KR20110103961A - 저점도 고농축 현탁액 - Google Patents

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KR20110103961A
KR20110103961A KR1020117013867A KR20117013867A KR20110103961A KR 20110103961 A KR20110103961 A KR 20110103961A KR 1020117013867 A KR1020117013867 A KR 1020117013867A KR 20117013867 A KR20117013867 A KR 20117013867A KR 20110103961 A KR20110103961 A KR 20110103961A
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키쓰 피. 존스턴
마리아 안드레아 마주스키
조슈아 엥스트롬
미구엘 안젤로 로드리게스
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보드 오브 리전츠 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 용매와, 하나 이상의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 비결정성 입자와의 고농도 저점도 현탁액을 제공한다. 임의로, 진탕 또는 교반시 현탁 가능한 적어도 20㎎/㎖의 농도 및 2 내지 100센티푸아즈의 용액 점도를 갖는 고농도 저점도 현탁액을 형성하기 위한 약제학적으로 허용되는 용매 중의 하나 이상의 첨가제가 당해 현탁액에 포함되고, 여기서, 상기 현탁액은, 전달시 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 펩티드는 용해되어 펩티드 응집물을 형성하지 않고, 21 내지 27-게이지 니들을 통하여 주사 가능하다.

Description

저점도 고농축 현탁액{Low viscosity highly concentrated suspensions}
본 발명은 일반적으로 단백질 저장 및 전달 분야에 관한 것이며, 보다 특히, 신규한 조성물에 관한 것이고, 또한 고농축 단백질 현탁액 및 이들의 전구체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니지만, 본 발명의 배경을 단백질의 농도와 관련하여 기술한다. 치료를 위한 단백질 및 기타 폴리펩티드는 체내에서 자연적으로 발견되지 않는 약제의 기타 종류보다 덜 독성이고 생체내에서 보다 예상 가능하게 거동하는 것으로 보여지므로, 이의 사용은 환자를 확장시키고 보다 잘 치료하는 방법으로서 최근 몇 년 동안 증가하고 있다. 단백질 치료제의 전달은 주로 대용량의 정맥내 주사를 희석하여 필요한 고용량(100-1000㎎)을 전달하고 고농도의 단백질의 물리적 및 화학적 불안정성을 예방하기 위해 제한되었다. 잠재적으로 덜 침습적인(invasive) 투여 방법은 피하 주사이다. 주사 용적은 1.5㎖로 제한되므로, 단백질 치료제의 농도는 종종 실질적으로 100㎎/㎖를 초과한다. 폴리펩티드 안정성 외에, 또 다른 주요 관심은 단백질 상호 작용으로 인하여 100 내지 400㎎/㎖를 초과하는 용액 농도에 대한 극적인 점도 상승이다. 주요 상호 작용이 정전기로 인한 인력이 있는 단백질-단백질 상호 작용인 경우, 이러한 점도 증가는 염화나트륨을 첨가하여 용액의 이온 강도를 증가시키고 완충액 종 및 용액의 pH를 변화시켜 예방할 수 있었다. 이러한 높은 농도에서는, 변성에 대해 보호하기기 위하여 큰 부형제 농도가 종종 필요하다. 대안적인 접근은 비수성 용매 중의 불용성 단백질의 현탁액을 형성하는 것일 것이다. 고농축 현탁액의 점도는 용액에 대해서보다 훨씬 더 낮을 수 있고, 단백질을 안정화시키는 보다 낮은 부형제 수준을 필요로 할 수 있다. 그러나, 농축 현탁액을 사용한 성공적인 전달을 위하여, 입자 크기 및 현탁액 균일성은 정확하고 균일한 용량을 투여하기 위하여 조절되어야 한다.
이제까지, 의학적 목적을 위한 비수성 매질 중의 단백질의 현탁액은 비교적 소수의 예가 존재한다. 젖소의 우유 생산량을 증가시키기 위하여 판매되는, 소 소마토트로핀(bovine somatotropin)의 고점성 현탁액 및 소의 뇌하수체로부터 소마토트로핀을 방출시키는데 사용되는 소 성장 호르몬 방출 인자 유사체가 각각 참기름 및 미글리올유 중에서 제형화된다. 이러한 점성 현탁액은 주사를 위하여 큰 14-16 게이지 니들을 필요로 하지만, 사람에 대한 바람직한 니들 크기는 25-게이지 내지 27-게이지이다. 또한, 몇 가지 비수성 주사제가 희석제, 예를 들면, 벤질 벤조에이트 또는 벤질 알콜의 존재하에 점도 강화제 및 겔 형성 중합체의 도움으로 펩티드 인슐린 및 매우 안정한 단백질, 예를 들면, 단백질 C 및 독점적 모노클론성 항체에 대한 서방성 제형으로서 제형화되어 왔다. 그러나, 당해 제형은 주사시 비순응성을 유도하는 상당한 통증을 유발하는 보다 큰 21-게이지 니들로만 주사 가능하고, 고수준의 부형제가 제형 중의 전체 단백질 농도를 감소시킨다. 또 다른 선택은 단백질 또는 모노클론성 항체를 결정화시키고 결정의 수성 현탁액을 형성하는 것이다. 이러한 접근은 3개의 모노클론성 항체 및 인슐린에 대하여 나타낸 바 있다. 그러나, 고분자량 단백질의 결정화는 고도의 분절 유연성으로 인하여 매우 곤란할 수 있고, 훨씬 더 낮은 정도의 유연성을 갖는 작은 펩티드에 대하여 보다 실행 가능하다.
발명의 기술
본 발명은 하나 이상의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 마이크론 미만(sub-micron) 또는 마이크론 크기의 입자를 형성하고, 임의로 하나 이상의 첨가제를 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자에 첨가하고, 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자를 약제학적으로 허용되는 용매에 현탁시켜, 진탕 또는 교반시 현탁 가능한, 농도가 적어도 20㎎/㎖이고 용액 점도가 2 내지 100센티푸아즈(centipoise)인 고농도 저점도 현탁액(여기서, 상기 현탁액은, 전달시 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자는 용해되어 펩티드 응집물을 형성하지 않거나 단지 적은 분획의 응집물을 형성하고, 21 내지 27-게이지 니들을 통하여 주사 가능하다)을 형성함으로써 고농도 저점도 단백질 또는 펩티드 현탁액을 제조하는 방법을 제공한다. 약제학적으로 허용되는 용매는 약제학적으로 허용되는 수성 용매, 약제학적으로 허용되는 비수성 용매 또는 배합물일 수 있다.
또한, 하나 이상의 마이크론 크기의 펩티드 입자는 투약 용기(dosage container)에서 형성되고 바이알, 앰풀, 시린지 또는 벌크 용기인 투약 용기로부터 직접 전달될 수 있다. 하나 이상의 마이크론 크기의 펩티드 입자는 분쇄, 침전, 투석, 체질, 분무 건조, 동결 건조, 분무 동결 건조, 액체로의 분무 동결, 박막 동결 또는 투약 용기 속에서의 직접 동결에 의하여 제조할 수 있다. 하나 이상의 첨가제는 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자의 일부, 상기 고농도 저점도 현탁액의 일부 또는 둘 다일 수 있다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 용매와, 하나 이상의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 비결정성 입자와의 고농도 저점도 현탁액을 제공한다. 임의로, 약제학적으로 허용되는 용매 중의 하나 이상의 첨가제는, 진탕 또는 교반시 현탁 가능한, 농도가 적어도 20㎎/㎖이고 용액 점도가 2 내지 100센티푸아즈인 고농도 저점도 현탁액을 형성하고, 여기서, 상기 현탁액은, 전달시 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자는 용해되어 펩티드 응집물을 형성하지 않거나 21 내지 27-게이지 니들을 통하여 주사 가능한 단지 적은 분획의 응집물을 형성한다. 약제학적으로 허용되는 용매는 약제학적으로 허용되는 수성 용매, 약제학적으로 허용되는 비수성 용매 또는 이들의 배합물일 수 있다. 또한, 하나 이상의 마이크론 크기의 펩티드 입자는 투약 용기 중에서 형성되고, 바이알, 앰풀, 시린지 또는 벌크 용기인 투약 용기로부터 직접 전달될 수 있다. 하나 이상의 마이크론 크기의 펩티드 입자는 분쇄, 침전, 투석, 체질, 분무 건조, 동결 건조, 분무 동결 건조, 액체로의 분무 동결, 박막 동결 또는 투약 용기 내에서의 직접 동결에 의하여 제조할 수 있다. 하나 이상의 첨가제는 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자의 일부, 상기 고농도 저점도 현탁액의 일부 또는 이들 둘 다일 수 있다.
본 발명은 단일 용량 용기 중의 단일 용량 고농도 저점도 현탁액을 제공한다. 단일 용량 용기는 단일 용량 용기에 배치된 약제학적으로 허용되는 용매(여기서, 약제학적으로 허용되는 용매는 수성 용매, 비수성 용매 또는 이들의 배합물로부터 선택된다) 및 단일 용량 용기에 배치된 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 비결정성 입자(여기서, 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 비결정성 입자는 하나 이상의 단백질 또는 펩티드를 포함한다)를 포함한다. 또한, 하나 이상의 첨가제가 임의로 단일 용량 용기에 배치되어 농도가 적어도 20㎎/㎖이고 용액 점도가 21 내지 27-게이지 니들을 통하여 주사 가능한 2 내지 100센티푸아즈인 고농도 저점도 현탁액을 형성할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점의 보다 완전한 이해를 위하여, 첨부한 도면과 함께 본 발명의 상세한 설명을 참조하여 수행한다:
도 1A-C는 본 발명의 한 양태의 방법에 의하여 제조된 입자의 SEM 이미지이다.
도 2A-2E는 원심분리(3000rpm에서 20분) 전(도 2A 및 B) 및 후(도 2C-E)의 현탁액의 이미지이다. 좌측에서 우측으로 모두 NaCl을 154mM 이온 강도로 첨가한 150mM pH 4.7 아세테이트 완충액 중의 1.5M 황산암모늄(a 및 c), 30% PEG 300(b 및 d), 35% NMP(e).
도 3은 3000g에서 20분 동안 원심분리 후의 수성 PEG 300 현탁액의 이미지이다. 좌측에서 우측으로 NaCl을 154mM 이온 강도로 첨가한 150mM pH 4.7 아세테이트 완충액 중의 30% PEG 300, 40% PEG 300 및 50% PEG 300이다.
도 4는 모두 50% PEG 300을 포함하고 NaCl을 154mM 이온 강도로 첨가한 다양한 pH에서의 수성 현탁액의 겉보기 점도의 그래프이다.
도 5는 3000g에서 20분 동안 원심분리 후의 수성 50% PEG 300 현탁액의 이미지이다. 좌측에서 우측으로 pH 4.7 아세테이트 완충액, pH 5.5 아세테이트 완충액 및 pH 7.4 아세테이트 완충액이다.
도 6은 NaCl을 154mM 이온 강도로 첨가한 150mM pH 4.7 아세테이트 완충액 중의 PEG 300 및 유기 첨가제를 갖는 수성 현탁액의 겉보기 점도의 그래프이다.
도 4A 및 7B는 a) 25% PEG 300 20% 에탄올 및 b) 35% PEG 300과 15% NMP 중의 순수한 분쇄된 입자의 [η]를 사용하여 크리거-도허티(Krieger-Dougherty) 식으로부터 계산한 바와 같은 이론적 점도에 따른 150mM pH 4.7 아세테이트 완충액 중의 다양한 비율에서의 분쇄된 BSA 및 트레할로스의 겉보기 점도를 나타내는 그래프이다.
도 8A-8E는 IgG의 다양한 동결 분말의 SEM 이미지이다.
도 9는 350㎚에서 측정된 IgG의 용해도를 감소시키는 용매의 총 50용적%에 이르는 다양한 첨가제를 갖는 IgG의 광학 밀도의 그래프이다. 우측은 추가의 첨가제가 없는 pH 6.4 20mM 히스티딘 완충액 중의 IgG의 5㎎/㎖ 농도의 흡광도를 나타낸다.
도 10A-10D는 IgG의 다양한 현탁액의 이미지이다.
도 11A-11E는 IgG의 다양한 현탁액의 현미경 이미지이다.
도 12는 아세토니트릴과 에탄올 중의 원래의 분쇄된 입자에 대하여, 및 2개월 동안의 저장 후 순수한 벤질 벤조에이트 및 벤질 벤조에이트와 오일과의 혼합물 중의 현탁액에 대하여, 둘 다 광 산란에 의해 에탄올에 희석한 직후에 10-15% 불투명도(obscuration)로 측정된, 입자의 용적% 대 크기이다.
도 13A-13C는 50/50 벤질 벤조에이트와 홍화유 중의 300㎎/㎖ 리소자임 현탁액의 사진이다.
도 14는 실온 및 변화하는 농도에서의 벤질 벤조에이트와 홍화유의 용액의 점도이다.
도 15는 비수성 용매 중의 현탁액으로서의 입자의 농도와 수성 리소자임 용액의 이론적 점도의 함수로서의 겉보기 점도이다.
도 16은 현탁액의 칼 피셔(Karl Fisher) 수분 함량 분석이다.
도 17은 제형화 직후에 촬영한 현탁액의 이미지이다.
도 18은 바이알 내부의 리소자임 용액(10㎎/㎖)의 동결 온도 프로파일이다.
도 19A-19D는 표 2에 기재된 조건에서의 바이알 내의 필름 동결에 의하여 제조된 단백질 입자의 용적 크기 분포이다.
도 20은 바이알 내부의 필름 동결에 의하여 동결된 수중 리소자임 용액(20㎎/㎖) 4㎖를 나타낸다.
도 21은 바이알 내부의 필름 동결에 의하여 동결된 수중 헤모글로빈 용액(150㎎/㎖) 2㎖를 나타낸다.
발명의 설명
본 발명의 다양한 양태의 제조 및 사용을 아래에 상세히 논의하는 한편, 본 발명이 매우 다양한 특정 상황에서 구체화될 수 있는 다수의 적용 가능한 본 발명의 개념을 제공한다는 것을 인식하여야 한다. 본원에서 논의된 특정 양태는 단지 본 발명을 제조하고 사용하는 특정 방법의 예시이고 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위하여, 다수의 용어가 아래에 정의된다. 본원에서 정의된 용어는 본 발명에 관련된 영역의 통상의 숙련가에 의하여 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하나("a", "an" 및 "the")는 단수의 독립체만을 나타내려는 것이 아니라, 특정한 예가 예시를 위해 사용될 수 있는 일반적인 종류를 포함하려는 것이다. 본원에서의 용어는 본 발명의 특정 양태를 설명하는데 사용되지만, 이들의 용법은 특허청구범위에 기재된 것을 제외하고는, 본 발명을 제한하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "높은 단백질 농도"는 단백질 농도가 100㎎/㎖를 초과하는 액체, 겔, 하이드로겔 또는 겔 유사 조성물을 언급한다.
본원에서 사용된 용어 "비-응집성" 또는 "응집하지 않는" 또는 "응집되지 않은"은 높은 단백질 농도, 예를 들면, 100㎎/㎖를 초과하는 단백질 농도의 형태로 제공됨에도 불구하고 현탁액에 잔존하는 단백질 입자를 언급한다.
본원에서 사용된 용어 "주사 가능한"은 유동 가능하기에 충분히 유체인, 대상자에게 전달하기 위한 최종 조성물을 언급한다. 예를 들면, "주사 가능한" 조성물은 시린지에 적재시키고 과도하게 힘을 가하지 않고 시린지로부터 대상자에게 주사하기에 충분히 낮은 점도를 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "비-침강성" 또는 "재분산성"은 연장된 기간 후, 예를 들면, 1시간, 2시간, 1일, 3일, 5일, 1주, 1개월, 3개월, 6개월, 1년 이상 후 용액 상에 잔존하는(즉, 침강하지 않는) 조성물을 언급한다. 예를 들면, 조성물은 "재분산성"이고, 재분산시 이는 약물의 재현성 있는 투약을 방해할 정도로 신속하게 응집하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "단백질(들)", "폴리펩티드(들)" 및 "펩티드(들)"는 아미노산을 다양한 길이의 쇄로 연결시켜 형성된 중합체 조성물을 언급한다.
본원에서 사용된 용어 "첨가제(들)"는 다음을 포함하는 염, 당, 유기물, 완충액, 중합체 및 기타 조성물을 언급한다: 에데트산이나트륨, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 석신산나트륨, 수산화나트륨, 나트륨 글루코헵토네이트, 나트륨 아세틸트립토파네이트, 중탄산나트륨, 나트륨 카프릴레이트, 나트륨 퍼테크네테이트, 아세트산나트륨, 나트륨 도데실 설페이트, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 시트르산암모늄, 염화칼슘, 칼슘, 염화칼륨, 칼륨 나트륨 타르트레이트, 산화아연, 아연, 염화제1주석, 황산마그네슘, 스테아르산마그네슘, 이산화티탄, DL-락트산/글리콜산, 아스파라긴, L-아르기닌, 아르기닌 하이드로클로라이드, 아데닌, 히스티딘, 글리신, 글루타민, 글루타티온, 이미다졸, 프로타민, 황산프로타민, 인산, 트리-n-부틸 포스페이트, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 염산, 시트르산수소, 시트르산삼나트륨, 구아니딘 하이드로클로라이드, 만니톨, 락토스, 수크로스, 아가로스, 소르비톨, 말토스, 트레할로스, 계면활성제, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 188, 소르비탄 모노올레에이트, 트리톤 n101, m-크레졸, 베닐 알콜, 에탄올아민, 글리세린, 포스포릴에탄올아민, 트로메타민, 2-페닐옥시에탄올, 클로로부탄올, 디메틸설폭사이드, N-메틸-2-피롤리돈, 프로필렌글리콜, 폴리옥실 35 피마자유, 메틸 하이드록시벤조에이트, 트로메타민, 옥수수유-모노-디-트리글리세라이드, 폴록실 40 수소화 피마자유, 토코페롤, n-아세틸트립토판, 옥타-플루오로프로판, 피마자유, 폴리옥시에틸화 올레산 글리세라이드, 폴리옥시테틸화 피마자유, 페놀(소독제), 글리시글리신, 티메로살(소독제, 살균제), 파라벤(방부제), 젤라틴, 포름알데히드, 둘벡코(Dulbecco) 개질 이글 매질, 하이드로코르티손, 네오마이신, 폰 빌레브란트(Von Willebrand) 인자, 글루테르알데히드, 벤제토늄 클로라이드, 백랍판(White petroleum), p-아미노페닐-p-아니세이트, 글루탐산일나트륨, 베타-프로피오락톤, 아세테이트, 시트레이트, 글루타메이트, 글리시네이트, 히스티딘, 락테이트, 말레에이트, 포스페이트, 석시네이트, 타르트레이트, 트리스, 카보머 1342(아크릴산과, 펜타에리트리톨의 알릴 에스테르와 가교결합된 장쇄 알킬 메타크릴레이트와의 공중합체), 글루코스 스타 중합체, 실리콘 중합체, 폴리디메틸실록산, 폴리에틸렌 글리콜, 카복시메틸셀룰로스, 폴리(글리콜산), 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리락트산, 덱스트란 40, 폴록사머(에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 삼블록 공중합체).
비수성 용매 중의 고농축 단백질 현탁액에 대하여, 크리거-도허티 식은 용액의 점도η0에 대한 현탁액의 상대 점도 η를 입자의 용적 분율 φ에 상호 연관시키는데 사용될 수 있다(수학식 1).
Figure pct00001
고유 점도 [η]는 아인슈타인 값인 2.5에 근접하여, 용적 상호 작용만을 제외한 상호 작용하지 않는, 구형 입자를 가정한다. 그러나, [η]는, 입자의 용매화, 구형 입자로부터의 이탈 및 1차, 2차 및 3차 전기점성 효과를 생성하는 정전기 상호 작용의 경우에 증가한다. 이전에 증명된 비수성 단백질 현탁액에 대하여, 약 2.5의 [η] 는 리소자임 분쇄된 입자의 점도에 대하여 용매화, 형상 및 전기점성 효과의 결핍을 나타내었다. 그러나, 비수성 용매는 때로는 주사시 통증 및 입자의 지연되고 느린 방출을 유발할 수 있다. 결과적으로, 고도로 농축되고 분자적으로 안정한 단백질 입자의 수성계 현탁액은 비수성 현탁액에 대한 유리한 대안물일 것이다.
치료학적 단백질은 예를 들면, 모델 단백질 BSA에 대하여 100㎎/㎖의 범위의 수성 매질 중에서 높은 용해도를 위하여 고안될 수 있다. 따라서, 마이크론 크기의 입자의 현탁액을 형성하기 위하여, 용해도는 종종 현저히 감소되어야 한다. 수중 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있는 침전제는 세 가지 범주로 분류할 수 있는데; 염, 중합체 및 수용성 유기물이다. 염은 수화용수 뿐만 아니라 단백질 분자 사이의 보다 강한 상호 작용을 생성하는 이온 결합에 대한 경쟁에 의하여 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있다. 염은 또한 이중 층의 두께를 감소시켜 정전기 반발을 생성한다. 그러나, 혈액 긴장도(blood tonicity)인 약 154mM의 총 이온 강도는 통상적으로 주사시 통증을 방지하는 것으로 권장된다. 바람직하게는 단백질 표면으로부터 배제되는, 가장 일반적으로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 중합체는 침전을 유발하는 소모 인력(depletion attraction)을 생성한다. PEG는 단백질의 열 안정성을 증가시키는 것으로도 공지되어 있다. 추가로, 이는 피하 주사용으로 허용되는 부형제이다. 수용성 유기 첨가제, 예를 들면, 에탄올 및 n-메틸-2-피롤리돈(NMP)은 유전 상수를 저하시킴으로써, 그리고 단백질 표면으로부터의 상기 물질들의 배제로 인한 배제된 용적 효과에 의하여 단백질 용해도를 감소시킨다.
당해 연구의 목적은 피하 전달에 적합한 모델 단백질 소 혈청 알부민(BSA)의 마이크론 미만 내지 마이크론 크기의 입자의 저점도(< 50cP), 고농축(100 내지 350㎎/㎖) 수성 현탁액을 형성하는 것이었다. 단백질의 용해도를 감소시키는 것으로 공지된, 침전제는 황산암모늄(대표적인 염), PEG 300(저분자량 중합체) 및 에탄올 및 N-메틸-2-피롤리돈(NMP)의 배합물을 포함하였다. 두개 주요 인자가 단백질의 제시된 용적 분율에서 현탁액의 점도에 영향을 미친다: 단백질이 부재한 용액의 초기 점도 및 단백질이 존재하는 고유 점도. BSA 37㎛ 미만의 분쇄된 입자는 당해 경쟁 효과를 특성으로 하는 각종 수성계 용매에 현탁시켰다. 다수의 경우, 첨가제의 농도는 약제학적으로 허용되는 한계 내에 있었다. 다양한 입자 농도에서의 현탁액의 겉보기 점도는 크리거-도허티 식과 상호 연관되어 고유 점도를 측정한다. 고유 점도는 전기점성 및 용매화 상호 작용을 포함하는 입자내 상호 작용을 확인시키는데 사용하였다. 약제학적으로 관련된 첨가제를 포함하는 다양한 저점도, 고농축(350㎎/㎖ 이하) 수성계 현탁액이 분쇄된 BSA 입자에 대하여 보고되어 있다. 모델 단백질 BSA의 현탁액의 점도 및 모폴로지의 연구로부터 수득한 통찰은 IgG와 같은 치료학적 단백질의 현탁액의 고안에 유용하다.
입수한 BSA 분말 또는 트레할로스 분말은 자기 막자사발과 막자로 수 분 동안 개별적으로 건조 분쇄시켰다. 이어서, 분쇄된 분말을 400호 메쉬를 통하여 체질하였고, 37㎛ 미만의 입자를 수집하였다. 혼합되고 분쇄된 BSA와 트레할로스 입자에 대하여, 이어서, BSA 대 트레할로스의 필요한 비를 막자사발과 막자로 혼합하였고, 400호 메쉬를 통하여 재체질하여 정확한 입자 비를 유지하지만 37㎛ 미만의 입자 크기를 보유하였다. 분말의 공지된 중량을 NMP, PEG 300 및/또는 에탄올 및 염화나트륨 또는 황산암모늄 염으로 구성된 수용액에 현탁시켰다. pH를 아세테이트(pH 4.7 및 5.5) 또는 포스페이트(pH 7.4) 완충액으로 4.7, 5.5 또는 7.4로서 선택하였다. 이어서, 각각의 바이알을 손으로 진탕시켜 현탁액을 통하여 균일하게 분말을 분산시켰다. 니들의 첨단을 사용한 추가의 혼합을 사용하여 필요한 경우, 균일성을 보장하였다.
BSA는 pH 4.7 150mM 아세테이트 완충액 중에서 5㎎/㎖로 용이하게 가용성이었다. BSA 용액 5㎎/㎖의 분취량을 단백질의 침전도를 측정하는 목적으로 첨가제(PEG 300, NMP 또는 이들 둘의 배합물)를 함유하는 동등한 용적의 제2 수용액과 혼합하였다. 단백질의 침전은 매우 혼탁(HT), 낮은 혼탁(LT, 약간의 혼탁도) 또는 혼탁도 변화 없음(N)으로 분류되었다. 용액은 모두 pH 4.7 150mM 아세테이트 완충액 중에서 제형화시켰다.
IgG 현탁액의 겉보기 점도를 현탁액 0.25㎖를 1㎖ 투베르쿨린 슬립 팁 시린지에 부착된 25 게이지 1.5" 니들로 뽑아내는 시간으로서 측정하였다. 통상적인 시간은 5 내지 100초의 범위였다. 각각의 측정은 3회 이상 실시하여 평균내는 한편, 매번 1㎖ 마크(mark)에서 플런저(plunger)의 말단을 유지함으로써 흡인력을 유지시켰다. 점도 및 1㎖(측정되는 양의 4배)를 뽑아내는 시간에 대한 선형 상관 곡선를 공지된 점도를 갖는 액체(PEG200, PEG 300, PEG 400, 물, 에탄올, 올리브유 및 벤질 벤조에이트)를 측정하여 구성하였다. 하겐-푸아죄유(Hagen-Poiseuille) 식으로부터 예상되는 바와 같은, 이러한 상관 관계는 0.999를 초과하는 r2 값을 제공하고, 이전에 보고되었다. 대부분의 경우, 점도 재현성은 5% 이내였다. 본 발명자들의 실험에서 시린지내 공동의 25%의 최대 용적은 흡입(uptake)용 현탁액으로 충전되었다. 결과적으로, 압력 강하는 상대적으로 일정하였다. 압력 강하의 작은 변화에 의하여 도입된 오차는 매번 동일한 플런저 위치를 사용하고 상기 데이타를 공지된 점도를 갖는 액체에 상호 연관시켜 최소화시켰다.
현탁액 점도 측정 이후, 단백질 현탁액을 에펜도르프 원심분리기(Eppendorf Centrifuge, model 5810, Wesbury, NY)용 2㎖ 원심분리 관 어댑터가 장착된 회전 버킷 원심분리 로터(part A-4-62)를 사용하여 3000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 원심분리된 샘플을 사진 촬영하고, 상청액을 니들 및 시린지를 사용하여 샘플을 조심스럽게 디캔팅함으로써 분리하였다. 이어서, 잔여 단백질 입자를 5분 동안 가볍게 욕 초음파처리하여 아세토니트릴 약 15㎖에 재현탁시켰다. 아세토니트릴에 BSA가 용해되는 것은 무시할만한 수준이었다. 재분산 후, 단백질 입자 크기를 이어서 초음파 처리 분산액의 한 액적에 대하여 측정하였다. 분산액을 적은 용적(11㎖)의 자기 교반된 셀 속에서 아세토니트릴에 약 10%의 불투명도로 희석하고, 입자 크기를 맬번 인스트루먼츠 마스터사이저(Malvern Instruments Mastersizer) S를 사용한 광 산란에 의하여 분석하였다.
입자 크기 측정 부분에 기재된 원심분리 후, 이어서 회수된 상청액을 0.22㎛ 필터를 통하여 여과하고, 수집하였다. 이어서, 여과된 샘플을 pH 4.7 150mM 아세테이트 완충액에 총 용적 0.7㎖로 희석하였다. 각각의 샘플의 세 개의 200㎕ 분취량을 이어서 UV-투명 96-웰 플레이트에 놓고, 분광 광도계를 사용하여 280nm에서 이미지화하였다. 동일한 완충액 중의 3, 2, 1, 0.5 및 0㎎/㎖의 BSA 농도 대 280nm에서의 흡광도의 표준 곡선으로 0.99를 초과하는 r2 값이 산출되었다. 교정(calibration) 곡선을 사용하여 각각의 샘플에 대한 가용성 농도 값을 회귀시켰다. 필요한 경우, 샘플을 후속적으로 희석하고, 농도가 0.5-3㎎/㎖의 범위에 속할 때까지 재측정하였다.
수성 현탁액의 한 액적을 액체 질소로 -200℃에서 유지시킨 동결 알루미늄 SEM 단계로 급속 동결시켰다. 동결 액적을 비르티스 어드밴티지 플러스(VirTis Advantage Plus) XL-70 쉘프(shelf) 동결 건조기를 사용하여 -40℃에서 12시간 동안 1차 건조시켜 동결 건조시킨 다음, 25℃에서 6시간 램핑(ramping)시키고, 25℃에서 적어도 6시간 동안 2차 건조시켰다. 동결 건조로 SEM 단계에서 건조된 분말 샘플이 생성되었다. 분쇄된 입자의 건조 분말 샘플을 접착성 탄소 테이프 위에 놓았다. 이어서, 각각의 샘플을 크레싱톤 208 벤치 톱 스퍼터 코터(Cressington 208 bench top sputter coater)를 사용하여 15nm의 두께로 금-팔라듐 스퍼터 피복하였다. 이어서, 5kV의 가속 전압으로 자이스 수프라(Zeiss Supra) 40 VP 주사 전자 현미경을 사용하여 현미경 사진을 촬영하였다.
다양한 첨가제를 첨가하여 수성 완충액 중의 단백질의 용해도를 감소시킬 수 있다. 표 1의 용해도의 혼탁측정 연구는 순수한 PEG 및 NMP 또는 이들의 혼합물로 5㎎/㎖의 낮은 단백질 농도에서도 BSA가 침전됨을 나타낸다. 표 2는 낮은 혼탁도 현탁액(LT)이 30%에서 형성되므로, PEG가 NMP보다 강한 반용매(antisolvent)임을 나타낸다. 추가로, 두 반용매의 혼합물은 단백질 침전시 상승적인 효과를 생성할 수 있다. 예를 들면, 20-20% 혼합물은 높은 혼탁도를 발생시키는 반면, 40% NMP는 혼탁도의 변화를 생성하지 않는다. 최종적으로, 반용매의 제시된 총 중량%에 대하여, 혼탁도는 PEG의 상대 분율이 증가함에 따라 증가한다. 이러한 실험은 희석된 5㎎/㎖ 단백질 농도도 당해 반용매로 용해도 한계를 훨씬 초과함을 나타낸다. 그러므로, 단백질의 단지 적은 분획이, 전체 단백질 농도가 주사용 현탁액에 대한 통상적인 농도인, 200㎎/㎖인 경우, 당해 첨가제와 함께 용해될 수 있다.
도 1A-C는 본 발명의 한 양태의 방법으로 제조된 입자의 SEM 이미지이다. 도 1A는 원래의 분쇄된 입자의 SEM 이미지이다. 도 1B는 200㎎/㎖에서 순간 동결되고 동결 건조된 30% PEG 300 현탁액의 SEM 이미지이다. 도 1C는 350㎎/㎖에서 순간 동결되고 동결 건조된 25% PEG 300 20% 에탄올 현탁액의 SEM 이미지이다.
원래의 분쇄된 입자의 모폴로지는 도 1A에 나타낸다. 평균 입자 크기는 20㎛였다. 크기는 241㎛ 미만의 내부 직경을 갖는 25-27 게이지 니들을 통하여 통과하기에 충분히 작도록 선택되었다. 최종 현탁액의 한 액적을 동결시키고 동결 건조시키고, SEM을 이용하여 도 1B 및 C에 나타낸 침전제의 두 가지 종류에 대한 현탁액의 입자 크기를 측정하였다. 입자 크기는 원래의 분쇄된 입자의 크기보다 단지 조금 더 커서 입자 응집 또는 오스트발트 숙성(Ostwald ripening)으로부터의 약간의 성장을 나타낸다. 또한, 도 1C는 보다 작은 1㎛ 미만의 입자의 양의 약간의 증가를 나타낸다. 이러한 결과는 입자 크기가 본질적으로 현탁액 중에서 유지될 수 있고, 단백질의 용해가 최소임을 나타낸다.
당해 부분의 목적은 단백질 침전에 대한 메카니즘을 설명하고 각각의 침전제 종류에 대한 점도의 결과의 간략한 개관을 제공하는 것이다. 수성 매질 중의 BSA의 현탁액을 형성하기 위하여, 매질은 BSA의 상당 분획이 용해되는 것을 방지하도록 고안되어야 한다. pH 4.5에서 순수한 수성 완충액 중의 BSA의 용해도는 100㎎/㎖를 초과한다. 다양한 첨가제를 수성 완충 매질에 도입하여 염, 중합체 및 수용성 유기물을 포함하는 용해도를 감소시켰다.
표 1은 5㎎/㎖에서 PEG와 NMP 혼합물 중의 BSA의 침전물의 표이다(N은 첨가제를 첨가하지 않은 경우에 대하여 혼탁도의 변화가 없는 투명 용액을 나타내고, LT는 저 혼탁도를 나타내고, HT는 고도의 혼탁도를 나타낸다).
Figure pct00002
용해도가 저하되는 메카니즘은 표 2에 침전제의 각각의 유형에 대하여 제시되어 있다. 표 1에서 나타난 바와 같이 모든 세 개의 다양한 첨가제 그룹에 대하여 200㎎/㎖에서의 불투명 백색 농축 현탁액의 형성이 가능하였다. 표 2는, 각각의 첨가제를 갖는 150mM pH 4.7 아세테이트 완충액 중의 200㎎/㎖에서 측정한 용해도 및 현탁액 점도의 감소에 대한 메카니즘을 나타내는, 단백질의 용해도를 저하시키는 여러가지 첨가제의 비교이다.
첨가제 단백질 용해도를 저하시키는 메카니즘 200㎎/㎖ 분쇄된 BSA에 대한 현탁액 점도의 예
염
Figure pct00003
수화용수에 대한 경쟁
Figure pct00004
단백질-단백질 상호 작용을 변화시키는 이온 결합
Figure pct00005
이중 층 두께의 감소로 인한 정전기 반발 감소		 1.5M (NH4)2SO4에 대한 3cP
중합체
Figure pct00006
우선적으로 소모 인력을 야기하는 단백질 표면으로부터의 우선적인 배제
Figure pct00007
보다 낮은 용매 유전 상수		 30% PEG 300 18cP
수용성
유기물
Figure pct00008
보다 낮은 용매 유전 상수
Figure pct00009
단백질 표면으로부터의 용매의 배제로 배제된 용적 효과가 생성됨		 35% n-메틸-2-피롤리돈(NMP)에 대한 10cP
아래에 보다 상세히 기재한 25g 1.5" 니들로 측정한 선택된 점도 결과의 요약은 표 2에 또한 제시되어 있다. 3cP의 매우 낮은 점도가 1.5M (NH4)2SO4로 수득되었다. 값은 또한 기타 PEG 및 NMP 반용매에 대해서 매우 낮다. 이들 실시예 3개 모두 26g 니들로부터 1㎖를 방출하는데 20초 미만이 소요되므로, 용이하게 주사 가능하다고 고려될 수 있는 한계 내에 있다. 당해 결과는 입자의 모폴로지 및 현탁액과 관련하여 훨씬 광범위한 조건에서 아래에 보다 훨씬 상세하게 검토된다.
도 2A-2E는 원심분리(3000rpm에서 20분) 전(도 2A 및 B) 및 후(도 2C-E)의 현탁액의 이미지이다. 좌측에서 우측으로 모두 NaCl을 154mM 이온 강도로 첨가한 150mM pH 4.7 아세테이트 완충액 중의 1.5M 황산암모늄(a 및 c), 30% PEG 300(b 및 d), 35% NMP (e). 도 2에 나타낸 바와 같이, 다양한 용해도 감소 첨가제가 현탁된 큰 입자의 상이한 양을 생성하였다. 현탁된 입자의 상대적인 양은 초기의 현탁액의 혼탁도로부터 정량적으로 분명히 나타난다. 용해된 단백질에 비해 대량의 현탁된 입자를 나타내는 도 2B 및 2E에 나타낸 바와 같은 30% PEG 300 및 35% NMP에 대하여 불투명 백색 현탁액이 형성되었다. 이러한 관찰은 단백질이 거의 용해되지 않음을 나타내고, 3000rpm에서 20분 동안 원심분리 후의 침전제의 용적 분율에 의하여 보다 정량적으로 확인된다. 이러한 힘은 약 400㎚를 초과하는 모든 입자를 침강시키기에 충분하다. 이러한 결과는 도 1C에서의 동결-SEM에 의한 현탁액 중의 마이크론 크기의 단백질 입자가 직접 관찰됨을 지지한다. 첨가제로서의 1.5M 황산암모늄 염에 대하여, 원래의 현탁액은 단지 반투명으로 훨씬 적은 정도의 침전을 나타낸다. 원심분리 후, 원래의 현탁액에서 상대적으로 낮은 혼탁도가 관찰되는 것과 일관되게, 적은 용적의 침전제만이 존재하였다(도 2A 및 C). 초기의 현탁액의 혼탁도 및 원심분리 후의 침전제의 용적 분율을 특징으로 하는 침전도는 현탁액의 점도 거동을 이해하기 위한 중요한 인자일 수 있다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 30% PEG 300과의 수성 현탁액은 200㎎/㎖ BSA에 대하여 18cP의 겉보기 점도를 제공한다. 이러한 낮은 점도는 용액에 용해된 단백질에 비례하는 단백질 입자의 존재에 관하여 검사될 수 있다. 이전에 나타낸 바와 같이, 30% PEG 300을 첨가하는 경우, BSA의 용해도는 25%에서 약 6㎎/㎖로부터 1㎎/㎖로 감소된다. 용해도의 이러한 큰 감소는 5㎎/㎖의 단백질 농도에서 25% 내지 30%(용적 기준) PEG 300의 침전제의 수준에 대한 혼탁도 증가에 의하여 표 1에 입증되었다.
순수한 분쇄된 BSA 입자의 현탁액은 30 내지 50용적%의 PEG 300 수준으로 형성되었다. 두 기본 인자가 단백질의 제시된 용적 분율에서 현탁액의 점도에 영향을 미친다: 단백질이 부재한 용액의 초기 점도 및 단백질이 존재하는 고유 점도. 표 3은 모두 pH 4.7 아세테이트 150mM 이온 강도 완충액에서의 샘플(그렇지 않은 경우 표시됨)인, 전기점성 및 수화의 효과를 비교하는 현탁액의 고유 점도 데이타를 나타낸다. 고유 점도 측정에 대하여, φ최대는 0.64인 것으로 추정된다(NMP - N-메틸-2-피롤리돈, ND - 측정되지 않음). 정적 광 산란에 의하여 측정된 평균 입자 직경은 20㎛였다.
Figure pct00010
표 3에 나타낸 바와 같이, 용액 점도(단백질 부재)는 30% PEG 300 용액의 경우에 2.6으로부터 50% PEG 300 용액의 경우에 6.6으로 증가한다. 그러나, 동시에, 고유 점도는 11.4에서 7.9로 감소하였다. 결과적으로, 전체 현탁액 점도는 실험적인 불확실성의 2배 값인, 약 10% 감소하였다. 흥미롭게도, 고유 점도가 보다 높은 용매 점도를 보상하기에 충분히 감소하지 않았기 때문에(단백질 부재), 점도는 30% PEG 보다 40% PEG에서 보다 높았다. 따라서, 침전제의 양을 최적화시켜 단백질이 부재한 용액의 초기 점도 대 단백질 현탁액의 고유 점도에 대한 이의 효과의 균형을 맞출 수 있다.
도 3은 3000g에서 20분 동안의 원심분리 후 수성 PEG 300 현탁액의 이미지이다. 좌측에서 우측으로 모두 NaCl을 154mM 이온 강도로 첨가한 150mM pH 4.7 아세테이트 완충액 중의 30% PEG 300, 40% PEG 300 및 50% PEG 300이다. 3000g에서 20분 동안 원심분리 후의 모든 3개의 PEG계 현탁액은 고도의 다량으로 침강된 입자를 나타내었다(도 3). 그러나, 30% PEG 300 현탁액의 경우, 상청액은 약간 혼탁하게 나타내어, 소량의 현탁된 나노입자의 존재를 나타낸다. 따라서, 가용성 농도는 이러한 경우 측정되지 않았다. 40 및 50% PEG 300 현탁액에 대한 가용성 농도는 2.0-2.1㎎/㎖로 존재하여, 200㎎/㎖에서 입자의 99%가 현탁되었음을 나타내었다(표 3). 40 및 50% PEG 300 현탁액에 대한 평균 입자 직경은 표 3에 나타낸 바와 같이, 둘 다 분쇄된 입자에 대한 원래의 20㎛ 값에 근접하였다. 그러나, 30% PEG 300 현탁액의 경우, 평균 입자 직경은, 상청액의 혼탁도를 기본으로 하여 보다 큰 용해와 일관되게, 약 10㎛로 감소하였다. 이러한 크기 감소는 도 1의 SEM에 의한 관찰과 일관된다. 보다 큰 표면적을 갖는 이러한 보다 작은 입자 및 용해된 단백질은 표 3의 보다 높은 고유 점도의 원인이 되었다.
30% PEG 300 제형에 대하여, 추가의 겉보기 현탁액 점도를 표 4에 나타낸 바와 같이, 보다 높은 이온 강도에서 측정하였다. 용액의 이온 강도가 증가함에 따라, 점도는 56에서 19로 감소하였다. 이온 강도의 증가 및 디바이(Debye) 길이의 감소에 따른 전기점성 효과의 감소는 고유 점도 및 이에 따른 현탁액 점도의 감소에 상당한 원인이 된다.
Figure pct00011
단백질의 전하 및 용해도를 변화시키기 위하여, 용액 pH를 BSA의 pI(4.7)로부터 pH 5.5로 증가시키는 한편, 아세테이트 이온을 완충액으로서 유지시켰다. 또한, 포스페이트 완충액 이온을 아세테이트 완충액에 대립하여 사용하여 pH를 7.4로 상승시켰다. 단백질의 용해도는 pH가 pI로부터 멀어짐에 따라 증가하므로, 50% PEG 300 첨가제가 매질에 포함되어 BSA의 낮은 용해도를 보장하였다.
도 4는 모두 50% PEG 300을 포함하고 NaCl을 154mM 이온 강도까지 첨가한 다양한 pH에서의 수성 현탁액의 겉보기 점도의 그래프이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 완충액 이온이나 pH 어느 것도 임의의 농도에서 겉보기 현탁액 점도의 현저한 변화를 야기하지 않았다. 50% PEG 300을 갖는 다양한 pH에 대한 용액 점도는 6.0-6.6으로 약간만 변화하였다. 모든 경우의 농도에 대한 겉보기 점도는 유사하였고, 계산된 고유 점도는 pH 증가에 대하여 7.9에서 9.0으로 약간만 증가하였다. 도 4의 이론적 곡선은 크리거-도허티 식으로 고유 점도를 회귀시켜(표 3) 결정하였다.
도 5는 3000g에서 20분 동안 원심분리 후의 수성 50% PEG 300 현탁액의 이미지이다. 좌측에서 우측으로 pH 4.7 아세테이트 완충액, pH 5.5 아세테이트 완충액 및 pH 7.4 아세테이트 완충액이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 상청액은 원심분리 후 pH 5.5 및 pH 7.4 샘플 둘 다에 대하여 여전히 혼탁하다. 그 결과, 가용성 농도는 측정될 수 없었고 평균 입자 크기는 pH 5.5 샘플에 대해서만 측정될 수 있었다. pH 5.5에서의 평균 입자 직경은 pH 4.7에서의 평균 입자 직경과 매우 유사하지만, 상청액의 혼탁도 증가는 pH 4.7 샘플에 존재하지 않는, 약간의 추가적인 보다 작은 나노입자의 존재를 나타낸다.
도 6은 NaCl을 154mM 이온 강도로 첨가한 150mM pH 4.7 아세테이트 완충액 중의 PEG 300 및 유기 첨가제를 갖는 수성 현탁액의 겉보기 점도의 그래프이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 유기 첨가제 10-20%를 적어도 25%의 PEG 300으로 가할 때, 현탁액의 겉보기 점도는 300㎎/㎖를 초과하는 매우 높은 BSA 농도에 대해서도 50cP 미만으로 잔존하였다. 추가로, 표 3에 나타낸 바와 같이, 이러한 PEG 300을 갖는 유기 현탁액 모두는 겉보기 점도를 250㎎/㎖의 BSA 농도에서 14-22cP의 범위로 감소시킨다. 이러한 점도 범위는 위에서 논의된 보다 높은 이온 강도 샘플(300 및 500mM)에서와 거의 동일하다(표 4). 이러한 PEG 300-유기 샘플은 당해 연구에서 측정된 최저 고유 점도 값(5.8-6.5)을 제공하였다(표 3). 10-20% NMP를 첨가한 모든 세 개의 샘플은 원래의 20㎛ 분쇄된 입자에 매우 근접한 입자 직경을 제공하였다. 또한, 모든 세 개의 NMP 샘플에 대한 가용성 농도는 2.3-2.9㎎/㎖로, 300㎎/㎖ 수준에서 첨가된 BSA의 99% 초과의 현탁액을 나타내었다(표 3). 20% 에탄올을 첨가한 샘플은 최저 용액 점도를 갖고, 250㎎/㎖에서의 최저 현탁액 점도 14cP를 제공하였다(표 3). 4.8㎎/㎖의 약간 더 높은 가용성 농도는 첨가된 BSA의 98% 초과가 현탁됨을 나타내었다. 그러나, 현탁된 비율(%)의 이러한 약간의 감소는 평균 입자 직경을 7.4㎛로 감소시키는데 충분하였다. 입자 크기의 약간의 감소는 이미지화된 SEM에서 볼 수 있다.
위의 샘플 모두는 단량체 응집에 대하여 분자 수준에서 치료학적 단백질을 안정화시키는데 도움을 줄 수 있는 당 동결보호제(lyoprotectant)의 부재하에 분쇄된 모델 단백질, BSA를 함유하였다. BSA는 매우 안정한 단백질이고, 따라서 분자 안정성은 당해 연구에서 고려되지 않았다. 그러나, 분쇄는 다수의 치료학적 단백질에 대하여 불안정성을 발생시킬 수 있다{Maa}. 다른 한편으로, 단백질 입자의 동결 및 동결 건조는 마이크론 미만의 크기에 대해서도 분자적으로 안정한 단백질 입자를 생성하는 것으로 나타났다. 매우 일반적인 동결보호제는 트레할로스이다.
도 7A 및 7B는 a) 25% PEG 300 20% 에탄올 및 b) 35% PEG 300과 15% NMP 중의 순수한 분쇄된 입자의 [η]를 사용한 크리거-도허티 식으로부터 계산한 이론적 점도에 따른 150mM pH 4.7 아세테이트 완충액 중의 다양한 비율에서의 분쇄된 BSA 및 트레할로스의 겉보기 점도를 나타내는 그래프이다. 도 7은 중량기준으로 BSA 대 트레할로스 1:0.1 내지 1:1의 비에서의 단백질 및 BSA 입자의 데이타의 이미지를 나타낸다. 모든 점에서, BSA에 대한 트레할로스의 보다 높은 비는 25% PEG 300 20% 에탄올 또는 35% PEG 300 및 15% NMP에서 형성된 현탁액의 점도를 단조적으로 증가시킨다. 트레할로스가 첨가제를 갖는 수성 용매 중에서 가용성이지만, 이는 여전히 용매 또는 용해되지 않은 입자에 이용 가능하지 않은 추가의 배제된 용적의 원인이 된다. 따라서, 이러한 배제된 용적은 제시된 점도를 유지시키는 가능한 입자의 최고 적재를 감소시킬 수 있다. 도 7에서의 이론적인 선은 트레할로스가 부재한 각각의 현탁액에 대한 동일한 고유 점도를 사용하고 최대 용적 분율을 0.64로 가정하여 계산하였다.
항체 치료제는 현재 연간 백오십억 달러의 시장 규모를 구성하여, 항암, 항감염 및 항염증 질환에서의 필요성을 나타낸다. 큰 단백질 분자로서, 이는 현재 전달을 위하여 직접 주사(정맥내 또는 피하)를 필요로 한다. 요구되는 용량은 매우 크고 자주 투여되므로, 이는 약제 전달에 상당한 장애를 내포한다: 작은 보어 시린지로 피하 전달을 달성하기 위하여, 항체는 고농도(> 100㎎/㎖), 저용적(< 1.5㎖), 저점도(< 100cP) 형태로 제형화시켜야 한다. 이러한 세부 사항은 전통적인 용액 제형(트레할로스를 함유한 포스페이트 완충액 중의)으로 달성하기가 매우 곤란했지만, 용해를 방지하는 염 및 침전제를 함유하는 수성 용매 중의 동결 건조된 항체의 현탁액은 가능한 선택을 나타낸다. 본 발명자들은 이전에 모델 단백질, BSA를 사용한 이러한 접근의 성공을 입증한 바 있으며, 본원에서는 다클론성 항체에 대한 기술의 확장을 제시한다. 본원에서 본 발명자들은 최초로, 면역글로불린이 저점도 및 응집 부재(96% 단량체성 단백질)되어, 200㎎/㎖ 이하의 농도의 수성 현탁액으로서 제조될 수 있음을 명시한다.
양 혈청으로부터 정제된 IgG(제품 번호 15131호)를 시그마-알드리히 인코포레이티드(Sigma-Aldrich, Inc.)로부터 구입하였다. α-α 트레할로스, 평균 분자량이 300인 폴리에틸렌 글리콜(PEG 300), 황산암모늄, USP 등급 에탄올 및 n-메틸 2-피롤리돈(NMP)을 피셔케미칼스(FisherChemicals)로부터 구입하였다.
공지된 양의 IgG를 α-α 트레할로스를 갖는 적당량의 20mM pH 5.5 히스티딘 완충액에 용해시킨 후, 샘플을 -40℃에서 미리 냉각된 동결 건조기 쉘프에서 서서히 동결시켰다. 이어서, 샘플을 -40℃, 100mTorr에서 12시간 동안 동결 건조시킨 다음, 50 mTorr에서 25℃로 6시간 램핑시키고, 25℃, 50 mTorr에서 2차 건조를 위해 추가로 6시간 이상 동안 유지시켰다. 이어서, 분말 1㎎을 칭량하고, 아래에 기재한 바와 같은 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 안정성 분석을 위하여 200mM pH 7.0 포스페이트 완충액 중에서 1㎎/㎖로 재구성하였다.
5㎎/㎖ IgG 용액의 분취량을 단백질 용해도를 저하시키기 위하여 첨가제를 함유하는 동등한 용적의 제2 수용액과 혼합하였다. 단백질의 침전은 350㎚의 파장에서 24시간 후 용액의 혼탁도 증가를 특징으로 하였다. 용액을 PEG 300 및 NMP를 첨가한 pH 6.4 20mM 히스티딘 완충액 중에서 모두 제형화시켰다. 최종 제형의 100㎕ 분취량의 혼탁도를 분광 광도계를 사용하여 UV-투과성 96-웰 플레이트에서 측정하였다.
다양한 용적%의 NMP, PEG 300 및 에탄올 및 다양한 몰 농도의 염화나트륨 또는 황산암모늄 염을 함유하는, 단백질이 부재한 수성계 용매 혼합물을 혼합하여 균일한 투명 용액을 형성하였다. 당해 용액을 pH 6.4에서(양 IgG의 등전점) 히스티딘 또는 포스페이트 완충액을 사용하여 다양한 이온 강도에서 완충시켰다. 이어서, 단백질의 샘플을 분말 중량이 목적하는 중량의 5% 이내가 되도록 0.1㎖ 원추형 바이알로 압축시켰다. 분말 중량은 최종 단백질 농도 및 부형제/단백질 비에 좌우되었다. 제조된 수성계 용매 혼합물의 측정량을 원추형 바이알에 첨가하여 0.1㎖의 총 용적을 갖는 현탁액을 형성하였다. 혼합물을 에어 포켓을 제거하는 니들의 첨단으로 교반하여 충분한 균일성을 갖는 현탁액을 형성하였다. 초음파 처리는 사용하지 않았고, 필요하지도 않았다. 이어서, 균일한 현탁액의 한 액적을 현미경 슬라이드 위에 놓고 현탁액을 이미지화하고, 현탁액 10㎕를 200mM pH 7.0 포스페이트 완충액에 1㎎/㎖로 희석하여 아래에 명시된 바와 같은 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 단백질 단량체 분율을 측정하였다.
IgG 현탁액의 겉보기 점도는 현탁액 50㎕를 1㎖ 투베르쿨린 슬립 팁 시린지에 부착된 25게이지 1.5" 니들로 뽑아내는 시간으로서 측정하였다. 원추 형상의 바이알을 사용하여 샘플 용적으로 제공된 단백질의 비용을 최소화시켰다. 현탁액을 함유하는 원추형 바이알의 비디오를 촬영하고, 원추의 기저로부터 0.4" 높이로부터 원추의 기저로부터 0.1" 높이까지 뽑아내는 시간을 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 높이의 불확실성(uncertainty)은 1%였다. 시간은 비디오가 초당 20개의 이미지를 포함한 이미지 스택으로 전환되면서 0.05초 이내로 측정하였다. 각각의 측정을 적어도 3회 수행하고, 평균내는 한편, 매번 1㎖ 마크에서 플런저의 말단을 유지함으로써 각각의 측정에 대한 흡인력 상수를 유지하였다. 대부분의 경우, 점도 재현성은 10%였다. 모델 단백질의 현탁액을 사용한 이전의 작업으로 시린지 속의 샘플의 특정량을 뽑아내는 시간이 점도에 선형으로 상호 연관됨이 밝혀졌다. 시린지 속의 10%의 공동의 최대 용적을 흡입하기 위해 현탁액으로 충전시켰다. 결과적으로, 압력은 본질적으로 일정하고, 점도는 푸아죄유 식으로부터 수득할 수 있다. 이러한 경우, 다양한 점도를 갖는 표준 용액(순수한 DI 수, 에탄올, PEG 200, PEG 300, PEG400 및 벤질 벤조에이트)을 사용하여 0.99를 초과하는 r2 값을 갖는 점도와, 원추형 바이알로부터 0.05㎖를 뽑아내는 시간 사이의 선형 상관 관계가 제공된다.
동결 건조 후의 건조 분말의 주사 전자 현미경(SEM)에 대한 샘플을 접착성 탄소 테이프 위에 놓았다. 이어서, 각각의 샘플을 크레싱톤 208 벤치 톱 스퍼터 코터를 사용하여 15nm의 두께로 금-팔라듐 스퍼터 피복하였다. 이어서, 자이스 수프라 40VP 주사 전자 현미경을 사용하여 5kV의 가속 전압으로 현미경 사진을 촬영하였다. 유리 현미경 슬라이드 위의 최종 현탁액의 한 액적의 광학 현미경 사진 이미지를 니콘 옵티포트2-폴(Nikon Optiphot2-Pol, Nikon Instruments Inc. Melville, NY) 현미경에 부착된 MTI CCD 72(Dage-MTI, Michigan City, IN) 카메라를 사용하여 촬영하였다.
재구성된 분말 및 최종 희석 현탁액인, 초기 용액의 단량체%는 토소 바이오사이언시즈(Tosoh Biosciences) G3000SWXL 크기 배제 컬럼에 이어서 모델 717플러스 오토샘플러, 2487 이중 파장 검출기 및 1525 2성분 펌프(Waters Corporation, Milford, MA)를 함유하는 워터스 브리즈(Waters Breeze) HPLC 시스템에 부착된 G2000SWXL 크기 배재 컬럼을 사용하여 분석하였다. 200mM pH 7.0 포스페이트 완충액 중의 재구성되거나 약 1㎎/㎖로 희석된 제조된 샘플을 0.22㎛ 밀렉스(Millex)-GV 필터를 통하여 여과하여 분석 전에 큰 응집물을 제거하였다. 이동 상은 0.7㎖/분의 유속에서 pH 7.0 200mM 포스페이트 완충액 및 50mM 염화나트륨으로 이루어졌다. 검출 파장은 214nm였다. 약 1㎎/㎖의 제조된 샘플 20㎕의 주사 용적을 사용하였다. 단량체는 약 21.5분에 용출되고, 보다 고분자량 응집물은 이들의 크기에 따라 이보다 몇분 전에 용출되었다.
도 8A-8E는 IgG의 다양한 동결 분말의 SEM 이미지이다. 도 8A는 1:1 IgG 대 트레할로스 비에서 동결된 40㎎/㎖ IgG의 SEM 이미지이다. 도 8B는 1:0.5 IgG 대 트레할로스 비에서 동결된 55㎎/㎖ IgG의 SEM 이미지이다. 도 8C는 1:0.5 IgG 대 트레할로스 비에서 동결된 25㎎/㎖ IgG의 SEM 이미지이다. 도 8D는 트레할로스가 부재한 40㎎/㎖ IgG의 SEM 이미지이다. 도 8E는 1:1 IgG 대 트레할로스 비에서의 20㎎/㎖ IgG의 SEM 이미지이다. α-α 트레할로스에 의하여 안정화된 IgG의 큰 마이크론 크기의 입자는 IgG 20-80㎎/㎖ 사이의 다양한 초기 농도에서 20mM pH 5.5 히스티딘 완충액 중의 1:1, 0.5:1, 0.25:1 또는 0:1 비의 트레할로스 대 IgG를 사용하여 동결 건조시켜 제조하였다. 최종 건조 분말의 SEM 현미경 사진은 트레할로스가 부재한 경우(도 8D)를 포함하여 각각의 트레할로스 대 IgG 비에 대해 보다 높은 농도에서(40 내지 80㎎/㎖) 동결된 입자에 대하여(도 8A 및 8B) 상대적으로 작은 미세한 입자(수 백 나노미터)와 함께 큰 10-100㎛ 입자를 나타낸다. 큰 입자는, 보다 낮은 농도, 20 및 25㎎/㎖ IgG에서, 각각 1:1 및 1:0.5의 IgG 대 트레할로스 비로 동결된 단백질에서 볼 수 있는 보다 작은 웹상 형태와 대조적이다(도 8C 및 8E). 동결 동안, 보다 높은 농도의 단백질은 더 큰 성장 및 이에 따른 더 큰 최종 입자를 유도한다.
SEC로부터의 상대 안정성은 pH 7.0 포스페이트 완충액에 희석된 초기 분말에 대한 동일한 pH 7.0 포스페이트 완충액 중의 건조 분말의 재구성 후 단량체 피크의 면적% 차이로서 정의되었다. 이러한 상대적 안정성은 적어도 98.6%이고 종종 그보다 높았다. 안정성은 트레할로스 부재하에 동결된 40㎎/㎖ IgG 분말의 경우에서 조차 높아서, 동결보호제가 당해 기술에 의하여 측정된 높은 안정성을 달성하는 것이 필요하지 않음을 나타내었다. 그러나, 이러한 98.6의 값은 표에서 트레할로스를 포함한 모든 기타 예의 값보다 낮다. 따라서, 동결보호제는 안정성을 증가시키는데 유리할 수 있고, 트레할로스가 포함되었다.
다양한 첨가제를 사용한 5㎎/㎖ IgG의 침전. 다양한 첨가제를 첨가하여 위에서 상세히 설명한 바와 같이 IgG의 용해도를 감소시킬 수 있다. 본 발명자들은 5㎎/㎖의 IgG 농도에서 높은 몰 농도(1.5M)의 황산암모늄 용액의 침전을 관찰하여 이를 확인하였다(광학 밀도는 측정되지 않음).
도 9는 350㎚에서 측정하였을 때 IgG의 용해도를 감소시키는 용매의 총 50용적%에 이르는 다양한 첨가제를 사용한 IgG의 광학 밀도의 그래프이다. 우측은 추가의 첨가제를 첨가하지 않은 pH 6.4 20mM 히스티딘 완충액 중의 IgG 5㎎/㎖ 농도의 흡광도를 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 5㎎/㎖ IgG의 농도에서, 350nm에서의 흡광도는 pH 6.4에서의 순수한 단백질 용액에 대한 약 0.05에서 pH 6.4에서의 PEG 300의 50용적% 용액에 대한 약 0.6으로 증가한다. pH 6.4에서의 NMP의 50용적% 용액 중의 당해 농도에서의 IgG에 대하여, 350nm에서의 흡광도는 약 0.2로 50% PEG 300의 경우에 대해서 보다 현저히 낮았다(도 9). 용매의 총 50용적%에 이르는 PEG 300과 NMP의 혼합 샘플(25% 이상의 PEG 300을 가짐)의 350nm에서의 흡광도는 유사하였다. PEG 300 25%와 NMP 25%의 혼합 용액에 대하여 %NMP가 약 0.6에서 0.5로 증가함에 따라 흡광도가 약간 감소하였다. 그러나, 약 0.2의 훨씬 더 낮은 흡광도가 PEG가 부재한 50% NMP 용액에 대하여 관찰되었다. 당해 실험은 단백질이 5㎎/㎖의 낮은 단백질 농도에서도 당해 첨가제로 침전됨을 나타낸다. 그러므로, 전체 단백질 농도가 주사용 현탁액에 대한 통상적인 농도인, 200㎎/㎖의 정도인 경우, 적은 분획의 단백질만이 당해 첨가제와 용해될 수 있다.
입자 크기의 함수로서의 현탁액 모폴로지. 동결 건조된 입자 중 트레할로스 대 단백질의 비 외에, 입자의 크기 및 표면적이 현탁액의 모폴로지 및 점도(주사 가능성(syringeability))를 변화시킨다. 최적의 입자 크기는 25 게이지 니들까지 유동시키기에 충분히 작지만 점도에 대한 수화 및 전기점성력의 유해한 효과를 최소화하기에 충분히 큰 입자를 함유한다. 추가로, 입자의 표면적 감소는 단백질의 변성 및 응집을 감소시킬 수 있다.
도 10A-10D는 IgG의 다양한 현탁액의 이미지이다. A) 황산암모늄 염 1.5M을 갖는 20mM pH 6.4 히스티딘 완충액 중의 55㎎/㎖ IgG 1:0.5 IgG 대 트레할로스 비 입자로 제조된 200㎎/㎖ IgG 현탁액. B) 50% PEG 300을 갖는 50mM pH 6.4 포스페이트 완충액 중의 55㎎/㎖ IgG 1:0.5 IgG 대 트레할로스 비 입자로 제조된 200㎎/㎖ IgG 현탁액. C) 24시간 후 용적 기준으로 35% PEG 300 및 15% NMP를 첨가한 50mM pH 6.4 포스페이트 완충액 중의 55㎎/㎖ IgG 1:0.5 IgG 대 트레할로스 비 입자로 제조된 200㎎/㎖ IgG 현탁액. D) 용적 기준으로 35% PEG 300 및 15% NMP를 갖는 50mM pH 6.4 포스페이트 완충액 중의 20㎎/㎖ IgG 1:1 IgG 대 트레할로스 비 입자로 제조된 200㎎/㎖ IgG 현탁액.
도 10A 및 도 10B에서, 농축 현탁액은 현탁액을 초기에 형성한 후 두 개의 상이한 첨가제 및 200㎎/㎖의 IgG 농도를 나타내었다. 현탁액은 불투명한 백색이었다. 경로 길이는 원추의 중간점에서 약 0.5cm였다. 현탁액의 액적 속의 입자는 도 4의 광학 현미경으로 추가로 확인시킬 수 있다. 마이크론 크기의 입자는 도 8의 SEM으로부터의 건조 초기 입자와 일치하는, 수 마이크로 내지 10마이크로의 범위로 존재한다. 도 10C는 24시간 후의 도 10A 및 도 10B의 현탁액의 낮은 침강도의 통상적인 예를 나타낸다. 도 10D에서, 동결 건조에 대한 초기 농도는 훨씬 낮은, 20㎎/㎖이고, 입자는 현탁액의 SEM에서 및 광학 현미경에 의하여 명시되는 바와 같이 훨씬 작았다. 이러한 보다 작은 입자는 강하게 광을 산란시키지 않았고, 현탁액은 불투명한 백색이 아닌 반투명을 나타냈다.
도 11A-11E는 IgG의 다양한 현탁액의 현미경 이미지이다. 도 11A는 1.5M 황산암모늄 염을 갖는 20mM pH 6.4 히스티딘 완충액 중의 55㎎/㎖ IgG 1:0.5 IgG 대 트레할로스 비 입자로 제조된 200㎎/㎖ IgG 현탁액의 이미지이다. 도 11B는 PEG 300을 갖는 50mM pH 6.4 포스페이트 완충액 50% 중의 55㎎/㎖ IgG 1:0.5 IgG 대 트레할로스 비 입자로 제조된 200㎎/㎖ IgG 현탁액의 이미지이다. 도 11C는 35% PEG 300 15% NMP를 갖는 50mM pH 6.4 포스페이트 완충액 중의 55㎎/㎖ IgG 1:0.5 IgG 대 트레할로스 비 입자로 제조된 200㎎/㎖ IgG 현탁액의 이미지이다. 도 11D는 35% PEG 300 15% NMP를 갖는 50mM pH 6.4 포스페이트 완충액 중의 20㎎/㎖ IgG 1:1 IgG 대 트레할로스 비 입자로 제조된 200㎎/㎖ IgG 현탁액의 이미지이다. 도 11E는 35% PEG 300 15% NMP를 갖는 50mM pH 6.4 포스페이트 완충액 중의 80㎎/㎖ IgG 1:1 IgG 대 트레할로스 비 입자로 제조된 200㎎/㎖ IgG 현탁액의 이미지이다. 표 5는 크기-배제 HPLC에 의한 건조 분말의 안정성에 대해 확인된, 20mM pH 5.5 히스티딘 완충액 중의 다양한 단백질 농도 및 트레할로스 비에서 제조된 IgG 동결 건조된 분말을 나타낸다.
Figure pct00012
표 6은 50mM pH 6.4 포스페이트 완충액에 첨가된 용적 기준으로 35% PEG 300, 15% N-메틸-2-피롤리돈(NMP)을 함유하는 용매 중의 200㎎/㎖ IgG 현탁액을 나타낸다(ND - 측정되지 않음; NM - 측정 불가).
Figure pct00013
도 11E에 나타낸 바와 같은 80㎎/㎖에서 동결된 순수한 IgG 입자로 최대 입자가 형성되었다. 최대 입자 크기는 동결 건조 동안 높은 출발 농도에 의하여 발생되었다. 이는 표 2에 기재된 35% PEG 300 15% NMP 용매에 현탁시켰다. 입자 크기는 > 50μ에 이르고, 따라서, 입자는 25 게이지 시린지를 통하여 유동하지 않았다. 대조적으로, 도 11의 보다 작은 입자 전부가 주사 가능하였다.
표 8은 점도 및 원래의 샘플에 존재하는 단량체%에 대하여 구분된 다양한 첨가제를 갖는 다양한 완충액 중의 IgG 현탁액을 나타낸다(ND - 측정되지 않음; EtOH - 에탄올, NMP - N-메틸-2-피롤리돈).
Figure pct00014
100cP 미만의 점도가 25게이지 1.5" 시린지를 통한 주사 가능성에 충분하다. 200㎎/㎖ 이하의 IgG 농도에서 현탁액에 대한 주사 가능한 점도가 수득되었다(표 6-8). BSA 분말{Miller aqueous BSA}에 대하여 이전에 나타난 바와 같은, 동결보호제, 예를 들면, 트레할로스의 첨가는 현탁액의 점도를 상승시킨다(표 6). 이러한 상승은 주로 동결보호제에 의하여 점유되어 배제된 용적에 의하여 발생된다. 예를 들면, 표 6에서, 트레할로스가 부재한 200㎎/㎖ IgG 현탁액은 트레할로스 대 IgG의 0.5:1 비에 대한 104cP에 대립하여 52cP의 점도를 갖는다. 트레할로스를 첨가하면 총 용질(트레할로스 + IgG) 농도가 300㎎/㎖로 상승된다. IgG 대 트레할로스가 1:1 비로 상승함에 의해 총 용질 농도를 400㎎/㎖로 상승시키면, 점도가 추가로 194cP로 상승된다. 따라서, 안정한 단백질 분자를 형성하는 동결보호제에 대한 잠재적 필요는 동결보호제의 배제된 용적으로 인한 점도 상승에 대하여 균형을 맞추어져야 한다. 배제된 위의 용해도 연구에서 나타난 침전과 현탁액의 점도 사이의 관계를 조사하기 위하여, 55㎎/㎖ IgG 0.5:1 트레할로스:IgG 입자를 사용하여 일련의 시험을 수행하였다. 표 7의 처음 세 개의 엔트리에서의 첨가제 조건에 대하여, 도 9의 용해도 측정에서 5㎎/㎖의 낮은 단백질 농도에서도 높은 OD가 수득되었다. 이러한 150㎎/㎖ 단백질 현탁액에 대한 바이알은 도 3에서와 같이 불투명한 백색이었다. 당해 샘플은 57 내지 98cP의 측정 가능한 점도를 가졌다. 15 또는 0% PEG와 나머지 NMP를 포함한 마지막 2개의 엔트리에서의 첨가제 조성물에 대하여, OD는 5㎎/㎖ 단백질에서의 침전 연구에 대하여 훨씬 낮아서 보다 높은 단백질 용해도를 나타내었다. 이러한 첨가제 조성물 및 150㎎/㎖ 현탁액에 대하여, 점도는 287cP로 매우 높거나, 페이스트형 겔이 형성되어 측정할 수 없었다. 따라서, 도 9에서의 5㎎/㎖에서 현저한 단백질 침전을 발생시키는 첨가제 조성물은 또한 보다 낮은 점도를 생성하는데 유리하다. 용해된 단백질 대 마이크론 크기의 단백질 입자의 비가 감소됨에 따라, 점도는 감소한다. 이러한 감소는 용매화 및 전기점성력의 감소로 인한 것일 수 있지만, 추가의 특성화가 상기 메카니즘을 보다 완전히 설명하는데 필요할 것이다.
표 8에서, 각종 첨가제 조건이 표 6 및 표 7에서의 조건을 넘어선다. 수용액은 용액의 총 50% 이하의 순수한 염, 순수한 PEG 300 및 염, PEG 300 및 수용성 유기 첨가제의 혼합물을 함유하였다(표 8). 주사 가능한 수성계 IgG 현탁액을 25G 1.5" 니들을 사용하여 이들 경우 모두에서 수득하였다. 이들 경우 각각에서, 마이크론 크기의 입자가 형성되고, 40-55㎎/㎖의 IgG 동결 농도가 제공되었다. 당해 표에서 모든 현탁액에 대하여, 마이크론 크기의 입자의 존재가 광학 현미경으로 확인되었다(도 11에 나타낸 샘플을 선택함). 높은 몰 농도의 염(1.5M) 첨가제는 200㎎/㎖의 IgG 농도에서 12.2cP의 최저 점도를 제공하였다(표 8). 트레할로스를 포함한 200㎎/㎖의 IgG 농도에서, 그 다음의 최저 점도는 79cP에서의 50% PEG 300 샘플에 대한 점도였다(표 8). pH 6.4에서 15% NMP를 첨가하고 PEG 300을 35%로 감소시키면 현탁액 점도가 104cP까지 증가한다(표 8). 유사한 유전 상수를 갖는 상이한 유기 첨가제인 에탄올을 동일한 15% 수준으로 첨가하면 92cP에서 약간 낮은 점도가 제공된다(표 4). BSA에 대하여 이전에 증명된 바와 같이, 단백질의 용해도를 5㎎/㎖ 미만으로 감소시키는 다양한 첨가제 조성물이 100㎎/㎖ 초과의 IgG 농도에서 종종 매우 침전된 현탁액 및 100cP 미만의 점도를 제공할 수 있다. 특정한 첨가제 조성물은 단백질 200㎎/㎖까지는 이러한 점도를 가능하게 하고, 보다 높은 단백질 농도가 추가의 최적화에 의하여 달성될 수 있다고 예상될 수 있다.
표 5에서 언급한 바와 같이, 단량체 응집에 대하여 매우 안정한 단백질을 함유하는 분말이 동결보호제로서 트래할로스의 존재 또는 부재하에서도 달성되었다. 본 발명자들은 또한 현탁액을 형성한 후의 단백질 안정성을 검사하였다. 최종 현탁액에 대하여, 현탁액 10㎕를 약 1㎎/㎖의 최종 IgG 농도를 제공하는데 필요한 pH 7.0 포스페이트 완충액에 희석하였다. 상대 안정성은 재구성시 초기 동결 건조된 입자에 대한 단량체%와 비교하여. 재희석 후 단량체%의 차이로서 측정하였다. 표 6-8에서의 모든 예에 대하여, 트레할로스가 0.5:1 이상으로 존재하고 유기 용매(NMP 또는 에탄올)를 첨가하지 않은 경우, 단량체%는 적어도 97% 높았다. 단량체%는 일부 경우, 실험적 오류 또는 수용된 출발 벌크 물질에 대한 단량체 분율의 실질적인 증가 때문에, >100%였다. 높은 PEG 수준을 갖는 시스템에 대한 높은 안정성은 PEG가 단백질의 열 안정성을 유지시키는데 도움이 된다고 공지되어 있기 때문에 예상치 못한 것은 아니었다{Stevenson}. 높은 안정성은 높은 염 농도를 갖는 두 경우(1.5M 황산암모늄)에 대해 표 4의 마지막 두 열에서 나타내었다. 높은 염 농도는 매우 낮은 단백질 용해도를 생성하고, 마이크론 크기의 단백질 입자가 존재하는 것에 유리하다.
표 6에서의 트레할로스를 첨가하지 않은 2개의 연구에 대해서는 단백질 응집이 현저하였다. 트레할로스를 갖지 않은 분말을 현탁시킨 후, SEC는 작은 응집물에 대해 단량체%의 약 20% 손실을 나타낸다(표 6의 제2 열). 트레할로스의 불충분한 비를 갖는 입자(0.25:1 트레할로스 대 IgG 비)에 대해서는 약 15%의 보다 적은 단량체%의 감소가 나타났다(표 6). 따라서, 0.5:1의 트레할로스 대 IgG 비에서 트레할로스는, 트레할로스가 표 5에서 초기 분말에 대한 안정성에 적은 영향을 미친다는 사실에도 불구하고, 현탁액 중의 단백질의 안정성을 유지시키는데 필요하였다.
NMP 및 PEG를 함유하는 시스템에 대한 거동은 보다 복잡하다. 표 7의 처음 3열에 나타낸 바와 같이, 단백질 안정성은 50%의 일정한 전체 첨가제 농도에 대하여 NMP 농도가 증가함에 따라 감소한다. 그러나, 35% PEG 300 및 15% NMP를 갖는 보다 높은 1:1 IgG 대 트레할로스 비에서, 초기 단량체는 98%였다. 따라서, 보다 높은 IgG 대 트레할로스 비는 고도의 유기 첨가제(NMP)를 보상하여 안정성을 유지시킬 수 있다.
현탁액에 대한 단백질 안정성은 용해도를 저하시키는 제제를 첨가하지 않은 완충액 중의 단백질 현탁액의 안정성과 비교할 수 있다. 초기 단백질 55㎎/㎖에서 형성된 분말(표 5)을 어떠한 기타 첨가제를 첨가하지 않은 pH 6.4 완충액에 첨가하였다. 수득한 혼합물은 반투명하고 표 5-8의 어느 엔트리보다도 덜 혼탁하였다. 16,100g에서 원심분리시, 총 단백질 용적의 10% 미만의 용적으로 침전물이 형성되었다. 따라서, 대부분의 단백질이 용해되었다. 단량체%는 위의 현탁액에 대해서와 같이 동일한 공정에 대하여 70%였다. 대조적으로, 단량체%는 표 6의 마이크론 크기의 입자의 불투명한 백색 현탁액에 대한 200㎎/㎖ 수준에서 동일한 분말(55㎎/㎖)에 대해 97.1이었다. 따라서, 단백질의 마이크론 크기의 입자는 주로 고농도에서 용해된 상태의 단백질보다 훨씬 더 안정할 수 있다.
SEC에 의하여 측정된 바와 같이 안정성인 매우 농축된 모델 IgG의 수성계 현탁액은 고농도(40-55㎎/㎖)에서 동결되고 동결 건조된 입자를 사용하여 생성하였다. 이러한 농도 범위(40-55㎎/㎖)로 약 10-100㎛의 직경을 갖는 입자가 제조되고, SEC에 의하여 98% 안정성을 초과하는 것으로 밝혀졌다. 트레할로스 대 IgG 0.5:1의 최소 비에서 입자를 트레할로스로 안정화시킴으로써 최종 현탁액은 또한 원래의 단량체%의 92% 이상을 보존하는 것으로 밝혀졌다. IgG의 안정성은 고농도 염(1.5M 황산암모늄), PEG 300(용매의 50용적%) 또는 PEG 300과 에탄올 또는 NMP의 배합물(용매의 총 50용적%)을 첨가함으로써 수성계 용매 중의 5㎎/㎖ 미만으로 저하되었다. 고농도 염 현탁액의 25g 1.5" 시린지를 통한 겉보기 점도(여기서, 용매 점도는 여전히 약 1cP이다)는 200㎎/㎖ 안정한(SEC에 의하여) IgG 현탁액에 대하여 약 12cP로 최저였다. 전체적으로, 매우 농축된 현탁액에 대하여 수득한 25g 1.5" 니들을 통한 모델 IgG의 안정성 및 저점도(100cP 미만)는 단백질 치료제의 피하 전달의 잠재적 진보를 나타낸다.
25 내지 27-게이지 니들을 통한 피하 주사에 의한 100 내지 400㎎/㎖ 범위의 농축 단백질 및 펩티드의 전달은 약 50cP 미만의 점도를 갖는 안정성 용액 또는 현탁액에 대하여 실행 가능하게 된다. 이러한 범위 미만의 점도는 단백질 400㎎/㎖ 이하에 대한 벤질 벤조에이트 또는 벤질 벤조에이트와 식물유의 혼합물 중의 분쇄된 리소좀 마이크로입자의 현탁액에 대하여 달성되었다. 단백질 입자는 적어도 2개월 동안 응집에 대하여 안정하였고, 현탁액 중의 고체 입자는 1년 동안 실온에서 저장 후 재현탁 가능하였다. 현탁액의 점도와 입자의 용적 분율 사이의 상관 관계는 입자들 사이의 상호 작용의 주요 근원이 단순히 정전기 반발, 입자의 용매화 또는 구형 형태로부터의 입자 형태의 이탈과 같은 추가적인 힘으로부터 약간의 영향을 받는 고농도 입자로 인한 것이었음을 나타낸다. 대조적으로, 이러한 추가의 힘은 수성 용액 중의 콜로이드성 단백질 분자에 대한 점도의 큰 상승을 유발할 수 있다. 따라서, 단백질 용액과 비교하여 매우 농축된 단백질 현탁액에 대한 보다 낮은 용매 점도가 피하 주사에 대한 새로운 기회를 제공할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "안정한 단백질"은 용해된 상태의 개별적인 단백질 분자의 변성 또는 응집과 같은 불안정성을 나타내지 않는 단백질을 언급한다. 이러한 불안정성은 광학적 혼탁, 동적 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피, 분석적 초원심분리 및 단백질 의존성 활성 검정과 같은 기술에 의하여 측정될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 용매는, 안정한 입자를 생성한 비수성 현탁액에서 0.03㎎/㎖ 미만의 단백질 용해도를 갖는 2개월의 저장 기간에 걸쳐 입자 크기의 변화가 없는 용매를 포함한다. 용매는 또한 단백질 입자의 안정성에 대하여 부정적인 영향을 미치지 않아야 한다. 단백질 입자의 안정성은 현탁액 중의 입자로의 물의 흡수가 동일한 상대 습도에서의 주위 공기 조건에 노출된 입자로의 물의 흡수와 거의 동일한 비수성 용매에 대하여 수득될 수 있다. 또한, 비수성 용매는 낮은 유전 상수를 가져서(37.5 미만) 용기의 기저에서 입자의 균열을 유발하는 입자들 사이의 인력을 방지하고 현탁액이 재현탁될 수 없도록 하여야 한다.
당해 연구의 목적은 25- 내지 27-게이지 시린지를 통한 피하 주사에 의하여 모노클론성 항체의 고 투여량을 전달하기 위한 매우 농축된 단백질 현탁액을 생성하는 것이었다. 50 내지 300㎎/㎖의 농도를 갖는 37㎛ 보다 작은 리소자임 입자의 현탁액은 약제학적으로 허용되는 용매인 홍화유와 벤질 벤조에이트의 50/50 용적 혼합물로 제형화시켰다. 당해 용매 혼합물은 FDA의 비활성 성분 목록18에 공개된 승인 범위 내에 있었다. 벤질 벤조에이트가 홍화유보다 덜 점성이고, 분산액의 형성 및 주사를 용이하게 하는 반면, 이는 현재 순수한 용매로서 FDA에 의하여 주사용으로 허용되지 않고 있지만; 독성 결핍을 나타내어 장래에 승인될 수 있을 것으로 보인다. 승인된 용매 혼합물 뿐만 아니라 순수한 벤질 벤조에이트 중의 제형에 대한 겉보기 점도는 적어도 300㎎/㎖의 농도 이하의 허용되는 범위 내에 있고 크리거-도허티 식에 따르는 현탁액의 이론적 점도와 상호 연관되는 것으로 나타난다. 균일한 용량을 수득해야 하는 필요성은 침강 속도의 측정을 통하여 처리되고 현탁액의 분취량의 농도 측정에 의하여 확인된다. 입자의 콜로이드성 안정성 및 단백질 분자의 안정성은 시간 경과에 따른 입자의 측정 및 단백질 응집에 의하여 처리되고 다양한 현탁액 중의 수분 함량을 분석하여 추가로 확인된다.
동결 건조된 분말 형태의 리소자임은 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)로부터 구입하였다. ACS 등급 아세토니트릴 및 USP 등급 에탄올이 피셔 케미칼스(Fisher Chemicals, Fairlawn, NJ)로부터 입수되어 사용되었다. 식품 등급 올리브유 및 홍화유는 식품점으로부터 초기 시험을 위하여 구입하였다. 벤질 벤조에이트는 아크로스 오거닉스(Acros Organics, New Jersey)로부터 입수하고, N.F. 등급 에틸 올레에이트는 스펙트럼 케미칼 코포레이션(Spectrum Chemical Corp., Gardena, CA)으로부터 입수하였다.
수령된 리소자임 분말은 자기 막자사발과 막자로 수 분 동안 건조 분쇄시켰다. 이어서, 분쇄된 분말을 400호 메쉬를 통하여 체질하고, 37㎛ 보다 작은 입자가 수집되었다. 이어서, 샘플을 칭량하고, 벤질 벤조에이트의 측정량 또는 예비 혼합된 벤질 벤조에이트와 홍화유의 50/50 용적 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 각각의 바이알을 손으로 진탕시켜 현탁액 전체에 분말을 균일하게 분산시켰다.
맬번 마스터사이저-S(Malvern Instruments, Ltd., Worcestershire, UK)를 사용한 다각도 레이저 광 산란에 의하여 입자 크기를 측정하였다. 분쇄되고 체질된 분말 샘플 크기를 큰 재순환 셀에서(약 500㎖) 아세토니트릴 중의 현탁액으로서 이후에 작은 배치 셀(Malvern, Worcestershire, UK, 약 15㎖) 중의 에탄올에 첨가하여 측정하였다. 각각의 경우, 측정 동안의 불투명도는 10-15%였다. 현탁액을 실온에서 2개월 동안 저장한 후, 작은 배치 셀 중 에탄올에서 샘플을 진탕시키고 희석한 직후 입자 크기를 다시 측정하였다.
점도를 샘플 1㎖를 25g 5/8" 또는 27g 1/2" 니들을 사용하여 시린지로 뽑아내는 시간으로 측정하였다. 각각의 측정은 3회 이상 수행하여 평균내었다. 리우(Liu) 등은 당해 측정 시간이 점도에 선형으로 상호 연관된다고 밝혀내었다. 각각의 순수한 액체, 벤질 벤조에이트, 에탄올, 에틸 올레에이트 및 올리브유의 공지된 점도로부터, 용액 1㎖를 뽑아내는 시간과 점도 사이의 상관 관계는 각각의 니들 크기에 대하여 0.999를 초과하는 r2 값을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 각각의 순수한 용매 중의 현탁액의 겉보기 점도는 이러한 상관 관계로부터 계산되었고, 두 개별적 니들 크기에 대한 값을 평균내어 각각의 샘플의 최종 평균 겉보기 점도를 제공하였다. 벤질 벤조에이트와 홍화유의 용매 혼합물의 추가의 샘플은 벤질 벤조에이트 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 및 90용적%에서 제조되었다. 각각의 샘플의 점도를 위에서 기재한 바와 같이 계산하였다.
용매 중의 입자의 침강 속도는 직경 13mm의 시험관 속에서 현탁액을 진탕시켜 측정하였다. 10, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 1200 및 1440분 후 표준 디지털 카메라로 사진을 촬영하였다. 샘플의 최종 침강 용적을 측정하기 위하여, 현탁액을 함유하는 바이알을 4개월 동안 평정하게 방치하고, 침강된 현탁액의 이미지를 촬영하였다. 모든 이미지를 메니스커스(meniscus)로부터 침강 전면까지의 거리에 대한 이미지 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 침강 현탁액에 대한 최대 용적 분율은 전체 현탁액 중의 입자의 용적 분율을 4개월 동안 침강 후의 입자를 함유하는 용적 대 전체 용적의 비로 나누어 정의하였다.
수용액 중의 리소자임의 농도는 마이크로 BCA 단백질 검정용 프로토콜에 따라 측정하였다. 각각의 샘플을 일반 검정 96 웰 플레이트에서 2% 미만의 상대 표준 편차(%RSD)로 3중으로 측정하였다(아래의 통계적 분석 참조). 분광 광도계에서 562㎚에서 흡광도를 측정하였다. 미처리 리소자임의 표준 곡선을 2 내지 30㎍/㎖의 농도에서 제조하였다.
농축된 현탁액으로부터의 리소자임의 분별 및 용해는 pH 7.4 인산칼륨 완충액 중에서 측정하였다. USP 패들법을 반더캄프(Vanderkamp) VK650A 히터/순환기를 장착한 반켈 VK6010 용해 시험기(VanKel VK6010 Dissolution Tester)로 사용하였다. 용해 매질 900㎖를 큰 1ℓ-용량의 용해 용기(Varian Inc., Cary, NC) 속에서 37℃로 예열하였다. 리소자임 총 18㎎을 제공하는 농축 현탁액의 샘플을 첨가하였다. 2, 5, 10, 20, 40, 60, 120 및 240분의 시간 증분에서, 샘플 1㎖를 채취하고 위에서 언급한 마이크로 BCA 단백질 분석을 사용하여 분석하였다.
농축 리소자임 현탁액 0.1㎖를 DI 수 4㎖를 포함한 시험관에 첨가하였다. 이어서, 당해 혼합물을 가볍게 혼합하고 3일 동안 단백질이 수상으로 분배되도록 방치하였다. 이어서, 수상을 분리하고, 샘플을 희석하고, 위에서 언급한 마이크로 BCA 단백질 검정을 사용하여 농축에 대하여 시험하였다. 잔여 수용액을 1㎎/㎖의 농도로 희석하였다. 당해 용액을 96-웰 플레이트에서 적어도 3개의 300㎕ 분취량을 사용하여 광학 밀도에 대하여 시험하고, 350㎚에서 μ퀀트(μQuant) 분광 광도계를 사용하여 분석하였다. 표준 리소자임 용액을 1㎎/㎖ 농도로 제조하고, 순수한 벤질 벤조에이트 용매 및 벤질 벤조에이트와 홍화유 용매 혼합물에 3일 동안 노출시키고, 단백질의 유-수 계면 유도된 응집에 대한 표준으로서 측정하였다. 어떠한 유기 용매에도 노출시키지 않고 수용액을 또한 제조 직후 측정하고 모든 측정에 대한 표준 흡광도로서 사용하였다.
재현탁 농축 리소자임 현탁액의 3개의 개별적인 0.1㎖ 분취량을 DI 수 8㎖를 포함한 시험관에 첨가하였다. 이어서, 당해 혼합물을 가볍게 혼합하고, 단백질이 수 상으로 분배되도록 1일 동안 방치하였다. 이어서, 수성 상을 분리하고, 단백질 100%가 분배되는 경우, 20㎍/㎖의 이론적 농도로 희석하였다. 이어서, 위에서 언급한 마이크로 BCA 단백질 검정을 사용하여 실제 농도를 분석하였다.
칼 피셔 수분 분석. 4개월 동안 저장한 후, 재분산 농축 현탁액 0.1㎖의 샘플을 19-게이지 니들을 사용하여 아쿠아테스트 8 칼-피셔 적정기(Aquatest 8 Karl-Fischer Titrator, Photovolt Instruments, Indianapolis, IN)의 격막을 통하여 삽입하였다. 각각의 현탁액, 순수한 벤질 벤조에이트 및 벤질 벤조에이트와 홍화유 용매 혼합물을 삼중으로 측정하고 평균내었다.
극성 측정. 현탁액의 분취량을 개별적인 입자가 광학 현미경(Bausch & Lomb, 10x magnification)을 통하여 슬라이드 위에서 가시적이 될 때까지 용매로 희석하였다. 미량전기영동법을 사용하여 입자에 전하가 존재하는지를 측정하였다. 희석된 입자 분산액을 1mm 간격으로 떨어진 두 평행한 와이어 전극(0.01-in. 직경 스테인레스 강 304 와이어, California Fine Wire) 사이에 위치시켰다. 전극을 유리 현미경 슬라이드에 고정하고 광학 현미경에 의하여 관찰하였다. 10-100V의 전위를 매 15-60초마다 스위칭되는 전극의 극성으로 인가하였다.
단백질 농도, 칼 피셔 수분 분석, 현탁액 균일성, 광학 밀도 및 물에 분배되는 리소자임의 비율에 대해 샘플을 삼중으로 측정하여 평균, 표준 편차 및 상대 표준 편차(std. dev./mean)를 측정하였다.
자기 막자사발과 막자로 분쇄하고 400호 체를 통하여 체질한 리소자임 입자에 대하여, 평균 입자 크기는 광 산란 측정에 따라 약 20㎛였다(도 12). 작은 제2 마이크로 미만의 피크가 또한 모든 측정에서 가시적이었다. 그러나, 15㎖의 작은 배치 셀은 500㎚ 아래의 입자 크기에 대해서만 교정되므로, 당해 피크는 분석에 포함시키지 않았다. 입자와 용매를 함유하는 바이알은 이어서 손으로 진탕시키고, 입자는 분산되어 균일한 현탁액을 형성한다(도 13B). 입자 현탁액이 평정하게 방치되는 경우, 이는 24시간 후에도 부분적으로 현탁된 상태로 잔존하기에 충분히 느리게 침강하고(도 13C), 매우 농축된 현탁액은 2개월 후에도 용적의 상당 부분을 차지한다(도 13A).
용매 혼합물 및 현탁액의 점도. 순수한 용매의 공지된 점도를 사용하여, 샘플 1㎖를 뽑아내는 시간과 점도 사이의 상관 관계를 생성하였다. 이러한 상관 관계 유형은 하겐-푸아죄유 식5-7을 기초로 샤이어(shire) 및 동료들에 의하여 기재된 바 있다
Figure pct00015
위의 수학식 2에서,
υ는 속도이고,
R은 니들의 내부 반경이고,
η는 점도이고,
ΔP/L은 니들의 길이에 따른 평균 압력 강하이다.
니들의 길이에 따른 평균 압력 강하가 시린지 내부의 동일한 흡인 압력을 유지시켜 각각의 샘플에 대하여 일정하게 유지하도록 보장되면, 유체의 속도의 역수에 횡단면적을 곱하면 액체의 명시된 용적, 이 경우 1㎖를 뽑아내는 시간을 제공한다. 이 시간은 하겐-푸아죄유 식에 의하여 나타낸 바와 같이 점도에 비례한다.
벤질 벤조에이트와 홍화유의 용매 혼합물의 측정된 속도는 도 14에 나타나 있다. 당해 경우, 최소 및 최대 값은 순수한 용매에 대한 것이므로, 일반화된 혼합 규칙은 다음 형태를 따를 수 있다:
Figure pct00016
위의 수학식 3에서,
ηm은 혼합물의 점도이고,
i는 성분의 번호이고,
xi는 액체 용적, 중량 또는 몰 분율이고,
ηi는 i번째 성분의 점도이다.
f(η)L은 ηL, ln(ηL), 1/ηL 또는 또 다른 통상적 식일 수 있다20. 당해 경우, 실험 결과와 가장 근접하게 연관된 상관 관계는 f(η)L이 ln(ηL)인 경우였다. 이러한 이론적 결과는 도 14에 점선으로 나타낸다.
농도가 증가하는 현탁액의 겉보기 점도를 순수한 벤질 벤조에이트 시스템 및 50/50 벤질 벤조에이트와 홍화유의 용매 혼합물 둘 다에 대하여 측정하였다. 두 시린지 크기를 사용한 측정치로부터 평균내어 수득된 점도(좌측 y-축) 및 25-게이지 시린지로부터 1㎖를 뽑아내는 시간(우측 y-축)을 리소자임 입자의 농도에 대하여 플롯팅하였다(도 15). 자유 용매 용적 분율을 갖는 겉보기 점도의 상관 관계를 크리거-도허티 식을 사용하여 모델링하였다:
Figure pct00017
위의 수학식 4에서,
η는 분산액의 겉보기 점도이고,
η0은 용액 점도이고,
φ는 입자의 용적 분율이고,
φ최대는 최대 팩킹(packing) 분율이고,
[η]는 고유 점도이다.
φ최대는 4개월에 걸쳐 입자를 중력 침강시킨 후 근사치를 구하였다. 낮은 전단률에 대하여 순수한 벤질 벤조에이트 용매 용액에 대해서는 약 0.50이고, 벤질 벤조에이트와 홍화유 용매에 대해서는 약 0.52였다. 당해 값을 사용하여, 현탁액의 고유 점도 [η]는 순수한 벤질 벤조에이트 현탁액에 대하여 2.7, 벤질 벤조에이트와 홍화유 현탁액에 대해서는 2.3으로 측정되었다.
현탁액 중의 입자의 안정성을 다수의 상이한 기술에 의하여 측정하였다. 우선, 침강 속도를 계산하고, 이론적 스토크스 침강 속도와 비교하였다:
Figure pct00018
위의 수학식 5에서,
r은 입자의 반경이고,
Δρ는 용매와 입자 사이의 밀도차이고,
g는 중력으로 인한 가속이다.
입자의 높은 농도에 대하여, 입자 밀집화(crowding)는 침강 속도를 감소시킬 수 있고 다음으로부터 산출된다:
Figure pct00019
당해 개질된 스토크스 침강 속도 및 실험적으로 측정된 값은 표 1에 나타낸 바와 같이 300㎎/㎖ 보다 낮은 대부분의 농도에 대하여 2의 인자 내인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 400㎎/㎖의 농도에 대하여, 당해 값은 예상된 속도 미만의 정도이다(표 9).
Figure pct00020
현탁액 균일성은 수성 상으로 추출되는 비율(%)에 의하여 추가로 정량화되었다. 초기에 리소자임의 수성 상으로의 분배 속도는 약 60분을 필요로 하는 것으로 측정되었다. 재현탁된 샘플로부터의 3개의 분취량을 개별적인 시험관에 넣고 1일 동안 수성 상으로 분배하여 완전한 분배를 보장하였다. 이어서, 수성 상을 약 1000배 희석하고, 단백질의 농도를 측정하였다. 결과는 농축 비수성 현탁액 0.1㎖에 노출된 소량(8㎖)의 수성 상으로도 단백질 ¾ 이상이 24시간내에 수성 상으로 분배됨을 나타낸다(표 10). %RSD 값은 통상적으로 5% 미만으로 재분산된 현탁액 내의 단백질 입자의 합당한 균일성을 나타낸다. %RSD는 혼합 용매 중의 매우 농축된 300㎎/㎖ 샘플에 대하여 약간 더 컸다.
Figure pct00021
입자의 성장이 샘플의 저장을 위태롭게 하기에 충분한 비율에서 발생하지 않음을 보장하기 위하여 비수성 용매에 노출된 입자의 응집이 또한 시험되었다. 원래의 입자 크기를 입자를 체질하고 리소자임이 매우 불용성인 아세토니트릴 및 리소자임이 약간 가용성인 에탄올 둘 다에 재현탁시킨 직후 광 산란을 통하여 측정하였다. 두 측정치의 균일성은 측정의 시간 규모가 에탄올 중의 입자의 성장 시간의 규모보다 훨씬 더 신속함을 보장한다(도 12). 2개월의 저장 후, 샘플을 에탄올에 희석하고, 즉시 시험하였다. 입자 크기는 저장 동안 본질적으로 일정한 것으로 밝혀졌다(도 12). 1년 동안의 저장 및 진탕에 의한 재분산 후의 하나의 제형화된 현탁액의 육안 검사로 입자가 재분산될 수 있음이 확인된다.
입자 안정성에 대한 정전기 반발의 전위 효과를 시험하였다. 그러나, 리소자임 입자는 전압이 벤질 벤조에이트 용매 중에서 1mm 간격으로 떨어진 두 전극에 대하여 10에서 100으로 변화되는 경우, 조직적 운동성을 나타내지 않았다.
유기 상으로부터 수 상으로 분배하는 샘플 분취량에 대한 광학 밀도를 측정하여 단백질 응집을 조사하였다. 단백질을 1㎎/㎖의 농도로 희석하였다. 동일한 농도의 수용액 중의 추가의 리소자임 샘플을 용매에 노출시켜 응집시 유-수 계면의 효과를 측정하였다. 이들 모든 용액을 동일한 농도에서의 새로운 리소자임 용액과 비교하여 큰 단백질 응집물에 대하여 체크하였다. 350㎚에서의 흡광도가 표준 및 모든 샘플에 대하여 1% 이내, 이어서, 연구의 오차 이내이므로, 응집물이 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다.
수분 함량의 정량화를 사용하여 현탁액 중의 유리수 및 결합수를 측정할 수 있다. 수분 함량은 2개월 동안의 대기 조건에 노출된 후 각각의 현탁액에 대하여 측정하였다. 수분 함량과 현탁액 농도 사이에 나타난 선형 상관 관계는 수분이 단백질과 직접 연관됨을 나타낸다(도 16). 벤질 벤조에이트 용매는 용액 0.1㎖당 평균 20㎍ 또는 약 0.02중량%의 물을 함유한다. 홍화유와 벤질 벤조에이트 혼합물은 동일한 용적의 샘플 중의 물 약 74㎍ 또는 약 0.074%를 함유한다. 벤질 벤조에이트 중의 단백질의 최고 농도를 갖는 샘플(400mg/ml)은 가장 많은 수분, 용액 0.1㎖당 평균 물 4450㎍을 함유하여 2개월 동안 저장 후 현탁액 4.5중량%의 절대 최대 농도를 제공하였다.
단백질 및 입자 안정성 외에, 기타 주요 기준은 현탁액의 겉보기 점도가 시린지를 통해 주사하기에 충분히 낮아야 한다는 것이다. 피하 전달을 위해서는, 50cP가 현탁액 1㎖가 26-게이지 시린지를 통하여 방출되는데 약 20초가 소요되는 적합한 최대 점도이다. 도 15로부터, 측정된 최고 겉보기 점도는 약 50cP였으며, 여기서, 1㎖를 25-게이지 시린지로 뽑아내는데는 약 55초가 소요되었다. 측정된 시간의 불일치는 시린지로부터 용액을 방출시키는데 필요한 힘에 대하여 시린지로 당해 용적을 뽑아내는 보다 작은 흡인력을 반영한다. 또한, 이러한 농축된 현탁액은 현탁액의 유동이 입자의 보다 유리한 재배열을 생성할 수 있으므로, 전단 박화인 것으로 고려된다. 예를 들면, 전단 속도가 증가함에 따라, 초기에 랜덤하게 팩킹된 구형 입자(φ최대=0.64)는 보다 정렬되고 보다 밀집하게 팩킹되어, 약 0.71의 보다 높은 최대 팩킹 분율을 제공한다. 그 결과, 용적 방출과 관련된 보다 높은 전단 속도에서, 측정된 현탁액의 겉보기 점도는 감소할 수 있고 잠재적 피하 전달에 대한 최대 미만으로 잔존할 수 있다.
크리거-도허티 식을 사용한 현탁액의 점도의 추가의 분석은 현탁액 중의 입자간 힘의 효과를 나타낼 수 있다. 아인슈타인에 의하여 유도된 희석 현탁액의 점도에 대한 초기 식은 입자를 고려하고 입자가 고체 구형이고 이의 농도가 개별적으로 처리되는 입자에 대하여 충분히 낮다(φ<0.1)고 가정한다. 이는 입자의 용적 분율이 2.5의 경사로 용매에 대한 현탁액의 점도 비에 관계되는 1차 식을 제공한다. 보다 일반적인 용어에서, 이러한 경사는 분산된 입자의 첨가로 인한 점도의 증분을 의미하고, 이를 또한 고유 점도, [η]라고 한다. 입자 밀집화의 원인이 되는 보다 농축된 현탁액에 대하여, 현탁액의 최대 팩킹 분율(φ최대)은 크리거-도허티 식(수학식 5)에서 야기된다. 당해 경우, 고유 점도란 용어는 용매화, 다양한 형상 및 정전기력 뿐만 아니라 전단 속도의 효과에 따라 2.5의 아인슈타인 계수 값으로부터 변화할 수 있다. 벤질 벤조에이트 및 벤질 벤조에이트와 홍화유 혼합물 현탁액의 고유 점도에 대한 값은 원래의 아인슈타인 유도된 2.5에 근접하므로, 용매화, 다양한 형상 및 정전기력의 효과는 전단 속도가 낮다는 것을 가정하여 무시할 정도라고 고려될 수 있으며, 0에 근사할 수 있다. 정전기 효과의 결핍은 유전 상수가 단지 4.8에 불과한 용매 중에서 이온 페어링(ion pairing)에 대한 경향이 제시되어 놀랍지 않았다. 이는 위에서 측정한 전기영동 이동성의 결핍으로 추가로 확인된다. 입자가 용매에 의하여 용매화되는 경우, 용적 분율은 다음 식에 의하여 증가할 것이다:
Figure pct00022
위의 수학식 7에서,
m1,b는 결합된 용매의 질량이고,
m2는 입자의 질량이고,
ρ2는 입자의 밀도이고,
ρ1은 용매의 밀도이다.
크리거-도허티 식의 경우, 이러한 증가는 [η] 항으로 흡수되어, 측정된 고유 점도를 증가시킨다. 구형 형상으로부터의 입자의 이탈은 최대 팩킹 분율 및 고유 점도에 강한 영향을 미친다. 예를 들면, 다양한 축 비 7, 14 및 21의 유리 섬유는 각각 3.8에서 5.03을 거쳐 6.0까지 고유 점도를 증가시키고, 0.374에서 0.26을 거쳐 0.233까지 최대 팩킹 분율을 감소시킨다.
용액 중의 모노클론성 항체와 같은 큰 거대분자는, 작은 콜로이드로서 근사될 수 있기 때문에, 유사한 점도 분석이 수행될 수 있다. 당해 경우, 다양한 농도의 모노클론성 항체를 함유하는 용액의 점도 증가에 대한 이전에 공개된 값을 사용하여 크리거-도허티 식을 사용한 분석으로부터 45의 최종 [η] 값을 제공하였다(표 11). 그러나, 단백질 용액의 분석은 통상적으로 용적 분율보다는 질량 농도(g/㎖)를 사용하여 수행되어, 단위가 ㎤/g인 고유 점도 값 및 단백질 용액과 수성 용매의 점도 사이의 약간 상이하게 유도된 보다 높은 차수의 관계를 유도한다. 경질 준구형 모델이 크리거-도허티 식에서와 동일한 멱급수로부터 유도되지만; x 성분으로서 용적 분율보다는 농도를 사용한다.
Figure pct00023
위의 수학식 8에서,
c는 질량 단백질 농도이고,
k는 단백질의 고농도를 설명하는 밀집 인자이고,
υ는 구형으로부터의 형상 변화를 설명하는 시마(Simha) 파라미터이다.
그 결과, 이는 모노클론성 항체의 고유 점도에 대해 6.9㎤/g의 값 및 0.533의 κ/ν 값을 유도한다. 다양한 단백질에 대하여, 고유 점도의 값은 리소자임에 대해 약 2.7로부터 200㎤/g 이상까지 변화한다. 당해 모델은 헤모글로빈, 소 혈청 알부민 및 2개의 다양한 모노클론성 항체의 점도(여기서, 긴 범위의 정전기력은 점도 대 농도에서 무시할 정도의 역할을 하는 것으로 밝혀졌다)를 정확하게 예상하는 것으로 나타났다. 매우 작은 축 비인 1.5를 갖는 단백질인 리소자임에서도, 당해 모델은 대략 300㎎/㎖의 농도에서 점도의 극적인 증가를 나타낸다(도 15). 그러므로, 경질 준구형 모델에 의하여 기재될 수 있고 리소자임보다 큰 축방향 비를 갖는(수학식 8) 다양한 모노클론성 항체, BSA 및 헤모글로빈에 대하여, 점도의 신속한 증가는 보다 극적일 수 있고, 보다 낮은 농도에서 발생한다. 이러한 용액에 대하여, 점도 증가는 입자 밀집화 뿐만 아니라 용매화의 배제된 용매 효과 및 구형으로부터의 형상 이탈로 인한 것이다. 이러한 강한 이탈은 동일한 농도에서의 현탁액 중의 입자에 대해서는 나타나지 않는데, 이는 입자가 상당히 구형이고, 용매에 의하여 수화되지 않고, 단백질의 밀도는 통상적으로 약 1.35g/㎤여서 각각의 농도에 대한 보다 낮은 용적 분율을 유도하기 때문이다.
Figure pct00024
모델 단백질, 리소자임의 분쇄된 입자 300-400㎎/㎖ 이하의 농축 현탁액의 점도는 27-게이지 니들을 통한 피하 주사가 가능할 정도로 충분히 작았다. 단백질 분자는 응집에 대하여 안정하였고, 입자 크기는 대기 조건에서 저장시 적어도 2개월 동안 변화되지 않았다. 겉보기 점도는 크리거-도허티 식에 따라 모든 조건에서 용적 분율로 상호 연관되었다. 입자의 완전한 침강은 24시간이 걸리는 것으로 밝혀졌으며, 이는 균일한 분취량을 채취하고 분석하기에 충분한 시간을 제공하였다. 결과는 단일 주사 또는 다중 주사 적용을 위한 정확한 투약을 가능하게 하기에 충분한 현탁액 안정성을 나타내었다. 전체적으로, 리소자임 마이크로입자 현탁액의 콜로이드 안정성 및 용량 균일성은 허용 가능하게 낮은 점도에 따른, 치료학적 단백질의 피하 전달에 대한 잠재적 진보를 나타낸다. 매우 농축된 용액 중의 단백질에 대하여, 정전기 반발력, 용매화력 및 구형 기하로부터의 입자 형상의 이탈을 포함하는 다양한 힘이 큰 점도 상승을 유발할 수 있는 반면, 이러한 힘은 현재의 단백질 현탁액에 대해 거의 무시할만한 영향을 미쳐서 훨씬 낮은 점도를 야기한다.
당해 예의 목적은, (1) 다양한 입자 가공 기술을 사용하여 단백질 입자를 생성하여 비수성 및 수성 용매 중의 현탁액을 형성하고, (2) 바이알 속의 입자를 형성하고 상기 입자를 바이알로 이동시키는 효율적인 방법을 찾아내고, (3) 입자 크기, 콜로이드 안정성 및 현탁액의 점도를 측정하고, (4) 변성 및 응집에 관한 단백질 분자의 안정성을 측정하는 것이다. 관련 입자 가공 기술은 분쇄, 분무 건조, 침전 및 박막 동결을 포함한다. 피하 주사에 의한 단백질 및 펩티드 전달 실행 가능성은 25 내지 27-게이지 니들을 통하여 주사 가능하지만 활성 단백질 또는 폴리펩티드의 필요한 고농도를 함유하여 용적 1.5㎖ 미만의 전체 용량을 제공하는 충분히 낮은 점도의 생성물을 제형화시키는데 달려있다. 목적하는 점도는 400㎎/㎖ 이하의 단백질 현탁액으로 제조되었다.
충분히 낮은 점도를 갖는 모노클론성 항체의 고농도를 함유하는 안정한 현탁액 시스템의 제형화에 있어서의 1차적 중요성은 안정한 적합한 크기의 모노클론성 항체 입자의 형성이다. 이전에, 현탁액을 약 10-20㎛ 분쇄된 리소자임으로 제형화시켰다.
분쇄 외에, 단백질 입자를 공급 농도에 따라, 단백질의 안정성 나노입자를 제조하고, 유사한 마이크론 크기의 입자를 제조하는 것으로 이미 기재되어 있는, 박막 동결(TFF)으로 형성할 수 있다. 모노클론성 항체는 용액 형태로 입수되므로, TFT는 현저히 덜 파괴적인 공정이어서, 잠재적 동결 응력을 유발할 뿐인 반면, 입자를 동결 건조에 이은 분쇄 및 체질시켜 변성이 야기될 수 있는 동결, 가열 및 기계적 응력에 노출된다. 제안된 작업은 TFT 공정을 조정하여 Mab의 용해도 한계 내에서 공급 농도를 변경시키고, 트레할로스 등의 동결보호 당을 첨가함으로써 명시된 입자 크기를 생성시키고, 용매(현재 순수한 DI 수와 완충액)를 변화시켜 에탄올과 다양한 완충액 및 피하 주사에 필요한 기타 부형제의 비율(%)을 포함시킴을 포함하고, 피하 주사 제형용으로 적합한 바이알로의 직접 동결을 검사한다.
단백질 입자를 바이알로 이동시키기 위하여 다양한 기술이 이용된다. 당해 목표는 가공 단계를 단순화시키고 멸균 상태를 유지시키는 것이다. 제1 방법은 동결 건조 분말을 고체로서 바이알로 이동시키는 것이다. 제2 방법은 단백질을 여전히 동결 상태로 바이알로 이동시키는 것이다. 입자 크기 데이타를 수득하여 TFT 공정을 사용한 당해 방법 각각을 나타내었다(표 12).
Figure pct00025
일단 적합한 안정한 입자가 제조되면, 적합한 용매 시스템이 밝혀져야 한다. 이 경우, 수성 및 비수성계 시스템 둘 다가 분석될 수 있다. 순수한 비수성 용매 벤질 벤조에이트와 용매 시스템 벤질 벤조에이트와 홍화유 중의 분쇄된 리소자임의 안정한 저점도 제형이 미리 분석되었고, 위에서 기재한 Mab 입자를 함유하는 현탁액 중에서 추가로 분석할 수 있다. 고도로 농축된 수용액 중의 단백질 또는 폴리펩티드의 불안정성 및 가용성 응집물 및 수화에 의하여 발생된 점도 증가를 극복하기 위하여, 당해 연구의 주 목적은 27-게이지 니들을 통하여 100㎎/㎖ 초과의 농도에서 주사 가능한 모델 단백질 리소자임을 사용하여 비수성 용매 또는 용매 혼합물 중의 단백질 현탁액을 제형화시키는 것이었다. 제형화된 현탁액은 적어도 300㎎/㎖의 농도까지 주사 가능하게 잔존하는 것으로 밝혀졌다. 단백질 및 입자 안정성은 적어도 2개월 동안 잔존하여 잠재적으로 안정한 단백질 생성물을 나타내었다. 현탁액 중의 단백질 입자는 또한 1년 동안 실온에서 저장한 후 재현탁 가능한 것으로 밝혀졌다. 제형의 점도와 입자의 증가하는 용적 분율 사이의 상관 관계는, 입자 사이의 상호 작용의 주 근원이 입자 밀집으로 인한 것이고, 정전기 반발력, 용매로부터의 입자의 용매화 또는 입자 형상의 구형으로부터의 이탈과 같은 추가의 힘이 사용되지 않아서 현탁액의 안정성을 유지시킴을 나타낸다.
그러나, 주요 초점은 수성 용매 상에서 존재할 수 있으며, 비수성 용매는 2차적인 대상이다. 수성 용매 시스템은 제형화시키기가 약간 더 복잡하고, (1) 수중 Mab의 안정성을 감소시키는 제제(용해도가 20㎎/㎖를 초과하는 경우), (2) 용매가 첨가되는 경우, 농축 현탁액이 거품을 생성하는 것을 방지하는 소포제 및 (3) 충분한 기간 동안 Mab 및 최종 현탁액 생성물의 안정성을 유지시키는 추가의 부형제를 포함하여야 한다.
단백질의 수중 용해도를 감소시키기 위하여 첨가할 수 있는 제제는 고농도의 염, 예를 들면, 황산나트륨 및 황산암모늄, 아연을 포함하는 착화제, 수용성 중합체, 예를 들면, PEG, 다양한 유기 용매, 예를 들면, 에탄올 및 기타 계면활성제, 예를 들면, 트윈(Tween) 20을 포함한다. 염을 첨가하면 단백질의 소수성 그룹의 안정성을 감소시키는 용액의 이온 강도가 증가한다. 그러나, 피하 주사용 전달의 경우, 등장성이 아닌 용액은 주사시 통증을 증가시켜 잠재적으로 비순응성을 유도한다. 그러므로, 기타 첨가제로 용해도를 감소시키는 대안물이 유리할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 물 혼합물은 또한 염의 유사한 "염석" 효과에 대하여 증명된 바 있고, 주사용 제형에 보다 용이하게 허용된다. 상이한 분자량 PEG가 시도될 수 있는데, 이는, 저분자량 PEG가 추가의 용해도 감소에 대해서는 훨씬 더 높은 농도로 제형화될 수 있지만, 보다 높은 분자량 PEG는 단백질의 열 안정성을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 1%(w/v) 농도의 트윈 20은, 현탁액 중의 첨가된 Mab 입자의 가용화를 방지하고 또 다른 대체 방법을 제공하여 현탁액을 제형화시킬 수 있는, 소수성 단백질 후미콜랄라누기노사 리파제5의 침전을 유발한다고 증명된 바 있다. 추가의 부형제, 예를 들면, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 디메틸아세트아미드를 포함하는 수용성 비수성 용매(여기서, Mab는 약간만 가용성이다) 또한 시도된다.
염을 갖는 저점도의 성공적인 보다 높은 농도의 제형 및 PEG 제형은 수성 매질 중에서 제조되었다(표 13). 초기 입자 크기 측정 및 성분이 또한 기재되어 있다. 당해 제형은 적어도 1시간 동안 입자 안정성을 함유하는 것으로 밝혀졌고(도 17); 장기간 안정성은 연구되지 않았다. 예비 데이타는 수성 현탁액의 일부의 점도가 25 게이지 니들에 대하여 충분히 낮음을 나타낸다.
Figure pct00026
단백질의 수성 분산액의 거품 형성(foaming)은, 액체가 건조된 TFF 입자에 첨가되는 경우, 1.0M 황산나트륨 수성 용매 현탁액 중에서 관찰되었다. 단백질과 지방 입자의 수성 현탁액의 거품 안정성(foam stability)은 기포 유착을 증가시키는 것으로 가정된 상이한 스팬(Span) 부형제의 첨가로 현저히 감소되었다. SPAN® 80을 사용한 시도는 1.0M 황산나트륨 용액 중의 BSA의 농축된 분산액에 첨가시 거품을 성공적으로 파괴하여, 저점도, 고농축 현탁액을 남긴다. 기타 계면활성제는 입자 제형 및 최종 제형화 단계에 둘 다 사용되어 거품 형성 문제를 해결할 수 있다. 또한, 기타 부형제를 첨가하여 피하 투여되는 약제학적으로 허용되는 현탁액의 제형을 완성시켜야 한다. 단백질을 안정화시키기 위하여, 필요한 경우, 트윈 20 및 트윈 80과 같은 계면활성제를 첨가할 수 있다. 최종 수성 분산액을 생성하기 위하여, 완충액, 산화방지제 및 항균제를 가할 수 있다.
이어서, 최종 제형화된 현탁액을 25-게이지 니들 이어서 27-게이지 니들을 갖는 시린지로 용액을 1㎖까지 뽑아내는 시간을 사용하여 점도에 대하여 시험한다. 위에서 나타낸 바와 같이, 당해 측정으로 근사치 점도는 이론적 및 선행 결과(위) 둘 다에 합당하다. 또한, 침강 속도 측정, 광학 현미경에 의하여 촬영된 이미지, 다각도 레이저 광 산란에 의한 입자 크기 측정 및 전기영동 이동성 측정을 사용하여 현탁액의 안정성을 확인한다. 침강 속도는 단백질 농도에 대하여 랜덤하게 제거되고 분석된 현탁액의 분취량 외에, 일정한 기간에 걸친 현탁액의 균일성을 측정하는데 유용할 수 있다. 또한, 광학 현미경에 의하여 촬영된 이미지는 보다 낮은 농도에서의 입자에서 우세한 힘 및 입자가 응집하거나 뭉치거나 반발하는지의 여부를 나타낼 수 있다. 시간 경과에 따른 입자 크기 측정은 입자의 오스트발트 숙성 및 응고의 효과를 나타낼 수 있다. 연구를 완성하기 위하여, 입자의 전기영동 이동성이 측정되고 제타 전위를 정량화하여, 현탁액 중의 입자의 정전기 안정성을 측정할 수 있다.
최종 단계는 제형화된 현탁액 중의 Mab의 안정성을 측정하는 것이다. 수성계 현탁액에 대하여, 적합한 희석을 수행하여 분석에 필요한 농도에서 Mab의 용액을 생성하여야 한다. 용액 중의 Mab는 또한 현탁된 입자로부터 분리하고, 둘 다를 안정성에 대하여 개별적으로 분석할 수 있다. 비수성계 현탁액에 대하여 충분한 Mab 농도를 갖는 분취량을 순수 또는 적합한 완충액에 노출시켜 현탁된 입자를 유-수 계면 상에서 변성 없이 용액 중의 수성 상으로 분배시켜야 한다. 이전에 수행한 바와 같이, 현탁액은 1-3일 동안 적합한 수성 완충액에 노출시켜 잠재적으로 변성하는 유-수 계면에 서서히 분배시키고 최소 노출시킨다. 또한, 표준은 측정 값이 현탁된 입자의 정확한 대표치임을 보장하도록 수행할 수 있다. 이어서, Mab의 안정성은 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 동적 광 산란(DLS), 분석적 초원심분리(AUC) 및 가용성 및 불용성 응집물에 대한 광학 혼탁을 포함하는 각종 기술에 의하여 확인시킬 수 있다.
건조된 분말 및 재구성된 비수성 현탁액 둘 다의 수분 함량은 경시적으로 분석하여 제형의 안정성에 대한 과량의 물의 효과를 측정한다. 이전의 실험에서 주목된 바와 같이, 낮은 단백질 수화도에서는, 비극성 또는 약간 극성 유기 용매 중의 시간 경과에 따른 물 수착이 증기 상 자체로부터의 수착과 유사하다. 또한, Mab 특이 ELISA 검정이 수행되어 제형화 후 Mab의 활성(%)을 나타내어 Mab의 미스폴딩(misfolding) 및 변성을 분석할 수 있다. 당해 기술은 이전에 재구성 후 수득한 IgG의 결합 친화도를 관찰하는데 사용되었다. FTIR은 또한 임의의 부분의 최종 제형과 임의의 Mab 부형제 상호 작용을 측정하는데 수행할 수도 있다.
바이알 속의 필름 동결에 의한 입자의 제조. 다수의 입자 제형화 공정에서, 최종 용량형의 전달을 위한 다양한 표면으로부터 바이알로의 고체의 이동은 문제를 나타낸다. 멸균 상태를 유지시키는 것이 필요하고, 이동된 입자의 정확한 양을 측정하고 조절하는 것은 곤란할 수 있다. 또한, 입자 크기는 취급 동안 변화할 수 있다. 최종 용량형이 저징될 수 있는 바이알 내에서 직접 입자를 제조하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 바이알 내의 직접 동결 및 입자 제조의 공정은 통상적인 트레이 동결 건조에서 실시한다. 그러나, 쉘프를 통한 바이알로의 열 이동에 의한 느린 동결 속도는 통상적으로 수 백 마이크론 정도의 입자를 유도한다. 현재의 기술은 마이크론 미만 및 마이크론 크기의 입자 분배를 생성하고 조절하는 수단을 제공한다.
(a) 원추형 바이알 내부로 물질의 액상 용액을 도입하고; (b) 원추형 바이알을 액체 냉각제 속으로 침지시키는 한편, 바이알을 액체가 바이알의 내부 벽에 필름으로서 동결될 때까지 수평으로 회전시키고; (c) 동결 건조에 의하여 또는 동결된 용매의 제2 용액 속으로의 추출에 의하여 용매를 제거함을 포함하는, 바이알 내부에서 물질의 입자를 형성하기 위한 방법이 제공된다.
따라서, 본 발명은 트레이 동결 건조의 경우보다 극저온 용액 속으로의 바이알의 침지로 훨씬 더 신속하게 동결시키는 대체 방법을 제공한다. 20초 정도의 보다 신속한 동결로 마이크론 미만의 입자가 발생될 수 있다. 0.2 내지 4mm 범위의 동결 액체의 두께는 신속한 동결을 용이하게 한다. 바이알은 동결 건조기에 직접 옮겨져 용매를 제거하는 한편, 바이알 속의 최종 입자를 생성할 수 있다. 최종 입자는 또한 제제(염, 제2 용매, 중합체 등)의 첨가에 의하여 생성되어 입자의 용해도를 감소시켜 입자의 현탁액을 생성할 수 있다. 따라서, 고체는 바이알로부터 전혀 제거될 필요가 없다.
당해 방법은 바이알 내부의 신속한 동결 속도에서 균일한 박막으로 물질의 액체 용액을 동결시킴으로써 크기 분포를 미세하게 조절하여 입자의 제조를 가능하게 한다. 당해 방법은 세 가지 기초적인 단계로 실시한다: (a) 물질의 액체 용액을 원통형 바이알 내부로 도입하고; (b) 원통형 바이알을 액체 냉각제 속으로 침지시키는 한편, 바이알을 액체가 바이알의 내부 벽에 필름으로서 동결될 때까지 수평으로 회전시키고; (c) 동결 건조 또는 동결된 용매의 제2 용매 속으로의 추출에 의해 용매를 제거한다.
제1 단계는 1㎎/㎖ 내지 500㎎/㎖ 범위의 통상적인 농도의 수용액에 활성 물질을 용해시켜 개시한다. 당해 용액은 또한 예로서 동결보호제 또는 계면활성제를 포함하는 부형제를 함유할 수도 있다. 용액은 원통형 바이알로 도입하고, 여기서, 액체 용적 및 바이알의 치수는 최종 동결된 막의 두께(크기 분포의 조절에서 중요한 변수임)를 결정한다. 표 14는 두 가지 상이한 크기의 바이알에 대하여 수득한 상이한 필름 두께의 예를 나타낸다.
Figure pct00027
제2 단계는 액상 냉각제(예: 액상 N2) 내부에서 수평으로 바이알을 침지시키는 한편, 이를 회전시킴을 포함한다. 회전으로 액상 용액이 원통형 바이알 내부 벽에 균일한 두께의 필름으로서 동결되게 한다. 냉각제 온도(통상적으로 50 내지 253K 범위) 및 회전 속도(통상적으로 15 내지 600RPM 범위)를 동결 속도를 조절하도록 조정할 수 있다. 도 18은 바이알 내부의 상이한 액체 용적을 동결시키기 위하여 측정된 동결 온도 프로파일을 나타낸다. 온도는 T형 온도계로 측정하는 한편, 80K 및 30RPM의 회전 속도에서 냉각제로 가공하였다.
제3 단계는 동결 건조에 의하여 용매를 제거하거나 제제를 동결 용매에 첨가하여 현탁액을 생성하는 난용성 환경을 생성한다. 제2 용매, 염, 중합체 및 기타 제제는 수성계 제형에 첨가하여 단백질계 입자에 대한 난용성 환경을 생성할 수 있다. 용매는 통상적으로 수 혼화성 유기 용매, 예를 들면, 아세토니트릴 및 에탄올이다. 염, 예를 들면, 황산나트륨 및 황산암모늄 및 중합체, 예를 들면, PEG는 수성 환경에서 단백질의 용해도 감소를 유발하여, 입자의 현탁액을 생성한다.
도 19는 아세토니트릴에 현탁된 입자를 맬번 마스터사이저-S로 다각도 레이저 광 산란에 의하여 측정하여 본 발명으로 수득한 통상적인 입자 크기 분포를 나타낸다. 선택된 조건에서, 두 입자 규모 모두의 입자의 나노메트릭 입자, 마이크로메트릭 또는 바이모들(bimodal) 분포를 도 19a-d에 나타낸 바와 같이 생성할 수 있다. 입자 분포는 용질 농도, 액상 냉각제의 온도 및 액체의 용적 및 바이알 회전 속도에 의하여 조절된다. 표 15는 도 19에 나타낸 입자 크기 분포를 발생시킨 공정 조건을 나타낸다.
Figure pct00028
다음 예는 바이알 속의 단백질의 필름 동결에 이은 동결 건조 및 이어서 동결 건조된 물질을 수동 진탕으로 용매에 현탁시킴에 의하여 제조된 단백질 현탁액을 나타낸다. 도 20에서, 수중 리소자임 용액(20㎎/㎖) 4㎖를 바이알 내부의 필름 동결에 의하여 동결시켰다. 동결 건조 후, 벤질 벤조에이트를 첨가하여 리소자임 80㎎/㎖과의 현탁액을 형성하였다. 도 21에서, 수중 헤모글로빈 용액(150㎎/㎖) 2㎖를 바이알 내부에서 필름 동결에 의하여 동결시켰다. 동결된 용액을 동결 건조시키고, 입자를 벤질 벤조에이트 2㎖에 현탁시켜 현탁액 150㎎/㎖를 구성하였다. 두 경우 모두에서, 현탁액은 1일 동안 침강하지 않았고, 수동 진탕에 의하여 재현탁될 수 있었다.
당해 명세서에 논의된 어떠한 양태도 본 발명의 어떠한 방법, 키트, 시약 또는 조성물에 대해서라도 실행될 수 있고 그 반대도 가능함이 예상된다. 추가로, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 특정 양태는 본 발명을 제한에 의해서가 아니라 예시의 방법으로 나타낸다. 본 발명의 주요한 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 양태에 사용될 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 특정 공정에 대한 다수의 동등물인 통상의 실험을 사용하는 것일 뿐임을 인식하거나 확신할 수 있다. 이러한 동등물은 본 발명의 범위 내에 있다고 여겨지고 특허청구범위에 의하여 포함된다.
명세서에서 언급한 모든 문헌 및 특허원은 본 발명이 속한 기술분야의 숙련가의 수준을 나타낸다. 모든 문헌 및 특허원은 본원에서 각각의 개별적인 문헌 또는 특허원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 인용되는 것과 동일한 범위로 참조로 인용된다.
특허청구범위 및/또는 명세서에 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우의 하나("a" 또는 "an")의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"("one or more", "at least one" 및 "one or more than one")의 의미와도 일치한다. 특허청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 명백하게 대안물만을 언급한다고 나타내거나 대안물이 상호 배타적인 경우가 아니면 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되지만, 기재 사항은 대안물 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침한다. 본원에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 장치, 값을 측정하는데 사용되는 방법 또는 연구 대상에서 존재하는 변화에 대한 오차의 고유한 변화를 포함함을 나타내는데 사용된다.
본 명세서 및 특허청구범위(들)에서 사용된 용어 "포함하는(comprising)"(및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는(having)"(및 "갖다"와 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하는(including)"(및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태) 또는 "함유하는(containing)"(및 "함유하다"와 같은 함유하는의 임의의 형태)은 포괄적이거나 제한이 없고 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "또는 이의 배합물"은 당해 용어 이전의 열거된 항목의 모든 순열 및 조합을 언급한다. 예를 들면, "A, B, C 또는 이의 배합물"은 다음 중의 적어도 하나를 포함하는 것을 의도한다: A, B, C, AB, AC, BC 또는 ABC, 순서가 특정한 문맥에서 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC 또는 CAB. 이러한 예에 연속하여, 예를 들면, BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등의 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 함유하는 배합물이 명백하게 포함된다. 당업자는 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 통상적으로 어떠한 조합의 항목 또는 용어의 수에 대한 제한이 없음을 이해한다.
본원에 기재되고 청구된 기재된 모든 조성물 및/또는 방법은 당해 기재 내용의 견지에서 과도한 실험 없이 제조되고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 양태에 대하여 기재되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법 그리고 방법의 단계 또는 단계의 순서에서 변화가 적용될 수 있음이 당업자에게 명백하다. 당업자에게 명백한 모든 이러한 유사한 치환 및 개질은 첨부한 특허청구범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있다고 간주된다.

Claims (50)

  1. 하나 이상의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 마이크론 미만(sub-micron) 또는 마이크론 크기의 입자를 형성하는 단계,
    임의로 하나 이상의 첨가제를 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자에 첨가하는 단계,
    상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자를 약제학적으로 허용되는 용매에 현탁시켜, 진탕 또는 교반시 현탁 가능한 적어도 20㎎/㎖의 농도 및 2 내지 100센티푸아즈(centipoise)의 용액 점도를 갖는 고농도 저점도 현탁액(여기서, 상기 현탁액은, 전달시 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 펩티드가 용해되어 펩티드 응집체를 형성하지 않거나 적은 분획의 응집체만을 형성한다)을 형성하는 단계를 포함하는, 고농도 저점도 단백질 또는 펩티드 현탁액을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액이 21 내지 27-게이지 니들을 통하여 주사 가능한, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 용매가 약제학적으로 허용되는 수성 용매, 약제학적으로 허용되는 비수성 용매 또는 이들의 배합물을 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 마이크론 크기의 펩티드 입자가 투약 용기(dosage container) 중에서 형성되고, 상기 하나 이상의 마이크론 크기의 펩티드 입자가 상기 투약 용기로부터 직접 전달될 수 있는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 투약 용기가 바이알, 앰풀, 시린지 또는 벌크 용기를 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액의 농도가 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500㎎/㎖ 또는 그 이상인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액에서 상기 하나 이상의 단백질 또는 펩티드에 대한 하나 이상의 첨가제의 비가 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 2.5, 5, 7.5, 10, 12 미만 또는 그 이상인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액의 점도가 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10센티푸아즈 미만인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 또는 펩티드가 항체, 금속 나노입자에 콘쥬케이트된(conjugated) 하나 이상의 항체, 형상 기반 조성물 위의 하나 이상의 항체, 성장 인자, 항원, 백신, 소염제, 치료학적 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 이들의 배합물로부터 선택되는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 마이크론 크기의 펩티드 입자가 분쇄, 침전, 투석, 체질, 분무 건조, 동결 건조, 분무 동결 건조, 액체로의 분무 동결, 박막 동결 또는 투약 용기에서의 직접 동결에 의하여 제조되는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 펩티드 입자의 용적 평균 직경이 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.75, 0.5, 0.4, 0.3, 0.1, 0.05 또는 0.02㎛인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 글리세롤, 에리트리톨, 아라비노스, 크실로스, 리보스, 이노시톨, 프럭토스, 갈락토스, 말토스, 글루코스, 만노스, 트레할로스 및 수크로스로부터 선택된 하나 이상의 제제를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 첨가제가 안정화제, 계면활성제, 유화제, 염, 아미노산, 작은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 중합체, 공용매 및 이들의 배합물로부터 선택되는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 첨가제가 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자의 일부, 상기 고농도 저점도 현탁액의 일부 또는 이들 둘 다의 일부인, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 첨가제가 나트륨 염, 아연 염, 리튬 염, 칼륨 염, 암모늄 염, 칼슘 염, 마그네슘 염, 아연 염, 클로라이드 염, 브로마이드 염, 요오다이드 염, 포스페이트 염, 설페이트 염, 글리세롤, 에리트리톨, 아라비노스, 크실로스, 리보스, 이노시톨, 프럭토스, 갈락토스, 말토스, 글루코스, 만노스, 트레할로스, 수크로스, 폴리(에틸렌 글리콜), 카보머 1342, 글루코스 중합체, 실리콘 중합체, 폴리디메틸실록산, 폴리에틸렌 글리콜, 카복시 메틸 셀룰로스, 폴리(글리콜산), 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리락트산, 덱스트란, 폴록사머; 에탄올, N-메틸-2-피롤리돈, PEG 300, PEG 400, PEG 200, PEG 3350, 프로필렌 글리콜, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸 설폭사이드, 솔케탈, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, 디글라임, 에틸 락테이트로부터 선택된 유기 공용매; 또는 이들의 배합물을 포함하는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 용매가 벤질 벤조에이트 또는 벤질 벤조에이트를 홍화유, 참기름, 피마자유, 면실유, 카놀라유, 사프란유, 올리브유, 땅콩유, 해바라기씨유, a-토코페롤, 미글리올 812 및 에틸 올레에이트로부터 선택된 하나 이상의 오일과 함께 포함하는, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 또는 펩티드의 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 0.95 또는 0.99 초과가 30, 20 또는 10㎚ 보다 작은 독립체(entity)들로서 가용성이 아닌, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액이 0.5mm 내지 1cm의 경로 길이 또는 5 내지 0.1㎖의 용적을 갖는 바이알에서 백색, 불투명 또는 반투명인, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액의 형성 전에 하나 이상의 단백질 또는 펩티드의 상대적 단량체 분율이, 완충된 수성 매질에 상기 하나 이상의 단백질 또는 펩티드가 용해될 때, 0.7, 0.8, 0.9, 0.95, 0.97, 0.98 또는 0.99를 초과하는, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액 중의 하나 이상의 단백질 또는 펩티드의 상대적 단량체 분율이, 상기 하나 이상의 마이크론 크기의 펩티드 입자의 완충된 수성 매질에 상기 펩티드가 용해될 때의 단량체 분율 값 0.93, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99, 0.995인, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액을 대상자에게 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 고농도 저점도 현탁액이 피하 전달, 근육내 전달 또는 폐 전달되는, 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자가 전달시 1, 5, 10, 30 및 60분 미만에 대상자 체내에서 용해되는, 방법.
  23. 제1항에 있어서, 약 1시간 내지 10주의 기간에 걸쳐 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자의 방출을 조절하는 지연 방출제(time release agent)를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 또는 펩티드의 비-단량체성 분획이 총 펩티드 중량의 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 농도로 전달되는, 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자가 상기 고농도 저점도 현탁액으로부터 침강된 후, 상기 고농도 저점도 현탁액을 주사 용량으로 재현탁시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 고농도 저점도 현탁액으로서,
    상기 고농도 저점도 현탁액은,
    약제학적으로 허용되는 용매,
    하나 이상의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 비결정성 입자 및
    임의로, 진탕 또는 교반시 현탁 가능한 적어도 20㎎/㎖의 농도 및 2 내지 100센티푸아즈의 용액 점도를 갖는 고농도 저점도 현탁액을 형성하기 위한, 약제학적으로 허용되는 용매 중의 하나 이상의 첨가제를 포함하고,
    상기 고농도 저점도 현탁액은 또한, 전달시 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 펩티드가 용해되어 펩티드 응집물을 형성하지 않거나 단지 적은 분획의 응집물을 형성하는, 고농도 저점도 현탁액.
  27. 제26항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액이 21 내지 27-게이지 니들을 통하여 주사 가능한, 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 용매가 약제학적으로 허용되는 수성 용매, 약제학적으로 허용되는 비수성 용매 또는 이들의 배합물을 포함하는, 조성물.
  29. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 마이크론 크기의 펩티드 입자가 투약 용기 중에서 형성되고, 상기 투약 용기로부터 직접 전달될 수 있는, 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 투약 용기가 바이알, 앰풀, 시린지 또는 벌크 용기를 포함하는, 조성물.
  31. 제26항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액의 농도가 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500㎎/㎖ 또는 그 이상인, 조성물.
  32. 제26항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액에서 상기 하나 이상의 단백질 또는 펩티드에 대한 하나 이상의 첨가제의 비가 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 2.5, 5, 7.5, 10, 12 미만 또는 그 이상인, 조성물.
  33. 제26항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액의 점도가 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10센티푸아즈 미만인, 조성물.
  34. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 또는 펩티드가 항체, 금속 나노입자에 콘쥬케이트된 하나 이상의 항체, 형상 기반 조성물 위의 하나 이상의 항체, 성장 인자, 항원, 백신, 소염제, 치료학적 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 이들의 배합물로부터 선택되는, 조성물.
  35. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 펩티드 입자의 용적 평균 직경이 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.75, 0.5, 0.4, 0.3, 0.1, 0.05 또는 0.02㎛인, 조성물.
  36. 제26항에 있어서, 글리세롤, 에리트리톨, 아라비노스, 크실로스, 리보스, 이노시톨, 프럭토스, 갈락토스, 말토스, 글루코스, 만노스, 트레할로스 및 수크로스로부터 선택된 하나 이상의 제제를 추가로 포함하는, 조성물.
  37. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 첨가제가 안정화제, 계면활성제, 유화제, 염, 아미노산, 작은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 중합체, 공용매 및 이들의 배합물로부터 선택되는, 조성물.
  38. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 첨가제가 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자의 일부, 상기 고농도 저점도 현탁액의 일부 또는 이들 둘 다의 일부인, 조성물.
  39. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 첨가제가 나트륨 염, 아연 염, 리튬 염, 칼륨 염, 암모늄 염, 칼슘 염, 마그네슘 염, 아연 염, 클로라이드 염, 브로마이드 염, 요오다이드 염, 포스페이트 염, 설페이트 염, 글리세롤, 에리트리톨, 아라비노스, 크실로스, 리보스, 이노시톨, 프럭토스, 갈락토스, 말토스, 글루코스, 만노스, 트레할로스, 수크로스, 폴리(에틸렌 글리콜), 카보머 1342, 글루코스 중합체, 실리콘 중합체, 폴리디메틸실록산, 폴리에틸렌 글리콜, 카복시 메틸 셀룰로스, 폴리(글리콜산), 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리락트산, 덱스트란, 폴록사머; 에탄올, N-메틸-2-피롤리돈, PEG 300, PEG 400, PEG 200, PEG 3350, 프로필렌 글리콜, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸 설폭사이드, 솔케탈, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, 디글라임, 에틸 락테이트로부터 선택된 유기 공용매; 또는 이들의 배합물을 포함하는, 조성물.
  40. 제26항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 용매가 벤질 벤조에이트 또는 벤질 벤조에이트를 홍화유, 참기름, 피마자유, 면실유, 카놀라유, 사프란유, 올리브유, 땅콩유, 해바라기씨유, a-토코페롤, 미글리올 812 및 에틸 올레에이트로부터 선택된 하나 이상의 오일과 함께 포함하는, 조성물.
  41. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 또는 펩티드의 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 0.95 또는 0.99 초과가 30, 20 또는 10㎚ 보다 작은 독립체들로서 가용성이 아닌, 조성물.
  42. 제26항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액이 0.5mm 내지 1cm의 경로 길이 또는 5 내지 0.1㎖의 용적을 갖는 바이알에서 백색, 불투명 또는 반투명인, 조성물.
  43. 제26항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액의 형성 전에 하나 이상의 단백질 또는 펩티드의 상대적 단량체 분율이, 완충된 수성 매질에 상기 하나 이상의 단백질 또는 펩티드가 용해될 때, 0.7, 0.8, 0.9, 0.95, 0.97, 0.98 또는 0.99를 초과하는, 조성물.
  44. 제26항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액 중의 하나 이상의 단백질 또는 펩티드의 상대적 단량체 분율이, 상기 하나 이상의 마이크론 크기의 펩티드 입자의 완충된 수성 매질에 상기 펩티드가 용해될 때의 단량체 분율 값 0.93, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99, 0.995인, 조성물.
  45. 제26항에 있어서, 상기 고농도 저점도 현탁액이 피하 전달, 근육내 전달 또는 폐 전달되는, 조성물.
  46. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자가 전달시 1, 5, 10, 30 및 60분 미만에 대상자 체내에서 용해되는, 조성물.
  47. 제26항에 있어서, 약 1시간 내지 10주의 기간에 걸쳐 상기 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 입자의 방출을 조절하는 지연 방출제를 추가로 포함하는, 조성물.
  48. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 또는 펩티드의 비-단량체성 분획이 총 펩티드 중량의 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 농도로 전달되는, 조성물.
  49. 단일 용량 용기,
    상기 단일 용량 용기 내에 배치시킨, 수성 용매, 비수성 용매 또는 이들의 배합물로부터 선택된 약제학적으로 허용되는 용매,
    상기 단일 용량 용기 내에 배치시킨, 하나 이상의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 비결정성 입자 및
    임의로, 상기 단일 용량 용기 내에 배치시킨, 21 내지 27-게이지 니들을 통하여 주사 가능한, 적어도 20㎎/㎖의 농도 및 2 내지 100센티푸아즈의 용액 점도를 갖는 고농도 저점도 현탁액을 형성하기 위한 하나 이상의 첨가제를 포함하는, 단일 용량 고농도 저점도 현탁액.
  50. 초기 용기,
    상기 초기 용기 내의 약제학적으로 허용되는 용매,
    상기 초기 용기 내의 하나 이상의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 마이크론 미만 또는 마이크론 크기의 비결정성 입자 및
    임의로, 적어도 20㎎/㎖의 농도 및 2 내지 100센티푸아즈의 용액 점도를 갖는 고농도 저점도 현탁액을 형성하기 위한 상기 약제학적으로 허용되는 용매 중의 하나 이상의 첨가제
    를 포함하는 농축된 저점도 현탁액으로서의 펩티드 또는 단백질의 조절된 중량을 이동시키는 방법으로서,
    상기 고농도 저점도 현탁액이 진탕 또는 교반시 현탁 가능하고 또한 상기 고농도 저점도 현탁액이 상기 초기 용기로부터 바이알, 앰풀 또는 시린지를 포함하는 투약 용기로 이동가능한, 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150009593A (ko) * 2012-05-18 2015-01-26 제넨테크, 인크. 고농도 모노클로날 항체 제제
US11826460B2 (en) 2018-07-23 2023-11-28 Chong Kun Dang Pharmaceutical Corp. Stable pharmaceutical composition comprising testosterone undecanoate

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2170283B1 (en) 2007-06-22 2019-01-09 Board of Regents, The University of Texas System Formation of stable submicron peptide or protein particles by thin film freezing
US9072668B2 (en) 2010-03-09 2015-07-07 Janssen Biotech, Inc. Non-aqueous high concentration reduced viscosity suspension formulations of antibodies
US20110223208A1 (en) * 2010-03-09 2011-09-15 Beth Hill Non-Aqueous High Concentration Reduced Viscosity Suspension Formulations
ES2659079T3 (es) * 2010-03-09 2018-03-13 Janssen Biotech, Inc. Formulaciones no acuosas en suspensión de viscosidad reducida a concentración elevada
US9445990B2 (en) * 2010-10-06 2016-09-20 Medtronic, Inc. TNF inhibitor formulation for use in implantable infusion devices
EP2683362A4 (en) * 2011-03-10 2014-09-17 Univ Texas DISPERSIONS OF NANOPARTICLES OF PROTEINS
CN104023748B (zh) 2011-10-28 2018-03-02 诚信生物公司 含有氨基酸的蛋白质制剂
WO2013070692A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Battelle Memorial Institute Processes for delivery of viscous drug therapies
US20140342006A1 (en) * 2013-03-15 2014-11-20 Ansun Biopharma, Inc. Methods for Preparing Injectable Protein Microparticle Suspensions
EP3808338A1 (en) 2013-09-11 2021-04-21 Eagle Biologics, Inc. Liquid protein formulations containing ionic liquids
CN103976947B (zh) * 2014-06-05 2016-08-17 段明星 一种含酶油悬浮剂及其制备方法与应用
WO2016054259A1 (en) 2014-10-01 2016-04-07 Arsia Therapeutics, Inc. Polysaccharide and nucleic acid formulations containing viscosity-lowering agents
BR112017012289B1 (pt) * 2014-12-12 2022-11-16 Motejo. Ltd Agente para injeção hipodérmica
JP5774190B1 (ja) * 2014-12-12 2015-09-09 ジーンメディカル株式会社 皮下注射用剤及び皮下注射用剤を含有する注射器の製造方法
JP7275027B2 (ja) * 2016-10-06 2023-05-17 アムジェン インコーポレイテッド 粘度低下タンパク質医薬製剤
CN113365609A (zh) 2019-01-31 2021-09-07 伊勒卓菲公司 颗粒形成和形态
JP2022519690A (ja) 2019-02-05 2022-03-24 リンディー バイオサイエンシーズ，インク． 単離された細胞培養成分、及びそれを液状の細胞培養培地から単離する方法
JP2022547546A (ja) 2019-09-13 2022-11-14 エレクトロフィ，インコーポレイテッド 疾患の処置のための治療用生物学的作用剤の送達のための組成物及び方法

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE795516A (fr) 1972-02-17 1973-08-16 Ciba Geigy Preparations de peptides huileuses et injectables et procede pour leur preparation
US4310516A (en) 1980-02-01 1982-01-12 Block Drug Company Inc. Cosmetic and pharmaceutical vehicle thickened with solid emulsifier
EP0079143A3 (en) 1981-10-20 1984-11-21 Adnovum Ag Pseudoplastic gel transfer
US4594108A (en) 1983-09-19 1986-06-10 The Dow Chemical Company Highly pseudoplastic polymer solutions
US5411951A (en) 1984-10-04 1995-05-02 Monsanto Company Prolonged release of biologically active somatotropin
US5288479A (en) 1989-01-17 1994-02-22 Sterling Drug, Inc. Extrudable elastic oral pharmaceutical gel compositions and metered dose dispensers containing them and method of making and method of use thereof
SE465950B (sv) 1989-10-23 1991-11-25 Medinvent Sa Kombination av ett aggregat partikelformat, kristallint eller frystorkat laekemedel med en pseudoplastisk gel foer beredning av ett injicerbart preparat samt foerfarande foer dess framstaellning
US5300302A (en) 1990-10-04 1994-04-05 Nestec S.A. Pharmaceutical composition in gel form in a dispensing package
YU87892A (sh) 1991-10-01 1995-12-04 Eli Lilly And Company Lilly Corporate Center Injektibilne formulacije produženog otpuštanja i postupci za njihovo dobijanje i primenu
US5540912A (en) 1992-03-30 1996-07-30 Alza Corporation Viscous suspensions of controlled-release drug particles
MX9301821A (es) 1992-03-30 1994-03-31 Alza Corp Sistema de matriz polimerica biodegradable regulador de degradacion y metodo de tratamiento del mismo.
US5512293A (en) 1992-07-23 1996-04-30 Alza Corporation Oral sustained release drug delivery device
SE9203594D0 (sv) 1992-11-30 1992-11-30 Christer Nystroem Laekemedel i dispersa system
AU682703B2 (en) 1994-06-13 1997-10-16 Alza Corporation Dosage form for administering drug in liquid formulation
US5904935A (en) 1995-06-07 1999-05-18 Alza Corporation Peptide/protein suspending formulations
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US5916582A (en) 1996-07-03 1999-06-29 Alza Corporation Aqueous formulations of peptides
SK284490B6 (sk) 1996-07-03 2005-05-05 Alza Corporation Stabilná nevodná formulácia a spôsob jej prípravy
US5932547A (en) 1996-07-03 1999-08-03 Alza Corporation Non-aqueous polar aprotic peptide formulations
IN184589B (ko) 1996-10-16 2000-09-09 Alza Corp
US7393630B2 (en) 1997-12-16 2008-07-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Use of microparticles combined with submicron oil-in-water emulsions
US7258869B1 (en) 1999-02-08 2007-08-21 Alza Corporation Stable non-aqueous single phase viscous vehicles and formulations utilizing such vehicle
IL144755A0 (en) 1999-02-08 2002-06-30 Alza Corp Stable non-aqueous single phase viscous vehicles and formulations utilizing such vehicles
FR2809309B1 (fr) * 2000-05-23 2004-06-11 Mainelab Microspheres a liberation prolongee pour administration injectable
US7374782B2 (en) 2000-10-27 2008-05-20 Baxter International Inc. Production of microspheres
US20040022861A1 (en) 2001-01-30 2004-02-05 Williams Robert O. Process for production of nanoparticles and microparticles by spray freezing into liquid
EP1372729B1 (en) * 2001-02-23 2009-04-08 Genentech, Inc. Erodible polymers for injection
JP2005500304A (ja) * 2001-06-21 2005-01-06 アルタス バイオロジックス インコーポレイテッド 球状タンパク質粒子およびそれらの作製方法および使用方法
EP1578394A4 (en) 2002-12-31 2011-02-23 Nektar Therapeutics ANTIBODY PARTICLES AND COMPOSITIONS
PT1610820E (pt) * 2003-04-04 2010-12-16 Novartis Ag Formulações de elevada concentração de anticorpos e proteínas
WO2004112747A2 (en) 2003-06-24 2004-12-29 Baxter International Inc. Specific delivery of drugs to the brain
WO2005035088A2 (en) 2003-07-18 2005-04-21 Baxter International, Inc. Method for preparing small spherical by controlled phase separation
FR2862536B1 (fr) * 2003-11-21 2007-11-23 Flamel Tech Sa Formulations pharmaceutiques pour la liberation prolongee de principe(s) actif(s), ainsi que leurs applications notamment therapeutiques
WO2005112893A1 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Baxter International Inc. Microspheres comprising protein and showing injectability at high concentrations of said agent
US8728525B2 (en) 2004-05-12 2014-05-20 Baxter International Inc. Protein microspheres retaining pharmacokinetic and pharmacodynamic properties
US20060141040A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Guohua Chen Injectable non-aqueous suspension
WO2006083761A2 (en) * 2005-02-03 2006-08-10 Alza Corporation Solvent/polymer solutions as suspension vehicles
US20070015689A1 (en) 2005-06-23 2007-01-18 Alza Corporation Complexation of metal ions with polypeptides
JP2009519975A (ja) 2005-12-16 2009-05-21 ユニバーシティ・オブ・カンザス 治療薬を送達するナノクラスター
US20090304599A1 (en) 2005-12-20 2009-12-10 Fujifilm Corporation Protein Nanoparticles and the Use of the Same
US20080102128A1 (en) * 2006-07-28 2008-05-01 Flamel Technologies, Inc. Modified-release microparticles based on amphiphilic copolymer and on active principles(s) and pharmaceutical formulations comprising them
EP2170283B1 (en) * 2007-06-22 2019-01-09 Board of Regents, The University of Texas System Formation of stable submicron peptide or protein particles by thin film freezing
CN101081882A (zh) * 2007-07-06 2007-12-05 天津大学 大分子印迹交联聚乙烯基吡咯烷酮微球及低温悬浮聚合制备方法
JP2009173610A (ja) 2008-01-28 2009-08-06 Fujifilm Corp タンパク質ナノ粒子
CN101965195A (zh) 2008-03-05 2011-02-02 巴克斯特国际公司 用于药物投送的组合物和方法
WO2009137112A1 (en) 2008-05-09 2009-11-12 South Dakota State University Method of forming non-immunogenic hydrophobic protein nanoparticles and uses therefor
US20100009007A1 (en) 2008-07-10 2010-01-14 Baxter International Inc. Non-covalent modification of microparticles and process of preparing same
US8323685B2 (en) 2008-08-20 2012-12-04 Baxter International Inc. Methods of processing compositions containing microparticles
AR075715A1 (es) 2009-03-05 2011-04-20 Novartis Ag Formulacion de anticuerpo liofilizado

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150009593A (ko) * 2012-05-18 2015-01-26 제넨테크, 인크. 고농도 모노클로날 항체 제제
KR20210103388A (ko) * 2012-05-18 2021-08-23 제넨테크, 인크. 고농도 모노클로날 항체 제제
US11826460B2 (en) 2018-07-23 2023-11-28 Chong Kun Dang Pharmaceutical Corp. Stable pharmaceutical composition comprising testosterone undecanoate

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CA2743789A1 (en) 2010-05-20
US8779094B2 (en) 2014-07-15
JP2012508744A (ja) 2012-04-12

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