KR20110120664A - 메밀 속성장으로부터 유래된 저영양성 바실러스 서브틸리스 에이치제이18-4 균주 및 이를 이용한 발효식품의 제조방법 - Google Patents

메밀 속성장으로부터 유래된 저영양성 바실러스 서브틸리스 에이치제이18-4 균주 및 이를 이용한 발효식품의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메밀을 이용한 속성장으로부터 유래되어 발효효소를 생산하고 식중독균 및 대장균에 대한 항균활성을 가지며 혈전용해능을 갖는 저영양성 발효 균주 및 이를 이용한 발효식품의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 메밀 속성장으로부터 분리된 저영양성 균주로서 발효효소 생산능을 가지며, 식중독균 및 대장균(E. coli) 균주에 대한 항균력 및 혈전용해능을 갖는 기탁번호 제 KACC 91541P 호의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) HJ18-4 균주는 발효와 관련된 셀룰라아제(cellulase), 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase) 및 자일라아제(xylanase) 등의 효소생산과 칸디다(Candida), 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 스타필로코커스(Staphilococcus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 등의 식중독균 및 대장균 E. coli 균주에 대하여 항균력과 혈전용해능을 가지므로, 이를 이용하여 발효효소를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 품질이 월등하게 향상된 발효식품 제조할 수 있어 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

메밀 속성장으로부터 유래된 저영양성 바실러스 서브틸리스 에이치제이18-4 균주 및 이를 이용한 발효식품의 제조방법{BACILLUS SUBTILIS HJ18-4 OLIGOTROPHIC STRAIN ISOLATED FROM MEMIL SOKSUNGJANG AND METHOD FOR MAKING FERMENTATION FOOD BY USING SAME}
본 발명은 메밀을 이용한 속성장으로부터 유래되어 발효효소를 생산하고 식중독균 및 대장균에 대한 항균활성을 가지며 혈전용해능을 갖는 저영양성 발효 균주 및 이를 이용한 발효식품의 제조방법에 관한 것이다.
유럽의 요거트, 일본의 나또 등 자국 고유의 종균을 이용한 발효기술을 전 세계를 대상으로 보급할 뿐만 아니라 이를 지식 재산권화 함으로써 많은 외화를 벌어들이고 있다. 따라서, 우리나라에서도 전통 발효식품을 중심으로 하는 맛의 고급화, 품질 균일화, 보존기간 연장을 위한 국내 전통 우수 발효미생물의 개발 및 보존관리에 대한 체계적인 연구가 요구되고 있다. 또한, 국내 산업체에서도 외국의 종균을 수입하여 로열티를 지불해야 하는 실정이어서 장기적인 산업발전을 고려해 볼 때 우리의 우량 균주의 확보가 반드시 필요하다.
지구상 생체중량의 60%를 미생물이 차지하고 있지만 이중 단지 1% 정도만이 분리되거나 배양되고 있다고 알려져 있다. 최근 이들 난배양 미생물이 갖고 있는 무한한 기능을 활용하기 위한 기술개발 필요성이 대두되고 있다.
메밀 속성장은 메주제조부터 숙성단계까지 5개월의 기간이 소요되는 일반 된장과는 달리 생리활성성분을 함유한 속성 웰빙장이다. 증자된 콩과 메밀가루를 이용하여 단기 발효시켜 제조된 속성장용 메주에 염수를 첨가하여 혼합한 후, 항아리에 넣어 속성 발효시킴으로써, 항혈전효과, 항산화능 등의 생리활성이 우수하며, 식중독 유발균에 대한 저해효과가 있는 안전 웰빙 속성장이다(대한민국 특허출원 제10-2009-134375호 참조).
이에 본 발명자들은 메밀 속성장으로부터 식중독균 및 대장균에 대한 항균활성을 가지며 혈전용해능을 갖는 신규한 균주를 분리 동정하기 위해 계속 연구를 진행하던 중 메밀 속성장으로부터 분리된 신균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주가 저영양성 균주로서 발효와 관련된 셀룰라아제(cellulase), 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase) 및 자일라아제(xylanase) 등의 효소생산과 칸디다(Candida), 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 스타필로코커스(Staphilococcus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 등의 식중독균 및 대장균 E. coli 균주에 대하여 항균력과 혈전용해능을 갖는다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 메밀을 이용한 속성장으로부터 유래된 발효와 관련된 효소를 생산하고 식중독균 및 대장균에 대한 항균활성을 가지며 혈전용해능을 갖는 저영양성 발효 균주를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 저영양성 발효 균주를 이용한 발효식품의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 메밀 속성장으로부터 분리된 저영양성 균주로서 발효효소 생산능을 가지며, 식중독균 및 대장균(E. coli) 균주에 대한 항균력 및 혈전용해능을 갖는 기탁번호 제 KACC 91541P 호의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) HJ18-4 균주를 제공한다.
상기한 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 바실러스 서브틸리스 균주 HJ18-4 균주를 이용한 발효식품의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따라 메밀 속성장으로부터 분리된 신균주인 바실러스 서브틸리스 HJ18-4는 발효와 관련된 셀룰라아제(cellulase), 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase) 및 자일라아제(xylanase) 등의 효소생산과 칸디다(Candida), 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 스타필로코커스(Staphilococcus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 등의 식중독균 및 대장균 E. coli 균주에 대하여 항균력과 혈전용해능을 가지므로, 이를 이용하여 발효효소를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 품질이 월등하게 향상된 발효식품 제조할 수 있어 발효식품 분야에서 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 대장균(E. coli), 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 선택배지의 메밀 속성장 배양결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양 세균 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주와 표준 균주인 바실러스 서브틸리스 KACC 10114 균주의 형태적관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주와 표준 균주인 바실러스 서브틸리스 KACC 10114 균주의 저영양 생성 배지에서의 콜로니 모르포롤지(colony morphology)를 비교한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주와 표준 균주인 바실러스 서브틸리스 KACC 10114 균주의 프로테아제(protease), 셀룰로오즈(cellulase), 아밀라아제(amylase) 및 리파아제(lipase) 효소활성을 비교한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주와 표준 균주인 바실러스 서브틸리스 KACC 10114 균주의 항균활성을 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주의 16s rDNA 염기 서열 분석에 의하여 계통학적으로 분류한 것이다.
도 7는 본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주의 혈전용해능을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주 용혈작용을 나타낸 것이다.
본 발명에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 갖는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 메밀 속성장으로부터 분리된 저영양성 균주로서 식중독균 및 대장균 E. coli 균주에 대한 항균력 및 혈전용해능을 갖는다. 본 발명에서 분리한 균주는 메밀 속성장으로부터 분리된 것으로, 균주의 형태적 특성, 생화학적 특성 및 16s rDNA의 염기서열 분석결과, 바실러스 서브틸리스와 99% 상동성을 갖는 것으로 확인되었는 바, 이를 각 바실러스 서브틸리스 HJ18-4로 명명하고, 2010년 3월 29일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁번호 제 KACC 91541P 호로서 기탁하였다. 이 균주의 분리는 일반적인 고영양 배지를 이용한 방법으로 불가능하나 저영양 배지에서 분리 후 그 증식은 일반 고영양 배지배양방법으로 배양할 수 있다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 저영양성 균주 HJ18-4는 다음과 같은 형태학적 및 분자생물학적 특징을 갖는다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 저영양성 균주 HJ18-4의 형태적 특징은 광학현미경으로 관찰하여 도 2에 나타내었으며, 도 3에 나타낸 바와 같이 표준 균주인 바실러스 서브틸리스 KACC 10114와 같은 전형적인 바실러스속 형태의 간균으로서 대표적인 그람 양성이며 당을 생성하는 저영양 세균으로서 28℃가 최적 성장 온도이다.
또한, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 HJ18-4의 생화학적 실험 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 표준균주인 바실러스 서브틸리스 KACC 10114 균주와 매우 유사하였다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주는 발효와 관련된 효소인 셀룰라아제(cellulase), 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase) 및 자일라아제(xylanase) 등의 효소를 생산하며(도 1 참조), 칸디다(Candida), 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 스타필로코커스(Staphilococcus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 등의 식중독균 및 대장균 E. coli 균주에 대하여 항균력을 가지며(도 4 내지 5 참조), 혈전용해능(도 7 및 8 참조)을 갖는다.
따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주를 이용하여 발효효소를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 품질이 향상된 발효식품, 예를 들어 장류를 제조할 수 있어 발효식품 분야에서 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 저영양 배지를 이용한 균주분리
본 발명의 효소와 당 및 항균물질을 생산하는 균주를 분리하기 위해 메밀속성장의 시료를 채취하고, 시료 10g을 멸균백에 넣고 0.85% 생리식염수 100ml를 가하여 BAGMIXER (interscience, France)를 사용하여 10분 동안 균질화하여 검체를 준비하였다.
저영양 배지조성은 효모 추출물, 0.5 g; 프로테오스 펩톤(proteose peptone) no3, 0.5g; 카사미노산(casamino acids), 0.5 g; 덱스트로스(dextrose) 0.5g; 가용성 전분(soluble starch) 0.5g; 피루빈산나트륨(sodium pyruvate), 0.3g; 제2인산 칼륨(dipotassium phosphate), 0.3g; 황산마그네슘(Magnesium sulfate), 0.05g; 증류수, 1000 ㎖이며 pH 7.0~7.2로 조정하여 준비하였다. 저영양세균분리 배지인 R2A에 10-1, 10-2, 10-3 및 10-4배로 증류수에 희석한 배지를 사용하여 분리한 다양한 저영양 세균들을 R2A 평판배지에서 배양한 후 자라나는 균주를 분리하였다.
실시예 2 : 효소활성 및 항균활성 우수균주 선발
상기 실시예 1에서 분리된 균주를 이용하여 효소활성과 당 생성력 및 식중독균에 대한 항균력을 측정하였다. 그 중 셀룰로오즈, 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제 및 자일라나제의 효소 생성이 우수하고, 칸디다, 리스테리아, 살모넬라, 스타필로코커스 및 바실러스 세레우스의 식중독균 및 대장균 E. coli의 생육을 저지시키는 능력을 가진 균주인 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주를 선발하였다.
실시예 3 : HJ18 -4의 형태적 특성 및 생화학적 특성
상기 실시예 2에서 선발된 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주의 형태학적 및 생화학적 특성을 조사한 후 16S rDNA의 분석을 기초로 하여 다른 종들과의 유연관계를 통한 분류 동정을 실시하였다.
선발된 바실리스 서브틸리스 HJ18-4 균주의 형태적 특징은 광학현미경으로 관찰하여 도 2에 나타내었다. 도 3에는 메밀 속성장으로 분리한 본 발명의 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주와 표준 균주인 바실러스 서브틸리스 KACC 10114 균주의 저영양 배지에서의 콜로니 모포롤로지(colony morphology)를 비교하여 나타내었다. 여기에서 보듯이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주는 표준 균주인 KACC 10114와 같은 전형적인 바실러스속 형태의 간균으로 대표적인 그람 양성이며 당을 생성하는 저영양 세균으로 28℃가 최적 성장 온도인 것으로 나타났다. 도 6에는 본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주의 16s rDNA 염기 서열 분석에 의한 계통학적 분류표를 나타내었다.
또한, 생화학적 실험은 미생물 동정 키트인 API20NE 키트를 이용하였으며, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 HJ18-4와 표준균주인 KACC10114 균주와 생화학적 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 여기에서 보듯이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주는 표준균주인 KACC10114 균주와 매우 유사한 것을 알 수 있다.
Figure pat00001
실시예 4 : 메밀장의 항균효과와 HJ18 - 4균주의 효소활성 및 항균활성 비교분석
본 발명의 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주의 검체인 메밀속성장의 식중독 유발균에 대한 항균활성을 검토하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 2주 이상 발효시킨 메밀속성장을 대장균(E. coli), 스타피로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 선택배지에 도말하여 배양한 결과 어떤 유해미생물도 검출되지 않았다.
또한 HJ18-4균주의 효소활성 및 항균활성을 조사한 결과 표준균주인 KACC10114에 비하여 효소활성 및 항균활성이 월등히 우수하였다. 그 결과는 도 4 및 5에 나타내었으며, 하기 표 2에 이를 종합하여 나타내었다.
Figure pat00002
또한 HJ18-4균의 정확한 속명을 확인하고자 16S rDNA를 분리하여 염기서열을 확인하였다. 그 결과 바실러스 서브틸리스와 99% 상동성을 가지고 있으며 다른 종들과의 유연관계 분석하였다. 따라서, 선별된 HJ18-4 균주를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) HJ18-4로 명명하고 2010년 3월 29일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁번호 제 KACC 91541P 호로서 기탁하였다.
실시예 5 : HJ18 -4 균주의 혈전용해능
본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주의 혈전용해능을 하기와 같이 측정하였다. 0.15 M NaCl을 포함하는 10 mM 인산완충액(pH 7.8)에 피브리노겐을 0.3%가 되도록 용해시키고, 완전히 용해된 피브리노겐 용액 5 mL에 1% 아가로즈 용액 5 mL을 첨가하여 충분히 혼합하였다. 이에 트롬빈(100NIH/mL) 0.1 mL을 첨가하여 혼합한 후, 즉시 페트리 디쉬에 붓고 실온에서 5~10분간 방치하여 응고시켜 피브린 플레이트를 만들었다. 군배양액 2uL씩 스팟(spot)하고 37℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, 피브린 플레이트의 용해면적을 측정하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었으며, 그 결과 본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주는 표준 균주인 바실러스 서브틸리스 KACC 10114 균주와 비교하여 우수한 혈전용해능을 보였다.
도 8은 본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주 용혈작용을 나타내었으며, 하기 표 3에 이를 종합하여 나타내었다.
균주명 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 바실러스 서브틸리스 D8-3
용혈작용 여부 - ++
상기 표 3에서 보듯이, 본 발명에 따른 메밀 속성장으로 분리한 저영양성 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주는 용혈작용을 나타내지 않았으며 교균주인 바실러스 서브틸리스 D8-3 균주는 용혈작용을 나타내었다.
본 발명에 따라 메밀 속성장으로부터 분리된 신균주인 바실러스 서브틸리스 HJ18-4는 발효와 관련된 셀룰라아제(cellulase), 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase) 및 자일라아제(xylanase) 등의 효소생산과 칸디다(Candida), 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 스타필로코커스(Staphilococcus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 등의 식중독균 및 대장균 E. coli 균주에 대하여 항균력과 혈전용해능을 가지므로, 이를 이용하여 발효효소를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 품질이 월등하게 향상된 발효식품 제조할 수 있어 발효식품 분야에서 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
농업생명공학연구원 KACC91541 20100329

Claims (5)

  1. 메밀 속성장으로부터 분리된 저영양성 균주로서 발효효소 생산능을 가지며, 식중독균 및 대장균(E. coli) 균주에 대한 항균력 및 혈전용해능을 갖는 기탁번호 제 KACC 91541P 호의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) HJ18-4 균주.
  2. 제 1 항에 있어서,
    발효효소가 셀룰라아제(cellulase), 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase) 또는 자일라아제(xylanase)인 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주.
  3. 제 1 항에 있어서,
    식중독균이 칸디다(Candida), 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 스타필로코커스(Staphilococcus) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)인 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 HJ18-4 균주.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 바실러스 서브틸리스 균주 HJ18-4 균주를 이용한 발효식품의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    발효식품이 장류인 것을 특징으로 하는 제조방법.
KR1020100040174A 2010-04-29 2010-04-29 메밀 속성장으로부터 유래된 저영양성 바실러스 서브틸리스 에이치제이18-4 균주 및 이를 이용한 발효식품의 제조방법 KR101156161B1 (ko)

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