KR20120021714A

KR20120021714A - 발효 대추잎 추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20120021714A
Application number: KR1020100078381A
Authority: KR
Inventors: 안준배; 최석현; 김동석; 박성민; 윤미영; 박지영; 이경아
Original assignee: 보은군
Priority date: 2010-08-13
Filing date: 2010-08-13
Publication date: 2012-03-09
Also published as: KR101243265B1

Abstract

대추나무(Zizyphus jujuba Miller) 잎을 포함하는 배지에 발효 미생물을 접종하여 발효한 대추잎 발효물을 추출하여 얻은 발효 대추잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 매우 뛰어난 피부 노화 방지 효과 및 피부 보습 효과를 가진다.

Description

발효 대추잎 추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing the extract of fermented jujube leaves}

본 발명은 발효 대추잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 대추나무(Zizyphus jujuba Miller) 잎을 포함하는 배지에 발효 미생물을 접종하여 발효한 대추잎 발효물을 추출하여 얻은 발효 대추잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리?화학적인 변화가 일어나며 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 즉, 피부의 노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따른 프리라디칼의 활성화 등으로부터 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 보다 구체적으로는 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히아루론산, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생화시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 한편, 노화에는 프리라디칼 뿐만 아니라 MMP라는 효소가 관여하는데, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 이러한 분해효소는 자외선 조사에 의해 활성화되기도 한다. 그러므로 세포내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

한편, 인체에 있어서 피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관으로서, 인체 내의 생체성분 즉, 물이나 전해질 등의 손실을 방지하는 동시에 외부로부터 유해물질이 인체 내로 침입하지 못하도록 하는 역할을 한다. 이러한 피부는 크게 표피층, 진피층 및 피하지방층으로 구분된다. 표피층은 각질세포와 멜라닌 세포로 구성되는데, 피부 최외곽의 각질세포층은 외부환경과 직접 접촉하기 때문에 물리적, 화학적 혹은 물질의 투과에 대한 강한 저항성이 요구되며, 인체로부터 외부로 수분이 손실되는 것을 막아줌과 동시에 자체로도 적당한 수분을 보유함으로써 유연성을 유지하여야 한다.

일반적으로 피부의 수분량은 진피층에서는 70% 정도이나 표피층으로 갈수록 감소하여 각질세포층에서는 약 10 내지 30%가 된다. 진피층에서 공급된 물은 주로 수동적 확산에 의해 각질층 상부로 이동하며 최종적으로는 외부로 배출된다. 이를 경피수분 손실(Trans Epidermal Water Loss : TEWL)이라 하며, 이러한 경피수분 손실을 적절한 수준으로 유지시켜주는 것이 각질세포층의 지질막 성분인 피지성분과 표피지질이라고 알려져 있다. 그리고 각질세포층에는 천연보습 인자 (Natural Moisturizing Factor : NMF)라고 하는 친수성의 수분 보유능을 가진 물질이 존재하여 피부의 보습에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 정상적인 각질세포층의 수분이 10 내지 30% 정도가 유지되면 피부는 매끄럽고 부드러우며, 신체 보호기능을 정상적으로 발휘하게 된다.

그러나 각질세포층의 수분함량이 10% 이하가 되면 피부는 거칠어지고 신체의 보호기능을 잃게 되어 노화현상이 일어난다. 예를 들어, 건성피부의 경우에는 각질세포의 결집력이 약화되어 피부표면으로부터 비늘조각과 같이 각질세포가 허옇게 벗겨져 나오는 스케일링(Scaling) 현상이 나타나는바, 이와 같이 피부가 건성화되는 것은 각질세포층의 수분함량이 정상피부에 비해 적기 때문이다. 이 밖에, 건강한 피부라 할지라도 혹독한 외부환경 즉, 바람, 추운 날씨, 햇빛, 세안, 면도 등에 의해 수분 부족현상이 일어나 피부상태가 나빠지기도 한다.

따라서 피부의 각질세포층의 수분함량을 적절히 유지하는 것은 매우 중요하다. 이를 위하여 화장품에는 피지와 유사한 성분이나 NMF 성분, 또는 폴리올과 같은 보습제 등이 첨가되어 사용되었다. 예를 들어, 수용성 폴리올로서 수산기(OH 기)가 3개 이상인 글리세린, 솔리톨 등은 뛰어난 보습력을 나타내나 끈적임이 심하여 사용할 때 불쾌감을 느끼게 하며, 수산기(OH기)가 2개인 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 등은 피부에 부작용이 발생하기도 한다. 또한, 다른 천연보습인자인 피롤리돈 카르복실산 나트륨(PCA-Na), 젖산나트륨(Sodium lactate), 요소 등은 전해성이 강해 화장료의 유화안정성을 해치는 문제점이 있으며, 아미노산, 콜라겐, 엘라스틴 등도 보습능력이 있다고 하나 그 보습능력에 한계가 있었다. 각질층의 수분을 보유할 수 있는 능력은 피지성분과 아미노산, 젖산, 요소 및 무기염 등으로 이루어진 천연보습인자(NMF)에 의해 조절되어지며 피부 외용제에서 천연보습인자와 같이 안전하면서도 사용성이 우수하고 보습효과가 높은 물질의 개발이 화장품에서 중요한 연구과제 중 하나이다.

게다가 최근에는 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 이에, 본 발명자들은 여러 천연물들에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 발효시킨 대추잎 추출물이 탁월한 피부 노화 방지 효과 및 피부 보습 효과를 나타내므로 화장품으로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되어 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명은 피부 화장료에 적용이 가능하고 인체에 무해하여 안전성이 우수할 뿐만 아니라 피부 노화 방지 효과가 매우 뛰어난 천연 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 피부 노화 방지 효과가 매우 뛰어날 뿐만 아니라 피부 보습 효과도 매우 뛰어난 천연추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 대추나무(Zizyphus jujuba Miller) 잎을 포함하는 배지에 발효 미생물을 접종하여 발효한 대추잎 발효물을 추출하여 얻은 발효 대추잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 발효 미생물은 효모, 유산균류 및 바실러스 속 균류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고, 1~7일간 20~40℃에서 pH 5~7로 유지하며 발효하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 발효 대추잎 추출물은 상기 대추잎 발효물을 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출한 후 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결건조하여 얻은 감압농출물 또는 동결건조물인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 발효 대추잎 추출물은 상기 감압농축물 또는 동결건조물을 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매에 0.001~70.0중량% 함유시킨 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 발효 대추잎 추출물을 조성물 전체에 대하여 동결건조중량 기준으로 0.0001 내지 30.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 피부 노화 방지용인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 피부 보습용인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형과; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 과제의 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.

대추나무(紅棗, jujube, Chinese date.)는 식물분류학적으로 갈매나무과 대추나무속에 속하는 교목 성 과수로서 중국계 대추(학명: Zizyphus jujuba Miller., 영명: Chinese jujube)와 인도계 대추(학명: Zizyphus mauritiana L A M., 영명: Indian jujube) 등이 있고. 가을에 익은 열매를 따서 햇볕에 말리고 표면은 적갈색이며 타원형이고 길이 1.5㎝ 내지 2.5㎝에 달하며 빨갛게 익히면 단맛이 있다. 대추잎은 호생하며 좁은 난형으로서 둔한 거치가 있고 기부에서 3개의 큰 맥이 발달한다. 취산화서로서 2-3개가 달리며 양성으로서 꽃은 6월에 핀다. 잎은 어긋나고 달걀 모양 또는 긴 달걀 모양이며 3개의 잎맥이 뚜렷이 보인다. 잎의 윗면은 연한 초록색으로 약간 광택이 나며 잎 가장자리에 잔 톱니들이 있다. 잎자루에 가시로 된 턱잎이 있다. 대추나무 잎에는 혈압을 낮추어 주는 루틴이 1.6퍼센트 들어 있고 이밖에 몇 가지 사포닌과 비타민 A, B1, B2, C, T, B6, K 등이 많이 들어 있다. 또한, 대추잎의 사포닌은 콜레스테롤을 녹이는 작용을 한다. 특히 비타민 C가 함께 들어 있어 피를 맑게 해주고 산성화를 막는다. 비타민C는 콜라겐의 합성과 아드레날린의 분비를 활발하게 해주는데, 콜라겐은 세포의 젊음을 유지시켜주는 작용을 하며 기쁘거나 흥분할 때 분비되는 아드레날린은 교감신경을 자극해 노화를 막는다.

본 발명에 있어서, 발효 추출의 재료가 되는 대추나무 잎은 이를 건조하여 사용하거나 또는 그대로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 건조하여 사용하는 것이다. 건조법으로는 자연 건조, 음지 건조, 열풍 건조, 진공건조 또는 동결 건조법을 이용할 수 있다. 또한, 추출을 용이하게 하기 위하여 대추나무 잎은 분쇄하여 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명에서 사용하는 발효 미생물은 효모, 유산균류 및 바실러스 속 균류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고, 사카로미세스(Saccharomyces) 속[Saccharomyces cerevisisae KCTC 7904] 균주가 바람직하다. 발효는 1~7일간 20~40℃에서 pH 5~7로 유지하며 발효하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 사용되는 추출용매는 특정의 종류에 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산 및 그의 혼합물로부터 선택된 것이 좋다.

또한, 본 발명에 사용된 발효 대추잎 추출물은 추출액을 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물, 또는 다시 그 농축물을 건조시켜 제조한 추출 엑기스 및 추출액 중에 함유되고 있는 주 효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

또한, 본 발명의 발효 대추잎 추출물의 제조방법의 일 예는 다음과 같다. 본 발명의 대추 잎은 충북지역에서 자생하는 국산의 대추 잎을 사용하며, 이들은 충분히 세척한 다음 분쇄한 후 100메시 크기의 체를 이용하여 미세하게 만든다. 이것을 100g/L되게 정제수에 대추잎 분쇄물을 섞어주고, 사카로미세스(Saccharomyces) 속[Saccharomyces cerevisisae KCTC 7904] 균주 배양액에 첨가한다. 여기에 탄소원으로는 포도당 1~4%를 사용하며 바람직하게는 1~2%를 첨가하고, 펩톤 0.1~1%를 첨가하며 바람직하게는 0.2~0.5%를 첨가하여 배양한다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 1~7일간, 37℃, pH 5-7로 유지하며 배양한다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거한다. 발효 후 배양균을 1차 제거한 대추 잎 발효물을 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #10 여과지로 여과한다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 0.25uM의 여과기를 이용하여 최종 여과하고 여과가 완료되면 상기 추출단계에서 얻어진 추출액을 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결 건조하였다. 이렇게 얻은 감압농축물 또는 동결건조물이 0.001~70.0 중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 혼합추출물을 제조한다.

또한, 본 발명의 발효 대추잎 추출물은 특정의 범위에 한정하는 것은 아니나, 화장료 조성물 총중량에 대해 동결건조중량 기준으로 0.0001~30중량% 함유되는 것이 바람직하다. 본 발명의 발효 대추잎 추출물이 0.0001중량% 미만으로 첨가하는 경우에는 그 효과를 기대하기 힘들고, 30중량%를 초과하여 첨가되는 경우에는 뚜렷한 효능?효과의 상승이 보이지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기의 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

한편, 본 발명의 발효 대추잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제형은 특정의 종류에 한정되는 것은 아니나, 일 예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형과; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 투웨이케익, 페이스파우더, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나의 외관을 가질 수 있다.

또한, 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있다. 이는 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 또한 화장 분야에서 통상적인 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 및 염료를 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총중량에 대해 0.0001 내지 30중량%이다. 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

이와 같이 제조된 본 발명의 화장료 조성물은 피부 노화 방지용 또는 피부 보습용으로 사용될 수 있다.

본 발명은 피부 화장료에 적용이 가능하고 인체에 무해하여 안전성이 우수할 뿐만 아니라 피부 노화 방지 효과가 매우 뛰어난 천연 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 피부 노화 방지 효과가 매우 뛰어날 뿐만 아니라 피부 보습 효과도 매우 뛰어난 천연추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지 모두 포함한다.

제조예 1: 발효 대추잎 추출물의 제조

대추 잎은 충북지역에서 자생하는 국산의 대추 잎을 시료로 선별하여 충분히 세척한 다음 모두 분쇄한 후 100메시의 체를 이용하여 미세하게 만들었다. 이것을 100g/L되게 정제수에 대추 잎 분쇄물을 섞어주고, Saccharomyces 속 (Saccharomyces cerevisisae KCTC 7904) 균주 배양액에 첨가하였다. 여기에 탄소원으로 포도당 1~4%를 첨가하였으며, 펩톤 0.2~0.5%를 추가로 첨가하여 배양하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 1~7일간, 37도, pH 5-7로 유지하며 배양하였다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거하였다.

발효 후 배양균을 1차 제거한 대추 잎 발효물을 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #10 여과지로 여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 0.25uM의 여과기를 이용하여 최종 여과하였다. 여과가 완료되면 상기 추출단계에서 얻어진 추출액을 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결 건조하였다. 감압농축물 또는 동결건조물이 0.001~70.0 중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 혼합추출물을 제조하였다.

비교 제조예 1: 대추잎 추출물의 제조

상기 제조예 1과 동일한 대추잎을 시료로 선별하여 세척한 다음 분쇄한 후 100메시의 체를 이용하여 미세하게 만들었다. 대추잎 분쇄물을 100g/L가 되도록 70% 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #10 여과지로 여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 0.25uM의 여과기를 이용하여 최종 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하였다. 감압농축물 및 동결건조물이 0.001~70.0 중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 혼합추출물을 제조하였다.

실시예 1: 세포 생존율 측정

상기 제조예 1 및 비교 제조예 1에서 수득한 발효 대추잎 추출물과 대추잎 추출물이 세포에 미치는 독성을 측정하기 위해 실시되었다.

세포 독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다.

HDF를 2×10⁴ 셀/웰 농도로 96-웰 플레이트에 접종한 후, 각 웰에 시료(제조예 1, 비교 제조예 1)를 각 농도별(7.81, 15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 ㎍/㎖)로 각각 첨가하여 혼합하여 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. MTT 용액(5 ㎍/㎖)을 첨가하고 4시간 후 원심분리하여 상등액을 제거하고, 100 ㎕ 산-이소프포판올(이소프로판올에 0.04 N HCl)을 첨가한 후 푸른색의 포마잔(formazan)이 용출되도록 하여 마이크로 플레이트 리더(micro plate reader, BIO-TEK Instruments, USA)로 565 nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과 각 시료의 모든 농도에서 세포 독성은 나타나지 않았다. 이로부터 본 발명의 발효 대추잎 추출물은 인체에 무해하며 안정성이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 발효 대추잎 추출물의 콜라겐 생합성 촉진 효과

본 실시예에서는 상기 제조예 1 및 비교 제조예 1에서 수득한 발효 대추잎 추출물과 대추잎 추출물의 콜라겐 생합성 촉진 효과를 평가하였다.

먼저 인체 피부 섬유아세포(Human skin fibroblast)를 24-웰 플레이트에 웰당 1.0×10⁵셀/웰로 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 사람 정상 섬유아세포(HDF)에 시료를 0.50, 1.00, 2.00% 각각 처리하고 대조군으로 Saline buffer를 처리하였다. 시료를 처리한 다음 48시간 동안 37 ℃ CO₂배양기에서 배양하고 procollagen type I C-peptode EIA kit(TaKaRa Bio Inc, Japen)을 이용하여 측정하였다. 먼저 단일클론 항체(monoclonal anti-MMP-1)로 코팅된 마이크로 플레이트의 각 웰에 배양 상등액 100 ㎕씩 단일클론 항체가 코팅된 마이크로 플레이트에 넣고 뚜껑을 덮은 다음 실온(20-25℃)에서 2시간 동안 보온하였다. 각 웰의 내용물을 제거한 후 세척용 완충제(wash buffer)로 세척과정을 4회 반복하였다. 세척액을 완전히 제거한 다음 각 웰에 Collagen type I 에 대한 다클론 항체(polyclonal anti-MMP-1) 100 ㎕씩 분주한 후, 뚜껑을 덮어 실온에서 2시간 동안 보온하였다. 각 웰의 내용물을 제거한 후 세척용 완충제의 세척과정을 4회 반복하였으며, 세척액을 완전히 제거한 후 각 웰에 peroxidase conjugate 100 ㎕씩 분주한 후 실온에서 1시간 동안 보온하였다. 보온이 끝난 후 세척용 완충제의 세척과정을 4회 반복하였으며, 희석된 기질(substrate) 용액을 각 웰에 100 ㎕씩 분주한 후 실온에서 30분간 보온하였다. 정지용액을 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 30분 내에 마이크로 플레이드 리더(micro plate reader, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준에 대한 시료의 농도를 산출하였다. 양성대조군으로는 TGF-b(10ng/ml)을 이용하였다.

콜라겐 생합성 효과는 하기의 수학식 1에 의해 산출하였으며, 그 결과는 표 1에 나타내었다.

시료	농도	콜라겐 생합성 효과 (%)
발효 대추잎 추출물 (제조예 1)	0.1%	151
대추잎 추출물 (비교 제조예 1)	0.1%	123
양성 대조군 (TGF-b)	10ng/ml	148
비처리군 (대조군)	-	100

표 1에 의하면, 본 발명의 제조예 1에서 수득한 발효 대추잎 추출물의 콜라겐 생합성 촉진효과는 151%로 양성 대조군의 148%보다 더욱 높아 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 발효 대추잎 추출물의 세포 보호 효과

본 실시예는 상기 제조예 1 및 비교 제조예 1에서 수득한 발효 대추잎 추출물과 대추잎 추출물의 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하여 세포의 사멸을 막아 생존율을 증가시키는지에 대한 효과를 평가하기 위한 것이다.

산화적 스트레스를 이용한 자극완화 평가실험은 다음과 같이 행하였다.

먼저 인체 피부 섬유아세포(Human skin fibroblast)를 24-웰 플레이트에 웰 당 1.0×10⁵셀/웰로 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 24시간 후 세포를 새로운 배지로 교환하고 세포의 사멸을 유도하는 H₂O₂ 20nM과 각각의 시료를 동시에 처리하고 약 24시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 MTT assay로 마이크로 플레이트 리더(Microplate reader)로 565 nm에서 O.D₅₆₅ 값을 측정하고 세포 생존율을 구하여 H₂O₂에 의한 세포 사멸 완화 효과를 평가하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산을 이용하였다.

세포 생존률 효과는 하기의 수학식 2에 의해 산출하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.

	농도	세포 생존률 (%)
발효 대추잎 추출물(제조예 1) + H₂O₂ (20nM)	0.1%	72.2
대추잎 추출물(비교 제조예 1) + H₂O₂ (20nM)	0.1%	46.8
양성 대조군(아스코르브산) + H₂O₂ (20nM)	20ug/ml	36.5
H₂O₂	20nM	12.3
비처리군 (대조군)	-	100

표 2에 의하면, 본 발명의 제조예 1에서 수득한 발효 대추잎 추출물의 세포 사멸 완화 효과는 매우 우수함을 확인할 수 있었다. 세포의 사멸을 유도하는 H₂O₂ 20nM과 각각의 시료 및 아스코르브산을 처리하여 세포의 사멸억제를 평가한 결과, H₂O₂ 20nM 단독으로 처리할 경우에는 대조군과 비교하여 12.3%의 세포 생존율을 보이나, 0.1%의 발효 대추잎 추출물을 처리하였을 경우 세포 생존율은 72.2%로 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 20ug/ml의 아스코르브산을 처리하였을 때의 36.5%보다 매우 우수한 세포 사멸 억제 효과를 가지는 것이었다.

실시예 4: 발효 대추잎 추출물의 피부 보습 효과

본 실시예는 상기 제조예 1 및 비교 제조예 1에서 수득한 발효 대추잎 추출물과 대추잎 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 보습효과를 비교예 1?5와 비교하여 평가하였다.

본 실시예에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 3에 나타난 바와 같다.

우선 표 3에 기재되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였다. 이것에 가)상을 가하여 예비 유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 4, 비교예 1?5)을 제조하였다. 실험자 20명을 대상으로 하박부에 실시예 4, 비교예 1?5를 바르고, 약 90분 후에, 바르기 전과 바른 후의 보습 능력을 Corneometer(CM 820)로 △Hydration을 평가하여 그 결과를 표 4에 나타내었다.

원료		실시예 4	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5
가	스테아릴 알콜	8	8	8	8	8	8
	스테아린산	2	2	2	2	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2	2	2	2	2
	스쿠알란	4	4	4	4	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6	6	6	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3	3	3	3	3
	글리세릴모노스테아린산 에스테르	2	2	2	2	2	2
나	발효 대추잎 추출물(제조예 1)	5	-	-	-	-	-
	대추잎 추출물(비교 제조예 1)	-	5	-	-	-	-
	글리세린	-	-	-	5	-	-
	Na-히알루론산염	-	-	-	-	5	-
	1,3-부틸렌글라이콜	-	-	-	-	-	5
	정제수	100이 될때까지	100이 될때까지	100이 될때까지	100이 될때까지	100이 될때까지	100이 될때까지

주)단위: 중량%

구분	실시예 4	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5
보습제 종류	발효 대추잎 추출물	대추잎 추출물	-	글리세린	Na- 히아루론산염	1,3- 부틸렌글라이콜
Corneometer (△Hydration)	17	8	5	11	13	11

표 4에서 나타낸 바와 같이, 발효 대추잎 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 보습효과가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

Claims

대추나무(Zizyphus jujuba Miller) 잎을 포함하는 배지에 발효 미생물을 접종하여 발효한 대추잎 발효물을 추출하여 얻은 발효 대추잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 발효 미생물은 효모, 유산균류 및 바실러스 속 균류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고,
1~7일간 20~40℃에서 pH 5~7로 유지하며 발효하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 발효 대추잎 추출물은 상기 대추잎 발효물을 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출한 후 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결건조하여 얻은 감압농출물 또는 동결건조물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제3항에 있어서,
상기 발효 대추잎 추출물은 상기 감압농축물 또는 동결건조물을 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매에 0.001~70.0중량% 함유시킨 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 발효 대추잎 추출물을 조성물 전체에 대하여 동결건조중량 기준으로 0.0001 내지 30.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
피부 노화 방지용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
피부 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형과; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.