KR20120018674A - 동중체로 표지된 단백질 및 펩티드를 큰 질량의 ｙ－타입 이온을 이용하여 정량분석하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 라벨링제를 이용하여 서로 양이 다른 단백질 및 펩티드 분석체를 정량분석하는 방법을 제공하는 것으로, 라벨링제를 분석체에 결합시킨 후 탄뎀질량분석을 통해 라벨링제의 일부만이 떨어져 나가고 남은, 분석체를 포함하는 큰 질량의 y-타입 조각이온을 활용하여 정량분석을 수행하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.
Description
본 발명은 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수소 동위원소를 포함하는 라벨링제를 이용하여 탄뎀질량분석 과정에서 아미노산 서열 및 정량분석을 하는 분석 방법에 관한 것이다.
말디 이온화법(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) 및 전자 분무 이온화법(Electrospray Ionization, ESI)이 개발된 이후로, 질량분석기술은 다양한 생체시료로부터 생성된 단백질 및 펩티드의 정체 규명 및 정량 분석에 널리 활용되고 있다.
예컨대, 단백질을 효소분해하여 얻어진 조각 펩티드 시료를 말디 또는 전자 분무 이온화법으로 이온화 한 후 질량분석기를 통해 질량을 측정하여 해당 질량의 조각 펩티드가 포함된 단백질을 데이터베이스를 통해 검색하여 단백질의 종류를 밝히기도 하고, 좀 더 정확하게는 질량분석기 내에서 일부 펩티드를 어미 이온을 질량 선택한 후 추가로 에너지를 가해 분해시킨 다음 조각 이온들의 질량을 바탕으로 펩티드의 아미노산 서열을 알아내서 단백질의 정체를 규명하기도 한다.
상기와 같이 질량분석기를 이용한 단백질과 펩티드의 정량분석을 위해서, 동위원소를 포함하고 있는 화학표지물을 분석 대상 단백질 또는 펩티드에 표지한 후 질량분석하는 방법이 널리 사용되고 있다. 상대적인 양을 비교해야 하는 동일한 종류의 여러 시료에 동위원소 표지가 상이하게 되어 있는 동일한 화학표지물을 부착하여 질량분석을 하면, 상이하게 표지된 동위원소에 의한 질량차이 때문에 질량분석 스펙트럼 또는 탄뎀질량분석 스펙트럼 상에서 각 시료가 서로 다른 질량 값에서 관측할 수 있다. 이 때 관측되는 피크의 상대적 세기를 비교하면 시료간의 상대적 정량분석이 가능하다.
상술한 단백질 또는 펩티드의 정체 규명과 정량 분석을 동시에 수행하기 위하여 탄뎀질량분석 과정에서 펩티드의 서열분석과 정량분석을 동시에 수행할 수 있도록 동중체 화학변형법이 도입되었다. 미국특허 공개번호 제2005-0148087호 및 국제특허 공개번호 WO 2005/068446 등은, 펩티드의 아민기에 결합하여 탄뎀질량분석 과정에서 정량 신호가 나타나도록 고안된 동중체 화합물을 개시하고 있다. 그러나, 기존에 개시된 동중체 표지시약을 이용한 정량분석은 폴 트랩(Paul trap), 선형이온트랩(Linear ion trap) 등과 같은 사중극자 이온트랩 질량분석기에서는 활용이 불가능하다.
사중극자 이온트랩 질량분석기는, 타 질량분석기에 비해 가격이 저렴하고 유지관리가 용이하고 사용이 편리하며 이온을 기체상에 포집하여 여러차례 탄뎀질량분석할 수 있는 능력을 가지고 있어 단백질 및 펩티드의 정체 규명에 널리 활용되어 왔다. 이에 따라, 단백질체 연구분야에 사중극자 이온트랩 질량분석기가 가장 널리 보급되어 운영되고 있다. 이 사중극자 이온트랩에서 탄뎀질량분석은, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 일반적으로 공명여기 충돌유래분해 (Resonant Excitation Collision-Induced Dissociation, RE-CID)라는 기술로 이루어진다. 이 경우 조각 이온의 질량대 전하비가 어미이온의 질량대 전하비의 약 1/3보다 작을 경우 이온 트랩 내에서 안정하게 포집되지 않아 검출되지 않으며, 이를 'low-mass cutoff' 효과라고 한다. 기존 기술들에 이용된 동중체 라벨링제들은 질량이 100-200 Da 정도로 작은 조각 이온을 정량신호로 사용하고 있어 사중극자 이온 트랩 질량분석기에서 low-mass cutoff 효과에 의해 정량신호이온이 검출되지 않는다는 문제가 있다. 나아가, 100-200 Da의 질량영역에서는 분석체인 단백질 또는 펩티드로부터 유도될 수 있는 작은 질량을 가지는 내부조각이온들이 정량신호이온을 방해할 가능성이 매우 커서 정확한 정량분석이 불가능한 경우도 있다.
따라서, 상술한 특허에 기재된 물질로는 낮은 질량을 가지는 조각이온만이 분석이 가능하므로, 사중극자 이온 트랩 질량분석기에서 사용할 수 없다는 결정적 한계를 가지고 있다.
이에 따라, 가장 널리 보급된 사중극자 이온트랩 질량분석기에서도 제한없이 활용이 가능한 동중체 표지물질과 이를 활용한 분석방법의 발명이 요구된다. 또한, 상기의 한계를 극복하기 위해서는 정량신호가 충분히 큰 질량을 가지는 조각이온으로 나타날 필요가 있다. 큰 질량을 가지는 조각이온의 경우 작은 질량의 조각이온에 비해 잡음신호에 방해받을 확률이 매우 낮으며, 사중극자 이온트랩에서 발생 가능한 low-mass cutoff에 제한을 받지도 않기 때문에 매우 활용가치가 높다.
한편, 본 발명자는 특허출원(대한민국특허 공개번호 제2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제2010-0009479호, 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159)을 통하여, 'MBIT'로 명명된 새로운 동중체 라벨링제를 제시한 바 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명자에 의해서 제시된 동중체 라벨링제를 사용하여 사중극자 이온트랩 질량분석기에서도 적용할 수 있는 분석방법을 연구하던 중, 큰 질량을 가지는 정량신호이온을 통하여 분석할 수 있는 방법을 확인하였으며, 이를 활용하여 사중극자 이온트랩 질량분석기를 포함하는 모든 질량분석기에서 펩티드 및 단백질의 상대적인 양을 정량할 수 있는 방법을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, 수소 동위원소를 포함하는, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시분석용 동중체 가변질량 라벨링제를 이뇽하여, 분석체보다 큰 질량값에서 검출되는 정량분석 신호로 정량분석하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 라벨링제를 분석체와 결합하는 단계(단계 1); 상기 결합체를 이온화하여 조각이온을 생성시키는 단계(단계 2); 및 상기 조각이온 중 분석체와 RC를 포함하는 조각이온을 정량하는 단계(단계 3)을 포함하는 분석체의 정량방법을 제공한다:
[화학식 1]
상기 식에서,
RA는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고, RB는 질량조절기이고,
RC는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고,
Linker는 분석체와 결합을 유도하는 반응성 링커이고,
RA 및 RC는 동일한 알킬로 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함한다.
상기 단계 1은, 상기 화학식 1로 표시되는 라벨링제를 분석체와 결합시키는 단계로서, 분석체에 라벨링제를 결합시켜 이후 정량분석에 이용하기 위한 단계이다. 상기 결합은 라벨링제의 Linker와 분석체의 아민기가 반응하여 결합되는 것이다. 결합 방법은 대한민국특허 공개번호 제2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제2010-0009479호, 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159에 기재된 바와 같으며, 당업계에 알려진 아민기와 Linker의 결합 반응으로 결합시킬 수 있다. 분석체에 여러개의 아민기가 2이상인 경우에는 상기 화학식 1로 표시되는 라벨링제가 2이상 결합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "라벨링제"란, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미하며, 상기 화합물은 대한민국특허 공개번호 제2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제2010-0009479호, 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159에 기재된 바와 같으며, 상기 특허문헌은 본 발명의 참조로서 포함된다.
구체적으로, 본 발명에서 사용되는 용어 "Linker"는, 아민의 친핵성 공격에 리빙 그룹이 되는 활성 에스테르인 것을 의미한다. 상기 아민은 1차 아민인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 반응성 링커는 N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기, 4-니트로페닐기 및 2-니트로페닐기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "상기 질량조절기(RB)"는, 분석체와 결합한 후 질량분석과정에서 분해될 때, N-아실화된 아미노산 단편의 질량을 조절하여 정량 신호가 스펙트럼상에서 다른 단편들과 겹치지 않게 하기 위해서 도입되는 것을 의미한다. RB의 종류를 바꿈으로써, 정량신호의 질량을 다양하게 변화시킬 수 있다. 상기 질량조절기는 유사 또는 동일 물성의 천연 또는 인공 아미노산 잔기의 측쇄 중 하나일 수 있다. 또한, 상기 질량조절기는 유사 또는 동일 물성을 지닌 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 질량조절기는 C1-18의 직쇄 또는 가지쇄의 알킬일 수 있으며, 일례로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 또는 옥틸 등의 직쇄 또는 가지쇄의 알킬일 수 있다.
상기 RA 및 RC는 동일한 알킬로 적어도 하나는 중수소를 포함하며, 동위원소의 질량차에 의한 정량분석을 가능하도록 하는 역할을 한다. 바람직하게는, 상기 RA 및 RC는 메틸 또는 하나 이상의 중수소를 포함하는 메틸인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 RA 및 RC는 탄소의 개수가 동일한 알킬로 이루어져 있으나, 포함된 중수소의 수가 서로 달라야 한다. 이러한 관점에서, 상기 RA와 RC는 각각 CH3 및 CD3이거나 CD3 및 CH3인 것이 바람직하다. 즉, 상기 화합물에서 RA와 RC는, RA가 CH3이면 RC는 CD3이고, RC가 CH3이면 RA가 CD3이다.
상기 화학식 1은 N-말단이 아실화되고 C-말단에 아민의 친핵성 공격에 리빙그룹이 되는 링커가 부착되고 동위원소로 표지되는 디펩티드인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 디펩티드는 중수소로 표지되는 디펩티드인 것을 특징으로 한다.
상기 "라벨링제"의 화학구조 및 분석원리를 도 1 내지 도 3을 참조하여 설명한다.
도 1은 라벨링제의 화학구조를 도식적으로 나타낸 것이다. 특허출원(대한민국특허 공개번호 제2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제2010-0009479, 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159)에서 개시된 화합물을 "MBIT"로 명명하였고, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, N-말단이 아실화되고 C-말단에 링커가 부착된 디펩티드의 구조를 지닌다.
도 2는, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 펩티드 및 단백질에서 MBIT물질이 결합하는 모습을 도식적으로 나타낸 그림이다. 펩티드 및 단백질의 N-말단의 1차 아민 뿐 아니라, 리신 측쇄의 1차 아민과도 결합이 일어날 수 있다. 그러므로 하나의 펩티드 또는 단백질에 라벨링제를 결합시킬 때, 단백질 및 펩티드가 포함하는 리신의 개수에 따라 2개 이상의 라벨링제가 다중 결합될 수 있다. 분석체가 꼭 단백질이나 펩티드가 아니더라도, 분석체가 가지고 있는 1차 또는 2차 아민의 개수만큼의 라벨링제가 최대로 분석체와 결합할 수 있다.
특히 본 발명은, RA 및 RC에 포함된 총 중수소의 수가 일정한 상기 화학식 1로 표현되는 화합물을 두 종류 이상, 바람직하게는 두 종류를 하나의 세트로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세트를 구성하는 화합물 쌍을 각각 제1화합물과 제2화합물이라고 할 때, 상기 제1화합물과 제2화합물은 동일한 질량조절기(RB)를 가지는 것이 바람직하다. 또한, 화합물 쌍에서, 제1화합물의 RA 및 RC 중 하나가 다른 하나에 비해 많은 수의 중수소를 포함하고 있다면, 제2화합물에서는 제1화합물의 RC를 RA로 가지고, 제1화합물의 RA를 RC로 가지는 것이 바람직하다. 일례로, 화합물 쌍에서 제1화합물의 RA 및 RC가 각각 CH3, CD3인 경우, 제2화합물의 RA 및 RC는 CD3, CH3로 구성되는 화합물의 쌍을 들 수 있다. 특히, 본 발명은 yS 이온을 이용하여 정량하기 위하여, 제1화합물과 제2화합물 중 하나의 RC에만 중수소를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 라벨링제 세트의 제1화합물과 제2화합물로 각각 구분 표지된 분석체를 탄뎀질량분석하였을 때, RA 및 RC가 분리되도록 라벨링제가 분해될 경우 분해를 통해 생성된 조각이온은 RA 및 RC에서 차이가 나는 중수소의 질량만큼의 차이를 보이며 이의 결과가 탄뎀질량분석 스펙트럼에 나타나게 된다. 이들의 상대적인 세기를 비교하여 분석체의 상대적인 양을 정량할 수 있다. 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 일반적으로 탄뎀질량분석 과정에서 분리되어 생성되는 서로 다른 상보적인 두 개의 조각이온이 각각 독립적인 정량분석신호로 활용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "분석체"는, 본 발명에 따른 라벨링제에 의하여 분석되는 물질을 의미한다. 상기 분석체는 단백질, 탄수화물 또는 지질일 수 있으며, 또한 펩티드, 핵산 또는 핵산 유도체, 또는 스테로이드일 수 있다.
상기 단계 2는, 상기 결합체를 이온화하여 조각이온을 생성시키는 단계로서, 결합체에 존재하는 아미드 결합이 깨지면서 조각이온을 생성시키는 단계이다.
본 발명의 결합체의 아미드 결합이 깨지면서 생성될 수 있는 조각이온 중에서, RA 및 RB를 포함하는 조각이온 및 RC와 분석체를 포함하는 조각이온이 생성될 수 있다. 본 발명에서 RA 및 RB를 포함하는 조각이온을 'bS 이온'으로 명명하고, RC와 분석체를 포함하는 조각이온을 'yS 이온'이라 명명하기로 한다. 이를 도 3 및 도 4를 참조하여 설명한다.
도 3은, 결합체가 탄뎀질량분석 과정에서 분해되었을 때 생성되는 조각이온들을 도시한 그림이다. 이 때 동일한 분자식에 중수소가 표지된 부위만 다른 MBIT 시약 쌍을 편의에 의하여 HMBIT과 LMBIT으로 구분하는데, RA 또는 RB에 중수소가 표지된 것을 HMBIT, RC에 중수소가 표지된 것을 LMBIT으로 부른다. HMBIT과 LMBIT이 결합된 분석체는 전체적인 무게는 동일하다.
동위원소 암호화기로 선택된 두 개 중에 중수소를 포함하는 것과 그렇지 않은 것의 좌측 상단에 각각 H(중수소 포함)와 L(중수소 미포함)을 첨자로 표기하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 결합체는 탄뎀질량분석 과정에서 디펩티드의 두 아미노산 사이의 아미드 결합이 깨지면서 RA와 RB를 포함하는 조각이온(bS)과 RC와 분석체를 포함하는 조각이온(yS)으로 분리될 수 있다. 분석체에서 화학식 1에 해당하는 부분만 떨어져 나간 조각 이온을 -tag이라 명명한다.
도 4는, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 2개 이상의 화학식 1의 화합물과 결합한 펩티드를 탄뎀질량분석하였을 때 이론적으로 생성될 수 있는 탄뎀질량분석 스펙트럼을 도시하고 있다. 도 4에 도시된 바와 같이, 펩티드의 N-말단 및 C-말단의 아미노산을 포함하여 2개 이상의 아민기와 화학식 1의 화합물이 결합한 경우, 펩티드로부터 생성 가능한 모든 b- 및 y-타입 서열 이온들의 질량은 -tag의 질량보다 작은 질량값을 가지게 된다. 따라서, -tag보다 질량이 큰 yS이온은 이론적으로 펩티드로부터 유도되는 다른 조각 이온들의 방해를 전혀 받지 않는 질량범위에서 나타나게 된다. 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 가장 널리 활용되고 있는 단백질 분해 효소인 트립신 또는 LysC를 이용하여 단백질을 효소분해하게 되면 C-말단에 리신을 포함하고 있는 펩티드를 얻을 수 있기 때문에, N-말단의 아민기와 C-말단 리신 측쇄의 아민기에 2개의 화학식 1의 화합물을 결합시킬 수 있다.
상기 단계 3은, 상기 조각이온 중 분석체와 RC를 포함하는 조각이온(yS)을 정량하는 단계로서, 큰 질량을 가지는 조각이온으로 분석체를 분석하기 위한 단계이다.
yS 정량신호의 질량값은 어미이온의 질량값의 1/3 이상이기 때문에, 이온트랩 질량분석기에서 공명여기 충돌유래 분해법을 이용하여 탄뎀질량분석을 하는 경우에도 low-mass cutoff와 무관하게 yS이온의 검출이 가능하다. 따라서, 작은 질량값을 가지는 정량신호를 활용하는 기존의 다른 동중체 표지와는 달리, 사중극자 이온트랩 질량분석기에서도 yS 정량신호를 활용한 정량분석을 수행할 수 있다는 특징이 있다.
상기 분석방법에 따른 본 발명의 일실시예에 따르면, 화학식 1의 화합물을 이용하여 큰 질량값을 가지는 yS 조각이온으로 정량분석이 가능하다는 것을 확인할 수 있다. 특히, 분석체 자체보다 큰 질량을 가지는 조각이온을 활용하기 때문에, 사중극자 이온트랩 질량분석기에서도 정량분석이 가능하며, 또한 신호의 세기도 증폭되는바, 기존에 화학식 1의 화합물을 이용한 분석보다 보다 효과적인 분석이 가능하다.
본 발명은 동중체 라벨링제를 활용하여, 펩티드의 아미노산 서열을 분석하고 동시에 양을 정량분석하는 새로운 방법을 제공할 수 있다. 기존의 다른 동중체 표지시약의 경우 표지물질을 분석체와 결합시킨 다음 탄뎀질량분석으로 표지물질 중간의 결합을 분해시킨 후 분석체를 포함하지 않는 작은 질량의 조각이온을 활용하여 정량분석을 수행하는 것인 반면, 본 발명은 동중체 라벨링제를 활용하여 표지물질의 결합이 탄뎀질량분석 과정에서 분해된 후 조각이온들 중 분석체를 포함하고 큰 질량값을 가지는 조각이온(yS)을 활용하여 정량분석을 수행할 수 있다는 특징이 있다. 이에 따라, 기존의 작은 질량값을 가지는 정량신호이온을 활용하는 경우에 비하여 최대 5배 이상 강한 신호세기로 정량분석이 가능하며, 사중극자 이온트랩 질량분석기를 포함하는 모든 질량분석기에서 펩티드 및 단백질의 상대적인 양을 정량할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 라벨링제의 화학구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 라벨링제가 펩티드 및 단백질에 결합하는 반응을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은, 분석체의 아민과 결합한 라벨링제가 탄뎀질량분석 과정에서 분해되었을 때 생성될 수 있는 조각이온들의 종류를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는, 2개 이상의 라벨링제와 결합한 펩티드를 탄뎀질량분석하였을 때 이론적으로 생성될 수 있는 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는, 모델 펩티드 2종과 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제를 결합시킨 후 각각을 전자분무(ESI) 질량분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, N-말단에 1개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGR에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은, N-말단에 1개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGR에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +1전하를 띠는 이온(MH+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은, N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는, N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +1전하를 띠는 이온(MH+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제로 표지된 모델 펩티드 LISFYAGR(도 10(a))과 LISFYAGK(도 10(b))의 +2가 전하를 띠는 어미이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩에서 탄뎀질량분석하였을 때 나타나는 yS 정량신호의 세기가 전체 조각이온들의 신호세기의 총 합에서 차지하는 비율을 나타낸 것이다.
도 11은, 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제로 표지된 모델 펩티드LISFYAG(도 11(a))과 LISFYAGK(도 11(b))의 +1가 전하를 띠는 어미이온(MH+)을 사중극자 이온트랩에서 탄뎀질량분석하였을 때 나타나는 yS 정량신호의 세기가 전체 조각이온들의 신호세기의 총 합에서 차지하는 비율을 나타낸 것이다. 도 11(c)는, 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제로 표지된 모델 펩티드 LISFYAGR의 +1가 전하를 띠는 어미이온을 MALDI 이온화법으로 생성하여 TOF/TOF 장비에서 탄뎀질량분석하였을 때 나타나는 bS 정량신호의 세기비를 나타낸 도면이다.
도 12(a)는, N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 Val-tag이 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 생성된 MS2 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이며, 도 12(b)는 MS2 탄뎀질량분석에서 생성된 LyS이온을 다시 이온트랩 내에서 선택하여 다시 충돌유래 분해하여 얻은 MS3 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13은, Gln-tag의 HMBIT과 LMBIT으로 구분 표지하여 다양한 비율로 섞은 모델펩티드 LISFYAGK를 탄뎀질량분석하여 생성된 LyS 및 HyS이온의 신호 세기비로 정량분석을 수행하여 얻은 표준정량분석커브를 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 라벨링제가 펩티드 및 단백질에 결합하는 반응을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은, 분석체의 아민과 결합한 라벨링제가 탄뎀질량분석 과정에서 분해되었을 때 생성될 수 있는 조각이온들의 종류를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는, 2개 이상의 라벨링제와 결합한 펩티드를 탄뎀질량분석하였을 때 이론적으로 생성될 수 있는 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는, 모델 펩티드 2종과 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제를 결합시킨 후 각각을 전자분무(ESI) 질량분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, N-말단에 1개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGR에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은, N-말단에 1개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGR에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +1전하를 띠는 이온(MH+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은, N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는, N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +1전하를 띠는 이온(MH+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제로 표지된 모델 펩티드 LISFYAGR(도 10(a))과 LISFYAGK(도 10(b))의 +2가 전하를 띠는 어미이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩에서 탄뎀질량분석하였을 때 나타나는 yS 정량신호의 세기가 전체 조각이온들의 신호세기의 총 합에서 차지하는 비율을 나타낸 것이다.
도 11은, 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제로 표지된 모델 펩티드LISFYAG(도 11(a))과 LISFYAGK(도 11(b))의 +1가 전하를 띠는 어미이온(MH+)을 사중극자 이온트랩에서 탄뎀질량분석하였을 때 나타나는 yS 정량신호의 세기가 전체 조각이온들의 신호세기의 총 합에서 차지하는 비율을 나타낸 것이다. 도 11(c)는, 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제로 표지된 모델 펩티드 LISFYAGR의 +1가 전하를 띠는 어미이온을 MALDI 이온화법으로 생성하여 TOF/TOF 장비에서 탄뎀질량분석하였을 때 나타나는 bS 정량신호의 세기비를 나타낸 도면이다.
도 12(a)는, N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 Val-tag이 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 생성된 MS2 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이며, 도 12(b)는 MS2 탄뎀질량분석에서 생성된 LyS이온을 다시 이온트랩 내에서 선택하여 다시 충돌유래 분해하여 얻은 MS3 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13은, Gln-tag의 HMBIT과 LMBIT으로 구분 표지하여 다양한 비율로 섞은 모델펩티드 LISFYAGK를 탄뎀질량분석하여 생성된 LyS 및 HyS이온의 신호 세기비로 정량분석을 수행하여 얻은 표준정량분석커브를 나타낸 것이다.
이하，본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐，실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 라벨링제의 제조
대한민국특허 공개번호 제10-2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제10-2010-0009479호 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159호를 참조하여, 본 발명의 화학식 1의 라벨링제를 제조하였다.
라벨링제는 각각 질량조절기가 발린(Val), 글루타민(Gln), 히스티딘(His), 페닐알라닌(Phe), 및 아르기닌(Arg)의 측쇄인 것들을 이용하였다. 질량조절기가 발린(Val), 글루타민(Gln), 히스티딘(His), 페닐알라닌(Phe), 및 아르기닌(Arg)의 측쇄인 것들을 편의상 각각 Val-tag, Gln-tag, His-tag, Phe-tag, 및 Arg-tag으로 명명하였다.
실시예 2: 결합체의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 라벨링제를, 2종의 모델 펩티드 LISFYAGR 과 LISFYAGK에 Val-, Gln-, His-, Phe-. 및 Arg-tag을 결합시켰다. 결합방법은 대한민국특허 공개번호 제10-2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제10-2010-0009479호 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159호를 참조하였다.
라벨링제로 결합된 모델 펩티드는 ZipTip-C18(Millipore사)으로 염을 제거한 후 최종적으로 각 5 μM 농도로 아세토니트릴과 물이 부피비 1:1로 혼합되어 있고 0.5%의 포름산이 첨가된 용액에 녹아있는 상태로 준비하였다.
실시예 3: 정량분석
상기 실시예 2의 결합체를 이용하여, 하기와 같이 정량분석을 실시하였다.
실시에 활용된 질량분석기는 전자분무 이온화 사중극자 이온트랩 장비로 Bruker사의 Esquire HCT제품을 사용하였다. 시료 용액 100 μL가 syringe pump에 로딩된 후 1 μL/min의 유속으로 전자분무 팁으로 운반되었다. 전자분무는 4 kV의 전압으로 이루어졌다. 한 주기에 하나의 스펙트럼 측정을 위하여 이온 트랩 내부에 최대 200 ms 동안 시료 이온이 포집되어 질량분석되었으며, 1분동안 최대 250주기의 반복측정이 이루어졌다.
1) LISFYAGR 및 LISFYAGK에 각각 Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우의 질량분석 결과
LISFYAGR 및 LISFYAGK에 각각 Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우에 대하여 정량분석을 실시하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 모델 펩티드 LISFYAGR(도 5(a)) 및 LISFYAGK(도 5(b))에 Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 후 이를 전자분무 이온화 하여 사중극자 이온트랩 질량분석기를 이용하여 얻은 질량분석 스펙트럼을 나타낸다. 각각 +1, +2의 전하를 띠는 펩티드 이온이 검출되었다.
LISFYAGR 펩티드의 원래 질량은 925.5 Da으로, 양성자가 1개 또는 2개 붙어서 검출되는 +1가, +2가 이온(MH+, MH2 2+)이 926.5 Th, 463.8 Th에서 각각 검출된다. 이 펩티드에 라벨링제를 결합시킨 경우 각 표지물질 1개의 질량에 해당하는 만큼 증가한 질량에서 펩티드가 검출되었다. Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우 각각 +1가 이온은 m/z 1141.6, 1170.6, 1179.6, 1189.6, 및 1198.6 Th에서 검출되고 있으며, +2가 이온은 m/z 571.3, 585.8, 590.3, 595.3, 및 599.9 Th에서 검출되고 있다.
LISFYAGK 펩티드의 원래 질량은 897.5 Da으로, 양성자가 1개 또는 2개 붙어서 검출되는 +1가, +2가 이온(MH+, MH2 2+)이 898.5 Th, 449.8 Th에서 각각 검출되었다. 상기 펩티드에 라벨링제를 결합시킨 경우 각 표지물질 2개의 질량에 해당하는 만큼 증가한 질량에서 펩티드가 검출된다. Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우 각각 +1가 이온은 m/z 1328.9, 1386.9, 1404.9, 1424.9, 및 1442.9 Th에서 검출되고 있으며, +2가 이온은 m/z 654.9, 693.9, 703.0, 712.9, 및 721.9 Th에서 검출되고 있다.
상기의 결과를 통하여, 1개의 아민을 가지고 있는 LISFYAGR에는 1개의 라벨링제가, 2개의 아민을 지니는 LISFYAGK에는 2개의 라벨링제가 결합되었다는 것을 확인할 수 있다.
2) LISFYAGR 및 LISFYAGK에 각각 Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우의 탄뎀질량분석 결과
LISFYAGR 및 LISFYAGK에 각각 Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우의 탄뎀질량분석을 실시하였으며, 이 때 LMBIT으로 표지된 펩티드와 HMBIT으로 표지된 펩티드를 1:1의 비율로 혼합하여 실험하였다. 그 결과를 도 6 내지 도 9에 나타내었다.
도 6은 N-말단에 1개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGR에 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼이다. 펩티드의 N-말단에만 라벨링제와 결합되었기 때문에 y-타입 조각 이온들은 모두 라벨링제의 종류와 무관하게 일정한 질량대 전하비(m/z)에서 검출되고 있다. 반면에 b-타입의 조각이온들은 라젤링제의 종류에 따라 질량대 전하비(m/z)가 증가하여 검출이 되고 있다.
정량신호로 활용될 수 있는 LyS, HyS이온은 +1가 전하를 띤 채로 m/z 987 Th과 1000 Th에서 각각 검출되고 있다. 강한 염기성을 지니는 His- 및 Arg-tag의 경우는 yS이온이 강하게 검출되고 있다. Val-, Gln-, 및 Phe-tag의 경우에도 신호세기가 약하기는 하지만 yS 정량신호이온이 검출되고 있음을 알 수 있다.
도 7은 N-말단에 1개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGR에 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +1전하를 띠는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸다. 이 경우, 정량신호이온이 검출은 되나, 매우 작은 신호세기로 측정이 되고 있어 정량분석에 활용하기에 적합하지 않음을 알 수 있다.
도 8은 N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸다. 도 8에 나타난 바와 같이, N-말단의 아민과 C-말단 리신의 아민에 각각 라벨링제가 결합하였기 때문에 라벨링제의 종류에 따라 b-타입 및 y-타입 조각이온들이 모두 일정 질량대 전하비 만큼 증가하여 검출되는 것도 확인할 수 있다. 특히, +1가 전하를 띠는 yS이온은 -tag보다 큰 질량 대 전하비에서 측정이 되며, 다른 서열이온들에 전혀 방해받지 않은 영역에서 검출이 되고 있음을 알 수 있다. 또한 신호세기도 다른 서열이온들 만큼 강하게 나타나고 있으며, 1:1의 혼합비에 잘 맞는 [LyS]:[HyS]이온의 세기비를 나타내었다.
Val-, Phe-tag의 경우 +2가를 띠는 yS이온도 검출되고 있으며, 이 또한 1:1의 혼합비에 잘 맞는 이온 세기비를 나타내었다. 반면, 약하게 염기성을 띠는 Gln-tag과 강한 염기성을 띠는 His-, Arg-tag의 경우는 +2가의 yS이온이 거의 검출되지 않았으며, 그만큼 +1가의 yS이온이 강하게 검출되었다. 이론적으로 한정된 것은 아니지만, +2가의 yS이온은 +1가의 다른 서열이온들에 의해 방해받을 수 있기 때문에 +1가의 yS이온을 정량분석 신호로 활용하는 것이 훨씬 유리한 것으로 판단된다.
도 9는 N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +1전하를 띠는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸다. +2가 어미이온으로 실험한 경우와 마찬가지로, 라벨링제의 종류에 따라 b-타입 및 y-타입 조각이온들이 모두 일정 질량대 전하비 만큼 증가하여 검출되는 것을 확인할 수 있다. 그러나 특징적으로, +1가 어미이온을 선택하여 실험한 결과에서는 +1가의 yS정량신호이온이 매우 강하게 나타난다는 것을 확인할 수 있다. 또한 [LyS]:[HyS]이온의 신호 세기 비 역시 1:1 혼합비와 거의 일치하게 검출이 되고 있음을 알 수 있다.
3) yS 정량신호의 세기 측정
도 10과 11은 라벨링제로 표지된 모델 펩티드를 탄뎀질량분석하였을 때 나타나는 yS 정량신호의 세기가 전체 조각이온들의 신호세기의 총 합에서 차지하는 비율을 나타낸 도면이다. 도 10은 라벨링제로 표지되어 전자분무 이온화 된 후 +2가 전하를 띠는 어미이온을 선택하여 분해한 결과를 도시하고 있다. 한 개의 라벨링제가 결합된 LISFYAGR의 경우에 비하여, 2개의 라벨링제가 N-말단과 C-말단에 결합된 LISFYAGK의 경우 정량신호이온 yS의 세기가 두 배 이상 강하게 나오는 것을 확인할 수 있었다.
도 11(a)와 (b)는 라벨링제로 표지되어 전자분무 이온화되어 +1가 전하를 띠는 LISFYAGR과 LISFYAGK를 각각 선택하여 분해한 결과를 나타낸 것이다. 기존의 bS이온을 활용하는 경우와 비교하기 위하여, 도 11(c)에는 라벨링제로 표지된 LISFYAGR +1가 어미이온을 MALDI-TOF/TOF 장비에서 검출했을 때의 bS 정량신호이온의 비율을 도시하였다. 두 개의 라벨링제가 결합한 LISFYAGK는 MALDI이온화 방법을 통해서는 검출되지 않았다. 그 결과 N-말단의 아민과 C-말단 리신의 아민에 두 개의 라벨링제가 결합된 LISFYAGK을 분해하여 생성되는 yS이온의 상대적인 세기가 기존의 bS를 활용하는 경우에 비해 5배 이상 강한 정량신호세기를 얻을 수 있다는 것을 확일할 수 있었다.
상기 결과를 바탕으로, 이론적으로 한정된 것은 아니나, N-말단에 추가하여 리신의 측쇄까지 라벨링제가 결합하여 총 2개 이상의 라벨링제가 결합한 경우 매우 강한 yS 정량신호를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, N-말단의 아민과 C-말단의 리신에 라벨링제가 2개 결합한 경우, +1가의 yS이온은 다른 서열이온들의 방해를 전혀 받지 않는 질량 대 전하비에서 매우 강한 신호세기로 검출이 되어 잡음신호의 방해 없이 매우 정확하고 재현성 있는 정량분석을 가능하게 해 준다는 것을 알 수 있었다. 큰 질량값을 가지는 yS를 이용하게 되면, 기존의 작은 질량값을 가지는 정량신호이온을 활용하는 경우에 비하여 최대 5배 이상 강한 신호세기로 정량분석이 가능하게 된다.
4) yS이온을 다시 이온트랩 내에서 선택하여 다시 충돌유래 분해하여 얻은 MS3 탄뎀질량분석 스펙트럼 분석
도 12는 N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2가 전하를 띠는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 생성된 +1가의 yS이온을 다시 이온트랩 내에서 선택하여 다시 충돌유래 분해하여 얻은 MS3 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
Val-tag과 결합된 LISFYAGK의 LyS 이온을 선택하여 실험한 결과를 도시하였다. 만일 N-말단의 라벨링제가 분해되어 yS 이온이 생성되었다면, MS3 스펙트럼에서 bn 이온들이 모두 144 Th씩 감소하여 나타나야 하고, 리신 측쇄에 결합한 라벨링제에서 yS 이온이 생성되었다고 하면 MS3 스펙트럼에서는 yn 이온들이 모두 144 Th씩 감소하여 나타나야 한다. MS3 스펙트럼에서 144 Th 감소해서 나타나는 bn 및 yn 조각이온들을 각각 bn', yn' 으로 명명한다. 도 12(b)에서 확인할 수 있는 바와 같이, N-말단을 포함하는 b-타입 조각이온들의 위치는 동일하게 유지되는데, C-말단을 포함하는 y-타입 조각이온들의 위치는 전부 144 Th만큼 감소하여 yn'으로 검출되는 것을 확인할 수 있었다. bn'은 거의 검출되지 않았다. 결과적으로, 탄뎀질량분석을 통해 강하게 나타나는 yS정량신호는 펩티드의 N-말단에 붙은 라벨링제가 아닌 리신 측쇄의 아민기와 결합한 라벨링제로부터 유래된다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 도 6 내지 도 12의 결과를 고려할 때, yS를 활용하는 정량분석은 이론적으로 한정되는 것은 아니나, 리신을 포함하고 있어 두 개 이상의 라벨링제가 결합할 수 있는 펩티드를 분석체로 할 때 가장 좋은 성능을 보인다고 판단할 수 있다. 특히, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 펩티드의 C-말단에 리신이 있는 경우 +1가의 yS이온이 다른 조각이온의 방해를 전혀 받지 않고 검출 될 수 있다는 큰 장점을 지닌다.
5) 표준 정량커브 분석
도 13은 HMBIT과 LMBIT으로 구분 표지하여 다양한 비율로 섞은 모델펩티드를 탄뎀질량분석하여 생성된 LyS 및 HyS이온의 세기로 정량분석을 수행하여 얻은 표준정량분석커브를 나타낸 도면이다. 실시에 활용된 라벨링제는 Gln-tag이며 모델펩티드로는 LISFYAGK가 활용되었다. +1가, +2가 전하를 띠는 펩티드 이온에 대하여 각각 실시 결과를 얻었다. 라벨링제로 표지된 펩티드 용액의 농도는 혼합비와 상관없이 약 5 μM로 유지되었다. 도 13에 나타난 바와 같이, 강한 신호세기를 보이는 yS이온을 활용한 정량분석은 실제 혼합비와 아주 잘 맞는 측정비를 보이고 있음을 알 수 있었다. 특히 +1가 어미이온을 선택한 경우 yS의 신호세기가 상기 서술한 바와 같이 특이적으로 강하게 나타나기 때문에 1:64의 혼합비에 이르기까지 매우 좋은 정량분석 결과를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다. +2가 어미이온을 선택하여 정량분석하는 경우도 1:36의 혼합비까지 매우 우수한 선형성을 보인다. 기존의 작은 질량을 가지는 bS 정량신호를 활용한 경우에는 1:16의 혼합비 정도가 정량한계였음을 생각해 보면, yS를 도입하면서 최대 약 4배 정도 정량한계가 개선되었다.
Claims (13)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 라벨링제를 분석체와 결합시키는 단계;
상기 결합체를 이온화하여 조각이온을 생성시키는 단계;
상기 조각이온 중 분석체와 RC를 포함하는 조각이온을 정량하는 단계를 포함하는 분석체의 정량방법:
[화학식 1]
또는
상기 식에서,
RA는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고, RB는 질량조절기이고,
RC는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고,
Linker는 분석체와 결합을 유도하는 반응성 링커이고,
RA 및 RC는 동일한 알킬로 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함한다.
- 제1항에 있어서, 상기 RA 및 RC는 각각 메틸이고, RA 및 RC 중 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제2항에 있어서, 상기 RA 및 RC는, 각각 CH3 및 CD3이거나, 또는 각각 CD3 및 CH3인 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RB는 천연 또는 인공 아미노산 잔기의 측쇄인 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RB는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-18 알킬인 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제1항에 있어서, 상기 Linker는 N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기, 4-니트로페닐기 및 2-니트로페닐기로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제1항에 있어서, 상기 라벨링제는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 두 종류 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제7항에 있어서, 상기 두 종류 이상의 화합물 각각의 RA 및 RC에 포함된 중수소의 수가 상이하고, 상기 두 종류 이상의 화합물은 서로 중수소의 수가 동일한 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제8항에 있어서, 상기 하나의 화합물의 RA 및 RC가 각각 CH3 및 CD3이고, 상기 다른 하나의 화합물의 RA 및 RC는 각각 CD3 및 CH3인 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제1항에 있어서, 상기 분석체는 단백질, 탄수화물 또는 지질인 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제10항에 있어서, 상기 분석체는 펩티드인 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제10항에 있어서, 상기 분석체는 핵산, 핵산 유도체 또는 스테로이드인 것을 특징으로 하는 정량방법.
- 제1항에 있어서, 상기 정량방법은 사중극자 이온트랩 질량분석기를 이용하는 것을 특징으로 하는 정량방법.
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