ES2651762T3 - Anticuerpo monoclonal humano contra la toxina alfa derivada de S. aureus y su uso en el tratamiento o prevención de la formación de abscesos - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal específico para la toxina alfa de S. aureus, en el que la región variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende la SEQ ID NO:1 en la región CDR1, la SEQ ID NO:2 en la región CDR2 y la SEQ ID NO:3 en la región CDR3, y en el que la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende la SEQ ID NO:4 en la región CDR1, la SEQ ID NO:5 en la región CDR2 y la SEQ ID NO:6 en la región CDR3, o un fragmento o muteína del mismo capaz de enlazar a la toxina alfa de S. aureus, en el que el fragmento es un fragmento Fab o F(ab')2 o una mezcla de los mismos; y en el que la muteína no tiene más de 5 sustituciones conservativas, en el que una sustitución conservativa es la sustitución de un aminoácido que pertenece a un grupo físicoquímico particular con un aminoácido que pertenece al mismo grupo físicoquímico, en el que el anticuerpo, fragmento o su muteína es capaz de prevenir la formación de abscesos causados por una infección por S. aureus.

Description

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Se divulga adicionalmente aquí un anticuerpo monoclonal específico para la toxina alfa de S. aureus, en el que la región variable de la cadena ligera del anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:7 y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:8, o un fragmento de la misma capaz de enlazarse a la toxina alfa de S. aureus, o una variante de dicho anticuerpo capaz de enlazarse a la toxina alfa de S. aureus, en la que la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo es al menos 85% idéntica a la SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo es al menos 85% idéntica a la SEQ ID NO:8

El término "variante", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido, en el que la secuencia de aminoácidos exhibe un cierto grado de identidad con la secuencia de aminoácidos como se establece en la lista de secuencias.

El término "% de identidad" conocido por las personas experimentadas en la técnica designa el grado de relación entre dos o más moléculas de polipéptido, que se determina mediante el acuerdo entre las secuencias. El porcentaje de "identidad" se encuentra a partir del porcentaje de regiones idénticas en dos o más secuencias, teniendo en cuenta los intervalos u otras características de secuencia.

El porcentaje de identidad de los polipéptidos mutuamente relacionados se puede determinar por medio de procedimientos conocidos. Como regla general, se utilizan programas informáticos especiales con algoritmos que tienen en cuenta los requisitos especiales. Los procedimientos preferidos para la determinación de la identidad en primer lugar generan la mayor concordancia entre las secuencias estudiadas. Los programas informáticos para la determinación de la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete del programa GCG, que incluye GAP (Devereux J et al., (1984); Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison (WI); BLASTP , BLASTN y FASTA (Altschul S et al., (1990)). El programa BLAST X puede obtenerse del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y de otras fuentes (BLAST Handbook, Altschul S et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul S et al., 1990). El conocido algoritmo de Smith Waterman también puede usarse para la determinación del porcentaje de identidad.

Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias incluyen los siguientes:

Algoritmo:

Needleman S.B. y Wunsch, C.D. (1970)

Matriz de Comparación:

BLOSUM62 de Henikoff S. y Henikoff J.G. (1992)

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Penalización de intervalo:

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Penalización por longitud de intervalo:

2

El programa GAP también es adecuado para usar con los parámetros anteriores. Los parámetros anteriores son los parámetros estándar (parámetros estándar) para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, en las que los intervalos en los extremos no disminuyen el valor de identidad. Con secuencias muy pequeñas en comparación con la secuencia de referencia, puede ser además necesario aumentar el valor de expectativa hasta 100.000 y en algunos casos reducir la longitud de palabra (tamaño de palabra) a 2.

Se pueden utilizar otros algoritmos modelo, penalizaciones por apertura de intervalo, penalizaciones por extensión de intervalo y matrices de comparación, incluidas las mencionadas en el Manual del programa, Wisconsin Package, Versión 9, septiembre de 1997. La elección dependerá de la comparación que se realice y de si la comparación se realiza entre pares de secuencias, donde se prefiere GAP o Best Fit, o entre una secuencia y una base de datos de secuencias grandes, donde se prefieren FASTA o BLAST. Un acuerdo del 85% determinado con los algoritmos antes mencionados se describe como el 85% de identidad. Lo mismo aplica para grados más altos de identidad.

En realizaciones preferidas, las variantes de acuerdo con la invención tienen una identidad de 85% o más, preferiblemente 90% o más, y más preferiblemente 95% o más.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humano. El término "humano", como se usa aquí, significa que el anticuerpo monoclonal humano está sustancialmente libre de secuencias de aminoácidos de especies foráneas, preferiblemente el anticuerpo monoclonal humano consiste enteramente en una secuencia de aminoácidos humanos.

La cadena ligera del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención puede ser del tipo kappa o lambda.

En una realización preferida de la invención, la cadena ligera es del tipo lambda. La cadena ligera puede ser una cadena natural que incluye un tipo de cadena ligera naturalmente reordenada, modificada genéticamente o sintética.

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estar presentes en forma de vectores binarios. El vector preferiblemente comprende el promotor unido operativamente al ácido nucleico para facilitar la expresión del ácido nucleico que codifica la cadena ligera y/o la cadena pesada. Preferiblemente, el vector también incluye un origen para replicación y mantenimiento en una célula huésped. El vector también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal ubicada en 5' del ácido nucleico que codifica la cadena ligera o la cadena pesada. La secuencia señal puede facilitar la secreción de la cadena codificada en el medio.

Preferiblemente, el vector se deriva de adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, virus SV40, retrovirus, virus de plantas o bacteriófagos tales como derivados de lambda o M13. El vector particularmente preferido es un vector que contiene las regiones constantes de cadenas pesadas de Ig humanas y cadenas ligeras humanas, tales como el sistema de vector integrado para la expresión eucariota de inmunoglobulinas descrito por Persic et al., 1987.

Además, la presente invención proporciona células huésped que comprenden el vector y/o el ácido nucleico adecuado para la expresión del vector. En la técnica, se conocen numerosos sistemas de expresión procariotas y eucariotas en los que células huésped eucariotas tales como células de levadura, células de insecto, células de plantas y células de mamífero, tales como células HEK293, células PerC6, células CHO, células COS o células HELA y sus derivados son preferidos. Particularmente preferidas son las líneas celulares de producción humana. Se prefiere que las células huésped transfectadas secreten el anticuerpo producido en el medio de cultivo. Si se logra la expresión intracelular, entonces la renaturalización se realiza de acuerdo con procedimientos estándar tales como por ejemplo, los descritos por Benetti et al., 1998.

Los anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con la invención se generan a partir de linfocitos de sangre de un paciente convaleciente y, por lo tanto, da como resultado anticuerpos refinados y seleccionados de forma natural con alta afinidad por la neutralización y protección eficaz contra infecciones.

La presente invención también proporciona métodos para producir el anticuerpo monoclonal. En una realización, el anticuerpo monoclonal se produce cultivando el hibridoma descrito anteriormente. El anticuerpo monoclonal producido se secreta en el sobrenadante y se puede purificar a partir de él aplicando técnicas cromatográficas convencionales.

Alternativamente, el anticuerpo monoclonal se produce mediante la célula huésped que comprende un vector de acuerdo con la presente invención y cultivando la célula huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión recombinante de la cadena de anticuerpo codificada. Preferiblemente, la célula huésped comprende al menos un ácido nucleico que codifica la cadena ligera y al menos un ácido nucleico que codifica la cadena pesada y es capaz de ensamblar el anticuerpo monoclonal de tal manera que se genera una estructura tridimensional que es equivalente a la estructura tridimensional de un anticuerpo monoclonal producido por un mamífero, preferiblemente una célula B humana. Si la cadena ligera se produce por separado de la cadena pesada, entonces ambas cadenas pueden purificarse y posteriormente ensamblarse para producir un anticuerpo monoclonal que tiene esencialmente la estructura tridimensional de un anticuerpo monoclonal producido por un mamífero, preferiblemente una célula B humana.

El anticuerpo monoclonal también se puede obtener por expresión recombinante de la cadena ligera y/o pesada codificada en la que el ácido nucleico se produce aislando un ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal de manera conocida e injertando la secuencia de ácido nucleico que codifica las CDRs como se define en las reivindicaciones sobre el ácido nucleico aislado.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo monoclonal o los ácidos nucleicos de la invención como se define aquí y un portador o ingrediente farmacéuticamente aceptable.

Se divulgan adicionalmente aquí composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo monoclonal y/o al menos un ácido nucleico que codifica una cadena ligera y/o pesada del anticuerpo monoclonal.

La composición farmacéutica puede comprender además fármacos antibióticos tales como estreptomicina, penicilina y vancomicina, etc., preferiblemente acoplados al anticuerpo monoclonal de la invención.

Las composiciones farmacéuticas comprenden el anticuerpo monoclonal en un intervalo de dosificación de 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier manera conocida tal como administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, tópica, intranasal, o como aerosol por inhalación.

En una realización preferida de la invención, las composiciones farmacéuticas se usan para la profilaxis o el tratamiento de la formación de abscesos, en donde la formación de abscesos es causada por una infección por S. aureus en un órgano de un paciente mamífero, tales como ganado, cerdo, gatos, perros, caballos, humanos. En una

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Figura 7

La Figura 7 muestra el efecto protector del anticuerpo monoclonal humano 243-4 en un modelo de ratón relacionado con un catéter venoso central de infección de órganos múltiples. Veinticuatro horas después de la colocación del catéter, los ratones recibieron 1x10e7 CFU de S. aureus cepa US300 y 7,5 mg/kg de mAb 243-4 o PBS a través del catéter. Dos días más tarde, los ratones del grupo de tratamiento recibieron una segunda dosis de anticuerpo (5 mg/kg), mientras que los ratones del grupo de control recibieron solo PBS. Cinco días después de la cirugía, se sacrificó a los ratones para controlar la carga bacteriana de los riñones y la formación de abscesos renales. Los ratones inmunizados con el anticuerpo monoclonal 243-4 mostraron una fuerte reducción de la carga bacteriana y no se observó formación de abscesos renales, mientras que todos los ratones de control poseían una alta carga renal bacteriana y una fuerte formación de abscesos.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención, pero no están destinados a limitar el alcance de la presente invención. Otras realizaciones serán evidentes para las personas experimentadas en la técnica al estudiar la especificación y teniendo en cuenta los conocimientos generales comunes.

Ejemplos

Ejemplo 1

Secuencias de ADN y aminoácidos de 243-4

La especificidad del anticuerpo está determinada por la secuencia de ADN y de aminoácidos, respectivamente. Se determinaron las secuencias de ADN de los fragmentos variables de las cadenas pesada y ligera.

Para el aislamiento de ARN, las células de hibridoma 5x10e5 se sedimentaron mediante centrifugación y se homogeneizaron usando columnas Qiashredder (no.79654, Qiagen). Luego se aisló el ARNm de pellas celulares de hibridoma homogeneizadas utilizando el RNeasy-Kit (no.74124, Qiagen) de acuerdo con el manual de instrucciones del proveedor. Construido sobre ARNm aislado, el ADNc se sintetizó mediante transcripción inversa usando la transcriptasa inversa Superscript II (no.18064-022, Invitrogen). Los genes del anticuerpo 243-4 se amplificaron a partir de ADNc sintetizado usando el kit Advantage 2 PCR (no.639206, Clontech) de acuerdo con el manual de instrucciones del proveedor. La amplificación específica de los genes del anticuerpo se garantizó mediante la aplicación de combinaciones de cebadores diseñadas para la amplificación de genes de la región variable IgG reordenada humana (Welschof et al., 1995). Para la amplificación de los dominios de cadena pesada variable (VH) y los dominios de cadena ligera variable (VL), se utilizó un conjunto de cebadores directos específicos de cadena en combinación con un cebador inverso específicamente recocido en los dominios constantes de la cadena pesada o la cadena ligera (amplificación VH CH IgG en combinación con VH1, VH2 y VH3; amplificación VL CL λ en combinación con VLλ, 1, VLλ 2/5, VLλ, 3, VLλ, 4a, VLλ, 4b y VLλ, 6; ver tabla 1). A continuación, los amplificados de PCR se clonaron en el plásmido pCR4-TOPO del Kit de Clonación TOPO TA para Secuenciación (#K457540, Invitrogen) y finalmente se envió el ADN de plásmido purificado para secuenciación (Microsynth, Balgach, Suiza) utilizando los cebadores específicos de plásmido del kit de clonación TOPO (T3 y T7, ver tabla 1). Las secuencias de ADN obtenidas se procesaron y alinearon usando el paquete de software de gestión de clones (no.875-501-1787, Scientific & Educational Software). Como resultado de las alineaciones realizadas, se definió una secuencia consenso y posteriormente se analizó utilizando la base de datos V Base de todas las secuencias de la región variable de la línea germinal humana (http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/). Con base en los resultados iniciales de la secuenciación, secuencias de cebador internas específicas de cadena adicionales (VL-atox as y VHatox as, ver la Tabla 1) se diseñaron y aplicaron para confirmar la secuencia de anticuerpo identificada en las regiones de recocido de las combinaciones de cebadores que se usaron anteriormente. Los genes del anticuerpo así generados se aplicaron a la secuenciación como se describió anteriormente, como se muestra en las Figuras 1 y 2.

Tabla 1

Secuencias de cebador utilizadas para la amplificación y secuenciación de dominios variables de anticuerpo 243-4

Cebador

Fuente SEQ ID NO Secuencia (5'-3) Aplicación

CH IgG

Welschof et al., J Immunol Met, 179, 1995 9 imagen11 PCR, secuenciación

Secuencias de cebador utilizadas para la amplificación y secuenciación de dominios variables de anticuerpo 243-4

Cebador

Fuente SEQ ID NO Secuencia (5'-3) Aplicación

VH1

10 imagen12 PCR, secuenciación

VH2

11 imagen13 PCR, secuenciación

VH3

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CLλ

13 imagen15 PCR, secuenciación

VLλ 1

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VLλ 2/5

15 imagen17 PCR, secuenciación

VLλ 3

16 imagen18 PCR, secuenciación

VLλ 4a

17 imagen19 PCR, secuenciación

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Biological Laboratories) y se transfirió en paralelo como referencia. Después de bloquear con 5% de leche en polvo durante 1 hora, la membrana de nitrocelulosa (no.LC2000, Invitrogen) se incubó con 50 μg/ml de anticuerpo monoclonal humano purificado 243-4. El enlace del anticuerpo 243-4 a la toxina alfa finalmente se detectó con anticuerpo secundario IgG de cabra antihumano conjugado con HRP a una dilución 1:2.000 (no.62-8420, Zymed Laboratories, Invitrogen, como se muestra en la Figura 4).

Tabla 2

Panel de cepas adquiridas del hospital y la comunidad de S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA) de líneas clonales representativas

Designación de inmunoprecipitación Western

Número del aislado del Instituto Robert Koch Tipo MLS*1 CC*2 Tipo de secuencia Spa3

1

93-00134 ST247 8 t051

2

06-00842 ST8 8 t008

3

06-02222 ST9 8 t008

4

06-01579 ST239 8 t031

5

06-00219 ST5 5 t002

6

06-00409 ST225 5 t003

7

06-01019 ST45 45 t1384

8

06-02182 ST22 22 t965

9

03-02773 ST1 1 t175

10

06-00373 ST8 8 t008

11

05-01089 ST22 22 t310

12

06-00300 ST80 80 t044

*1) tipificación de secuencia de múltiples locus *2) complejo clonal *3) Análisis de la región repetida variable del gen de la proteína A (spa)

10

Ejemplo 4

Determinación de afinidad (por BIAcore)

15 La resonancia de plasmón superficial se midió usando un instrumento BIAcore 2000 (BIAcore). Todos los experimentos se realizaron en regulador Mops 20 mM, pH 7,0, 150 mM de NaCl y 0,1 mg/ml de BSA. Primero, se inmovilizó IgG antihumana de cabra (no.81-7100, Zymed Laboratories, Invitrogen) en un chip CM5 (BIAcore) a aproximadamente 13.200 RU por acoplamiento de amina como se describe en el manual de aplicaciones BIA. Además del recubrimiento covalente inicial, el anticuerpo 243-4 se enlazó al chip sensor mediante la interacción con

20 el anticuerpo IgG antihumano preimmobilizado, produciendo finalmente un nivel de inmovilización adicional de aproximadamente 240 RU. Para la caracterización cinética de los pulsos de interacción antígeno-anticuerpo de concentraciones crecientes de toxina alfa (3,9 nM, 7,8 nM, 15,62 nM, 31,25 nM, 62,5 nM, 125 nM, 250 nM y 500 nM; no.120, List Biological Laboratories) inyectado a una rata de flujo de 50 μl/min. Después de cada ciclo de medición (5 minutos de asociación seguido de 30 minutos de disociación) el complejo anticuerpo-antígeno se resolvió por

25 regeneración de la superficie con 10 mM de glicina-HCl a pH 1,7. Para el cálculo de la constante de disociación del anticuerpo 243-4, las fases de asociación y disociación se registraron y evaluaron mediante ajuste global utilizando el software BIAevaluation 4.1 (BIAcore AB, como se muestra en la Figura 5). Para el análisis de ajuste global, solo se tuvieron en cuenta estas concentraciones de antígeno, lo que permitió el análisis siguiendo el modelo de enlace Langmuir 1:1 (≤ 125 nM, Tabla 2) y como se resalta en el manual BIAcore.

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Tabla 3

Constantes cinéticas de la interacción cuantitativa toxina alfa-anticuerpo 243-4

Concentración de antígeno

kass (l mol-1 s -1) kdiss (s-1) KD (en M)

3,9 nM

5,7 * 104 8,2 * 10-5 1,4 * 10-9

7,8 nM

6,1 * 104 1,0 * 10-5 1,6 * 10-9

15,62 nM

6,2 * 104 8,0 * 10-5 1,3 * 10-9

31,25 nM

6,3 * 104 9,7 * 10-5 1,5 * 10-9

62,5 nM

6,6 * 104 9,0 * 10-5 1,4 * 10-9

125 nM

6,2 * 104 8,9 * 10-5 1,4 * 10-9

Valor medio

6,2 * 104 ± 0,3 * 104 8,9 * 10-5 ± 0,7 * 10-5 1,4 * 10-9 ± 0,1 * 10-9

5 Ejemplo 5

Modelo de cultivo tisular de lesión de célula alveolar humana

Se cultivaron en placa células epiteliales alveolares humanas A549 en medio RPMI (no.R0883, Sigma-Aldrich) a una

10 densidad de 3x10e5 células por pozo. En concentraciones paralelas crecientes de toxina alfa (5 μg/ml-50 μg/ml; no.120, List Biological Laboratories) se preincubaron solo con medio, 20 μg/ml de anticuerpo de control de isotipo (lambda IgG1 humana, proteína de mieloma purificada; no.I 5029, Sigma-Aldrich) o 20 μg/ml de anticuerpo monoclonal purificado 243-4. Después de 4 horas de incubación a 37 °C, se añadieron soluciones de toxina alfa o toxina alfa-anticuerpo a las células y se continuó la incubación durante 16 horas adicionales. Después de ese

15 tiempo, las células se analizaron mediante el ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH) (no.04744934001, Roche), que proporciona una lectura de la liberación de LDH celular en el medio de cultivo, como se muestra en la Figura 6.

Ejemplo 6

20 Modelo de ratón de infección de órganos múltiples

Ratones hembra Balb/c (Charles River, Sulzfeld, Alemania), que pesaban 27-31 g, se aclimataron durante 14 días antes de la cirugía. Los ratones se obtuvieron del proveedor especificado como libre de patógenos. Para la colocación del catéter, los ratones fueron anestesiados intraperitonealmente con xilazina (8 mg/kg de peso 25 corporal)/ketamina (100 mg/kg de peso corporal). Se realizó una incisión horizontal mínima en la piel en el lado izquierdo del cuello afeitado para colocar el catéter de polietileno de una sola luz (diámetro exterior 0,6 mm, Föhr Medical Instruments, Seeheim, Alemania) en la vena cava superior. Veinticuatro horas después de la colocación del catéter, los ratones recibieron 1x10e7 CFU de la cepa US300 de S. aureus (en 100 μl) y 7,5 mg/kg de mAb 243-4 purificado o PBS (en 50 μl) a través del catéter. Dos días más tarde, los ratones del grupo de tratamiento recibieron

30 una segunda dosis de anticuerpo (5 mg/kg), mientras que los ratones del grupo de control recibieron solo PBS.

Cinco días después de la cirugía, se sacrificó a los ratones para controlar la carga bacteriana de los riñones y la formación de abscesos renales. Por esa razón, los riñones se recolectaron asépticamente de animales sacrificados y se homogeneizaron en solución salina. Antes de la extracción del órgano, se confirmó la ubicación del catéter en la

35 vena cava superior y, antes de la homogeneización renal, se examinaron macroscópicamente los órganos para determinar la formación de abscesos. Finalmente, se cultivaron diluciones en serie de los homogenizados de órganos en placas MPK durante al menos 48 horas a 37 ºC. Las unidades formadoras de colonias (CFU) se calcularon y documentaron como CFU/riñón, como se muestra en la Figura 7.

Tabla 4

Formación de abscesos renales diferenciales en animales de grupo de tratamiento y control

Grupo de Tratamiento MAb

Ratón 1 No hay formación de abscesos en ambos riñones

Ratón 2

No hay formación de abscesos en ambos riñones

Ratón 3

No hay formación de abscesos en ambos riñones

Grupo Control

Ratón 4 Fuerte formación de abscesos en ambos riñones

Ratón 5

Fuerte formación de abscesos en ambos riñones

Ratón 6

No se determinó ya que el ratón murió antes del final del experimento

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Claims (1)

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