KR20110132746A - 항암 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 암세포를 이용하여 측정한 항암효과 즉, 암세포에 대한 세포사멸 효과가 있을 뿐만 아니라, 천연물 추출물이므로 부작용과 안전성 관련 문제가 거의 없고 실험결과 세포 독성도 없으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 상기 약학 조성물은 암을 치료, 예방 또는 개선하기 위하여 사용될 수 있다.

Description

항암 조성물{ANTI-CANCER COMPOSITION}

본 발명은 항암효과가 있는 천연물 유래 물질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

암은 제어되지 않는 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 정상조직 또는 기관으로 침윤하여 파괴시키고 새로운 성장장소를 만들 수 있어 개체의 생명을 빼앗아 갈 수 있는 질환군을 총칭한다.

이러한 암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있고, 의학 기술 또한 혁신적으로 발전하고 있음에도 불구하고, 암의 발생 및 암에 의한 사망은 계속 증가추세에 있다. 세계 보건 기구의 최근 통계 자료에 의하면 전세계적으로 연간 약 1천만 명 이상의 새로운 암환자가 발생하는 것으로 알려져 있으며, 우리나라에서도 암은 가장 높은 사망원인으로 연간 약 십 만명 이상이 진단되고, 약 6 만명 이상이 암에 의해 사망하고 있다.

암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으며, 유전인자 또는 면역학적 요인 등의 내적 요인과 화학물질, 방사선 또는 바이러스 등의 외적 요인으로 구분되기도 한다. 특히, 최근 암 환자의 증가와 관련하여, 현대 사회에서 암이 발생되는 원인은 유전적 요인보다 환경적 요인이 더 큰 비중을 차지하고 있는 것으로 알려져 있고, 특히 식생활에서 오는 발암율은 환경적 요인의 36%로서 매우 높은 것으로 알려져 있어서, 현대 사회에서의 생활환경이 근원적으로 변화되지 않는 이상 이러한 암의 발병률 및 암에 의한 사망자 수의 증가추세는 계속해서 유지될 것으로 보인다. 특히, 암은 조기에 발견되지 못할 경우 완치가 거의 불가능하고, 병이 진전될수록 환자와 가족의 고통과 경제적 손실이 막대하며, 의료 보험의 재정고갈 등 사회적으로도 큰 비용을 초래한다는 점에서 암의 예방과 조기 치료의 중요성은 더욱 강조되고 있는 실정이다.

최근에는 암의 발생과 전이, 암세포의 생리, 암의 진단과 치료에 대한 연구와 함께 식품을 비롯한 항암 효과를 지니는 물질 검색을 통하여 새로운 암 치료제가 개발되고 있는 추세이다. 구체적으로, 종양의 혈액공급을 중단시키는 것을 목표로 한 약물인 혈관신생억제제(angiogenesis inhibitor)가 있다. 또한, 암세포의 성장 또는 암세포가 다른 조직으로 퍼져 나가는 암전이에 필요한 산소와 영양분을 공급받기 위해, 혈관 형성(angiogenesis)이 요구되며, 이러한 혈관 형성에는 내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 또는 세포간 접착 분자(intracellular adhesion molecule, ICAM) 등이 밀접하게 관련되어 있다. 또한, 암의 전이(침윤)에는 유로키나제 플라스미노겐 활성물(urokinase plasminogen activator, uPA)이 관련되어 있으며, 암의 전이과정에서 수반되는 암세포 부착에는 인테그린-알파(Integrin-α)가 관련되어 있다.

암이 발병되어 진행이 계속될 경우 수술 등의 외과적 치료법과 함께 약물처방 등과 같은 화학적 치료법이나 방사선치료 등을 병행하여 집중적인 치료를 해야 하지만, 이와 같은 약물 치료 등과 같은 화학적 치료법에 사용되는 암세포 사멸제 등은 그 독성 등의 후유증을 배제할 수 없으므로, 안정성과 치료효과 모두를 담보하기 위하여, 이러한 다양한 접근방법에 기초한 암 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있기 때문이다.

암화(carcinogenesis)과정은 다단계로 이루어지는 것으로 예상되는데, 각 단계마다 특이적인 분자 또는 세포수준에서의 변화를 수반한다. 상기 암화 과정은 크게 (a) 발암물질에 의해 DNA에 돌연변이가 유도되는 개시단계, (b) 양성 종양 (benign tumor)이 나타나는 촉진단계, (c) 양성종양이 악성종양 (malignant tumor)으로 변환되는 진행단계와 (d) 악성 정도의 증가 및 전이로의 진행단계와 같이 다단계로 진행되는 것으로 추정된다.

현재 보고된 항암제를 포함한 치료제는 주로 상기 악성종양으로 변환되는 진행단계에서 악성종양에 해당하는 암세포를 제거하기 위한 물질들이 주를 이루고 있다.

그러나, 상기 암세포는 정상세포와 많은 면에서 그 성질이 유사하므로 정상세포에는 피해를 주지 않고 암세포만을 제거하는 것은 쉬운 일이 아니다. 기존 암세포의 제거를 위해 사용되는 화학요법은 주로 항암물질을 환자에게 투여하는 방법으로, 종래 보고된 약 40여 종의 화학물질은 강한 세포독성을 나타내 정상세포에 대해서도 강한 세포독성을 나타내므로, 많은 부작용을 유발하는 문제점이 있다. 특히, 암세포의 특징 중 하나인 유전적인 불안정성은 암세포 스스로가 화학요법제에 대한 내성을 유도하는 원인으로 보고되어, 항암제 투여를 통한 암치료의 문제점으로 보고되어 있다.

따라서, 기존 화학요법에 사용되는 화학물질의 경우 강한 세포독성으로 인하여 많은 부작용이 유발되므로, 종래 천연물, 특히 식물 또는 식물생약으로부터 항암제를 개발하려는 연구가 이루어지고 있다. 이러한 천연물 유래 항암제로 대표적인 것은 주목나무에서 분리한 택솔(Taxol; 파클리탁셀)이 있으나, 암세포 사멸뿐만 아니라 신체 내 다른 정상세포에도 작용하기 때문에 다른 질환을 유발할 수 있는 문제점을 안고 있으며, 물에 대한 용해도가 낮아서 독성 및 부작용이 심각한 것으로 보고되어 있다.

상기와 같은 요구에 부응하기 위하여, 본 발명은 암세포 사멸효과 뿐만 아니라 암 전이를 차단할 수 있으면서도, 부작용이 문제되지 않는 천연물 유래 항암 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천연물 즉, 군소(Aplysia kurodai) 유래 유효성분을 포함하는 항암 조성물을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸(glycosaminoglyca)을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다.

본 발명의 발명자들은 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 위암 세포주인 AGS 세포를 이용하여 Cell Viability Assay를 수행한 결과 암세포 사멸효과가 있는 것으로 확인되었으며, 세포독성 관련하여, rat 유래의 회장세포인 IEC-6 세포주에 대한 독성 실험을 수행한 결과, 세포 안전성이 확인되었으며, 천연물로부터 유래된 것으로 부작용이 문제될 가능성도 낮다는 것을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 군소(Aplysia kurodai)로부터 추출한 글리코사미노글리칸(glycosaminoglyca)을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.

상기 군소(Aplysia kurodai)는 측강목 군소과에 속하는 동물로, 봄철 해안의 바위지대의 해조 사이에서 볼 수 있는 연체동물이다. 머리에는 앞더듬이와 뒷더듬이가 각각 1쌍씩 있고, 녹조류나 갈조류를 먹이로 하는 초식성이며, 자웅동체로서 생식기는 오른쪽 더듬이의 뒤쪽에 있다. 3월 내지 7월에 해조 사이나 뼈 밑에 황등색의 끈을 뭉친 모양의 알을 낳으며, 한국, 중국, 일본, 타이완 등지에 분포한다.

상기 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans, GAGs)은 반복하는 이당류 단위를 가진 음이온성 이형다당류로서 뮤코(muco) 다당이라고도 한다. 상기 그리코사미노글리칸은 생합성 과정에서 부분적인 변화를 통해 구조적으로 다양하고 복잡한 형태를 지니게 된다. 상기 글리코사미노글리칸의 구조적 특성은 산성당 (우론산, urnocic acid)과 아미노당(글루코사민, N-acetylglucoamine 또는 N-acetylgalactosamine)의 결합을 통한 사슬이 무수히 반복되는 구조를 가지고 있으며, 당 잔기에 황산기나(SO^{3 -}) 카르복실기(COO^-)를 가지므로 음전하를 띠며, 당 잔기들 간의 결합형태와 sulfate의 수와 위치에 따라 그 특성이 분류된다. 동물류의 글리코사미노글리칸으로는 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate), 케라틴 황산(keratin sulfate), 헤파린 황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin) 등이 알려져 있다.

상기 글리코사미노글리칸은 군소(Aplysia kurodai)로부터 추출하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 분자량이 약 30 kDa인 것일 수 있다. 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 일 예로 하기 화학식 1과 같은 구조를 갖는 구성당 및 화학식 2와 같은 구조를 갖는 구성당으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것, 더 구체적으로 하기 화학식 1과 같은 구조를 갖는 구성당 및 화학식 2와 같은 구조를 갖는 구성당으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 전체 구조물의 분자량을 기준으로 55%(w/w) 이상 55%(w/w) 내지 60%(w/w) 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 헤파린 또는 헤파린 황산, 바람직하게는 헤파린 황산을 2탄당으로 포함하는 것일 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 군소로부터 글리코사미노글리칸을 추출하는 방법은 연체동물 유래 다당류를 추출을 위한 통상의 방법에 따라 수행할 수 있으며, 바람직하게는 효소를 이용한 가수분해법에 의해 단백질을 제거한 후, 다당류를 수득하는 방법으로 수행할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명의 군소 추출물은 내장을 제거한 군소를 동결건조하고 분쇄한 후에, 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시키고, 상기 반응이 끝나면 단백질을 제거하고, 알코올 불용성 물질인 다당류를 원심분리를 통하여 수득한 후에 상기 수득한 다당류를 이온크로마토그래피로 분리하는 방법으로 제조할 수 있다.

이 때, 상기 군소의 분쇄과정은 통상의 분쇄기를 사용하여 수행할 수 있고 예를 들어 가정용 믹서기를 이용하여 2분 동안 2,000 rpm 내지 3,000 rpm의 조건으로 수행할 수 있으며, 상기 단백질 가수분해 효소는 바람직하게는 플라보자임(flavozyme), 알카라제(alcalase), 프로타멕스(protamex), 파파인(papain), 프로텍스, 파라타제 및 뉴트라제(neutrase)로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상의 단백질 가수분해 효소, 바람직하게는 플라보자임일 수 있으며, 상기 플라보자임 효소는 상기 분쇄된 군소 1g 당 바람직하게는 400 MG 내지 600 MG를 첨가할 수 있고, 상기 효소 반응은 효소의 종류에 따라 적절하게 수행되어 질 수 있으며, 바람직하게는 50℃ 내지 70℃ 더욱 바람직하게는 57℃ 내지 63℃의 교반 배양기(shaking incubator)에서 10시간 내지 20시간, 바람직하게는 14시간 내지 16시간 반응을 시킬 수 있다.

상기 효소의 불활성화는 효소의 종류에 따라 적절하게 선택된 통상의 방법으로 수행되어 질 수 있다. 상기 단백질의 제거는 우선 2000rpm 내지 4000rpm, 바람직하게는 2500rpm 내지 3500rpm, 더욱 바람직하게는 2700rpm 내지 3300rpm으로 20분 내지 40분, 바람직하게는 25분 내지 35분 동안 원심분리하여 상등액을 수득한 후, 상기 상등액에 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)을 첨가하고, 10℃ 내지 30℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃, 더욱 바람직하게는 17℃ 내지 23℃에서 20분 내지 40분, 바람직하게는 25분 내지 35분, 더욱 바람직하게는 27분 내지 33분간 반응시킨 후에, 2000rpm 내지 4000rpm, 바람직하게는 2500rpm 내지 3500rpm, 더욱 바람직하게는 2700rpm 내지 3300rpm으로 20분 내지 40분, 바람직하게는 25분 내지 35분 동안 원심분리하여 침전한 단백질을 제거하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 트리클로아세트산을 제거하기 위하여, 상기 침전한 단백질을 제거하고 수득한 상등액에 에탄올 등의 유기 용매를 첨가한 후, 침전물을 제거하는 유기용매 침전법을 추가로 수행할 수 있다.

상기 군소 추출물의 수득은 상기 단백질, 펩타이드 및 아미노산 등을 제거하여 얻은 나머지 군소의 추출물 즉, 군소 유래 다당류를 수득하여 얻을 수 있다.

또한, 상기 수득한 군소 유래 다당류로부터 글리코사미노글리칸을 얻는 과정은 이온크로마토그래피를 수행하는 방법으로 제조될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 항암 조성물의 유효성분인 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 항암 활성이 우수할 뿐만 아니라, 식용으로 사용될 수 있는 동물을 이용하여 제조한 것이므로 부작용 등이 문제될 가능성이 적고, 세포 독성 실험을 통해 확인한 결과, 안전성이 우수하므로, 상기 항암 조성물은 암의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 또는 암의 개선 또는 예방을 위한 식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물은 유효성분으로 상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 단독으로 포함할 수 있으며, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 암은 악성 종양(malignant tumor)이라고도 하며, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리로 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하게 되는 질환을 의미하고, 상기 암은 암종(carcinoma)과 육종(sarcoma)을 포함하며, 일예로 유방암, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 식도암, 췌장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병 및 다발성 골수종 등일 수 있다.

상기 암 치료 또는 예방용 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하고, 소화기관, 배설기관 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하며, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.

상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 상기 암 치료 또는 예방용 조성물 내에 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물이 약제로 사용되거나, 의약 또는 약학적 용도로 사용되는 경우, 상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용될 수 있다.

이 경우 상기 조성물 내 상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸의 함량은 0.001 중량 % 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량% 또는 1 중량% 내지 20 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸의 함량은 약학적으로 유효한 양 또는 바람직한 양으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.

상기 ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 또한, 상기 암 치료 또는 예방용 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분들은 상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 공지의 항암제로 사용되는 물질을 더욱 포함할 수 있다.

상기 암 치료 또는 예방용 조성물이 약제로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 일 예로는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

또한, 상기 암 치료 또는 예방용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 일반적으로는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제(TABLETS), 알약, 연질 또는 경질 캅셀제(CAPSULES), 환제(PILLS), 산제(POWDERS) 및 과립제(GRANULES) 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제(SUSTESIONS), 내용액제, 유제(EMULSIONS) 및 시럽제(SYRUPS) 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 형태는 크림(CREAM), 로션제(LOTIONS), 연고제(ONITMENTS), 경고제(PLASTERS), 액제(LIQUIDS AND SOULTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 유동엑스제(FRUIDEXTRACTS), 엘릭서(ELIXIR), 침제(INFUSIONS), 향낭(SACHET), 패취제(PATCH) 또는 주사제(INJECTIONS) 등의 형태일 수 있다.

더 나아가, 본 발명의 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 제형화될 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 일 예로 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항암 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다. 상기 본 발명의 항암 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 예방용 식품 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 예로는 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제를 들 수 있다.

본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.

상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸이 포함될 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영아식 또는 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료, 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 첨가제는 본 발명의 상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸 100 중량부 당 0 내지 20 중량부, 바람직하게는 0.00001 내지 15 중량부 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 기능성음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 중량부 내지 20 중량부, 바람직하게는 1 중량부 내지 18 중량부, 더욱 바람직하게는 5 중량부 내지 12 중량부 포함될 수 있다.

또한, 상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 예방용 식품 조성물에 있어서, 상기 항암 조성물 또는 상기 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸의 양은 전체 식품 중량의 0.00001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 음료 조성물의 경우 식품 전체의 부피 100 ml 를 기준으로 0.001 g 내지 50 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 10 g의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 이용한 항암 조성물의 제조 방법, 구체적으로 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은 내장을 제거한 군소를 동결건조하고 분쇄하여 군소 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 군소 분쇄물에 가수분해효소를 첨가하고 반응시켜 가수분해물을 제조하는 단계; 상기 가수분해물에 트리클로로아세트산(trichloroacetiec acid)을 첨가하여 단백질을 제거하는 단계; 상기 단백질을 제거한 가수분해물에 에탄올을 첨가하여 다당류를 추출하는 단계 및 상기 추출된 다당류를 이온교환크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 군소 분쇄물을 제조하는 단계는 통상의 분쇄기를 사용하여 수행할 수 있고 예를 들어 가정용 믹서기를 이용하여 1분 내지 3분, 바람직하게는 1분 30초 내지 2분 30초 동안 2,000 rpm 내지 3,000 rpm, 바람직하게는 2,300 rpm 내지 2,700 rpm의 조건으로 수행할 수 있다.

상기 가수분해물을 제조하는 단계는 상기 군소 분쇄물에 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시키는 과정 및 상등액을 얻는 과정을 포함할 수 있다. 상기 단백질 가수분해 효소는 플라보자임(flavozyme), 알카라제(alcalase), 프로타멕스(protamex), 파파인(papain), 프로텍스, 파라타제 및 뉴트라제(neutrase)로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 플라보자임일 수 있다. 상기 군소 분쇄물은 pH가 pH 5.5 내지 pH 6.5, 바람직하게는 5.7 내지 pH 6.2로 조절된 반응액에 군소 분쇄물을 첨가하여 제조한 것일 수 있다. 상기 반응액은 구체적으로, 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충액일 수 있고, 더욱 구체적으로는 50 mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충액일 수 있다. 상기 완충액은 중량을 기준으로 상기 군소 분쇄물의 8배 내지 12배, 바람직하게는 9 내지 11배의 완충액을 첨가할 수 있다. 상기 단백질 가수분해 효소의 첨가량은 완충액에 대한 기질인 군소 분쇄물의 농도의 약 1% 내지 3%일 수 있고, 일 예로, 상기 군소 분쇄물의 함량이 1g인 경우에 상기 단백질 가수분해 효소 중 하나인 플라보자임의 첨가량이 400 MG 내지 600 MG 또는 450 MG 내지 550 MG일 수 있다.

상기 단백질 가순분해 효소의 반응 온도조건은 50℃ 내지 70℃ 더욱 바람직하게는 57℃ 내지 63℃일 수 있고, 반응시간은 10시간 내지 20시간, 바람직하게는 14시간 내지 16시간일 수 있다.

상기 단백질 가수분해 효소의 반응 후에 상기 단백질 가수분해 효소를 불활성화하는 과정을 수행할 수 있으며, 상기 분활성화하는 과정은 효소의 종류에 따라 적절하게 선택된 통상의 방법으로 수행되어 질 수 있다.

상기 상등액을 얻는 과정은 상기 군소 분쇄물에 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시킨 반응물을 2000rpm 내지 4000rpm, 바람직하게는 2500rpm 내지 3500rpm, 더욱 바람직하게는 2700rpm 내지 3300rpm으로 20분 내지 40분, 바람직하게는 25분 내지 35분 동안 원심분리하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 가수분해물에 트리클로로아세트산(trichloroacetiec acid)을 첨가하여 단백질을 제거하는 단계는 상기 수득한 상등액에 상기 트리클로로아세트산을 전체 부피를 기준으로 즉, 최종농도가 2% 내지 4%, 바람직하게는 2.7% 내지 3.3%가 되도록 첨가하고, 10℃ 내지 30℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃, 더욱 바람직하게는 17℃ 내지 23℃에서 20분 내지 40분, 바람직하게는 25분 내지 35분, 더욱 바람직하게는 27분 내지 33분간 반응시킨 후에, 2000rpm 내지 4000rpm, 바람직하게는 2500rpm 내지 3500rpm, 더욱 바람직하게는 2700rpm 내지 3300rpm으로 20분 내지 40분, 바람직하게는 25분 내지 35분 동안 원심분리한 후, 상등액을 수득하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 트리클로아세트산을 제거하기 위하여, 상기 침전한 단백질을 제거하고 수득한 상등액에 에탄올 등의 유기 용매를 첨가한 후, 침전물을 제거하는 유기용매 침전법을 추가로 수행할 수 있다.

상기 단백질을 제거한 가수분해물에 에탄올을 첨가하여 다당류를 추출하는 단계는 상기 단백질을 제거한 가수분해물을 감압농축하는 과정, 상기 감압농축된 가수분해물에 에탄올을 첨가하는 과정 및 상기 에탄올이 첨가된 가수분해물을 원심분리하여 침전물을 수득하는 과정을 포함하는 것일 수 있다.

상기 감압농축하는 과정은 상기 단백질을 제거한 가수분해물 즉, 수득된 상등액의 Brix가 50 Brix 내지 70 Brix, 바람직하게는 55 Brix 내지 65 Brix, 더욱 바람직하게는 57 Brix 내지 63 Brix가 될 때까지 증발시키는 방법으로 수행할 수 있고, 상기 증발은 일 예로 회전진공증발기 등을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 감압농축하는 과정은 40℃ 이하, 구체적으로 40℃ 내지 15℃ 또는 35℃ 내지 20℃에서 수행할 수 있다.

상기 에탄올을 첨가하는 과정은 상기 감압농축시킨 상등액에 100% 에탄올을 상기 상등액의 부피를 기준으로 약 400% 내지 600% 또는 450% 내지 550%의 함량의 에탄올을 첨가하는 방법으로 수행할 수 있고, 상기 에탄올을 첨가한 후 알콜성 불용성 물질이 침전될 때까지 일정 시간, 일 예로 1분 내지 30분 정도 방치하는 과정을 추가로 수행할 수 있다.

상기 침전물을 수득하는 과정은 2000rpm 내지 4000rpm, 바람직하게는 2500rpm 내지 3500rpm, 더욱 바람직하게는 2700rpm 내지 3300rpm으로 20분 내지 40분, 바람직하게는 25분 내지 35분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 추출된 다당류를 이온교환크로마토그래피로 분리하는 단계는 상기 수득한 침전물을 반응액으로 용해시키는 과정 및 상기 반응액과 2M NaCl를 포함하는 인산 나트륨 완충액을 이용하여 이온교환크로마토그래피를 수행하는 과정을 포함하는 것일 수 있다.

상기 반응액은 pH가 pH 5.5 내지 pH 6.5, 바람직하게는 5.7 내지 pH 6.2로 조절된 반응액일 수 있고, 더욱 바람직하게는 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충액일 수 있으며, 일 예로 50 mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충액일 수 있다. 상기 수득한 침전물을 반응액으로 용해시키는 과정은 40 mg/mL침전물(w)/반응액(w)) 내지 60 mg/mL(침전물(w)/반응액(w)), 바람직하게는 45 mg/mL침전물(w)/반응액(w)) 내지 55 mg/mL(침전물(w)/반응액(w))일 수 있다.

상기 이온교환크로마토그래피를 수행하는 과정은 수지 컬럼(resin column)에 상기 반응액을 주입하는 방법으로 수행하는 이온교환크로마토그래피 장치의 컬럼을 상기 반응액으로 평형화시키는 과정을 더욱 포함할 수 있다.

상기 이온교환크로마토그래피를 수행하는 과정은 상기 반응액, 구체적으로 인산 나트륨 완충액(A 용매)과 2M NaCl를 포함하는 인산 나트륨 완충액(B 용매)을 선형구배하면서, 0분 내지 30 min분의 구간에서는 A 용매 100%, 30분 내지 60분의 구간에서는 A 용매 100%에서 B 용매 100%, 60분 내지 90분의 구간에서는 B 용매 100%, 90분 내지 120분의 구간에서는 B 용매 100%에서 A 용매 100%로, 120분 내지 150분의 구간에서는 A용매 100%의 조건으로, 유속 1 mL/min로 수행하였다. 상기 이온교환크로마토그래피에서 글리코사미노글리칸을 수득하는 과정은 B 용매가 25% 내지 37.5%인 구간에서 즉, NaCl이 0.5 M 내지 0.75 M인 구간에서 용출되는 용출액을 수집하는 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 암세포에 대한 세포성장실험(Cell Proliferation Assay) 분석결과 암세포 사멸효과를 가지는 것으로 확인되었을 뿐만 아니라, 식품으로 이용가능한 천연물로부터 유래된 것으로 부작용이 문제될 가능성도 낮고, 세포 독성 실험을 통하여 확인한 결과 안전성도 인정되므로, 다양한 암의 치료, 개선 및 예방을 위하여 여러 방면으로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 군소 유래 다당류에 대해 이온교환크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, poferritin(MW 443,000), alcohol dehydrogenase(MW 150,000), fructose-6-phosphate kinase(MW 84,000) 및 carbonic anhydrase(MW 29,000)를 이용하여 도출한 표준 검량 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 이온교환크로마토그래피 획분의 분자량을 Superdex 200 HR column을 이용하여 254 nm에서 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 이온교환크로마토그래피 획분을 산 가수분해한 뒤, HPAED-PAD를 수행하여 상기 획분의 조성을 확인한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, chondroitin sulfate A를 사용하여 효소 분해 시에 이탄당(Disaccharides)의 농도를 도출한 표준 검량 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 이온교환크로마토그래피 획분의 글리코사미노글리칸의 이탄당 분석을 위해 SAX-HPLC를 수행하여 상기 획분의 이탄당을 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, IEC-6 세포주를 이용하여, 군소 유래 글리코사미노글리칸의 정상 세포에 대한 세포독성 즉, 정상세포의 생존율을 확인한 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 군소 추출물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 측정된 세포의 수를 군소 유래 글리코사미노글리칸을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 환산한 값이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, AGS 세포주를 이용하여, 군소 유래 글리코사미노글리칸의 항암효과 즉, 암세포 성장저해 효과를 확인하기 위하여, 암세포의 생존율을 확인한 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 군소 유래 글리코사미노글리칸의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 측정된 세포의 수를 군소 유래 글리코사미노글리칸을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 환산한 값이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시한 것일 뿐으로 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 군소 유래 글리코사미노글리칸의 제조

1-1. 군소 유래 다당류의 제조

군소(Aplysia kurodai)는 대한민국 경남도 통영시 소재 군소 중간 집하장(통영시 잠수기조합, 대한민국)에서 끓는 물에서 5분 동안 자숙하여 물기를 제거한 것으로 수득하였다. 상기 수득한 군소는 육과 내장을 분리하여, 내장을 제거하고, 동결건조한 후, -20℃의 냉동고에서 보관하면서 시료로 사용하였다.

상기 보관한 군소 동결 건조시료 1 g에 약 10배량의 50 mM sodium phosphate 완충액 (pH 6.0)을 첨가하고, 기질에 대하여 단백질 농도비가 1/50 즉, 2%가 되도록 플라보자임(flavourzyme, Sigma, Co., USA), 뉴트라제(neutrase, Sigma, Co., USA) 및 파파인(papain, Sigma, Co., USA)을 각각 500 MG씩 첨가하였다. 상기 효소를 첨가한 후, 반응온도(40℃, 50℃ 및 60℃) 및 반응시간(6시간, 15시간 및 24시간)을 달리하면서 반응시켰다.

상기 가수분해 후에, 3,000 rpm의 조건으로 30 분간 원심분리하여 얻은 가수분해물의 상등액만을 분리하였다. 상기 상등액에 전체 반응액 부피를 기준으로 최종농도가 3%(w/v)가 되도록 trichloroacetic acid를 첨가하고 실온, 일 예로 17℃에서 30분 동안 방치하여 단백질을 침전시킨 후 3,000 rpm의 조건으로 30 분간 원심분리하여 침전한 단백질을 제거하고 상등액을 수득하였다.

상기 단백질을 침전시킨 후에, 40℃ 이하, 일 예로 20℃에서 상기 단백질 침전을 제거하고 수득한 상등액의 농도를 회전진공증발기를 이용하여 감압농축하는 방법으로 조절한(11.0 Brix, 29.5 Brix, 42.0 Brix, 50.0 Brix 및 60.0 Brix) 후에, 상기 농축물에 상기 농축물을 기준으로 에탄올의 함량을 달리하면서(300%(v/v), 500%(v/v) 및 700%(v/v)) 첨가하여, 알코올 불용성 물질을 침전시키고, 3,000 rpm의 조건으로 30 분간 원심분리하여 상등액을 제거함으로써 침전물을 회수하는 방법으로 군소 유래 추출 다당류를 수득하였다.

상기 제조과정에서 효소의 종류 및 효소 반응 조건에 따른 최종 추출물의 제조 수율을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 상기 최종 추출물의 제조와 관련하여, 상기 에탄올 첨가 전 상등액의 농도는 60 Brix이었고, 상기 에탄올 첨가량은 상기 농축물의 500%를 첨가하였다. 하기 표 1에 기재된 수율은 최초 이용된 시료 대비 수득된 추출물의 질량을 %농도로 표시한 것이다.

효소종류	번호	반응시간(hr)	반응온도()	수율(%)
Flavourzyme	F-1	6	40	5.3
	F-2	15		1.7
	F-3	24		6.9
	F-4	6	50	4.1
	F-5	15		6.9
	F-6	24		6.5
	F-7	6	60	8.5
	F-8	15		12.8
Neutrase	N-1	6	40	7.4
	N-2	15		5.6
	N-3	24		4.9
	N-4	6	50	7.3
	N-5	15		4.2
	N-6	24		5.6
	N-7	6	60	8.1
	N-8	15		4.2
Papain	P-1	6	40	2.2
	P-2	15		3.9
	P-3	24		5.5
	P-4	6	50	2.0
	P-5	15		2.9
	P-6	24		3.6
	P-7	6	60	2.0
	P-8	15		2.9

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 반응효소로 최적인 효소는 플라보자임인 것으로 확인되었다. 상기 각 효소의 최적 반응조건을 비교한 결과, 파파인에 비해서는 약 350%, 뉴트라제에 비해서도 약 250%로 군소 유래 추출물 제조를 위해서는 플라보자임이 가장 최적인 것으로 확인되었다.

또한, 상기 플로보자임의 최적 반응조건은 60℃에서 15시간 동안 반응시키는 것으로 확인되었다. 60℃에 반응시키는 경우 뉴트라제 등의 경우에는 반응에 의한 추출물의 수득이 매우 소량이어서 측정되기 힘든 것으로 확인되어, 상기 표에 기재하지 아니하였다. 플로보자임의 경우 상기 60℃에서 24시간 동안 반응시키는 경우 수율이 12.5%로 오히려 감소되는 것을 확인되어, 상기 반응시간으로는 수율 및 반응시간 등을 고려한 경제성의 측면에서 15시간이 가장 바람직한 것으로 확인되었다.

상기 제조과정에서 상등액의 농도 및 에탄올 첨가량에 따른 최종 추출물의 제조 수율을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다. 하기 표 2 및 표 3에 기재된 함량은 대비 수득된 추출물의 질량을 나타내며, 하기 표 3에 기재된 에탄올 첨가량은 농축된 반응액 대비 에탄올 첨가량을 %농도로 표시한 것이다.

반응액의 농도	수득량(g)
11.0 Brix	0.04
29.5 Brix	0.22
42.0 Brix	0.49
50.0 Brix	0.64
60.0 Brix	0.83

에탄올 첨가량(%)	수득량(g)
300	0.41
500	0.81
700	0.96

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 반응액의 농도에 따라 최종적으로 수득된 군소 추출물의 수득량은 농도 의존적으로 증가하는 것으로 확인되었다. 한편, 상기 반응액의 농도가 너무 높은 경우에는 너무 높은 점도로 인하여 오히려 군소 추출물의 수득이 어려워, 최종 수율이 낮아질 수 있다는 문제점이 발생할 수 있다. 따라서, 상기 반응액의 농도는 60.0 Brix가 바람직한 것으로 확인되었다.

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 에탄올 첨가량이 상기 반응액의 500%인 경우에는 에탄올 첨가량이 300%인 경우에 비하여 수득량이 약 2배로 증가하여, 현저한 수율향상이 있는 것으로 확인되었다. 한편, 상기 반응액의 700%의 에탄올을 첨가한 경우에는 동일한 정도의 에탄올 함량 증가에도 불구하고 수율향상이 낮은 것으로 확인되었으며, 너무 많은 에탄올의 첨가에 의한 반응시간 및 비용 등을 고려한 경제적 측면에서 바람직한 에탄올의 함량은 반응액 기준 500%(v/v)인 것으로 결정되었다.

따라서, 이하에서 기능성 확인을 위해 제조된 군소 추출물은 다음과 같은 과정으로 제조한 것을 사용하였다. 우선, 군소 동결 건조시료 1 g에 약 10배량의 50 mM sodium phosphate 완충액 (pH 6.0)을 첨가하고, 기질에 대하여 2%가 되도록 플라보자임을 첨가한 후, 60℃에서 15시간 동안 반응시킨 후에 원심분리하여 가수분해물 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 가수분해물의 상등액에 trichloroacetic acid를 첨가하여 침전한 단백질을 제거하고 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 상등액을 60.0 Brix로 감압농축하여 농축물을 제조한 후에, 상기 농축물에 상기 농축물 부피의 500%(v/v) 함량의 에탄올을 첨가하여, 알코올 불용성 물질을 침전시키고, 상등액을 제거함으로써 침전물을 회수하는 방법으로 군소 유래 다당류를 제조하였다.

1-2. 이온교환크로마토그래피

상기 실시예 1-1에서 최적 조건에 의하여 추출한 군소 유래 다당류는 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.0)를 이용하여 용해시켜 최종 농도가 50 mg/mL인 반응원액으로 제조하였다.

또한, 이온교환크로마토그래피에 사용될 DEAE-Sepharose fast flow resin column(1.6 x 15 cm)은 상기 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.0)으로 평형화시켰다. 상기 평형화시킨 컬럼에 상기 반응원액 200 μL를 넣고, 칼럼 부피와 동량의 50 mM sodlium phosphate buffer(pH 6.0, A 용매)로 세척한 후, 2 M NaCl을 포함한 50 mM sodlium phosphate buffer(B용매)로 선형균배 하였다.

상기 선형균배 과정은 0분 내지 30 min분의 구간에서는 A 용매 100%(0-30 min; A, 100%), 30분 내지 60분의 구간에서는 A 용매 100%에서 B 용매 100%(30-60 min; A→B, 100%), 60분 내지 90분의 구간에서는 B 용매 100%(60-90 min; B, 100%), 90분 내지 120분의 구간에서는 B 용매 100%에서 A 용매 100%로(90-120 min; B→A 100%), 120분 내지 150분의 구간에서는 A용매 100%(120-150 min; A, 100%)의 조건으로 수행하였고, 유속은 1 mL/min이었으며, 254 nm에서 monitoring하였다. 용출되는 시료의 분획은 0분 내지 70분의 범위에서는 5 mL씩 분취하였고, 70분 내지 120 min에서는 2 mL씩 분취하였다.

상기 이온교환크로마토그래피 수행 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 매우 단순한 패턴의 피크(peak)가 검출되었다. GAGs는 ion-chromatography 상에서 NaCl 농도 특이적 용출 패턴을 나타내었다. 일반적으로 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)은 이온교환크로마토그래피 상에서 각기 다른 NaCl 이온강도 하에서 용출되기 때문에 피크가 겹치는 일이 드물고 이에 따라 분획하기도 용이한 정제 과정을 가지고 있다.

상기 도 1에 나타낸 바와 같이 용출 부피(volume) 약 72 mL 상에서 하나의 피크가 검출되었다. 이온크로마토그래피를 통해 얻은 크로마토그램 상의 전기전도도를 확인한 결과, 0.5 M 내지 0.75 M NaCl 상에서 용출되는 물질임을 확인할 수 있었고, 상기 결과로부터 약 72 mL 상에서 용출된 글리코사미노글리칸의 주요 구성당은 헤파린(heparin) 또는 헤파린 황산(heparan sulfate)일 것으로 추정되었다.

< 실시예 2> 군소 유래 글리코사미노글리칸의 분석

2-1. 이온교환크로마토그래피 분획의 분자량 측정

상기 실시예 1-2에서 수득한 이온교환크로마토그래피 획분의 분자량을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 정제된 물질을 50 mM sodlium phosphate buffer(pH 6.0)로 평형화된 Superdex 200 HR column(1.0 x 30 cm)을 이용하여 유속 0.3 mL/min로 용출하면서, 254 nm에서 측정(monitoring)하였다. 상기 측정결과는 poferritin(MW 443,000), alcohol dehydrogenase(MW 150,000), fructose-6-phosphate kinase(MW 84,000) 및 carbonic anhydrase(MW 29,000)로부터 도출된 도 2의 표준 검량 곡선식에 따라 정량하였다.

상기 측정한 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-2에서 수득한 물질의 분자량은 약 30 kDa인 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터 상기 실시예 1-2에서 수득한 물질에는 헤파린(heparin) 또는 헤파린 황산(heparan sulfate)이 존재하고 있는 것으로 예상되었다.

2-3. 이온교환크로마토그래피 분획의 Bio - LC 에 의한 조성 분석

상기 실시예 1-2에서 수득한 이온교환크로마토그래피 획분의 조성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 정제된 물질을 10 mg/mL 농도로 용해하여 정제된 물질이 2 mg이 되도록 분취한 후, 최종농도가 2 M이 되도록 trifluoroacetic acid(TFA, Sigma Co., USA)를 첨가하고, 100℃에서 4시간 동안 산가수분해 한 뒤 Speed-vac(DP23080A, Sunonwealth Elec Mach Ind Co. Ltd., China)으로 건조하였다. 상기 건조 후에, 정제수로 수회 세척 후, 탈이온수 100 μL에 용해하여 16 mM NaOH 용액으로 평형화된 CarboPac PA1 column(0.45 x 25 cm, Dionex Co., USA)에 유속 1.0 mL/min로 흘려보내며 HPAED-PAD(High-performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector, Dionex Co., USA)으로 검출하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-2에서 정제된 물질에는 fucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucose 및 galactose와 미량의 mannose 및 xylose이 포함되어 있는 것으로 확인되었고, 그 중 N-acetylgalactosamine 및 N-acetylglucosamine이 70%이상을 차지하는 다당복합체인 것으로 확인되었다.

2-3. 이온교환크로마토그래피 분획의 구성당 확인

상기 실시예 1-2에서 수득한 이온교환크로마토그래피 획분의 구성당을 확인하기 위하여, 효소를 통하여 해중합(depolymerization)을 통해 글리코사미노글리칸의 구성당을 확인하였다.

상기 해중합(depolymerization)을 통해 글리코사미노글리칸의 구성당을 확인은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

상기 실시예 1-2에서 수득한 물질 100 μg를 chondroitin sulfate ABC lyase (Sigma Co., USA)와 heparinase I(Sigma Co., USA)로 각각 37℃에서 15시간동안 가수분해하였다. 상기 가순분해 후에 반응물을 100℃에서 2분 동안 실활시키고, 0.45 μm 필터로 여과한 후 13 mL 시험관에 여과액 50 μL를 분취하여 30 mM HCl 250 μL를 첨가하고 반응시켰다. 상기 반응 후, 최종 반응액에 대해 UV spectrophotometer를 이용하여 232nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정결과는 표준품으로는 chondroitin sulfate A를 사용한 도 5의 검량 곡선식에 따라 정량 하였다. 상기 정량 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 상기 표 4에 기재된 Disaccharides의 농도의 단위는 100 μg 당 생성된 Disaccharides의 양(μg)을 의미한다.

반응효소의 종류	condroitin sulfate ABC lyase	heparinase I
Disaccharides 농도	22.1	36.1

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-2에서 수득한 물질 100 μg을 chondroitin sulfate ABC lyase를 이용해 가수분해한 결과 22.1 μg의 이당류가 검출되어, 약 20% 이상의 이당류(disaccharides)를 함유하고 있는 것으로 나타났고, heparinase I을 이용해 가수분해한 결과 36.1 μg의 이당류가 검출되어, 약 35%의 이당류를 함유하고 있는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 실시예 1-2에서 수득한 물질은 글리코사미노글리칸으로 구성된 다당 복합체이며, 상기 글리코사미노글리칸은 상기 글리코사미노글리칸의 기본형태를 구성하는 이당류 단위가 전체 구성단위 중 약 58% 이상인 것으로 예상되었다.

2-4. SAX - HPLC 에 의한 이탄당의 구성당 확인

상기 실시예 1-2에서 수득한 이온교환크로마토그래피 글리코사미노글리칸의 이탄당(disaccharides) 분석을 위해, SAX-HPLC법을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 수득한 물질 50 μg을 chondroitin sulfate ABC lyase와 heparinase I로 37℃에서 15시간 동안 가수분해 하였다. 그 후에 100℃에서 2분 동안 실활 시키고 0.45 ㎛ 필터로 여과한 뒤 탈이온수로 평형화된 SAX column(Phenosphere 5μ SAX 80A, 25 x 0.46 cm, Phenomenex Co., USA)상에서 2 M NaCl(pH 3.5) 용액으로 선형 균배하여 232nm에서 검출하였다. 상기 검출 결과를 확인하기 위해 표준품으로 heparin/heparan sulfate disaccharide kit(Seikagaku, Co., Japan)를 사용하였다. 상기 분석결과는 도 6에 나타내었다.

상기 도 6에 나타낸 바와 같이, Heparinase I을 사용한 A는 heparin/heparan sulfate disaccharide kit의 4GlyUA→4GlcNS(6S)와 일치하는 35분대에서 peak가 용출 되었으며, chondroitin sulfate ABC lyase를 사용한 B는 heparin/heparan sulfate disaccharide kit의 4GlyUA(2s)→4GlcNS와 일치하는 36분대에서 peak가 용출되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 결과로부터 상기 실시예 1-2에서 수득한 이온교환크로마토그래피 글리코사미노글리칸의 이탄당은 헤파린 황산임을 예상할 수 있었다.

< 실시예 3> 세포 배양

상기 세포의 배양(Cell culture)에 사용된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), FBS(fetal bovine serum) 및 RPMI 1640은 Hyclone Co.(USA)에서 구입하였다. 또한, 페니실린-스트렙토마이신 및 LPS(lipopolysaccharide)는 Gibco/BRL(USA)에서 구입하였다.

상기 실시예 1에서 제조된 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸의 세포독성 및 항암효과를 측정하기 위한 세포주로 위암세포주(AGS cell line) 및 정상 세포주(IEC-6 cell line)은 모두 한국 세포주 은행(KCLB, 대한민국)에서 구입하였다.

상기 AGS cell line 세포 및 IEC-6 cell line 세포는 각각 10% FBS가 포함된 DMEM 배양액을 사용하여 배양하였고, 36.5℃의 습윤한 CO₂배양기(5% CO₂ 및 95% air 조건)에서 배양하였다. 상기 세포는 계대배양을 하였고, 배지는 2일마다 교환하였다. 보다 구체적으로, 상기 세포가 배양접시의 약 80%가 차게 배양된 후, PBS(Phospate Bufferd Saline, pH 7.4)로 세포의 단층을 2번 씻어내고, 0.25% 트립신(trypsin) 및 2.56 mmol/L EDTA를 이용하여 1분 동안 처리하여 세포가 배양접시로부터 떨어지면, FBS를 포함하는 상기 배양액 동량을 넣고 1,000 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 상기 원심분리를 통해 얻은 세포는 뭉치지 않게 풀어준 후, 새 배지에 희석하여 계대 배양하였다.

< 실시예 4> 세포 독성 실험

상기 실시예 1에서 제조된 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸의 정상세포에 대한 독성여부를 확인하기 위하여, rat 유래의 회장세포(rat intestinal epithelial cell)인 IEC-6 세포주(Mouse illeum cell line)를 한국 세포주 은행 (KCLB, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다.

보다 구체적으로, 상기 IEC-6 세포주의 세포를 96 well plate에 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주하고, 36.5℃의 습윤한 CO₂배양기(5% CO₂ 및 95% air 조건)에서 24시간 동안 배양하면서 안정화시켰다. 상기 세포에 상기 실시예 1에서 제조된 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸(ASF)을 농도(1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL)를 달리하여 24시간 동안 처리한 후 MTS 시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하여 정상세포에 대한 독성여부를 측정하였다.

보다 구체적으로, 상기 독성 여부의 측정은 상기 24시간동안 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸 처리 후에, MTS 시약을 1시간 동안 처리한 후 microplate reader(Perkin Elmer 1420, VICTORTM X Multilabel Plate Readers, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 수행하였다. 상기 측정된 결과는 도 7에 나타내었고, 상기 도 7의 세포 생존율은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.

상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 100 μg/mL의 농도에서 오히려 약간의 세포수의 증가를 나타내어, 100 μg/mL의 농도까지는 장내 상피세포에 대한 독성이 없는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 세포독성은 없는 것으로 확인되었다.

< 실시예 5> 항암 효과 측정

상기 실시예 1에서 제조된 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸의 항암효과를 측정하기 위하여, 인간의 위암세포인 AGS 세포주를 이용하여 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, AGS 세포주의 배양을 위하여 10% FBS를 함유한 RPMI 배지를 사용하여 1주일에 2회 내지 3회 계대하였고, 배지는 2일에 1회 교환하였다. 상기 세포를 96 well plate에 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주하고, 36.5℃의 습윤한 CO₂배양기(5% CO₂ 및 95% air 조건)에서 24시간 동안 배양하면서 안정화시켰다. 상기 세포에 상기 실시예 1에서 제조된 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 상기 실시예 4에서 세포 안전성이 확인된 농도까지 농도(10 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL)를 달리하여 72시간 동안 처리한 후 MTS 시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하여 정상세포에 대한 독성여부를 측정하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

상기 도 8에서 확인된 바와 같이, 72시간 시료 처치 후에는 대조군에 대비하여 군소 추출물 10 μg/mL은 68.5%의 생존율을, 100 μg/mL에서는 59.3% 생존율을 보여주어, 상기 실시예 1에서 제조된 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 100 μg/mL 처리하는 경우 약 40%에 가까운 암세포의 성장억제 효능을 나타내었다.

상기 결과로부터 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 암세포 사멸(생성억제) 효과가 우수할 뿐만 아니라, 결장 상피세포를 이용한 독성 실험 수행 결과, 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다. 상기와 같은 결과로 인해 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸은 건강기능성식품의 원료와 화장품 및 의약품 원료로서의 개발 가능성이 있을 것으로 생각된다.

Claims (5)

1. 군소(Aplysia kurodai)로부터 추출한 글리코사미노글리칸(glycosaminoglyca)을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 글리코사미노글리칸은 하기 화학식 1의 화학식으로 표시되는 2당류 및 화학식 2의 의 화학식으로 표시되는 2당류로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 항암 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   [화학식 2]
   

   
3. 제1항의 항암 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
4. 제1항의 항암 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 예방용 식품 조성물.
5. 내장을 제거한 군소를 동결건조하고 분쇄하여 군소 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 군소 분쇄물에 플라보자임을 첨가하고 57℃ 내지 63℃에서 14시간 내지 16시간 동안 반응시키는 단계; 상기 가수분해물에 트리클로로아세트산(trichloroacetiec acid)을 첨가하여 단백질을 제거하는 단계; 상기 단백질을 제거한 가수분해물에 에탄올을 첨가하여 다당류를 추출하는 단계 및 상기 추출된 다당류를 이온크로마토그래피로 분리하는 단계
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 군소로부터 추출한 글리코사미노글리칸의 제조방법.

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