KR20220077974A

KR20220077974A - 가시광 매개 골형성 촉진 조성물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20220077974A
Application number: KR1020200166518A
Authority: KR
Inventors: 오승한; 최은주; 문경숙; 박영범
Original assignee: 원광대학교산학협력단; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2022-06-10

Abstract

본 발명은 골형성 촉진 조성물에 대한 것으로, 금속 산화물 나노튜브; 상기 금속 산화물 나노튜브 상에 형성된 금속 나노입자;를 포함하며, 상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브는 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수한 것이다. 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브가 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수함으로써 골형성능이 촉진되어 임플란트, 골이식재, 골조직 재생재 등에 응용될 수 있다.

Description

가시광 매개 골형성 촉진 조성물 및 이의 제조 방법{VISIBLE LIGHT MEDIATED COMPOSITION FOR PROMOTING OSTEOGENESIS AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은 골형성 촉진 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브가 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수함으로써 골형성능이 촉진되어 임플란트, 골이식재, 골조직 재생재 등에 응용될 수 있다.

임플란트(implant) 또는 스캐폴드(scaffold)는 생체 내에 매식되어 소기의 기능을 발휘하는 생체 매식용 의료기구이다. 따라서 임플란트 또는 스캐폴드는 반복되는 하중 및 순간적인 압력에도 견딜 수 있는 기계적 강도를 지니고 있어야 함은 물론, 생체 친화성(biocompatibility), 화학적 적합성(chemical compatibility) 등의 조건을 만족해야 한다.

따라서 임플란트 또는 스캐폴드 재료 중 현재 가장 많이 사용되고 있는 재료는 생체적합성이 뛰어난 티타늄과 일부의 티타늄 합금 등이다. 티타늄은 비중이 낮아서 다른 금속재료에 비해 상대적으로 가볍지만 다른 금속과의 합금으로 제조되거나 적절한 처리과정을 거치면 강도가 향상될 수 있고 또한 공기 중이나 수중에서 매우 치밀하고 재형성 능력이 뛰어난 부동태 산화 피막을 형성하여 매우 큰 부식저항성을 갖는다. 또한, 골 내에 매식되었을 때 골과의 유착(osteointegration)이 일어나는 장점이 있으므로 현재 임플란트 또는 스캐폴드의 소재로서 가장 널리 사용되고 있다.

이러한 뛰어난 기계적 특성, 화학적 안정성, 생체적합성 등의 특성을 갖는 티타늄 및 그의 합금은 정형외과 및 치과영역에서 사용되는 임플란트 또는 스캐폴드로 널리 사용이 되고 있다. 하지만, 임플란트 또는 스캐폴드와 골 조직 간의 불충분한 결합이 임플란트 또는 스캐폴드를 느슨하게 하고 결국에는 임플란트 또는 스캐폴드의 이식 실패에 이르게 된다. 티타늄 표면과 골 조직사이의 골 융합을 향상시키기 위해, 칼슘 포스페이트 또는 히드록시아파타이트 코팅, 생체분자, 단백질, 표면 지형의 제어를 통한 표면 개질과 기능화에 대한 다양한 방법들이 개발이 되어 왔다. 최근에는 조골세포의 기능을 향상시키기 위해, 콜라젠 젤, 스폰지, 피브노젠, 키토산 등을 이용한 골형성 성장인자 BMP-2 (Bone morphogenic protein-2) 전달시스템이 개발되어 왔다. 하지만, 이러한 약물전달체 중에 몇몇은 BMP-2가 단기간에 빠른 약물 방출과 초기에 갑작스런 방출되는 문제점을 나타내었다.

정형외과 또는 치과 영역의 임플란트 또는 스캐폴드의 이식 실패에 대한 또 다른 주요 원인은 금속표면에 대한 박테리아의 감염과 관련이 되어 있다. 일반적인 티타늄 임플란트는 삽입하는 동안 환자 자신의 피부 또는 점막으로부터 유래하는 박테리아에 감염이 되기 쉽다. 임플란트 표면에 박테리아가 부착되어 성장을 하면, 박테리아 세포는 두꺼운 생체필름을 형성하게 되고, 이는 숙주방어 메커니즘과 투여된 항생제의 확산/침투를 막는 주요 장애물 역할을 한다. 이러한 박테리아 감염은 임플란트의 실패의 원인이 되며, 임플란트 제거에 따른 추가 비용과 함께 환자의 질병을 악화시킬 수 있다.

공개특허공보 KR 제10-2011-0102362호

본원은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해서, 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브가 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수함으로써 골형성능이 촉진되어 임플란트, 골이식재, 골조직 재생재 등에 응용될 수 있다. 또한, 400 nm 내지 500 nm의 파장을 흡수함으로써 항균효과가 발현된다.

상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 골형성 촉진 조성물은 금속 산화물 나노튜브; 상기 금속 산화물 나노튜브 상에 형성된 금속 나노입자;를 포함하며, 상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브는 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수한 것이다.

상기 골형성 촉진 조성물 100 중량부에 있어서, 상기 금속 나노입자가 10 중량부 내지 30 중량부로 포함되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 금속 산화물 나노튜브의 직경은 30 nm 내지 100 nm인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 금속 산화물 나노튜브는 티타늄, 텅스텐, 아연, 니오븀, 지르코늄 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 금속을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 금속 나노입자는 금, 백금, 팔라듐, 은 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 귀금속을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 증가시키는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 골형성 촉진 조성물의 제조 방법은 금속 시트를 산화 및 열처리하여 금속 산화물 나노튜브를 성장시키는 단계; 상기 금속 산화물 나노튜브 상에 금속 나노입자를 형성하는 단계; 및 상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브 상에 가시광선을 조사하는 단계;를 포함한다.

상기 금속 나노입자를 형성하는 단계는 이온 플라즈마 스퍼터링에 의해 수행되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 가시광선은 550 nm 내지 650 nm의 파장인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 임플란트는 금속 산화물 나노튜브; 상기 금속 산화물 나노튜브 상에 형성된 금속 나노입자;를 포함하며, 상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브는 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수한 것을 특징으로 한다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.

개시된 기술은 다음의 효과를 가질 수 있다. 다만, 특정 실시예가 다음의 효과를 전부 포함하여야 한다거나 다음의 효과만을 포함하여야 한다는 의미는 아니므로, 개시된 기술의 권리범위는 이에 의하여 제한되는 것으로 이해되어서는 아니 될 것이다.

전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 본원에 따른 골형성 촉진 조성물은 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브가 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수하여 저레벨 레이저 치료 효과(Low-level laser treatment, LLLT) 및 광열 효과(photothermal effect)가 발현되어 중간엽 줄기세포의 골형성을 촉진시키는 것 일 수 있다.

또한, 종래에는 항균약물을 담지한 금속 산화물이 광조사에 의해서 상기 항균약물을 원하는 시점에 용출하는 기술이었으나, 본 발명의 상기 골형성 촉진 조성물은 항균약물 없이, 400 nm 내지 500 nm의 파장을 조사하는 것 만으로 항균효과가 나타난다. 본원의 골형성 촉진 조성물은 항균효과 또한 발현되기 때문에 박테리아에 의한 감염을 방지하여 임플란트의 성공 확률을 높일 수 있다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 골형성 촉진 조성물의 제조 방법의 순서도이다.
도 2의 (a) 내지 (c)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 FE-SEM(Field-emission scanning electron microscope) 이미지이다.
도 3의 (a) 내지 (c)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 FE-SEM(Field-emission scanning electron microscope) 이미지이다.
도 4의 (a) 및 (b)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 TEM(Transmission Electron Microscope) 이미지이다.
도 5의 (a) 및 (b)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 UV-Vis-NIR 스펙트럼이다.
도 6의 (a) 내지 (d)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 XPS(X-ray photoelectron spectroscopy) 그래프이다.
도 7은 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물 상에 연쇄상구균을 배양했을 때의 사진이다.
도 8은 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물 상에 연쇄상구균을 배양했을 때의 집락형성능(colony forming units, CFUs)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물 상에 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)를 배양 후 칼세인 AM(calcein acetoxymethyl) 및 EtD-1(ethidium homodimer-1)을 염색했을 때의 형광이미지이다.
도 10은 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물 상에 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)를 배양했을 때의 MTT assay 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물 상에 배양된 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)의 사상위족의 FE-SEM(Field-emission scanning electron microscope) 이미지이다.
도 12의 (a) 및 (b)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 ALP 활성을 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 ALP 발현을 분석한 그래프이다.
도 14는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 OPN 발현을 분석한 그래프이다.
도 15는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 BSP 발현을 분석한 그래프이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용한다. 제 1, 제 2등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소도 제 1 구성요소로 명명될 수 있다. "및/또는" 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다.

일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미가 있는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않아야 한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에", "상부에", "상단에", "하에", "하부에", "하단에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

이하에서는 본원의 골형성 촉진 조성물 및 이의 제조 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

본원은, 금속 산화물 나노튜브; 상기 금속 산화물 나노튜브 상에 형성된 금속 나노입자;를 포함하며, 상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브는 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수한 골형성 촉진 조성물에 관한 것이다.

상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브는 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수하여 저레벨 레이저 치료 효과(Low-level laser treatment, LLLT) 및 광열 효과(photothermal effect)가 발현되어 중간엽 줄기세포의 골형성을 촉진시키는 것 일 수 있다.

상기 저레벨 레이저 치료 효과는 550 nm 내지 650 nm의 파장 영역에서 세포분화 촉진효과가 나타나는 것이다.

상기 광열 효과가 발현될 경우, 상기 금속 산화물 나노튜브에서 열이 발생되고 상기 열이 세포로 전달되어 퍼컬레이션(percolation)이 용이해진다. 이에 따라 세포 배지 내에 성장 인자 또는 분화 촉진물 등이 쉽게 침투되어 골형성을 촉진시키는 것 일 수 있다.

상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브는 400 nm 내지 500 nm의 파장을 흡수함으로써, 항균효과가 발현되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

종래에는 항균약물을 담지한 금속 산화물이 광조사에 의해서 상기 항균약물을 원하는 시점에 용출하는 기술이었으나, 본 발명의 상기 골형성 촉진 조성물은 항균약물 없이, 400 nm 내지 500 nm의 파장을 조사하는 것 만으로 항균효과가 나타난다.

본원의 골형성 촉진 조성물은 항균효과 또한 발현되기 때문에 박테리아에 의한 감염을 방지하여 임플란트의 성공 확률을 높일 수 있다.

상기 금속 나노입자는 상기 금속산화물 나노튜브의 표면뿐만 아니라 상기 금속산화물 나노튜브의 내부에 침투되어 형성되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

ALP는 유골(osteoid) 형성과 무기질화(mineralization)에 중요한 역할을 하는 효소로 뼈 특이적 ALP는 골형성을 촉진하는 기능을 가진 오스테오칼신 막당단백질이며, 골아세포 활성도의 마커로 잘 알려져 있다. 특히 ALP는 피로인산염(석회화 위치에서 결정화 억제제) 뿐만 아니라 유기인산 에스테르(무기 인산염 농도 증가)를 분해한다. 혈청에서 전체 ALP는 다양한 조직(간, 뼈, 장, 비장, 신장, 태반)에서 유래한 여러 2합체 형(dimericisoform)으로 구성되어 있다. 그러나 건강한 성인에서는 혈청 ALP의 50%는 간에서, 나머지 50%는 뼈로부터 얻어진다.

상기 조성물은 오스테오폰틴(osteopontin, OPN), 본시알로프로틴(bone sialoprotein, BSP)의 유전자 발현을 증가시켜 골형성을 촉진하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 금속 나노입자가 10 중량부 미만 또는 30 중량부 초과로 포함될 경우, 550 nm 내지 650 nm의 파장에 대한 흡수도가 낮아질 수 있다.

상기 금속 산화물 나노튜브의 직경이 30 nm 미만 100 nm초과일 경우, 550 nm 내지 650 nm의 파장에 대한 흡수도가 낮아질 수 있다.

상기 금속 산화물 나노튜브의 종횡비는 1:1 내지 1:50인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 금속 산화물 나노튜브는 바람직하게는 티타늄을 포함하는 것 일 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 금속 산화물 나노튜브가 티타니아(TiO-₂)인 것 일 수 있다.

더욱 바람직하게는 상기 금속 나노입자는 금 또는 백금인 것 일 수 있다.

본 발명은 금속 시트를 산화 및 열처리하여 금속 산화물 나노튜브를 성장시키는 단계; 상기 금속 산화물 나노튜브 상에 금속 나노입자를 형성하는 단계; 및 상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브 상에 가시광선을 조사하는 단계;를 포함하는 골형성 촉진 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 골형성 촉진 조성물의 제조 방법의 순서도이다.

먼저, 금속 시트를 산화 및 열처리하여 금속 산화물 나노튜브를 성장시킨다(S100).

상기 금속 시트는 티타늄, 텅스텐, 아연, 니오븀, 지르코늄 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 금속을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 산화는 양극산화공정에 의하여 산화되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 열처리는 300℃ 내지 500℃의 온도 하에서 이루어지는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 열처리 온도가 500℃ 초과일 경우, 상기 금속 산화물 나노튜브가 파괴되는 것 일 수 있다.

상기 열처리는 1시간 내지 6시간동안 수행되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 열처리 과정에서 상기 금속 산화물 나노튜브의 결정화가 이루어지는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이어서, 상기 금속 산화물 나노튜브 상에 금속 나노입자를 형성한다(S200).

상기 금속 나노입자를 상기 이온 플라즈마 스퍼터링에 의해 형성함으로써, 상기 금속 나노입자가 상기 금속 산화물 나노튜브의 표면뿐만 아니라 내부에도 형성되는 것 일 수 있다. 또한, 상기 금속 산화물 나노튜브의 방향성에 따라 상기 금속 나노입자가 형성되어 상기 금속 나노입자는 막대형태로 형성될 수 있다. 상기 금속 나노입자가 막대형태 또는 나노튜브 형태로 형성됨으로써 광열효과가 나타나는 것 일 수 있다.

이어서, 상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브 상에 가시광선을 조사한다(S300).

상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브 상에 중간엽 줄기세포를 배양하고 550 nm 내지 650 nm의 파장을 조사하였을 때, 상기 중간엽 줄기세포의 골형성능이 촉진된다.

본원의 골형성 촉진 조성물의 제조 방법에 대하여, 본원의 골형성 촉진 조성물과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 골형성 촉진 조성물에 기재된 내용은 골형성 촉진 조성물의 제조 방법에 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명은 금속 산화물 나노튜브; 상기 금속 산화물 나노튜브 상에 형성된 금속 나노입자;를 포함하며, 상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브는 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수한 임플란트에 관한 것이다.

상기 임플란트는 골형성 촉진뿐만 아니라 항균효과 또한 발현되기 때문에 박테리아에 의한 감염을 방지하여 임플란트의 성공 확률을 높일 수 있다.

본원의 임플란트에 대하여, 본원의 골형성 촉진 조성물과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 골형성 촉진 조성물에 기재된 내용은 임플란트에 동일하게 적용될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

먼저, 250 μm 두께의 티타늄 시트를 0.5 w/v% 농도의 불산 용액에 넣고 20V 전압을 30분동안 인가하여 산화티타늄 나노튜브를 성장시켰다. 상기 산화티타늄 나노튜브를 400℃의 온도에서 3시간동안 열처리하여 결정화시켰다. 상기 결정화된 산화티타늄 나노튜브 상에 이온 플라즈마 스퍼터링법으로 1분동안 금 나노입자를 증착하였다. 상기 금 나노입자가 증착된 산화티타늄 나노튜브 상에 600 nm의 파장을 조사하여 골형성 촉진 조성물(Au-TiO₂ NTs-1min, LED-600)을 제조하였다.

금 나노입자를 2분동안 증착하는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 골형성 촉진 조성물(Au-TiO₂ NTs-2min, LED-600)을 제조하였다.

금 나노입자를 3분동안 증착하는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 골형성 촉진 조성물(Au-TiO₂ NTs-3min, LED-600)을 제조하였다.

금 나노입자 대신 백금 나노입자를 증착하는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 골형성 촉진 조성물(Pt-TiO₂ NTs-1min, LED-600)을 제조하였다.

백금 나노입자를 2분동안 증착하는 것을 제외하고, 실시예 4와 동일한 방법으로 골형성 촉진 조성물(Pt-TiO₂ NTs-2min, LED-600)을 제조하였다.

백금 나노입자를 3분동안 증착하는 것을 제외하고, 실시예 4와 동일한 방법으로 골형성 촉진 조성물(Pt-TiO₂ NTs-3min, LED-600)을 제조하였다.

[비교예 1]

600 nm의 파장을 조사하지 않는 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 골형성 촉진 조성물(Au-TiO₂ NTs-2min)을 제조하였다.

[비교예 2]

600 nm의 파장을 조사하지 않는 것을 제외하고, 실시예 6과 동일한 방법으로 골형성 촉진 조성물(Pt-TiO₂ NTs-3min)을 제조하였다.

[비교예 3]

600 nm의 파장 대신 470 nm의 파장을 조사하는 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 골형성 촉진 조성물(Au-TiO₂ NTs-2min, LED-470)을 제조하였다.

[비교예 4]

600 nm의 파장 대신 470 nm의 파장을 조사하는 것을 제외하고, 실시예 6과 동일한 방법으로 골형성 촉진 조성물(Pt-TiO₂ NTs-3min, LED-470)을 제조하였다.

1. 골형성 촉진 조성물의 특성 분석

상기 실시예 1 내지 6, 비교예 1 내지 4에서 제조한 골형성 촉진 조성물의 특징을 관찰하였고 그 결과를 도 2 내지 도 6으로서 나타내었다.

도 2의 (a) 내지 (c)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 FE-SEM(Field-emission scanning electron microscope) 이미지이다.

구체적으로, 도 2의 (a)는 실시예 1, 도 2의 (b)는 실시예 2, 도 2의 (c)는 실시예 3의 FE-SEM 이미지이다.

도 3의 (a) 내지 (c)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 FE-SEM(Field-emission scanning electron microscope) 이미지이다.

구체적으로, 도 3의 (a)는 실시예 4, 도 3의 (b)는 실시예 5, 도 3의 (c)는 실시예 6의 FE-SEM 이미지이다.

도 2 및 3에서 금 나노입자 및 백금 나노입자가 증착됨에 따라 변화된 산화티타늄 나노튜브의 직경, 높이 및 종횡비를 하기 표 1로서 나타내었다.

	직경(nm)	높이(nm)	종횡비
실시예 1	9.36±1.88	8.77±1.90	1:0.94
실시예 2	13.05±2.22	11.79±2.41	1:0.90
실시예 3	18.29±6.44	30.77±3.28	1:1.68
실시예 4	15.35±4.31	18.65±3.75	1:1.22
실시예 5	20.72±5.21	30.42±6.01	1:1.47
실시예 6	24.23±4.40	48.24±6.41	1:1.99

도 4의 (a) 및 (b)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 TEM(Transmission Electron Microscope) 이미지이다.

구체적으로, 도 4의 (a)는 실시예 1, 도 4의 (b)는 실시예 4의 TEM 이미지이다.

도 2 내지 4에 나타난 결과에 따르면, 산화티타늄 나노튜브 상에 증착되는 시간이 길어질수록 금 및 백금 입자가 막대모양으로 형성되는 것을 확인할 수 있다. 이는 상기 금 및 백금 입자를 이온 플라즈마 스퍼터링으로 형성함으로써, 상기 산화티타늄 나노튜브의 방향성에 따라 성장하기 때문에 나타나는 것으로 볼 수 있다. 또한, 도 4에 나타난 결과에 따르면, 상기 금 및 백금입자는 상기 산화티타늄 나노튜브의 표면상에 대부분 형성되고 내부에는 일부 형성되는 것을 확인할 수 있다. 상기 금은 17.73 wt%, 백금은 24.29 wt%로 각각 형성되었다.

도 5의 (a) 및 (b)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 UV-Vis-NIR 스펙트럼이다.

구체적으로, 도 5의 (a)는 산화티타늄 나노튜브(NTs), 금을 1분동안 증착시킨 산화티타늄 나노튜브(Au 1 min), 금을 2분동안 증착시킨 산화티타늄 나노튜브(Au 2 min), 금을 3분동안 증착시킨 산화티타늄 나노튜브(Au 3 min)의 UV-Vis-NIR 스펙트럼이고, 도 5의 (b)는산화티타늄 나노튜브(NTs), 백금을 1분동안 증착시킨 산화티타늄 나노튜브(Pt 1 min), 백금을 2분동안 증착시킨 산화티타늄 나노튜브(Pt 2 min), 백금을 3분동안 증착시킨 산화티타늄 나노튜브(Pt 3 min)의 UV-Vis-NIR 스펙트럼이다.

도 5의 (a) 및 (b)에 나타난 결과에 따르면, 상기 나노튜브 들은 350 nm 내지 400 nm, 400 nm 내지 500 nm, 550 nm 내지 650 nm 및 800 nm 이상에서 흡수도가 나타나는 것을 확인할 수 있다. 350 nm 내지 400 nm는 산화티타늄(TiO₂)의 전자전이를 의미하고, 400 nm 내지 500 nm는 산화티타늄 상에 형성된 금 및 백금의 LSPR 효과(localized surface plasmon resonance effect)를 의미하고, 550 nm 내지 650 nm는 금 및 백금이 증착된 산화티타늄 나노튜브(단축)의 광열 산란(photothermal scattering)을 의미하고, 800 nm 이상은 금 및 백금이 증착된 산화티타늄 나노튜브(장축)의 광열 산란(photothermal scattering)을 의미한다.

도 5의 (a)에 나타난 결과에 따르면, 금이 증착되는 시간이 증가될수록 550 nm 내지 650 nm 파장의 흡수도가 감소되는 것을 확인할 수 있다. 이는 상기 금의 양이 적정량 보다 많이 증착될 경우, 유의미한 가시광선에 대한 흡수도가 낮아져 골형성능, 항균효과 등이 감소할 수 있음을 시사한다. 즉, 골형성 촉진 조성물 100 중량부에 있어서, 상기 금속 나노입자가 10 중량부 내지 30 중량부로 포함되는 것이 바람직하다.

도 6의 (a) 내지 (d)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 XPS(X-ray photoelectron spectroscopy) 그래프이다.

구체적으로, 도 6의 (a) 내지 (d)에서 검정색은 산화티타늄 나노튜브, 빨간색은 실시예 1, 파란색은 실시예 5를 의미하고, 도 6의 (a)는 Ti2p, (b)는 O1s, (c)는 Au4f, (d)는 Pt4f를 의미한다.

도 6의 (a) 및 (b)에 나타난 결과에 따르면, 금 및 백금이 증착됨에 따라 산화티타늄의 Ti2P 및 O1s 결합에너지가 감소되는 것을 확인할 수 있다. 도 6의 (c)에 나타난 결과에 따르면, 금을 증착한 실시예 1의 경우, Au4f가 메인 피크인 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 6의 (d)에 나타난 결과에 따르면, 백금을 증착한 실시예 5의 경우, Pt4f가 메인 피크인 것을 확인할 수 있다.

2. 골형성 촉진 조성물의 항균 특성 및 생체적합성 분석

상기 실시예 1 내지 6, 비교예 1 내지 4에서 제조한 골형성 촉진 조성물의 항균 특성 및 생체적합성을 관찰하였고 그 결과를 도 7 내지 도 10으로서 나타내었다.

<항균 특성 분석>

먼저, 24시간동안 인큐베이션 배양한 연쇄상구균(staphylococcus aureus)을 1x10⁵ CFU/ml의 농도로 희석하였다. TiO₂ 나노튜브, Au-TiO₂ 나노튜브(비교예 1) 및 Pt-TiO₂ 나노튜브(비교예 2) 각각에 상기 희석된 연쇄상구균 500 μl를 주입 후, 37℃의 온도에서 24시간동안 배양하였다. 상기 연쇄상구균이 배양된 각각의 샘플에 470 nm, 600 nm 파장의 가시광선(5.5 mW/cm²)을 30분동안 조사하였다. 상기 가시광선이 조사된 샘플 각각을 100 μl씩 추출하여 PBS(phosphate buffered saline) 용액으로 희석한 후 배지 상에 37℃의 온도에서 24시간동안 배양하였다.

도 7은 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물 상에 연쇄상구균을 배양했을 때의 사진이다.

구체적으로, 도 7은 TiO₂ 나노튜브, Au-TiO₂ 나노튜브(비교예 1), Pt-TiO₂ 나노튜브(비교예 2), 470 nm 파장의 가시광선이 조사된 TiO₂ 나노튜브, Au-TiO₂ 나노튜브(비교예 3), Pt-TiO₂ 나노튜브(비교예 4), 600 nm 파장의 가시광선이 조사된 TiO₂ 나노튜브, Au-TiO₂ 나노튜브(실시예 2) 및 Pt-TiO₂ 나노튜브(실시예 6) 각각에 연쇄상구균을 배양했을 때의 사진이다.

도 8은 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물 상에 연쇄상구균을 배양했을 때의 집락형성능(colony forming units, CFUs)을 나타낸 그래프이다.

도 7 및 8에 나타난 결과에 따르면, 가시광선을 조사하기 전의 CFU 수치가 각각 다른 것을 확인할 수 있다. 이는 표면 상태에 따라 박테리아의 성질이 달라지기 때문이다. 하지만 470 nm 및 600 nm 파장의 가시광선을 조사함으로써 초기 CFU 수치와 상관 없이 CFU 수치가 모두 감소하는 것을 확인할 수 있다.

별도의 항균약물 투입 없이 470 nm 및 600 nm 파장의 가시광선 조사에 의해 금 및 백금이 증착된 산화티타늄 나노튜브의 항균능이 발현되었다. 이는 상기 산화티타늄 나노튜브 상에 증착된 금 및 백금 나노입자의 국부적인 표면 플라즈마 공명 효과(Localized surface plasma resonance, LSPR)에 기반한 플라즈몬 광촉매 작용에 의한 것이다.

TiO₂ 나노튜브, Au-TiO₂ 나노튜브(비교예 1) 및 Pt-TiO₂ 나노튜브(비교예 2) 각각에 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)를 배양하고 24시간, 48시간이 지난 뒤, PBS 용액으로 세척한 후, 2 μM 농도의 칼세인 AM(calcein acetoxymethyl) 및 4 μM 농도의 EtD-1(ethidium homodimer-1)을 첨가한 후, 형광분석하였다.

MTT 분석을 위해서, TiO₂ 나노튜브, Au-TiO₂ 나노튜브(비교예 1) 및 Pt-TiO₂ 나노튜브(비교예 2) 각각에 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)를 배양하고 24시간, 48시간이 지난 뒤, 1ml의 MTT 염료(3-(4,5-디메틸티아졸-2- 일)-2,5-디페닐테트라조리움 브롬마이드)를 첨가하였다. 이어서, 1 ml 디메틸설폭사이드를 각각의 웰에 첨가하고 5% CO₂ 인큐베이터에서 4시간동안 배양한 후 540 nm로 흡광도를 측정하였다.

도 9는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물 상에 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)를 배양 후 칼세인 AM(calcein acetoxymethyl) 및 EtD-1(ethidium homodimer-1)을 염색했을 때의 형광이미지이다.

도 10은 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물 상에 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)를 배양했을 때의 MTT assay 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9 및 10에 나타난 결과에 따르면, TiO₂ 나노튜브와 금 및 백금을 증착한 샘플 상에서 배양된 인간 중간엽 줄기세포는 거의 비슷한 것으로 나타났다. 이는 ISO 10993-5 표준에 부합하는 것으로서, 본원의 골형성 촉진 조성물의 생체적합성이 인정됨을 의미한다.

3. 골형성 촉진 조성물의 골형성능 평가 분석

상기 실시예 1 내지 6, 비교예 1 내지 4에서 제조한 골형성 촉진 조성물의 골형성능을 관찰하였고 그 결과를 도 11 내지 도 15로서 나타내었다.

도 11은 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물 상에 배양된 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)의 사상위족의 FE-SEM(Field-emission scanning electron microscope) 이미지이다.

도 11에 나타난 결과에 따르면, 470 nm 파장의 가시광선을 조사한 샘플의 경우, 대부분의 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)의 사상위족이 분리되어 있는 것을 확인할 수 있다. 이는 470 nm 파장이 조사되었을 때 플라즈몬 광촉매 작용에 의해 분리된 것으로 볼 수 있다. 반면에, 600 nm 파장의 가시광선을 조사한 샘플의 경우, 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)의 사상위족이 확장되어 있는 것을 확인할 수 있다. 이는 600 nm 파장이 산화티타늄의 광촉매 성질과는 관계가 없기 때문이다.

TiO₂ 나노튜브, Au-TiO₂ 나노튜브(비교예 1) 및 Pt-TiO₂ 나노튜브(비교예 2) 각각에 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)를 20,000 cells/well로 조정하여 24-well에 분주하였고 1시간 뒤 470 nm 및 600 nm 파장의 가시광선을 조사하였다. 3일에 한번씩 배지를 교환 및 가시광선을 조사하였다. 배양 후 일주일 및 이주일 뒤 용해 버퍼 용액(25 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40)으로 용해(lysis)하였다. 용해된 된 세포 상등액에 p-NPP(p-nitrophenyl-phosphate)를 첨가한 후 다시 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 50L의 3 NaOH로 반응을 중지하고, p-NPP로부터 생성된 p-NP(p-nitrophenol)를 405nm에서 흡광도를 측정하였다. ALP 활성도(activity)는 p-NPP로부터 생성된 p-NP를 측정하여 p-NP에 대한 표준그래프를 작성한 후 활성도를 대조군과의 대비교를 통해 도출하였다.

도 12의 (a) 및 (b)는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 ALP 활성을 나타낸 그래프이다.

구체적으로, 도 12의 (a)는 배양 후 일주일 뒤의 ALP 활성을 나타낸 그래프이고, 도 12의 (b)는 배양 후 이주일 뒤의 ALP 활성을 나타낸 그래프이다.

도 12의 (a)에 나타난 결과에 따르면, Pt-TiO₂ NTs-600nm(실시예 6)의 ALP 활성이 가장 높은 것을 확인할 수 있다. 다만, 도 12의 (b)에서 배양후 이주일 뒤의 ALP 활성은 샘플별로 큰 차이가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있다. 이는 ALP 활성이 줄기세포가 골아세포로 분화되는 데의 초기 단계 마커이기 때문에 배양 초기(일주일) ALP의 활성이 나타나는 것이다.

<RT-PCR법에 의한 조골세포 분화 관련 골기질 유전자 발현 조사>

TiO₂ 나노튜브, Au-TiO₂ 나노튜브(비교예 1) 및 Pt-TiO₂ 나노튜브(비교예 2) 각각에 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)를 상기 ALP 활성 분석을 수행할 때와 같은 조건에서 배양한 후, cDNA를 제조하고 PCR 프라이머(ALP, OPN 및 BSP)를 이용한 PCR 방법으로 증폭하여 측정하였다.

상기 ALP, OPN 및 BSP는 상기 인간 중간엽 줄기세포의 골형성 분화 정도를 모니터링하기 위한 마커(marker)이다. 상기 ALP 발현의 증가는 hMSCs의 골형성 분화의 초기단계에 관찰되어 배양후 일주일 뒤를 평가하였다. 상기 OPN 및 BSP는 성숙 골아 세포 및 골 세포 단계에서 발현되며, 이는 hMSCs 골형성 회절의 후기 단계에 해당되어 배양 후 이주일 뒤를 평가하였다.

도 13은 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 ALP 발현을 분석한 그래프이다.

도 14는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 OPN 발현을 분석한 그래프이다.

도 15는 본 실시예에 따라 제조된 골형성 촉진 조성물의 BSP 발현을 분석한 그래프이다.

도 13 내지 15에 나타난 결과에 따르면, 600 nm 파장의 가시광선을 조사한 샘플의 ALP, OPN 및 BSP 발현도가 가장 높은 것을 확인할 수 있다.

특히, 금 및 백금 나노입자를 형성한 산화티타늄 나노튜브가 600 nm의 파장을 흡수할 때 골형성능이 가장 높은 것으로 볼 수 있다. 이는 본원의 골형성 촉진 조성물의 골형성능을 입증하는 것이다.

또한, 600 nm 파장의 가시광선은 LLLT(Low level laser therapy)에 자주 사용되는 파장이다. 600 nm 내지 650 nm 파장의 낮은 에너지가 조사되었을 때, 세포분화의 촉진, 상처 치료, 조직 회복 등이 이루어지므로, 상기 골형성 촉진 조성물은 골형성능뿐만 아니라 세포 치료, 항균 효과 등이 동시에 발현될 수 있다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

금속 산화물 나노튜브;
상기 금속 산화물 나노튜브 상에 형성된 금속 나노입자;를 포함하며,
상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브는 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수한 것인, 골형성 촉진 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 골형성 촉진 조성물 100 중량부에 있어서, 상기 금속 나노입자가 10 중량부 내지 30 중량부로 포함되는 것인, 골형성 촉진 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 금속 산화물 나노튜브의 직경은 30 nm 내지 100 nm인 것인, 골형성 촉진 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 금속 산화물 나노튜브는 티타늄, 텅스텐, 아연, 니오븀, 지르코늄 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 금속을 포함하는 것인, 골형성 촉진 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 금속 나노입자는 금, 백금, 팔라듐, 은 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 귀금속을 포함하는 것인, 골형성 촉진 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 증가시키는 것인, 골형성 촉진 조성물.
금속 시트를 산화 및 열처리하여 금속 산화물 나노튜브를 성장시키는 단계;
상기 금속 산화물 나노튜브 상에 금속 나노입자를 형성하는 단계; 및
상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브 상에 가시광선을 조사하는 단계;를 포함하는, 골형성 촉진 조성물의 제조 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 금속 나노입자를 형성하는 단계는 이온 플라즈마 스퍼터링에 의해 수행되는 것인, 골형성 촉진 조성물의 제조 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 가시광선은 550 nm 내지 650 nm의 파장인 것인, 골형성 촉진 조성물의 제조 방법.
금속 산화물 나노튜브;
상기 금속 산화물 나노튜브 상에 형성된 금속 나노입자;를 포함하며,
상기 금속 나노입자가 형성된 금속 산화물 나노튜브는 550 nm 내지 650 nm의 파장을 흡수한 것인, 임플란트.