KR20120015327A - 샘플 중의 감마-하이드록시 부티르산(ｇｈｂ)의 농도를 측정하기에 적합한 방법, 조성물 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 샘플 중의 감마-하이드록시 부티르산(GHB)의 농도를 측정하기 위한 방법 뿐만 아니라 상기 방법을 수행하기에 적합한 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 마이크로티터 플레이트 또는 자동분석기 상에서 적용하기 위한 상기 방법의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 샘플 중의 감마-하이드록시 부티르산(GHB)의 농도를 측정하기 위한 방법 뿐만 아니라 상기 방법을 수행하기에 적합한 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 마이크로티터 플레이트 또는 자동분석기(임상 실험실에서 종종 사용되는 무작위 접근 분석용 장치) 상에서 적용하기 위한 상기 방법의 용도에 관한 것이다.
흔히 GHB로 약칭되는 감마-하이드록시 부티르산(4-하이드록시부탄산, C4H8O3)은 내인성 물질이고 다수의 국가에서 불법인 치료용 약물이며 중추 신경계, 포도나무, 소(beef), 작은 감귤류 과일 및 거의 모든 기타 생물에서 소량 발견되는 천연 물질이다. 이는 현재 미국에서 규제되며 크시렘(Xyrem)이라는 명칭하에 재즈 파마슈티컬즈(Jazz Pharmaceuticals)에 의해 판매된다.
의학적 배경에서, GHB는 불면증, 임상적 우울증, 기민증 및 알콜중독과 같은 상태를 치료하고 운동 기록을 개선시키기 위해 전신 마취제로서 사용된다.
이탈리아에서, GHB는 급성 알콜 금단 뿐만 아니라 중기 내지 장기 해독 둘 다에 대해 상표명 알코버(Alcover)(ATCN 07 BB) 하에 알콜중독의 치료에 사용된다(3회 이상 나눈 투여량으로 1일 1kg당 50 내지 100mg). 미국에서, 식약청(FDA)은 기민증을 앓는 환자의 탈력발작 횟수를 감소시키기 위해 상표명 크시렘 하의 GHB의 사용을 허용한다.
GHB가 나트륨 또는 칼륨 염 형태로 사용되는 경우 과량의 나트륨 또는 칼륨의 상당량이 소모될 수 있는데, 심부전, 고혈압 또는 감소된 신 기능을 앓는 사람들은 이를 고려해야 한다. 나트륨 GHB의 생물학적 이용 효율은 음식으로 소모되는 경우 상당히 감소되므로, 식사 후 2시간 이상 기다린 다음 상기 투여량을 소모하도록 권고된다. 나트륨 GHB의 강한 진정 효과로 인해, 환자는 이를 섭취한 후 적어도 6시간 동안 중장비를 운전 또는 운용하지 말아야 한다.
임상 실험에서 크시렘으로부터의 부작용은 두통, 구역질, 비인두염, 현기증, 경면, 구토, 요실금, 혼돈, 호흡 곤란, 지각감퇴, 감각이상, 진전증, 현훈, 및 몽롱을 포함한다.
감마-하이드록시 부티레이트(GHB) 또한 미국 및 기타 국가에서 약물 관련 혼수상태의 주요 원인이 되는 불법 화학약품이다. 사실상, 미국에서 GHB 과다투여 횟수는 현재 MDMA(엑스타시)로부터의 과다투여를 앞지른다. GHB는 1960년대 미국 의료 단체에 의해 거부되었지만, 희열을 생성시키지만 독성 효과도 생성시키면서 혈액 뇌 차단막을 자유롭게 통과하고 의식을 저하시키는 이의 능력으로 인해 다수의 사람들에게 인기가 있어 왔다. 이들의 사용이 검증된 과학적 연구에 의해 입증되지 않고 잠재적으로 치명적인 경련을 수반할 수 있음에도 불구하고 이는 또한 인터넷상에서 수면 보조제 및 항우울 및 체중감량 제품으로도 추천되었다. 처음에는 스테로이드가 규제되는 1980년대 후반 스테로이드에 대한 대안으로서 출발하여, GHB는 이를 탐닉하는 이들을 잃은 사람들의 삶을 파괴시키고 이에 중독된 이들의 가족/친구를 두렵게 하면서 다방면의 의학적 악몽을 배출하는 응급실 서비스로 성장하여 왔다. 아직까지, 이는 대부분의 법 집행관, 의료진/검시관 및 부모에게 여전히 베일에 싸여 있다.
비의학적으로, 중추신경계(CNS) 진정제로도 작용하는 GHB는 남용 약물로서 사용된다. 이는 액체 엑스타시 및 액체 X를 포함하는 다수의 속칭을 갖는다. 비교적 낮은 투여량에서, GHB는 희열 상태, 운동 및 음악 향유 증대, 성욕 증대 및 사교성 증대를 일으킬 수 있다. 비교적 높은 투여량에서, GHB는 구역질, 현기증, 졸림, 불안, 시각 장애, 호흡 저하, 기억상실증, 무의식 및 사망을 유도할 수 있다. GHB의 효과는 다량의 투여량이 소모되거나 알콜과 혼합되는 경우 1.5 내지 3시간, 또는 이보다 장시간 지속될 수 있다.
일반적으로, 기분전환용으로 사용되는 투여량은 500mg 내지 3000mg이며, 이는 상기 농도가 1g/ml인 경우(항상 이렇지는 않다) 약 0.5 내지 3ml의 액체에 상응한다. 기분전환용 약물로서 사용되는 경우, GHB는 순수한 액체이거나 통상 1g/ml의 표준 농도로 물에 용해된 GHB 염인 것으로 밝혀질 수 있으므로, 의료용으로 합법적으로 판매되는 크시렘 약물 농도의 2배이다.
물 및/또는 알콜 음료에 용해된 GHB 염은 GHB의 농도가 알려지지 않을 수 있어서 소모된 GHB의 실제 투여량을 정확하게 판단하기 어려울 수 있음에 따라 익히 주지된 바와 같이 위험하다. 기분 전환용으로 판매되는 GHB가 표준화되지 않으므로, 불법적인 시장에서 구입한 GHB 용액의 실제 농도를 증명하는 것이 불가능할 수 있다. 1g 이상의 나트륨 GHB가 1ml의 물에 용해될 수 있으므로 나트륨 GHB 용액은 순수한 GHB 액체에 비해 사실상 농도가 더 높을 수 있다. 칼륨 GHB, 칼슘 GHB 및 마그네슘 GHB와 같은 기타 염 형태가 또한 보고되지만 나트륨염이 현재까지 가장 일반적이다.
일부 화학약품은 위에서와 혈류 순환시 GHB로 전환된다. GBL 또는 감마-부티로락톤은 이러한 프로드러그의 하나이다. 기타 프로드러그는 1,4-부탄디올(1,4-B)을 포함한다. 이들 전구체들에 관한 추가의 독성이 있을 수 있다. 1,4-B 및 GBL은, 예를 들면, 페인트 스트리퍼 또는 와니스 희석제로서의 산업적 용도를 의도하는 경우 하나 이상의 유해한 용매로 혼합될 수 있기는 하지만 일반적으로 순수한 액체인 것으로 밝혀졌다.
GHB는 비밀 실험실에서 제조될 수 있으며, 미국에서 사용되는 GHB의 대부분이 이의 국경지대에서 불법적으로 제조된다고 주장된다. 일부 기타 국가에서 수면 장애용 처방으로서 입수할 수 있지만, GHB는 이의 사용과 관련된 위험 때문에 1990년에 FDA에 의해 (미국에서) 금지되었다. 그러나, 2002년 7월 17일에, GHB는 종종 기민증과 관련되는 탈력 발작의 치료를 위해 승인되었다.
GHB는 가능한 마취제로서 40년도 더 전에 프랑스에서 처음 합성되었지만, 이의 바람직하지 못한 부작용 때문에 미국 의료 단체에 의해 거부되었다. 국가들이 상기 문제를 인식하기 시작함에 따라 어느 곳에서나 이의 합법적 사용은 감소되고 있다. GHB는 기민증/탈력 발작으로서 공지된 수면 장애의 복합병을 치료하기 위해 연구된 희귀 의약품으로서 1987년에 표면화되었다. 거의 동시에, 스테로이드 사용자는 GHB가 (깊은 수면 상태에서) 성장 호르몬의 체내 생성을 증진시킬 수 있다고 들었다. 그러나, 과다투여 횟수의 증가로 인해, 1990년 11월에 시판이 중지되었다. 안타깝게도, 이는 기분전환용 약물로서 및 강간 약물로서의 위상을 얻어왔으며 위험하게 상용화되었다. GHB 자체에 대한 규제가 증가된 결과로서, 체내에서 GHB로 전환될 수 있는 이의 '동족체' 또는 화학적 관련물이 점점 더 유행하게 되었다.
GHB의 상기 작용은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. GHB는 최근 특성화되고 적절하게 지명된 "GHB 수용체" 뿐만 아니라 GABAB 수용체도 자극하면서 명백하게 두 가지 이상의 부작용을 갖는다. GHB가 실제로 신경전달제인 경우, 이는 GABAB 수용체에 대해 비교적 약한 친화성을 가지므로 일반적으로 단지 GHB 수용체에서만 작용하기에 충분히 높은 농도에 도달할 것이다. 그러나, 기분전환용으로 사용하는 동안, GHB는 기준 농도에 비해 뇌에서 매우 높은 농도에 도달할 수 있으며 GABAB 수용체에서도 작용할 수 있다. GABAB 수용체에서 GHB의 작용은 추측컨대 진정 효과에 책임이 있다. GHB-매개된 GABAB 수용체 자극은 도파민 방출을 억제할 뿐만 아니라 (바클로펜과 같은 기타 GABAB 효능제와 같이) 천연 진정 뉴로스테로이드의 방출을 야기한다. 동물에서, GHB의 진정 효과는 GABAB 길항제(차단제)에 의해 중단될 수 있다.
GHB에 의해 유도된 거동 효과에서 GHB 수용체의 관련성은 보다 논쟁의 여지가 있다. 상기 GHB 수용체가 피질을 포함하는 뇌의 여러 영역에서 조밀하게 발현되는 경우 중요하지 않을 뿐만 아니라 GHB 작용의 높은 친화성 위치라는 점을 믿기 어려워 보인다. 상기 GHB 수용체에 대한 연구는 제한될 뿐이었다. 그러나, 상기 GHB 수용체가 자극성 신경전달제인 글루타메이트의 방출을 일으킨다는 증거는 있다. 상기 GHB 수용체를 선택적으로 활성화시키지만 트랜스-4-하이드록시크로톤산 및 4-(p-클로로벤질)-GHB와 같은 GABAB 수용체는 활성화시키지 않는 약물은 동물에서 경련을 야기하며 GHB-적합한 반응을 생성하지 않는다.
상기 GHB 수용체의 활성화는 GHB의 중독 특성을 단독으로 설명하지 않으며; 선택적 GABAB 효능제, 및 상기 GHB 수용체에 대한 선택적 효능제이지만 GABAB를 활성화시키지 않는 GHB의 동족체를 사용한 연구는 GHB 수용체와 GABAB 수용체가 둘 다 도파민 방출 및 결과적으로 남용 책임에 있어서 중요함을 제안한다. 상기 수용체들 중의 하나만을 활성화시키지만 둘 다 활성화시키지는 않는 화합물은 급성 도파민 방출을 유도하거나 GHB 자체에 전형적인 남용 가능성을 발휘하는 것으로 보이지 않는다.
일반적으로, 높은 투여량의 GHB는 GABAB 수용체의 작용을 통해 진정성이 있지만, 낮은 투여량은 GHB 수용체의 활성화를 통해 자극성이 있다. 이는 GHB 중독에 전형적인 진정성 및 자극성의 역설적 혼합 뿐만 아니라, 수면제로서 GHB를 사용한 개인이 GHB-유도된 몇 시간의 깊은 수면을 취한 후 갑자기 깨어난 경우 겪게되는 일명 "리바운드(rebound)" 효과도 설명할 수 있다. 이는 전신계에서 GHB의 농도가 GABAB 수용체 기능을 자극하기 위한 역치 미만의 대사작용 때문에 감소하고, 이후 각성을 유도하는 GHB 수용체를 자극한다는 사실에 기인한다.
낮은 투여량에서 뇌에 대한 GHB의 진정 효과는 억제가 저하됨에 따라 기분 고조 또는 희열감을 생성시킨다. 상기 투여량이 증가되는 경우, 깊은 혼수상태가 일어난다. 심박수가 저하되거나 느려질 수도 있다. 신경계에 미치는 효과는 발작형 움직임을 생성하면서 간대성근경련으로 불리는 근 수축 경련을 일으킬 수 있다. 혼돈, 기억상실, 구토 및 불규칙한 호흡과 같은 기타 효과는 GHB의 주요한 진정제 효과와 조합되는 경우 위험하다. GHB와 조합되는 기타 약물, 특히 알콜은 진정 효과를 악화시키고 치명적인 결과의 가능성을 증가시킬 수 있다. 낮은 투여량에서 GHB에 대한 바람직한 효과는 솔깃하게 들릴 수 있지만 (잘못된) 높은 투여량의 결과로서 사망에 이를 수 있다. GHB의 투여량 반응은 완전히 가파른데, 이는 투여량의 미미한 증가가 증상 및 위험면에서 치명적인 증가를 일으킬 수 있음을 의미한다. 가변적인 효과들은 티스푼 투여량이 한번은 적량일 수 있지만 그 다음 투여에는 과다투여가 될 수 있음을 의미한다. GHB가 기타 화학약품과 혼합되는 경우 발생하는 결과를 인식하는 것이 또한 중요하다. 예를 들면, GHB를 알콜 또는 기타 진정제와 혼합하면 사망을 일으키는 경향이 더 높다. 상기 효과는 약 4시간 동안 지속되며 완전히 갑자기 풀려날 수 있다.
상기 약물은 또한 최근에 대중 매체에서 알콜 및 약물 로힙놀(Rohypnol)과 매우 유사한 방식으로 데이트 강간 약물로서 지칭되어 왔다. GHB 자체는 비누맛 또는 짠맛을 갖지만, 용액에 희석되면 거의 맛이 나지 않으므로 일부 드링크에 혼합하는 경우 검측하기 어렵다. 더욱이, 소모 후 GHB의 확인은 체액 내에 지속되는 짧은 기간으로 인해 복잡하다. 지금까지, 몇 가지 시험 방법이 당 분야에서 개발되어 왔다: 체액 또는 모발 뿐만 아니라 음료 중의 감마-하이드록시부티르산(GHB)의 스크리닝 방법.
킨츠(Kintz) 등은, 예를 들면, 가스 크로마토그래피(GC)/질량 분광분석법(MS)에 의한 모발 중의 GHB에 대한 시험 방법을 기술한다. 상기 방법은 모발 샘플을 디클로로메탄로 오염 제거하는 단계, 이후 GHB-d6의 존재하에 0.01N NaOH 중에서 밤새 배양하는 단계, 및 이후 산성 조건하에 에틸 아세테이트 중에서 중화 및 추출하는 단계를 필요로 한다(J. Forensic Sci., 2003, Jan; 48(1): 195-200). 유사한 방법이 모발 중의 GHB에 대한 GC/MS 검정을 제공하는 쉔(Shen) 등에 의해 개발되었다(Fa Yi Xue Za Zhi; 2006 Feb; 22(1): 48-51). 상기 두 방법은 GC/MS 시험 방법이 시간 소모적이고 수고롭다는 단점을 가질 뿐만 아니라 모발 샘플은 상응하는 정규 성장 기간을 샘플링하기 위해 상기 사건으로부터 빨라야 한 달이 지나야 수집할 수 있다. 그러므로, 실시간 및 현장 시험이 가능하지 않다.
현재까지, 혈액 및 뇨에서 GHB를 측정하는 방법은 거의 GC-MS, LC/LC-MS, HPLC, HPLC-MS 또는 모세관 전기영동(CE)과 같은 크로마토그래피 방법에 국한되어 왔다.
혈액 및 뇨 샘플 중의 GHB를 검측하는 시험 방법은, 예를 들면, 칸카안파(Kankaanpaa) 등에 의해 개발되어 왔다(Forensic Sci Int. 2007 Aug 6; 170 (2-3): 133-8). 상기 방법은 또한 몇 가지 추출, 산성화 및 원심분리 단계 후 GC/MS 분석을 사용한다. 유사한 방법(몇 가지 컨디셔닝 및/또는 준비 단계들과 관련된 GC/MS)이 류(Liu) 등(Fa Yi Xue Za Zhi; 2007 Apr; 23(2): 120-2, 129), 폴(Paul) 등(J Anal Toxicol. 2007 Jul-Aug; 30(6): 375-9), 페라라(Ferrara) 등(J Farm Biomed Anal. 1993 JUN; 11(6): 483-7), 빌라인(Villain) 등(J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003 Jul 15; 792(1): 83-7), 맥쿠스커(McCusker) 등(J Anal Toxicol. 1999 Sept; 23(5): 301-5), 엘리안(Elian) (Forensic Sci Int. 2000 Apr 10; 109(3): 183-7) 및 블랑쉐(Blanchet) 등(J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2002 Apr 5; 769(2): 221-6)에 의해 제공된다. 가스-크로마토그래피(GC) 방법은 또한 음료 및/또는 드링크에서 GHB를 검측하는데 통상 사용된다(예: Liu et al., Fa Yi Xue Za Zhi, 2007 Apr; 23(2): 120-2, 129).
GHB 함량에 대한 추가의 시험 방법은, GHB가 수산화나트륨 형성 하이드록사메이트의 존재하에 하이드록실아민 하이드로클로라이드와 반응하는 GBL로 산성 용액 중에서 전환됨을 특징으로 하는 드링크 및 뇨 중의 GHB의 신속한 스크리닝을 위한 색상 시험을 포함한다. 하이드록사메이트가 산성 조건에서 염화 제2철과 반응하는 경우 자주색 착물이 형성된다(Zhang et al.; Fa Yi Xue Za Zhi, 2006 Dec; 22(6): 424-7).
추가로, 전기분무 이온화 이온-트랩 질량 분광분석법을 사용하여 간접적으로 UV를 검측 및 확인하면서 모세관 전기영동(CE)에 의해 사람 뇨 중의 GHB를 검측하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다(Baldacci et al., J Chromatogr A, 2003 Mar 21; 990(1)-2: 99-110). 상기 검정은 간접적으로 UV를 흡수 검측하는 액체 추출 및 모세관 영역 전기영동(CZE)를 토대로 한다. 상기 배경 전해질은 4mM의 니코틴산(간접적 검측용 화합물), 3mM의 스페르민(역 전기삼투) 및 히스티딘(pH 6.2에 도달하도록 첨가)으로 구성된다. 유효 길이가 40cm인 50㎛ I.D. 모세관, 내부 표준으로서 1-옥탄설폰산, 214nm에서 용질 검측 및 2.4 mS/cm의 전도도를 갖는 희석 뇨를 사용하면, 2㎍/ml 이상의 GHB 농도가 검측될 수 있다.
또한, GHB 검측을 위한 효소 이용 검정은 브라보(Bravo) 등에 의해 개발되어 왔으며, 여기서 샘플의 GHB 함량은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로부터의 GHB 탈수소 효소를 사용한 2단계 시험 방법으로 측정된다. 이러한 방법은 2개 이상의 연속 단계로 이루어지며, 여기서 제1 단계는 상기 샘플을 GHB-산화환원 효소 및 산화 보인자(cofactor)와 접촉시켜 상기 산화 보인자를 환원시키는 것으로 이루어지며, 제2 단계는 상기 샘플 및 상기 환원된 보인자를 제2 산화환원 효소 및 색원체 또는 염료와 접촉시켜 검측 가능한 화합물을 형성시키는 것으로 이루어진다(Bravo et al., J Forensic Sci, Mar. 2004, Vol. 49, No. 2: 379-87). 상기 방법은 미국 특허 제6,703,216 B2호에 의해 추가로 특허되었다.
최신 기술 범위 내에서 이미 공지된 모든 방법은 광범위한 장치 및/또는 고도로 숙련된 인원을 필요로 하고/하거나 장기간의 수행 시간이 소요된다. 덜 훈련된 실험실 인원에 의해서도 수행될 수 있는 새롭고 간단하며 신속한 방법에 대한 요구는 대규모 수행 장치를 필요로 하지 않으며 - 또한 매우 신속하게 - 상기 방법을 응급 시험에 적합하게 한다.
그러므로, 본 발명의 목적은, 용이하게 수행 가능하고 마이크로티터 플레이트 판독기 및 자동분석기에 적용하기 위한 대규모 고가의 장치를 필요로 하지 않는 GHB의 측정 방법을 제공하는 것이다. 추가로, 본 발명의 목적은 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 키트 및 조성물을 제공하는 것이다.
상기 방법은 임상적 화학 분석기에 용이하게 맞출 수 있고 표준 크로마토그래피 방법과 양호한 연관성을 나타내는 추가의 이점을 가져야 한다. 또한, GHB 측정은 샘플 중의 농도가 높거나 낮은 경우에도 가능해야 한다.
놀랍게도, 상기 샘플을 GHB를 석신산 세미알데히드(SSA)로 전환시킬 수 있는 효소 및 산화 보인자와 배양시켜 상기 산화 보인자를 환원시키고 상기 환원된 보인자량을 측정함으로써 샘플의 GHB 함량을 검측할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이어서, 상기 환원된 보인자 측정량은 상기 샘플 중의 GHB의 농도와 직접 연관될 수 있다.
그러므로, 본 발명은
a) 샘플, 및 GHB를 석신산 세미알데히드(SSA)로 전환시킬 수 있고 산화 보인자를 환원시킬 수 있는 효소를 배양하는 단계,
b) 상기 환원된 보인자의 양을 측정하는 단계 및
c) 상기 환원된 보인자의 측정량을 상기 샘플 중의 GHB의 농도와 연관시키는 단계
를 포함하는 샘플 중의 감마-하이드록시 부티르산(GHB)의 농도의 측정방법을 제공한다.
본 발명은
a) GHB를 석신산 세미알데히드(SSA)로 전환시킬 수 있는 효소 및
b) 산화 보인자
를 포함하는, GHB에 대한 샘플 검정용 조성물을 추가로 제공한다.
더욱이, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 마이크로티터 플레이트 또는 자동분석기에 적용(전해질, 효소, 남용 약물, 치료 약물, 종양 마커, 호르몬, 심 마커 등과 같은 임상적인 화학적 파라미터를 측정하기 위해 임상 실험실에서 종종 사용되는 무작위 접근 분석)하기 위한 본 발명의 방법의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 방법에서, 상기 샘플은 모든 종류의 체액으로부터 취하거나 알콜 함유 음료를 포함하는 모든 종류의 음료 또는 모든 종류의 음식 추출물로부터도 취할 수 있다. 상기 샘플이 체액으로부터 취하는 경우, 상기 샘플은 바람직하게는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 세포 또는 조직 유도된 추출물, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선 용액, 창만 또는 정제된 물질 및 양수로 이루어진 그룹으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않으며, 여기서 혈액, 혈청 또는 혈장 및 배설뇨가 가장 바람직하다. 가능한 혈장 샘플은 EDTA, 시트레이트 및 헤파린 혈장을 포함한다. 상기 샘플이 음료 또는 음료형 제품으로부터 취해지는 경우, 상기 샘플은 맥주, 포도주 및 독주와 같은 알콜 함유 드링크 뿐만 아니라 칵테일 및 "알코팝(alcopop)"과 같은 알콜 함유 혼합 드링크와 같은 드링크, 및 레모네이드, 탄산 무기수, 코카 콜라(Coca Cola)R, 진저 에일(Ginger Ale)R, 비터 레몬(Bitter Lemon)R, 토닉 워터(Tonic Water)R 또는 스프라이트(Sprite)R, 과일 주스와 같은 탄산화 또는 발포성 드링크와 같은 비알콜성 음료로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이 바람직하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 의미에서, 버터밀크, 우유, 마시는 요구르트, 요구르트 및 크림과 같은 음료형 식품으로부터 샘플을 취할 수도 있다. 추가의 가능한 샘플은 차 및 차 함유 제품, 코코아 및 코코아 함유 제품 뿐만 아니라 커피, 커피 대체물 및 기타 커피 함유 제품이다.
본 발명의 의미에서, GHB는 GHB 또는 이의 동족체로부터 유래할 수 있다. 추가로 용어 "GHB"는 용어 "감마-하이드록시 부티르산", "감마-하이드록시 부티레이트", "4-하이드록시 부티르산", "옥시부티레이트", "감마-하이드록시 나트륨 부티레이트", "감마-하이드록시 부티레이트 나트륨", "감마-하이드록시 부티르산 분해산물", "감마-하이드록시 부티르산 모노나트륨 염", "4-하이드록시 부탄산", "4-하이드록시부타노에이트", "4-하이드록시부티레이트 나트륨", "4-하이드록시 부티르산 모노나트륨 염", "4-하이드록시 부티르산 나트륨 염", "나트륨 감마 옥시부티레이트" 등을 포함하지만 이로 한정되지 않으며, 상기 용어는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 하기 용어 및 상표명에 의해 지정된 물질들이 추가로 포함되지만 이에 한정되지 않는다: "4-HB", "4-03-00-00774(Beilstein Handbook Reference)", "4-OHB", "502-85-2", "52352-27-9", "591-81-1", "AIDS-156012", "AIDS 156012", "BRN 1720582", "C00989", "CHEBI:30830", "DEA No. 2100", "EB 27", "Gam-OH", "감마-OH", "LMFA01050006", "NSC84223", "솜사나이트(Somsanite)", "WY 3478", "WY-3478", "나트륨 옥시베이트" 등. 추가로 포함되고 본 발명의 방법에 의해 검측 가능한 것은 GHB 동족체, 염 및 이의 이성체이며, 이들은 GHB와 구조적으로 연관되고 약리학적 효과가 동일하거나 매우 유사하며 본 발명의 청구항 1에 기술된 바와 같은 효소에 대한 기질로서 사용될 수 있다. 상기 GHB 염은 전술한 바와 같은 GHB 또는 이의 동족체 뿐만 아니라 GHB로 전환될 수 있는 전구형 또는 전구체(예: 에테르 또는 아미드) 및 GHB로 전환될 수 있는 전구체(이는 "감마 부티로락톤", "1,4-부탄올"을 포함하지만 이로 제한되지 않는다), 및 GHB와 구조적으로 연관되고 (직접 또는 대사후) 동일하거나 유사한 약리학적 효과를 생성하며 직접 또는 제조 단계 후 본 발명에 의해 제공된 방법에 의해 검측될 수 있는 임의의 기타 화합물일 수 있다. 용어 "GBL", "감마 부티로락톤", "4-하이드록시 부티르산 락톤", "1,4-부타놀라이드", "4-부티로락톤" 등이 상호 교환적으로 사용되며 "디하이드로-2(3H)-푸라논"을 지칭한다. 용어 "전구체"는 화학적으로 또는 체내에서 대사후 GHB를 생성시키는 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 의미에서, 5μM(~ 0.5mg/L) 내지 100,000μM(~ 10g/L), 바람직하게는 25μM 내지 50000μM, 보다 바람직하게는 50μM 내지 20000μM의 농도가 측정될 수 있다. 뇨 샘플을 시험하는 경우, 치료학적 농도를 시험하는 경우 측정될 수 있는 GHB의 농도는 바람직하게는 0μM 내지 2000μM, 보다 바람직하게는 20 내지 500μM, 추가로 바람직하게는 30 내지 150μM, 가장 바람직하게는 100μM이고, 100μM의 컷 오프(cut-off)가 내인성 및/또는 치료학적 농도와 잠재적 독성 효과를 갖는 양성 농도 사이를 식별하기 위해 바람직하게 사용된다. 혈장 또는 혈청 샘플을 시험하는 경우, 측정될 수 있는 GHB의 농도는 바람직하게는 0μM 내지 1000μM, 보다 바람직하게는 10 내지 500μM, 추가로 바람직하게는 20 내지 100μM이고, 50μM의 컷 오프가 내인성 및/또는 치료학적 농도와 잠재적 독성 효과를 갖는 양성 농도 사이를 식별하기 위해 바람직하게 사용된다. 직접 분석을 하기에 지나치게 높은 농도를 갖는 샘플은 당분야의 통상의 기술자에게 공지된 수단에 의해 희석될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용된 효소는 GHB를 석신산 세미알데히드(SSA)로 전환시킬 수 있고 산화 보인자를 환원시킬 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 이러한 효소에 대한 예는 산화환원 효소이다. 본 발명의 의미에서, 용어 "산화환원 효소"는 한 분자(수소 수용체 또는 전자 공여체로도 불리우는 환원제)로부터 또 다른 분자(수소 공여체 또는 전자 수용체로도 불리는 산화제)로의 전자 전달을 촉매할 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 특히 바람직한 산화환원 효소는 탈수소 효소 및 환원 효소를 포함하며, 여기서 GHB 탈수소 효소(GHB-DH), SSA-환원 효소, 글루쿠로네이트 환원 효소 및 알데히드 환원 효소가 가장 바람직하다. 전술한 바와 같은 하나 이상의 효소의 혼합물이 또한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 적합한 효소는 천연 유도되거나 재조합될 수 있지만, 합성 제조된 유전자 구조물(플라스미드)로부터 유도된 것이 바람직하다. 본 발명의 의미에서, 재조합 효소의 제조를 위해 당분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 자연에서 발견되는 출발 물질을 기본으로 하는 화합물의 합성 및 완전 합성 시스템의 제조를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 의미에서, 상기 효소를 생성하기 위한 두 가지 상이한 방법이 바람직하다. 이하에서, 본 발명의 의미에서 바람직한 방법은 GHB-DH의 단리, 클로닝 및 서열 결정(유전자 구조물의 생성)으로부터 출발하여 효소 GHB-DH의 생성에 대한 개요를 예시적으로 기술한다.
GHB-DH의 단리, 클로닝 및 서열 결정은 랄스토니아 유로파(Ralstonia eutropha), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 및/또는 보르데텔라 파라페르투씨스(Bordetella parapertussis)로부터 수행된다. GHB-DH에 대한 업스트림 및 다운스트림 프라이머가 상기 유전자를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 이어서, GHB-DH는 재조합 히스티딘 표식 융합 단백질로서 생성되고 히스티딘-결합 자석 비드 또는 슈퍼플로우(superflow) 컬럼을 사용하여 정제된다. 상기 유전자의 코딩 서열은 pQE-30 UA 벡터로 클로닝될 수 있고, 재조합 GHB-DH는 지시한 바와 같이 발현 및 정제된다.
1. 대장균(E. coli)에서의 발현
랄스토니아 유로파(Ralstonia eutropha ), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 및/또는 보르데텔라 파라페르투씨스(Bordetella parapertussis)로부터의 구조물이 출발 물질로서 사용된다. 이러한 방법에 따라, GHB-DH 발현의 최적화를 위한 세 가지 가능한 변형태가 있다: (1) 대장균 균주(M15, BL-21 및 XL1-블루 MRF'), (2) 유도체 농도(IPTG) 및 (3) 유도하기 위한 배양 온도(18 내지 37℃). 랄스토니아 유로파, 슈도모나스 푸티다 및/또는 보르데텔라 파라페르투씨스로부터의 서열을 포함하는 구조물 pQE-30UA 벡터는, 예를 들면, 상기 lac 억제인자 보조체 플라스미드 pREP4를 함유하거나 함유하지 않는 XL1-블루 중에서 변형된다. 정확한 재조합 단백질의 발현은 항-히스티딘 표식 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 및 SDS-PAGE에 의해 입증된다. 병행해서, 소규모 IMAC는 XL1-블루 발현으로부터 가용화 GHB-DH 응집물로부터 수행된다. 이어서, 상기 플라스미드는 선택된 발현 균주 세트에서 재변형될 것이다.
2. 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 발현
표적 재조합 단백질에 대한 알파-인자 분비 신호를 함유하는 벡터 pPICZ알파 A를 성장 매질에 제공한다. 관심 유전자의 다수의 복사체가 단세포에 집적될 수 있다. 제오신(Zeocine) 농도를 증가시킴으로써 다수의 복사체가 선택될 수 있다. 원래의 구조물(상기 참조)로부터의 GHB-DH 서열은 히스타딘 표식 표지 없는 벡터 pPICZ알파 A로 재클로닝된다. 피키아 파스토리스에서의 변형은 화학적 방법에 의해 수행되며 제오신에 대한 내성에 의해 선택된다.
본 발명의 의미에서, 보인자는 효소에 단단하게 결합하고 촉매 활성을 필요로 하는 비단백질 화합물로서 이해된다. 이들은 각각 생화학적 변형에서 보조하는 "보조체" 분자 및 이온으로서 간주될 수 있다. 본 발명의 의미에서 산화 보인자는 본 발명의 방법에서 환원될 수 있는 임의의 보인자이다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 보인자는 니코틴아미드 보인자, 플라빈 보인자, 퀴논 보인자 및 옥소산을 포함하지만 이에 한정되지 않는 한편, 니코틴아미드 보인자는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP), 니코틴아미드 1, N6-에테노아데닌 디뉴클레오티드 및 니코틴아미드 1, N6-에테노아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 플라빈 보인자는 플라빈 그룹 또는 이의 활성 부분을 포함하는 보인자들을 포함한다. 본 발명의 의미에서 플라빈 보인자에 대한 예는 리보플라빈, 이소알록사진, 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 의미에서, 퀴논 보인자는 퀴논 그룹을 포함하는 보인자로서 이해될 것이다. 퀴논 보인자의 예는 피롤로퀴놀린 퀴닌(PQQ)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 옥소산의 예는 알파-케토글루타레이트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 보인자의 동족체도 본 발명의 범위에 속한다.
특히 바람직한 보인자는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+) 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP)이다.
본 발명의 의미에서, NAD+는 2개의 리보스 환으로 이루어지는데, 하나는 이의 1' 탄소 원자에 아데닌이 부착되고 다른 하나는 이 위치에 니코틴아미드가 부착된다. 이들 2개의 당 헤테로사이클 잔기는 5' 탄소를 통해 2개의 포스페이트 그룹의 브릿지에 의해 함께 결합된다. NAD(P)+ 에서, 상기 아데닌에 부착된 리보스 환은 2' 위치에서 추가의 포스페이트 그룹을 갖는다. 상기 보인자의 동족체는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)이고, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP)는, 예를 들면, 3-아세틸피리딘-NADH, 3-아세틸피리딘 NADPH, 3-피리딘알데히드-NADH, 3-피리딘알데히드-NAPDH, 티오니코틴아미드-NADH 및 티니코틴아미드-NADPH이지만 이에 한정되지 않고, 본 발명의 방법 내에서 사용될 수도 있다. 추가로, 앞에서 정의한 바와 같은 하나 이상의 보인자 및 이들의 동족체의 혼합물 각각이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, NAD+는 0.001mM 내지 1000mM, 바람직하게는 0.01mM 내지 100mM, 보다 바람직하게는 0.1mM 내지 10mM, 가장 바람직하게는 2mM의 농도에서 사용된다.
본 발명의 방법에서, 보인자 NAD(P)+가 전자를 수용하는데 사용되므로 NAD(P)+는 NAD(P)H로 환원된다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 몇 가지 상이한 방식으로, 예를 들면, 마이크로티터 플레이터 또는 자동분석기에서 수행될 수 있다. 이러한 맥락에서, 마이크로티터(또는 마이크로플레이트)는 소형 시험관으로서 사용되는 소형 관상 "웰"을 갖는 편평한 플레이트이다. 마이크로플레이트의 각각의 웰은 전형적으로 수 마이크로리터 내지 수백 마이크로리터의 액체 중의 어딘가에 고정된다. 마이크로플레이트가 로봇에 의해 핸들링될 수 있지만 수동으로 핸들링될 수도 있다. 상기 로봇은 이들 플레이트으로부터 및 이들 플레이트로 액체 샘플을 흡입 또는 분배하는 액체-핸들러이거나 장치들에 이들을 수송하는 "플레이트 이동기"일 수 있다. 상기 플레이트의 벽에서 발생하는 사건은 특수 마이크로티터 플레이트 판독기에 의해 추후에 검측될 수 있다. 바람직하게는, 고광도 램프는 빛을 상기 마이크로티터 벽을 통해 전송하고, 상기 마이크로플레이트 벽에 구축된 반응 생성물에 의해 흡광되거나 발광된 빛은 검측기에 의해 정량화된다. 본 발명의 의미에서 적합한 검측 방식의 예는 흡광성, 형광성 광도, 발광성, 시간 분해 형광성 및 형광성 분극이며, 흡광성이 특히 바람직하다.
본 발명의 의미에서 자동분석기는 특수한 유체 핸들링 및 유동 기술을 사용하는 자동화 분석기이다. 본 발명의 의미에서 가능한 자동화 분석기의 예는 분할 흐름 분석기, 흐름-주입-분석기, 또는 여막 분석기 모듈을 갖는 자동화 분석기이다. 본 발명의 의미에서 전형적인 자동-분석기는 애보트(Abbott) 회사로부터의 에어로셋(Aeroset), 알사이온(Alcyon) 300, C8000/16000 및 Ci 8200/16200; 벡맨(Beckman)으로부터의 신크론(Synchron) Cx5, 신크론 Cx4, 신크론 Cx7, 신크론 Lx20 및 유니셀(UniCell) DxC800; 써모(Thermo)로부터의 코네(Kone) T20, T20 XT, T30 및 T60; 올림푸스(Olympus)로부터의 응답 분석기, AU 400, AU 600, AU 800, AU 640 및 AU 2700/5400; 오르토(Ortho)로부터 비트로스 퓨젼(Vitros Fusion) 5.1 및 비트로스 340; 로슈(Roche)로부터의 코바스 미라(Cobas Mira), 히타치(Hitachi) 704, 히타치 717, 히타치 911, 히타치 902, 히타치 912, 히타치 917, 코바스 인테그라(Cobas Integra) 400/700/800, 모듈라(Modular) P 800, 코바스(Cobas) C501, 코바스 C111, 모듈라 D2400, 코바스 BIO, 코바스 FARA 및 코바스 6000; 시멘즈(Siemens)(Bayer)로부터의 아드비아(Advia) 1200, 아드비아 1650, 아드비아 1800 및 아드비아 2400; 시멘즈(Siemens)(Dade)로부터의 디멘션(Dimension) RxL 디멘션 X팬드 플러스 디멘션 비스타 3000T 및 디멘션 비스타 1500; ABX로부터의 펜트라(Pentra) 60 및 펜트라 120; 엘리테크(ELITech)로부터의 셀렉트라(Selectra) E/XL; 란독스(Randox)로부터의 RX 데이토나(Daytona) 및 RX 아이몰라(Imola); 테크니콘(Technicon)으로부터의 RA 500, RA 1000 및 RA XT일 수 있지만, 이로 한정되지 않는다. 본 발명의 의미에서 자동-분석기는 또한 "임상 화학 분석기"로도 지칭된다.
샘플 중의 GHB의 농도를 측정하기 위해, 상기 환원된 보인자의 양이 측정되어야 한다. 상기 환원된 보인자의 양을 측정하기 위한 가능한 검측 방식은 흡광성, 형광성 광도, 발광성, 시간 분해 형광성 및 형광성 분극이며, 여기서 흡광성이 특히 바람직하다. 상기 샘플의 흡광성은 분광광도계를 사용함으로써 바람직하게 측정된다. 본 발명의 의미에서, 분광광도계는 빛의 색상 또는 보다 특정하게는 파장의 함수로서 광도를 측정할 수 있는 광도계(빛의 광도를 측정하는 장치)이다. 본 발명의 의미에서 여러 종류의 가능한 분광광도계가 있다. 이들을 분류하기 위해 사용된 가장 중요한 구분 중에는 이들이 작용하는 파장, 이들이 사용하는 측정 기술, 이들이 시료를 획득하는 방식 및 이들이 측정하도자 하는 광도 편차의 공급원이 있다. 분광광도계의 기타 중요한 특징은 스펙트럼 밴드-너비 및 선형 범위를 포함한다. 일반적으로, 두 가지 상이한 형태의 분광광도계가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다: 단일-빔 및 이중-빔 분광광도계. 이중 빔 분광광도계는 상기 광도의 비를 두 가지 상이한 빛의 경로에 대해 측정하고, 상기 단일 빔 분광광도계는 절대 광도를 측정한다. 비 측정이 보다 용이하고 일반적으로 보다 안정함에도 불구하고, 단일 빔 계기가 이점을 가지는데, 예를 들면, 이들은 보다 넓은 동적 범위를 가질 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 처리된 샘플의 광학 밀도는 1 내지 1,000nm의 파장, 바람직하게는 100 내지 650nm의 파장, 보다 바람직하게는 280 내지 450nm의 파장, 가장 바람직하게는 340nm의 파장에서 측정될 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하는 경우, pH, 완충제, 이온 강도, 하나 이상의 염들의 존재 및 농도, 변형물 및 보인자의 존재 및 농도, 임의의 시약, 온도, 기간(배양 시간) 및 반응 용적을 포함하는 하나 이상의 파라미터가 개별적으로 선택될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 파라미터는 목적하는 결과를 생성하기 위해 임의의 조합으로 선택될 수 있다.
상기 반응 혼합물의 pH는 pH 2 내지 pH 13, 바람직하게는 pH 8 내지 pH 12로부터 선택될 수 있으며, pH 10이 가장 바람직하다. 상기 pH가 본 발명의 방법에 적합하도록 보장하기 위해, 바람직하게는 완충제가 상기 검정에 포함된다. 사용될 수 있는 가능한 완충제는 아세테이트, 바이신, 프탈레이트, 보레이트, 트리클로로아세테이트, 설포살리실레이트, 포스페이트, 타르타레이트, 시트레이트, 석시네이트, 말레산, 2,2-비스(하이드록시메틸)-2,2',2"-니트릴로트리에탄올, 3,3-디메틸글루타르산, 3-N-모르폴리노프로판설폰산(MOPS), 말론산, 1,3-비스 트리스(하이드록시메틸)메틸아미노프로판(비스-TRIS), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-말레산(TRIS-말리에이트), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-말론산(TRIS-말로네이트), 3-N-(트리스하이드록시메틸)메틸아미노-2-하이드록시프로판 하이드록시프로판 설폰산(TAPSO), 2-(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)에탄설폰산(TES), 1,4-피페라진비스(에탄설폰산)(PIPES), 4-모르폴리노에탄설폰산(MES), N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES), 설페이트, 아미노산(예: 글리신), 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올 (AMPD), 이미다졸, 트리에탄올아민, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), N-사이클로헥실-2-아미노에탄설폰산(CHES), TRIS-HCl 및 당분야의 통상의 기술자에게 공지된 기타 완충제를 포함한다. 가장 바람직한 것은 AMPD 완충제이다.
본 발명의 방법에 따라, 상기 샘플의 배양은 0℃ 내지 100℃, 바람직하게는 18 내지 70℃, 보다 바람직하게는 28 내지 50℃, 추가로 바람직하게는 35 내지 40℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 방법에 따르면, 상기 샘플의 배양 시간은 1초 내지 수일이며, 바람직하게는 10초 내지 24시간, 보다 바람직하게는 30초 내지 5시간, 추가로 바람직하게는 1분 내지 60분이고, 3분 내지 12분이 또한 바람직하고, 5분 내지 8분의 배양이 가장 바람직하다.
본 발명의 방법에서 사용되는 효소의 농도는 1리터당 0.1 내지 10,000㎍/mL, 바람직하게는 1 내지 1,000㎍/mL, 보다 바람직하게는 10 내지 100㎍/mL, 추가로 바람직하게는 30 내지 80㎍/mL의 범위로부터 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 60㎍/mL이다.
본 발명의 방법에 따라, 상기 반응 용적은 1㎕ 내지 100ml, 바람직하게는 50㎕ 내지 10ml, 보다 바람직하게는 100㎕ 내지 1ml로부터 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 250㎕이다.
본 발명의 범위 내에서, 추가의 반응물들이 본 방법에 포함될 수 있다. 이러한 반응물들은 본 발명의 방법에 의해 검측 가능한 화합물들을 형성하기 위해 GHB의 전구체를 전환시킬 수 있는 반응물들을 포함할 수 있다. 에스테르를 GHB로 전환시키기 위해, 에스테르 가수분해 효소가 포함되어 GHB의 에스테르, GBL 등과 같은 내부 에스테르를 GHB로 전환시킬 수 있다. 아미드 가수분해 효소가 포함되어 유사하게 GHB의 아미드화 형태를 GHB로 전환시킬 수 있다.
본 발명의 방법 내에 임의로 포함되는 물질은 폴리비닐피폴리돈, 폴리비닐 알콜, 아라비아 검, 젤라틴, 알긴, 카라기난, 카세인, 알부민, 메틸 셀룰로스, 캡핑되지 않은 폴리에틸렌 글리콜, 말단 캡핑된 폴리에틸렌 글리콜, 다당류(예: 슈크로스) 및 기타 천연 및 합성 중합체 물질들 및 이들의 배합물과 같은 중합체 제제, 및 단당류(예: 글루코스) 및 글리세롤과 같은 비중합체성 제제를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 추가의 시약은 안정제 및 살생물제를 함유할 수 있다.
추가로, 단백질(예: 소 혈청 알부민), 당류(예: 말토스, 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 글리세롤 등), 고분자량 화합물(예: 폴리에틸렌 글리콜 및 당분야에 공지된 기타 고분자량 화합물) 및 금속 이온(예: 나트륨, 마그네슘, 칼륨, 칼슘 및 당분야의 공지된 기타 금속 이온)과 같은 기타 임의의 성분들이 본 발명의 방법 내에 포함될 수 있다. 금속 이온이 추가의 임의 성분들로서 사용되는 경우, 이들 금속 이온은 효소 활성제 및/또는 안정제로서 작용할 수 있다. 추가의 임의의 성분들은 에틸렌 디아민 테트라-아세트산(EDTA)과 같은 킬레이팅 화합물이다. 바람직하게는, 상기 당류들은 0.1 내지 50%(w/v), 바람직하게는 0.15 내지 20%(w/v), 보다 바람직하게는 1 내지 5%(w/v)의 농도로 사용된다. 단백질들은 바람직하게는 0.001 내지 50%(w/v), 바람직하게는 0.0015 내지 20%(w/v), 보다 바람직하게는 0.01 내지 2%(w/v)의 농도를 갖는 용액에 사용된다. 금속 이온은 0.001 내지 1000mM, 바람직하게는 0.1 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 0.15 내지 80mM의 금속 이온 농도를 갖는 용액 중에서 바람직하게 사용된다. EDTA는 0.001 내지 50mM, 바람직하게는 0.01 내지 2mM, 추가로 바람직하게는 0.1 내지 1.5mM, 가장 바람직하게는 0.8mM의 농도를 갖는 용액 중에서 바람직하게 사용된다.
또한, 상기 언급된 것들에 추가의 단계들이 수행될 수 있다. 추가의 단계들은, 예를 들면, 하기 단계들로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있지만 이에 한정되지 않는다:
단일 시험의 성능에 따라 샘플 탈보호 또는 가열과 같은 샘플의 특수 처리; 변형된 박테리아 배양물을 보다 강하게 분해시킴으로써, 상기 발현된 단백질들을 원래 조건 및 변성 조건하에 Ni2 +-하전된 컬럼에 의해 용출시킴으로써 및/또는 상기 용출된 단백질에 단백질 가수분해 효소 억제제 및/또는 방부제(예: NaN3)를 첨가함으로써 효소 정제의 재현 가능성을 최적화하는 것 - 발현된 융합 단백질 및 단백질 오염물의 광도는 SDS-PAGE 분석에 의해 또는 봉입체의 형성을 분해하고 이들을 다시 접는 방법을 평가함으로써 평가될 수 있다; 상기 샘플을 GHB-DH의 부재하에 NAD+로 예비 배양함으로써, 상기 샘플을 희석함으로써, 락테이트 탈수소 효소(예: 옥살산)를 포함하는 글리콜분해 효소의 억제제를 EDTA와 배합하여 첨가함으로써 또는 상기 샘플을 열-불활성화시킴으로써 샘플 중의 NADH의 GHB-DH 독립성 효소적 또는 비효소적 형성을 최소화하는 것; 아질산염 및 아질산나트륨염과 같은 헤모글로빈 억제제 첨가; TRIS-HCl, CAPS, CAPSO 및/또는 알칼리성 pH를 위한 AMP와 같은 추가의 적합한 완충제 첨가. 본 발명의 의미에서, 상기 언급된 바와 같은 모든 추가의 단계들이 본 발명의 방법 내에서 단독으로 또는 임의로 조합하여 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상술한 바와 같은 방법을 수행하기에 적합한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 키트는 GHB를 석신산 세미알데히드(SSA)로 전환시킬 수 있는 하나 이상의 효소 및 산화 보인자를 포함한다. 상기 키트는 또한 각각 위에서 보다 상세하게 기술된 완충 물질, GHB 전구체를 검측 가능한 형태로 전환시킬 수 있는 추가의 시약, 상기 검정 능력을 개선시키는 물질, 단백질, 당류, 고분자량 화합물, 금속 이온 및 킬레이팅 화합물과 같은 임의의 성분들을 함유할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 GHB를 석신산 세미알데히드(SSA)로 전환시킬 수 있는 하나 이상의 효소 및 산화 보인자를 포함하는, GHB의 샘플을 검정하기에 적합한 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물에 함유된 효소는 바람직하게는 산화환원 효소, 보다 바람직하게는 탈수소 효소, 가장 바람직하게는 GHB 탈수소 효소(GHB-DH)이다. 위에서 보다 상세하게 기술된 바와 같은 추가의 화합물들 및 시약들은 추가로 상기 조성물에 함유될 수 있다. 상기 조성물에 함유된 산화 보인자는 바람직하게는 NAD+이다.
본 발명은 또한 마이크로티터 플레이트 또는 자동분석기에 적용하기 위한 상술한 바와 같은 방법의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 하기 도면들에 의해 추가로 기술되지만 이에 한정되지는 않는다. 도면들은 예시 특성을 가지며 단지 예시용인 것으로 이해된다.
도 1은 샘플(예: 혈청, 뇨, 음료) 중의 GHB의 농도의 측정 원리를 도시한다. 상기 검정에서, 상기 산화환원 효소(GHB 탈수소 효소, GHB-DH; EC 1.1.1.61)는 보인자로서 NAD+를 사용하여 GHB를 석신산 세미알데히드(SSA)로 산화시킨다. 약물(GHB) 농도와 효소 활성이 직접적인 관계에 있다. 상기 반응은 효소를 첨가함으로써 개시되며, GHB-DH 활성은 NAD+를 NADH로 전환시키는 능력을 측정함으로써 340nm에서 분광분석적으로 측정된다.
도 2는 GHB-DH의 동력학에 관한 마이크로플레이트 검정을 도시한다. 반응 용적에 첨가된 GHB 농도의 함수에서 GHB-DH 활성은 마이크로플레이트 검정에서 5분 동안 측정된다. 상기 검정에서 사용된 GHB 농도(mM 단위로 표현됨)는 우측에 나타내었다.
도 3은 자동-분석기(임상 화학 분석기)에 대해 맞춘 두 가지 검정 포맷을 도시한다. 이들 포맷은 둘 다 코네 T30 분석기 상에서 수행된 1-시약 검정을 기술한다. 상기 자동-분석기 상에 상기 시약을 놓기 전에, 완충제, 억제제, 보인자 및 효소를 함유하는 시약 혼합물은 제시된 바와 같은 Ra, Rb 및 Rc를 혼합하거나 Ra'및 Rb'를 혼합하여 제조되어야 한다. 이어서, 상기 시약은 자동-분석기에서 지정된 시간 동안 배양되고 그 후 측정된 샘플 또는 교정용 표준과 접촉된다. 약어: OxA (옥살산); Cal(교정용 표준).
도 4는 코네 T30 자동-분석기 상에서 수행된 2-시약 검정 포맷을 도시한다. 상기 자동-분석기 상에 상기 시약 혼합물 R1을 놓기 전에, 완충제 및 억제제를 함유하는 시약 R1a 및 보인자를 함유하는 시약 R1b는 지시된 바와 같이 R1a 및 Rb를 혼합시킴으로써 제조되어야 한다. 이어서, 상기 시약 R1a:R1b는 GHB-DH를 함유하는 시약 R2를 첨가하기 전에 2분 동안 상기 샘플 또는 교정용 표준과 접촉된다. 상기 최종 반응 혼합물이 배양되고 상기 자동-분석기에서 또 다른 6분 동안 측정된다. 약어: OxA(옥살산); Cal(교정용 표준); Con L(약 150μM의 GHB를 함유하는 뇨 대조용); Con H(약 800μM의 GHB를 함유하는 뇨 대조용).
도 5는 임상 화학 분석기(코네 T30(제조원: Thermo); 2-시약 검정 포맷; 총 배양 시간은 8분이다) 상에서의 GHB 표준 곡선 수행을 도시한다. ΔOD, 2분으로부터 8분까지의 배양 시간에서 340nm에서의 광학 밀도의 차이.
도 6은 뇨 샘플에 대한 상기 방법의 정확도를 확인하기 위해 임상 화학 분석기(코네 T30(제조원: Thermo); 2-시약 검정 포맷; 총 배양 시간은 8분이다) 상에서 일련의 검정(스파이킹 회복 실험) 수행 결과를 도시한다. 이러한 예에서, 정상 공여자(n=5)로부터의 뇨는 0, 100, 500 및 1000μM의 GHB로 스파이킹되었다. 스파이킹 회복율(%)은 스파이킹된 샘플 중의 예측치(E) GHB 농도에 대한 관측치(O) GHB 농도의 %-값(O/E)으로서 계산되었다.
도 7은 혈청 샘플에 대한 상기 방법의 정확도를 확인하기 위해 임상 화학 분석기(코네 T30(제조원: Thermo); 2-시약 검정 포맷; 총 배양 시간은 8분이다) 상에서 일련의 검정(스파이킹 회복 실험) 수행 결과를 도시한다. 이러한 예에서, 정상 공여자(n=6)로부터의 혈청은 0, 150 및 800μM의 GHB로 스파이킹되었다. 스파이킹 회복율(%)은 스파이킹된 샘플 중의 예측치(E) GHB 농도에 대한 관측치(O) GHB 농도의 %-값(O/E)으로서 계산되었다.
도 8은 본 발명의 효소적 방법의 정확도를 확인하기 위해 임상 화학 분석기(코네 T30(제조원: Thermo); 2-시약 검정 포맷; 총 배양 시간은 8분이다) 상에서 또는 이온 크로마토그래피(IC) 방법에서 일련의 검정 수행 결과를 도시한다. 약물에 취한 환자들(각각 n=3)로부터의 GHB-양성 혈청 및 뇨 샘플은 2-시약 과정을 사용하는 효소적 방법으로 분석되며, 측정된 결과는 이온 크로마트그래피를 토대로 하여 잘 확립되어 있는 기준 방법(Jordi et al.: Determination of formic acid, glycolate, gamma-hydroxybutyrate together with other endogenous organic acids in human serum and urine, Diploma work at the Technical High Scool of both Basel, Switzerland, Departement Industry, Chemistry, Muttenz, 2003; Jordi et al.: GHB Determination with ion chromatography, Poster at the IATDMCT congress, 2003, Basel Switzerland)으로 수득된 결과와 비교한다.
도 9는 임상 화학 분석기(코네 T30(제조원: Thermo); 2-시약 검정 포맷; 총 배양 시간은 8분이다) 상에서 일련의 검정 수행 결과를 도시한다. 약물에 취한 환자(n=9)로부터의 GHB-양성 뇨 샘플의 농도는 본 발명의 효소적 방법에 의해 측정되며 도 8에서 기술된 IC 기준 방법과 연관된다. 초기 농도가 2000μM(약 200mg/L)을 초과하는 뇨 샘플은 0.9% NaCl 용액으로 5회 내지 100회 희석하고 재분석하였다. 측정된 GHB 농도는 mg/L 단위이다.
도 10은 본 발명의 효소적 방법(코네 T30(제조원: Thermo); 2-시약 검정 포맷; 총 배양 시간은 8분이다)으로 측정된 바와 같이 각각 10명의 정상 공여자의 혈청 및 뇨에서 GHB의 내인성 농도를 도시한다.
도 11은 정상 공여자(n=10)로부터의 뇨 샘플 중의 GHB의 내인성 농도와 약물에 취한 환자(n=9)로부터의 뇨 샘플 중의 GHB 농도를 비교하여 도시한다. 모든 샘플은 본 발명의 효소적 방법(코네 T30(제조원: Thermo); 2-시약 검정 포맷; 총 배양 시간은 8분이다)으로 측정된다. 측정된 GHB 농도는 μM 단위이다. 초기 농도가 2000μM 를 초과하는 환자 샘플은 0.9% NaCl 용액으로 5회 내지 100회 희석하고 재분석하였다.
Claims (20)
- a) EDTA와 배합된 옥살산 함유 완충제를 첨가함으로써 희석되는 샘플, 및 산화 보인자를 환원시킴으로써 GHB를 석신산 세미알데히드(SSA)로 전환시킬 수 있는 효소를 배양하는 단계,
b) 상기 환원된 보인자의 양을 측정하는 단계 및
c) 상기 환원된 보인자의 측정량을 상기 샘플 중의 GHB의 농도와 연관시키는 단계
를 포함하는 샘플 중의 감마-하이드록시 부티르산(GHB)의 농도의 측정방법. - 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 효소가 산화환원 효소인 측정방법.
- 제2항에 있어서, 상기 효소가 GHB 탈수소 효소, SSA 환원 효소, 글루쿠로네이트 환원 효소 및/또는 알데히드 환원 효소인 측정방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소가 합성 제조된 유전자 구조물로부터 유도되는 측정방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화 보인자가 NAD+인 측정방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원된 보인자의 측정이 100 내지 650 nm의 파장에서 수행되는 측정방법.
- 제6항에 있어서, 상기 환원된 보인자의 측정이 340 nm의 파장에서 수행되는 측정방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플의 배양이 28 내지 50℃의 온도에서 수행되는 측정방법.
- 제8항에 있어서, 상기 샘플의 배양이 37℃의 온도에서 수행되는 측정방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 시간이 1 내지 60분인 측정방법.
- 제10항에 있어서, 상기 배양 시간이 8분인 샘플 중의 감마-하이드록시 부티르산(GHB)의 농도의 측정방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 용적의 pH 값이 8 내지 12인 측정방법.
- 제12항에 있어서, 상기 pH 값이 10인 측정방법.
- a) GHB를 석신산 세미알데히드(SSA)로 전환시킬 수 있는 효소,
b) 산화 보인자 및
c) 농도 범위가 1 내지 100mM, 바람직하게는 10mM인 옥살산과 농도 범위가 0.1 내지 1.5mM, 바람직하게는 0.8mM인 EDTA를 함유하는 완충제
를 포함하는, GHB에 대한 샘플 검정용 조성물. - 제14항에 있어서, 상기 효소가 GHB 탈수소 효소인 조성물.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 산화 보인자는 농도 범위가 0.1 내지 10mM, 바람직하게는 2mM인 NAD+인 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 측정방법을 수행하기에 적합한 키트.
- 제17항에 있어서, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 조성물을 함유하는 키트.
- 마이크로티터 플레이트에 적용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 측정방법의 용도.
- 자동-분석기상에 적용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 측정방법의 용도.
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