KR20120039328A - 가시오갈피에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머, 키트, 및 이들의 용도 - Google Patents

가시오갈피에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머, 키트, 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가시오갈피에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 가시오갈피의 DNA 다형성 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 가시오갈피 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있고 가시오갈피와 오갈피의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 오갈피에서 가시오갈피와는 다른 증폭산물을 보이므로 가시오갈피와 오갈피의 종구분에도 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 가시오갈피와 오갈피의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다.

Description

가시오갈피에서 유래된 ＳＳＲ 프라이머, 키트, 및 이들의 용도 {SSR primer and kits derived from Acanthopanax senticosus, and use of there}
본 발명은 가시오갈피(Acanthopanax senticosus)에서 분리한 SSR 프라이머, 키트 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 오갈피의 DNA 다형성 검출 방법에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류,동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 이용한 지문분석법 (fingerprinting)에는 RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs) 방법, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphic DNA) 방법, SSR (Simple Sequence Repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 SSR (microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, SSR 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요작물 및 소재배 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 한창 진행 중에 있다.
벼에서는 벼 게놈에 반복되는 SSR을 PCR 기술로 증폭하여 벼 품종의 유전자형을 동정하는 SSR 마커들이 개발되었다(대한민국 특허출원번호 제2001-34003호). 미국의 탕 (Tang) 박사팀은 879개의 SSR 마커들을 개발하여 해바라기의 유전자 지도를 발표한 바 있다 (Tang et al., Theor. Appl. Genet., 105: 1124-1136, 2002). 이외에도 보리, 콩 등에서 많은 SSR 마커들이 개발되었다. 그러나, 가시오갈피와 오갈피에서는 SSR 마커가 아직 국내에서 전혀 개발된 바 없으며, 외국에서도 이와 관련된 연구가 거의 이루어지지 않은 실정이다.
이에 본 발명자들은 가시오갈피와 오갈피의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 오갈피에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머쌍을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 목적은 오갈피속(Acanthopanax)의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 오갈피속(Acanthopanax)의 DNA 다형성 검출 방법 및 품종 동정 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍, DNA 중합효소 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 오갈피속(Acanthopanax)의 DNA 다형성 검출용 키트 및 오갈피속(Acanthopanax) 동정용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 가시오갈피 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있고 오갈피속(Acanthopanax)의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 오갈피속에서 가시오갈피와는 다른 증폭산물을 보이므로 가시오갈피와 오갈피의 종구분에도 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 오갈피속의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 가시오갈피로부터 유래된 SSR(Simple Sequence Repeat)을 이용하여 오갈피속(Acanthopanax)의 유전적 다형성을 특이적으로 분석할 수 있는 SSR 마커를 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 SSR은 초위성체(Microsatelite), 또는 Short Tandem Repeats (STRs)로 통용되기도 한다.
오갈피속에 대한 분류는 학자에 따라 차이는 있으나, 국내에 분포하는 종으로는 가시오갈피 (Acanthopanax senticosus), 오갈피 (Acanthopanax sessiliflrorum), 지리오갈피 (Acanthopanax divaricatus var. chiisanensis), 섬오갈피 (Acanthopanax gracilistylus var. gracilistylus), 당오갈피 (Acanthopanax sieboloianus) 등이 있으며, 상기에서 오갈피나 섬오갈피도 가시가 있어 가시오갈피로 오인할 가능성이 높은 품종이다.
본 발명에서는 비오틴-스트렙타비딘 포획(biotin-streptavidin capture; Dixit et al., Mol. Eco. Note, 5: 736-738) 방법으로 가시오갈피부터 SSR 마커를 개발하였다. 가시오갈피에서 분리된 SSR 마커는 본 발명에 의해 처음으로 제공되는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 SSR 마커는 다음과 같은 방법으로 개발되었다. 가시오갈피로부터 추출한 게놈 DNA를 제한효소로 처리해 DNA 단편을 제조한 후 AP11 및 AP12의 2개의 어댑터와 라이게이션 하였다.
라이게이션 산물을 비오틴이 표지된 SSR 탐침과 혼성화한 후 마그네틱 비드를 이용해 분리하였다. 이를 AP11 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭한 후 서열을 분석함으로써 가시오갈피의 SSR을 포함하고 있는 711개의 DNA단편을 수득하였다.
상기에서 수득한 DNA단편을 분석함으로써 4개 이상의 반복 유닛을 포함하고 있는 단편만을 선발하고 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 SSR을 증폭 할 수 있는 양방향 프라이머 190쌍을 디자인하였다. 상기 프라이머쌍을 사용하여 다양한 가시오갈피 품종 및 야생근연종들의 PCR을 통한 DNA 프로파일링을 수행함으로써 다형성 변이를 많이 나타내는 21쌍의 SSR 프라이머쌍을 선발하였다.
본 발명에서 제공하는 SSR 마커는 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 가진다. 바람직하게는 GB-ES-4(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-25(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-27(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-36(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-48 (서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-76(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-79(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-80(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-104(서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-109(서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-112(서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-124(서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-133(서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-138(서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-143(서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-146(서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-148(서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-159(서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-161(서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-175(서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍) 및 GB-ES-181(서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍)로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 및 이들에 의해 증폭되는 SSR에 존재하는 반복 모티브 (repeat motif), 증폭되는 SSR의 크기, TA(℃) 및 SSR이 존재하는 염색체 대립인자에 대한 정보를 하기 표 1에 기재하였다.
프라이머 명 서열 서열
번호		 반복 모티브 증폭산물의 크기(bp) TA 대립인자 No.
1 GB-ES-4 aF TACTTCTTTTGCTCTAGAAGGG 1 (AC)9 207 ~ 217 55 4
bR CGATATATAGAACAAATTCGGG 2
2 GB-ES-25 F GCAACTAAAGATGTTCAATCAA 3 (GT)13 237 ~ 287 55 8
R TAGAGCAGACAGAGTTTAGGGT 4
3 GB-ES-27 F AGAATCGAAGGAAATAGATGAA 5 (GA)6 203 ~ 213 55 4
R AATGATGTCGGAGCTAGTTATT 6
4 GB-ES-36 F GAAGCAGTTGGAGTAGAAGAAC 7 (TCC)TCCC(TCC)3 234 ~ 250 55 2
R GATGCAGAAATAGAAGAAGAGG 8
5 GB-ES-48 F GCTTTGGAGAATATTTTTATGC 9 (CT)17 199 ~ 211 55 4
R AATTCATGAACCCACCCTAC 10
6 GB-ES-76 F ACGAACTAAACATGTACCAACA 11 (GAAGGA)6 158 ~ 172 55 3
R CTACTTGTAAGAATTTTTCCCG 12
7 GB-ES-79 F ACCTATTTTACCATTCCTTGTG 13 (TTC)22 271 ~ 299 55 5
R TAGCACTCACTGACCAATACAT 14
8 GB-ES-80 F GAGAAGAGGAATTTGAGTGAAG 15 (AAC)4 199 ~ 202 55 3
R TTGTTGCTTCTGTTATTGTTGT 16
9 GB-ES-104 F GAGAGAGAAGGTAGAGATGGTG 17 (TTC)9 207 ~ 255 55 10
R TCTTCTTTTACGTGGTGAAAAT 18
10 GB-ES-109 F AGAAGAGAAAAGAGAGTGTGGA 19 (GT)9, (TC)13 204 ~ 222 55 8
R GATAAGGTGAAGGGAGTGATAA 20
11 GB-ES-112 F ATATAGGATAGGCATGACAAGG 21 (TC)8 254 ~ 314 55 3
R TCAATCGTAATGAAGACATGAT 22
12 GB-ES-124 F GCTAAAAAGCTCTGATCTTCA 23 (CA)18(GA)7 298 ~ 316 55 7
R TTGTTGCTTTATGTGAACTAGC 24
13 GB-ES-133 F TGATGAACACTTGCATACAATA 25 (TGC)9 300 ~ 306 55 2
R AAAGCTATGTTTCAGGGAAG 26
14 GB-ES-138 F ATTTGAAATGGATGTACCAACT 27 (TG)7 275 ~ 281 55 2
R CTCACCACAGCTTTCATTTAG 28
15 GB-ES-143 F GATGTGTTTGTGTTGGAAGTTA 29 (GCA)6 251 ~ 268 55 6
R ATGGTATGAAAATGGAGTGATT 30
16 GB-ES-146 F TATATTTCAGGAAGAGGTATGC 31 (TC)7, (CA)16 179 ~ 203 55 11
R CCCATTTGATCTTATCTTCACT 32
17 GB-ES-148 F ACTCTAATTGCTTCAACTCCAT 33 (TC)19 256 ~ 276 55 6
R GTCTTGTGTGTGATTCGTAAAG 34
18 GB-ES-159 F TCGAATAACAGAAGAGGAGAAT 35 (CCAGCA)3 161 ~ 167 55 2
R CATTTGTAGCATCTAACTGGTG 36
19 GB-ES-161 F CTTTCTGTTTGCTCACTCTGTA 37 (TG)13 272 ~ 290 55 7
R ATCTTTTCCAATTTCCTGACTA 38
20 GB-ES-175 F TACCACATACTGCAGTCCTTTA 39 (CT)13 244 ~ 266 55 10
R TCAATAGAGTGGAAACATGAGA 40
21 GB-ES-181 F AGTTGGCTACTAAACATTCCAT 41 (CA)11 260 ~ 274 55 5
R CTAATACCCAATAATGCCTAGC 42
상기 표 1에서 aF는 정방향 프라이머, bR는 역방향 프라이머를 의미한다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 가시오갈피와 오갈피에서 DNA 다형성을 검출하고 유전적 다양성을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머를 이용하여 가시오갈피와 오갈피의 유전자원을 효율적으로 평가 및 보존할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 가시오갈피와 오갈피의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다.
구체적으로 가시오갈피와 오갈피의 DNA 다형성 검출 방법은
(a) 가시오갈피와 오갈피로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol . Biol . Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al ., Nuc . Res ., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 가시오갈피와 오갈피에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl (Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성 (denaturation); 결합 (annealing); 및 증폭 (extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장 (elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 52-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에서 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 95℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분 30초를 36 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔 (agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔 (polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치 (ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 보다 바람직하게는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
아울러, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 가시오갈피의 품종 및 야생근연종 동정 방법을 제공한다.
구체적으로 가시오갈피의 품종 및 야생 근연종 동정 방법은
(a) 가시오갈피 및 대조군 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
(c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 각각의 크기별 분리 결과를 서로 비교하는 단계를 포함한다.
(a) 내지 (c) 단계의 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 상기에서 기재한 바와 같으며, 상기 (d) 단계에서 가시오갈피 및 대조군 품종에 대한 비교는 동일한 조합의 SSR 프라이머쌍에 대한 시료가 되는 가시오갈피와 오갈피와 대조군 품종의 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 SSR 프라이머쌍에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 가시오갈피와 대조군 품종의 결과와 모두 일치하면 시료가 되는 가시오갈피와 오갈피는 대조군 품종과 동일한 품종으로 동정할 수 있다. 이와 같은 품종의 동정 방법은 신규 유전자원 도입시 중복여부 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종의 동정이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
대조군 가시오갈피 품종에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 가시오갈피가 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 가시오갈피보다 이전에 수행되어 동정의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 가시오갈피에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 가시오갈피 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 적용될 수 있는 가시오갈피 (Acanthopanax senticosus)와 오갈피(Eleutherococcus sessiliflorus)는 국내외 품종 및 야생근연종에 해당된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 게놈 DNA 추출
품종 및 야생근연종 가시오갈피 (국립농업과학원 농업유전자원센터, 강원도농업기술원 보존번호 : GNKS010001)로부터 SDS를 이용한 방법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990)에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 이를 상세히 설명하면 다음과 같다. 가시오갈피 식물체로부터 약 1개월 정도의 신초 잎 조직을 0.5 g 채취하여 1.5 ml 튜브에 넣고 액체질소로 급냉시켰다. 이후, 즉시 플라스틱 막대로 잎을 곱게 마쇄하였다. 마쇄된 잎이 녹기 전에 추출 완충용액 (200 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 750μl를 첨가하고, 혼합액을 65℃에서 30분간 보관하였다. 여기에 동량의 페놀 (phenol):클로로포름 (chloroform):이소아밀알코올 (isoamylalchol) (25:24:1) 용액을 추가로 첨가한 후, 약 15분간 교반하였다. 이를 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 새 튜브에 옮겼다. 상기 튜브에 동량의 이소프로판올(-20℃)을 첨가하고, -20℃에서 1시간 보관하였다. 이후, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 버린 후 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척하였다. DNA를 건조시킨 후, 약 300μl의 RNase (50μg/ml)를 함유하는 TE 완충용액(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.4)을 첨가하여 충분히 녹인 후, 37℃에서 1시간 동안 보관하였다.
< 실시예 2> 어댑터와의 라이게이션( ligation )
상기 실시예 1에서 얻은 게놈 DNA 500 ng을 각 제한효소 제조사의 지침에 따라 EcoRV, DraI, SmaI, PvuI, AluI, HaeIII 및 RsaI로 절단하였다. 절단된 DNA를 1.2% 아가로스 겔에 전기영동한 후, 약 300-1500 bp 크기의 DNA 단편만을 겔로부터 일루션(elution)하여 수득하였다. 이후, 수득된 DNA 단편을 2개의 어댑터(adapter; AP-11 및 AP-12, 각 50 ng)와 T4 DNA 라이게이즈(ligase; Promega, 미국)를 이용하여 12℃에서 하룻밤 동안 라이게이션시켰다. 이 때 라이게이션 효율을 높이기 위해 5'말단이 인산화된 AP-12 어댑터를 사용하였으며, 라이게이션시의 반응용액의 조성은 다음과 같다: 1X 라이게이션 버퍼 (Promega, 미국), 50 ng AP11 어댑터, 50 ng AP12 어댑터, 150 ng DNA 단편, 3 Unit T4 DNA 라이게이즈 (Promega, 미국).
어댑터 명 염기서열 서열번호
AP-11 5'-CTCTTGCTTAGATCTGGACTA-3' 43
AP-12 5'-TAGTCCAGATCTAAGCAAGAG-3' 44
< 실시예 3> SSR을 포함하고 있는 DNA 단편의 선발 및 분리
<3-1> 마그네틱 비드 준비
마그네틱 비드 (magnetic bead; SA-PMPs, Promega, 미국; 1 mg/ml) 0.6 ml를 마그네틱 분리기(magnetic stand; Promega, 미국)로 수집한 후 용액을 제거하였다. 여기에 0.5x SSC (Saline-Sodium Citrate) 버퍼 0.6 ml를 넣어 세척을 하고 다시 마그네틱 분리기로 수집한 후 용액을 제거하였다. 0.5x SSC 버퍼를 이용한 세척은 3회 반복하여 실시하였다. 세척한 마그네틱 비드에 0.5x SSC 버퍼 100μl를 넣은 후 30분 이내에 사용하였다.
<3-2> 혼성화
상기 실시예 2에서 제조한 라이게이션 산물에 증류수를 넣어 500μl 가 되도록 한 후 65℃에서 10분간 변성(denature)시켰다. 여기에 바로 비오틴 (biotin)이 표지된 SSR 탐침 1.5μl(20 ng)와 20x SSC 버퍼 13μl를 넣고 상온에서 10분간 방치하여 결합을 유도하였다. 혼성화에 사용된 8개의 SSR 탐침은 하기 표 3에 기재하였으며, SSR 탐침은 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라 비오틴으로 표지하였다.
서열 번호
Biotin-(GA)20 45
Biotin-(CA)20 46
Biotin-(AT)20 47
Biotin-(GC)20 48
Biotin-(AGC)15 49
Biotin-(GGC)15 50
Biotin-(AAG)15 51
Biotin-(AGG)15 52
혼성화 반응을 통하여 게놈 DNA 단편 중 상기 반복염기서열을 가지고 있는 DNA 단편들은 비오틴이 표지된 SSR 탐침들과 상보적 결합을 할 것이고, 이를 SSR 탐침-템플릿 (template) 혼성체 (hybrid)라고 한다.
<3-3> 템플릿의 분리
<3-1>에서 제조한 마그네틱 비드 용액을 <3-2>에서의 SSR 탐침-템플릿 혼성체 용액에 넣고 상온에서 10분간 방치시킨다. 반응용액에서 마그네틱 분리기로 SSR 탐침-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 수집하고 상등액을 제거하였다. 상기 SSR 탐침-템플릿 혼성체가 결합된 마그네틱 비드를 0.1x SSC 300μl로 4회 세척한 후 증류수 50μl를 넣고 90℃에서 5분간 가열하여 하기 템플릿을 분리하였다.
<3-4> PCR 반응
<3-3>에서 분리한 템플릿에 대해 AP-11 어댑터를 프라이머로 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 혼합물(20μl)의 조성은 다음과 같다: 250 ng 어댑터-라이게이션된 DNA, 10 pmol AP11 프라이머, 2 mM dNTP, 2 units Taq DNA 중합효소, 5μl 10×완충용액. PCR 반응은 72℃에서 2분, 94℃에서 3분 동안 가열한 후 94℃에서 30초; 56℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 24 싸이클 (cycle)로 반복 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분의 조건으로 수행하였다.
이와 같은 방법으로 본 발명에서는 SSR을 함유하고 있는 711개의 DNA 단편을 분리하였다.
< 실시예 4> 분리된 DNA 단편의 서열분석 및 프라이머 디자인
상기 실시예 3에서 분리된 SSR을 함유하고 있는 DNA 단편들을 pGEM T-easy vector 벡터 (Promega, 미국)에 클로닝하여 이들의 서열을 분석하였다. 염기서열 분석은 (주)솔젠트에 의뢰하여 수행하였다. 분석된 서열을 기초로 하여 4개 이상의 반복 유닛 (repeat unit)을 포함하고 있는 단편만을 선발하였다. 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 하여 SSR을 증폭할 수 있는 양 방향의 프라이머를 디자인하였다. 총 190쌍의 프라이머쌍을 디자인하였으며 대량 DNA profiling 검정을 위하여 각각의 정방향프라이머 5'끝에 M13 (TGTAAAACGACGGCCAGT) 염기서열을 붙였다.(결과미도시).
< 실시예 5> SSR 마커의 선발
상기 실시예 4에서 디자인된 프라이머쌍 중에서 다양한 가시오갈피 품종 및 야생근연종에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머 조합을 선발하기 위하여, 하기 표 4에 기재된 17점의 품종 및 야생근연종 가시오갈피에 대하여 DNA 프로파일링 (profiling) 분석을 수행하였으며 비슷한 종인 오갈피에와의 종구분 적용가능성을 확인하기 위하여 5점의 야생근연종 오갈피에 대하여 PCR을 통한 DNA 프로파일링 (profiling) 분석을 수행하였다. 표 4에는 분석에 사용된 오갈피의 종류가 나타나 있다.
일련번호 보존번호 기탁기관 나라/수집지 비고
1 GNKS030193 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/정선 가시오갈피
2 GNKS030256 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/품종 가시오갈피
3 GNKS030372 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/품종 가시오갈피
4 GNKS030106 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/정선 가시오갈피
5 GNKS090003 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/방태산 가시오갈피
6 GNKS090007 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/방태산 가시오갈피
7 GNKS090009 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/방태산 가시오갈피
8 GNKS120002 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/태백산 가시오갈피
9 GNKS120004 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/태백산 가시오갈피
10 GNKS120005 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/태백산 가시오갈피
11 GNKS180001 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/금당산 가시오갈피
12 GNKS210006 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/홍천 가시오갈피
13 GNKS800004 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/호 시 가시오갈피
14 GNKS800009 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/호 시 가시오갈피
15 GNKS800014 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/호 시 가시오갈피
16 GNKS800015 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/호 시 가시오갈피
17 GNKS810003 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 중국 흑룡강성 가시오갈피
18 GNOG220010-1 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/영월 오갈피
19 GNOG220010-2 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/영월 오갈피
20 GNOG220010-3 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/영월 오갈피
21 GNOG220010-4 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/영월 오갈피
22 GNOG220010-5 농진청,농업유전자원센터, 강원도원 대한민국/영월 오갈피
각각의 PCR 반응 혼합물 (20μl)의 조성은 다음과 같다: 실시예 1의 방법에 의해 분리한 가시오갈피 주형 DNA 40 ng, 정방향 프라이머 0.2 μM, 역방향 프라이머 0.6 μM, 형광물질이 표지된 M13 프라이머(TGTAAAACGACGGCCAGT) 0.6 μM, 1X PCR 반응액 (10 mM Tris-HCl (pH 8.8), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1 unit DNA 중합효소. PCR 반응은 94℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 각 프라이머의 TA(표 1 참조)에 해당하는 온도에서 30초; 및 72℃ 에서 45초의 조건으로 35회 반복한 후, 다시 94℃에서 30초; 53℃에서 45초; 및 72℃에서 45초의 조건으로 15회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 15분의 조건으로 수행하였다.
각기 다른 형광물질로 증폭된 PCR 산물 단편의 크기를 분석하기 위해 자동 염기서열 분석 장치 (ABI 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였다. 분석을 위하여, PCR 산물 1.5 , Hi-di 포름아마이드 (formamide) 9.2μl, 내부 크기 표준시약 (Internal Size Standard; Genescan-500 ROX) 0.3μl를 혼합한 후 94℃에서 3분간 변성하여 분석에 사용하였다.
그 결과, 국내 및 국외에서 수집된 가시오갈피와 오갈피에서 다형성을 나타내는 SSR 프라이머쌍 21쌍을 확인하여 GB-ES-4(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-25(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-27(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-36(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-48 (서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-76(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-79(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-80(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-104(서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-109(서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-112(서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-124(서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-133(서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-138(서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-143(서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-146(서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-148(서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-159(서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-161(서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍), GB-ES-175(서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍) 및 GB-ES-181(서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍)을 선별하였다 (표 1 참조). 상기 21쌍의 프라이머에 의해 증폭된 PCR 단편의 각각의 크기는 다음 표 5와 같다.
프라이머쌍
일련번호		 GB-ES-4 GB-ES-25 GB-ES-27 GB-ES-159 GB-ES-36 GB-ES-48 GB-ES-175 GB-ES-181
1 209 249/271 203 161 234 199 244/252 266
2 217 249/271 203 161 234 - 244/262 -
3 215 249/271 203 161 234 - 250/254 266/268
4 215 249 - 161 234 199 250/254 266/268
5 209 249 209 161 234 199 250/266 260/266
6 209 249 203 161 234 - 250/266 260/266
7 209 249 203 161 234 199 250/266 260/266
8 209 - 203 161 234 199 244/252 266
9 209 249/287 203 161 234 - 244/252 266
10 209 249/273 203 161 234 199 244/252 266
11 209 249/281 203 161 234 - 250/256 266
12 209/217 249/269 203 161 234 199 250 266/268
13 217 249/269 203 161 234 199 250/252 266
14 217 249/273 203 161 234 - 250/252 266/268
15 209 249/269 203 161 234 199 252 268
16 215 249/273 203 161 234 199 250/258 260/268
17 213 249/273 - 161 234 199 244/250 266/268
18 209 253 209 167 250 211 260/264 264
19 209 237/253 209/213 167 250 209 260/262 264
20 209 - 209/211 167 250 203 260/262 266/274
21 209 271 209/211 167 250 203 260/262 266/274
22 209 237 213 167 250 - 260/262 274
프라이머쌍
일련번호		 GB-ES-76 GB-ES-79 GB-ES-80 GB-ES-104 GB-ES-109 GB-ES-112 GB-ES-124 GB-ES-133
1 170 271 202 216 204/210 314 298/302 300/306
2 170 - 202 216 212 304/314 302/310 300/306
3 170 271 202 219 212 314 298 300/306
4 - 271 202 219 212 314 298 300/306
5 170 271/299 202 - - 304 302/304 306
6 170 271/299 202 219 208/214 304 302/304 306
7 170 271/299 202 219 208/214 304 302/304 306
8 170 271/299 202 - - 314 298/300 300/306
9 170 271/299 202 216/219 204/212 314 298/300 300/306
10 170 - 202 216/219 204/212 314 298/300 300/306
11 - 271 - - - 314 302/310 300/306
12 - 271 202 207/216 210/222 314 298/302 300/306
13 170 271/299 - 216 204/212 314 298/310 300/306
14 170 271/299 202 207/216 212/214 314 302 300/306
15 170 271/299 - 207/216 212 314 298/310 300/306
16 170 271/299 202 207/219 210 314 302/304 300/306
17 170 271/299 202 216 204 314 310 300/306
18 158 287/296 199 249/255 210 254 308 306
19 164/170 287 190 243/246 210 254 - 306
20 158/170 287/296 199 237/264 202/210 254 308/316 306
21 158/170 287/296 199 - 202/210 254 308/316 306
22 170 290/296 202 237/240 212/218 254 308 306
프라이머쌍
일련번호		 GB-ES-138 GB-ES-161 GB-ES-143 GB-ES-146 GB-ES-148
1 275 272/288 251/254 179/187 258
2 275 272/274 251/254 179/185 256/258
3 275 272/278 251 183/185 258
4 275 272/278 251 183/185 258
5 275 284/288 251/254 183/191 258
6 275 284/288 251/254 183/191 258
7 275 284/288 251/254 183/191 258
8 275 272 251 185/187 258
9 275 272 251 185/187 258
10 275 272 251 185/187 258
11 275 272 251 185/187 256/258
12 275 288/292 251/254 183/185 258
13 - 272/288 251/254 183/187 258
14 275 272 251/254 179/183 258
15 - 272 251 183/185 258
16 275 272 251/254 183/189 258
17 275 284/288 251/254 179/183 258
18 281 280/290 266/271 201/219 256/276
19 281 280/290 263/266 197/203 264
20 281 284/290 266/268 203 266
21 281 284/290 266/268 203 266
22 281 284 266/268 211/219 266/274
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 가시오갈피에서 처음으로 SSR 마커를 개발하였다. 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 가시오갈피의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 가시오갈피의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 가시오갈피 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 오갈피에서 가시오갈피와는 다른 증폭산물을 보이므로 가시오갈피와 오갈피의 종구분 뿐만 아니라 각 종 내의 품종 구분에도 이용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> SSR primer and kits derived from Acanthopanax senticosus, and use of there <130> NPF18239 <160> 42 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 1 tacttctttt gctctagaag gg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 2 cgatatatag aacaaattcg gg 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 3 gcaactaaag atgttcaatc aa 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 4 tagagcagac agagtttagg gt 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 5 agaatcgaag gaaatagatg aa 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 6 aatgatgtcg gagctagtta tt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 7 gaagcagttg gagtagaaga ac 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 8 gatgcagaaa tagaagaaga gg 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 9 gctttggaga atatttttat gc 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 10 aattcatgaa cccaccctac 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 11 acgaactaaa catgtaccaa ca 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 12 ctacttgtaa gaatttttcc cg 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 13 acctatttta ccattccttg tg 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 14 tagcactcac tgaccaatac at 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 15 gagaagagga atttgagtga ag 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 16 ttgttgcttc tgttattgtt gt 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 17 gagagagaag gtagagatgg tg 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 18 tcttctttta cgtggtgaaa at 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 19 agaagagaaa agagagtgtg ga 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 20 gataaggtga agggagtgat aa 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 21 atataggata ggcatgacaa gg 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 22 tcaatcgtaa tgaagacatg at 22 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 23 gctaaaaagc tctgatcttc a 21 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 24 ttgttgcttt atgtgaacta gc 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 25 tgatgaacac ttgcatacaa ta 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 26 aaagctatgt ttcagggaag 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 27 atttgaaatg gatgtaccaa ct 22 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 28 ctcaccacag ctttcattta g 21 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 29 gatgtgtttg tgttggaagt ta 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 30 atggtatgaa aatggagtga tt 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 31 tatatttcag gaagaggtat gc 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 32 cccatttgat cttatcttca ct 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 33 actctaattg cttcaactcc at 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 34 gtcttgtgtg tgattcgtaa ag 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 35 tcgaataaca gaagaggaga at 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 36 catttgtagc atctaactgg tg 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 37 ctttctgttt gctcactctg ta 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 38 atcttttcca atttcctgac ta 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 39 taccacatac tgcagtcctt ta 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 40 tcaatagagt ggaaacatga ga 22 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 41 agttggctac taaacattcc at 22 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Acanthopanax senticosus <400> 42 ctaataccca ataatgccta gc 22

Claims (9)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR (Simple Sequence Repeat) 프라이머쌍.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42로 표시되는 염기서열의 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 SSR 프라이머 쌍.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 오갈피속(Acanthopanax) 식물체의 품종을 구분하기 위한 것임을 특징으로 하는 SSR (Simple Sequence Repeat) 프라이머쌍.
  4. 제1항에 있어서, 상기 염기서열은 가시오갈피(Acanthopanax senticosus)로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 SSR 프라이머쌍.
  5. (a) 오갈피속(Acanthopanax) 또는 대조군 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 오갈피속(Acanthopanax)의 DNA 다형성 검출 방법.
  6. (a) 오갈피속(Acanthopanax) 또는 대조군 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
    (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
    (d) 상기 PCT 산물의 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 오갈피속(Acanthopanax)의 품종 동정 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 오갈피속(Acanthopanax)의 품종 동정 방법은 가시오갈피와 오갈피 품종의 동정 및 야생근연종 동정에 사용되는 것을 특징으로 하는 오갈피속(Acanthopanax)의 품종 동정 방법.
  8. 제1항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 오갈피속(Acanthopanax)의 DNA 다형성 검출용 키트.
  9. 제1항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 오갈피속(Acanthopanax)의 품종 동정용 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108754018A (zh) * 2018-07-27 2018-11-06 大连民族大学 一种刺五加目的基因ssr分子标记的筛选方法及应用

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