KR20110102362A

KR20110102362A - 기능성 티타늄 임플란트 및 관련 재생 재료

Info

Publication number: KR20110102362A
Application number: KR1020117014523A
Authority: KR
Inventors: 타카히로 오가와
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2008-11-25
Filing date: 2009-11-24
Publication date: 2011-09-16
Also published as: WO2010068468A3; AU2009324879A1; JP6072413B2; EP2373355A2; EP2373355A4; CN102245221A; JP2012509750A; CA2744540A1; US20110313536A1; WO2010068468A2

Abstract

임플란트 표면을 처리하여 그 표면을 양전기로 하전되게 하는 것을 포함하는 임플란트 기능화 방법에 제공된다. 임플란트는 조직-임플란트 유착 및/또는 뼈-임플란트 유착이 향상된다.

Description

기능성 티타늄 임플란트 및 관련 재생 재료{FUNCTIONALIZED TITANIUM IMPLANTS AND RELATED REGENERATIVE MATERIALS}

상호참조

본 출원은 2008년 11월 25일 출원된 미합중국 가특허출원 제 61/117,831호의 우선권을 주장하며, 그 개시내용 전체를 언급함으로써 인용한다.

본 발명은 일반적으로 생물의학용도의 의료용 임플란트에 관한 것이다.

골다공증으로 인한 대퇴골 경부 골절(osteoporotic femoral neck fracture) 및 무릎 및 고관절의 퇴행성 변화는 매우 자주 있는 문제이다. 미국에서는 티타늄 임플란트를 앵커로서 사용하는 것이 필수적인 치료법이 되고 있는 둔부 및 무릎 복원에 연간 500,000 이상의 수술이 실시되고 있다. 이들 부위에서의 골절의 특성 및 위치 때문에 뼈의 고정화(예를 들어, 깁스부목고정(cast splinting))가 불가능하며, 통상적으로 수술 직후에 임플란트는 중력과 걷기 같은 일상의 활동에 의해 야기되는 일정하고/일정하거나 반복적인 하중에 의해 충격을 받는다. 이런 치료결과의 문제로는 주로 상당한 정도의 신체장해, 장기간의 의존성, 5%-40%에 달하는 비교적 높은 비율의 교정 수술, 및 삶의 질의 상당한 저하가 포함된다. 다른 유해한 요인은 이런 목적으로 임플란트를 이식하면 임플란트 주위의 골절치유를 방해하는 골다공증 및 노쇠 특성 같은 대사활동 및 손상된 뼈의 재생능과 직면하게 된다는 것이다. 따라서 골내 임플란트(endosseous implant)를 사용하여 뼈와 관절을 신속하고 견고하게 고정하는 것은 사망률을 최소화하고 기능회복 및 장기 예후를 최대화하기 위한 영원한 노력이다.

한편, 치과용 티타늄 임플란트를 사용하여 결손치아를 복구치료하는 것은 일반적으로 용인되었다. 그러나, 치과에서 임플란트 치료를 적용하는 것은 주골(host bone)의 질과 치수, 전신증상 및 나이를 포함한 매우 위험한 요소를 갖는다. 교합하중을 견딜 수 있게 티타늄 임플란트가 뼈와 일체로 되는데 필요한 오랜 치유시간(4-6개월)은 이런 유리한 치료를 적용하는 것을 실질적으로 제한한다. 골형성(골유도) 능력이 향상된 임플란트는 환자 및 치과의사에게 상당한 이익을 제공할 것이다.

뼈에 추가하여, 뼈, 관절 및 치아 재생치료술 이외의 현행의 조직 재생치료술은 많은 난관을 만난다. 예를 들어, 상해 및 퇴행성 변화 후에 골결손에 대하여 현재 실시하는 치료는 조직의 재생을 촉진하기 위해 성장인자 같은 생체분자를 사용할 필요가 있다. 그리고 재생 가능한 뼈의 체적 및 생체분자의 효과에는 여전히 한계가 있다. 생체분자의 나쁜 영향 및 치료비용도 역시 중요하다.

캐리어 생체재료와 함께 공급되는 경우에 생물활성이 향상된 임플란트는 조직 재생에 필요한 생체 반응을 향상시키는데 사용될 수 있는 가능성을 가질 수 있다.

여기서 제시하는 것은 양성 전하를 담고 있는 금속산화물을 포함하는 금속 표면을 포함하는 의료용 임플란트이다. 이 금속은 티타늄, 금, 백금, 탄탈륨, 니오븀, 니켈, 철, 크롬, 코발트, 지르코늄, 알루미늄 및 팔라듐이 될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 임플란트는 금속이나 비금속이 될 수 있는 캐리어 재료를 포함한다.

일 실시형태에 있어서, 의료용 임플란트는 티타늄 표면을 포함한다. 티타늄 표면은 TiO₂를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 티타늄 표면은 실질적으로 탄화수소가 없다.

임플란트 표면은 향상된 속도로 단백질 및/또는 세포를 끌어당긴다. 단백질은 소혈청 알부민, 분획 V, 및 소혈장 피브로넥틴(bovine plasma fibronectin)이 될 수 있다. 세포는 인간 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 골아세포(osteoblastic cell)가 될 수 있다. 단백질이나 세포는 처리된 임플란트에 직접, 예를 들어 연결하는 2가 양이온 없이 부착할 수 있다.

임플란트 표면은 조직-임플란트 유착 및/또는 뼈-임플란트 유착을 야기하거나 촉진시킬 수 있다. 임플란트 표면은 단백질 흡착 증대, 골아세포 이동 증대, 골아세포 부착 증대, 골아세포 확산 용이, 골아세포의 증식 증대 및 골아세포 분화 촉진 중에서 하나 또는 임의의 조합을 가능하게 한다.

여기서 제시하는 것은 (1) 금속 임플란트 표면을 제공하는 단계, 및 (2) 임플란트 표면을 처리하여 표면이 양전기로 하전되게 하거나 또는 표면의 양성전하를 증대시키는 단계를 포함하는 의료용 임플란트를 기능적으로 하는 방법이다. 일부 실시형태에 있어서, 이 방법은 생리학적 조건에서 표면이 양전기로 하전되게 한다. 생리학적 조건은 약 7의 pH 값을 가질 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 이 방법은 표면이 7 미만의 pH에서 또는 7보다 높은 pH에서 양전기로 하전되게 한다.

일 실시형태에 있어서, 처리된 표면은 처리되지 않은 표면에 비하여 향상된 속도로 단백질 및/또는 세포를 끌어당길 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 임플란트는 티타늄 표면을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 티타늄 표면은 이산화티타늄을 포함한다.

일 실시형태에 있어서, 임플란트 표면은 자외선을 조사함으로써 처리된다. 자외선은 자외선 램프에 의해 조사될 수 있다. 자외선은 파장이 약 10nm 내지 400nm일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 자외선은 파장이 약 170nm 내지 약 270nm 또는 약 340nm 내지 약 380nm일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 표면은 파장이 약 170nm 내지 약 270nm인 자외선과 파장이 약 340nm 내지 약 380nm인 자외선을 조합하여 조사함으로써 처리된다.

자외선 강도는 넓은 범위를 가질 수 있다. 예를 들어, 자외선 강도는 0.001mW/cm² 내지 100mW/cm²의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 자외선은 강도가 약 0.1mW/cm² 또는 약 2mW/cm²일 수 있다. 자외선 처리는 48시간 이하의 시간, 예를 들어 30초, 1분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 5시간, 10시간, 24시간, 36시간 및 48시간에 걸쳐서 이루어질 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 본 방법은 임플란트 표면을 처리하기 전에 임플란트 표면을 공정처리(processing)하는 것을 더 포함한다. 임플란트 표면은 물리적 공정 또는 화학적 공정에 의해 공정처리될 수 있다. 물리적 공정은 기계가공 또는 샌드블라스팅이 될 수 있다. 화학적 공정은 산이나 염기에 의한 에칭이 될 수 있다. 산은 황산이 될 수 있다. 공정처리된 표면은 양전기로 하전될 수 있다. 자외선 처리는 공정처리된 표면의 양성정도를 높여준다.

일부 실시형태에 있어서, 처리된 표면은 금속산화물 양이온을 포함한다. 금속산화물 양이온은 이산화티타늄 양이온이 될 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 처리된 임플란트 표면은 소혈청 알부민, 분획 V, 소혈장 피브로넥틴 같은 단백질을 끌어당길 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 처리된 임플란트 표면은 인간의 간엽 줄기세포 및 골아세포 같은 세포를 끌어당길 수 있다. 단백질이나 세포는 처리된 임플란트 표면에 직접, 예를 들어 연결하는 2가 양이온 없이 부착할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 처리된 티타늄 표면은 Ca² ⁺, Mg²⁺, Zn² ⁺ 등 같은 2가 양이온을 포함하지 않는다.

처리된 임플란트 표면은 임플란트 위치에서의 조직-임플란트 유착 및/또는 뼈-임플란트 유착을 향상시킬 수 있다. 처리된 임플란트 표면은 처리되지 않은 임플란트 표면에 비하여 골형성 능력이 향상된다. 처리된 임플란트 표면은 단백질 흡착 증대, 골아세포 이동 증대, 골아세포 부착 증대, 골아세포 확산 용이, 골아세포의 증식 증대 및 골아세포 분화 촉진 중에서 하나 또는 임의의 조합을 가능하게 한다.

전술한 방법은 임플란트의 골형성 능력을 향상시키고, 임플란트의 골전도(osteoconductive) 능력을 향상시키고, 조직-임플란트 및/또는 뼈-임플란트 유착을 향상시키는데 사용될 수 있다.

여기서 제시하는 것은 전술한 방법에 따라서 기능적으로 된 표면을 포함하는 의료용 임플란트이다.

도 1은 자외선 처리되거나 되지 않은 산에칭된 티타늄 표면의 초기 생물활성을 여러 시간에 따라서 보여준다.
A 바로 사용하는 새롭게 공정처리된 티타늄 디스크, 4주된 디스크(암흑 주위 조건에서 저장), 및 4주되었으며 자외선으로 처리된 디스크에 대한 2시간, 24시간 및 72시간 배양 후의 소혈청 알부민의 평균 ±SD 흡착율.
B 3시간의 배양 중에 8μm 구멍을 통해 여러 가지로 조절된 산에칭된 티타늄 디스크에 이동된 인간 간엽줄기세포(MSC)의 양.
C 접종 3시간 및 24시간 후에 WST-1 검출로 평가된 티타늄 디스크에 부착된 인간 MSC. 데이터는 모든 패널에 대한 평균 ±SD로서 도시되어있다(n=3).
도 2는 여러 가지로 조절된 산에칭된 Ti 표면: 즉 새롭게 공정처리된 표면, 4주된 표면 및 자외선 처리되고 4주된 표면상에 접종하고 3시간 후에 인간 간엽줄기세포(MSC)의 초기확산 및 세포골격 정렬상태를 보여준다.
A 액틴 필라멘트(적색), 항팍실린(녹색) 또는 양자의 조합에 대하여 로다민 팔로이딘으로 염색된 세포의 대표적인 공초점현미경 이미지.
B 3개의 이미지를 사용하여 실시한 세포형태계측 평가. 데이터는 평균±SD이다(n=10).
도 3은 4주된 표면과 비교하여 새롭게 공정처리된 티타늄 표면 및 자외선 처리되고 산에칭된 티타늄 표면에 대한 뼈-티타늄 유착 향상을 기계적 압입 시험으로 평가하여 보여준다. 자외선 처리되거나 되지 않았고 기계가공된 임플란트 및 산에칭된 임플란트의 압입값. 데이터는 평균±SD로 보여준다(n=5).
도 4는 양전기로 하전된 티타늄 표면에 대한 향상된 알부민 흡착 A 및 세포 부착 B를 보여준다.
A 알부민 배양 전 24시간 동안 이온 처리되거나 되지 않은 다양한 티타늄 표면(새롭게 공정처리된 표면, 4주된 표면, 및 자외선 처리되어 4주된 표면)에 대한 3시간 배양 중의 알부민 흡착. 알부민 배양 배지는 pH 7 또는 3에서 조정되었다.
B 24시간의 배양중에 다양한 티타늄 표면에 부착된 인간 MSC의 양. 티타늄 표면은 패널 A와 동일한 방식으로 준비되어 처리되었다. 데이터는 평균±SD로서 보여주었다(n=3).
도 5는 새롭게 발견된 티타늄 표면에 대한 정전기 특성-조절된 단백질 및 세포 부착율을 나타내는 개략도를 보여준다. 좌측(오래된 티타늄) 및 우측(새로운 티타늄 또는 자외선 처리된 티타늄)은 세포 비친화성 및 세포 친화성 표면을 나타낸다.
도 6은 새롭게 공정처리된 티타늄 표면 및 자외선 처리된 티타늄 표면의 향상된 생물활성의 총괄을 보여준다.
A 기계가공된 티타늄 디스크 및 샌드블라스팅된 티타늄 디스크의 새롭게 공정처리되고, 1주일 되고, 자외선 처리되어 4주된 표면에 대한 6시간 배양중의 알부민 흡착율. 데이터는 평균±SD로서 보여준다(n-3).
B 기계가공된 티타늄 디스크, 산에칭된 티타늄 디스크 및 샌드블라스팅된 티타늄 디스크의 새롭게 공정처리되고, 1주 되고, 자외선 처리되어 4주된 표면에 대한 6시간 배양중의 피브로넥틴 흡착율.
C 자외선 처리되거나 되지 않은 기계가공된 임플란트에 대하여 압입 시험으로 측정한 뼈-티타늄 유착. 데이터는 평균±SD로서 보여준다(n=5).
도 7은 티타늄 표면의 자외선에 의한 골아세포 친화성을 보여준다. 티타늄의 두 가지 서로 다른 표면 형태, 즉 기계가공된 표면 및 산에칭된 표면이 준비되었다.
A 48시간의 자외선 처리 후에 얻어진 초친수성 티타늄 표면(좌측 이미지). 친수성의 변화는 다양한 시간 동안 자외선 처리한 후에 H₂O의 접촉각으로 평가하였다(선그래프).
B 48시간의 자외선 조사 후에 암흑 속에서 티타늄 표면의 초친수성 상태의 열화가 정지되었다.
C, D 자외선 예비처리되거나 되지 않은 티타늄 표면에 대한 단백질 흡착율. 알부민(C) 및 피브로넥틴(D)를 2시간, 6시간 및 24시간 동안 티타늄 표면상에서 배양하였다.
E 3시간 및 24시간 배양 후에 자외선 예비처리되거나 되지 않은 티타늄 표면에 부착된 골아세포의 상대개수를 WST-I 비색정량법으로 평가
F, G 단백질 및 골아세포에 대한 티타늄 친화성의 자외선 처리시간에 따른 변화. 티타늄 표면의 알부민 흡착율(F) 및 골아세포 부착율(G)은 자외선 예비처리 시간과 관련하여 도시되어 있다. 데이터는 패널 C-G에 대한 평균±SD로서 보여주는 것으로서(n=3), 자외선 처리된 표면과 처리되지 않은 대조 표면 간에 각각 **p<.01, *p<.05로서 통계적으로 의미가 있다.
도 8은 자외선 처리된 티타늄상의 골아세포의 초기 거동을 보여준다.
자외선 예비처리되거나 되지 않은 티타늄 표면상의 초기 골아세포 확산 및 세포골격 정렬상태. 핵에 대해서는 DAPI로(청색) 액틴 필라멘트에 대해서는 로다민 팔로이딘으로(적색) 이중 염색하여 접종하고 3시간 후에 공초점현미경 이미지(상단 패널)를 취하였다. 막대는 10μ이다. 이 이미지를 사용하여 세포 형태학적 평가를 실시하였다(바닥의 막대그래프). 데이터는 평균±SD로서 보여주며(n=6), 자외선 처리된 표면과 처리되지 않은 대조 표면 간에 *p<.05로서 통계적으로 의미가 있다.
B 배양 2일 및 5일째에 자외선 처리되거나 되지 않은 티타늄 표면상의 골아세포 밀도(하측 막대그래프). 2일째에 얻어진 세포의 형광 이미지는 세포 밀도 결과를 확인하기 위해 상단에 도시되어 있다.
C 배양 2일째에 세포당 BrdU 인코포레이션으로 평가한 티타늄 기재상의 골아세포의 세포증식활성. 데이터는 패널 B 및 C에 대한 평균±SD로도 보여주는데(n=3), 자외선 처리된 표면과 처리되지 않은 표면 간에 각각 **p<.01, *p<.05로서 통계적으로 의미가 있다.
도 9는 자외선 처리된 티타늄 표면상의 향상된 골아세포 표현형 및 촉진된 분화를 보여준다.
자외선으로 향상된 알칼리성 포스파타제(ALP) 활성, 골아세포의 초기단계 표식. 상단 패널은 10일 동안 티타늄 기재상에서 배양된 골아세포의 ALP 염의 이미지를 보여준다. 배양액 면적의 퍼센트로서 ALP 양성 면적이 도시되어있다(하단 좌측 막대그래프). 세포당 규격화된 비색분석으로 정량화된 ALP 활성도 나타나있다(하단 우측 막대그래프).
B 골아세포의 광화작용 능력(후기단계 표식). 상단 패널은 14일 동안 배양된 골아세포의 본코사(von Kossa) 광화 소괴 염색의 이미지를 보여준다. 배양면적의 퍼센트로서의 본코사 양성 면적이 도시되어 있다(하단 좌측 막대그래프). 비색분석에 기초한 방법을 사용하여 측정된 총 칼슘 침착도 도시되어있다(하단 우측 막대그래프).
C, D 기계가공된 티타늄 표면(C) 및 산에칭된 티타늄 표면(D)상의 골아세포 배양액에서의 뼈 관련 유전자 발현. 골아세포는 자외선 처리되거나 되지 않은 티타늄상에서 배양되었으며, 유전자 발현은 역전사폴리머라제연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 반정량적으로 분석하였다. 대표적인 전기영동 이미지는 상단에 도시되어 있다. GAPDH mRNA 발현에 대한 유전자 발현의 정량화된 레벨은 바닥에 나타나있다. C: 처리되지 않은 대조구. UV: 자외선 처리됨. 데이터는 패널 A-D에 대하여 평균±SD로서 보여주며(n=3), 자외선 처리된 표면과 처리되지 않은 대조 표면 간에 각각 **p<.01, *p<.05로서 통계적으로 의미가 있다.
도 10은 생체역학적 압입 시험으로 평가된 자외선으로 향상된 뼈-티타늄 유착을 보여준다. 자외선 처리되거나 되지 않은 기계가공된 임플란트 및 산에칭된 임플란트의 압입값. 데이터는 평균±SD로서 보여준다(n=5). 처리되지 않은 대조 표면과 자외선 처리된 표면 간에 **p<.01; *p<.05로서 통계적으로 의미가 있다.
도 11은 자외선으로 촉진된 임플란트 주위의 뼈 발생을 보여준다. 골드너 삼중염색(Goldner's trichrome stain)으로 염색된 산에칭된 티타늄 임플란트의 대표적인 조직 이미지가 패널 A-D에 대해서는 ×40, 패널 E-H에 대해서는 ×200, 패널 I-L에 대해서는 ×400의 원래 배율로 나타나있다. 유의할 것은 2주의 자외선 처리된 임플란트는 연조직이 뼈와 임플란트 사이에 개재되는 것을 방지하여(F에서 화살표 머리) 임플란트 표면상에 뼈가 직접 침착되게 하는(J에서 화살표 머리) 활발한 골형성과 관련된다는 것이다. 한편, 처리되지 않은 대조구 주위의 뼈들은 파편(E)으로 되어있다고 생각되며 뼈와 임플란트 표면 사이로 이동하여 뼈-임플란트 직접 접촉(I에서 화살표 머리)의 확립을 방해하는 연조직을 수반한다. 임플란트 계면 뼈 형태형성에서의 이런 차이점도 4주의 단면에서 분명하게 볼 수 있다(패널 G, H). 연조직 개재 없이 임플란트 표면을 따라서의 광범위한 뼈의 확산(패널 L에서 화살표 머리) 자외선 처리되지 않은 임플란트 주위에 표시되어 있는 반면(H, L), 처리되지 않은 임플란트 주위의 뼈는 대부분 연조직에 의해 임플란트 표면으로부터 떨어져있다(G 및 패널 K에서 화살표 머리). 뼈-임플란트 접촉의 조직형태계측값(M), 근접 구역에서의 뼈 체적(N), 원위 구역에서의 뼈 체적(O), 및 연조직 개재(P)가 도시되어 있다(n=4). 결과는 자외선 처리된 표면과 처리되지 않은 표면 간에 각각 **p<.01, *p<.05로서 통계적으로 의미가 있다.
도 12는 생물학적 효과와 관련된 티타늄의 표면특성에서 자외선으로 야기된 변화를 보여준다.
A 기계가공된 티타늄 표면 및 산에칭된 티타늄 표면과 TiO₂ 순수 금홍석 구조, 및 각각 923K 및 673K에서 가열하여 발생된 금홍석 및 예추석의 결합구조의 X선회절(XRD) 스펙트럼.
B 기계가공된 티타늄 표면 및 산에칭된 티타늄 표면의 광흡수 스펙트럼.
C 기계가공된 티타늄 표면 및 산에칭된 티타늄 표면에 대한 X선광전자분광(XPS) 스펙트럼.
D 패널 C에서 XPS Ti2p 피크의 확대도.
E-G 다양한 자외선 노출 시간후에 산에칭된 티타늄 표면의 Ti2p(E), OI(F) 및 CI(G)에 대한 XPS 프로파일의 변화.
H 여러 가지 자외선 처리 시간에 따른 산에칭된 티타늄 표면의 원자퍼센트의 변화.
I 산에칭된 티타늄 표면 상의 탄소 원자 퍼센트에 대한 3시간의 배양후의 알부민 흡착율의 도표로서 상당한 역선형 상관관계를 보여준다.
J 산에칭된 티타늄 표면상의 탄소 원자 퍼센트에 대하여 그려진 3시간 배양 후의 골아세포 부착율로서 상당한 역지수적 상관관계를 보여준다.
K, L 산에칭된 티타늄 표면상의 H₂O 접촉각에 대하여 그려진 알부민 흡착율(K) 및 골아세포 부착율(L)로서, 이들 사이에 큰 상관관계는 없다는 것으로 보여준다.
M 단백질 흡착, 및 골아세포의 부착 및 확산을 촉진하고 향상시키는 생체친화적 TiO₂ 표면의 광생성을 도시하는 제안된 TiO₂의 광기능화의 개략 설명.
도 13은 자외선으로 다양하게 처리된 티타늄 표면에 부착된 세포의 개수를 보여준다.

금속 표면을 갖는 의료용 임플란트

여기서 제시하는 것은 양전하를 갖는 금속산화물을 포함하는 금속 표면을 포함하는 의료용 임플란트이다. 금속은 티타늄, 금, 백금, 탄탈륨, 니오븀, 니켈, 철, 크롬, 코발트, 지르코늄, 알루미늄 및 팔라듐이 될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 금속 표면은 금속산화물 양이온을 포함한다.

티타늄 표면

티타늄 표면은 음전기로 하전된다고 생각되었으며, 따라서 Ca² ⁺ 같은 양이온은 티타늄 표면과 반응한다. 한편, 대부분의 단백질과 생체세포들은 생리조건하에서 음전기로 하전되며 이는 티타늄 표면과 반발할 수 있다.

티타늄 임플란트는 정형외과 및 치아 질병 및 문제에서 재건용 앵커로서 사용된다. 성공적인 임플란트 고착은 연질/연결 조직의 개입 없이 티타늄 표면상에 직접 침착된 뼈의 크기에 좌우된다. 이는 "뼈-임플란트 유착" 또는 "골유착(osseointegration)"이라고 부른다. 현재의 치과용 및 정형외과용 티타늄 임플란트는 이런 개념에 근거하여 개발되었으며 "골유착 임플란트(Osseointegrated implant)"라고 부른다. 그러나 뼈로 덮여진 전체 임플란트 부위(뼈-티타늄 접촉 퍼센트)는 45±16%, 또는 50-75%, 즉 이상적인 100% 보다 훨씬 아래를 유지한다. 대부분의 임플란트는 뼈-임플란트 계면의 불완전 확립 또는 이르거나 늦은 파괴적 변화 때문에 실패한다. 골조직이 임플란트 주위에 완전히 형성되지 않는 이유는 알려지지 않았다.

자외선으로 야기된 이산화티타늄(TiO₂)의 초친수성은 1997년에 발견되었다. 반도체산화물의 광화학 반응(초신수성 발생을 포함)은 환경 과학 및 클린에너지 과학에서 상당히 크고 넓은 관심을 받았다. 높은 친수성의 티타늄 표면의 발광은 광처리에 의해 생긴 친수성 상태의 변경된 표면 구조에 기인하는 것이다. 이 모델에서, 광처리에 의해 가교위치에서 표면 산소 공공(surface oxygen vacancy)이 생기고 그 결과 Ti⁴ ⁺ 자리가 Ti³ ⁺ 자리로 전환되는데 이는 해리성 물흡착(dissociative water adsorption)에 유리한 것이다.

본 발명자는 1) 새롭게 공정처리되거나 제조된 티타늄 표면은 양전기로 하전되며; 2) 오래된 티타늄 표면을 자외선으로 처리하면 표면이 양전기로 하전되며 새롭게 공정처리된 티타늄 표면은 양전기성이 향상되며; 3) 양전기로 하전된 표면은 친단백질 및 친세포성이며 자외선 처리 없는 오래된 티타늄 표면과 비교하여 단백질 및 세포 인력이 상당히 증가됨을 보여주며; 4) 이런 새롭게 발견되어 만들어진 단백질 및 세포 부착 기구는 단백질 및/또는 세포와 티타늄 표면 사이의 직접적인 상호작용을 가능하게 하며 Ca² ⁺ 같은 연결성 2가 양이온을 필요로 하지 않는다. 이 새로운 표면 및 생물학적 기구는 티타늄 임플란트 분야에서 인정된 생물학적 공정과는 구별될 수 있다. 단백질 흡착 및 세포 부착이 향상되기 때문에, 그 결과의 티타늄 표면은 조직 집적 및 회생 능력이 상당히 향상되는 것을 나타내는 것이 입증되었다.

자외선 처리는 진공 같은 임의의 분위기 설정 또는 불활성 가스의 추가 없이 정상적인 주위공기 조건에서 실시될 수 있다. 티타늄이나 티타늄 함유 금속을 자외선 처리하면 전자들이 티타늄 원자의 가전자대로부터 전도대로 여기되며, 결국 티타늄의 표면층에 정공이 생기고 그 표면에 양성 전하를 발생시킨다는 것을 전제로 한다. 이 전자 여기를 일어나기 하기 위해서는, 3.2eV의 자외선 에너지가 필요한데, 이는 UVA라고 부르는 대략 365nm의 파장에 해당한다. 한편, 직접적인 탄화수소 분해는 피크 파장이 260nm 미만일 때 UVC에 의해 실시된다. 이렇게 탄소를 제거하면 UVA가 티타늄 표면으로 용이하게 침투할 수 있게 되며 양전기의 발생 효율이 향상되며, 결국 발생된 양성 전하의 노출을 촉진시키고 향상시킨다.

어떤 이론에도 구속됨 없이 UVA(약 340nm 내지 약 380nm) 및 UVC(약 170nm 내지 약 270nm)의 조합이 사용되었다. 자외선 처리된 티타늄에 의해 뼈-티타늄 유착이 향상되는 정도는 상당한 것으로 증명되었다. 예를 들어, 산으로 에칭된 임플란트의 생체역학적 고착정도는 초기 치유 단계 2주에서 3배 이상까지 향상되었다. 이렇게 푸시인(push-in) 값이 3배 증가하는 것은 동일 동물 모델에서 치유 8주째에 이루어졌다. 다시 말해서, 2주에서 자외선 처리된 산에칭 임플란트에 의해 얻어진 푸시인 값은 8주에서 처리되지 않은 산에칭 임플란트에 의해 얻어진 것과 동등한데, 이는 자외선 처리된 표면이 뼈-티타늄 유착을 4배 빨리 이루었다는 것을 나타낸다. 자외선으로 향상된 티타늄은 거의 연조직의 개재 없이 뼈-티타늄 직접 접촉율에서 최적의 레벨(실질적으로 100%)의 확립을 가능하게 하였다. 이런 체내 성과는 자외선 처리된 티타늄 표면상의 다음과 같은 생물학적 과정에 기인할 수 있다: (1) 단백질 흡착성 향상, (2) 골아세포 이동성 향상, (3) 골아세포의 부착성 향상, (4) 용이한 골아세포 확산, (5) 골아세포의 증식 증가, 및 (6) 골아세포분화 촉진.

이런 과정들은 서로 독립적이거나 의존적일 수 있다. 예를 들어 단백질 흡착성 향상은 단백질과 세포 인테그린 사이의 상호작용이 향상되어 골아세포의 부착을 향상시킬 수 있다. 골아세포 증식이 증가되면 세포 대 세포 상호작용에 의한 분화를 촉진시킬 수 있다.

자외선 처리된 표면은 피브로넥틴 흡착을 증대시키기 때문에, RGD결합 인테그린을 갖는 다른 세포들도 그 표면에 끌어당겨질 수 있다. 놀랍게도, 연조직의 개재는 자외선 처리된 티탄 주위로 상당히 감소되었다.

보다 많은 뼈를 보다 신속하게 발생하기 위해서는 골아세포에서의 증식과 분화 속도 사이의 역관계가 극복되어야 한다. 이는 티타늄 임플란트 주위에 뼈가 형성되는 것에 적용된다. 예를 들어 미세하게 거칠게 된 티타늄 표면은 조직-티타늄의 기계적 교합을 향상시킬 뿐만 아니라 골아세포 분화를 촉진시켜서 보다 빠르게 뼈가 형성되게 한다는 점에서 기계가공되어 매끈한 표면에 비하여 이점들을 갖는다. 그러나 골량(bone mass)은 골아세포의 증식이 감소됨에 따라서 기계가공된 표면 주위보다 작다. 산으로 에칭되어 보다 거친 표면은 비교적 매끈한 기계가공 표면과 비교하여 세포 밀도 및 증식 활성을 감소시킨다. 기재의 표면이 보다 거칠어지면 일반적으로 세포 증식이 감소되는데, 여기서 세포내 장력은 세포 주기의 Gl 단계 발달의 지체 또는 심지어 제한과 관련될 수 있다. 자외선 처리된 표면상의 세포의 용이한 확산은 경감된 세포내 장력의 지수가 될 수 있다. 세포 증식은 세포 주기의 S단계를 대상으로 하는 BrdU 인코포레이션 분석에 의해서만 평가되었다.

세포들을 다양한 세포 주기 단계와 형상 및 세포내 장력으로 분화하기 위한 분석은 골아세포 증식을 조절하는데 있어서의 자외선 처리 표면의 역할을 특정하는데 도움이 된다. ALP 활성 및 유전자 발현의 결과에서 도시한 바와 같은 골아세포 분화 속도가 약간 향상됨을 발견하였다. 이는 자외선 처리된 표면은 분화성이 희생 없이 골아세포 증식을 증대시킬 수 있음을 나타낸다. 이 생물학적 이점들은 자외선 처리된 표면 주위의 뼈 체적이 대략 2배 증가한다는 것을 보여주는 조직형태계측(histomorphometric) 결과에서 아주 명백하였다.

자외선에 의한 세포 부착 및 증식과 뼈-임플란트 접촉 퍼센트의 향상은 예추석(anatase) TiO₂ 결정을 생성하기 위한 열처리로 침착된 티타늄 테트라이소퍼옥사이드에서 입증되었다. 본 발명은 광에 의해 야기된 생물학적 효과가 심지어 산화성 티타늄의 침착 또는 소결 없이 티타늄 표면에서도 얻어질 수 있다는 것을 밝혔다.

다른 주목할 만한 발견은 본 발명에서 얻어진 뼈-임플란트 접촉율은 예추석 TiO₂ 결정을 이용하여 얻어진 것보다 더 현저하게 증가되었다는 것인데, 여기서 24시간동안 자외선으로 처리된 임플란트는 뼈-임플란트 접촉 퍼센트가 28%이고 처리되지 않은 임플란트는 18%라는 것이 보고되었다. 본 연구에서 48시간 자외선 처리는 뼈-임플란트 접촉율을 2주간의 초기 치유 단계에서 2.5배 증가시켰다. 자외선 처리의 강도, 파장 및 기간과 사용된 티타늄의 표면화학성질의 차이는 여러 가지 생물학적 효과에 영향을 주었다. 체내 연구 이전에 기계가공된 표면과 산에칭된 표면에 초친수성을 발생시키는데 48시간의 자외선 처리가 필요하다는 것과 생물학적 효과, 예를 들어 세포부착능력은 24시간 내지 48시간 자외선 처리기간 사이에서 서서히 증가하였다는 것이 확인되었다.

단백질 흡착 및 세포 부착의 촉진 및 향상으로 나타내어지는 것 같은 광에 의한 생물학적 효과는 초친수성의 발생 및 탄소원자의 퍼센트 감소와 관련된 것이었다. 이런 물리화학적 변화가 TiO₂의 광촉매작용 현상에 기인한 것인지를 판단하기 위해, 본 연구에서 사용된 티타늄 표면의 특성을 주의 깊게 나타내었다. 사용된 티타늄 샘플에서는 300-350nm에서 흡착대가 발견되었는데, 이는 일반적으로 TiO₂ 반도체에서 볼 수 있는 것이다. XPS 스펙트럼은 기계가공 표면과 산에칭 표면에서 453.8eV에서가 아니라 대략 458.5eV에서 2P₃ _/2 피크를 나타내었으며(도 6D); Ti 및 TiO₂의 2P₃ _/2 피크는 각기 453.8eV 및 458.5eV라고 알려져 있다. 그 외에, Ti³ ⁺ 및/또는 TiO 같은 환원종에 기인한 쇼울더 피크는 어느 티타늄 디스크에 대한 저에너지 영역에서 관측되지 않았다. 이들 데이터는 이들 기재의 부근 표면이 완전히 산화되어 화학양론적 TiO₂ 박층을 형성하였으며 자외선 선량(UV dose)의 증가로 탄소 퍼센트가 감소된 것은 탄화수소의 광촉매 제거에 기인한 것이었다는 것을 나타내었다. 게다가, 2P₃ _/2 피크가 기계가공된 표면에 비하여 산에칭된 표면에서 약간 높게 이동되었음을 보여주는 이 데이터는 산에칭된 표면이 더 두꺼운 산화층으로 덮여있다는 것을 나타낼 수 있다. 이는 산에칭된 표면에 대하여 자외선에 의한 물리화학적 변화가 크다는 것을 설명할 수 있다.

초친수성 레벨이 아니라 탄화수소의 레벨은 단백질 흡착 및 세포 부착 속도와 크게 상관관계가 있다. 이런 발견에 비추어 보아 이식시에 TiO₂에 흡착된 탄화수소의 양은 골아세포의 초기 친화성 레벨을 판단하고 따라서 체내 뼈의 형태형성에서의 차이점을 명시하고 뼈-티타늄 유착의 정도를 결정하는데 매우 중요하다고 생각된다. 단백질 흡착 레벨 및 제어 티타늄 표면에 부착된 세포의 개수는 오랜 기간의 배양 후에도 자외선 처리 표면에 비하여 낮게 유지되었는데, 이는 초기의 생물학적 환경에 의해 야기된 신뢰할만한 장기간 효과를 시사한다. 현재 임상용 및 실험용으로 사용되는 티타늄 임플란트는 오염된 탄화수소를 함유하는 것으로 발견되었다. 유기분자 특히 티타늄 표면상에 카보닐 부분을 갖는 유기분자의 점차적인 축적은 주위환경하에서는 피할 수 없는 것이라고 생각된다. 이는 앞에서 설명한 바와 같이 비교적 낮은 뼈-티타늄 접촉 결과(45-75%)를 설명할 수 있다. 본 발명은 뼈-티타늄 접촉율이 티타늄 임플란트를 자외선으로 처리함으로써 거의 100%까지 향상될 수 있음을 입증하였다.

시험한 단백질 및 골아세포들은 음전기로 하전된다. TiO₂ 표면을 덮고 있는 산소함유 탄화수소가 자외선 처리에 의해 제거되었을 때, Ti⁴ ⁺ 자리가 노출된다. 이는 단백질과 세포와 이런 양이온 자리 사이의 상호작용을 촉진시킬 수 있다. 탄화수소의 광분해와 관련된 생체친화성 TiO₂ 표면의 발생은 도 6M에 개략적으로 제시되어있다.

결함율을 최소화하고, 사망률을 줄이고 수술후 기능성을 최대화하기 위해 치과 및 정형외과 분야에서 뼈임플란트 치료에 많은 노력이 있었다. 한가지 문제점은 특히 뼈-티타늄 유착 과정을 지체시키고 방해하는 재활능 및 대사활동에서 손상된 뼈와 재활용 임플란트 이식물이 마주보게 된다는 것이다. 다른 문제점은 일부 임플란트 과정에서 아크릴 뼈 시멘트를 사용하는 것이 임플란트의 생체친화성 및 장기예측을 본질적으로 한정한다는 것이다. 뼈시멘트 합병증을 피하기 위해 시멘트가 없는 이식의 경향이 있다. 이런 역학적(epidemiological), 외과적 및 사회적 문제는 보다 큰 다용성 및 보다 좋은 수명 예측성을 갖는 새로운 임플란트 치료를 개발하려는 노력들을 강하게 정당화한다. 본 발명에서 제시한 자외선을 이용하여 티타늄을 물리화학적으로 개질함에 의해 얻어지는 주된 이점은 초기 치유 단계에서 임플란트의 고착정도가 3배 세지는데 이는 뼈-티타늄 유착의 확립을 4배 촉진시키는 것에 해당한다. 골유착 능력을 향상시키는데 있어서의 자외선 효과가 기계가공된 표면과 산에칭된 표면에서 모두 증명되었다면, 이 기술의 적용은 현재 이용 가능한 티타늄 임플란트의 대부분을 포함하는 다른 표면 유형까지 확장될 수 있다고 더욱 기대된다. 이 기술은 간단하고 효율이 높으며 비용이 낮기 때문에 치과, 안면 및 정형 외과 임플란트 치료에 즉각적이고 확장적인 용도를 갖는다.

여기서 제시하는 것은 (1) 임플란트 표면을 제공하는 단계, 및 (2) 임플란트 표면을 처리하여 그 표면이 양전기로 하전되게 하거나 그 표면상의 양성 전하를 증대시키는 단계를 포함하는, 임플란트를 기능적으로 하는 방법이다. 일부 실시형태에 있어서, 이 방법은 생리적 조건하에서 양성 전하를 만들어서 증대시킨다. 생리적 조건은 약 7의 pH 값을 가질 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 이 방법은 7미만의 pH에서 또는 7보다 높은 pH에서 양성 전하를 발생하여 증대시킨다.

일 실시형태에 있어서, 임플란트는 티타늄 표면을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 임플란트는 금속 또는 비금속의 캐리어 재료를 더 포함한다. 티타늄 표면은 TiO₂를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 처리된 표면은 산화티타늄 양이온을 포함한다.

티타늄 표면상의 탄소 원자 퍼센트는 처리되지 않았거나 오래된 티타늄 표면 상의 50%보다 대략 높은 것과는 대조적으로 20%보다 낮게 감소될 수 있다.

임플란트 표면은 자외선을 그 표면에 조사함으로써 처리된다. 자외선은 자외선 램프에 의해 조사될 수 있다. 자외선은 파장이 약 10nm 내지 약 400nm가 될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 자외선은 파장이 약 170nm 내지 약 270nm 또는 약 340nm 내지 약 380nm가 될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 티타늄 표면은 파장이 약 170nm 내지 약 270nm인 자외선과 파장이 약 340nm 내지 약 380nm인 자외선의 조합 자외선을 조사함으로써 처리된다.

자외선 강도는 넓은 범위를 가질 수 있다. 예를 들어, 자외선 강도는 0.001mW/cm² 내지 100mW//cm²의 범위가 될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 자외선은 약 0.1mW/cm² 또는 약 2mW/cm²의 강도를 가질 수 있다.

자외선 처리는 48시간까지의 기간, 예를 들어 30초, 1분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 5시간, 10시간, 24시간, 36시간 및 48시간 동안 실시될 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 이 방법은 임플란트 표면을 처리하기 전에 임플란트를 공정처리하는 것을 더 포함한다. 임플란트 표면은 물리적 공정이나 화학적 공정에 의해 처리될 수 있다. 물리적 공정은 기계가공 또는 샌드블라스팅이 될 수 있다. 화학적 공정은 산이나 염기에 의한 에칭이 될 수 있다. 산은 황산이 될 수 있다. 새롭게 공정처리된 표면은 양성 전하를 가질 수 있다. 자외선 처리는 공정처리된 표면의 양전기성을 향상시킬 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 처리된 표면은 향상된 속도로 단백질과 세포들을 끌어당길 수 있다. 여기서 사용하는 "향상된 속도(enhanced rate)"는 처리된 임플란트 표면이 세포나 단백질을 끌어당기는 속도가 대응하는 처리되지 않은 임플란트 표면보다 높다는 것을 의미한다. 처리되지 않은 임플란트 표면은 새롭게 공정처리된 표면과 1일, 3일, 1주일, 2주일, 3주일, 4주일 등 같은 기간동안 공정처리되거나 시간 경과된 "오래된" 표면을 포함한다. 향상된 속도는 대응하는 처리되지 않은 표면이 단백질이나 세포를 끌어당기는 속도보다 높은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% 등이 될 수 있다.

여기서 사용하는 용어 "향상하다(enhance)"는 "개량하다(improve)" 또는 "증가하다(increase)"라는 용어와 상호 혼용할 수 있다. 향상시키는 것은 보다 빠르거나, 강하거나 양이 크게 만들어지는 것을 의미한다.

단백질은 소혈청 알부민, 분획 V, 및 소혈장 피브로넥틴이 될 수 있다. 세포는 인간의 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 골아세포(osteoblastic cell)가 될 수 있다. 단백질 또는 세포는 처리된 임플란트 표면에 직접, 예를 들어 연결성 2가 양이온 없이 부착될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 처리된 티타늄 표면은 Ca² ⁺, Mg² ⁺, Zn² ⁺ 등 같은 2가 양이온을 포함하지 않는다.

처리된 임플란트 표면은 임플란트 자리에서의 조직-임플란트 유착 및/또는 뼈-임플란트 유착을 향상시킬 수 있다. 처리된 임플란트 표면은 골형성 능력이 처리되지 않은 임플란트 표면보다 향상되었다. 처리된 표면은 조직-임플란트 유착, 뼈-임플란트 유착 또는 골형성 활성을 대응하는 처리되지 않은 표면보다 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 등 같은 퍼센트만큼 향상시킬 수 있다.

처리된 임플란트 표면은 처리되지 않은 표면에 비하여 단백질 흡착 증대, 골아세포 이동 증대, 골아세포 부착 증대, 골아세포 확산 용이, 골아세포의 증식 증대 및 골아세포 분화 촉진 중에서 하나 또는 임의의 조합을 가능하게 한다. 다양한 활성중의 각 활성은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 등 같은 퍼센트만큼 향상될 수 있다.

여기서 제시하는 것은 전술한 방법에 따라서 기능적으로 된 표면을 표면을 포함하는 임플란트이다. 일 실시형태에 있어서, 의료용 임플란트는 티타늄 표면을 포함한다. 티타늄 표면은 양전하를 담고 있는 TiO₂를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 티타늄 표면은 실질적으로 탄화수소가 없다.

임플란트는 캐리어 재료를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 캐리어 재료는 금속이다. 일 실시형태에 있어서, 캐리어 재료는 비금속이다.

임플란트 표면은 향상된 속도로 단백질 또는 세포를 끌어당길 수 있다. 여기서 사용하는 "향상된 속도"는 임플란트 표면이 세포나 단백질을 끌어당기는 속도가 양전하가 없거나 적은 표면보다 높다는 것을 의미한다. 향상된 속도는 양전하가 없거나 적은 대응 표면의 속도보다 높은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%가 될 수 있다.

임플란트 표면은 소혈청 알부민, 분획 V, 및 소혈장 피브로넥틴 같은 단백질을 끌어당길 수 있다. 임플란트 표면은 인간의 간엽줄기세포 및 골아세포 같은 세포를 끌어당길 수 있다.

임플란트 표면은 조직-임플란트 유착 및/또는 뼈-임플란트 유착을 향상시킬 수 있다. 임플란트 표면은 양전하가 없거나 적은 표면에 비하여 조직-임플란트 유착, 뼈-임플란트 유착 또는 골형성 활성을 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 등 같은 퍼센트만큼 향상시킬 수 있다.

임플란트 표면은 양전하가 없거나 적은 표면에 비하여 단백질 흡착 증대, 골아세포 이동 증대, 골아세포 부착 증대, 골아세포 확산 용이, 골아세포의 증식 증대 및 골아세포 분화 촉진 중에서 하나 또는 임의의 조합을 가능하게 한다. 다양한 활성중의 각 활성은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 등 같은 퍼센트만큼 향상될 수 있다.

여기서 제시하는 것은 향상된 생체활성을 나타내며 단백질 및 생체세포를 끌어당기는 신규의 티타늄 표면이다. 이 티타늄 표면은 양전기로 하전되어 있으며, 새로운 티타늄층을 노출시키고/노출시키거나 그 표면을 자외선으로 처리함에 의해 형성된다. 새로운 티타늄층의 노출과정은 표면을 기계가공, 에칭, 샌드블라스트 및 이들의 조합 같은 새롭게 공정처리, 및 오래된 표면의 재공정처리를 포함한다. 본 발명은 간단하고 매우 효과적이며 비용이 저렴하기 때문에 치과 및 정형외과용 임플란트와 골재생치료 분야에서 즉각적이고 넓은 용도를 갖는다.

티타늄을 자외선으로 처리하면 골전도 능력이 향상된다는 것이 발견되었다. 다양한 체외 거동에 대한 티타늄의 자외선 처리의 효과와 티타늄 기재에 대한 골아세포의 작용과 뼈-티타늄 유착의 체내 가능성과 향상된 골전도성에 관여하는 자외선 처리된 티타늄 표면상의 요인들을 검사하였다.

여기서 제시하는 것은 티타늄의 골전도 능력을 향상시키는 방법 및 이 방법을 이용하여 만들어진 골전도 능력이 향상된 티타늄 표면이다. 기계가공되고 산에칭된 티타늄 샘플은 48시간 이하의 여러 가지 시간동안 자외선으로 처리되었다. 양 표면에서 자외선 처리는 쥐의 골수 유래 골아세포의 부착, 확산, 증식 및 분화 속도와 단백질 흡착 능력을 3배까지 증대시켰다. 쥐 모델에서의 체내 조직형태계측에 의해 드러난 것은 실질적으로 연조직의 개재 없이 자외선 처리 임플란트에서 광범위하게 새로운 뼈가 형성되어 치유 4주에서 뼈-임플란트 접촉율을 거의 100%까지 최대화시킨다는 것이다.

임플란트의 생체역학적 시험으로 드러난 것은 자외선 처리가 임플란트 고착을 4배 촉진시켰다는 것이다. 단백질 흡착 및 세포 부착 속도는 TiO₂에서 자외선 선량에 반응하는 탄소 원자 퍼센트와 크게 상호 관련되고 친수성 상태와는 관련이 없다는 것이다. 이 데이터가 나타내는 것은 티타늄을 자외선 예비처리하면 TiO₂ 표면으로부터 탄화수소를 자외선 촉매작용으로 점차 제거함에 의해 골전도 능력을 상당히 향상시킨다는 것인데, 이는 티타늄을 광으로 기능화시키면 뼈-티타늄 유착을 보다 신속하고 완전하게 이룰 수 있다는 것이다.

티타늄 표면을 자외선으로 처리하면 골전도 능력을 현저하게 증대시켰다. 실질적으로 연조직의 개재 없이 자외선 처리 임플란트에서 새로운 뼈의 생성이 광범위하게 일어나서 치유 4주에 뼈-임플란트 접촉율을 거의 100%까지 최대화시키는 반면, 처리되지 않은 임플란트의 뼈-임플란트 접촉율은 대략 50%로 유지되었다. 자외선 처리는 뼈-티타늄 유착 강도를 치유 2주에서 3배 이상 향상시켰다. 자외선 처리된 표면은 골아세포의 부착, 확산, 증식 및 분화가 향상되고 단백질 흡착성 향상으로 입증된 바와 같이 골아세포와 친화적인 환경을 제공하였다. 단백질 흡착 및 세포 부착 속도는 TiO₂ 상의 자외선 선량에 따르는 탄소 원자수와 크게 관련되며 친수성 상태와는 관련이 없다. 이 티타늄 생체 활성의 자외선에 의한 향상은 기계가공되고 산으로 에칭된 표면의 여러 가지 표면 형태에서 입증되었다. 따라서, 여기서 제시하는 것은 뼈-티타늄 유착을 보다 신속하고 완전하게 이룰 수 있게 하는 티타늄의 광기능화 방법이다.

의료용 임플란트

의료용 임플란트는 금속 임플란트 또는 비금속 임플란트가 될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 의료용 임플란트는 티타늄 임플란트, 예를 들어 결손치아를 교체하거나(치과용 임플란트) 질병이 있거나 골절되거나 이식된 뼈를 고정하기 위한 티타늄 임플란트 같은 금속 임플란트이다. 다른 전형적인 금속 임플란트로는 티타늄합금 임플란트, 크롬-코발트합금 임플란트, 백금 및 백금합금 임플란트, 니켈 및 니켈합금 임플란트, 스테인레스 스틸 임플란트, 지르코늄, 크롬-코발트합금, 금 또는 금합금 임플란트 및 알루미늄 또는 알루미늄합금 임플란트를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

여기서 설명하는 금속 임플란트는 티타늄 임플란트 및 비티타늄 임플란트를 포함한다. 티타늄 임플란트는 티타늄이나 티타늄을 포함하는 합금으로 만들어진 치아 또는 뼈 대체품을 포함한다. 티타늄 뼈 대체품은 예를 들어 무릎관절 및 고관절 보철, 대퇴경부 대체품, 척추 대체품 및 수리품, 목뼈 대체품 및 수리품, 악골 수리품, 고정 및 증대품, 이식골 고정품, 및 그 외의 팔다리 보철을 포함한다. 비티타늄 금속 임플란트는 금, 백금, 탄탈륨, 니오븀, 니켈, 철, 크롬, 티타늄, 티타늄합금, 산화티타늄, 코발트, 지르코늄, 산화지르코늄, 망간, 마그네슘, 알루미늄, 팔라듐, 이들의 합금, 예를 들어 스테인레스 스틸 또는 그 조합으로 만들어진 치아 또는 뼈 임플란트를 포함한다. 합금의 일부 예는 티타놀(titanol), 크롬-코발트 합금, 스테인레스 스틸 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에 있어서, 금속 임플란트는 전술한 금속중의 어느 금속이라도 특별히 배제할 수 있다.

비금속 임플란트로는 예를 들어 세라믹 임플란트, 인산칼슘 또는 폴리머 임플란트가 포함된다. 유용한 폴리머 임플란트는 생체적합성 임플란트, 예를 들어 생분해성 폴리머 임플란트가 될 수 있다. 대표적인 세라믹 임플란트로는 예를 들어 바이오글라스 및 이산화규소 임플란트가 포함된다. 인산칼슘 임플란트에는 예를 들어 수산화인회석(hydoxyapatite), 인산삼칼슘(tricalcium phospahte; TCP)이 포함된다. 모범적인 폴리머 임플란트로는 예를 들어 폴리-락틱-코-글리콜산(poly-lactic-co-glycolic acid; PLGA)과, 폴리메타크릴레이트 및 폴리아크릴레이트 같은 폴리아크릴레이트와, 폴리유산(PLA) 임플란트가 포함된다.

일부 실시형태에 있어서, 임플란트는 금속 임플란트 및 골시멘트 재료를 포함한다. 골시멘트 재료는 기술적으로 알려진 어떤 골시멘트 재료도 될 수 있다. 일부 대표적인 골시멘트 재료로는 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)/메틸 메타크릴레이트(MMA) 같은 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트계 재료, PLA 또는 PLGA 같은 폴리에스테르계 재료, 바이오글라스, 세라믹, 인산칼슘계 재료, 칼슘계 재료, 및 그 조합이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에 있어서, 의료용 임플란트는 후술하는 어떤 폴리머도 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 여기서 설명하는 의료용 임플란트는 전술한 재료중의 어느 것도 특별히 배제할 수 있다.

"골전도능력(osteocondcutive capacity)" 또는 "골전도성(osteoconductivity)"라는 용어는 골형성 능력을 의미한다. 이는 또한 향상된 골유착 능력을 의료용 임플란트에게 부여하는 능력을 의미한다. 골유착 능력은 의료용 임플란트가 생체의 뼈 속에 유착되는 능력을 의미한다. 조직유착 능력은 의료용 임플란트가 생체의 조직 속에 유착되는 능력을 의미한다.

자외선 조사

여기서 사용하는 "자외선을 적용하다"라는 용어는 "광활성화", "광방사", "광조사", "자외선 활성화", "자외선 방사", 또는 "자외선 조사"라는 용어와 상호 교환하여 사용될 수 있다. 파장이 약 400nm 내지 10nm인 방사선은 일반적으로 자외선이라고 부른다.

의료용 임플란트는 소독하여 또는 소독 없이 방사될 수 있다. 당업자에게는 의료용 임플란트가 자외선 방사 과정중에 소독될 수 있다.

본 발명의 일 면에 따르면, 의료용 임플란트를 방사하기 위한 설비나 장치가 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 이 설비나 장치는 의료용 임플란트를 배치하기 위한 챔버, 고에너지 방사선원 및 방사를 온이나 오프로 절환하는 스위치를 포함한다. 이 설비나 장치는 타이머를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 이 설비나 장치는 의료용 임플란트 또는 자외선원을 임플란트의 완전 방사를 위해 회전 또는 선회시키기 위한 기구를 더 포함할 수 있다. 다른 방법으로서, 의료용 임플란트를 배치하기 위한 챔버는 반사면을 가져서 방사선이 여러 가지 각도로부터, 예를 들어 360도의 각도로 의료용 임플란트로 향하게 할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 설비 또는 장치는 향상된 뼈유착 능력의 보존 기구, 예를 들어 광의 다중 조사, 방사선 투과성의 임플란트 포장, 팩킹 및 수송을 포함할 수 있다.

의학적 용도

여기서 제공하는 의료용 임플란트는 의료용 임플란트를 포유류 대상물에 이식함으로써 병적상태의 증상을 치료하거나, 방지하거나, 개선하거나, 보정하거나, 감소시키는데 사용될 수 있다. 포유류 대상물은 인간 또는 개, 고양이, 말, 암소, 황소 또는 원숭이 같은 수의동물이 될 수 있다.

여기서 제시하는 임플란트를 사용하여 치료 또는 방지할 수 있는 대표적인 병적상태에는 대퇴골경부 골절, 결손치아 같은 결손치아 또는 뼈와 관련된 병적상태, 치열교정 고착의 필요성 또는 대퇴골경부 골절, 목뼈 골절, 손목 골절, 척추 골절/장해 또는 척추디스크 교체 같은 뼈와 관련된 병적상태, 무릎관절 관절염 같은 관절의 골절이나 퇴행성 변화, 예를 들어 암, 상해, 전신대사, 감염 또는 노화 같은 장해나 신체상태에 의해 야기되는 뼈 및 그 외의 조직 결손이나 후퇴 및 이들의 조합이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시형태에 있어서, 여기서 제시하는 의료용 임플란트는 결손치아, 치열교정 고착의 필요성 또는 대퇴골경부 골절, 목뼈 골절, 손목 골절, 척추 골절/장해 또는 척추디스크 교체 같은 뼈와 관련된 병적상태, 무릎관절 관절염 같은 관절의 골절이나 퇴행성 변화, 암, 상해, 전신대사, 감염 및 노화 같은 신체상태나 장해에 의해 야기되는 뼈 및 그 외의 조직의 결함, 상해 및 질병으로 인한 수족의 절단, 및 이들의 조합 같은 병적상태의 증상을 치료하거나, 방지하거나, 개선하거나, 감소시키는데 사용될 수 있다.

이상 본 발명의 특정 실시형태들을 도시하고 설명하였지만, 당업자라면 본 발명의 넓은 면에서 이탈할 없이 변형 및 수정이 가능하다는 것이 명백할 것이다. 따라서, 첨부하는 특허청구의 범위는 그 범위내에서 본 발명의 진정한 정신 및 범위 내에 속하는 이런 모든 변형 및 수정을 포함하는 것이다.

실시예

티타늄 샘플, 표면 분석 및 자외선 처리

두 가지 유형의 상업적으로 순수한 티타늄 표면을 원통형 임플란트(직경 1mm, 길이 2mm) 및 디스크(직경 20mm, 두께 1.5mm)에 대하여 준비하였다. 그 중 하나는 선반으로 선삭된 기계가공 표면을 가지며, 다른 것은 1200℃에서 75초동안 67%의 H₂SO₄로 산에칭하였다. 추가적으로 기계가공 표면과 샌드블라스팅된 표면을 준비하였다. 모든 표면은 분광광도계(UV-2200A, 일본 토쿄 시마즈사 제품) 및 X선회절법(XRD)(XRD-6100, 일본 토쿄 시마즈사 제품)으로 각각 검사하여 광학특성 및 결정구조를 결정하였다. 티타늄 표면의 친수성 상태를 접촉각 계측기(CA-X, 일본 토쿄 쿄와인터페이스사이언스사 제품)으로 측정한 1μl의 H₂O 물방울의 접촉각으로 측정하였다. 모든 과정은 200℃ 및 46% 습도의 관리상태하의 10등급 클린룸에서 실시하였다.

티타늄 표면상의 화학조성물은 화학분석용 전자분광법(ESCA)으로 평가하였다. ESCA는 높은 진공상태(6×10^-7 Pa)하의 X선전자분광법(XPS)(ESCA3200, 일본 토쿄 시마즈사 제품)을 사용하여 실시하였다. 주위조건하에서 48시간 이하의 다양한 시간동안 자외선으로 처리된 티타늄 디스크 및 원통형 임플란트를 표면특성 및 생물학적 가능성에 대하여 처리되지 않은 대조구와 비교하였다. 자외선 처리는 15 W의 살균램프(일본 토쿄 토시바사 제품); 강도; ca. 0.1 mW/cm² (UVA: λ = 360ㅁ20 nm) 및 2 mW/cm² (UVC: λ = 250ㅁ20 nm)를 사용하여 실시하였다.

티타늄 표면에 대한 활성화 능력에 대하여 UVA 및 UVC를 별도로 사용하는 것도 시험하였다.

자외선처리는 진공이나 불활성 가스 추가 같은 분위기 설정도 없이 정상적인 주위공기 조건하에서 실시할 수 있다. 티타늄이나 티타늄 함유 금속을 자외선 처리하면 전자가 원자의 가전자대로부터 전도대로 여기되어 티타늄의 표면층에 정공이 생기고 그 표면에 양성 전하가 발생된다는 것을 전제로 한다. 이렇게 전자가 여기되게 하기 위해서는, 3.2eV의 자외선 에너지가 필요한데, 이는 UVA라고 부르는 대략 365nm의 파장에 해당한다. 대조적으로 직접 탄화수소 분해는 260nm 미만의 피크 파장에서 UVC에 의해 이루어진다. 이렇게 탄소가 분해되면 UVA가 티타늄에 침투하기 쉬워지고 양전기성의 발생 효율이 향상되며 결국에는 발생된 양성 전하의 노출을 촉진시키고 향상시킨다.

어떠한 이론에도 구속됨 없이 UVA(약 340nm 내지 약 380nm) 및 UVC(약 170nm 내지 약 270nm)의 조합을 사용하였다.

단백질 흡착의 측정

소혈청 알부민, 분획 V(일리노이주, 록포드의 Pierce Biotechnology, Inc.,사 제품) 및 소혈장 피므로넥틴(미저리주, 세인트루이스의 Sigma-Aldrich사 제품)을 모델 단백질로서 사용하였다. 3000ml의 단백질 용액(1mg/ml 단백질/식염수)을 피펫을 사용하여 Ti 디스크 위에 분산시켰다. 37℃의 축축한 멸균상태에서 몇 가지 다른 기간동안 배양한 후(예를 들어, 2시간, 6시간, 24시간 또는 72시간의 배양), 부착하지 않은 단백질을 제거하고 0.9%의 염화나트륨의 식염수를 사용하여 두 번 세정하였다. 초기의 제거된 용액의 일정분량(200μl)을 마이크로비신코닉산(microbicinchoninic acid)(일리노이주 록포드 Pierce Biotechnology Inc.사 제품) 200μl와 혼합하고 37℃에서 60분간 배양하였다. 단백질의 양은 563nm에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 정량하였다.

인간 간엽줄기세포 배양액

인간 간엽줄기세포(MSC)(Poietics, 뉴저지주 이스트러더포드의 Cambrex Bio Science Walkersville사 제품)를 MSC 기초배지 및 성장보충제(SingleQuots)로 구성된 MSC 성장배지에서 배양하였다. 성장보충제는 소태아 혈청(fetal bovien serum; FBS), L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하였다. 세포는 37℃에서 95% 공기, 5% CO₂의 습기 분위기에서 배양하였다. 최종 통과의 80% 밀집도에서 0.25% 트립신-1mM EDTA-4Na를 이용하여 세포를 분리하고 3×10⁴ 셀/cm²의 밀도에서 Ti 디스크 상에 접종하였다. 배지는 3일마다 새 것으로 바꾸었다.

골아세포 배양액

8주령의 수놈 Sprague-Dawley 쥐의 대퇴골로부터 분리된 골수세포를 15% 소태아혈청, 50μg/ml 아스코르빈산, 10mM Na-β-인산글리세롤, 10^-8M 덱사메타존 및 항생-항진균 용액을 보충한 알파 개질 이글 배지(alpha-modified Eagle's medium) 속에 넣었다. 세포들은 37℃에서 95% 공기, 5% CO₂의 습기 분위기에서 배양하였다. 3×10⁴ 세포/cm²의 밀도에서 자외선 처리를 하던지 하지 않고서 80%의 밀집도에서 세포들을 0.25% 트립신-1mM EDTA-4Na를 사용하여 분리하고 기계가공이나 산에칭된 티타늄 디스크에 접종하였다. 배지는 3일마다 새 것으로 교환하였다.

이동 분석

인간의 MSC가 Ti 표면으로 이동하는 것을 이중 챔버 이동 분석(345-024K, 메릴랜드주 게이더스버그의 Trevigen사 제품)을 이용하여 검사하였다. 세포는 배지내의 상단 챔버 속에 접종하였다. Ti 디스크는 하측 챔버의 바닥에 놓았다. 8μm 직경의 기공을 갖는 폴리에스테르막을 통해 37℃에서 3시간 배양한 후에 하측 챔버속으로 침투한 세포의 퍼센트를 칼세인-AM으로 염색한 후에 플레이트 리더를 이용하여 분석하였다.

세포 부착, 밀도 및 증식 분석

배양 3시간 및 24시간 후에 티타늄 기재에 부착된 세포의 양을 측정함으로써 세포의 초기 부착을 평가하였다. 그 외에 번식된 세포들을 2일 및 5일 배양하였을 때의 세포 밀도로서 정량하였다. 이런 정량화는 WST-1계 비색정량기(WST-1, 독일 만하임의 Roche Applied Science사 제품)를 이용하여 실시하였다. 배양 세포는 100μl의 테트라졸륨염(WST-1) 시약으로 37℃에서 4시간 배양하였다. 포르마잔(formazan) 생성물의 양을 420nm에서 ELISA 리더를 이용하여 측정하였다. 또한 세포들을 형광현미경으로 관찰하여 세포 밀도 결과를 확인하기 위해 칼세인 AM으로 염색하였다.

세포들의 증식활성을 DNA 합성중에 BrdU 인코포레이션에 의해 측정하였다. 100μl의 100mM BrdU 용액(독일 만하임의 Roche Applied Science사 제품)을 배양웰에 첨가하여 10시간 동안 배양하였다. 세포들을 트립신 처리하고 DNA를 변성시킨 후에 배양액을 90분동안 페록시다제로 접합시킨 항BrdU로 배양시키고 착색을 위해 테트라메틸벤지딘과 반응시켰다. 370nm에서의 흡광도는 ELISA 리더(Synergy HT, 버몬트주 윈우스키의 BioTek Instruments사 제품)를 이용하여 측정하였다.

세포 형태 및 형태 계측

공초점 레이저 주사 현미경법을 실시하여 인간 MSC의 형태 및 세포골격 배열을 검사하였다. 배향 3시간 후에 세포를 10%의 포르말린에 고정하고 형광색소인 로다민 팔로이딘(액틴필라멘트 적색, Molecular Probes, 오레곤주)을 이용하여 착색시켰다. 또한 배양액을 마우스의 항팩실린 모노클론 항체(anti-paxillin monoclonal antibody)(메사츄세츠주 캠브리지의 Abeam사 제품)로 면역화학적으로 착색시킨 다음 FITC 접합된 항마우스 이차항체(메사츄세츠주 캠브리지의 Abeam사 제품)를 추가하였다. 화상분석기(ImageJ, 메릴랜드주 베데스다의 국립위생연구소)를 이용하여 세포 면적, 주위길이 및 페렛 직경(Feret's diameter)을 정량적으로 평가하였다.

3시간의 배양후에 골아세포를 10%의 포르말린에 고정하고 형광색소 DAPI(핵 청색, Vector, 캘리포니아주) 및 로다민 팔로이딘(액틴필라멘트 적색, Molecular Probes, 오레곤주)를 이용하여 착색시켰다. 공초점레이저주사현미경법을 사용하여 세포 형태 및 세포골격 배열을 검사하였다. 세포 면적, 주위길이 및 페렛 직경에 대한 정량적 평가는 화상분석기(ImageJ, 메릴랜드주의 베데스다의 국립위생연구소)를 사용하여 실시하였다.

알칼리성 포스파타제(ALP) 활성

배양된 골아세포의 ALP 활성을 배양면적 및 비색정량에 기초한 분석으로 검사하였다. 배양된 골아세포는 한크 용액(Hank's solution)으로 두 번 세정하고 0.9mM 나프톨 AS-MX 인산염 및 1.8mM fast red TR을 함유하는 120mM 트리스 완충액(pH 8.4)으로 37℃에서 30분간 배양하였다. 착색된 이미지의 ALP 양성 면적은 화상분석 소프트웨어(Image Pro-plus, 미국 메릴랜드주 실버스프링의 Media Cybernetics)를 이용하여 [(착색 면적/총 접시 면적)×100)](%)로서 계산하였다. 비색정량을 위해 배양액을 ddH₂O로 헹구고 250μl의 p-니트로페닐포스페이트(LabAssay ATP, 버지니아주 리치몬드의 Wako Pure Chemicals사 제품)를 첨가한 다음, 3TC에서 15분간 배양하였다. ALP활성은 효소반응을 통해 방출된 니트로페놀의 양으로서 평가하고 ELISA 리더(Synergy HT, 버몬트주 윈우스키의 BioTek Instruments사 제품)을 이용하여 405nm 파장에서 측정하였다.

광화작용 분석(Mineralization assay)

배양된 골아세포의 광화작용 능력을 광화작용된 소괴 면적 및 칼슘 비색정량에 기초한 분석으로 검사하였으며, von Kossa stain을 이용하여 골아세포의 광화작용된 소괴가 보이도록 하였다. 배양액을 50% 에탄올/18%의 포름알데히드 용액을 이용하여 30분간 고정하였다. 배양액은 자외선하에서 30분간 5% 질산은으로 배양하였다. 배양액을 ddH₂O로 두 번 세정하고 5% 티오황산나트륨 용액으로 2-5분간 배양하였다. [(착색 면전/총 접시 면적)×100)](%)로 정의된 광화작용된 소괴는 화상분석 소프트웨어(Image Pro-plus, 미국 메릴랜드주 실버스프링의 Media Cybernetics)를 사용하여 측정하였다. 칼슘 침착에 대한 비색검출을 위해 배양액을 PBS로 세정하고 완만하게 흔들면서 0.5M HCl 1ml 속에서 밤새 배양하였다. 용액은 알칼리 매체 속의 o-크레졸프탈레인 컴플렉손(칼슘 결합 및 완충 시약, 미저리주 세인트루이스의 Sigma사 제품)과 혼합하여 적색의 칼슘-크레졸프탈레인 컴플렉손 착체를 만들었다. 칼라 강도는 575nm 흡광도에서 ELISA 리더(Synergy HT, 버몬트주 윈우스키의 BioTek Instruments사 제품)에 의해 측정하였다.

유전자 발현 분석

유전자 발현은 역전사폴리머라제연쇄반응법(reverse transcription-polymerase chain reaction)(RT-PCR)을 이용하여 반정량적으로 분석하였다. 배양액중의 총 RNA를 TRIzol(캘리포니아주 칼스바드의 Invitrogen사 제품) 및 정제탑(RNeasy, 캘리포니아주 발렌시아의 Qiagen사 제품)을 사용하여 추출하였다. DNAse I 처리 후에 oligo(dT) 프라이머(캘리포니아주 칼스바드의 Clontech사 제품)의 존재하에서 MMLV 역전사효소(캘리포니아주 칼스바드의 Clontech사 제품)를 사용하여 o.5μg의 총 RNA의 역전사를 실시하였다. 미리 확정된 PCR 조건 및 프라이머 설계를 이용하여 콜라겐 I, 오스테오폰틴 및 오스테오칼신 mRNA을 검출하기 위해 이미 Taq DNA 폴리머라제(EX Taq, 위스콘신주 메디슨의 Takara Bio사 제품)를 사용하여 PCR반응을 실시하였다. 에티듐 브로마이드 염색으로 1.5% 한천겔상에서 PCR 생성물을 보이도록 하였다. 자외선하에서 밴드강도를 검출하여 정량화하고 GAPDH mRNA를 참조하여 규격화하였다.

외과수술

8주령의 수놈 Sprague-Dawley 쥐를 1-2%의 이소플루란 흡입제로 마취시켰다. 쥐의 다리를 면도하고 10%의 프고비돈-이오딘 용액으로 문지른 후에 대퇴골의 원위면(distal aspect)을 피부절개 및 근육해부를 통해 주의 깊게 노출시켰다. 말단 대퇴골의 평면을 임플란트 이식용으로 선택하였다. 임플란트 자리는 0.8mm의 둥근 천공기로 드릴링하여 대퇴골의 말단가장자리로부터 9mm 준비하고 리머(#ISO 090 및 100)를 사용하여 확장시켰다. 냉각 및 세정을 위해 무균 등장식염수용액으로 충분하게 세정하였다. 하나의 원통형 임플란트를 대퇴골의 각 측면 속에 배치하였다. 그리고 수술자리를 층을 이루어 폐쇄시켰다. 근육과 피부를 별도로 재흡수 가능한 봉합사로 봉합하였다. 캘리포니아대학 로스엔젤스교(UCLA)의 Chancellor's Animal Research Committee는 이 순서를 승인하였으며 모든 실험들은 미국농무부(USDA)의 동물연구 가이드라인에 따라서 실시하였다.

임플란트 생체역학적 압입 시험

임플란트 생체역학적 압입시험은 뼈-임플란트 유착의 생체역학적 강도를 평가하기 위해 사용하였으며 다른 곳에도 설명되어있다. 원통형 임플란트를 포함한 대퇴골을 적출하여 상단면이 임플란트 레벨이 되도록 하여 상온중합수지(auto-poymerizing resin) 속에 매립하였다. 임플란트가 임플란트의 측면 및 바닥면으로부터 피질골을 지지하지 않는 것을 확인하기 위해 MicroCT를 사용하였다. 200N 부하셀(load cell) 및 압입봉(직경=0.8mm)을 구비한 시험기(Instron 5544 전자기계 시험시스템, 메사츄세츠주 칸톤의 Instron사 제품)을 사용하여 1mm/분의 크로스헤드 속도로 임플란트를 수직 하방으로 로드하였다. 압입값은 부하-변위 곡선의 피크를 측정함으로써 결정되었다.

조직 준비

산에칭된 임플란트를 포함한 대퇴골을 적출하여 4℃에서 2주간 10% 완충 포르말린에 고정하였다. 피검사물을 상승계열의 알콜 린스 속에서 탈수시키고 탈회(decalcification) 없이 광경화 에폭시 수지(Technovit 7200VLC, 독일 베르하임의 Hereaus Kulzer사 제품) 속에 매립하였다. 매립된 피검사물을 임플란트의 선단부로부터 0.5mm의 위치에서 원통형 임플란트의 종축선에 수직하게 톱질 절단하였다. 피검사물을 연마시스템(독일 노르데스테트의 Exakt Apparatebau사 제품)으로 두께 30μm까지 연마하였다. 단면들을 골드너 삼중염색(Goldner's trichrome stain)으로 착색하고 광학현미경으로 관찰하였다.

조직형태계측

컴퓨터에 의한 조직형태계측 측정을 위해 컴퓨터 디스플레이 상의 40배율 렌즈 및 4배 줌을 사용하였다(Image Pro-plus, 메릴랜드주 실버스프링의 Media Cybernetics사 제품). 조직 구조의 상세를 확인하기 위해 400× 이하의 현미경 배율을 사용하였다. 임플란트관련뼈 및 비임플란트관련뼈 사이를 구별하는 임플란트 조직형태계측을 미리 입증하였다. 이 방법에 의거하여 임플란트를 둘러싸는 조직들을 다음과 같이 (i) 근접 구역, 임플란트 표면의 50μm 내의 원주 구역; 및 (ii) 원위 구역, 임플란트 표면의 50μm 내지 200μm의 원주 구역으로 분할하였다. 다음의 변수들을 분석하였다:

뼈-임플란트 접촉율(%)=(뼈-임플란트 접촉 길이의 합계)/(임플란트의 원주)×100, 여기서 임플란트-뼈 접촉율은 연조직이 전혀 개재되지 않고 뼈조직이 임플란트 표면의 20μm 내에 위치하는 계면으로 정의하였다.

근접 구역에서의 뼈체적(%)=(근접 구역에서의 뼈면적)/(근접 구역의 면적)×100

원위 구역에서의 뼈체적(%)=(뼈와 임플란트 사이에 개재되는 연조직의 길이 합계)/(임플란트를 둘러싸는 뼈 길이의 합계)×100

통계적 분석

10개의 세포 샘플을 필요로 하는 세포 형태계측의 평가를 제외하고는 세포 배양 연구에 대하여 3개의 샘플을 사용하였다. 자외선 처리의 유무에 따라서 여러 시간의 Ti 표면 및 배양 시간의 영향을 검사하기 위해 2방향 ANOVA를 실시하였다. 필요에 따라서 사후 본페로니(Bonferroni) 시험을 실시하여 새롭게 처리된 표면, 4주가 된 표면 그리고 자외선 처리되어 4주가 된 표면 사이의 차이를 검사하였는데, p<0.05는 통계적으로 중요하다고 생각되었다. 단지 한 시점에서만 데이터를 이용할 수 있는 경우, 일방향 ANOVA를 사용하여 실험군 사이의 차이를 검사하였다. 또한 T 테스트를 사용하여 처리되지 않은 대조군과 자외선 처리군 사이의 차이를 검사하였다. 알부민 흡착과 세포 부착 사이의 상관관계, 및 탄소의 원자 퍼센트 및 H₂O 접촉각을 검사하고, 최소자승평균 근사(least-squares mean approximation)에 의해 회귀식을 결정하였다.

결과

1. 새롭게 처리된 티타늄 표면 및 자외선 처리된 티타늄 표면에 대한 단백질 흡착 촉진 및 향상

이방향 ANOVA가 보여준 것은 시험된 실험군들, 즉 새롭게 공정처리되어 산에칭된 표면(공정처리 직후), 4주된 표면(즉, 4주간 저장), 자외선 처리되어 4주된 표면 사이에서 알부민 흡착율이 상당히 변화하였다(p<0.01; 도 1A). 2시간의 배양 후에 배양액 속에 배양된 알부민의 대략 10%만이 4주된 Ti 표면에 흡착된 반면, 알부민의 대략 60%가 새로운 표면에 흡착되었다(p<0.01; 본페로니). 알부민 흡착량은 72시간의 배양 후에도 새로운 표면에서보다 4주된 표면에서 40% 적었다(p<0.01). 자외선처리된 1주된 표면은 2시간 및 24시간 배양 후에 새롭게 공정처리된 표면과 동등한 알부민 흡착정도를 보여주었으며, 72시간 후에는 더 큰 정도를 나타내었다(p<0.05).

2. 새롭게 공정처리된 티타늄 표면 및 자외선 처리된 티타늄 표면에서 줄기세포 이동 및 부착 향상

8μm 구멍을 통해 이동한 인간 간엽줄기세포의 개수는 배양조건 사이에서 상당히 변하였다(p<0.01, 1방향 ANOVA; 도 1B). 3시간의 배양중에 4주된 표면으로 이동한 세포의 개수는 새롭게 공정처리된 표면에서 관찰된 개수의 50% 그리고 자외선 처리된 4주된 표면에서 관찰된 개수의 25%였다(p<0.01). 4주된 표면은 새로운 표면보다 2배 큰 세포 이동을 보여주었다(p<0.01).

Ti 표면에 부착된 인간 MSC의 개수는 다음 순서로 증가하였다: 자외선 처리되어 4주된 표면>새롭게 공정처리된 표면>4주된 표면(p<0.01; 이방향 ANOVA; 도 1C). 4주된 표면에 부착된 세포의 개수는 새롭게 공정처리된 표면에 대하여 50% 미만이었다. 자외선 처리되어 4주된 표면은 24시간에서 새롭게 처리된 표면보다 상당히 높은(120% 이상) 세포 부착성을 보여주었다(p<0.01).

3. 새롭게 공정처리된 Ti 표면 및 자외선 처리된 Ti 표면에서의 세포 확산 및 세포골격 발달 촉진

액틴 필라멘트(로다민 팔로이딘) 염색된 인간 MSC를 3시간 배양한 후에 찍은 저배율 이미지는 자외선 처리되어 4주된 표면에서 세포의 개수가 최대이고 4주된 표면에서 최소가 되어 세포 부착성 분석의 결과를 지지한다는 것을 보여주었다(도 2A). 액틴 염색된 고배율 이미지는 새롭게 공정처리된 표면 및 자외선 처리되어 1주된 표면에서 여러 방향으로 공정처리가 확장되어 세포가 분명하게 큰 반면 4주된 표면에서는 세포골격 발달이 거의 없으며 둥근 형태로 유지되었다는 것을 보여주었다. 팍실린(paxillin)의 강력한 국소화로 인하여 새롭게 공정처리된 표면 및 자외선 처리되어 4주된 표면에서는 세포구조를 따라서 세포 부착 및 유착을 조절하는 단백질이 세포 내에서 관찰되었다. 특히 자외선 처리되어 4주된 표면에서 세포 내에는 치밀한 세포질의 명확한 염색이 보였다.

면적, 주위 길이 및 페렛 직경의 세포형태계측 평가에 의해 3개의 Ti 기재 사이의 이들 변수에서 상당한 차이를 입증하였다(ANOVA, p<0.01; 도 2B). 이들 변수들은 4주된 표면 보다 새롭게 공정처리된 표면 및 자외선 처리된 표면에서 5배 내지 8배 컸다(본페로니, p<0.01). 새롭게 공정처리된 표면과 자외선 처리된 표면 사이에 큰 차이점은 없었다.

4. 새롭게 공정처리된 티타늄 표면 및 자외선 처리된 티타늄 표면에 대한 체내 뼈-티타늄 유착 향상

임플란트 고착의 체내 정착은 부하를 지지하는 장치로서 티타늄 임플란트의 임상 능력을 결정하는데 가장 중요한 요인이다. 티타늄 임플란트의 체내 안정성을 쥐 모델에서 확립된 생체역학적 임플란트 압입 시험을 이용하여 검사하였다. 원통형 임플란트를 쥐 대퇴골 속에 넣었다. 2주의 조기 치유단계에서 생체 모델에서 쥐의 압입값에 의해 측정된 뼈-티타늄 유착 강도는 1주된 표면과 비교하여 새롭게 공정처리된 표면과 자외선 처리된 표면에서 각각 2.8배 및 3.1배 급증하였다(p<0.01; 도 3).

도 3은 생체역학적 압입 시험으로 평가하여 4주된 표면과 비교하여 새롭게 공정처리된 티타늄 표면 및 자외선처리되어 산에칭된 티타늄 표면에서 뼈-티타늄 유착이 향상된 것을 보여준다.

5. 새롭게 공정처리된 티타늄 및 자외선 처리된 티타늄의 양전기로 하전된 표면은 단백질을 끌어당긴다

도 4A는 배지 내의 여러 가지 pH 조건에서 다양하게 준비된 티타늄 표면에 대한 알부민 흡착을 보여준다. pH 7에서 처리되지 않고 4주된 표면에는 한정된 양의 알부민이 흡착되었는데, 그 개수는 10-15%였다. 이는 통상적으로 이용할 수 있는 티타늄의 표면과 알부민이 이런 생리적 pH에서 음으로 하전되어 티타늄-알부민 상호작용을 방지한다는 사실로부터 예측할 수 있었다. 1주된 표면을 알부민 배양 전에 CaCl₂ 같은 2가 양이온으로 처리된 경우에만 알부민 흡착이 증가하였다. 이는 2가 칼슘 양이온이 1가의 음전기 티타늄 표면에 침착될 때 음전기 알부민 분자와 티타늄 표면 사이에서 가교 역할을 한다는 것으로 설명되었다.

한편, 앞에서 설명한 바와 같이 새롭게 공정처리된 표면과 자외선 처리된 표면은 4주된 표면과 비교하여 pH 7에서 >35% 또는 >55%의 높은 흡착율을 나타내었다. 그러나, pH 3으로 준비된 배지에서 이들 표면에 대한 단백질 흡착은 4주된 표면만큼 낮게 유지되었다. 알부민의 등전위 pH는 4.7-4.9이기 때문에, 알부민은 중성-염기성 전이를 받고 pH 3 같이 낮은 pH에서 양전기로 하전되는 한편, 알부민은 중성-산성 전이를 받고 pH 7 같이 높은 pH에서 음전기로 하전된다는 것이 알려져 있다. 이는 새롭게 공정처리된 티타늄 표면과 자외선 처리된 티타늄 표면이 양전기로 하전된다는 것을 지시하며 환경 pH 값에 따라서 다른 단백질 인력 특성을 나타낸다. 또한 이틀 표면의 양전기 특성은 이들 표면을 NaCl 및 CaCl₂ 용액 같은 1가 음이온으로 처리하면 이들 표면의 현재 양전기성을 중성화시켰으며 결국 처리되지 않은 4주된 표면의 기준 레벨과 비교하여 알부민 흡착의 증가가 없었다는 것을 보여주는 시험으로 확인되었다.

새롭게 공정처리된 티타늄 표면 및 자외선 처리된 티타늄 표면은 심지어 pH 3에서 그리고 이런 이온처리 후에도 양전하 및 낮은 정도의 표면 탄소를 유지할 수 있다. 이는 표면의 양전하고 주로 단백질 흡착 같은 티타늄 표면의 생물활성을 조절하여 초친수성 및 탄소 레벨의 효과를 대신한다는 것을 지시한다.

6. 새롭게 공정처리된 티타늄 및 자외선 처리된 티타늄의 양전기로 하전된 표면이 세포를 끌어당긴다.

도 4B는 도 4A와 동일한 방식으로 준비된 다양한 티타늄 표면에 부착된 인간 간엽줄기세포(MSC)의 양을 보여준다.

이 실험은 생리적 pH 7에서 실시되었다. 4주된 표면에 부착된 세포의 개수는 공히 음전기로 하전된 티타늄 표면과 세포 사이의 반발력 때문에 한정되었다는 것이 예상되었다. 한편, 새롭게 공정처리된 표면과 자외선 처리된 표면에는 4주된 표면보다 더 많은 개수의 세포가 부착되었다. 새롭게 공정처리된 표면과 자외선 처리된 표면에 부착된 세포의 개수는 이들 표면을 Cl^- 같은 음이온으로 처리한 후에 처리되지 않은 4주된 표면의 기준 레벨까지 감소하였다. 생체 세포는 음전기로 하전된다는 공지의 사실을 고려하면, 새롭게 공정처리된 티타늄 및 자외선 처리된 티타늄의 표면은 양전기로 하전되고 따라서 세포-티타늄 상호작용이 향상된다는 것이 입증되었다.

새롭게 공정처리된 티타늄 표면과 자외선 처리된 티타늄 표면은 심지어 pH 3 조건에서 그리고 이온 처리 후에도 음전하 및 낮은 레벨의 표면 탄소를 유지할 수 있다. 이는 표면 양전하가 주로 단백질 흡착 및 세포 부착 같은 티타늄 표면의 생물활성을 조절하여 초친수성 및 탄소 레벨의 효과를 대신한다는 것을 지시한다.

티타늄 표면에 대한 단백질 및 세포 부착 메카니즘은 도표(도 5)에 설명되어있다. 패널의 좌측(오래된 Ti)은 티타늄 표면 주위에서 발생한 메카니즘을 보여준다. 이 메카니즘에서 세포의 부착은 단백질의 RGD 순서를 통해 음전기 단백질 그리고 세포를 흡착하기 위해 Ca² ⁺ 같은 2가 양이온에 의해 가교되어야 한다. 또한 여기서 유의하여야 할 것은 Na⁺ 및 K⁺ 같은 1가 양이온의 경쟁적인 결합이 Ca² ⁺ 결합에 필요한 티타늄 표면의 음이온 자리를 차단한다는 것이다. 그 결과, 티타늄 표면에 부착될 수 있는 세포의 개수가 제한된다.

우측(새로운 Ti 및 자외선 처리된 Ti)의 메카니즘은 티타늄 표면이 세포 반발에서 세포 당김으로 전환된 현재의 시험 결과에 근거한 새로운 메카니즘을 나타낸다. 새롭게 공정처리된 표면과 자외선 처리된 표면상의 정전기 양전하 때문에 음전기로 하전된 단백질 및 세포들은 2가 양이온의 도움 없이도 직접 티타늄 표면에 부착하여 보다 많은 개수의 세포가 표면에 부착된다.

7. 새롭게 공정처리된 티타늄 표면 및 자외선 처리된 티타늄 표면의 높은 단백질 및 세포 친화성의 총괄

산에칭된 티타늄 표면 외에도 기계가공된 티타늄 표면 및 샌드블라스팅된 티타늄 표면을 새롭게 공정처리된 표면 및 자외선 처리된 표면의 가능한 이점에 대하여 시험하였다(도 6A). 4주된 표면들은 각각의 표면군을 갖는 새롭게 준비된 표면과 비교하여 단지 20-45%의 알부민 부착율을 보여주었다. 4주된 Ti 표면을 자외선 처리하면 기계가공에 의해 새롭게 공정처리된 표면과 동등한 레벨까지 또는 샌드블라스팅에 의해 새롭게 공정처리된 표면보다 높은 레벨까지 흡착율을 증가시켰다(p<0.05).

피브로넥틴 흡착율에서도 유사한 경향이 발견되었다(도 6B). 흡착율은 시험된 3개의 모든 표면 형태에서 자외선 처리되어 4주된 Ti, 새롭게 공정처리된 Ti 및 4주된 Ti의 순서로 높았다(p<0.01).

기계가공된 티타늄을 사용하여 뼈-티타늄 유착의 체내 달성을 시험하였다. 자외선 처리되고 기계가공된 표면은 치유 2주 및 4주에서 뼈-티타늄 유착의 강도가 상당히 증가함으로 나타내었다(p<0.05; 도 6C).

이들 결과들은 새롭게 공정처리된 티타늄 표면과 자외선 처리된 티타늄 표면의 생물학적 이점들은 여러 가지 표면 공정처리에 대하여 보편적이며 여러 가지 단백질에 대하여 효과적이다.

8. 티타늄의 광생성 초친수성

티타늄 디스크를 48시간 동안 자외선 처리한 후에, 기계가공된 표면과 산에칭된 표면에서 각각 53.5° 및 88.4°였던 H₂O 방울의 접촉각은 0°로 급감하였는데, 이는 소수성 표면이 초친수성 표면으로 전환되었다는 것을 지시한다(도 7A). 초친수성은 산에칭된 표면에서 보다 급속하게 발생하였다. 산에칭된 표면은 1시간의 자외선 처리를 필요로 한 반면, 기계가공된 표면은 48시간이 필요하였다(도 7A). 48시간 다음에 산에칭된 표면에 대하여 자외선 조사 초친수성 상태가 보다 긴 시간동안 지속되었으며, H₂O의 0°접촉각은 암흑 속에서 7일 동안 유지되었다(도 7B). 한편, 기계가공된 표면에서는 초친수성이 바로 사라지기 시작하였다.

9. 티타늄의 자외선으로 향상된 단백질 흡착 능력

양 표면 유형(기계가공 및 산에칭된 표면)에 대하여 자외선 처리는 알부민 및 피브로넥틴의 흡착을 촉진시켰다(도 7C, 도 7D). 예를 들어, 2시간의 배양 후에 <10%였던 알부민 흡착율은 48시간의 자외선 처리 후에 티타늄 표면에서 50-60%까지 증가하였다(p<0.01)(도 7C). 자외선으로 향상되는 효과는 양 단백질에서 기계가공된 표면에서보다 산에칭된 표면에서 더 컸다(p<0.01). 처리되지 않은 표면상에 흡착된 단백질의 양은 24시간의 배양 후에도 자외선 처리된 표면에서 발견된 것보다 적었는데, 이는 자외선 처리가 단백질 흡착율을 대략 100% 만큼 촉진 및 증가시킨다는 것을 지시하는 것이다(도 7C, 도 7D).

10. 자외선 처리된 티타늄에 대한 골아세포 부착성 향상

3시간의 배양 후에 자외선 처리된 표면에 부착된 세포의 개수는 기계가공된 표면과 산에칭된 표면에서 처리되지 않은 대조 표면보다 3배 내지 5배 많았다(도 7E). 세포 부착성에서 자외선으로 야기되는 이점은 24시간 후에도 존재하였다.

11. 생물학적 효과의 자외선 선량 의존성

자외선으로 촉진된 단백질 흡착율 및 골아세포 부착율을 확인하기 위해, 단백질 흡착율 및 골아세포 부착성의 자외선 선량 의존성을 검사하였다. 산에칭된 티타늄 표면을 48시간 이하의 여러 가지 시간동안 자외선 처리하였다. 자외선 적용량은 단백질 흡착율 및 세포 부착 능력에 다르게 영향을 주었다(도 7F, 도 7G). 알부민 흡착율의 증가는 급속하였으며 1시간이 자외선 처리 후에 포화되었다. 세포 부착율은 자외선 처리 시간이 48시간까지 증가함에 따라서 계속하여 상당히 증가하였다(p<0.01).

12. 자외선 처리된 티타늄상의 골아세포 증식 향상 및 확산 용이성

기계가공된 대조 티타늄 표면상에서의 골아세포의 확산 및 골격세포 발달은 접종 3시간 후에 기계가공 공정으로부터 회전된 흔적을 따라서 등방성이 된다고 생각되었다. 이들 세포에서는 세포 돌기들이 거의 발달되지 않았다. 한편, 자외선 처리되어 기계가공된 표면상의 세포들은 여러 방향으로 발달된 성장부(philopodia) 같은 세포 돌기를 나타내었다(도 8A의 이미지). 세로들은 분명하게 컸으며, 세포돌기들은 처리되지 않고 산에칭된 표면에서보다 자외선 처리되고 산에칭된 표면에서 보다 크게 신장되었다. 세포의 면적, 주위 길이 및 페렛 직경에 대한 형태학적 평가에 의해 자외선 처리된 티타늄 표면에 대한 이들 변수의 값이 보다 크다는 것을 보여주었다(도 8A의 막대그래프).

세포 밀도는 배양일 2일 및 5일에서 기계가공된 표면유형 및 산에칭된 표면유형에서 처리되지 않은 표면에서보다 자외선 처리된 티타늄 표면에서 일관되게 컸는데(도 8B의 막대그래프), 이는 칼세인 염색 후에 세포의 형광이미지와 일치하였다(도 8B의 상단 이미지). 배양 2일에서 세포당 BrdU 인코포레이션은 자외선 처리된 표면에 더 높았는데, 이는 골아세포 증식이 향상되었다는 것을 확실하게 하는 것이다(도 8C).

13. 자외선 처리된 티타늄상에서의 골아세포 표현형 향상

10일 째에 각각의 대조 표면과 비교하여 자외선 처리되고 기계가공된 표면과 산에칭된 표면에서 배양액중의 2배이상의 면적이 ALP 양성이었다(도 9A의 상단 이미지 및 하단 좌측 막대그래프). 그 외에 세포의 개수에 의해 선택적으로 정량화되고 규격화된 ALP 활성은 자외선 처리되지 않은 티타늄 표면에서 상당히 높았다(도 9A의 하단 우측 막대그래프).

배양 14일 및 28일 째, 본코사 염색(von Kossa stain)에 의해 검출된 광화작용된 소괴의 면적도 자외선 처리된 티타늄 표면에서 더 컸는데, 이 효과는 산에칭된 표면에서 보다 큰데, 이는 14일 째에 120%의 향상을 나타낸다(도 9B의 상단 이미지 및 하단 좌측 막대그래프). 총 칼슘 침착 결과는 본코사 결과와 일치하였다(도 9B의 하단 우측 막대그래프). RT-PCR 분석은 전체 배양기간을 통해 콜라겐 I, 오스테오폰틴 및 오스테오칼신의 발현이 자외선 처리를 한 배양액과 하지 않은 배양액 사이에 유사하였거나 일부 시점에서 자외선 처리된 표면에서 <30%만큼 상향 조절되었음을 보여주었다(도 9C, 도 9D).

14. 자외선으로 향상된 체내 임플란트 고착

2주의 초기 치유단계에서 압입 값으로 측정된 뼈-티타늄 유착의 강도는 자외선 처리로 인하여 기계가공된 표면과 산에칭된 표면에서 각각 1.8배 및 3.1배 급증하였다(도 10). 치유 후기 단계(4주)에서 자외선 처리된 임플란트에 대한 골유착 강도는 기계가공된 표면과 산에칭된 표면에서 처리되지 않은 임플란트보다 각각 50% 및 60%만큼 우월함을 유지하였다.

15. 자외선 처리된 임플란트 주위의 뼈 형태 형성

2주 째에 대조 임플란트와 자외선 처리되고 산에칭된 임플란트에서 임플란트 표면으로부터 비교적 먼 영역에 직조형의 미숙한 외관을 갖는 골조직이 형성되었다(도 11A 및 도 11B). 임플란트 표면에 인접한 영역을 검사하여 두 임플란트 사이에 골형태 형성 차이점이 발견되었다. 골형성은 처리되지 않은 임플란트 주위에서 보다 광범위하게 발생하였다(도 11E, 도 11F). 다른 주목할만한 차이점은 연조직에 의한 개재 정도였다. 처리되지 않은 대조 임플란트 주위의 일부 골조직은 뼈와 임플란트 사이에 개재된 연조직과 연결되어 있었는데(도 11I), 이는 자외선 처리된 임플란트 주위에서는 좀처럼 관찰되지 않았다(도 11J). 4주 째에 처리되지 않은 대조 표면의 일부는 여전히 뼈와 임플란트 사이에 개재된 섬유성 결합조직을 나타내는 반면(도 11C, 도 11G, 도 11K), 자외선 처리된 임플란트는 직접 침착된 뼈로 거의 완전히 둘러싸였다(도 11D, 도 11H, 도 11L).

뼈의 조직형태계측으로 인하여 자외선 처리되고 산에칭된 임플란트에 대한 뼈-임플란트 접촉 퍼센트는 대조 임플란트의 것보다 일관되게 컸다(2주에 2.5배, 4주에 1.9배)는 것이 밝혀졌다(도 11M). 뼈-임플란트 접촉 퍼센트는 자외선 처리된 표면에서 98.2%였다. 임플란트 표면에 대한 근접 구역의 뼈 체적도 대조 임플란트보다 자외선 처리된 임플란트에서 컸으며(도 11N), 반면 원위 구역에서 자외선에 의한 뼈 체적의 차이는 없었는데, 이는 임플란트 표면에 인접한 영역에 특유한 자외선으로 인한 뼈 발생을 지시하는 것이다(도 11O). 자외선 처리에 의해 연조직 개재 퍼센트가 상당히 감소하는 것을 알게 되었다(도 11P). 자외선 처리된 표면은 4주에서 뼈-임플란트 계면으로부터 연조직을 거의 완전하게 차단한 반면, 처리되지 않은 표면 주위의 뼈의 >20%는 2주 및 4주에서 티타늄 계면에 개재되는 연조직을 수반하였다.

16. 티타늄 및 골아세포상의 탄소 원소와 단백질 인력 사이의 역상관관계

XRD분석으로 보여준 것은 기계가공된 표면 및 산에칭된 표면은 둘 다 예추석 및 금홍석형 TiO₂ 결정에서 일반적으로 볼 수 있는 25° 및 28°에서의 피크를 전혀 나타내지 않았다는 것이다. 이는 단지 Ti 금속에 기인한 회절패턴만을 보여주었다(도 12A). 그러나 양 티타늄 디스크에 대한 자외선-VIS 흡착 스펙트럼은 300-350nm에서 흡착대를 보여주었다(도 12B). 산에칭된 표면의 흡수 가장자리는 기계가공된 표면보다 약간 긴 파장 영역에 있었다.

X선광전자분광법(XPS) 스펙트럼은 양 티타늄 표면에서 Ti2p, OI 및 CI의 피크를 보여주었지만 다른 피크는 보여주지 않았는데, 이는 이들 원소 이외의 불순물 오염이 없다는 것을 지시한다(도 12C). Ti2p의 좁은 스펙트럼은 대략 458.5eV에서 명확한 2p₃ _/2 피크를 나타냈으며 저에너지 영역에서 쇼울더 피크는 없었다(도 12D). 2p_3/2 피크는 기계가공된 표면과 비교하여 산에칭된 표면에서 높은 정도로 약간 이동하였다.

산에칭된 티타늄 표면의 화학적 분석을 실시하여 향상된 생물활성에 관여하는 요인들을 확인하였다. XPS 스펙트럼은 CI 피크가 자외선 처리 시간의 증가에 따라서 감소한 반면 Ti2p 및 OI 피크는 증가하였다는 것을 나타내었다(도 12E, 도 12F, 도 12G). 특히 TiO₂ 표면에 강하게 흡착된 산소함유 탄화수소에 기인한 약 288eV에서의 쇼울더 피크가 사라졌다. 탄소 원자 퍼센트는 자외선 처리 48시간까지 >50%에서 <20%까지 계속하여 감소하였다(도 12H). 최소자승근사법에 의해 탄소 원자 퍼센트와 티타늄 표면에 흡착된 알부민의 양 사이의 음의 선형 상관관계가 나왔으며 결정계수는 높았는데(R²=0.930), 즉 티타늄 표면상의 탄소가 적을수록 많은 알부민이 표면에 흡착되었다(도 12I). 골아세포 부착율은 다른 패턴의 회귀곡선을 만들었는데, 즉 탄소의 단계적 제거에 따라서 지수함수적으로 증가하였다(도 12J). 접촉각은 알부민 흡착율 또는 세포 부착율과 크게 상관되지 않았다(도 12K, 도 12L).

17. UVA 및 UVC 조합을 효과적으로 사용하여 표면 양성전하를 생성하고 세포를 끌어당긴다

도 13에 도시한 바와 같이, UVA 및 UVC 광원을 모두 사용하면 UVA만을 사용하거나 UVC만을 사용하는 것과 비교하여 세포 부착 개수를 가장 증가시켰다.

참고문헌

1. Campion, E. W., Jette, A. M., Cleary, P. D. & Harris, B. A. Hip fracture: a prospective study of hospital course, complications, and costs. J Gen Intern Med 2, 78-82 (1987).

2. Guccione, A. A., Fagerson, T. L. & Anderson, J. J. Regaining functional independence in the acute care setting following hip fracture. Phys Ther 76, 818-26 (1996).

3. Bhandari, M. et al. Predictors of in-hospital mortality following operative management of hip fractures. Int J Surg Investig 1, 319-26 (1999).

4. Melton, L. J., 3rd et al. Fractures attributable to osteoporosis: report from the National Osteoporosis Foundation. J Bone Miner Res 12, 16-23 (1997).

5. Espehaug, B., Furnes, 0., Havelin, L. L, Engesaeter, L. B. & Vollset, S. E. The type of cement and failure of total hip replacements. J Bone Joint Surg Br 84, 832-8 (2002).

6. Hudson, J. I. et al. Eight-year outcome associated with clinical options in the management of femoral neck fractures. Clin Orthop Relat Res, 59-66 (1998).

7. Lu-Yao, G. L., Keller, R. B., Littenberg, B. & Wennberg, J. E. Outcomes after displaced fractures of the femoral neck. A meta-analysis of one hundred and six published reports. J Bone Joint Surg Am 76, 15-25 (1994).

8. Tidermark, J., Ponzer, S., Svensson, O., Soderqvist, A. & Tornkvist, H. Internal fixation compared with total hip replacement for displaced femoral neck fractures in the elderly. A randomised, controlled trial. J Bone Joint Surg Br 85, 380-8 (2003).

9. Ravikumar, K. J. & Marsh, G. Internal fixation versus hemiarthroplasty versus total hip arthroplasty for displaced subcapital fractures of femur― 13 year results of a prospective randomised study. Injury 31, 793-7 (2000).

10. Tidermark, J., Zethraeus, N., Svensson, O., Tornkvist, H. & Ponzer, S. Quality of life related to fracture displacement among elderly patients with femoral neck fractures treated with internal fixation. 2002. J Orthop Trauma 17, S 17-21 (2003).

11. LeGeros, R. Z. & Craig, R. G. Strategies to affect bone remodeling: osteointegration. J Bone Miner Res 8 Suppl 2, S583-96 (1993).

12. Puleo, D. A. & Nanci, A. Understanding and controlling the bone-implant interface. Biomaterials 20, 2311-21 (1999).

13. Pilliar, R. M. Cementless implant fixation― toward improved reliability. Orthop Clin North Am 36, 113-9 (2005).

14. Ozawa, S. et al. Ovariectomy hinders the early stage of bone-implant integration: histomorphometric, biomechanical, and molecular analyses. Bone 30, 137-43 (2002).

15. Yamazaki, M. et al. Bone reactions to titanium screw implants in ovariectomized animals. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 87, 411-8 (1999).

16. Takeshita, F., Murai, K., Ayukawa, Y. & Suetsugu, T. Effects of aging on titanium implants inserted into the tibiae of female rats using light microscopy, SEM, and image processing. J Biomed Mater Res 34, 1-8 (1997).

17. Zhang, H., Lewis, C. G., Aronow, M. S. & Gronowicz, G. A. The effects of patient age on human osteoblasts' response to Ti-6A1-4V implants in vitro. J Orthop Res 22, 30-8 (2004).

18. Geertman, M. E. et al. Two-center clinical trial of implant-retained mandibular overdentures versus complete dentures-chewing ability. Community Dent Oral Epidemiol 24, 79-84 (1996).

19. Carlsson, G. E. & Lindquist, L. W. Ten-year longitudinal study of masticatory function in edentulous patients treated with fixed complete dentures on osseointegrated implants. Int J Prosthodont 7, 448-53 (1994).

20. Pera, P., Bassi, F., Schierano, G., Appendino, P. & Preti, G. Implant anchored complete mandibular denture: evaluation of masticatory efficiency, oral function and degree of satisfaction. J Oral Rehabil 25, 462-7 (1998).

21. van Kampen, F. M., van der BiIt, A., Cune, M. S., Fontijn-Tekamp, F. A. & Bosnian, F. Masticatory function with implant-supported overdentures. J Dent Res 83, 708-11 (2004).

22. Nowjack-Raymer, R. E. & Sheiham, A. Association of edentulism and diet and nutrition in US adults. J Dent Res 82, 123-6 (2003).

23. Heydecke, G., McFarland, D. H., Feine, J. S. & Lund, J. P. Speech with maxillary implant prostheses: ratings of articulation. J Dent Res 83, 236-40 (2004).

24. Melas, F., Marcenes, W. & Wright, P. S. Oral health impact on daily performance in patients with implant-stabilized overdentures and patients with conventional complete dentures. Int J Oral Maxillofac Implants 16, 700-12 (2001).

25. van Steenberghe, D., Jacobs, R., Desnyder, M., Maffei, G. & Quirynen, M. The relative impact of local and endogenous patient-related factors on implant failure up to the abutment stage. Clin Oral Implants Res 13, 617-22 (2002).

26. Nevins, M. L., Karimbux, N. Y., Weber, H. P., Giannobile, W. V. & Fiorellini, J. P. Wound healing around endosseous implants in experimental diabetes. Int J Oral Maxillofac Implants 13, 620-9 (1998).

27. Doundoulakis, J. H., Eckert, S. E., Lindquist, C. C. & Jeffcoat, M. K. The implant-supported overdenture as an alternative to the complete mandibular denture. J Am Dent Assoc 134, 1455-8 (2003).

28. Annual industry report. US markets for dental implants: Executive summary. Implant Dent 12, 108-111 (2003).

29. Ellingsen, J. E. A study on the mechanism of protein adsorption to TiO2. Biomaterials 12, 593-6 (1991).

30. Klinger, A., Steinberg, D., Kohavi, D. & SeIa, M. N. Mechanism of adsorption of human albumin to titanium in vitro. J Biomed Mater Res 36, 387-92 (1997).

31. Ogawa, T. et al. Biomechanical evaluation of osseous implants having different surface topographies in rats. J Dent Res 79, 1857-63 (2000).

32. Ray NF, Chan JK, Thamer M, Melton LJ, 3rd. Medical expenditures for the treatment of osteoporotic fractures in the United States in 1995 : report from the National Osteoporosis Foundation. J Bone Miner Res 1997;12:24-35.

33. Jones LC, Hungerford DS. Cement disease. Clin Orthop Relat Res 1987: 192- 206.

34. Espehaug B, Fumes O, Havelin LI, Engesaeter LB, Vollset SE. The type ofcement and failure of total hip replacements. J Bone Joint Surg Br 2002;84:832-8.

35. Bhandari M, Koo H, Saunders L, Shaughnessy SG, Dunlop RB, Schemitsch EH. Predictors of in-hospital mortality following operative management of hip fractures. Int J Surg Investig 1999; 1:319-26.

36. Lamade WR, Friedl W, Schmid B, Meeder PJ. Bone cement implantation syndrome. A prospective randomised trial for use ofantihistamine blockade. Arch Orthop Trauma Surg 1995;114:335-9.

37. Takeshita F, Murai K, Ayukawa Y, Suetsugu T. Effects of aging on titanium implants inserted into the tibiae of female rats using light microscopy, SEM, and image processing. J Biomed Mater Res 1997;34: 1-8.

38. Nowjack-Raymer RE, Sheiham A. Association of edentulism and diet and nutrition in US adults. J Dent Res 2003;82: 123-6.

39. Weinlaender M, Kenney EB, Lekovic V, Beumer J, 3rd, Moy PK, Lewis S. Histomorphometry of bone apposition around three types of endosseous dental implants. Int J Oral Maxillofac Implants 1992;7:491-6.

40. Berglundh T, Abrahamsson I, Albouy JP, Lindhe J. Bone healing at implants with a fluoride-modified surface: an experimental study in dogs. Clin Oral Implants Res 2007; 18: 147-52.

41. Ogawa T, Nishimura I. Different bone integration profiles of turned and acid- etched implants associated with modulated expression of extra cellular matrix genes. Int J Oral Maxillofac Implants 2003;18:200-10.

42. De Maeztu MA, Braceras I, Alava JJ, Gay-Escoda C. Improvement of osseointegration of titanium dental implant surfaces modified with CO ions: a comparative histomorphometric study in beagle dogs. Int J Oral Maxillofac Surg 2008;37:441-7.

43. Moy PK, Medina D, Shetty V, Aghaloo TL. Dental implant failure rates and associated risk factors. Int J Oral Maxillofac Implants 2005;20:569-77.

44. Esposito M, Hirsch JM, Lekholm U, Thomsen P. Failure patterns of four osseointegrated oral implant systems. J Mater Sci Mater Med 1997;8:843-7.

45. Chuang SK, Wei LJ, Douglass CW, Dodson TB. Risk factors for dental implant failure: a strategy for the analysis of clustered failure-time observations. J Dent Res 2002;81:572-7.

46. Wang R, Hashimoto K, Fujishima A. Light-induced amphiphilic surfaces. Nature 1997; 388:431-32.

47. Keleher J, Bashant J, Heldt N, Johnson L, Li YZ. Photo-catalytic preparation of silver-coated TiO2 particles for antibacterial applications. World J Microb Biot 2002;18: 133-39.

48. Nakashima T, Ohko Y, Kubota Y, Fujishima A. Photocatalytic decomposition of estrogens in aquatic environment by reciprocating immersion of TiO2-modified polytetrafluoroethylene mesh sheets. J Photoch Photobio A 2003;160: 115-20.

49. Saruwatari L, Aita H, Butz F, Nakamura HK, Ouyang J, Yang Y; et al. Osteoblasts generate harder, stiffer, and more delamination-resistant mineralized tissue on titanium than on polystyrene, associated with distinct tissue micro-and ultrastructure. J Bone Miner Res 2005;20:2002-16.

50. Ogawa T, Ozawa S, Shih JH, Ryu KH, Sukotjo C, Yang JM, et al. Biomechanical evaluation of osseous implants having different surface topographies in rats. J Dent Res 2000;79:1857-63.

51. Stein GS, Lian JB. Molecular mechanisms mediating proliferation/differentiation interrelationships during progressive development of the osteoblast phenotype. Endocr Rev 1993;14:424-42.

52. Siddhanti SR, Quarles LD. Molecular to pharmacologic control of osteoblast proliferation and differentiation. J Cell Biochem 1994; 55:310-20.

53. Alborzi A, Mac K, Glackin CA, Murray SS, Zernik JH. Endochondral and intramembranous fetal bone development: osteoblastic cell proliferation, and expression of alkaline phosphatase, m-twist, and histone H4. J Craniofac Genet Dev Biol 1996;16:94-106.

54. Owen TA, Aronow M, Shalhoub V, Barone LM, Wilming L, Tassinari MS, et al. Progressive development of the rat osteoblast phenotype invitro:reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formation of the bone extracellular matrix. J Cell Physiol 1990;143:420-30.

55. Ogawa T, Sukotjo C, Nishimura I. Modulated bone matrix-related gene expression is associated with differences in interfacial strength of different implant surface roughness. J Prosthodont 2002; 11 :241 -7.

56. Takeuchi K, Saruwatari L, Nakamura HK, Yang JM, Ogawa T. Enhanced intrinsic biomechanical properties of osteoblastic mineralized tissue on roughened titanium surface. J Biomed Mater Res A 2005 ;72A:296-305.

57. Bachle M, Kohal RJ. A systematic review of the influence of different titanium surfaces on proliferation, differentiation and protein synthesis of osteoblast- like MG63 cells. Clin Oral Implants Res 2004;15:683-92.

58. Zhao G, Schwartz Z, Wieland M, Rupp F, Geis-Gerstorfer J, Cochran DL, et al. High surface energy enhances cell response to titanium substrate microstructure. J Biomed Mater Res A 2005;74:49-58.

59. Boyan BD, Bonewald LF, Paschalis EP, Lohmann CH, Rosser J, Cochran DL, et al. Osteoblast mediated mineral deposition in culture is dependent on surface microtopography. Calcif Tissue Int 2002;71:519-29.

60. Washburn NR, Yamada KM, Simon CG, Jr., Kennedy SB, Amis EJ. High- throughput investigation of osteoblast response to polymer crystallinity: influence of nanometer-scale roughness on proliferation. Biomaterials 2004;25: 1215-24.

61. Zapata P, Su J, Garcia Al, Meredith JC. Quantitative high-throughput screening of osteoblast attachment, spreading, and proliferation on demixed polymer blend micropatterns. Biomacromolecules 2007;8:1907-17.

62. Huang S, Chen CS, Ingber DE. Control of cyclin Dl, p27(Kipl), and cell cycle progression in human capillary endothelial cells by cell shape and cytoskeletal tension. MoI Biol Cell 1998;9:3179-93.

63. Sawase T, Jimbo R, Baba K, Shibata Y, Ikeda T, Atsuta M. Photo-induced hydrophilicity enhances initial cell behavior and early bone apposition. Clin Oral Implan Res 2008; 19:491-96.

64. Buser D, Broggini N, Wieland M, Schenk RK, Denzer Al, Cochran DL, et al. Enhanced bone apposition to a chemically modified SLA titanium surface. J Dent Res 2004;83:529-33.

65. Massaro C, Rotolo P, De Riccardis F, Milella E, Napoli A, Wieland M, et al. Comparative investigation of the surface properties of commercial titanium dental implants. Part I: chemical composition. J Mater Sci Mater Med 2002;13:535-48.

66. Takeuchi M, Sakamoto K, Martra G, Coluccia S, Anpo M. Mechanism of photoinduced superhydrophilicity on the TiCh photocatalyst surface. J Phys Chern B 2005;109:15422-28.

67. Kikuchi L, Park JY, Victor C, Davies JE. Platelet interactions with calcium- phosphate-coated surfaces. Biomaterials 2005;26:5285-95.

68. Uetsuka H, Onishi H, Henderson MA, White JM. Photoinduced redox reaction coupled with limited electron mobility at metal oxide surface. J Phys Chern B 2004; 108:10621-24.

69. Henderson MA, White JM, Uetsuka H, Onishi H. Selectivity changes during organic photooxidation on TiCh: Role of 0-2 pressure and organic coverage. J Catal 2006;238:153-64.

70. Kojima N, Ozawa S, Miyata Y, Hasegawa H, Tanaka Y, Ogawa T. High- throughput gene expression analysis in bone healing around titanium implants by DNA microarray. Clin Oral Implants Res 2008; 19: 173-81.

71. Brunski JB, Puleo DA, Nanci A. Biomaterials and biomechanics of oral and maxillofacial implants: current status and future developments. Intl Oral Maxillofac Implants 2000;15:15-46.

72. Sykaras N, Iacopino AM, Marker VA, Triplett RG, Woody RD. Implant materials, designs, and surface topographies: their effect on osseointegration. A literature review. Int J Oral Maxillofac Implants 2000;15:675-90.

73. Ogawa T, Nishimura I. Genes differentially expressed in titanium implant healing. J Dent Res 2006;85:566-70.

74. Shalabi MM, Gortemaker A, Van't HofMA, Jansen JA, Creugers NH. Implant surface roughness and bone healing: a systematic review. J Dent Res 2006;85:496-500.

Claims

금속 표면을 포함하는 의료용 임플란트로서, 상기 금속 표면은 양전하를 갖는 금속산화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 의료용 임플란트.
제 1 항에 있어서, 상기 금속은 티타늄, 백금, 탄탈륨, 니오븀, 니켈, 철, 크롬, 코발트, 지르코늄, 알루미늄, 및 팔라듐으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 의료용 임플란트.
제 1 항에 있어서, 상기 금속 표면은 실질적으로 탄화수소가 없는 것을 특징으로 하는 의료용 임플란트.
제 1 항에 있어서, 상기 임플란트는 캐리어 재료를 포함하는 것을 특징으로 하는 의료용 임플란트.
제 1 항에 있어서, 상기 임플란트 표면은 금속산화물 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 의료용 임플란트.
제 5 항에 있어서, 상기 금속산화물 양이온은 산화티타늄 양이온인 것을 특징으로 하는 의료용 임플란트.
제 1 항에 있어서, 상기 임플란트 표면은 단백질이나 세포를 향상된 속도로 끌어당길 수 있는 것을 특징으로 하는 의료용 임플란트.
제 7 항에 있어서, 상기 세포는 인간 간엽줄기세포 및 골아세포로 구성된 군에서 선택되며, 상기 단백질은 소혈청 알부민, 분획 V 및 소혈장 피브로넥틴으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 의료용 임플란트.
제 7 항에 있어서, 상기 단백질이나 세포는 임플란트 표면에 직접 부착하는 것을 특징으로 하는 의료용 임플란트.
제 1 항에 있어서, 상기 임플란트 표면은 조직-임플란트 유착 및/또는 뼈-임플란트 유착을 향상시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 의료용 임플란트.
제 1 항에 있어서, 상기 임플란트 표면은
단백질 흡착 증대,
골아세포 이동 증대,
골아세포 부착 증대,
골아세포 확산 증대,
골아세포 증식 증대 및
골아세포 분화 증대
중의 어느 것 또는 조합이 가능한 것을 특징으로 하는 의료용 임플란트.
의료용 임플란트를 기능적으로 하는 방법으로서,
(1) 금속 임플란트 표면을 제공하는 단계, 및
(2) 임플란트 표면을 처리하여 그 표면이 양전기로 하전되게 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 처리된 표면은 단백질 및/또는 세포를 향상된 속도로 끌어당기는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 표면은 티타늄 표면인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 티타늄 표면은 TiO₂를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 처리된 표면은 실질적으로 탄화수소가 없는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 임플란트는 캐리어 재료를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 임플란트 표면을 처리하는 단계 전에 임플란트 표면을 공정처리하는 단계를 더 포함하며, 상기 임플란트 표면은 화학적 에칭, 기계가공 또는 샌드블라스팅에 의해 공정처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 임플란트 표면은 자외선으로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 공정처리된 표면은 자외선으로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 상기 자외선은 약 170nm 내지 약 270nm 및 약 340nm 내지 약 380nm로 구성된 군에서 선택된 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 상기 표면은 약 170nm 내지 약 270nm의 파장의 자외선 및 약 340nm 내지 약 380nm의 파장의 자외선의 조합으로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 상기 자외선에 의한 처리는 48시간 이하의 시간에 걸쳐 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 자외선에 의한 처리는 30초, 1분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 3시간, 5시간, 10시간, 15시간, 24시간, 36시간 및 48시간으로 구성된 군에서 선택된 시간에 걸쳐 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 처리된 표면은 금속산화물 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서, 상기 금속산화물 양이온은 산화티타늄 양이온인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 세포는 인간 간엽줄기세포 및 골아세포로 구성된 군에서 선택되며, 상기 단백질은 소혈청 알부민, 분획 V 및 소혈장 피브로넥틴으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 단백질이나 세포는 처리된 임플란트 표면이 직접 부착하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 처리된 임플란트 표면은 처리되지 않은 임플란프 표면보다 조직-임플란트 유착 및/또는 뼈-임플란트 유착이 개량되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 처리된 임플란트 표면은 처리되지 않은 임플란트 표면보다 골형성 능력이 개량되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 처리된 임플란트 표면은,
처리되지 않은 임플란트 표면보다 단백질 흡착 향상,
골아세포 이동 증대,
골아세포 부착 증대,
골아세포 확산 증대,
골아세포 증식 증대, 및
골아세포 분화 증대
중의 어느 것 또는 조합이 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항 내지 제 31 항 중의 어느 항의 방법을 포함하는 뼈-임플란트 유착 또는 골형성을 향상시키는 방법.