KR20120039468A

KR20120039468A - 감마-세크레타제 저해제를 유효성분으로 함유하는 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20120039468A
Application number: KR1020110100981A
Authority: KR
Inventors: 조동규; 박종성
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2011-10-05
Publication date: 2012-04-25
Also published as: KR101300017B1; KR20130076850A; KR20130076851A; KR101300016B1; KR101330184B1; KR20130076849A

Abstract

본 발명은 감마-세크레타제 저해제를 유효성분으로 함유하는 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 감마-세크레타제 저해제는 농도 의존적으로 관절염 유발 정도를 감소시키고, 무릎관절에 염증세포들의 유입을 감소시키며, 사이토카인 및 케모카인의 양을 감소시키고, NICD(notch intracelluar domain)의 발현 양을 감소시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 감마-세크레타제 저해제는 면역세포의 활성화, 분화, 증식을 조절하여 염증 반응을 일으키는 노치 신호 전달에 가장 중요한 역할을 하는 NICD의 생성 억제 효과가 우수함으로, 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료에 유용한 의약품 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다.

Description

감마-세크레타제 저해제를 유효성분으로 함유하는 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising gamma-secretase inhibitor for preventing or treating rheumatoid arthritis}

본 발명은 감마-세크레타제 저해제를 유효성분으로 함유하는 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

류마티스성 관절염은 자가면역질환으로서, 관절의 만성 염증과 관련되어 있는 만성 염증성 질환이다. 흔히, 염증은 관절 주변의 조직과 다른 기관으로 퍼진다. 일반적으로, 류마티스성 관절염은 관절 파괴 및 기능 장애를 유발할 수 있는 진행성 질환이며, 류마티스성 관절염과 관련된 관절 염증은 관절의 부종, 통증, 강직 및 발적을 유발한다. 류마티스성 관절염과 관련된 관절 염증은 관절 주변의 조직(건, 인대, 근육)에서도 발생할 수 있다. 일부 류마티스성 관절염 환자의 경우, 만성 염증이 연골, 골 및 인대를 파괴하여 관절의 변형이 유발된다. 관절의 손상은 질병 초기에 발생할 수 있고 진행성일 수 있다. 관절의 진행성 손상은 관절에 발생한 통증, 강직 또는 부종의 정도에 반드시 상관관계가 있는 것은 아니다.

한편, 감마-세크레타제(γ-secretase)는 주로 알츠하이머성 치매의 치료에 연구되는 단백질로, 알츠하이머성 치매의 주원인으로 알려진 아밀로이드 베타 펩티드(amyloid beta peptides)를 생성하는데 중요한 역할을 한다. 감마-세크레타제는 4개의 단백질, 예를 들어 프레세닐린(presenilin), 니카스트린(nicastrin), pen-2, aph-1로 이루어진 공동 복합체 단백질 분해 활성제이다. 프레세닐린은 감마-세크레타제의 활성에 필수성분이고, 이들 기질의 트랜스 맴브레인에서 분열하여 스스로 폴리토픽(polytopic) 멤브레인 단백질이 되는 변칙적인 아스파르틸 프로테아제의 새로운 그룹을 나타낸다. 니카스트린은 비교적 큰 분자량의 단백질로 세포막에 존재하는 감마-세크레타제의 구성 단위이며, 세포 표면에 존재할 경우에는 니카스트린이 세포 외부로 향해 있으면서 수용체 구실을 한다. 또한, 세포막에 존재하는 몇몇 세포들과 결합을 형성하는데 이 가운데는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein; APP)도 포함된다. 일단 결합을 형성하고 나면 아밀로이드 전구체 단백질을 감마-세크레타제의 활성 부위로 이동시키고 여기서 단백질이 두 부위로 쪼개지면서 아밀로이드-베타는 세포 밖으로 배출되고 다른 한 부위는 세포 내부에 남는다. 세포 밖으로 분비된 아밀로이드-베타가 뇌에 축적되어 플라크(plaque)를 만들면 바로 알츠하이머병의 대표적인 특징이 생기게 된다. pen-2와 aph-1의 정확한 기능은 알려져 있지 않다(Wolfe MS, Biochemistry, 2006, 45, 7931-9).

이러한 감마-세크레타제는 아밀로이드 베타 전구체 단백질을 분해할 뿐만 아니라 노치(Notch), CD44, N-카드헤린(N-cadherin), IGF1-R 등 다양한 기질을 가지고 있다. 특히, 노치에서는 염증반응과 관련된 신호전달 기작을 가진다. 노치 신호 전달은 다양한 세포들의 분화, 증식, 생존 및 발달을 조절한다. 포유류 세포에서 노치 수용체는 노치 1~4까지 총 4가지를 가지고 있으며, 제그드-1,2(jagged-1,2)와 델타-유사-1,3,4(delta-like-1,3,4) 등 총 5가지의 리간드를 가지고 있다. 노치 수용체는 리간드와 결합 후 활성화되어 메탈로 프로테아제인 ADAM과 감마-세크레타제에 의해 두 단계의 단백질 분해가 일어나게 되면 NICD(notch intracelluar domain)를 생성하고, NICD가 핵 안으로 들어가서 전사 조절 인자로 작용한다.

특히, 포유류에서 노치 신호 전달은 T 세포와 B 세포의 발달에 여러 단계에 관여를 하고 있으며, T 세포의 활성화, 조절 T 세포의 기능 및 헬퍼 T 세포의 분화에도 관여한다. 또한, 노치 신호 전달은 수지상 세포(dendritic cell, DC)의 분화와 생존을 조절하고, 류마티스성 관절염 환자의 관절 부위에서 많이 생성되는 TLR (toll-like receptor) 신호전달을 조절한다고 보고되어 있다(Amsen, et al., Immunity, 2007, 27, 89-99, Amsen, et al., Cell, 2004, 117, 515-26, Eager, et al., Immunity, 2004, 20, 407-15, Fung, et al., Circulation, 2007, 115, 2948-56, Maillard, et al., Annu. Rev. Immunol., 2005, 23, 945-74, Osborne, et al., Nat. Rev. Immunol., 2007, 7, 64-75, Ostrouhova, et al., J. Clin. Invest., 2006, 116, 996-1004, Skokos, et al., J. Exp. Med., 2007, 204, 1525-31, Tanigaki, et al., Nat. Immunol., 2007, 8, 451-6, Hu, et al., Immunity, 2008, 29, 691-703). 노치 신호 전달은 류마티스성 관절염 환자의 관절 조직에서 많이 발현되고 있으며, 류마티스성 관절염에서 생성되는 사이토카인의 방출을 증가시킨다고 알려져 있다(Nakazawa, et al., Arthritis and Rheumatism, 2001, 44, 1545-54, Ando, et al., Oncogene, 2003, 22, 7796-7803, Yabe, et al., J. Orthop. Sci., 2005, 10, 589-94).

현재까지 알려져 있는 감마-세크레타제 저해제는 총 50가지 이상의 종류가 있으며, 최근에는 이들 감마-세크레타제 저해제 중 일부를 염증 관련 질환의 치료 물질로 사용하려는 연구가 꾸준히 시도되고 있다. 그러나, 이들 물질의 항염 효과, 특히 류마티스성 관절염과 관련된 관절 염증에 대한 항염 효과에 대해서는 미미하거나 명백하게 입증하지 못하고 있는 실정이다.

따라서, 류마티스성 관절염과 관련된 관절 염증에 대한 감마-세크레타제 저해제의 항염 효과에 관한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 류마티스성 관절염과 관련된 관절 염증에 대한 감마-세크레타제 저해제의 항염 효과에 대해 연구하던 중, 감마-세크레타제 저해제가 농도 의존적으로 관절염 유발 정도를 감소시키고, 무릎관절에 염증세포들의 유입을 감소시키며, 사이토카인 및 케모카인의 양을 감소시키고, NICD(notch intracelluar domain)의 발현 양을 감소시킴을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 감마-세크레타제 저해제를 유효성분으로 함유하는 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 감마-세크레타제 저해제를 유효성분으로 함유하는 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 감마-세크레타제 저해제는 DAPT, L-685,458, RO4929097, DBZ, Z-YIL-CHO, DAPM, compound E, CW, begacestat(GSI-953), semagacestat (LY450139), BMS 299897 및 MRK 560으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 DAPT (N-[(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glycine-1,1-dimethylethyl ester)는 백색 고체이며, 분자식 C₂₃H₂₆F₂N₂O₄, 분자량 432.46, CAS No. 208255-80-5이다.

상기 L-685,458 ((5S)-(tert-butoxycarbonylamino)-6-phenyl-(4R)-hydroxy-(2R)-benzylhexanoyl)-L-leucy-L-phenylalaninamide)은 분자식 C₃₉H₅₂N₄O₆, 분자량 672.85, CAS No. 292632-98-5이다.

상기 RO4929097은 하기 화학식 1로 표시되며, 분자식 C₂₂H₂₀F₅N₃O₃, 분자량 469.4, CAS No. 847925-91-1이다.

상기 DBZ (dibenzazepine; (S,S)-2-[2-(3,5-difluorophenyl)acetylamino]-N-(5-methyl-6-oxo-6,7-dihydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl)propionamide)는 백색 고체이며, 분자식 C₂₆H₂₃F₂N₃O₃, 분자량 463.4, CAS No. 209984-56-5이다.

상기 Z-YIL-CHO는 하기 화학식 2로 표시되며, 백색의 동결건조된 고체이고, 분자식 C₂₉H₃₉N₃O₆, 분자량 525.7이다.

상기 DAPM (N-[N-3,5-difluorophenacetyl]-L-alanyl-S-phenylglycine methyl ester)은 분자식 C₂₀H₂₀F₂N₂O₄, 분자량 390.4이다.

상기 compound E ((S,S)-2-[2-(3,5-difluorophenyl)-acetylamino]-N-(1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-3-yl)-propionamide)는 황백색의 분말이며, 분자식 C₂₇H₂₄F₂N₄O₃, 분자량 490.5이다.

상기 CW (3,5-bis(4-nitrophenoxy)benzoic acid)는 분자식 C₁₉H₁₂N₂O₈, 분자량 396.31, CAS No. 173550-33-9이다.

상기 begacestat(GSI-953)는 하기 화학식 3으로 표시되며, 분자식 C₉H₈ClF₆NO₃S₂, 분자량 391.74, CAS No. 769169-27-9이다.

상기 semagacestat(LY450139)는 하기 화학식 4로 표시되며, 분자식 C₁₉H₂₇N₃O₄, 분자량 361.434이다.

상기 BMS 299897은 하기 화학식 5로 표시되며, 분자식 C₂₄H₂₁ClF₃NO₄S, 분자량 511.94, CAS No. 290315-45-6이다.

상기 MRK 560 (N-[cis-4-[(4-chlorophenyl)sulfonyl]-4-(2,5-difluorophenyl)cyclohexyl]-1,1,1-trifluoromethanesulfonamide)은 하기 화학식 6으로 표시되며, 분자식 C₁₉H₁₇ClF₅NO₄S₂, 분자량 517.92, CAS No. 677772-84-8이다.

본 발명에 따른 감마-세크레타제 저해제는 농도 의존적으로 관절염 유발 정도를 감소시키고, 무릎관절에 염증세포들의 유입을 감소시키며, 사이토카인 및 케모카인의 양을 감소시키고, NICD(notch intracelluar domain)의 발현 양을 감소시킨다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 감마-세크레타제 저해제는 면역세포의 활성화, 분화, 증식을 조절하여 염증 반응을 일으키는 노치 신호 전달에 가장 중요한 역할을 하는 NICD의 생성 억제 효과가 우수함으로, 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료에 유용한 의약품 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 감마-세크레타제 저해제와 함께 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 감마-세크레타제 저해제의 일일 투여량은 약 1~500㎎/㎏, 바람직하게는 약 150~250㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 류마티스성 관절염의 예방을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 감마-세크레타제 저해제를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 감마-세크레타제 저해제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 감마-세크레타제 저해제는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.20g, 바람직하게는 약 0.04~0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 감마-세크레타제 저해제는 농도 의존적으로 관절염 유발 정도를 감소시키고, 무릎관절에 염증세포들의 유입을 감소시키며, 사이토카인 및 케모카인의 양을 감소시키고, 면역세포의 활성화, 분화, 증식을 조절하여 염증 반응을 일으키는 노치 신호 전달에 가장 중요한 역할을 하는 NICD(notch intracelluar domain)의 발현 양을 감소시키는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 감마-세크레타제 저해제(DAPT)의 관절염 유발 정도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 감마-세크레타제 저해제(DAPT)의 관절염 유발 정도를 정량화하여 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 감마-세크레타제 저해제(DAPT)의 관절염 유발 정도를 임상 점수로 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 감마-세크레타제 저해제(DAPT)를 처리한 류마티스성 관절염 동물 모델의 무릎관절에서 조직학적 염증 정도를 현미경으로 관찰한 도이다.
도 5는 본 발명의 감마-세크레타제 저해제(DAPT)를 처리한 류마티스성 관절염 동물 모델의 혈청에서 사이토카인(IL-6, IL-12, IL-17, TNF-α, INF-γ)과 케모카인(MCP-1)의 방출 양을 측정한 도이다.
도 6은 본 발명의 감마-세크레타제 저해제(DAPT)를 처리한 류마티스성 관절염 동물 모델의 관절에서 NICD의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 감마-세크레타제 저해제(L-685,458, RO4929097, DBZ)의 관절염 유발 정도를 임상 점수로 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 감마-세크레타제 저해제(L-685,458, RO4929097, DBZ)를 처리한 류마티스성 관절염 동물 모델의 무릎관절에서 조직학적 염증 정도를 현미경으로 관찰한 도이다.
도 9는 본 발명의 감마-세크레타제 저해제(L-685,458, RO4929097, DBZ)를 처리한 류마티스성 관절염 동물 모델의 혈청에서 사이토카인(IL-6, IL-12, IL-17, TNF-α, INF-γ)의 방출 양을 측정한 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 감마- 세크레타제 저해제( DAPT )가 관절염 유발 정도에 미치는 영향

본 발명의 감마-세크레타제 저해제(DAPT)가 관절염 유발 정도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

류마티스성 관절염에서 감마-세크레타제 저해제에 의하여 관절염 유발 정도가 줄어드는지 확인하기 위하여, 류마티스성 관절염 동물 모델(collagen induced arthritis model)을 제작하였다. 즉, 8주령 C57BL/6J 마우스를 구입하여 22℃ 온도를 유지하고 12시간의 명암주기(dark/light cycle)를 유지하는 항온?항습 동물 사육실에서 한달 동안 사료와 물을 충분히 공급하면서 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 류마티스성 관절염 동물모델은 12주령 C57BL/6J 마우스를 네이처 프로토콜(nature protocol)과 같은 방법으로 제작하였다. 구체적으로는, 동일 량의 Bovine type Ⅱ collagen(2㎎/㎖, Chondrex, Japan)과 Complete Freund's adjuvant (CFA, Chondrex, Japan)로 만든 에멀젼을 C57BL/6J 마우스의 꼬리와 엉덩이 부위에 0.1㎖씩 주사하여 1차 면역(primary immunization)하였다. 1차 면역 3주 후, Bovine type Ⅱ collagen(2㎎/㎖, Chondrex, Japan)과 Incomplete Freund's adjuvant(IFA, Chondrex, Japan)로 만든 에멀젼을 마우스의 꼬리와 엉덩이 부위에 0.1㎖씩 주사하여 추가 면역(booster immunization)하였다. 추가 면역 주사 후, 감마-세크레타제 저해제인 DAPT(Tocris bioscience, Cat.No: 2634, UK)를 10㎎/㎏, 20㎎/㎏씩 4주 동안 마우스에 복강주사 하였다. 4주간 DAPT를 투여한 후, 혈관 형성 표적 물질인 HGC(hydrophobically modified glycol chitosan)에 NIRF(near-infrared fluorescence) 물질인 Cy5.5를 결합하여 eXplore optix system을 이용하여 관절염 유발 정도를 측정하였다. 또한, DAPT를 주사하는 기간 동안 관절염 유발 정도를 임상 점수(clinical score)로 측정하여 기록하였으며, 임상 점수 측정 기준은 네이처 프로토콜의 제시예에 따랐다.

본 발명의 감마-세크레타제 저해제인 DAPT의 관절염 유발 정도와 이를 정량화한 결과는 각각 도 1 및 도 2에 나타내었으며, 관절염 유발 정도를 임상 점수로 측정한 결과는 도 3에 나타내었다.

도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 감마-세크레타제 저해제인 DAPT는 농도 의존적으로 관절염 유발 정도를 감소시켰다.

또한 도 3에 나타난 바와 같이, 관절염 유발 정도는 시간이 지남에 따라 DAPT의 농도에 의존적으로 감소하였다.

실시예 2 : 감마- 세크레타제 저해제( DAPT )가 무릎관절의 조직학적 염증 정도에 미치는 영향

본 발명의 감마-세크레타제 저해제(DAPT)가 무릎관절의 조직학적 염증 정도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1에서 제작한 류마티스성 관절염 동물 모델에 4주 동안 DAPT(10㎎/㎏, 20㎎/㎏)를 복강 투여한 후 무릎관절을 적출하였다. 적출된 무릎관절을 10% NBF(neutral buffered formalin)에 고정하였다. 고정한 무릎관절을 탈회 용액 (decalcifying solution lite, Sigma)을 이용하여 뼈의 석회질을 제거하고 파라핀 블록을 만들었다. 제조된 파라핀 블록 관절 조직을 5㎛의 절편으로 만들고, 헤마토실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 류마티스성 관절염 동물 모델의 무릎관절 조직 절편에서는 무릎관절의 염증반응에 의한 염증세포들의 유입이 일어났으나, DAPT를 처리한 군에서는 염증세포들의 유입이 감소되었다.

실시예 3 : 감마- 세크레타제 저해제( DAPT )가 사이토카인 및 케모카인의 방출 양에 미치는 영향

본 발명의 감마-세크레타제 저해제(DAPT)가 사이토카인 및 케모카인의 방출 양에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1에서 제작한 류마티스성 관절염 동물 모델에 4주 동안 DAPT(10㎎/㎏, 20㎎/㎏)를 복강 투여한 후 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 13000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 혈청만 분리하였다. 분리한 혈청은 Mouse Cytokine Panel 1-8 Plex(Millipore, MPXMCYTO-70K-08, USA)를 이용하여 사이토카인(IL-6, IL-12, IL-17, TNF-α, INF-γ)과 케모카인(MCP-1)의 방출 양을 측정하였다.

결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 류마티스성 관절염 동물 모델의 혈청에서 사이토카인 및 케모카인의 양이 많이 방출되었으나, DAPT를 투여한 군에서는 사이토카인 및 케모카인의 양이 감소하였다.

실시예 4 : 감마- 세크레타제 저해제( DAPT )가 NICD 의 발현 정도에 미치는 영향

본 발명의 감마-세크레타제 저해제(DAPT)가 노치 신호 전달에 중요한 역할을 하는 NICD의 발현 정도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1에서 제작한 류마티스성 관절염 동물 모델에 4주 동안 DAPT를 복강 투여 후 관절을 적출하였다. 적출한 관절을 균질기(MagNA Lyser, Roche)를 이용하여 파쇄하고 조직 용해액(T-per, Thermo)을 첨가하여 1시간 동안 4℃ 냉장고에서 교반한 후, 샘플 완충액을 첨가하여 100℃에서 10분간 끓여 주었다. 제조된 샘플은 웨스턴 블롯 방식으로 노치 신호 전달에 중요한 역할을 하는 NICD의 발현 정도를 확인하였다.

결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에서 나타난 바와 같이, 류마티스성 관절염 동물 모델의 관절에서 노치 1의 발현 양이 증가되었으나, DAPT를 투여한 군에서는 NICD의 발현 양이 감소하였다.

실시예 5 : 감마- 세크레타제 저해제(L-685,458, RO4929097 , DBZ )가 관절염 유발 정도에 미치는 영향

본 발명의 감마-세크레타제 저해제(L-685,458, RO4929097, DBZ)가 관절염 유발 정도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 감마-세크레타제 저해제로 DAPT(10㎎/㎏, 20㎎/㎏) 대신 L-685,458(Tocris bioscience, Cat.No: 2627, UK), RO4929097(Selleck chemical, S1575 USA), DBZ(Calbiochem, Cat.No: 565789, Germary) (1㎎/㎏)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 관절염 유발 정도를 확인하였다.

결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 시간이 지남에 따라 감마-세크레타제 저해제인 L-685,458 > RO4929097 > DBZ의 순으로 관절염 유발 정도가 감소하였다. 특히, 본 발명의 L-685,458(1㎎/㎏)을 투여한 경우 DAPT(20㎎/㎏)를 투여한 경우와 비교하여 관절염 유발 정도가 더 감소하였으며, RO4929097, DBZ 또한 동일한 효과를 나타내었다.

실시예 6 : 감마- 세크레타제 저해제(L-685,458, RO4929097 , DBZ )가 무릎관절의 조직학적 염증 정도에 미치는 영향

본 발명의 감마-세크레타제 저해제(L-685,458, RO4929097, DBZ)가 무릎관절의 조직학적 염증 정도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에서 감마-세크레타제 저해제로 DAPT(10㎎/㎏, 20㎎/㎏) 대신 L-685,458, RO4929097, DBZ(1㎎/㎏)을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일하게 하여 류마티스성 관절염 동물 모델의 무릎관절의 조직학적 염증 정도를 현미경으로 관찰하였다.

결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 류마티스성 관절염 동물 모델의 무릎관절 조직 절편에서 무릎관절의 염증반응에 의한 염증세포들의 유입이 일어났으나, L-685,458, RO4929097, DBZ를 투여한 군에서는 염증세포들의 유입이 감소되었다.

실시예 7 : 감마- 세크레타제 저해제(L-685,458, RO4929097 , DBZ )가 사이토카인의 방출 양에 미치는 영향

본 발명의 감마-세크레타제 저해제(L-685,458, RO4929097, DBZ)가 사이토카인(IL-6, IL-12, IL-17, TNF-α, INF-γ)의 방출 양에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 감마-세크레타제 저해제로 DAPT(10㎎/㎏, 20㎎/㎏) 대신 L-685,458, RO4929097, DBZ(1㎎/㎏)을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일하게 하여 류마티스성 관절염 동물 모델의 혈청에서 사이토카인(IL-6, IL-12, IL-17, TNF-α, INF-γ)의 방출 양을 확인하였다.

결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 류마티스성 관절염 동물 모델의 혈청에서 사이토카인의 양(IL-6, IL-12, IL-17, TNF-α, INF-γ)이 많이 방출되었으나, L-685,458, RO4929097, DBZ를 투여한 군에서는 사이토카인의 양이 감소하였다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

감마-세크레타제 저해제 200㎎

유당 100㎎

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

감마-세크레타제 저해제 200㎎

옥수수전분 100㎎

유당 100㎎

스테아르산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

감마-세크레타제 저해제 200㎎

옥수수전분 100㎎

유당 100㎎

스테아르산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 주사제의 제조

감마-세크레타제 저해제 200㎎

만니톨 100㎎

Na₂HPO₄?12H₂O 2㎎

주사용 멸균 증류수 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분을 혼합하여 주사제를 제조하였다.

제제예 2 : 식품의 제조

본 발명의 감마-세크레타제 저해제를 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

감마-세크레타제 저해제 20~95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

감마-세크레타제 저해제 0.2~1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

감마-세크레타제 저해제 0.5~5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

감마-세크레타제 저해제 0.1~5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

감마-세크레타제 저해제 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

감마-세크레타제 저해제 5~10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 3 : 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

감마-세크레타제 저해제 10~15%, 설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 75~80%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들었다. 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82%를 주입하여 감마-세크레타제 저해제를 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

감마-세크레타제 저해제(고형분 2.5%, 97.16%), 대추 엑기스(65 brix, 2.67%), 과체복합 추출물(고형분 70%, 0.12%), 비타민 C(0.02%), 판톤텐산칼슘 (0.02%), 감초 추출물(고형분 65%, 0.01%)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채쥬스의 제조

감마-세크레타제 저해제 0.5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4. 과일쥬스의 제조

감마-세크레타제 저해제 0.1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

Claims

감마-세크레타제 저해제를 유효성분으로 함유하는 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 감마-세크레타제 저해제는 DAPT (N-[(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glycine-1,1-dimethylethyl ester), L-685,458 ((5S)-(tert-butoxycarbonylamino)-6-phenyl-(4R)-hydroxy-(2R)-benzylhexanoyl)-L-leucy-L-phenylalaninamide), 하기 화학식 1의 RO4929097, DBZ (dibenzazepine; (S,S)-2-[2-(3,5-Difluorophenyl)acetylamino]-N-(5-methyl-6-oxo-6,7-dihydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl)propionamide), 하기 화학식 2의 Z-YIL-CHO, DAPM (N-[N-3,5-difluorophenacetyl]-L-alanyl-S-phenylglycine methyl ester), compound E ((S,S)-2-[2-(3,5-difluorophenyl)-acetylamino]-N-(1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-3-yl)-propionamide), CW (3,5-bis(4-nitrophenoxy)benzoic acid), 화학식 3의 begacestat(GSI-953), 화학식 4의 semagacestat(LY450139), 화학식 5의 BMS 299897 및 화학식 6의 MRK 560 (N-[cis-4-[(4-chlorophenyl)sulfonyl]-4-(2,5-difluorophenyl)cyclohexyl]-1,1,1-trifluoromethanesulfonamide)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>
제 1항에 있어서, 감마-세크레타제 저해제는 NICD(notch intracelluar domain)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
감마-세크레타제 저해제를 유효성분으로 함유하는 류마티스성 관절염의 예방용 식품 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 감마-세크레타제 저해제는 DAPT (N-[(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glycine-1,1-dimethylethyl ester), L-685,458 ((5S)-(tert-butoxycarbonylamino)-6-phenyl-(4R)-hydroxy-(2R)-benzylhexanoyl)-L-leucy-L-phenylalaninamide), 하기 화학식 1의 RO4929097, DBZ (dibenzazepine; (S,S)-2-[2-(3,5-Difluorophenyl)acetylamino]-N-(5-methyl-6-oxo-6,7-dihydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl)propionamide), 하기 화학식 2의 Z-YIL-CHO, DAPM (N-[N-3,5-difluorophenacetyl]-L-alanyl-S-phenylglycine methyl ester), compound E ((S,S)-2-[2-(3,5-difluorophenyl)-acetylamino]-N-(1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-3-yl)-propionamide), CW (3,5-bis(4-nitrophenoxy)benzoic acid), 화학식 3의 begacestat(GSI-953), 화학식 4의 semagacestat(LY450139), 화학식 5의 BMS 299897 및 화학식 6의 MRK 560 (N-[cis-4-[(4-chlorophenyl)sulfonyl]-4-(2,5-difluorophenyl)cyclohexyl]-1,1,1-trifluoromethanesulfonamide)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 류마티스성 관절염의 예방용 식품 조성물.
<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>
제 4항에 있어서, 감마-세크레타제 저해제는 NICD의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 류마티스성 관절염의 예방용 식품 조성물.