KR20110129528A - 전기화학적 바이오센서 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 금속 나노입자가 분산된 그래핀 시트의 다이아몬드 박막 전극을 이용한 전기화학적 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오센서는, 기판; 효소 반응이 발생되는 작업전극 및 상기 작업전극과의 전기적 출력 차이를 검출하기 위한 상대전극을 포함하는 전기화학적 바이오센서로서, 상기 작업전극은, 불순물 도핑된 다이아몬드층; 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층 상에 형성된 그래핀층; 및 상기 그래핀층 상에 형성된 금속 나노입자층을 포함하는 것이 특징이다.

Description

전기화학적 바이오센서 및 그 제조방법{Electrochemical biosensor and method of fabricating the same}
본 발명은 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 작업전극의 감도가 향상되도록 전극 물질을 개선한 전기화학적 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것이다.
종래의 바이오센서에는 기판에 특정한 물질을 고정하고, 그에 특이적으로 결합하는 표적 물질을 결합시킴으로써 표적 물질을 검출 또는 분석하는 다양한 바이오센서들이 알려져 있었다. 특히, 이러한 바이오센서 중에서도 효소(enzyme)를 사용하여 효소-기질 간의 전기화학적 반응으로부터 야기되는 전기적 신호를 검출하기 위한 여러 가지 전기화학적 바이오센서들이 알려져 있으며, 이는 혈중 포도당 농도 및 혈중 콜레스테롤 농도와 같은 수치들을 비교적 정밀하게 측정하는 것을 가능하게 한다.
특히, 혈중 포도당 농도를 측정하기 위한 바이오센서에 대한 연구가 광범위하게 수행되고 있으며, 이는 하기와 같은 원리에 의해서 혈중 포도당 농도를 측정하게 된다. 즉, 작업전극 상에 포도당을 산화시킬 수 있는 효소인 글루코오스 산화효소(glucose oxidase, GOx)를 고정시키고, 상기 글루코오스 산화효소는 측정 시료 중의 포도당을 글루콘산(gluconic acid)으로 전환시키면서 그 자신은 환원형 글루코오스 산화효소로 변화하게 된다. 상기 환원된 글루코오스 산화효소는 다시 산소와 반응하여 과산화수소를 발생시키거나 또는 전자전달 매개체를 환원형으로 전환시키게 되는데, 이러한 과산화수소 또는 환원형 전자전달 매개체의 재산화 과정에서 측정되는 산화 전류 등을 측정함으로써 혈중 포도당 농도를 측정할 수 있게 된다.
기존의 바이오센서는 전극 표면 처리를 통한 감도 향상에 중점을 두고 개발되고 있다. 그러나, 암과 같이 질환들 중에는 단분자 물질까지도 검출이 불가피한 경우도 있다. 따라서, 다양한 질병에 대한 정확한 진단을 위해서는 고감도 못지않게 미량의 농도 검출과 재현성도 센서 개발에 있어 중요한 요소들이다.
보론이 도핑된 다이아몬드 박막을 센서 전극으로 이용하는 연구가 시도되고 있다. 다이아몬드는 생체 적합성 뿐 아니라, 화학 안정성, 열 전도성, 견고성, 광학적 특성이 우수하다. 그러나 다이아몬드 자체는 전기적 전류 전도가 안 되는 절연체이기 때문에, 보론을 도핑함으로써 반도체의 특성을 보인다. 보론이 도핑된 다이아몬드 박막 전극은 높은 신호-잡음비와 오랜 안정성, 높은 감도, 좋은 재현성을 보이기 때문에, 기존 금이나 백금 등의 전극을 사용할 때보다 더 낮은 농도까지 검출이 가능하다. 그런데, 보론이 도핑된 다이아몬드 박막은 소수성을 띄므로, 친수성의 생체 물질과 결합이 쉽지 않아 그에 따른 표면 처리 기술이 요구된다.
현재까지 주로 연구된 표면 처리 방법은 대부분 화학 물질을 이용하는 방법으로, 복잡하고 제한적이며 처리 시간이 길다. 이러한 이유 때문에 아직까지 보론이 도핑된 다이아몬드 박막을 바이오센서에 적용한 사례는 많지 않다. 따라서 쉽고 보편적인 표면 처리 기술이 요구된다.
또한, 전극 표면에 고정화되는 바이오물질의 양은 바이오센서의 감도에 영향을 미치는 중요한 요인들 중에 하나로, 이러한 물질들을 고정화할 수 있는 유효 면적 또한 고감도 센서 개발에 중요한 인자이다. 이러한 문제점들을 극복하고자 우수한 물성의 나노 물질들의 개발과 이들을 이용한 센서 개발이 요구되고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 고감도이면서 저농도 물질까지 검출이 가능하고 좋은 재현성을 갖는 바이오센서 및 그 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기의 기술적 과제를 해결하기 위한, 본 발명에 따른 바이오센서는, 기판; 효소 반응이 발생되는 작업전극 및 상기 작업전극과의 전기적 출력 차이를 검출하기 위한 상대전극을 포함하는 전기화학적 바이오센서로서, 상기 작업전극은, 불순물 도핑된 다이아몬드층; 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층 상에 형성된 그래핀층; 및 상기 그래핀층 상에 형성된 금속 나노입자층을 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 따른 바이오센서는, 상기 금속 나노입자층 상에 글루코오스 산화효소(glucose oxidase)를 포함하는 효소 반응 물질층을 더 포함할 수 있으며, 상기 금속 나노입자층은 백금 나노입자층인 것이 바람직하다. 바람직하게, 상기 그래핀층과 금속 나노입자층은 금속 나노입자가 분산된 그래핀 시트(sheet)이다.
본 발명에 따른 바이오센서 제조방법에서는 불순물 도핑된 다이아몬드층을 형성하는 단계; 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층 상에 그래핀층을 형성하는 단계; 및 상기 그래핀층 상에 금속 나노입자층을 형성하는 단계를 포함하여 작업전극을 형성하게 된다.
특히, 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층을 형성하는 단계는, 기판 상에 다이아몬드 나노결정 씨드를 코팅하는 단계; 및 B2H6, CH4 및 H2 가스를 이용해 상기 기판 상에 보론 도핑된 다이아몬드층을 증착하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 다이아몬드 나노결정 씨드를 코팅하는 단계는, 다이아몬드 나노결정을 PSS[poly sodium 4-styrene sulfonate] 수용액에 분산시키는 단계; 상기 기판으로 열산화된 실리콘 기판을 준비하는 단계; 및 상기 기판을 상기 다이아몬드 나노결정이 분산된 수용액 중에 침지한 후 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 불순물 도핑된 다이아몬드층 상에 그래핀층을 형성하는 단계는, 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층 상에 그래핀 시트를 부착하는 것일 수 있고, 상기 그래핀층 상에 금속 나노입자층을 형성하는 단계는, 상기 그래핀층이 형성된 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층을 타겟 금속의 수용액 속에 침지하여 전기화학적인 방법으로 상기 그래핀층 상에 상기 금속의 나노입자를 증착하는 것임이 바람직하다. 특히, 상기 그래핀층이 형성된 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층을 K2PtCl6을 포함하는 수용액 속에 침지하여 -0.6V의 정전위를 가하는 전기화학적인 방법으로 상기 그래핀층 상에 백금 나노입자를 증착하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 바이오센서는 작업전극의 표면적이 넓고, 전기전도도 성질이 우수하여 효소 물질의 고정화 양을 높일 수 있고, 검출 민감도를 증대시키는 것이 가능하다. 소량의 원료만으로도 정확한 측정치를 얻을 수 있다. 또한 본 발명에 따르면, 저농도까지 검출할 수 있는 빠른 감응시간을 갖는 고감도의 전기화학적 바이오센서를 높은 재현성으로 제조할 수 있다.
특히 본 발명에 따라 제조하는 백금 나노입자가 분산된 그래핀 시트의 다이아몬드 박막 전극의 유효 전극 면적은 1.463 cm2으로, 표면 처리 전 전극의 유효면적(0.415 cm2)에 비하여 약 3.53 배 증가되었다. 감도는 17.1 μA/mM로, 1.98 μM - 1.95 mM의 비교적 넓은 농도 범위에서 선형성을 보이며, 0.14 μM의 검출한계로 상당히 낮은 농도에서도 검출이 가능하였다. 그래핀 시트가 없는 보론이 도핑된 다이아몬드 박막 위에 백금 나노입자를 분산시킨 경우의 감도는 4.94 μA/mM에 불과하여, 본 발명에 따른 바이오센서에서의 그래핀층의 효과를 확인할 수 있다.
뿐만 아니라, 기존 다이아몬드 전극을 이용한 글루코오스 센서들은 단지 다이아몬드 전극에 약품 처리로 표면 기능화한 후 효소를 고정화한 형태로, 본 발명에 따른 바이오센서는 이들보다 약 171배 정도의 감도 향상을 보였다.
즉, 본 발명에서는 보론이 도핑된 다이아몬드 박막과 백금 나노입자가 분산된 그래핀 시트를 접목함으로써 시너지 효과로 전극 면적 증가, 감도 향상, 낮은 검출 한계 등 센서의 성능을 향상시킨다. 백금 나노입자는 표면적을 증가시키고 그래핀은 전기 전도도가 높아 센서의 감도를 높이고 산화환원 효소와 전극 표면간의 직접적인 전자 이동을 촉진한다. 또한 다이아몬드 박막은 용량성 전류가 낮으므로 이를 이용한 바이오센서는 저농도의 분석물질도 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 바이오센서에 대한 평면도이다.
도 2는 본 발명에 따른 바이오센서의 작업전극 단면도이다.
도 3은 본 발명에 따라 개선된 작업전극을 만드는 과정의 개략도이다.
도 4는 본 발명 실험예에 따라 다양한 전위에서 그래핀층 위에 전기증착되는 백금 나노입자들의 SEM 사진들이다.
도 5는 본 발명과 비교예에 따른 바이오센서에 대한 상대적인 CV 응답 특성을 보인다.
도 6은 본 발명과 비교예에 따른 바이오센서에 대한 I p (피크전류)와 v 1/2(스캔 속도1/2)의 관계를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명과 비교예에 따른 바이오센서에서 전류 변화와 글루코오스 농도의 상관관계를 보여주는 그래프이다.
이하에서 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 바이오센서 및 그 제조방법의 바람직한 실시예에 대해 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 따라서, 도면에서의 요소의 형상 등은 보다 명확한 설명을 강조하기 위해서 과장되어진 것이며, 도면상에서 동일한 부호로 표시된 요소는 동일한 요소를 의미한다. 또한, 어떤 층이 다른 층 또는 기판의 "상"에 있다라고 기재되는 경우에, 상기 어떤 층은 상기 다른 층 또는 기판에 직접 접촉하여 존재할 수 있고, 또는, 그 사이에 제3의 층이 개재되어질 수 있다.
도 1에는 본 발명에 따른 바이오센서에 대한 평면도가 도시되어 있다. 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 바이오센서(100)는 기판(10), 작업전극(20), 기준전극(30) 및 상대전극(40)을 포함한다.
본 발명에서 사용하는 기판(10)은 유리(glass), 석영(quartz), Al2O3 , SiC 등의 투명한 무기물 기판, PET(폴리에틸렌 테레프탈레이트), PS(폴리스티렌), PI(폴리이미드), PVC(폴리염화비닐), PVP(poly vinyl pyrrolidone), PE(폴리에틸렌) 등의 투명한 유기물 기판 또는 Si, GaAs, InP, InSb, AlAs, AlSb, CdTe, ZnTe, ZnS, CdSe, CdSb, GaP 등의 반도체용 기판을 사용할 수 있다. 공정상, 기판(10) 위에 고온의 증착 방법으로 전극 등을 형성하는 경우에는 고온에도 견딜 수 있는 반도체용 기판이 바람직하다.
작업전극(20)은 검출 대상이 되는 물질과의 효소 반응을 수행한다. 상대전극 (40)은 상기 작업전극(20)과의 전기적 출력 차이를 검출한다. 전기화학적 측정을 위해 기준전극(30)도 구비될 수 있다. 기준전극(30)은 염화은전극, 칼로멜전극(SCE), 황산수은(I) 전극일 수 있다. 기준전극(30)과 작업전극(20), 또는 기준전극(30)과 상대전극(40)으로 셀을 구성하여 그 기전력을 측정하면, 기준전극(30)의 전위는 이미 알고 있으므로 측정하는 다른 전극의 전위를 알 수 있다.
작업전극(20), 기준전극(30) 및 상대전극(40)은 각각의 전극 패드(27, 37, 47)와 도선(25, 35, 45)으로 연결되어 있다. 실질적으로 전극 패드(27, 37, 47)는 도선(25, 35, 45)과 일체형이어서 도선(25, 35, 45)의 연장 부분이 되므로, 그 재질 및 두께는 서로 동일할 수 있다. 전극 패드(27, 37, 47) 반대편의 도선(25, 35, 45) 연장부는 각각 작업전극(20), 기준전극(30) 및 상대전극(40)의 일부를 이루는 것으로 구성할 수도 있다. 도선(25, 35, 45)의 재료로는 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag) 등의 희귀금속(noble metal)을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 희귀금속은 전극 표면 영역에 있어 안정성 및 재현성이 우수하고 산화되기 어려운 성질 등, 전기화학적 성질이 우수하기 때문이다. 상기 도선(25, 35, 45)의 두께는 기판(10)과의 접착성 및 경제성 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있으며, 대략 100nm 내외의 두께로 할 수 있다.
본 발명은 특히 작업전극(20) 물질을 개선한다. 도 2는 작업전극(20)의 단면도이다. 도 2를 참조하면, 작업전극(20)은 불순물 도핑된 다이아몬드층(12), 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층(12) 상에 형성된 그래핀층(14), 상기 그래핀층(14) 상에 형성된 금속 나노입자층(16), 그리고 효소 반응 물질층(18)을 포함한다.
불순물 도핑된 다이아몬드층(12)은 기존의 금이나 은 등의 금속 전극에 비하여 높은 신호-잡음비와 오랜 안정성, 높은 감도, 좋은 재현성을 보인다. 그리고, 불순물 도핑된 다이아몬드층(12)은 용량성 전류가 낮으므로 이를 이용한 바이오센서(100)는 저농도의 분석물질도 검출할 수 있다. 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층(12)은 도전성, 접착성 및 경제성 등을 고려하여 적당한 두께로 적층된다.
본 발명에서는 다이아몬드 박막만을 전극으로 사용할 경우에 대해 표면 처리와 전극 면적을 개선하기 위하여 불순물 도핑된 다이아몬드층(12) 상에 그래핀층(14)과 금속 나노입자층(16)을 형성한다. 바람직하게, 그래핀층(14)과 금속 나노입자층(16)은 금속 나노입자가 분산된 그래핀 시트(sheet)이다.
그래핀은 탄소원자 한 층으로 만들어진 벌집구조의 2차원 박막을 말한다. 탄소원자는 sp2 혼성궤도에 의해 화학 결합하면 이차원으로 퍼진 탄소 육각망면을 형성한다. 이 평면 구조를 가지는 탄소 원자의 집합체가 그래핀이다. 그래핀은 유연하고 전기 전도도가 매우 높으며 넓은 표면적을 가진다. 그러나, 표면 처리 방법이 복잡하고 제한적이라 바이오센서에 이용하기가 어렵다.
본 발명에서는 표면 처리 방법을 보다 쉽고 효과적으로 개선하기 위하여 그래핀층(14) 위에 금속 나노입자층(16)을 형성한다. 일반적으로 금속막 자체는 쉽게 바이오물질들을 변이시켜 그의 활성을 저하시킨다고 알려져 있지만, 본 발명에서 이용하는 금속 나노입자에서는 쉽게 흡착된 바이오물질의 변성이 일어나지 않는다. 따라서, 흡착을 통하여 금속 나노입자층(16) 표면에 많은 양의 바이오물질들을 고정화시킬 수 있다. 금속 나노입자층(16)은 전극 면적과 화학 반응에 의해 생성된 전자 전달을 극대화시킨다.
이와 같이, 본 발명에 따른 바이오센서(100)는 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층(12) 상에 그래핀층(14)과 금속 나노입자층(16)을 형성함으로써, 검출 대상 물질에 대한 감도 향상 및 검출 대상 물질을 산화시키는 효소의 활성 극대화를 도모할 수 있다. 이는 금속 나노입자층(16)이 효소를 보다 안정적으로 고정하며, 그래핀층(14)은 효소 반응 결과물로서 생성된 전자 전달의 속도를 증가시키기 때문에 야기되는 효과인 것으로 판단된다.
효소 반응 물질층(18)은 검출 대상이 되는 시료와 반응하는 효소를 포함한다. 사용되는 효소는 검출하고자 하는 시료에 따라 다양하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 글루코오스 산화효소, 젖산 산화효소, 알코올 산화효소, 콜레스테롤 산화 효소 등을 검출하고자 하는 시료에 따라 적절히 사용할 수 있다. 특히, 혈중 포도당 또는 글루코오스를 검출하고자 하는 경우에는 글루코오스 산화효소가 사용될 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 바이오센서(100)는 빠른 감응 속도와 저농도까지 감지할 수 있는 고감도의 바이오센서이다.
이하에서는 이러한 바이오센서를 제조하는 방법과 구체적인 실험 평가 결과에 대해 도면 및 실험예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
도 3은 본 발명에 따라 개선된 작업전극을 만드는 과정의 개략도이다.
우선, 도 3의 (a)에서와 같이 기판(10)을 준비한다. 본 실험예에서 기판(10)은 열산화시킨 실리콘 웨이퍼였다. (100)면을 가지는 실리콘 웨이퍼를 준비하여 열산화 방법으로 1mm 정도 두께의 실리콘 산화막(SiO2)을 형성하였다.
다음에 도 3의 (b)에서와 같이 기판(10) 위에 불순물 도핑된 다이아몬드층(12)으로서 보론 도핑된 다이아몬드 박막(BDD)을 증착한다. 이를 위해, 먼저 기판(10) 위에 다이아몬드 나노결정을 막 증착을 위한 씨드(seed)로 사용하기 위해 고밀도로 코팅한다. 그런 다음, 그 위에 보론 도핑된 다이아몬드 박막을 성장시킨다.
구체적으로 다음과 같이 수행되었다. 먼저 1000 rpm으로 5 시간 동안 어트리션 밀(attrition mill)을 이용해 다이아몬드 나노결정을 10 % (v/v) PSS[poly sodium 4-styrene sulfonate(MW: 70,000)] 수용액에 분산시켰다. 사용한 다이아몬드 나노결정은 평균 입자 크기가 3.2nm이었다.
이렇게 하면 음이온성 PSS 사슬로 코팅된 양이온성 다이아몬드 나노결정이 얻어진다. 도 3의 (a)와 같이 준비된 기판(10)을 10% (v/v) PDDA[poly diallyldimethyl ammonium chloride(MW: 400,000~500,000)] 수용액에 30분간 침지한 후 탈이온수로 세척하면 기판(10) 위에 얇은 양이온성 폴리머막을 입힐 수 있다. 이 과정에서 양이온성 폴리머막의 대부분은 기판(10) 위의 산화막에 녹아 기판(10)과 직접적인 정전기적 접합을 하게 된다. 이것과 동일하게, 음이온성 PSS 폴리머로 코팅된 다이아몬드 나노결정은 양이온성 기판(10) 표면에 고밀도로 부착된다.
이와 같이 기판(10) 위에 다이아몬드 나노결정을 코팅하여 고밀도 씨드층을 형성한 다음에는 핫 필라멘트 화학기상증착(hot-filament chemical vapor deposition : HFCVD) 방법을 이용해서 보론 도핑된 다이아몬드 박막을 성장시켜 불순물 도핑된 다이아몬드층(12)을 형성한다. 원료 가스인 B2H6, CH4 및 H2 가스의 유량은 각각 0.05sccm, 1sccm, 및 100sccm으로 하였다. 증착은 90 torr 압력과 800℃ 온도 조건에서 5시간 동안 수행하였다. 바로 증착된 상태의 다이아몬드 박막 두께(as-grown thickness)는 약 1 mm이었다.
다음에 도 3의 (c)에서와 같이 불순물 도핑된 다이아몬드층(12) 위에 그래핀층(14)을 형성한다. 본 발명에서는 시트 형상의 그래핀 박막을 불순물 도핑된 다이아몬드층(12) 위에 부착하는 방법을 취한다.
시트 형상의 그래핀 박막은 다음과 같은 방법으로 얻어졌다. 먼저 실리콘 산화막이 형성된 실리콘 기판 위에 300 nm 이하의 두께를 갖는 니켈층을 이-빔 증착기(electron-beam evaporator)를 이용해 형성하였다. 니켈층은 기상 탄소 공급원으로부터 그래핀을 석출하는 데 촉매 역할을 하게 된다.
그런 다음, 아르곤 분위기의 쿼츠 튜브 안에서 기판 온도를 1000℃로 올렸다. 기상 탄소 공급원으로는 메탄(CH4)을 사용하였다. CH4, H2, 및 Ar의 혼합 가스를 50sccm : 65 sccm: 600 sccm의 비로 공급하였다. 이후 상온(25℃)까지 아르곤 스트림(stream)을 이용해 급랭하였다. 냉각 속도는 약 10℃s-1 이다. 이 과정에서 그래핀 박막이 니켈층 위에 성장하였다. 다음에 그래핀 박막을 실리콘 기판으로부터 분리하였다. 1 M FeCl3 용액에 수분간 침지한 후 탈이온수로 린스하면 니켈층이 녹아 그래핀 박막이 분리되면서 용액 위에 부유한다. 이렇게 만든 시트 형상의 그래핀 박막을 불순물 도핑된 다이아몬드층(12) 위로 옮기면 정전기적인 힘에 의해 서로간에 비교적 강한 결합을 하게 된다.
다음, 도 3의 (d)에 도시한 바와 같이, 그래핀층(14) 위에 금속 나노입자층(16)을 형성한다. 본 발명에서는 그래핀층(14)까지 형성된 기판(10)을 20 mM K2PtCl6와 0.5 M H2SO4를 포함하는 3mL 용액 속에서 -0.6V의 정전위를 720초동안 가하여 전기화학적인 방법으로 백금 나노입자를 그래핀층(14) 위에 석출 및 증착하였다.
이렇게 하여 도 1 바이오센서(100)의 작업전극(20)이 형성된다. 다음에 도 1과 같은 전극 구조를 만들기 위해 기준전극(30), 상대전극(40), 도선(25, 35, 45) 및 전극 패드(27, 37, 47)를 구성한다. 글루코오스 산화효소(GOx)를 포함하는 용액 속에 작업전극(20)을 침지하면 글루코오스 산화효소가 직접적으로 백금 나노입자의 표면에 흡착된다. 이렇게 하여 효소 반응 물질층(18)까지 형성한 다음, 인산 완충용액(phosphate buffer (PB) solution)으로 헹구어 잔류하는 모노머 또는 약하게 결합된 효소 분자를 제거한다. D-글루코오스와 글루코오스 산화효소(GOx; E.C. 1.1.3.4, 200 U/mg)는 pH 7의 0.05M 인산 완충용액에 혼합하여 사용하였다.
(실험예 1)
도 3의 (d)와 같이 그래핀층(14) 위에 금속 나노입자층(16)을 형성할 때에, 전위를 변화시켜가며 실험하였다. 도 4는 다양한 전위에서 그래핀층(14) 위에 전기증착되는 백금 나노입자들의 SEM 사진들이다.
음의 전압을 증가시켜 -0.6V에 도달하는 경우인 도 4의 (a)-(c)를 참조하면, 백금 나노입자들은 전위 증가에 따라 보다 밀집되면서 넓게 퍼지는 것으로 확인할 수 있다.
-0.6V보다 큰 전압을 가하면 도 4의 (d)-(f)에서 보는 바와 같이 오히려 밀도가 현저하게 감소되었다. 이러한 결과로부터, 백금 나노입자를 그래핀층(14) 위에 증착할 경우에는 20 mM K2PtCl6와 0.5 M H2SO4를 포함하는 3mL 용액 속에서 -0.6V의 정전위를 가하는 것이 바람직하다는 결론을 얻었다.
(실험예2)
본 발명에 따른 바이오센서(100)를 위에 상술한 방법으로 제조하되, 상대전극(40)은 백금 와이어로, 기준전극(30)은 SCE를 이용해 3-전극 시스템을 구성하였다. 도핑된 다이아몬드층(BDD)/그래핀/백금(Pt)-나노입자로 구성된 본 발명에 따른 바이오센서(100)의 작업전극(20)과의 비교를 위하여 도핑된 다이아몬드 전극만을 사용한 경우(비교예1 _ BDD)와 도핑된 다이아몬드 박막 위에 그래핀 박막을 적층한 전극을 사용한 경우(비교예2 _ BDD/그래핀)에 대해서도 실험하였다.
도 5는 본 발명과 비교예에 따른 바이오센서의 서로 다른 세가지 전극에 대한 상대적인 CV 응답 특성을 보인다. 세가지 다른 전극은 10 mM의 Fe(CN)6 3-/4- 을 함유하는 3M KCl 용액 속에서 측정하였다.
도핑된 다이아몬드 박막만을 전극으로 사용한 비교예 1의 경우, 음이온성 피크(전류 : 0.494mA, 전위 : 0.395V)와 양이온성 피크(전류 : -0.664mA, 전위 : 0.114V)가 관찰되었다. 피크 전위차 간격(ΔEp)은 약 0.281V이었다.
도핑된 다이아몬드 박막 위에 그래핀 박막을 적층한 전극을 사용한 비교예 2의 경우, 음이온성 전위 피크(Epa)는 0.338V(전류 : 0.716mA)이고, 양이온성 전위 피크(Epc)는 0.177V(전류 : -0.823mA)이어서, 피크 전위차 간격(ΔEp)은 약 0.161V이었다.
주목할만하게 본 발명의 경우에는 산화 피크 전류가 ~1.08mA(Epa 0.332V)로 증가하고 피크 전류는 -1.25mA로 감소하여 ΔEp는 약 0.136V이었다. 이러한 전극의 전기화학적 응답 크기는 본 발명의 경우가 가장 크고 그 다음이 비교예2, 가장 작은 것이 비교예1이었다.
본 발명에서 피크 전류가 증가한 것은 유효 표면적이 증가했기 때문이다. 잘 정의되고 의사가역적인(quasi-reversible) 산화환원 피크는 전극과 산화환원종간의 직접적인 전자 전이를 제시해준다. 도핑된 다이아몬드층(BDD)/그래핀/백금(Pt)-나노입자로 구성된 본 발명에 따른 바이오센서(100)의 작업전극(20)에서 눈에 띄게 증가한 신호는 그래핀 박막과 백금 나노입자의 시너지적인 효과 때문이다. 이러한 결과로부터, 그래핀 박막과 백금 나노입자가 전자 전이를 가속하여 신호를 증가시킨다는 것이 명확해졌다.
(실험예 3)
각 전극의 유효 표면적은 Randles-Sevcik 방정식을 이용해 측정하였다. 이 방정식에 의하면 유효 표면적(A)은 I p /v 1/2에 비례한다(Ip : 피크 전류, v: 스캔 속도). 본 발명에 따른 바이오센서와 비교예1, 2의 바이오센서를 10 mM K3Fe(CN)6를 포함하는 3 M KCl 용액 안에서 다양한 스캔 속도를 가지고 연속 순환전위를 측정하였다.
도 6은 본 발명에 따른 전극에 대해 I p 와 v 1/2의 선형적인 관계를 보여준다. 이것은 전극에서 일어나는 반응이 거의 가역적이고 이중층 영역에서의 질량 전이 현상은 주로 확산에 의해 제어된다는 것을 보여준다.
다음 표 1에 그 결과를 정리하였다.
Figure pat00001
비교예 1에 비하여 비교예 2는 표면적이 1.95배 증가하고, 본 발명의 경우에는 3.53배 증가하였다.
세 가지 전극의 계면 특성은 임피던스 분광분석법을 이용해 측정하였다. 비교예1의 경우 전자 전이 저항은 750Ω으로 측정되었는데 이것은 본 발명 경우에 비하여 매우 큰 값이었다. 따라서, 본 발명 전극에서와 같이 그래핀과 금속 나노입자가 함께 있는 경우에 전자 전이를 촉진한다는 것을 알 수 있다.
(실험예 4)
그래핀 박막의 유용성을 검증하기 위해 다이아몬드 박막에 그래핀층이 없이 백금 나노입자를 부착한 전극의 경우인 비교예3과 본 발명에 대해 SCE 기준 전극에 대해 0.6V를 가하면서 50 mM 인산 완충용액에 준비한 글루코오스 샘플을 전기적 측정하였다.
도 7은 전류 변화와 글루코오스 농도의 상관관계를 보여주는 그래프이다. 도 7의 (a)를 참조하면, 비교예3의 경우 선형 구간은 4.94 μA/mM (R = 0.9916)의 기울기를 가지고 글루코오스 농도가 2.76 μM부터 8.9 mM까지 이어진다. 반면, 도 7(b)에서 보는 바와 같이 본 발명의 경우 선형 구간은 1.98 μM 부터 1.95 mM이고 감도는 17.1 μA/mM (R = 0.9969)이다. 검출 한계는 0.14 μM이고 신호-잡음비는 3.00이다. 일반적으로 글루코오스 산화효소의 활성적인 산화환원 중심은 보호 단백질 껍질 안에 깊이 박혀 있어 전극과의 직접적인 전자 교환이 매우 어렵다는 것으로 알려져 있다. 그래핀은 전기전도도가 굉장히 높고 비표면적이 넓다. 이러한 장점 때문에 본 발명에서 작업전극에 이용하는 그래핀은 전자 전이를 촉진할 수 있고 글루코오스 산화효소와 전극간의 직접적인 전자 전이를 가능하게 한다.
문헌 조사 결과, 종래의 전극들을 이용한 바이오센서의 감도는 0.428 ~ 10 μA/mM 정도의 수준이었으나, 본 발명의 경우는 17.1μA/mM이므로 획기적인 감도 향상인 것으로 평가된다. 또한 본 발명의 경우가 종래의 전극들에 비하여 선형 구간이 넓고 검출 한계가 낮은 것으로 평가된다.
특히 본 발명의 경우 KM app(Michaelis-Menten constant)가 10.28 mM으로 낮게 측정되었는데 이것은 글루코오스와 전극에 고정된 글루코오스 산화효소간 높은 친화도를 대변한다. 재현성도 검증하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 바람직한 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.

Claims (10)

  1. 기판;
    효소 반응이 발생되는 작업전극 및 상기 작업전극과의 전기적 출력 차이를 검출하기 위한 상대전극을 포함하는 전기화학적 바이오센서로서,
    상기 작업전극은, 불순물 도핑된 다이아몬드층;
    상기 불순물 도핑된 다이아몬드층 상에 형성된 그래핀층; 및
    상기 그래핀층 상에 형성된 금속 나노입자층을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  2. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자층 상에 글루코오스 산화효소(glucose oxidase)를 포함하는 효소 반응 물질층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  3. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자층은 백금 나노입자층인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  4. 제1항에 있어서, 상기 그래핀층과 금속 나노입자층은 금속 나노입자가 분산된 그래핀 시트(sheet)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  5. 기판;
    효소 반응이 발생되는 작업전극 및 상기 작업전극과의 전기적 출력 차이를 검출하기 위한 상대전극을 포함하는 전기화학적 바이오센서 제조방법으로서,
    상기 작업전극을 형성하는 단계는,
    불순물 도핑된 다이아몬드층을 형성하는 단계;
    상기 불순물 도핑된 다이아몬드층 상에 그래핀층을 형성하는 단계; 및
    상기 그래핀층 상에 금속 나노입자층을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층을 형성하는 단계는,
    기판 상에 다이아몬드 나노결정 씨드를 코팅하는 단계; 및
    B2H6, CH4 및 H2 가스를 이용해 상기 기판 상에 보론 도핑된 다이아몬드층을 증착하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 다이아몬드 나노결정 씨드를 코팅하는 단계는,
    다이아몬드 나노결정을 PSS[poly sodium 4-styrene sulfonate] 수용액에 분산시키는 단계;
    상기 기판으로 열산화된 실리콘 기판을 준비하는 단계; 및
    상기 기판을 상기 다이아몬드 나노결정이 분산된 수용액 중에 침지한 후 세척하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서 제조방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층 상에 그래핀층을 형성하는 단계는,
    상기 불순물 도핑된 다이아몬드층 상에 그래핀 시트를 부착하는 것을 특징으로 하는 바이오센서 제조방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 그래핀층 상에 금속 나노입자층을 형성하는 단계는,
    상기 그래핀층이 형성된 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층을 타겟 금속의 수용액 속에 침지하여 전기화학적인 방법으로 상기 그래핀층 상에 상기 금속의 나노입자를 증착하는 것을 특징으로 하는 바이오센서 제조방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 그래핀층 상에 금속 나노입자층을 형성하는 단계는,
    상기 그래핀층이 형성된 상기 불순물 도핑된 다이아몬드층을 K2PtCl6을 포함하는 수용액 속에 침지하여 -0.6V의 정전위를 가하는 전기화학적인 방법으로 상기 그래핀층 상에 백금 나노입자를 증착하는 것을 특징으로 하는 바이오센서 제조방법.
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