KR20120022311A

KR20120022311A - 벼 유래의 Ｍｙｂ４ 유전자의 과발현에 의한 내냉성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체

Info

Publication number: KR20120022311A
Application number: KR1020100085786A
Authority: KR
Inventors: 윤성중; 박명렬; 지 데 로스 레이예스 베닐도
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2010-09-02
Filing date: 2010-09-02
Publication date: 2012-03-12
Also published as: KR101250870B1

Abstract

본 발명은 벼 유래의 Myb4 유전자의 과발현에 의한 내냉성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래의 Myb4 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에서 과발현시키는 단계를 포함하는 내냉성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 내냉성이 증진된 형질전환 식물체 및 상기 Myb4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 내냉성 증진용 조성물에 관한 것이다.

Description

벼 유래의 Ｍｙｂ４ 유전자의 과발현에 의한 내냉성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic plant improving cold resistance by Oryza sativa Myb4 overexpression and the plant thereof}

우리나라 쌀 농사의 노동과 생산비 절감을 통한 국제적 경쟁력 강화 필요성이 대두됨에 따라 벼농사의 기계화 및 직파재배의 확대를 통한 노동력 부족현상의 완화와 생산비 절감을 위한 노력이 진행되고 있다. 특히, 이앙재배에 요구되는 육묘의 노력을 경감하여 생산비를 절감할 수 있는 벼 직파재배 기술은 1990년 보급되기 시작하여 1994년부터 본격적으로 확대되었고 2009년에는 3만 1천ha에 이르렀다. 그러나 직파재배시 저온에 의한 초기 생육의 저하는 직파재배의 안정성을 저하시키고 있다. 따라서 직파재배의 안정성을 향상시키기 위해서는 벼의 발아와 생육 초기의 유묘상태의 내냉성의 증진이 요구되어진다.

벼의 내냉성 관련 형질은 생육시기에 따라 저온에 대한 반응이 다르며(Choi and Lee, (1976) Korean J. Crop Sci. 21(2): 203-210) 내냉성과 관련된 주요형질들의 저온반응도 품종에 따라 다양하므로(Choi et al., (1985) Res. Rept. RDA(C). 27(1): 101-108) 내냉성에 대한 연구나 내냉성 품종 육성에 어려움이 수반된다. 결국, 벼의 내냉성 관련형질은 polygene으로 구성되어 있는 양적형질이므로 생육시기에 따른 반응과 표현형을 중심으로 유전양상을 연구하여 내냉성 품종 육성을 위한 기초자료로 활용해야 한다.

내냉성에 관한 연구는 교배육종에 의한 내냉성 품종개량과 스트레스 관련 형질의 내냉성과의 연관 기작을 구명하는 연구가 많이 보고되었다. 그러나 내냉성은 양적형질로서 다수의 유전자가 관여하여 표현되는 특성이므로 내냉성 유전기작을 구명하기 위해서는 유전체 수준의 유전자 발현 및 조절 연구가 필수적이다.

애기장대는 저온에 대해 순응 능력이 있기 때문에 저온 스트레스 반응기작의 모델식물로 많이 연구되고 있으며(Srinivasasainagendra et al., (2008) Plant Physiol. 147:1004-10161), 내냉성 관련 개별유전자에 대한 연구뿐만 아니라 하위의 유전자 발현조절 및 조절네트워크에 대한 연구도 많이 보고되고 있다(Ma and Bohnert, (2007) Genome Biol 8:R49). 그러나 애기장대는 쌍떡잎 식물이며 기본적으로 저온에 대한 저항성이 강한 식물이고 벼는 외떡잎 식물이며 저온에 대해 민감한 식물이기 때문에 애기장대의 내냉성 관련 연구결과를 벼에 직접 활용하기에는 어려운 점이 많이 존재한다. 현재 벼의 저온 스트레스 저항성에 관련된 연구가 활발하게 진행되고 있으며 저온에 의한 유전체 수준의 유전자의 발현의 특성 및 발현조절 네트워크에 대한 연구결과가 활발하게 보고되고 있다(Cheng et al., (2007) BMC Genomics. 8:e175).

애기장대에서 OsMyb4의 과발현에 의해 PAL2 (phenylalanine ammonia lyase), COR15a, COR78와 같은 유전자가 조절되는 것으로 보고되고 있지만(Pasquali et al., (2008) Cell Reports. 27(10):1677-1686) 벼에서의 OsMyb4의 기능뿐만 아니라 전사조절요소 유전자로서 OsMyb4의 발현에 의해 조절되는 저온 저항성에 관련 유전자 조절네트워크에 대해서는 보고된 적이 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4 단백질을 코딩하는 유전자를 벼에 형질전환하여 내냉성이 증진된 벼 계통을 개발하였고, 이를 통하여 벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4 유전자를 이용하여 식물체의 내냉성을 향상시키는 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 Myb4 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에서 과발현시키는 단계를 포함하는 내냉성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 내냉성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Myb4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 내냉성이 증진된 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Myb4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 내냉성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 벼에서 분리한 OsMyb4의 과발현 식물체가 내냉성 증진에 효과가 있음을 확인함으로써, 저온지역에서 재배 가능한 벼 개발에 활용이 가능하고 내냉성이 증진된 벼를 공급함으로써 벼 재배지역 확대와 냉해발생에 대한 예방력을 높여 냉해에 따른 벼 품질저화와 생산량저하를 방지할 수 있다 또한, 본 발명을 이용하여 벼 이외의 식물체에서도 내냉성이 증가한 품종을 개발할 수 있다.

도 1은 니폰바레(Nipponbare)에 저온(10℃, A) 및 과산화수소(H₂O₂, B)를 처리하였을 때 OsMyb4의 발현변화를 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)를 이용하여 조사한 결과이다.
도 2는 벼의 OsMyb4의 염기서열과 염기서열로부터 연역된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 OsMyb4의 발현 구조를 포함하는 식물 유전자 발현용 재조합체(pMG540)의 부분 구성도이다. Hyg , Hygromycin phosphotransferase gene: OsMyb4, Oryza sativa Myb4 transcription factor gene: Tnos, polyadenylation signal of the nopaline synthase gene: p35S, 35S promoter: t7', polyadenylation signal of the gene 7 of pTiA6: RB, T-DNA right border: LB, T-DNA left border.
도 4는 무균발아 배유 캘러스(callus)에 OsMyb4 유전자 식물 발현용 재조합체 함유 아그로박테리움과의 공동배양 후, 항생제 하이그로마이신이 함유된 배지에서 유전자가 도입된 세포의 선발과 선발된 세포로부터의 신초와 뿌리의 분화를 유도하여 완전한 식물체로 발달시켜 온실에 순화시키는 과정이다. A: 캘러스 유도, B: 재분화, C: 온실순화.
도 5는 OsMyb4의 삽입을 확인하기 위한 서던 블럿 분석용 탐침 모식도(A)와 재분화된 T₀ 세대 계통(M1, M2, M3, M4, M5, M6) 식물체로부터 추출한 게놈 DNA상에 OsMyb4의 삽입을 서던 블럿 분석을 통해 확인한 결과(B)이다. 레인 N: 형질전환과정을 거치지 않은 대조 식물체, 레인 1: M1 , 레인 2: M2, 레인 3: M3, 레인 4: M4, 레인 5: M5, 레인 6: M6.
도 6은 니폰바레와 T₀ 세대 형질전환 계통(M2, M4, M5, M6)에서의 OsMyb4 발현 변화를 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)를 이용하여 조사한 결과이다.
도 7은 니폰바레와 T₀ 세대 계통(M2, M4, M5, M6) 식물체에 상온(28℃)과 저온(10℃), 염(200mM NaCl) 처리시 항산화효소인 퍼옥시데이즈의 활성을 잎과 뿌리로 분리하여 조사한 결과이다.
도 8은 니폰바레와 T₀ 세대 계통(M2, M4, M5, M6)의 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능을 상온(28℃)과 저온(10℃), 염(200mM NaCl) 처리한 후, 잎과 뿌리로 분리하여 조사한 결과이다.
도 9는 니폰바레와 IR64 형질전환 T₀ 세대 계통(M2, M4, M5, M6) 종자의 상온(28℃, A)과 저온(13℃, B) 처리에 따른 발아율을 조사한 결과이다.
도 10은 니폰바레와 IR64 형질전환 T₀ 세대 계통(M2, M4, M5, M6)에서 4엽기 유묘의 상온(28℃, A)과 저온(10℃, B) 처리에 따른 전해질 누출율을 조사한 결과이다.
도 11은 벼 식물체 내에서 OsMyb4의 과발현에 의해 유도되는 유전자들의 특성를 분석하기 위해 OsMyb4 전이유전자의 도입 및 발현증가가 확인된 M2 또는 M6 계통의 전체 전사체를 탐침으로 이용하여 유전자 미세배열 분석을 실시한 결과이다. 레인 H₂O₂: 니폰바레에 과산화수소(4mM) 처리했을 때 유도되는 것으로 알려진 유전자와의 상동성, 레인 Cold: 니폰바레에 저온(10℃) 처리했을 때 유도되는 것으로 알려진 유전자와의 상동성.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 Myb4 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에서 과발현시키는 단계를 포함하는 내냉성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 형질전환 식물체의 제조방법에서, 바람직한 내냉성의 온도 범위는 4~15℃이고, 더욱 바람직하게는 8~12℃이고, 더 더욱 바람직하게는 10℃이다.

본 발명에 따른 Myb4 단백질의 범위는 벼(Oryza sativa)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 Myb4 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시켰을 경우 식물의 내냉성을 증진시키는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 Myb4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 Myb4 유전자는 과발현시켰을 경우 식물의 내냉성을 증진시키는 특징이 있으며, 서열번호 1의 염기서열은 벼(Oryza sativa) 유래의 Myb4 유전자를 나타내는 염기서열이다. Myb4 유전자는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물체에서 Myb4 유전자를 과발현시키는 방법으로는 상기 유전자를 포함하고 있는 식물체 또는 상기 유전자를 포함하고 있지 않은 식물체 내로 상기 유전자를 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기에서 "유전자의 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 상기 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 상기 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 바이러스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 외피 단백질 프로모터를 들 수 있다. 또한, 단자엽 식물이나 목본식물체에서 Myb4 유전자를 과발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein et al., 1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물이 될 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물이다. 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 옥수수, 보리, 밀, 벼, 귀리, 호밀 및 사탕수수 등의 식물이 있다. 상기 식물체는 바람직하게는 벼(Oryza sativa)이다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래의 Myb4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 내냉성이 증진된 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 벼(Oryza sativa) 유래의 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 포함하는, 식물체의 내냉성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 서열번호 1의 염기서열은 벼 유래의 Myb4 유전자를 나타내는 염기서열이다. 본 발명의 조성물에서, 상기 Myb4 유전자는 염기서열에서 특정 염기서열의 삽입, 치환, 결실된 것을 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4의 발현양상 조사 및 유전자 분리

(제1단계) 저온과 과산화수소 처리에 따른 벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4의 발현양상 조사

벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4의 저온에 대한 반응을 조사하기 위해 니폰바레(Nipponbare)에 저온(10℃)을 0.5, 2, 6, 12, 24시간 처리하였으며, 스트레스에 의해 발생하는 활성산소종에 대한 반응을 확인하기 위해 과산화수소(4mM)를 3, 6, 12, 18시간 처리하였다. 처리된 각각의 시험재료에서 Trizol reagent(Invitrogen, USA)를 이용하여 총 RNA를 분리한 뒤, 분리된 총 RNA를 이용하여 합성한 cDNA(cDNA synthesis kit, Takara, Japan)와 OsMyb4의 발현 특이적 프라이머 (정방향: 5'-ccaaggaggaggacaccatc-3'(서열번호 3), 역방향: 5'-gcatcgaggcgcttcttgagg-3'(서열번호 4))를 이용하여 실시간 PCR(iQ^TM5 multicolor real-time PCR detection system, Biorad,USA)을 실시하였다. 실시간 PCR에 의해 확인된 threshold cycle(Ct) 값을 활용하여 대조구(무처리구)에 상대적인 발현양을 조사하였다.

(제2단계) 벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4의 분리 및 분리한 유전자를 식물 유전자 발현용 운반체인 pCambia1305.1에 삽입하여 유전자 재조합체(pMG540) 작성

OsMyb4의 특성과 기능을 확인하기 위해 생물학적 정보를 토대로 OsMyb4 특이적 증폭 프라이머 (정방향: 5'-gaactagtacaatggggagggct-3'(서열번호 5), 역방향: 5'-ctctcacgtgctctagatctgc-3'(서열번호 6))를 합성하였다. 합성된 프라이머와 벼의 총 RNA에서 합성된 cDNA(cDNA synthesis kit, Takara, Japan)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR, PTC-200, Biored, USA)으로 OsMyb4 cDNA를 증폭하였다. 증폭된 cDNA를 염기서열 분석용 운반체 pGEM T-easy(Promega, USA)에 재조합한 후, 염기서열 자동분석기(모델 ABI 3730xl, Macrogen사)로 염기서열을 결정하였다.

도 1에서 보는 바와 같이 OsMyb4는 저온과 과산화수소 처리 초기에 모두 발현이 증가하였다가 6시간 이후에 감소하였지만, 저온 처리시 처리 24시간에 다시 증가하여 발현의 최고점에 도달하였다. 분리된 유전자는 총 819개의 염기서열과 판독틀에 맞는 257개의 아미노산으로 구성되어있다(도 2). 도 1의 결과를 통해 OsMyb4는 벼에서 저온 및 과산화수소 스트레스에 의해 초기에 발현이 유도됨을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4의 벼 세포내 도입을 통한 형질전환 계통 개발

(제1단계) 벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4의 식물 유전자 발현용 운반체인 pCambia1305.1에 삽입하여 유전자 재조합체(pMG540) 작성

분리된 OsMyb4의 제한효소 자리를 분석하여 유전자가 정상적으로 발현되도록 전체 판독틀이 포함되는 단편을 만들어 pCambia 1305.1에 삽입하여 형질전환용 유전자 재조합체(pMG540)를 작성하였다(도 3).

(제2단계) 벼 세포내로 pMG540을 도입한 후, pMG540이 도입된 세포의 선발 및 식물체 재분화

냉해동방법(freezing-thawing, An et al., (1988) Plant Molecular Biology Manual A3: 1-19. (Gelvin., S.B., Schilperoort, R., and Verma, D. P., Eds.), Kluwer Academic Pub., The Netherlands)을 이용하여 상기 제1단계에서 제작한 pMG540를 아그로박테리움 투메파시엔스 AGL 1에 도입하고, 카나마이신 배지에서 pMG540이 도입된 균주를 선발하였다.

pMG540이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스 AGL 1을 50mg/L 카나마이신이 포함된 YEP(1% 효모 추출물, 1% 펩톤, 0.5% NaCl) 액체배지에 접종한 다음 28℃, 암상태에서 48시간 이상 250rpm으로 진탕 배양하였다. 아그로박테리움 배양액의 OD₆₀₀가 0.6일 때 배양액을 AAM 액체 배지에 10배 희석하였고 희석액을 이용하여 지름이 1-2mm 크기인 캘러스(callus)를 10분간 접종하였다. 아그로박테리움을 접종한 캘러스(callus)는 2,4-D(2㎎/L), 세포탁심(cefotaxime, 250mg/L), 하이그로마이신(40mg/L)이 첨가된 N6 기본배지에서 1차 선발한 캘러스(callus)를 다시 2,4-D(2㎎/L), 세포탁심(cefotaxime, 250mg/L), 하이그로마이신(40mg/L), BA(0.5mg/L)가 첨가된 N6 기본배지에서 2차 선발하였다. 2차 선발배지에서 분화된 신초를 NAA(0.1mg/L), 케네틴(2.0mg/L), 세포탁심(125mg/L)이 첨가된 MS 기본배지에 이식하여 발근을 유도하여 식물체로 육성하였다(도 4).

(제3단계) 벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4가 형질전환된 식물체 내의 전이유전자의 도입 및 발현 확인

T₀세대 재분화 계통내의 전이유전자 도입을 확인하기 위해 서던 블럿을 실시하였다. OsMyb4가 벼에서 유래되었기 때문에 OsMyb4 특이적 탐침과 p35S 프로모터 특이적 탐침을 준비하였다. 각 탐침별 10ug씩 각 식물 시험재료에서 게놈 DNA 20ug을 추출한 후, Xba I 제한효소로 완전히 제한하여 분석에 이용하였다.

전이유전자 발현을 확인하기 위해 형질전환이 확인된 계통(M2, M4, M5, M6)과 니폰바레(10℃, 28℃)로부터 총 RNA를 추출하였으며, 실시예 1의 제1단계에서 실시한 실시간 PCR 방법과 동일한 방법으로 OsMyb4의 발현변화를 조사하였다.

결과는 도 3, 4, 5 및 6을 통해 확인할 수 있다. 하이그로마이신 항생제 배지에서 선발 및 재분화된 유식물체를 토양에 이식하여 정상적으로 성장 발달시켜 118계통의 T₀세대 식물체를 획득하였다. 서던 블럿 분석방법을 이용하여 전이유전자의 삽입을 확인한 계통(M1, M2, M3, M4, M5, M6)중 M1을 제외한 5개 계통에서 전이유전자 삽입을 확인하였다(도 5). 이와 같은 방법으로 형질전환 계통 총 118개 중 106개 계통이 OsMyb4가 삽입되었음을 확인하였다. OsMyb4가 벼에서 유래되었기 때문에 OsMyb4 특이적 탐침에 의해서 유사형의 유전자들이 다량 탐침 되었지만, p35S 프로모터 특이적 탐침을 통해 삽입이 확인된 계통에서는 단일사본의 전이유전자가 삽입되었음을 확인할 수 있었다. 전이유전자의 삽입이 확인된 M2, M4, M5, M6 형질전환 계통의 전이유전자 발현을 확인한 결과 선발된 형질전환 계통 모두에서 OsMyb4가 강하게 발현됨을 확인하였고 M2와 M6계통은 40배 이상 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(도 6).

실시예 3. 벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4의 삽입이 확인된 형질전환 계통 벼 식물체의 내냉성 분석 및 OsMyb4의 과발현에 의해 유도되는 유전자와 그 유전자의 특성 분석

(제1단계) 벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4의 삽입이 확인된 형질전환 계통 벼의 내냉성 분석

형질전환 계통(M2, M4, M5, M6)의 저온에 대한 특성을 조사하기 위해 퍼옥시데이즈 활성, DPPH 라디칼 소거능, 종자의 저온 발아율, 저온 스트레스에 대한 전해질 누출율을 조사하였다.

스트레스에 의해 발생되는 활성산소종을 소거하는 것으로 알려진 항산화 효소중 하나인 퍼옥시데이즈 활성을 측정하기 위해 상온(28℃)과 저온(10℃), 염(200mM NaCl) 처리된 형질전환 계통(M2, M4, M5, M6)과 니폰바레의 시험재료를 액체질소로 곱게 마쇄한 후, 100 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.8), 1 mM EDTA, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethysulfonyl fluoride), 10 mg/ml 폴리비닐-폴리피롤리돈(polyvinyl-polypyrrolidone)으로 구성된 추출용액으로 현탁하여 총 단백질을 추출하였다(Anderson et al.,(1995) Plant Physiol. 109:1247-1257). 추출한 총 단백질(100ug)과 50mM 포타슘 포스페이트 (pH 6.4), 10mM guaiacol, 100mM H₂O₂를 반응시킨 후, 자외선/가시광선 분광광도계(UV- 1601, Simazu, Japan)를 이용하여 반응액을 흡광도 470nm에서 효소의 활성을 측정하였다(Chance and Maehly, (1955) Methods Enzymol. 2:764-775).

DPPH 라디칼 소거능, 즉 항산화효소 활성을 측정하기 위해 처리했던 동일한 시험재료와 추출방법으로 총 단백질을 추출하였다. 추출한 총 단백질(100ug)과 에탄올에 녹여 제조한 0.2mM DPPH의 비율이 1:1이 되도록 혼합하여 10분간 상온에서 반응 후, Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) reader (Synergy 2, BioTek, USA)를 이용하여 517nm에서 반응액의 흡광도를 측정하였다. 대조구(총단백질 추출용액)의 흡광도 값에 대한 시험재료의 흡광도 값의 차를 각 시험재료의 DPPH 라디칼 소거능으로 계산하였다(Blios, Nature(1958) 1199-1200).

니폰바레와 저온에 매우 민감한 인디카계 품종인 IR64, 형질전환 계통(M2, M4, M5, M6)의 종자를 13℃에서 100립씩 3반복으로 10일간 처리하며 매일 발아율을 조사하였다.

스트레스에 의한 세포의 전해질 누출율을 조사하기 위해 형질전환 계통(M2, M4, M5, M6)과 니폰바레의 4엽기 유묘에 저온(10℃)을 10일간 처리하였다. 처리된 유묘 잎에서 직경이 1.0cm 정도의 원반형 조각 10개를 떼어내어 18MOhms 이상의 초순수로 간단히 씻어주고, 새로운 초순수를 함유한 가열 가능한 시험관에 원반형 조각을 띄운 뒤, 1시간 동안 상온에서 부드럽게 흔들어 배양하였다. 배양 1시간 후, 전기전도측정기 Accumet BASIC conductivity meter (Fisher Scientific, USA)로 각 시험재료의 전기전도도(Xi)를 측정한 후, 잎 조각이 든 시험관을 80℃ 항온수조에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후, 다시 전기전도도(Xt)를 측정하였다. 전해질 누출율은 [(Xi/Xt) X 100%]로 환산하여 분석하였다(Scotti Campos and Thu Pham Thi,(1997) Plant Sci. 130:11-18).

(제2단계) 벼(Oryza sativa) 유래 OsMyb4의 삽입이 확인된 형질전환 계통 벼 식물체 내에서 OsMyb4의 과발현에 의해 유도된 유전자와 그 유전자의 특성 분석

OsMyb4의 과발현에 의해 벼 식물체 내의 유전자발현의 변화를 확인하기 위해 실시예 2의 제2단계와 실시예 3의 제1단계에서 확인된 결과를 토대로 내냉성 증진이 우수한 형질전환 계통 M2와 M6를 선발하여 벼 식물체내 OsMyb4의 과발현에 의해 유도되는 유전자와 그 유전자의 특성을 분석하였다.

유전체 수준의 유전자들의 발현변화를 대량으로 조사하기 위해 미국과학재단의 연구비 지원으로 제작된 NSF 45K oligonucleotide microarray를 이용하였다. Trizol reagent (Invitrogen, USA)를 이용하여 상온에서 재배된 4엽기의 유묘에서 총 RNA를 추출하였다. MessageAmp II aRNA amplification kit (Ambion, USA)를 이용하여 추출된 총 RNA를 aRNA로 합성하였고, 대조구 aRNA(20ug)는 Cy3 형광염료로 M2 또는 M6계통 aRNA(20ug)는 Cy5 형광염료로 염색하였다. Cy3와 Cy5 형광염료로 염색된 탐침과 microarray slide는 1× 혼성화 용액 (50% formamide, 5× SSC, 0.1% SDS 및 10 mM DTT)으로 42℃의 Hybex Humidified Thermal Blocks (Scigene, USA)에서 16시간 동안 혼성화되었다. 형광염료 탐침과 혼성화가 완료된 microarray slide를 42℃에서 약 세척 용액(2× SSC, 0.1% SDS)으로 2번, 상온에서 강 세척용액(0.1× SSC, 0.1% SDS)으로 2번, 0.1× SSC로 간단히 세척한 후, 건조시켜 Axon 4000B scanner와 GenePix Pro 5.1 (Axon-Molecular Devices, USA)를 이용하여 각 유전자별 Cy3와 Cy5 형광강도를 측정하였다. 측정된 유전자별 Cy3와 Cy5 형광강도에 대한 정보를 MeV4 Bioinformatics Tools (Saeed et al., 2003)를 이용하여 유전자 발현에 대한 정보로 변환하였고 이를 토대로 OsMyb4의 과발현에 의해 벼 식물체내에서 유도되는 유전자와 그 유전자의 특성을 분석하였다.

결과는 도 7, 8, 9, 10, 11 및 표 1 내지 3을 통해 확인할 수 있다. 퍼옥시데이즈 활성은 상온에서 형질전환 계통의 잎의 활성만 대조구에 비해 증가 되었고 저온에서 뿌리에서만 활성이 증가되었다. 염 처리시 뿌리와 잎 모두 대조구의 활성과 차이를 보이지 않았다(도 7).

DPPH 라디칼 소거능은 상온에서 형질전환 계통의 뿌리와 잎 모두에서 대조구에 비해 증가 되었지만 저온에서는 뿌리에서만 증가 되었다. 염 처리시 퍼옥시데이즈 활성과 마찬가지로 형질전환 계통의 DPPH 라디칼 소거능은 대조구와 큰 차이를 보이지 않았다(도 8).

상온에서 모품종인 니폰바레와 저온에 민감한 인디카계 대조구 IR64, 형질전환계통 종자는 4일 후, 거의 모두 발아하였지만 1~3일간의 발아율은 니폰바레와 형질전환 계통에 비해 IR64의 발아율이 낮았다. 저온에서 IR64의 경우 10일 이후에도 거의 발아하지 않았고 니폰바레와 형질전환 계통의 경우에도 상온에 비해 발아율이 현저히 낮아졌다. 저온 처리시 형질전환 계통은 처리 5~9일 사이의 발아율이 니폰바레에 비해 높았으며 동일기간 동안 형질전환된 M5 계통의 발아율이 가장 높았다(도 9).

4엽기에 저온처리에 의한 형질전환 계통의 잎 세포의 전해질 누출율은 대조구(니폰바레와 IR64)에 비해 모두 낮았으며 처리 10일에 IR64의 전해질 누출율은 100%에 이르렀다. 뿌리의 경우도 잎과 거의 같은 경향을 보였다(도 10).

OsMyb4의 과발현에 의한 형질전환 계통 벼 식물체내에서 발현의 변화를 보인 유전자의 특성을 확인하기 위해 OsMyb4 형질전환 계통 M2와 M6 식물체 내에서 공통적으로 발현이 증가된 유전자만을 선발하여 벼에서 저온과 과산화수소 처리를 통해 유전자들의 발현양상과 발현조절 네트워크를 분석한 Cheng 등 (BMC Genomics. (2007) 8:e175)과 Yun 등(BMC Plant Biolog. (2010) 10:16)에 의해 밝혀진 저온 또는 과산화수소에 의해 발현이 유도되는 유전자들과의 상동성을 분석했다. 분석결과 OsMyb4의 과발현에 의해 NSF 45K 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 상의 유전자 중 저온에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려진 3,142종 유전자의 약 14%(440종)의 유전자가 발현이 증가되었고 과산화수소에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려진 유전자의 4%만이 OsMyb4의 과발현에 의해 증가하였다(도 11, 표 1, 2 및 3).

실시예 3을 통해 형질전환 계통 식물체 내의 OsMyb4의 과발현에 의해 퍼옥시데이즈 활성, DPPH 라디칼 소거능, 종자의 저온 발아율, 전해질 누출이 대조구 니폰바레에 비해 형질전환 계통이 향상되었으며 이러한 결과를 통해 저온저항성을 증진시키는 OsMyb4의 기능을 확인할 수 있었다. 또한, OsMyb4 형질전환계통은 OsMyb4의 과발현에 의해 저온에 의해 발현이 유도되는 유전자의 상당량의 유전자의 발현에 관여하기 때문에 OsMyb4는 저온 스트레스에 대한 유전자 조절 네트워크상의 상위의 위치에서 저온관련 유전자의 발현을 조절하여 벼에 저온 저항성을 증진시키는 것으로 예상할 수 있다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for producing transgenic plant improving cold resistance by Oryza sativa Myb4 overexpression and the plant thereof <130> PN10175 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 819 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 gaattcggct tgaactagta caatggggag ggctccgtgc tgcgagaaga tggggctcaa 60 gaagggtcca tggacgccgg aggaggacaa ggtcctcgtc gcccacatcc agcgccacgg 120 ccacggcaac tggcgcgccc tgcccaagca agccgggctg ctgcgttgcg gcaagagctg 180 ccggctccgg tggatcaact acctgcggcc ggacatcaag cggggcaact tctccaagga 240 ggaggaggac accatcatcc atctccacga gctgcttggc aacaggtggt ccgcaattgc 300 cgccaggttg cccgggagga cggacaacga gatcaagaac gtgtggcaca cccacctcaa 360 gaagcgcctc gatgcgccgg ctcagggcgg tcatgtcgcg gcgagcggcg gcaagaagca 420 caagaagccg aagagcgcga agaagccagc cgccgccgcc gccgcgccgc cggcgtcgcc 480 cgagcggtcc gcctcgtcgt cggtgacgga gtcctcgatg gcctcgtcgg tggcggagga 540 gcacggcaac gccgggatca gctcggcgtc cgcgtccgtg tgcgccaagg aggagagctc 600 cttcacctcg gcttccgagg agttccagat cgacgacagc ttctggtcgg agacgctgtc 660 gatgccgctg gacgggtacg acgtgtccat ggagcccggc gacgcgttcg tcgcgccgcc 720 atccgccgac gacatggact actggctcgg agtgttcatg gagtccggcg aagcgcaaga 780 cttgccgcag atctagagca cgtgagagaa gccgaattc 819 <210> 2 <211> 257 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Gly Arg Ala Pro Cys Cys Glu Lys Met Gly Leu Lys Lys Gly Pro 1 5 10 15 Trp Thr Pro Glu Glu Asp Lys Val Leu Val Ala His Ile Gln Arg His 20 25 30 Gly His Gly Asn Trp Arg Ala Leu Pro Lys Gln Ala Gly Leu Leu Arg 35 40 45 Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp 50 55 60 Ile Lys Arg Gly Asn Phe Ser Lys Glu Glu Glu Asp Thr Ile Ile His 65 70 75 80 Leu His Glu Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Ala Ile Ala Ala Arg Leu 85 90 95 Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Val Trp His Thr His Leu 100 105 110 Lys Lys Arg Leu Asp Ala Pro Ala Gln Gly Gly His Val Ala Ala Ser 115 120 125 Gly Gly Lys Lys His Lys Lys Pro Lys Ser Ala Lys Lys Pro Ala Ala 130 135 140 Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ser Pro Glu Arg Ser Ala Ser Ser Ser 145 150 155 160 Val Thr Glu Ser Ser Met Ala Ser Ser Val Ala Glu Glu His Gly Asn 165 170 175 Ala Gly Ile Ser Ser Ala Ser Ala Ser Val Cys Ala Lys Glu Glu Ser 180 185 190 Ser Phe Thr Ser Ala Ser Glu Glu Phe Gln Ile Asp Asp Ser Phe Trp 195 200 205 Ser Glu Thr Leu Ser Met Pro Leu Asp Gly Tyr Asp Val Ser Met Glu 210 215 220 Pro Gly Asp Ala Phe Val Ala Pro Pro Ser Ala Asp Asp Met Asp Tyr 225 230 235 240 Trp Leu Gly Val Phe Met Glu Ser Gly Glu Ala Gln Asp Leu Pro Gln 245 250 255 Ile <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccaaggagga ggacaccatc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcatcgaggc gcttcttgag g 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gaactagtac aatggggagg gct 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctctcacgtg ctctagatct gc 22

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래의 Myb4 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에서 과발현시키는 단계를 포함하는 내냉성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.
제1항의 방법에 의해 제조된 내냉성이 증진된 형질전환 식물체.
제2항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래의 Myb4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 내냉성이 증진된 식물체.