publicação de Adlam et al (1977) negou um papel- chave na formação de abscesso para alfa-toxinas. Os autores demonstraram que a alfa-toxina desempenha um papel-chave na forma hemorrágica que se espalha de mastite de coelho azul vista em surtos naturais. Eles reproduziram o quadro clínico em laboratório com duas cepas de Staphylococcus não relacionadas. Um elevado título anti-alfa-toxina circulante conferiu proteção contra esta forma letal de mastite. Assim, o título de neutralização poderia prevenir morte fatal, modificando o quadro clínico para condição de abscesso menos severa. No entanto, a neutralização de alfa-toxina não afetou / impediu a formação de abscesso em coelhos. Em uma publicação mais recente Kielian et al (2001) investigaram o papel da alfa-toxina na formação de abscesso cerebral em um modelo camundongo. Experimentalmente os autores implantaram cepas tipo selvagem de S. aureus e os mutantes derivados das mesmas, para dentro do tecido do lobo cerebral frontal e avaliaram a capacidade para induzir a abscessos cerebrais de cada cepa. Os autores utilizaram cepas mutantes em loci relevantes para a expressão de fatores de virulência conhecidos, por exemplo, mutantes, no locus sarA e locus agr, ambos envolvidos na regulação global de importantes fatores de virulência. Tal como alfa-toxina está sob o controle do sistema regulatório sarA/agr, os autores também incluíram uma cepa mutante de alfa-toxina em seus experimentos. Os dados experimentais demonstraram que a replicação de cepas bacterianas mutantes para alfa-toxina ou locus sarA/agr tinha virulência reduzida em consequência da injeção de células bacterianas dentro do crânio comparado com a sua cepa controle isogênica RN6390, resultando em números bacterianos menores e pequenos focos inflamatórios nos cérebros de animais a serem detectados, tal como em comparação com os grandes abscessos bem-formados nos camundongos que receberam a cepa isogênica. No entanto, as cepas mutantes não eram inteiramente avirulentas no modelo experimental de abscesso cerebral e elas não puderam ser excluídas para fora de tal modo que o fator(s) adicional além da alfa-toxina desempenha papel(s) crítico na formação do abscesso cerebral.

[0018] O papel da alfa-toxina na formação de abscesso foi avaliado em outro cenário experimental, conforme descrito por Schwan et al (2003) em uma análise de formação de abscesso local, sistêmica formando modelos de infecção por S. aureus. Os autores observaram que cepas de S. aureus não hemolíticas tornaram-se mais abundantes com o passar do tempo em modelos de abscesso murino e de feridas, mas não dentro de tecidos de órgãos associados com infecções sistêmicas. Por exemplo, em uma infecção mista, usando todas as variantes de cepas de S. aureus RN6390 (hiperhemolítica, hemolítica, e não-hemolítica) no modelo de abscesso, o grupo hiperhemolítico diminuiu marcadamente o 7° dia após a infecção, considerando que a população não-hemolítica aumentou significativamente. Sequenciamento de vários dos mutantes rotulados indicaram mutações no gene agrC ou dentro da região intergênica agrA-agrC, o que resultou na restrição tanto da atividade da alfa-toxina como da delta-toxina. Analisando-se cepas mutantes específicas para atividade agr (agr-) e alfa- toxina (hla-) nos modelos de abscesso, ferida e sistêmico de infecção, a cepa mutante agr- e a cepa mutante de hla- não mostraram diferença nas contagens bacterianas em abscessos murinos no 4° dia, tal como em comparação com as cepas parentais do tipo selvagem (RN6390). O mesmo acontece para infecções locais (modelo de ferida), enquanto que uma tiragem considerável da cepa mutante hla e da cepa mutante agr ocorreu no modelo sistêmico de infecção. O resultado indicou claramente a importância da alfa-toxina em infecções sistêmicas, mas não em infecções locais ou formação de abscesso. Na verdade infecções mistas com as cepas mutantes de hla- e cepas tipo selvagem no modelo de abscesso mostraram uma ligeira vantagem dada para a população mutante hla superior a cepa tipo selvagem. Os autores mesmo concluíram que as mutações agr causam reduções na expressão de alfa- e delta-toxinas, que por sua vez contribuíram para uma vantagem de crescimento deste grupo mutante agr na extensão de uma população mista de células de S. aureus residentes em abscessos e feridas. Os resultados aparentemente contradizem os resultados descritos por Kielian et al, onde a falta da produção de alfa-toxina reduziu a virulência bacteriana. Por conseguinte, o papel da alfa-toxina na formação de abscesso não é claro.

[0019] Em geral não há evidências que apontem para um único fator de virulência como o principal na formação de abscesso. Como tal pesquisa focou na presença de fatores adicionais que não foram controlados inteiramente por S. aureus, tais como fatores ambientais, ou dados motivos estruturais, como o fator chave comum na formação de abscesso. Por exemplo, os dados mais recentes em relação aos fatores de virulência afetam a formação de pontos de abcessos para os efeitos de íons metálicos bivalentes não quelados, tais como Mn ++ e Ca ++ na formação de abscesso e crescimento bacteriano nos limites dos abscessos. Quelação de íons metálicos em animais inibiu a formação de abcessos do fígado e inibiu o crescimento de S. aureus em abscessos (Corbin 2008). Por outro lado Tzianabos et al. (2001) forneceram hipóteses que um organismo, tal como S. aureus, requer fatores de virulência presentes na célula bacteriana, a fim de estabelecer estruturas patológicas tais como abscessos no tecido. Eles demonstraram que as cepas altamente associadas com casos clínicos de abscessos podem possuir uma ou mais paredes celulares associadas a polissacarídeos com um motivo de carga zwitteriônica (um composto químico que transporta uma carga líquida total de 0, portanto, eletricamente neutra, mas traz cargas positivas formais e negativas nos diferentes átomos). Na ausência do motivo de carga zwitteriônica nenhuma formação de abscesso pôde ser observada. Os autores concluíram que estes polímeros polissacarídeos podem modular a indução de abscesso por este organismo. Adicionalmente eles apresentaram dados confirmantes para não apenas polissacarídeos do núcleo CP5 e CP8 mas também para o ácido lipoteicóico (LTA), um fator de virulência adicional bem caracterizado dentro da parede celular. Eles identificaram um motivo de carga zwitteriônica dentro do LTA bem como e, por conseguinte, generalizaram sua hipótese para a formação de abscesso na presença de um motivo de carga zwitteriônica em qualquer fator de virulência essencial para a formação de abscesso.

[0020] Com base nos resultados indicando que vários fatores contribuem para formação de abscesso mediada por S. aureus, uma pessoa competente na arte não esperaria que a neutralização de um único fator iria prevenir a formação de abscesso.

[0021] Assim, um objeto da invenção é o fornecimento de meios e métodos para profilaxia e terapia clínica do complexo de infecção por S. aureus, tais como formação de abscesso.

[0022] Por conseguinte, um problema técnico subjacente à presente invenção é o de proporcionar um anticorpo monoclonal específico para alfa-toxina derivada de S. aureus, em que o anticorpo tem capacidade protetora in vivo, contra o complexo clínico de infecção por S. aureus, tais como formação de abscesso.

[0023] O problema técnico é resolvido pelos anticorpos monoclonais tal como definido na seguinte redação.

[0024] A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal denominado 243-4 específico para a alfa-toxina de S. aureus, em que a região variável da cadeia leve do anticorpo compreende pelo menos um da SEQ ID NO: 1 na região CDR1, SEQ ID NO: 2 na região CDR2 e SEQ ID NO: 3 na região CDR3, e em que a região variável da cadeia pesada do anticorpo compreende pelo menos um da SEQ ID NO: 4 na região CDR1, SEQ ID NO: 5 na região CDR2 e SEQ ID NO: 6 na região CDR3, ou um fragmento ou muteína do mesmo capaz de se ligar à alfa-toxina de S. aureus, em que a muteína do anticorpo monoclonal carrega, pelo menos, uma substituição conservadora em qualquer uma das regiões CDR na cadeia pesada ou leve.

[0025] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, um anticorpo monoclonal humano, específico para alfa-toxina de S. aureus é fornecido onde a região variável da cadeia leve do anticorpo compreende SEQ ID NO: 1 na região CDR1, SEQ ID NO: 2 na região CDR2 e SEQ ID NO: 3 na região CDR3, e onde a região variável da cadeia pesada do anticorpo compreende SEQ ID NO: 4 na região CDR1, SEQ ID NO: 5 na região CDR2 e SEQ ID NO: 6 na região CDR3; ou um fragmento ou muteína do mesmo capaz de se ligar à alfa-toxina de S. aureus, em que a muteína do anticorpo monoclonal carrega, pelo menos, uma substituição conservadora em qualquer uma das regiões CDR na cadeia pesada ou leve.

[0026] Surpreendentemente, foi encontrado que os anticorpos monoclonais de acordo com a invenção exibem capacidade protetora alta contra a formação de abscesso. Prevenção da formação de abscesso tem sido demonstrada em um modelo de rim de camundongo por administração de um anticorpo humano monoclonal com alfa-toxina específica de acordo com a invenção. Com base na natureza da toxina, a saber, sendo uma proteína secretada ao invés de uma parede celular componente associada (polissacarídeo), qualquer efeito bactericida direto, por exemplo, morte da célula bacteriana, ou sistema imunológico indireto relacionado com função efetora, tais como opsonofagocitose mediada pelo complemento, pode ser descartado e não representa a falta de formação de abscesso.

[0027] O termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizado engloba parcialmente ou totalmente qualquer anticorpo monoclonal humano independente da fonte a partir da qual o anticorpo monoclonal é obtido. Um anticorpo monoclonal totalmente humano é o preferido. A produção do anticorpo monoclonal por um hibridoma é o preferido. O hibridoma pode ser um hibridoma de mamífero, tais como murino, bovino ou humano. Um hibridoma preferido é o de origem humana. O anticorpo monoclonal pode também ser obtido por engenharia genética e em particular o enxerto de CDR dos segmentos CDR, tal como definido nas reivindicações em direção aos anticorpos monoclonais disponíveis pela substituição das regiões CDR do anticorpo de base com os segmentos específicos de CDR, tal como definidos nas reivindicações.

[0028] O termo "região CDR" significa a região determinante de complementaridade de um anticorpo, ou seja, a região de determinação da especificidade de um anticorpo para um antígeno particular. Três regiões CDR (CDR1 a CDR3) tanto de cadeia leve como pesada são responsáveis pela ligação do antígeno.

[0029] As posições das regiões CDR dentro da cadeia pesada são como segue: aminoácidos da região CDR1 26 a 33 dentro do exon VH, aminoácidos da região CDR2 51a 58 dentro do exon VH, aminoácidos da região CDR3 97 a 110 dentro do exon VH.

[0030] As posições das regiões CDR são independentes a partir da classe do anticorpo, ou seja, IgM, IgA de IgG.

[0031] As posições da região CDR dentro da cadeia leve tipo lambda são como segue: aminoácidos da região CDR1 26 a 33 dentro do exon VÀ, aminoácidos da região CDR2 51 a 53 dentro do exon VÀ, aminoácidos da região CDR3 90 a 101 dentro do exon VÀ.

[0032] Alinhamentos de aminoácidos do exon VH, VX, e VÀ podem ser obtidos a partir da V Base de Dados do banco de dados (http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/).

[0033] O termo "fragmento" significa qualquer fragmento do anticorpo capaz de se ligar à alfa-toxina de S. aureus. O fragmento tem um comprimento de, pelo menos, 10, de preferência 20, mais preferivelmente 50 aminoácidos. É ainda preferido que o fragmento compreenda a região de ligação do anticorpo. É preferido que o fragmento seja um Fab, F (ab')2, cadeia única ou anticorpo de domínio. O mais preferido é um fragmento Fab ou F(ab')2 ou uma mistura dos mesmos. Fragmentos de anticorpos podem ser glicosilados, por exemplo, contendo porções de carboidrato nas regiões variáveis de anticorpos.

[0034] Por conseguinte, a presente invenção proporciona ainda um anticorpo monoclonal tal como aqui definido, em que o anticorpo é um Fab, F(ab')2, de cadeia única ou fragmento de anticorpo de domínio.

[0035] O termo "muteína" engloba quaisquer muteínas do anticorpo monoclonal diferindo pela adição, eliminação, e / ou substituição de pelo menos um aminoácido. De preferência, a muteína do anticorpo monoclonal carrega, pelo menos, uma substituição conservadora em qualquer um dos CDR na cadeia pesada e / ou cadeia leve, tal como indicado nas reivindicações. Mais preferivelmente, a muteína não tem mais do que 5, não mais do que 4, de preferência não mais do que 3, particularmente não mais do que 2 substituições conservativas. A capacidade do fragmento ou muteína do anticorpo ser capaz de se ligar para a alfa-toxina de S. aureus é determinada direto por ELISA, como descrito na seção Exemplo: a alfa-toxina purificada é imobilizada na fase sólida das placas de ELISA. Fragmentos de anticorpo ou muteínas dos anticorpos são incubados com a alfa- toxina imobilizada, e anticorpos ligados ou muteínas dos mesmos são visualizados através de um anticorpo secundário conjugado com uma enzima adequada.

[0036] O termo "substituição conservadora" significa uma substituição de um aminoácido pertencente a um grupo físico- químico especial, com um aminoácido, pertencente ao mesmo grupo físico-químico. Os grupos físico-químicos são definidos como segue:

[0037] O grupo físico-químico de aminoácidos não-polares compreende: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina, e triptofano. O grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais polares não carregadas compreende asparagina, glutamina, tirosina, cisteína, e cistina. O grupo físico-químico dos aminoácidos possuindo uma cadeia lateral polar carregada positivamente compreende lisina, arginina e histidina. O grupo físico-químico dos aminoácidos tendo uma cadeia lateral polar carregada negativamente compreende ácido aspártico e ácido glutâmico, com seus ânions carboxilatos também referidos como aspartato e glutamato.

[0038] De acordo com uma concretização adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal específico para a alfa-toxina de S. aureus, em que a região variável da cadeia leve do anticorpo tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região variável da cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, ou um fragmento capaz de ligar-se à alfa-toxina de S. aureus, ou uma variante do dito anticorpo capaz de se ligar à alfa-toxina de S. aureus, em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo é de pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 7 e a sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada do anticorpo é de pelo menos 85 % idêntica à SEQ ID NO: 8.

[0039] O termo "variante", tal como aqui utilizado refere-se a um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácido exibe um certo grau de identidade com a sequência de aminoácido conforme estabelecida na listagem de sequência.

[0040] O termo "% de identidade" conhecido para a pessoa técnica na arte designa o grau de parentesco entre duas ou mais moléculas polipeptídicas, o que é determinado pela combinação entre as sequências. A porcentagem de "identidade" é encontrada a partir do percentual de regiões idênticas em duas ou mais sequências, tendo em conta as lacunas ou outros fatores da sequência.

[0041] A porcentagem de identidade de polipeptídeos mutuamente relacionados pode ser determinada por meio de procedimentos conhecidos. Como uma regra, programas de computador especiais com algoritmos que levam em conta as exigências especiais são usados. Procedimentos preferidos para a determinação de identidade em primeiro lugar geram a maior combinação entre as sequências estudadas. Programas de computador para a determinação da identidade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados a, pacote de programa GCG, incluindo GAP (Devereux J et al, (1984); Genetics Computer Group da Universidade de Wisconsin, Madison (WI); BLASTP , BLASTN e FASTA (Altschul S et al., (1990)). O programa BLAST X pode ser obtido no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) e em outras fontes (BLAST Handbook, Altschul S. et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul S et al.,1990) O bem- conhecido algoritmo de Smith Waterman também pode ser usado para a determinação da porcentagem de identidade.

[0042] Parâmetros preferidos para a comparação de sequências incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman SB e Wunsch, CD (1970) Matriz de comparação: BLOSUM62 de S. Henikoff e Henikoff JG (1992) Pontuação de lacuna: 12 Pontuação de comprimento de lacuna: 2

[0043] O programa GAP também é adequado para uso com os parâmetros acima. Os parâmetros acima são os parâmetros padrão (parâmetros usados como padrão) para comparações de sequências de aminoácidos, nas quais lacunas situadas nas extremidades não diminuem o valor de identidade. Com as sequências muito pequenas em comparação com a sequência de referência, ele pode ser ainda mais necessário para aumentar o valor de expectativa de até 100.000 e em alguns casos para reduzir o comprimento de palavra (tamanho da palavra) para baixo de 2.

[0044] Algoritmos de outros modelos, pontuações de abertura de lacuna, pontuações de extensão de lacuna e matrizes de comparação, incluindo as citadas no Manual do Programa, do Pacote Wisconsin Package, versão 9, de setembro de 1997, podem ser usados. A escolha vai depender da comparação a ser realizada, e ainda mais se a comparação é executada entre os pares de sequências, onde GAP ou Best Fit são preferidos, ou entre uma sequência e um banco de dados de sequência de grande porte, onde FASTA ou BLAST são os preferidos. Uma combinação de 85% determinada com os algoritmos anteriormente referidos é descrita como identidade de 85%. O mesmo se aplica a graus mais elevados de identidade.

[0045] Em concretizações preferidas, as variantes de acordo com a invenção têm uma identidade de 85% ou mais, de preferência 90% ou mais, e mais preferivelmente 95% ou mais.

[0046] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o anticorpo monoclonal é um anticorpo humano. O termo "humano", tal como aqui utilizado, significa que o anticorpo monoclonal humano é substancialmente livre de sequências de aminoácidos de espécies estrangeiras, de preferência o anticorpo monoclonal humano consiste inteiramente da sequência de aminoácido humano.

[0047] A cadeia leve do anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção pode ser do tipo kappa ou lambda.

[0048] Em uma forma de realização preferida da invenção, a cadeia leve é do tipo lambda. A cadeia leve pode ser tanto a cadeia que ocorre naturalmente incluindo uma naturalmente rearranjada, um tipo geneticamente modificado ou sintético da cadeia leve.

[0049] A cadeia pesada do anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser selecionada a partir dos isotipos IgM, IgA, ou IgG, de preferência IgG.

[0050] De acordo com uma forma de realização preferida adicional da invenção, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal é do tipo IgG.

[0051] O termo "capaz de se ligar" tal como aqui utilizado refere-se a ligação que ocorre entre um anticorpo e seu antígeno reconhecido para o qual o anticorpo foi produzido. Esse tipo de ligação é a ligação específica em contraste com a não-específica, que ocorre na ausência do antígeno.

[0052] Anticorpos capazes de se ligar à alfa-toxina são preparados usando uma tecnologia de hibridoma, em que a célula B é uma das células B de mamíferos, tais como murino, bovino ou humano. Preferivelmente, a célula B é uma célula B humana. Alternativamente, o anticorpo monoclonal capaz de se ligar à alfa-toxina pode ser obtido pelo enxerto de CDR das regiões CDR, como indicado nas reivindicações sobre anticorpos monoclonais disponíveis produzindo, assim, um anticorpo monoclonal específico para alfa-toxina de S. aureus em conformidade com a presente invenção.

[0053] Em uma forma de realização adicional da invenção, um anticorpo monoclonal capaz de se ligar à alfa-toxina de S. aureus é fornecido, que é obtido a partir de uma célula B de mamífero, tal como murino, bovino ou humano, de preferência uma célula B humana ou um hibridoma obtido por fusão da referida célula B humana com um mieloma ou célula de heteromieloma.

[0054] Em uma concretização adicional a invenção proporciona um hibridoma capaz de produzir o anticorpo monoclonal capaz de se ligar à alfa-toxina de S. aureus, tal como aqui definido.

[0055] O termo "alfa-toxina" tal como aqui utilizado refere-se a uma proteína bacteriana produzida por S. aureus. A alfa-toxina sofre oligomerização em um pré-poro heptamérico após a ligação com a superfície celular da célula hospedeira. A formação do poro é uma das principais causas de apoptose e lise celular. A capacidade do anticorpo monoclonal de se ligar tanto às formas monoméricas quanto oligoméricas de alfa-toxina derivada de S. aureus é, portanto, de fundamental importância para uma proteção potente.

[0056] De acordo com uma forma de realização preferida adicional da invenção, o anticorpo monoclonal da invenção é capaz de se ligar especificamente a formas monoméricas e oligoméricas da alfa-toxina de S. aureus. De acordo com uma forma de realização adicional da invenção o anticorpo monoclonal da invenção ou fragmento ou muteína do mesmo é capaz de se ligar especificamente às formas tanto monoméricas quanto oligoméricas da alfa-toxina de S. aureus ou ambas.

[0057] O termo "forma oligomérica" tal como aqui utilizado inclui uma outra forma além da forma monomérica de alfa-toxina, tais como dimérica, trimérica, tetramérica, pentamérica, hexamérica, heptamérica, etc, ou formas poliméricas, tais como a forma de pré-poro heptamérica de alfa- toxina.

[0058] De acordo com uma forma de realização preferida adicional, o anticorpo monoclonal da invenção é uma N- terminalmente, internamente ou C-terminalmente modificada. As modificações incluem a di-, oligo-, ou polimerização ou da forma monomérica, por exemplo, por ligação cruzada usando diciclohexilcarbodiimida. Os di-, oligo-, ou polímeros assim produzidos podem ser separados uns dos outros por filtração em gel. Outras modificações incluem modificações da cadeia lateral, modificações, por exemplo, de resíduos de ε-amino-lisina, ou de modificações amino e carboxi-terminal, respectivamente. Outras modificações incluem modificações pós-traducionais, por exemplo, glicosilação e / ou desglicosilação parcial ou completa da proteína, e formação de ligação de dissulfeto. O anticorpo pode também ser conjugado a um marcador, tal como um marcador enzimático, fluorescente ou radioativo. De preferência, a modificação é selecionada a partir de, pelo menos, um da glicosilação, oligomerização, ou conjugação a uma droga ou um marcador.

[0059] Adicionalmente, a presente invenção proporciona ácidos nucleicos que codificam a cadeia pesada e a cadeia leve, respectivamente, do anticorpo monoclonal da presente invenção. O ácido nucleico pode ser um ácido nucleico que ocorre naturalmente deste derivado a partir da linhagem de gérmen ou a partir do rearranjo que ocorre em células-B, alternativamente os ácidos nucleicos podem ser sintéticos. Ácidos nucleicos sintéticos também incluem ácidos nucleicos possuindo ligações internucleosídicas modificadas incluindo fosfotioester para aumentar a resistência dos ácidos nucleicos a partir da degradação. O ácido nucleico pode ser desenvolvido geneticamente ou completamente produzido sinteticamente por síntese de nucleotídeos.

[0060] A presente invenção proporciona ainda vetores compreendendo, pelo menos, um ácido nucleico que codifica a cadeia leve do anticorpo monoclonal da presente invenção e / ou, pelo menos, um ácido nucleico que codifica a cadeia pesada do anticorpo monoclonal da presente invenção. Os ácidos nucleicos podem estar tanto presentes no mesmo vetor ou podem estar presentes sob a forma de vetores binários. O vetor compreende preferencialmente o promotor operacionalmente ligado ao ácido nucleico, a fim de facilitar a expressão do ácido nucleico que codifica a cadeia leve e / ou pesada. De preferência, o vetor também inclui uma origem para a replicação e manutenção em uma célula hospedeira. O vetor pode também compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência sinal localizada a 5' do ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou cadeia pesada. A sequência sinal pode facilitar a secreção da cadeia codificada no meio.

[0061] De preferência, o vetor é derivado a partir de adenovírus, vírus vaccinia, baculovírus, vírus SV 40, retrovírus, vírus vegetais ou bacteriófagos tais como derivados de lambda ou M13. O vetor particularmente preferido é um vetor contendo as regiões constantes de cadeias pesadas de Ig de humanos e de cadeias leves humanas, tais como o sistema integrado de vetores para a expressão eucariótica de imunoglobulinas descrito por Persic et al., 1987.

[0062] Adicionalmente, a presente invenção proporciona células hospedeiras que compõem o vetor e / ou o ácido nucleico adequado para a expressão do vetor. Na arte numerosos sistemas de expressão de procariotas e eucariotas são conhecidos em que as células hospedeiras eucarióticas, tais como células de levedura, células de insetos, células de plantas e células de mamíferos, tais como células HEK293, células PerC6, células CHO, células COS ou células HELA e suas derivados são as preferidas. Particularmente preferidas são linhagens de células de produção humana. É preferido que as células hospedeiras transfectadas secretem o anticorpo produzido no meio de cultura. Se a expressão intracelular é alcançada, em seguida, a renaturação é realizada em conformidade com os procedimentos padrão, tais como aqueles descritos, por exemplo, por Benetti et al., 1998.

[0063] Os anticorpos monoclonais humanos de acordo com a invenção são gerados a partir de linfócitos de sangue de um paciente convalescente e, assim, resultam em anticorpos naturalmente refinados e selecionados com alta afinidade para a neutralização e proteção eficaz contra infecções.

[0064] A presente invenção também fornece métodos para produzir o anticorpo monoclonal. Em uma forma de realização, o anticorpo monoclonal é produzido através da cultura do hibridoma acima descrito. O anticorpo monoclonal produzido é secretado no sobrenadante e pode ser purificado a partir dele através da aplicação de técnicas cromatográficas convencionais.

[0065] Alternativamente, o anticorpo monoclonal é produzido pela célula hospedeira compreendendo um vetor de acordo com a presente invenção e cultivando a célula hospedeira sob condições adequadas para expressão recombinante da cadeia de anticorpo codificado. De preferência, a célula hospedeira compreende pelo menos um ácido nucleico que codifica a cadeia leve e, pelo menos, um ácido nucleico que codifica a cadeia pesada e é capaz de montar o anticorpo monoclonal de tal forma que uma estrutura tri-dimensional é gerada a qual é equivalente à estrutura tri-dimensional de um anticorpo monoclonal produzido por uma célula B de mamífero, de preferência humana. Se a cadeia leve é produzida separadamente a partir da cadeia pesada, em seguida, ambas as cadeias podem ser purificadas e, subsequentemente, ser montadas para produzir um anticorpo monoclonal possuindo essencialmente a estrutura tri-dimensional de um anticorpo monoclonal como são produzidos por uma célula B de mamífero, de preferência humana.

[0066] O anticorpo monoclonal pode também ser obtido por expressão recombinante da cadeia leve e / ou cadeia pesada codificada em que o ácido nucleico é produzido através do isolamento de um ácido nucleico que codifica um anticorpo monoclonal de uma maneira conhecida e enxertando a sequência de ácido nucleico que codifica o de CDR, tal como definido nas reivindicações para o ácido nucleico isolado.

[0067] A presente invenção ainda proporciona composições farmacêuticas compreendendo, pelo menos, um anticorpo monoclonal e / ou, pelo menos, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve e / ou pesada do anticorpo monoclonal.

[0068] A composição farmacêutica pode ainda compreender drogas antibióticas tais como estreptomicina, penicilina e vancomicina, etc, de preferência acopladas ao anticorpo monoclonal da invenção.

[0069] As composições farmacêuticas compreendem o anticorpo monoclonal em uma faixa de dosagem de 0,1-100 mg / kg de peso corporal.

[0070] As composições farmacêuticas podem ser administradas em qualquer forma conhecida, tais como administração intravenosa, intra-muscular, intra-dérmica, subcutânea, intra-peritoneal, tópica, intra-nasal, ou como spray de inalação.

[0071] Em uma forma de realização preferida da invenção as composições farmacêuticas são utilizadas para a profilaxia ou tratamento de formação de abscesso em um órgão de uma paciente mamífero, tais como bovinos, porcinos, gatos, cães, cavalos, humanos. Em uma forma de realização preferida da invenção as composições farmacêuticas são aplicadas a pacientes humanos. Em uma concretização adicional da invenção, a formação de abscesso é causada por uma infecção por S. aureus. Adicionalmente, a infecção por S. aureus a ser tratada com a composição farmacêutica da invenção pode ser, por exemplo, uma infecção da mama, tal como a mastite.

[0072] Por conseguinte, a presente invenção proporciona a utilização de um anticorpo monoclonal ou ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia leve e / ou cadeia pesada como aqui definido para a preparação de uma composição farmacêutica para profilaxia ou tratamento de formação de um abscesso em um órgão em um paciente mamífero, de preferência humano.

[0073] Em uma forma de realização preferida da invenção as composições farmacêuticas, o anticorpo monoclonal ou o ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia leve ou cadeia pesada, tal como aqui definido, são aplicadas para a profilaxia ou tratamento de formação de um abscesso em um órgão, tal como rim, coração, fígado, vesícula biliar, pâncreas, intestino delgado, intestino grosso, pulmão, cérebro, pele, olhos, tecido linfático, ou baço. Em uma concretização preferencial, o abscesso a ser tratado é um abscesso abdominal. Por conseguinte, o órgão abdominal a ser tratado é fígado, vesícula biliar, baço, pâncreas, intestino delgado, rins, e intestino grosso.

[0074] O termo "formação de abscesso", tal como aqui utilizado refere-se à formação de um abscesso em um órgão, tal como rim, coração, fígado, vesícula biliar, pâncreas, intestino delgado, intestino grosso, pulmão, cérebro, pele, tecido linfático, olho, ou baço. O termo "abscesso" tal como aqui utilizado significa uma quantidade grande de pus que se acumulou em uma cavidade formada pelo tecido na base de um processo infeccioso (geralmente causado por bactérias ou parasitas). As toxinas liberadas pelas bactérias que se multiplicam destroem células e desencadeiam uma resposta inflamatória que atrai um grande número de células brancas do sangue para a área e aumenta o fluxo sanguíneo regional. Esses leucócitos quebram os tecidos mortos e absorvem as bactérias por meio de fagocitose. Pus grosso verde ou amarelado é formado a partir dos tecidos quebrados, as bactérias mortas e leucócitos, e do fluido extracelular que acumulou. Um abscesso é caracterizado por encapsulamento por uma parede do abscesso, que é formado pelas células saudáveis adjacentes em uma tentativa de manter o pus a partir das estruturas vizinhas infectadas. Trata-se de uma reação defensiva do tecido para impedir a propagação de materiais infecciosos para outras partes do corpo. Os abscessos podem ocorrer em qualquer tipo de tecido sólido, mas mais frequentemente na superfície da pele (onde podem ser pústulas superficiais (furúnculos) ou abscessos profundos da pele), nos pulmões, cérebro, rins e amídalas. As principais complicações são espalhadas do material de abscesso, como órgão de contaminação para os tecidos adjacentes ou remotos e morte tecidual regional extensa (gangrena). A formação de abscesso é detectada através da avaliação da carga bacteriana dentro do órgão.

[0075] O termo "abscesso abdominal" como aqui utilizado refere-se a um abscesso em um órgão da cavidade abdominal. A cavidade abdominal é a cavidade do corpo que detém as grandes quantidades de vísceras e que está localizada abaixo (ou inferior a) da cavidade torácica, e acima da cavidade pélvica. Trata-se de uma parte da cavidade abdominopélvica. Os órgãos da cavidade abdominal incluem o estômago, fígado, vesícula biliar, baço, pâncreas, intestino delgado, rins, e intestino grosso.

[0076] "Órgão contaminante", conforme usado aqui significa a disseminação de bactérias vivas do sítio local de infecção para tecidos e órgãos distantes. Contaminação de órgãos é caracterizada pela presença de células bacterianas infectantes vivas no tecido saudável sem formação de colônias macroscópicas encapsuladas de células bacterianas.

[0077] "Carga bacteriana", tal como aqui utilizada, é definida como a quantidade de células bacterianas vivas dentro de um tecido anatômico bem definido expresso como a quantidade de células bacterianas que crescem fora das colônias em meios de crescimento sólidos, tais como placas de ágar. Para a finalidade de avaliar a carga bacteriana dentro de um órgão, o órgão é cirurgicamente extraído a partir do tecido circunvizinho e o tecido do órgão é gradeado para cima sob condições estéreis em solução salina estéril para destruir a organização bem estruturada do tecido e para separar as células bacterianas a partir dos tecidos de mamíferos. Uma quantidade definida de suspensão de células (ou diluições em série das mesmas, em solução salina estéril) é espalhada em meios sólidos de crescimento bacteriano. Carga bacteriana é expressa como "unidades formadoras de colônia" por rim (por exemplo, cfu/rim).

[0078] A presente invenção também fornece um kit de teste para o diagnóstico de infecções por S. aureus que compreendem pelo menos um anticorpo monoclonal da presente invenção e, opcionalmente, ingredientes ainda mais adequados para a realização de um teste de diagnóstico.

[0079] Ingredientes adequados para a realização de um teste de diagnóstico são, por exemplo, uma solução tampão com uma osmolaridade dentro de um intervalo de 280-320 mOsm / Litro e um valor de pH dentro de uma faixa de pH 6-8; uma solução tampão contendo agentes quelantes; uma solução tampão contendo cátions monovalentes ou bivalentes com a concentração de cátion total da composição tampão variando de cerca de 0,02 M a cerca de 2,0 M; e / ou uma solução tampão contendo soro derivado animal ou humano a uma concentração entre 0,01% e 20%.

[0080] O kit de teste é adequado para o diagnóstico específico confiável de uma infecção por S. aureus. Um ensaio teste pode ser baseado em um teste de ELISA convencional no estado líquido ou na forma de ligação de membrana. A detecção pode ser direta ou indireta tal como é conhecida na arte em que o anticorpo é, opcionalmente, conjugado a um marcador, enzimático, fluorescente ou radioativo.

[0081] Por conseguinte, a presente invenção também proporciona a utilização de, pelo menos, um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção para a detecção de ligação com a alfa- toxina em uma amostra. Ligação do anticorpo de acordo com a invenção para alfa-toxina pode ser detectada, por exemplo, com anticorpo secundário IgG anti humano HRP-conjugado de cabra.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIGURA 1

[0082] A Figura 1 apresenta o DNA e a sequência de aminoácido do anticorpo monoclonal humano 243-4 da região variável da cadeia pesada. A região CDR1 de 243-4 está nas posições 26 a 33, a região CDR2 de 243-4 está nas posições 51 a 58, e a região CDR3 de 243-4 está nas posições 97 a 110.

FIGURA 2

[0083] A Figura 2 apresenta o DNA e a sequência de aminoácido do anticorpo monoclonal humano 243-4 da região variável de cadeia leve. A região CDR1 de 243-4 está nas posições 26 a 33, a região CDR2 de 243-4 está nas posições 51 a 53, e a região CDR3 de 243-4 está nas posições 90 a 101.

FIGURA 3

[0084] A Figura 3 apresenta a especificidade do antígeno do anticorpo monoclonal humano 243-4. A especificidade do antígeno do anticorpo 243-4 foi avaliada pela ligação a um painel de toxinas bacterianas em um ensaio de ELISA. O ELISA foi realizado em placas de microtitulação revestidas com toxinas purificadas. Após a incubação durante a noite à temperatura ambiente as placas de microtitulação foram bloqueadas com BSA e ligações de mAb 243-4 à toxinas imobilizadas foram detectadas com anticorpo secundário IgG anti humano HRP conjugado de cabra. Binding of human monoclonal antibody 243-4 to S. Ligação de anticorpo monoclonal humano 243-4 a alfa-toxina de S. aureus é claramente favorecida em detrimento de se ligar a todas as outras toxinas testadas.

FIGURA 4

[0085] A Figura 4 apresenta a ligação do anticorpo monoclonal humano 243-4 à alfa-toxina da cepa epidêmica de S. aureus em experimentos de Western blot. Produção de alfa-toxina de 12 cepas epidêmicas de S. aureus foi monitorada a partir de culturas bacterianas em fase estacionária de crescimento. Depois do cultivo normalizado, sobrenadantes bacterianos e purificado de alfa-toxina foram carregados em um gel de SDS-PAGE e aplicados à eletrotransferência. Após o bloqueio a membrana de nitrocelulose foi incubada com anticorpo monoclonal humano 2434 purificado. Produção e reconhecimento tanto de alfa-toxina monomérica e / ou heptamérica a partir de cada cepa epidêmica avaliada foi comprovada por ligação do anticorpo monoclonal humano 243-4.

[0086] Na Figura 4, M significa tamanho de marcador, números 1-12 são cepas epidêmicas de S. aureus e um Tox é uma alfa-toxina purificada.

FIGURA 5

[0087] A Figura 5 mostra a determinação de afinidade de anticorpo monoclonal humano 243-4 por BIAcore. A cinética de ligação de anticorpo monoclonal humano 243-4 foi analisada utilizando um instrumento BIAcore 2000. Diferentes concentrações de alfa-toxina foram aplicadas a uma célula de fluxo imobilizada com mAb 243-4. As fases de associação e de dissociação foram registradas para calcular a constante de dissociação do anticorpo. Os dados cinéticos foram avaliados por encaixe global usando o software BIAevaluation 4.1.

FIGURA 6

[0088] A Figura 6 mostra a neutralização da alfa-toxina pelo anticorpo monoclonal humano 243-4 em um modelo de cultura de tecido de lesão celular alveolar humana. Células epiteliais alveolares humanas A549 foram co-cultivadas por 16 h, com alfa- toxina na presença de qualquer um dos anticorpos de controle isótipo ou anticorpo monoclonal 243-4. Após esse período as células foram analisadas pelo ensaio de lactato desidrogenase (LDH), que fornece um estágio de leitura de injúria celular causada por alfa-toxina e revela o grau de proteção que pode ser alcançado com os anticorpos aplicados. Para interpretação dos resultados do grau de lise celular, o qual foi resultante da pré-incubação com a concentração mais alta de alfa-toxina, foi definido para 100%. Células tratadas somente com toxina apresentaram uma titulação de lise em dependência da concentração da alfa-toxina aplicada. A mesma titulação foi observada quando a alfa-toxina foi pré-incubada com o anticorpo controle isotipo, indicando que não há efeito protetor do controle do isotipo. Em contraste, células epiteliais alveolares humanas foram protegidas a partir da lise dependente da alfa- toxina por incubação com anticorpo monoclonal humano 243-4. O experimento foi realizado em três ocasiões independentes, cada um dos quais confirmaram a proteção do anticorpo 243-4.

FIGURA 7

[0089] A Figura 7 mostra o efeito protetor do anticorpo monoclonal humano 243-4 em modelo de cateter venoso central de camundongo relacionado à infecção de múltiplos órgãos. Vinte e quatro horas após a colocação do cateter, os camundongos receberam 1x10e7 CFU de cepa de S. aureus US300 e, ainda, 7,5 mg / kg de mAb 243-4 ou PBS através do cateter. Dois dias depois, os camundongos do grupo de tratamento receberam uma segunda dose do anticorpo (5 mg / kg), enquanto que camundongos do grupo controle receberam apenas PBS. Cinco dias após a cirurgia os camundongos foram submetidos à eutanásia para monitorar a carga bacteriana do rim e formação de abscesso do rim. Camundongos imunizados com anticorpo monoclonal 243-4 apresentaram uma redução forte da carga bacteriana e nenhuma formação de abscesso do rim foi observada, enquanto que todos os camundongos controle possuíram uma alta carga bacteriana do rim e uma forte formação de abscesso.

[0090] Os seguintes exemplos ilustram a invenção, mas não estão destinados a limitar o escopo de aplicação da presente invenção. Formas de realização adicionais serão aparentes para a pessoa técnica na arte quando se estuda a especificação e levando em conta o conhecimento geral comum.

EXEMPLOS Exemplo 1 DNA e sequências de aminoácidos de 243-4

[0091] A especificidade do anticorpo é determinada pelas sequências de DNA- e de aminoácido, respectivamente. Sequências de DNA dos fragmentos variáveis das cadeias pesadas e leves foram determinadas.

[0092] Para o isolamento do RNA 5x10e5 células de hibridoma foram sedimentadas por centrifugação e homogeneizadas usando colunas de Qiashredder (# 79.654, Qiagen). O mRNA foi então isolado a partir de peletes de células homogeneizadas de hibridoma usando o Kit RNeasy (# 74.124, Qiagen) de acordo com o manual de instruções do fornecedor. Construído no mRNA isolado, cDNA foi sintetizado por transcrição reversa usando transcriptase reversa do Superscript II (# 18.064-022, Invitrogen). Genes do anticorpo 243-4 foram amplificados a partir de cDNA sintetizado utilizando o Kit Advantage 2 PCR (# 639.206, Clontech) de acordo com o manual de instruções do fornecedor. Amplificação específica de genes de anticorpos foi garantida pela aplicação de combinações de iniciadores desenhados para a amplificação de genes da região variável de IgG rearranjado de humanos (Welschof et al., 1995). Para a amplificação de ambos os domínios de cadeia pesada variável (VH) e os domínios de cadeia leve variável (VL) um conjunto de iniciadores para frente específicos de cadeia foi utilizado em combinação com um iniciador para trás que, especificamente, anela nos domínios constantes de uma ou outra cadeia pesado ou cadeia leve (amplificação de VH CH IgG em combinação com VH1, VH2, e VH3; amplificação de VL CL À em combinação com VL À 1, VL À 2/5, VL À 3, VL À 4a, VL À 4b, e VL À 6; ver Tabela 1). Amplificados de PCR foram, em seguida, clonados no plasmídeo PCR4-TOPO do Kit de Clonagem para Sequenciamento TOPO TA (# K457540, Invitrogen) e o DNA de plasmídeo purificado foi finalmente enviado para sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça), utilizando os iniciadores plasmídicos específicos do Kit de Clonagem TOPO (T3 e T7, ver Tabela 1). As sequências de DNA obtidas foram processadas e alinhadas usando o pacote de software de gestão de clones (# 875-501-1787, Scientific&Educational Software). Como resultado dos alinhamentos realizados uma sequência de consenso foi definida e, posteriormente, analisada utilizando o banco de dados Base V de todas as sequências de região variável germinativas humanas (http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/). Com base nos resultados de sequenciamento iniciais adicionais sequências de iniciadores internos específicos de cadeia (tanto VL-atox como VH-Atox, consulte a Tabela 1) foram concebidas e aplicadas a fim de confirmar a sequência de anticorpo identificada nas regiões de anelamento das combinações de iniciadores que foram usados anteriormente. Os genes de anticorpos, assim gerados, foram aplicados para sequenciamento, como descrito acima, como mostrado nas Figuras 1 e 2. Tabela 1 Sequências de iniciadores utilizados para amplificação e sequenciamento de domínios variáveis de anticorpo 243-4

Exemplo 2: Especificidade de Antígeno de anticorpo monoclonal humano 243-4 (ELISA)

[0093] Especificidade de Antígeno de anticorpo 243-4 foi avaliada por ligação com um painel de toxinas bacterianas (alfa- toxina: # 120, Lista de Laboratórios Biológicos; todas as outras toxinas: em produção em casa, Kenta Biotech AG) em um ensaio de ELISA. ELISA foi realizado em placas de microtitulação (# 439.454, Nunc Maxisorp) revestidas com toxinas purificadas a uma concentração de 1 m g / ml cada. Após a incubação durante a noite à temperatura ambiente as placas de microtitulação foram bloqueadas durante 2 h, com 0,5% de BSA e ligações de mAb 243-4 (1 μg/ml) para toxinas imobilizadas foram detectadas com anticorpo secundário IgG anti-humana de cabra conjugado com HRP a 1:2000 de diluição (# 62-8420, Zymed Laboratories,Invitrogen). Reações foram paradas com HCl.

[0094] Densidade ótica foi lida em um leitor de ELISA a 490 nm, utilizando software Softmax Pro ®, como apresentado na Figura 3.

Exemplo 3: Ligação a alfa-toxina de cepas epidêmicas de S. aureus em experimentos de Western Blot

[0095] Produção de alfa-toxina a partir de 12 cepas epidêmicas de S. aureus foi monitorada após 16 h de crescimento em meio BHI (# 255.003, Becton Dickinson), a 37 ° C. As cepas foram obtidas a partir de S. aureus do centro de referência alemão (Instituto Robert Koch, Wernigerode) e representam as cepas epidêmicas predominantes que atualmente causam infecções de S. aureus. Algumas destas cepas produzem menos alfa-toxina em comparação com outras que resultem em força de sinal diferentes.

[0096] Os genótipos diferentes das linhagens avaliadas são retratados na Tabela 2. Depois do cultivo bactérias foram sedimentadas por centrifugação e sobrenadantes de cultura foram normalizados para OD600 = 0,6 das culturas bacterianas iniciais. 25 ml de cada sobrenadante foi carregado em um gel de SDS-PAGE de 4-20% (# EC60252, Invitrogen), seguido por eletrotransferência durante 1 h. Uma mg de alfa-toxina purificada (# 120, Lista de Laboratórios Biológicos), foi carregada e plotada em paralelo como referência. Após bloqueio com leite em pó a 5% por 1 h, a membrana de nitrocelulose (# LC2000, Invitrogen) foi incubada com 50 m g / ml de anticorpo monoclonal humano 243-4 purificado. Ligação de anticorpo 243-4 para alfa-toxina foi finalmente detectada com anticorpo secundário IgG anti humana de cabra conjugado com HRP, a 1:2000 de diluição (# 62-8420, Zymed Laboratories, Invitrogen, como apresentado na Figura 4). TABELA 2 Painel de cepas de S. aureus resistentes à Meticilina adquiridas na comunidade e no hospital (MRSA) de linhagens clonais representativas

Exemplo 4: Determinação de Afinidade (por BIAcore)

[0097] Ressonância de Plasma de superfície foi medida utilizando um instrumento BIAcore 2000 (BIAcore). Todos os experimentos foram realizados em 20 mM de tampão Mops, pH 7,0, 150 mM de NaCl, e 0,1 mg / ml de BSA. Primeiro, IgG anti humana de cabra (# 81-7100, Zymed Laboratories, Invitrogen) foi imobilizada em um chip CM5 (BIAcore) até aproximadamente 13.200 RU por aminoacoplamento tal como descrito no livro BIAapplications Handbook. Adicionalmente para o revestimento covalente inicial o anticorpo 243-4 foi ligado ao chip do sensor através de interação com o anticorpo IgG anti humana pre- imobilizado, finalmente cedendo um nível de imobilização adicional de aproximadamente 240 RU. Para caracterização cinética dos pulsos de interação antígeno-anticorpo concentrações crescentes de alfa-toxina (3,9 nM, 7,8 nM, 15.62 nM, 31.25 nM, 62,5 nM, 125 nM, 250 nM e 500 nM; # 120, Lista de Laboratórios Biológicos) foram injetadas a uma taxa de fluxo de 50 μL / min. Depois de cada ciclo de medição (5 min de associação seguidos por 30 min de dissociação) o complexo antígeno- anticorpo foi resolvido por regeneração da superfície com 10 mM de glicina-HCl a pH 1,7. Para o cálculo da constante de dissociação do anticorpo 243-4 a associação e as fases de dissociação foram gravadas e avaliadas por encaixe global usando o software BIAevaluation 4.1 (BIAcore AB, como apresentado na Figura 5). Para análise do ajuste global de apenas estas concentrações de antígeno foram levadas em conta, o que permitiu a análise seguindo o modelo de ligação de Langmuir 01:01 (£ 125 nM, Tabela 2) e tal como referido no manual de BIAcore. TABELA 3 Constantes cinéticas da interação quantitativa alfa-toxina- anticorpo 243-4

Exemplo 5: Modelo de cultura de tecido de lesão de célula alveolar humana

[0098] Células epiteliais alveolares humanas A549 foram plaqueadas em meio RPMI (# R0883, Sigma-Aldrich) a uma densidade de 3x10e5 células por poço. Em um aumento paralelo concentrações de alfa-toxina-(5 mg/ml - 50 mg/ml; # 120, Lista de Laboratórios Biológicos), foram pré-incubadas com meio somente, 20 mg/ml de isotipo de anticorpo controle (IgG1 humana lambda, purificada com proteína de mieloma; # I 5029, Sigma-Aldrich) ou 20 mg/ml de anticorpo monoclonal 243-4 purificado. Depois de 4 h de incubação a 37 ° C, soluções de alfa-toxina ou alfa-toxina-anticorpo foram adicionadas nas células e incubação foi procedida por 16 h adicionais. Após esse tempo as células foram analisadas pelo ensaio de lactato desidrogenase (LDH) (# 04744934001, a Roche), que fornece uma referência de leitura para liberação celular de LDH nos meios de cultura, como apresentado na Figura 6.

Exemplo 6: Modelo de infecção de múltiplos órgãos em camundongos -

[0099] Fêmeas de camundongos Balb/c (Charles River, Sulzfeld, Alemanha), pesando 27-31 g foram aclimatadas durante 14 dias antes da cirurgia. Os camundongos foram obtidos junto do fornecedor especificado como livre patógeno. Para a colocação do cateter os camundongos foram anestesiados intraperitonealmente com xilazina (8 mg/kg de peso corporal)/cetamina (100 mg/kg de peso corporal). Uma incisão de pele horizontal mínima foi feita na parte lateral esquerda do pescoço raspado, a fim de colocar o cateter de polietileno de lúmen único (diâmetro externo de 0,6 mm, Fohr Medical Instruments, Seeheim, Alemanha) na veia cava superior. Vinte e quatro horas após a colocação do cateter, os camundongos receberam 1x10e7 CFU de cepas de S. aureus US300 (em 100 μL) e, ou de 7,5 mg / kg de mAb 243-4 purificado ou PBS (em 50 μL) através do cateter. Dois dias mais tarde, os camundongos do grupo de tratamento receberam uma segunda dose do anticorpo (5 mg / kg), enquanto que camundongos do grupo controle receberam apenas PBS. Cinco dias após a cirurgia camundongos foram submetidos à eutanásia para monitorar a carga bacteriana do rim e a formação de abscesso de rim. Por essa razão, os rins foram assepticamente coletados a partir de animais eutanaziados e homogeneizados em solução salina. Antes da retirada de órgãos a localização do cateter na veia cava superior foi confirmada e antes da homogeneização do rim os órgãos foram examinados macroscopicamente para a formação de abscesso. Finalmente, diluições em série dos homogenatos de órgãos foram cultivadas apenas em placas MPK por, pelo menos, 48 h à 37 ° C. Unidades formadoras de colônias (CFU) foram calculadas e documentadas como UFC / rim, como apresentado na Figura 7. TABELA 4 Formação diferencial de abscesso renal nos animais do grupo controle e tratamento

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[0122] WO2007/145689 Use of Alpha-Toxin for treating and preventing Staphylococcus infections.

Claims (22)

1. Anticorpo monoclonal específico para a alfa-toxina de S. aureus, caracterizado por a região variável da cadeia leve do anticorpo compreender a SEQ ID NO: 1 na região CDR1, SEQ ID NO: 2 na região CDR2 e SEQ ID NO: 3 na região CDR3, e em que a região variável da cadeia pesada do anticorpo compreende a SEQ ID NO: 4 na região CDR1, SEQ ID NO: 5 na região CDR2 e SEQ ID NO: 6 na região CDR3, ou um fragmento do mesmo capaz de se ligar à alfa- toxina de S. aureus, em que o fragmento é um fragmento Fab ou F(ab')2 ou uma mistura dos mesmos.

2. Anticorpo monoclonal específico para a alfa-toxina de S. aureus, caracterizado por a região variável da cadeia leve do anticorpo ter a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região variável da cadeia pesada ter a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, ou um fragmento Fab ou F(ab')2 ou uma mistura dos mesmos capaz de se ligar à alfa-toxina de S. aureus.

3. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo humano.

4. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a cadeia leve ser do tipo lambda.

5. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a cadeia pesada ser do tipo IgG.

6. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o anticorpo ser capaz de se ligar especificamente às formas monoméricas e oligoméricas da alfa-toxina de S. aureus.

7. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o anticorpo ser modificado N-terminalmente, internamente ou C-terminalmente.

8. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a modificação ser selecionada a partir de, pelo menos, uma de oligomerização, glicosilação, ou conjugação de uma droga ou um marcador.

9. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser obtido a partir de uma célula B de mamífero ou um hibridoma obtido por fusão da dita célula B de mamífero com uma célula de mieloma ou heteromieloma.

10. Ácido nucleico caracterizado por codificar a cadeia leve e a cadeia pesada do anticorpo monoclonal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 9, em que a região variável da cadeia leve do anticorpo é codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 24 e a região variável da cadeia pesada é codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 25.

11. Vetor caracterizado por compreender os ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada conforme definidos na reivindicação 10.

12. Vetor, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o vetor compreender ainda um promotor operacionalmente ligado ao ácido nucleico para facilitar a expressão do mesmo.

13. Célula hospedeira isolada caracterizada por compreender o vetor conforme definido na reivindicação 12 ou os ácidos nucleicos conforme definidos na reivindicação 10, com a condição de que não é uma célula animal ou vegetal.

14. Método para produzir o anticorpo monoclonal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 9 caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira conforme definida na reivindicação 13 sob condições adequadas para a expressão do anticorpo monoclonal.

15. Composição farmacêutica caracterizada por compreender, pelo menos, um anticorpo monoclonal conforme definido nas reivindicações 1 a 8 ou os ácidos nucleicos conforme definidos na reivindicação 10 e um veículo ou ingrediente farmaceuticamente aceitável.

16. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser para uso na profilaxia ou tratamento de formação de um abscesso em um órgão, em que a formação de abscesso é causada por S. aureus.

17. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ser para uso na profilaxia ou tratamento de formação de um abscesso em um órgão, em que a formação de abscesso é causada por S. aureus.

18. Uso de um anticorpo monoclonal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por ser para a preparação de uma composição farmacêutica para profilaxia ou tratamento de formação de um abscesso em um órgão, em que a formação de abscesso é causada por S. aureus.

19. Uso de um ácido nucleico conforme definido na reivindicação 10, caracterizado por ser para a preparação de uma composição farmacêutica para profilaxia ou tratamento de formação de um abscesso em um órgão, em que a formação de abscesso é causada por S. aureus.

20. Uso de um anticorpo monoclonal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16 ou 18, caracterizado por o abscesso em um órgão ser um abscesso abdominal.

21. Uso de um anticorpo monoclonal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16 ou 18, caracterizado por o órgão ser rim, coração, fígado, pulmão, cérebro, pele ou baço.

22. Kit de teste para o diagnóstico de uma infecção de S. aureus em uma amostra caracterizado por compreender, pelo menos, um anticorpo monoclonal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou os ácidos nucleicos conforme definidos na reivindicação 10.

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