KR20120046537A - 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정 구조의 화합물을 포함하는 골 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 파골세포의 형성을 억제하여 골 질환을 예방 및 치료하는데 큰 효능을 발휘하며, 천연물(natural source)로부터 유래된 것이기 때문에 안전하다.

Description

골 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Bone Disease}

본 발명은 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

보다 구체적으로 본 발명은 복숭아에서 분리한 특정 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날 까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생 하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 골재형성(bone remodeling) 이라고 한다(Yamaguchi A. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso ., 50(6Suppl):664-669(2005)). 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 뼈의 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다(Cohen-Solal M. et al., Therapie ., 58(5):391-393(2003)).

골재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)과 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK(receptor activator of nuclear factor-κB)에 결합하면 파골 전구 세포가 파골세포로 성숙화(maturation)되어 골 흡수(resorption)가 일어난다. 그러나 OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다(Theill LE. et al., Annu Rev Immunol ., 20:795-823(2002); Wagner EF. et al., Curr Opin Genet Dev ., 11:527-532(2001)). 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 혈액세포(조혈모세포)에서 생기는 파골세포에 의해 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다(William J. et al., Nature ., 423:337342(2003)). 한편 뼈세포에서 생성된 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침척물(hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다(Stains JP. et al., Birth Defects Res C Embryo Today., 75(1):72-80(2005)). 뼈가 파괴되기 시작하여 다시 새로운 뼈로 재형성되기까지는 약 100일 정도 걸린다(Schwarz EM. et al., Curr Opin Orthop ., 11:329-335(2000)). 유아에서는 1년 내에 뼈의 칼슘이 100% 바뀌지만 성인에서는 매년 골격의 약 10-30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골 속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다. 이와 같이 중요한 뼈에 균형이 깨질 경우 많은 질병이 야기될 수 있는데 특히 골다공증과 암세포의 골 전이(bone metastasis)로 인한 뼈의 손상과 관련 된 질환이 대표적이다.

골다공증(osteoporosis)은 여러 가지 원인에 의하여 뼈의 질량이 감소하고 뼈 조직의 미세구조의 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하는 질환으로 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다(Iqbal MM., South Med J., 93(1):2-18(2000)). 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 수 있는 상태로 진행된다(Stepan JJ. et al., Endocr Regul., 37(4):225-238(2003)). 골다공증은 폐경기의 시작과 동시에 급속한 골 손실(년간 2~3%)이 나타나며 척추의 압박 및 손목뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가하는 폐경기 이후의 골다공증(Postmenopausal osteoporosis), 70세 이상의 남녀 노인에게 서서히 발생하며(년간 0.5~1%) 골반골(hip bone)과 척추뼈의 점진적인 골손실을 가져오는 노년기의 골다공증(Senile osteoporosis), 그리고 연령에 상관없이 질병(내분비질환, 위장관질환, 악성종양)이나 약물(부신피질호르몬, 항암화학요법, 갑상선호르몬, 항경련제, 항응고제, methotexate, cyclosporine, GnRH 등), 알코올, 흡연, 사고로 인해 발생하는 2차 골다공증(Secondary osteoporosis)으로 분류된다(Rosen CJ., N Engl J Med ., 353(6):595-603(2005); Davidson M., Clinicain Reviews ., 12(4):75-82(2002)).

유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer) 또는 다발성 골수종(multiple myeloma) 환자들에서 거의 항상 골전이가 일어나고(Kozlow W. et al., J Mammary Gland Biol Neoplasia ., 10(2):169-180(2005)), 이들 암환자들이 얼마나 오랫동안 살 수 있는지는 골전이 여부에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 유방암 환자나 전립선암 환자의 사망률이 높아지는 이유는 암세포가 선택적으로 뼈로 전이되기 때문이다. 유방암에서 관찰되는 골 전이는 대부분 뼈를 파괴하는 골용해성 골 전이(osteolytic metastasis)로서 유방암 세포가 뼈에 직접적인 영향을 미치는 것이 아니라 파골세포를 자극함으로써 일어나는 것으로 알려져 있다(Boyde A. et al., Scan Electron Microsc., 4:1537-1554). 반면, 전립선암에서 관찰되는 골전이는 골조성 골전이(osteoblastic metastasis)이다. 골조성 골전이 또한 골용해와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 뼈로 전이해 온 암세포들은 뼈 주위의 미세환경에서 증식하여 파골세포나 조골세포 활성을 자극함으로써 골용해성 골전이로 진행될지 골조성 골전이로 진행될지를 결정한다(Choong PF. et al., Clin Orthop Relat Res ., 415(S):S19-S31(2003)). 유방암 환자의 약 80%가 암세포의 골 전이가 발생되며, 전이된 유방암 세포는 파골세포를 활성화 시킨다 (Bendre M., et al., Clin Orthop Relat Res., 415(Suppl):S39-S45(2003); Palmqvist P. et al., J Immunol., 169(6):3353-3362(2002)). 활성화 된 파골세포는 뼈 주위의 미세 환경의 균형을 파괴시켜 골용해(osteolysis)를 야기시키고 이러한 현상으로 인해 병적 골절이 자주 발생할 뿐만 아니라, 백혈구 감소증(leukoerythroblastic anaemia), 뼈의 기형, 고칼슘혈증(hypercalcemia), 통증(pain), 신경압박 증후군 (nerve-compression syndromes) 등의 뼈와 관련된 질환이 야기된다 (Roodman GD., N Engl J Med ., 350:1655-1664(2004)).

복숭아나무(Prunus persica (L.) Batsch)는 중국 황허강[黃河]유역의 고원지대에 그 근원을 두고 있으며, 현재는 한국을 포함하여 미국, 이탈리아, 에스파냐 등지에서 재배되는 식물로 중국, 한국의 전통의학에서 나무껍질, 나뭇잎, 꽃, 열매, 복숭아씨, 복숭아 털, 복숭아벌레까지 모두 약제로 쓰이는 것으로 알려져 있다. 그 중 복숭아씨(Semen Persicae)는 주성분인 글리세리드(glyceride), 스테롤(sterol), 에물신(emulsin), 아미그달린(amygdalin)으로 이루어져 있고, 말초혈액 순환불량 증후군 (Oketsu)을 차단하는 효과가 있는 것으로 보고되었으며(Kosuge T., Chem . Pharm . Bull., 33:1496-1498(1985)), 강력한 항종양 촉진자(anti-tumor promoter)와 긴밀하게 연관되어 있고, 부인병을 치료하는 데에도 사용되는 것으로 알려져 있다(Fukuda, T., Biol . Pharm . Bull., 26:271-273(2003)).

복숭아꽃(Flos Persicae)은 켐페롤, 쿠마린 등의 성분을 포함하고 있으면 민간요법에서는 이수, 통변, 수종, 각기 등의 병을 다스리는데 효과적인 것으로 알려져 있다. 또한 복숭아 잎은 신경성 두통, 습진, 종창, 선창에 복숭아 뿌리는 코피, 토혈을 치료하는 사용되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 사용된 복숭아 열매는 도자(桃子, Persicae fructus) 라고도 하며 과육이 흰 백도이다. 복숭아는 알칼리성 식품으로서 한방에서 면역력을 키워 주고 식욕을 돋구며, 발육 불량과 야맹증에 좋고 장을 부드럽게 하여 변비를 없애고 어혈을 풀어 준다고 말한다. 또한 껍질은 해독작용을 하고 유기산은 니코틴을 제거하며 독성을 없애 주기도 한다고 전해지고 있다. 주성분은 수분과 당분이며 주석산, 사과산, 시트르산 등의 유기산이 1% 가량 들어 있고, 비타민 A와 개미산?초산?바레리안산 등의 에스테르와 알코올류?알데히드류?펙틴 등도 풍부하다. 과육에는 유리 아미노산이 많이 들어 있는데, 특히 아스파라긴산이 많다. 특유의 향은 에스테르?알코올류?알데히드가 어울려서 내는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 골다공증과 같은 골 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있으며 인체에 안전한 물질, 특히 천연물-유래 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 복숭아에서 분리한 특정 화합물이 RANKL로 유도한 파골세포의 형성을 현저히 감소시키어 골 질환을 치료 또는 예방하는데 매우 유효하며, 각 화합물이 생쥐에서 분리한 골수 대식세포의 세포 생존율에 영향을 미치지 않음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 복숭아에서 분리한 특정 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 복숭아에서 분리한 특정 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물; 그의 약제학적으로 허용가능한 염; 또는 그의 용매화물 또는 수화물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

화학식 1

상기 화학식 1에서 R₁ 내지 R₃₁는 각각 독립적으로 수소, 할로, 시아노, 아미노, 니트로, C₁-C₁₂ 알킬, C₂-C₆ 알케닐기, C₃-C₈ 사이클로알킬, C₅-C₇ 사이클로알케닐, C₁-C₆ 알킬아미노이고; Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분쇄의 치환 또는 비치환된 C_1-12의 알킬이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 그의 염 또는 그의 용매화물 또는 수화물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 골다공증과 같은 골 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있으며 인체에 안전한 물질, 특히 천연물-유래 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 복숭아에서 분리한 상기 화학식 1의 화합물이 RANKL로 유도한 파골세포의 형성을 현저히 감소시키어 골 질환을 치료 또는 예방하는데 매우 유효하며, 각 화합물이 생쥐에서 분리한 골수 대식세포의 세포 생존율에 영향을 미치지 않음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서에서, 화학식 1의 화합물을 정의하기 위하여 사용되는 용어 “할로”는 할로겐족 원소를 나타내며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다.

용어 “알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 비치환 또는 치환된 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 포함한다. C₁-C₁₂ 알킬은 탄소수 1 내지 12의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C₁-C₁₂ 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.

용어 “사이클로알킬”은 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미하며, 이는 사이클로프로필, 사이클로부틸 및 사이클로펜틸을 포함한다. C₃-C₈ 사이클로알킬은 링 구조를 형성하는 탄소수가 3-8인 사이클로알킬을 의미하며, C₃-C₈ 사이클로알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.

용어 “알케닐”은 지정된 탄소수를 가지는 직쇄 또는 분쇄의 비치환 또는 치환된 불포화 탄화수소기를 나타내며, 예컨대, 에테닐, 비닐, 프로페닐, 알릴, 이소프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, t-부테닐, n-펜테닐 및 n-헥세닐을 포함한다. C₂-C₆ 알케닐은 탄소수 1 내지 6의 알케닐 유니트를 가지는 알케닐기를 의미하며, C₂-C₆ 알케닐이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.

용어 “사이클로알케닐”은 최소 하나의 이중 결합을 갖는 사이클릭 탄화수소기를 의미하며, 예컨대 사이클로펜텐, 사이클로헥센 및 사이클로헥사디엔을 포함한다. C₃-C₈ 사이클로알케닐은 링 구조를 형성하는 탄소수가 3-8인 사이클로알케닐을 의미하며, C₃-C₈ 사이클로알케닐이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.

용어 "약제학적으로 허용되는 염"은, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약제학적 염은, 본 발명의 화합물을, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 숙신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산과 반응시켜 얻어질 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜, 암모니움 염, 나트륨 또는 칼륨 염 등의 알칼리 금속염, 칼슘 또는 마그네슘 염 등의 알칼리 토금속염 등의 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염, 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성함으로써 얻어질 수도 있다.

용어 "수화물(hydrate)"은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다.

용어 "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이다.

바람직한 구현예에서, 상기 화학식 1의 R₁ 내지 R₃₁는 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₅의 알킬이고, 상기 Rx 또는 Ry는 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₅의 알킬이며, 더 바람직하게는 상기 R₁ 내지 R₃₁는 각각 독립적으로 수소 또는 메틸이고, 상기 Rx 또는 Ry는 각각 독립적으로 수소 또는 메틸이다.

보다 더 바람직한 구현예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시된다.

화학식 2

화학식 3

본 발명의 화합물들은 하나 또는 그 이상의 키랄 센터 및/또는 기하 이성질 센터를 가질 수 있으며, 이에 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 모든 입체이성질체, 즉, 광학이성질체, 부분입체이성질체 및 기하 이성질체를 포함한다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 상기 화합물들은 백도 복숭아 과실의 육질(과육) 및/또는 과실의 껍질(과피)의 조추출물에서 분리한 것일 수 있으며, 상기 복숭아 조추출물은 물, 알코올 또는 이의 조합을 복숭아에 가하여 수득한 것일 수 있다.

본원에서 정의되는 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 프로필렌글리콜, 초산에칠, 부틸렌글리콜, 에테르, 클로로포름으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 가용한 추출물을 포함한다.

또한 본원에서 정의되는 극성용매 가용 추출물은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 부탄올에 가용된 추출물이고, 비극성용매 가용추출물은 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매에 가용한 추출물을 의미한다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 상기 화합물들은 파골세포의 형성을 억제하며, 바람직하게는 RANKL(receptor activator of NFκB ligand)로 유도되는 파골세포의 형성을 억제시키는 것을 특징으로 한다. 따라서 골 질환을 예방하거나 치료하는 데 매우 유효하다.

본 발명의 조성물이 예방 또는 치료할 수 있는 상기 골 질환으로는 예컨대, 골다공증, 골연화증, 구루병, 암세포의 골 전이, 암세포의 골전이에 의한 골 손상, 암세포의 골전이에 의한 골 용해, 섬유성 골이형성증, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 퇴행성 관절염 및 디스크 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물을 제공되는 경우, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 식품 조성물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 기능성식품을 제공한다.

기능성식품이란 식품의약품안전청에서 개별인정을 통하여 약리 효과가 인정되는 식품을 의미한다.

본 발명의 기능성식품은 본 발명의 유효성분인 상기 화합물 1을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명의 기능성식품에 있어 상기 화학식 1의 화합물의 첨가량은, 식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 상기 기능성식품이 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태인 경우 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 100 중량%, 바람직하기로는 1 내지 100 중량%의 범위로 첨가될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 특정 구조의 화합물을 포함하는 골 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물은 파골세포의 형성을 억제하여 골 질환을 예방 및 치료하는데 큰 효능을 발휘하며, 천연물(natural source)로부터 유래된 것이기 때문에 안전하다.

도 1은 복숭아 과피에서 분리한 2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid의 ₁H-NMR 데이터를 나타낸 것이다.
도 2a 및 2b는 복숭아 과피에서 분리한 2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid의 ¹³C-NMR 데이터를 나타낸 것이다.
도 3은 복숭아 과피에서 분리한 2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid의 질량분석 데이터를 나타낸 도이다.
도 4는 복숭아 과피에서 분리한 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid의 ¹H-NMR 데이터를 나타낸 도이다.
도 5는 복숭아 과피에서 분리한 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid의 ¹³C-NMR 데이터를 나타낸 도이다.
도 6은 복숭아 과피에서 분리한 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid의 질량분석 데이터를 나타낸 도이다.
도 7은 복숭아 과피에서 분리한 2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid, 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid와 양성대조군으로 올레놀산과 우르솔산의 생쥐 골수 대식세포에 대한 세포 생존율을 데이터를 나타낸 도이다.
도 8은 복숭아 과피에서 분리한 2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid, 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid와 양성대조군으로 올레놀산과 우르솔산의 RANKL로 유도한 파골세포 형성에 대한 억제 효과를 데이터를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

복숭아에 함유된 활성 성분의 분리 및 구조 규명

본 발명에 사용한 백도는 경기도 장호원 경기동부과수농협으로부터 구입하였다. 복숭아를 세척한 후 씨를 제거하고 과육과 과피로 분리하여 동결건조 하였다. 과피에 80% 메탄올을 1:5(w/v)의 비율로 첨가하고 혼합한 후 상온에서 48시간 동안 3회 반복 환류 추출하였다. 메탄올 추출물을 수용액에 녹이고 에틸아세테이트로 추출한 후, 회전 감압농축기(Rotary vacuum evaporator; Heidolph VV2011, Switzerland)로 감압농축하여 에틸아세테이트 분획(1.5 g)을 얻었다. 에틸아세테이트 분획을 메탄올/물(4/1, v/v)부터 메탄올 100% 용매를 RP(reverse-phase)-18 silica gel resin이 충진된 칼럼(5.0x50.0 cm)에 통과시키면서 10개의 분획을 얻고 분획 3(200.0 mg)+4(100.8 mg)을 다시 헥산/에틸아세테이트(1/1. v/v)로 silica gel resin이 충진된 칼럼(3.0x45 cm)으로 분획하여 활성분획을 얻었다. RP-18 칼럼과 메탄올/물(95/5, v/v) 용매를 사용하여 preparative HPLC(Hitachi HPLC system: pump L-6700, detector: L-7400, column: YMC J'Sphere ODS-H80, 250x20 mm id)를 수행하여 화합물 PS-1(3.2 mg)과 PS-2(4.3 mg)을 얻었다. PS-1은 올레놀산(oleanolic acid) 유도체로 화학식 (1)의 2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid, PS-2는 우르솔산(ursolic acid) 유도체로 화학식 (2)의 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid로 확인하였다.

화학식 2: 2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid

HR-ESI MS m/z 473.3651 [M+H], C₃₀H₄₈O₄ (도 1).

¹H NMR data (400 MHz, pyridine-d₅) δ 5.48 (1H, t, J = 3.6 Hz, H-12), 4.31 (1H, dt, J = 11.2, 3.4 Hz, H-2), 3.78 (1H, d, J = 2.8 Hz, H-3), 3.29 (1H, dd, J = 13.6, 3.8 Hz, H-18), 1.29 (3H, s, H-23), 1.19 (3H, s, H-27), 1.03 (3H, s, H-26), 1.00 (3H, s, H-30), 0.98 (3H, s, H-25), 0.93 (3H, s, H-24), 0.91 (3H, s, H-29) (도 2).

¹³C NMR (75 MHz, pyridine-d₅) δ 180.8 (C-28), 145.3 (C-13), 122.9 (C-12), 79.7 (C-3), 66.5 (C-2), 49.1 (C-5), 48.4 (C-9), 47.0 (C-19), 46.9 (C-17), 43.1 (C-14), 42.6 (C-1), 42.4 (C-18), 40.4 (C-8), 39.2 (C-4), 39.1 (C-10), 34.6 (C-21), 33.6 (C-7), 33.6 (C-22), 33.6 (C-29), 31.3 (C-20), 29.9 (C-23), 28.7 (C-15), 26.5 (C-27), 24.3 (C-11), 24.2 (C-30), 24.1 (C-16), 22.7 (C-24), 18.9 (C-6), 17.9 (C-26), 17.0 (C-25) (도 3).

화학식 3: 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid

HR-ESI MS m/z 473.3681 [M+H], C₃₀H₄₈O₄ (도 4).

¹H NMR data (400 MHz, pyridine-d₅) δ 5.47 (1H, brs, H-12), 4.31 (brd, J = 14.4, H-2), 3.78 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-3), 2.63 (1H, d, J = 14.4 Hz, H-18), 1.29 (3H, s, H-23), 1.13 (3H, s, H-24), 1.06 (3H, s, H-26), 0.98 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-29), 0.97 (3H, s, H-25), 0.94 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-30), 0.91 (3H, s, H-24) (도 5).

¹³C NMR (75 MHz, pyridine-d₅) δ 180.3 (C-28), 139.7 (C-13), 126.0 (C-12), 79.7 (C-3), 66.5 (C-2), 53.9 (C-18), 49.1 (C-5), 48.4 (C-17), 48.3 (C-9), 43.3 (C-1), 43.0 (C-14), 40.6 (C-8), 39.8 (C-4), 39.8 (C-19), 39.2 (C-20), 39.0 (C-10), 37.8 (C-22), 33.9 (C-7), 31.5 (C-21), 29.8 (C-23), 29.0 (C-15), 25.3 (C-16), 24.1 (C-27), 24.1 (C-11), 22.7 (C-24), 21.8 (C-30), 18.8 (C-6), 17.9 (C-26), 17.1 (C-29), 17.1 (C-25)(도 6).

세포배양

4주령 수컷 ICR 생쥐(중앙실험동물(주), 서울, 대한민국)를 경추탈골 후 겸좌를 이용하여 뒷다리의 외피를 벗겼다. 수술용 가위로 외피가 벗겨진 뒷다리를 절단하고 혈청이 없는 α-MEM(Minimum Essential Medium Alpha)에 넣었다. 핀셋을 사용하여 근육 속의 뼈를 분리하여 신선한 α-MEM에 옮겨 담았다. 1 ㎖ 주사기에 500 ㎕의 α-MEM을 넣어 주사기 바늘을 다리뼈 가운데 척수 부분에 꽂고 2번 분사하여 골수세포를 적출하였다. Histopaque(Sigma, MO, USA)을 사용하여 적출한 골수세포로부터 골수 대식세포를 분리하였다. 분리한 생쥐 골수 대식세포는 1% 항생-항균(Antibiotic-Antimycotic)용액, 10% FBS(fetal bovine serum), M-CSF (macrophage-colony stimulating factor) 30 ng/㎖를 포함하는 α-MEM에서 배양하였다.

복숭아에서 분리한 화합물 PS -1(2α,3α- dihydroxyolean -12- en -28- oic acid )과 PS -2 (2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid )의 세포독성 측정

상기 복숭아 활성성분의 생쥐 골수 대식세포에 대한 세포 독성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법에 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다(Wattel A. et al., J Cell Biochem ., 92(2):285-295(2004)). 96-웰(well) 플레이트의 각 웰에 생쥐 골수 대식세포(1x10⁴ cells)를 넣고 1% 항생-항균(Antibiotic-Antimycotic)용액, 10% FBS(fetal bovine serum), M-CSF(macrophage-colony stimulating factor) 30 ng/㎖, 복숭아 활성성분인 PS-1(2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid), 또는 PS-2(2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid)가 포함되어 있는 α-MEM에서 배양하였다. 각 화합물은 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹인 후 0, 2, 10 및 20 μM의 농도가 되도록 10% FBS-α-MEM으로 희석하였다. 이틀마다 신선한 배지로 교환하면서 생쥐 골수 대식세포를 5일간, 37°C, 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양한 후, 각 웰당 5 ㎎/㎖의 농도가 되게 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액을 첨가하였다. 4시간 동안 37°C에서 배양한 후 배지 및 MTT 용액을 완전히 제거하고 각 웰 당 DMSO를 200 ㎕씩을 가하였다. 20분 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군(배지만 처리한 웰)의 흡광도에 대한 실험군(각 복숭아 활성성분을 포함한 배지를 가한 웰)의 흡광도의 백분율로 계산하였다.

생쥐 골수 대식세포에 복숭아 활성성분인 PS-1(2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid)과 PS-2 (2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid)를 0, 2, 10 및 20 μM의 농도로 가하였을 때 생쥐 골수 대식세포의 세포생존율에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 7 및 표 1 참조).

PS -1 (μM)	흡광도 (570 nm)	세포 생존율 (%)	PS -2 (μM)	흡광도 (570 nm)	세포 생존율 (%)
0	0.831	100	0	0.999	100
2	0.828	99.63	2	0.981	98.20
10	0.810	97.47	10	0.985	98.60
20	0.822	98.96	20	0.970	97.10

복숭아 활성성분의 파골세포 형성에 대한 억제능 측정

상기 복숭아의 활성성분의 생쥐 골수 대식세포로부터 파골세포 형성에 대한 억제효능을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법에 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다(Park EK. et al., Biochem Biophys Res Commun ., 325(4):1472-1480(2004)). 분리한 생쥐 골수 대식세포를 96-웰 플레이트에 각 웰 당 1x10⁴개씩 넣고, RANKL(Receptor Activator for Nuclear Factor κ B Ligand, 100 ng/㎖), M-CSF(macrophage colony stimulating factor, 30 ng/㎖) 및 각 복숭아 활성성분이 포함되어 있는 10% FBS-α-MEM에서 배양하였다. 각 복숭아 활성성분은 각각 0, 2, 10 또는 20 μM이 포함 되어 있는 10% FBS-α-MEM에서 배양하였다. 대조군에는 10% FBS-α-MEM만 가하였다. 이틀마다 신선한 배지로 교환을 해주고, 5일 동안 배양한 후 파골세포의 형성을 확인하기 위하여 TRAP 분석 키트(tartarate resistant acid phosphatase assay kit; Sigma, MO, USA)를 사용하여 염색을 시행하였다. 파골세포의 특성인 3개 이상의 핵을 포함하는 세포의 수를 광학 현미경을 사용하여 측정하였다.

실험결과, RANKL을 처리하지 않은 생쥐 골수 대식세포에서는 파골세포가 생성되지 않은 반면 RANKL을 처리한 생쥐 골수 대식세포에서는 파골세포의 수가 현저히 증가되었다(p <0.0001)(도 8 및 표 2-3 참조). 생쥐 골수 대식세포를 복숭아의 활성성분으로 각각 처리한 경우, PS-1(2α,3α-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid)과 PS-2(2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid)에 의해 RANKL로 유도된 파골세포의 형성이 현저히 억제되는 것을 확인하였다(도 8 및 표 2-3 참조).

PS -1 (μM)	파골세포의 수	파골세포 형성 억제율(%)	P value
0	255.7 ± 24.3	-	-
2	274.0 ± 13.1	0	-
10	42.0 ± 15.1	83.6	0.0002
20	0.3 ± 0.6	99.9	0.0001

PS -2 (μM)	파골세포의 수	파골세포 형성 억제율(%)	P value
0	255.7 ± 24.3	-	-
2	275.0 ± 10.2	0	-
10	147.3 ± 21.1	42.6	0.004
20	0	100	0.0001

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

1. 하기 화학식 1의 화합물; 그의 약제학적으로 허용가능한 염; 또는 그의 용매화물 또는 수화물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
   화학식 1
   

   

   
   상기 화학식 1에서 R₁ 내지 R₃₁는 각각 독립적으로 수소, 할로, 시아노, 아미노, 니트로, C₁-C₁₂ 알킬, C₂-C₆ 알케닐기, C₃-C₈ 사이클로알킬, C₅-C₇ 사이클로알케닐, C₁-C₆ 알킬아미노이고; Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분쇄의 치환 또는 비치환된 C_{1 -12}의 알킬이다.
   
2. 하기 화학식 1의 화합물, 그의 염 또는 그의 용매화물 또는 수화물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물:
   화학식 1
   

   

   
   상기 화학식 1에서 R₁ 내지 R₃₁는 각각 독립적으로 수소, 할로, 시아노, 아미노, 니트로, C₁-C₁₂ 알킬, C₂-C₆ 알케닐기, C₃-C₈ 사이클로알킬, C₅-C₇ 사이클로알케닐, C₁-C₆ 알킬아미노이고; Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분쇄의 치환 또는 비치환된 C_{1 -12}의 알킬이다.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 R₁ 내지 R₃₁는 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₅의 알킬이고, 상기 Rx 또는 Ry는 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₅의 알킬인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 R₁ 내지 R₃₁는 각각 독립적으로 수소 또는 메틸이고, 상기 Rx 또는 Ry는 각각 독립적으로 수소 또는 메틸인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물:
   화학식 2
   

   

   
   화학식 3
   

   

   
   
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 골연화증, 구루병, 암세포의 골 전이, 암세포의 골전이에 의한 골 손상, 암세포의 골전이에 의한 골 용해, 섬유성 골이형성증, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 파골세포의 형성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 RANKL(receptor activator of NFκB ligand)로 유도되는 파골세포의 형성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 복숭아 추출물로부터 분리한 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 복숭아 추출물은 물, 알코올 또는 이의 조합을 복숭아에 가하여 수득한 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제 2 항의 조성물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 기능성식품.
    
12. 제 11 항에 있어서, 상기 기능성식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 것을 특징으로 하는 기능성식품.

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