KR20110111927A - 히말라야 주목 세포 현탁배양에 의한 항암제 팩크리탁셀 고수율 제조방법 - Google Patents

히말라야 주목 세포 현탁배양에 의한 항암제 팩크리탁셀 고수율 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 세포를 현탁배양하여, 높은 수율로 생산된 팩크리탁셀 (paclitaxel)을 함유하는 세포 배양하는 방법 및 전기 방법에 의하여 제조된 팩크리탁셀 (paclitaxel)에 관한 것이다. 본 발명은 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 세포 현탁배양에 일리시터를 첨가하여 팩크리탁셀 (paclitaxel)의 수율을 높일 수있어, 본 발명을 통하여 생산되는 팩크리탁셀 (paclitaxel)은 항암제로서 의약용 원료로 널리 이용될 수 있을 것이다.

Description

히말라야 주목 세포 현탁배양에 의한 항암제 팩크리탁셀 고수율 제조방법 {Methods for High Yield Production of Paclitaxel by Suspension Cultures of Taxus wallichiana Zucc.}
본 발명은 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 세포 현탁배양을 통하여 팩크리탁셀 (paclitaxel) 수율이 높은 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.)세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.)을, 식물세포 배양용 MS (Murashige & Skoogs) 배지를 이용하여, 캘러스 (callus)를 유도하고, 캘러스를 이용하여 현탁배양을 유도하고, 팩크리탁셀 (paclitaxel) 고수율로 배양하여, 암 치료용 의약품으로 이용 가능한 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 세포를 생산하는 방법 및 전기 방법으로 제조된 팩크리탁셀 (paclitaxel)에 관한 것이다.
Taxus wallichiana Zucc.는 일명 히말라야 주목으로 불리고 있으며, 주로 파키스탄과 인도에 분포 서식하고 있다. 이 주목은 그 지역에서 전통요법 치료제로 다양하게 활용되고 있는데, 특히 잎은 asthma, indigestion, epilepsy 등에 효과가 있다고 전해지고 있다. 일반적으로 주목은 항암제 paclitaxel 또는 그 유도체들을 생합성하는 사실이 널리 알려져 있으며, T. wallichiana도 paclitaxel 뿐 아니라 새로운 유도체들이 발견되어 보고되고 있다.
Paclitaxel은 유방암과 난소암을 포함한 여러 가지 종류의 암에 대해 탁월한 치료 효과를 보여 널리 사용되고 있는 항암물질이다. 암세포에 대한 paclitaxel의 작용기작은 기존 대부분의 항암제들이 tubulin으로부터 microtubule의 형성을 방해하는 것과는 달리 cell cycle 상의 G2 후반기 또는 M phase에 작용하여 microtubule의 합성을 촉진하고 안정화시켜 그 후의 분해 과정을 억제하는 특이한 기작을 갖는다. 미국에서는 1983년에 FDA에 의해 임상실험이 시작되어, 10년 후인 1992년에 난소암 치료제가 허가를 받아 Bristol- Myers Squibb사에 의한 판매가 허용되었으며 1994년에는 유방암의 치료에도 사용이 허가되었다. Paclitaxel의 생산 공급은 주로 주목 나무로부터 추출에 의존하여 왔으나, 환경파괴의 문제 등으로 다양한 대체방법이 개발되었다. Paclitaxel의 전합성 뿐 아니라 전구체를 이용하는 반합성법, 그리고 주목 식물세포 배양을 통한 생산 방법 등이 개발되었다. 이러한 여러 방법 중에서도 가장 친환경적이며 경제성이 우수한 방법으로 주목세포배양에 의한 paclitaxel 생산 방법이 인정되고 있으며, 특히 고수율로 팩크리탁셀 (paclitaxel)을 생산할 수 있다면 암 치료용 의약품으로 널리 활용될 수 있을 것이다.
히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.)을 이용하여 캘러스를 유도하고, 팩크리탁셀 (paclitaxel)을 생산하여 함유하는 세포를 제조하였다. 하지만, 팩크리탁셀 (paclitaxel) 함량이 높지 않아, 경제성 있는 항암제 생산 측면에서 미흡한 면이 많았었다.
따라서, 식물세포배양 기법을 이용하여, 팩크리탁셀 (paclitaxel)의 수율을 높이는, 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 세포 배양 및 수율 향상 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두하였다.
이에, 본 발명자들은 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 생체 시료를 이용하여, 캘러스를 유도하고, 다시 현탁배양을 유도하여, 세포의 성장속도가 빠르고, 팩크리탁셀 (paclitaxel) 수율이 높은 히말라야 주목 세포를 제조하고, 팩크리탁셀 (paclitaxel) 생산 수율을 매우 높여 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 희귀성이 높은 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.)을, 현탁세포배양 방법과 복합 일리시터를 첨가하는 방법을 통하여, 팩크리탁셀 (paclitaxel)의 수율을 높이는 것이다.
본 발명은 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.)세포 현탁배양을 통하여, 높은 수율로 생산된 팩크리탁셀 (paclitaxel)이 함유된 히말라야 주목 세포를 제조하는 방법 및 전기 방법에 의하여 제조된 팩크리탁셀 (paclitaxel)을 제공한다.
히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 세포를 이용한 팩크리탁셀 (paclitaxel)을 제조하는 방법에서, 현탁배양 방법으로 세포 성장을 촉진하고, 일리시터 등을 사용하여 팩크리탁셀 (paclitaxel) 수율을 크게 향상시켜, 경제성을 높일 수 있었다. 이렇게 제조된 팩크리탁셀 (paclitaxel)은 암 치료용 의약품으로 이용 가능하기에 본 발명의 우수성을 보여주고 있다.
본 발명에 사용되는 히말라야 주목은 베트남 중부 하이랜드 지역에서 채취된 것으로, 학명은 Taxus wallichiana Zucc. 이고, 수령은 10년 생으로, 이들의 잎으로부터 캘러스를 유도하고, 안정적인 캘러스 세포주를 이용하여 현탁배양을 유도하였다. 이렇게 얻어진 현탁배양 세포에 팩크리탁셀 (paclitaxel)이 함유되어 있음을 확인하였고, 이하 설명하는 발명을 각각 실시하였다.
본 발명에서 이용하는 세포배양 방법은 공지의 현탁배양법이다. 현탁배양은 액체배지를 이용하며, 회전교반기 (gyrotory shaker)에서 120-150 rpm 속도로 교반배양을 함으로서 세포 성장 속도가 캘러스 고체배양보다 빨라서, 세포 바이오매스 생산이나 식물세포배양에 의한 유용물질 생산에 적합한 방법이다.
본 발명의 현탁배양은 성공적인 캘러스 유도를 한 후에 가능하였다. 히말라야 주목으로부터 캘러스는 다음과 같이 유도되었다. 차아염소산 나트륨과 에틸알코올로 표면 살균처리한 잎과 줄기를 적당한 크기로 자르고 고체 배양용 배지 위에 무균적으로 배양한다. 배양 수주 후에 뿌리와 잎의 절단면에서 캘러스 세포가 형성되어 자라기 시작하면, 캘러스를 연속적으로 계대 배양하여 안정된 세포주를 확립한다. 캘러스 세포 유도에 사용되는 배지는 MS (Murashige & Skoogs) 배지가 가장 적합하였다. 이 MS배지에 한천을 0.5-1.0% 첨가하여 고체 배지로 이용한다. 생장조절제로서 식물호르몬 옥신을 첨가하는데 옥신으로는 2, 4-D를 사용하였다. 또한, 배지 내에 자당(sucrose)의 농도를 30g/1 또는 그 이하로 유지할 때 세포의 성장이 좋아 바람직하다.
안정된 캘러스 세포주를 이용하여 현탁배양이 유도되었다. 한천을 첨가하지 않은 멸균된 액체배지에 캘러스를 넣고, 회전교반기 (gyrotory shaker)에서 하루 동안 약하게 교반하여 적응기간을 거친 후, 120-150 rpm 속도로 교반하면서 현탁배양을 유도하였다. 액체배지를 이용하고 교반하면서 배양하는 현탁배양은 세포 성장 속도가 캘러스 고체배양보다 빨라, 약 10일마다 계대배양을 하게 되었다. 하지만, 현탁배양 세포의 팩크리탁셀 (paclitaxel) 함량(수율)이 높지 않아, 이를 높이는 발명을 다음과 같이 수행하게 되었다.
식물세포는 외부 병원균(Pathogen)이 침입하면 이에 대응하여 이차 대사 산물의 생산을 늘려 침입균을 죽이려하는 자체 방어 능력(Self defence)이 있다. 그러나 배양중인 식물세포에 병원균을 첨가하면 초기에 이차대사 산물의 생산은 일시 증가할지 모르지만 첨가된 균에 의하여 배양 전체가 오염되어 세포 전체가 죽게 된다. 그러나 병원균과 같은 역할을 하고 배양세포 자체는 오염시키지 않는 병원균 모사물질을 넣으면 배양세포를 죽이지 않고 이차대사 산물의 생산을 증가시킬 수 있다. 이러한 물질을 일리시터(Elicitor)라 하며, 현재 쉬코닌(Shikonin), 산규나린(Sanguinarine) 등의 생산에 이용되고 있다(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants Vol. 4.p 153-196, 1987). 이렇게 일리시터가 여러 식물세포 배양 시스템에 이용되지만 적용되는 일리시터가 각각의 식물세포 배양에서 서로 일정하지 않다. 일반적으로 모든 식물세포배양 시스템에 공통으로 항상 적용되는 일리시터는 존재하지 않고 각 시스템에 적합한 일리시터를 실험으로 사용하고 있다(Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol 173(5), p380-385, 1992).
히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 세포배양에서 팩크리탁셀 (paclitaxel) 생산에 일리시터를 적용함으로써 수율을 월등히 향상시킬 수 있었다. 현탁배양에 여러 종류의 일리시터를 첨가하고 팩크리탁셀 (paclitaxel) 생산 증가 여부를 조사함으로써 팩크리탁셀 (paclitaxel)의 생산을 획기적으로 증가시키는 일리시터를 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명을 통하여 쟈스몬산 (jasmonic acid)과 셀룰라제 (cellulase)가 효과적인 일리시터임을 발견하였다. 세포 신호전달(signal transduction) 과정의 중간 매체인 쟈스몬산(Jasmonic acid)이 팩크리탁셀 (paclitaxel) 수율 향상에 효과가 우수하였는데, 현탁배양 액에 500 μM 농도로 투여하였을 때 팩크리탁셀 (paclitaxel)의 수율이 5.5배 증가하였다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
히말라야 주목 ( Taxus wallichiana Zucc .) 현탁 배양
베트남 중부 하이랜드 지역에서 채취한 팩크리탁셀 (paclitaxel) 생체시료를 이용하여 캘러스를 유도하였고 안정적 배양을 통하여 세포주를 확립하였다. 채집한 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.)은 수령 10-15년생으로 생장상태가 좋은 잎과 줄기를 캘러스 유도에 이용하였다.
생체시료를 약 10cm 길이로 자른 다음 세척한 후 트윈-20 0.1%를 함유한 0.5% sodium hypochloride 용액에 넣고 교반하며 20분간 표면살균 하였다. 이 기간 중에 30초 동안 초음파 파쇄(sonication)하여 생체시료 표면의 미세 기포를 제거하였다. 여기에 멸균수로 1회 세척한 후 70% 에탄올 용액에 넣어 1분간 재차 표면 살균한 다음, 살균 및 세척된 생체시료를 약 0.5cm 정도의 크기로 자른 뒤 MS 배지에 한천을 혼합한 고체배양용 배지 위에 옮겨 배양을 시작하였다. 배지의 주요성분은 MS 조성을 기본으로, 자당 3%, 2, 4 D 1 mg/L, kinetin 0.5 mg/L 이었다. 모든 조작은 무균조작대에서 무균적으로 실시하였고, 25℃ 암조건에서 배양시작 후 2-3주 후부터 캘러스가 유도되어 자랐다. 여러 생체시료로부터 캘러스가 잘 유도되었으며, 이중 우수한 것을 매 1개월마다 새로운 배지에 옮겨 계대배양을 실시하여 세포주 (cell line)를 확립하였다.
안정된 캘러스 세포주를 이용하여 현탁배양을 유도하였다. 상기 배지에서 한천을 첨가하지 않은 멸균된 액체 배지에 캘러스를 넣고, 회전교반기 (gyrotory shaker)에서 하루 동안 약하게 교반하여 적응기간을 거친 후, 120-150 rpm 속도로 교반하면서 현탁배양을 유도하였다. 액체 배지를 이용하고 교반하면서 배양하는 현탁배양은 세포 성장 속도가 캘러스 고체배양보다 빨라, 약 10일마다 계대배양을 하게 되었다.
현탁배양 세포의 팩크리탁셀 ( paclitaxel ) 함량
실시예 1에서 현탁배양된 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.)세포를 건조하여, 메탄올로 추출하여 함유된 팩크리탁셀 (paclitaxel)의 함량을 분석하였다. Paclitaxel 함량은 세포내 함량과 배지에 존재하는 세포 외 함량으로 구분하였다. 세포 내 함량은 fresh cell에 methanol을 가하고 초음파 파쇄하여 추출한 뒤 methylene chloride(MC)와 물을 (1:1, v/v) 이용해 partitioning하여 수용액 층을 제거한 후 MC를 진공 감압하여 제거하였다. 다시 methanol로 추출하여 0.45㎛, membrane filter로 여과하여 HPLC로 분석하였다. 배지에 존재하는 paclitaxel은 일정량의 배지를 MC와 1:1로 partitioning하여 MC를 진공 감압한 후 methanol로 녹여 여과 후 분석하였다. 분석 방법으로 HPLC 분석법을 이용하였다. 분석칼럼으로는 reversed phase pentafluorophenyl (PFP) HPLC column(4.6×250㎜, 5μ, 60Å,)을 이용하였다. PFP column을 이용한 분석에서의 이동상은 H2O와 acetonitrile을 62:38(v/v)로 25분간 일정한 비율로 유지한 후 10분간 linear gradient로 57:43(v/v)으로, 다시 5분간 linear gradient로 55:45(v/v)로 유지하였다. 유속은 1.2㎖/min, sample 주입량은 20㎕로 유지하였다. 검색 파장은 228㎚와 280㎚를 이용하였다
HPLC 분석 결과 배양된 세포에서의 팩크리탁셀 (paclitaxel) 함량은 세포의 배양 시기에 따라 달랐다. 회분식 배양 초기에는 paclitaxel이 검출되지 않았지만, stationary growth phase 및 decline phase 에 존재하는 세포에서는 2.0-5.1 mg/L 농도로 paclitaxel이 생성되어 함유되어 있음이 확인되었다.
일리시터 첨가에 의한 팩크리탁셀 ( paclitaxel ) 수율 향상
실시예 1에서 히말라야 주목세포의 paclitaxel 생산 함량 또는 생산성은 그다지 높지 않았다. 수율을 높이기 위하여 일리시터를 적용하였다. 실시예 1과 동일한 배양 조건에서, 다양한 종류의 일리시터를 첨가하고, 1주일 후 배양된 세포를 수확하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 생산된 팩크리탁셀 (paclitaxel)을 분석하여 표 1에 나타내었다. 적용한 일리시터는 쟈스몬산 (jasmonic acid), 셀룰라제 (cellulase), 펙티나제 (pectinase) 이었다.
일리시터 첨가에 의한 팩크리탁셀 (paclitaxel) 수율 증가
일리시터 첨가농도 첨가하지 않은 배양세포의 paclitaxel 함량 일리시터 첨가한
배양세포의 paclitaxel 함량		 수율 증가
쟈스몬산 100 μM 5.0 mg/L 12.0 mg/L 2.4 배
셀룰라제 20
unit/g fresh cell		 5.0 mg/L 8.3 mg/L 1.7 배
펙티나제 20
unit/g fresh cell		 5.0 mg/L 5.1 mg/L 1.0 배
팩크리탁셀 (paclitaxel)의 수율을 보다 높이기 위한 방법이 고안되었는데, [표 1]에서 효과가 있는 일리시터를 조합하여 복합 일리시터를 투여하는 방법이다. 여러 조합을 적용하여 시험하였는데, 그 중에서 특히 쟈스몬산과 셀룰라제 조합에서 수율 상승 효과 높음을 발견하였다. 즉 표 2와 같이 쟈스몬산과 셀룰라제 복합 일리시터를 첨가하면 paclitaxel 생성에 상승작용을 일으켜 수율이 크게 향상됨을 알 수 있었다.
복합 일리시터 첨가에 의한 팩크리탁셀 (paclitaxel) 수율 증가
복합 일리시터 및 첨가농도 첨가하지 않은 배양세포의 paclitaxel 함량 일리시터 첨가한
배양세포의 paclitaxel 함량		 수율 증가
쟈스몬산 100 μM
+
셀룰라제 20 unit/g fresh cell		 5.0 mg/L 22.0 mg/L 4.4 배
쟈스몬산 100 μM
+
펙티나제 20 unit/g fresh cell		 5.0 mg/L 13.2 mg/L 2.6 배
셀룰라제 20 unit/g fresh cell
+
펙티나제 20 unit/g fresh cell		 5.0 mg/L 8.3 mg/L 1.7 배

Claims (4)

  1. 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 현탁배양에, 일리시터를 투여하여 팩크리탁셀 (paclitaxel) 수율을 향상시킨, 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 세포 및 팩크리탁셀 (paclitaxel) 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.)의 살아있는 조직을, 2,4 D를 함유하는 캘러스 유도용 Murashige & Skoogs 고체배지에서 캘러스를 유도하고, 이를 이용하여 유도한 현탁배양을 특징으로 하는 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 세포 및 팩크리탁셀 (paclitaxel) 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 일리시터로서 쟈스몬산 50 - 1000 마이크로몰 (μM), 셀룰라제 10 - 100 단위 (unit/g fresh cell) 농도로 투여함을 특징으로 하는 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 세포 및 팩크리탁셀 (paclitaxel) 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 일리시터로서 쟈스몬산과 셀룰라제를 복합적으로 투여함을 특징으로 하는 히말라야 주목 (Taxus wallichiana Zucc.) 세포 및 팩크리탁셀 (paclitaxel) 제조방법.
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