KR20180012293A - 티타늄 또는 티타늄 합금으로 제조된 바디 상에 향상된 혈액 응고 및/또는 세포 부착을 위한 토포그래피의 준비 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 티타늄 또는 티타늄 합금으로 제조된 바디 상에 향상된 혈액 응고 및/또는 세포 부착을 위한 토포그래피의 준비를 위한 프로세스에 관한 것이다. 프로세스는 이하의 단계 a) 무기산을 포함하는 제1 에칭 용액으로 상기 바디의 표면의 적어도 일부를 에칭하는 단계, 및 b) 제1 에칭 용액과는 상이한 제2 에칭 용액으로 단계 a) 하에서 에칭된 표면을 에칭하는 단계로서, 상기 제2 에칭 용액은 불화수소산을 포함하는 것인, 에칭 단계를 포함한다.

Description

티타늄 또는 티타늄 합금으로 제조된 바디 상에 향상된 혈액 응고 및/또는 세포 부착을 위한 토포그래피의 준비 방법

본 발명은 티타늄 또는 티타늄 합금으로 제조된 바디 상에 향상된 혈액 응고 및/또는 세포 부착을 위한 토포그래피의 준비를 위한 프로세스, 이 프로세스에 의해 얻어지는 것이 가능한 바디 뿐만 아니라 치과용 임플란트 또는 치과용 임플란트 지대치(abutment)용 바디의 사용에 관한 것이다.

치과용 임플란트와 같은 임플란트는 당 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이들 임플란트는 일반적으로 생체적합성이고 부가적으로 유리한 기계적 특성을 갖는 재료로 이루어진다. 현재 사용되는 치과용 임플란트는 종종 생체적합성인 것 이외에 현저한 기계적 강도를 나타내는 티타늄 또는 티타늄 합금으로 제조된다.

임플란트를 향한 인체의 수용은 임플란트 표면에 의해 결정된다. 면역 체계에 의해 이물질로서 검출되어 거부될 때, 임플란트는 염증을 유발할 수도 있는 데, 이는 환자에 통증을 유발할 뿐만 아니라 종종 또한 임플란트를 제거하거나 교체하기 위한 2차 수술의 필요성을 유도한다.

인체에 의한 임플란트의 거부를 회피하기 위해, 임플란트 표면은 세포가 그에 부착하고 자연 체조직, 특히 골조직 또는 연조직이 임플란트 주위에서 성장하기 시작하는 방식으로 가공되어야 한다.

치과용 임플란트의 경우에, 예를 들어, 생체 턱뼈와 임플란트 표면 사이의 직접 구조적 및 기능적 연결이 식립(implantation) 직후에 성취되는 것이 요구된다. 이는 당 기술 분야에서 "골융합(osteointegration)"[또는 "골유착(osseointegration)"]이라 칭하는데: 양호한 골융합은 임플란트가 짧은 치유 시간 내에 안전하게 골화하여(ossifies) 임플란트와 뼈 사이의 영구적인 접합이 얻어지게 되는 것을 의미한다.

골융합 특성의 중요성 이외에, 또한 치과용 임플란트와 주위 치조정상방(supracrestal) 결합 조직(이하, "연조직"이라 칭함) 사이의 양호한 상호작용이 성공적인 식립을 위해 중대하다는 증가적인 증거가 존재한다. 이는 연조직이 구강 환경과 치과용 임플란트의 골내(endosseous) 부분 사이에 효과적인 밀봉부, 및 따라서, 또한 임플란트의 연조직 접촉면 및 골조직 접촉면 상에 박테리아 부착에 대한 배리어를 설정하는 데 있어서 기본적인 역할을 수행한다는 견해에 의해 지지된다.

주위 연조직 또는 골조직의 세포의 부착은 일단 임플란트가 혈액과 접촉하게 되면 표면에 부착, 즉 흡착하는 단백질에 의해 지배된다. 임플란트 표면 상에 흡착된 단백질은 각각의 조직의 세포의 거동, 예를 들어 분화(differentiation)에 영향을 미치는 것으로 가정된다.

치과용 임플란트와 각각의 조직 사이의 고속의 강한 상호작용을 성취하기 위해, 표면 상의 이들 단백질의 부착은 따라서 최고 중요성을 갖는다.

단백질 부착에 영향을 미치는 일 중요한 인자는 표면의 소수성이다.

최근에, 또한 특정 나노구조의 존재가 단백질의 부착에 중요한 역할을 수행하는 것이 발견되었다.

특히, WO 2013/056844호는 바디, 특히 임플란트의 표면 상의 향상된 단백질 부착을 위한 구조체를 제공하기 위한 프로세스를 설명하고 있다. 프로세스는 나노구조체가 그에 의해 기초 바디의 표면 상에 형성되는, 수용액 내에 산 에칭된 기초 바디를 저장하는 단계를 포함한다. WO 2013/056844호에 따르면, 나노구조체의 형태가 이에 의해 이들이 시간 경과에 따라 "성장" 또는 "축적"하는 점에서 점진적으로 발생한다.

또한, 알.에이. 기튼스(R.A. Gittens) 등[Biomaterials 32 (2011) 3395 - 3403]은 임상적으로 관련된 표면 상의 골유착을 촉진하기 위해 마이크로- 및 나노스케일 거칠기의 모두의 계층적 조합에 초점을 맞추는 연구를 보고하고 있다.

WO 2013/056844호의 프로세스에 따라 성취된 양호한 결과에도 불구하고, 식립 후에 주위 조직과 고속의 강한 상호작용을 설정하는 바디를 제공하기 위한 계속되는 요구가 존재한다.

이를 고려하여, 본 발명에 의해 해결되어야 할 목적은 주위 조직과의 향상된 상호작용을 허용하기 위한 방식으로 티타늄 또는 티타늄 합금으로 제조된 바디 상에 토포그래피를 준비하기 위한 프로세스를 제공하는 것이다. 특히, 혈액 응고 및/또는 세포 부착 및 따라서 바디와의 조직 상호작용을 중재하는 적어도 하나의 혈액 단백질의 비교적 선택적인 부착을 허용하는 바디의 표면을 개질하기 위한 간단하고 재현가능한 프로세스를 제공해야 한다.

본 발명의 목적은 청구항 1에 따른 프로세스에 의해 해결된다. 본 발명의 바람직한 실시예는 종속 청구항에 규정되어 있다.

청구항 1에 따르면, 본 발명의 프로세스는 티타늄 또는 티타늄 합금, 즉 치과용 임플란트 또는 치과용 임플란트 지대치를 위해 사용되는 가장 통상적인 재료로 제조된 바디 상의 향상된 혈액 응고 및/또는 세포 부착을 위한 토포그래피의 준비에 관한 것이다.

프로세스는 이하의 단계

a) 무기산을 포함하는 제1 에칭 용액으로 표면의 적어도 일부를 에칭하는 단계, 및

b) 제1 에칭 용액과는 상이한 제2 에칭 용액 - 불화수소산(HF)을 포함함 - 으로 단계 a) 하에서 에칭된 표면을 에칭하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 조합된 에칭에 의해, 고속 혈액 응고 및, 따라서 섬유소 네트워크의 형성 및/또는 주위 조직의 세포의 강한 부착을 허용하는 표면이 성취된다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 특히, 이하에 설명되는 특정 작용예를 경유하여 상세히 개시되는 바와 같이, 바디의 향상된 골융합이 성취된다.

심지어 바디의 표면이 비교적 소수성일 때의 경우에도, 향상된 조직 상호작용, 특히 골융합이 성취될 수 있다는 것이 또한 발견되었다. 이 발견은 소수성 표면이 양호한 골융합을 성취하기 위한 중요한 요건이라는 확립된 학설이 주어지면 가장 놀랍다.

이론에 의해 구속되기를 원하지 않고, 향상된 혈액 응고 및/또는 세포 부착은 이하의 메커니즘에 따라, 본 발명의 프로세스에 의해 얻어진 바디의 특정 토포그래피에 기인하는 것으로 가정된다.

바디가 조직 내로, 특히 골조직 내로 식립될 때, 이는 먼저 주위 혈액으로부터의 물분자에 의해 접촉된다. 다음의 단계에서, 이온 및 단백질이 임플란트의 표면 상에 축적하여 부착할 것이지만, 실제로 재료를 관통하지 않는다. 전술된 바와 같이, 이 "단백질 부착" 또는 "단백질 흡착"은 이후의 세포 응답을 위해 결정적인 것으로 가정된다.

본 발명에 의해 얻어지는 것이 가능한 특정 토포그래피에 의해, "단백질 보유 구조체"는 바디의 표면, 즉 특정 단백질의 향상된 부착을 허용하는 구조체 상에 제공된다. 첨부된 작용예를 경유하여 나타내는 바와 같이, 얻어진 토포그래피는 혈액 응고 및 따라서 섬유소 네트워크의 형성에 있어서 중요한 역할이 귀착되는 섬유소원의 비교적 선택적 부착을 허용한다. 이 맥락에서, 작용예는 또한 비교적 두꺼운 섬유소 네트워크가 비교예와의 비교시에 본 발명에 따른 바디 상에 형성된다는 것을 나타내고 있다.

용어 "에칭"은 본 발명의 맥락에서 사용될 때 광범위하게 이해되어야 하고, 바디의 표면으로부터 재료를 용해하고 따라서 제거하는 에칭 용액에 의해 바디의 토포그래피의 임의의 형성 또는 변경을 포함한다. 따라서, 에칭은 예를 들어 양극산화 처리에 대해 해당하는 바와 같이, 임의의 애디티브(additive) 표면 처리에 대조적인 서브트랙티브(subtractive) 표면 처리에 관련된다. 특정 실시예에 따르면, 용어 "에칭"은 바디의 자연 산화층의 단순한 제거에 관련되지 않는 데, 이는 이 자연 산화물 제거가 토포그래피의 형성 또는 변경을 수반하지 않기 때문이다. 본 실시예의 의미 내에서 에칭은 마찬가지로, 표면 불순물을 제거하는 데 사용되고 바람직하게는 균질 재료 제거를 목표로 하는 "산세척(pickling)" 처리에 대조적이다.

특히, 단계 a)에 따라 표면을 에칭함으로써, 마이크로스코픽 토포그래픽 형태가 형성되고, 단계 b)에 따라 표면을 에칭함으로써, 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태가 마이크로스코픽 토포그래픽 형태 내에 형성된다. 따라서, 단계 a)에서와는 상이한 토포그래픽 스케일의 형태가 단계 b)에서 형성되어, 계층적 토포그래피를 유도한다.

이하에 또한 상세히 설명되는 바와 같이, 서브트랙티브 프로세스 단계 a)는 공지의 SLA® 처리에 따른 산 에칭에 대응한다. 특히, 단계 a)는 따라서, 에칭 전에, 기계적 서브트랙티브 처리, 더 구체적으로 샌드-블라스팅 처리를 포함하는 전처리에 관련된다.

단계 a)와 같이, 단계 b)는 또한 서브트랙티브 프로세스 단계인 데, 이 단계에 의해 재료가 바디로부터 제거되는 것을 의미한다. 용어 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태가 "마이크로스코픽 토포그래픽 형태 내에 형성된다"라는 것은 따라서, "마이크로스코픽 토포그래픽 형태를 갖는 단계 a) 후에 얻어진 중간 바디로부터 재료를 더 제거함으로써 형성된다"로서 이해되어야 한다.

본 발명의 프로세스에 의해 얻어진 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 따라서 초기에 바디 내에 포함되고 단계 a 및 b) 후에 바디의 표면 상에 남아 있는 재료로 제조된다. 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태가 형성되는 방식은 따라서, 시간 경과에 따른 구조체의 성장 또는 축적, 및 따라서 애디티브 프로세스에 관한 것인 WO 2013/056844호에 설명된 나노구조체의 형태와는 모든 관점에서 상이하다.

단계 b)가 서브트랙티브인 프로세스인 것에 기인하여, 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태의 재료 조성은 본질적으로 처리 전의 바디의 표면의 재료 조성 뿐만 아니라 프로세스 단계 a) 후에 존재하는 마이크로스코픽 토포그래픽 형태의 재료 조성에 대응한다. 바디는 각각의 산화물층이 그 위에 자발적으로 형성되어 있는 표면을 갖는 티타늄 또는 티타늄 합금으로 제조되기 때문에, 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태가 그 위에 형성되어 있는 마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 마찬가지로 산화물층이 그 위에 형성되어 있는 티타늄 또는 티타늄 합금 각각으로 제조된다.

양 단계 a) 및 단계 b)는 에칭 단계이기 때문에, 본 발명의 프로세스는 "이중 에칭" 프로세스로 간주될 수 있다. 따라서, 이는 단지 하나의 단일의 에칭 단계, 즉 하나의 단일의 서브트랙티브 표면 처리 단계만을 포함하는 프로세스와는 모든 관점에서 상이하다. 특히, 이는 단일의 에칭 단계가 표면을 화학적으로 개질하기 위해 그리고/또는 그 토포그래피를 구조화하기 위해, 양극산화 단계와 같은 애디티브 표면 처리 단계로 이어지는, 2단계 처리와는 명백히 대조적이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 이하의 표면 파라미터,

i) 3차원에서 표면의 산술 평균 편차이고, 0.1 ㎛ 내지 2.0 ㎛의 범위이고, 바람직하게는 0.4 ㎛ 내지 1.8 ㎛, 더 바람직하게는 0.8 ㎛ 내지 1.7 ㎛, 가장 바람직하게는 0.9 ㎛ 내지 1.5 ㎛의 범위인 S_a;

ii) 3차원에서 최대 마루 대 골 높이이고 1.0 ㎛ 내지 20.0 ㎛의 범위이고, 바람직하게는 3.0 ㎛ 내지 18.0 ㎛, 더 바람직하게는 4.5 ㎛ 내지 13.0 ㎛, 가장 바람직하게는 6.0 ㎛ 내지 12.0 ㎛의 범위인 S_t; 그리고/또는

iii) 3차원에서 프로파일의 비대칭도(skewness)이고 -0.6 내지 1.0, 바람직하게는 -0.4 내지 0.6, 더 바람직하게는 -0.3 내지 0.5의 범위인 S_sk

중 적어도 하나에 의해 규정된다.

표면 파라미터는 당 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있고, 2차원에 대해 EN ISO 4287에 정의된 파라미터(R_a, R_t, R_sk) 각각에 대해 3차원에서 유사한 파라미터이다. 구체적으로, 상기 값은 예를 들어, 당 기술 분야의 숙련자에게 공지된 WinSAM 소프트웨어[SAM (Surface Analysis Method) for Windows]에 의해 얻어지는 것이 가능한 값에 관련된다.

S_a, S_t 및 S_sk에 대한 상기 값은 특히, 식립 후에 골조직과 접촉하게 되기 위한 바디의 골 접촉면, 즉 바디, 구체적으로 임플란트 상에 위치된 표면 영역에 관련된다. 바디의 연조직 접촉면에 있어서, 바람직한 값은 더 작다. 구체적으로, S_a는 연조직 접촉면에 대해 바람직하게는 0.05 ㎛ 내지 0.5 ㎛, 더 바람직하게는 0.05 ㎛ 내지 3.0 ㎛의 범위이다.

언급된 바와 같이, 상기에 규정된 마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 통상적으로 에칭 전에 샌드-블라스팅 처리를 더 포함하는 단계 a)에 의해 얻어진다.

마이크로스코픽 토포그래픽 형태에 관하여, 표면 파라미터는, a)에 따른 에칭이 SLA® 또는 SLActive® 프로토콜에 따라 수행되는 전술된 바람직한 실시예가 주어지면, 바람직하게는 "SLA®" 또는 "SLActive®" 표면의 범위이다.

양 "SLA®" 또는 "SLActive®" 처리는 각각의 분야에서 잘 알려져 있고, 골친화성 임플란트의 준비의 견지에서 혁신 기술에 관련된다. 특히, "SLA®"은 임플란트의 표면을 샌드블라스팅하고 이어서 제1 무기산을 포함하는 에칭 용액으로 이를 처리하는 것을 수반하고, 반면에 "SLActive®"은 질소 내에 또는 등장성 염수 용액(isotonic saline solution) 내에서 "SLA" 표면을 조절하여, 이에 의해 그렇지 않으면 분위기와의 상호작용에 기인하여 보관 중에 손실될 것인 "SLA®" 표면의 높은 친수성을 유지하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 제1 에칭 용액은 따라서 HCl 및 H₂SO₄를 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 더 구체적으로, 80℃ 초과의 온도에서 HCl과 H₂SO₄의 혼합물이 단계 a)를 위해 사용된다. 대안적으로, 적어도 하나의 무기산의 임의의 다른 용액, 특히 HCl, H₂SO₄, H₃PO₄ 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 무기산을 포함하는 용액이 프로세스 단계 a)를 위해 사용될 수 있다. HF가 제1 에칭 용액 내에 함유되면, HF의 농도는 제2 에칭 용액의 HF 농도보다 낮다. 특히 바람직한 실시예에 따르면, 제1 에칭 용액은 적어도 대략적으로 HF가 없다. 이와 관련하여, 본 발명은 EP 1 477 141호에 설명된 기술로부터 더욱 더 명백하게 구별되는 데, 이 EP 특허에 따르면, HF가 제2 단계에서 표면을 에칭하기 전에 제1 단계에서 자연 산화물을 제거하기 위해 사용된다.

단계 a) 전에, 매크로스코픽 토포그래픽 형태가 더 바람직하게는 샌드-블라스팅에 의해 표면에 제공되는 것이 더 바람직하다. 예를 들어, 250 내지 500 ㎛의 입경을 갖는 강옥(corundum)이 블라스팅 재료로서 사용될 수 있다. 본 실시예에서, 또한 SLA® 기술의 샌드-블라스팅 단계가 본 발명의 프로세스에 적용된다.

특히 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 따라서, SLA® 프로토콜에 따른 것과 동일한 단계를 수반하지만, SLA® 에칭 단계 후에 단계 b)를 더 포함한다.

바람직하게는, 프로세스는 단계 b)에서 형성된 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태에 의해, 단계 a)에서 형성된 마이크로스코픽 토포그래픽 형태를 규정하고 S_a, S_t 및 S_sk로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 표면 파라미터가 최대 50%만큼, 최대 20%만큼, 더 바람직하게는 최대 10%만큼 변화되고, 가장 바람직하게는 본질적으로 불변 유지되는 방식으로 수행된다.

따라서, SLA® 기술에 따른 양호하게 설정된 매크로스코픽 및 마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 변경되지 않거나 또는 프로세스 단계 b)에 의해 무시할만한 정도로만 변경된다. 이는 표면의 매크로스코픽 및 마이크로스코픽 토포그래픽 형태 상에 초점을 맞춘 배율로 거의 동일한 화상을 도시하고 있지만, 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태 상에 초점을 맞춘 배율로 표면의 완전히 상이한 화상을 도시하고 있는 첨부 도면에 의해 더 예시될 것이다.

구체적으로, 본 발명에 의해 성취 가능한 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 최대 1000 nm로 적어도 2차원으로 연장하는 서브마이크로스코픽 구조체를 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 바람직하게는, 서브마이크로스코픽 구조체는 20 nm 내지 1000 nm, 바람직하게는 30 nm 내지 500 nm, 더 바람직하게는 40 nm 내지 300 nm, 더욱 더 바람직하게는 50 nm 내지 250 nm, 가장 바람직하게는 100 nm 내지 200 nm로 적어도 2차원으로 연장한다.

바디의 특정 재료 및 프로세스 파라미터에 따라, 상이한 서브마이크로스코픽 구조체가 얻어질 수 있다. 구체적으로, 서브마이크로스코픽 구조체는 첨부 도면에 의해 또한 예시되어 있는 바와 같이, 적어도 하나의 직선 에지를 갖는 형상을 갖고, 더 구체적으로는 날카로운 에지형 그리고/또는 톱니형이다. 대안적으로 또는 부가적으로, 서브마이크로스코픽 구조체는 서로에 관해 단차형 또는 캐스케이드형 방식으로 배열될 수 있다. 더 구체적으로, 서브마이크로스코픽 구조체는 그 사이에 형성된 틈새(crevice)를 갖는 날카로운 에지형 클리프(cliff) 또는 칼럼(column)의 형태일 수 있다.

바람직하게는, 제2 에칭 용액 내의 불화수소산의 농도는 0.01 체적 % 내지 4 체적 %, 바람직하게는 0.05 체적 % 내지 2 체적 %, 더 바람직하게는 0.1 체적 % 내지 1 체적 %의 범위이다. 가장 바람직하게는, 제2 에칭 용액 내의 불화수소산의 농도는 0.2 체적 % 내지 0.5 체적 %의 범위이다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 단계 b) 하에서의 에칭은 0.1분 내지 30분, 바람직하게는 0.5분 내지 20분, 더 바람직하게는 0.5분 내지 10분, 가장 바람직하게는 1분 내지 5분의 범위의 기간 동안 수행된다.

단계 b)에 따른 처리의 기간 및 불화수소산의 농도를 상기에 주어진 바람직한 범위 이내로 유지함으로써, 원하는 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태가 매크로스코픽 및 마이크로스코픽 토포그래픽 형태의 모두의 특징을 그대로 남겨두면서 성취될 수 있다. 특히, 마이크로스코픽 토포그래픽 형태를 규정하는 표면 파라미터(S_a, S_t, S_sk) 중 적어도 하나는 본질적으로 불변 유지되는 데, 이는 전술된 바와 같이 바람직하다.

비교적 짧은 에칭의 기간은 WO 2013/056844호에 언급된 나노구조체의 성장에 대한 본 발명의 프로세스의 차이점을 또한 강조하는 데, 이는 훨씬 더 장기간 동안 연장한다.

단계 b)에서의 에칭은 10℃ 내지 90℃, 바람직하게는 10℃ 내지 60℃, 더 바람직하게는 15℃ 내지 40℃, 더욱 더 바람직하게는 15℃ 내지 30℃의 범위의 온도, 가장 바람직하게는 실온(20℃)에서 수행되는 것이 또한 바람직하다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 바디는 티타늄-지르코늄 합금으로 제조되는 데, 이 재료에 있어서 특정 관련성의 표면 토포그래피가 본 발명의 프로세스에 의해 성취될 수 있기 때문이다. 더 바람직하게는, 바디는 13 내지 17% 지르코늄을 포함하는 바이메탈릭 티타늄 지르코늄 합금으로 제조된다. 특히 바람직한 티타늄 지르코늄 합금은 상표명 Roxolid®(Institut Straumann AG, 스위스) 하에서 입수 가능한데, 그 특성은 당 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 성취될 목표에 따라, 바디는 티타늄으로 또한 제조될 수 있는데, 이는 또한 티타늄, 특히 티타늄 임플란트로 제조된 바디에 있어서, 향상된 혈액 응고 및/또는 세포 부착을 위한 토포그래피가 본 발명의 프로세스에 의해 성취될 수 있기 때문인 것으로 발견되었기 때문이다.

상기에 지적된 바와 같이, 본 발명의 프로세스는 특히 주위 조직과의 강한 상호작용을 허용하는 표면을 그에 제공하기 위해, 치과용 임플란트 또는 치과용 임플란트 지대치에 관한 것이다. 바람직한 실시예에 따르면, 바디는 치과용 임플란트 또는 치과용 임플란트 지대치이고, 토포그래피는 사용시에 골조직 또는 연조직과 각각 접촉하도록 의도된 바디의 표면의 적어도 일부 상에 제공된다.

또한 전술된 바와 같이 그리고 작용예에 의해 더 상세히 나타내는 바와 같이, 표면이 비교적 소수성일 때의 경우에도, 향상된 골융합이 본 발명에 따라 제공된 토포그래피에 의해 성취될 수 있다. 따라서, 표면은 또한 치과용 임플란트의 공기중의 보관 후에 양호한 골융합 특성을 제공하고, 따라서 보호 환경에서 치과용 임플란트를 보관할 필요성이 없다. 궁극적으로, 이는 치과용 임플란트의 매우 간단한 패키징을 허용한다.

용어 "소수성의" 또는 "소수성"은 용어 "친수성의" 또는 "친수성"에 대한 반대어로서 사용되는 데, 친수성은 - 본 발명의 맥락에서 사용될 때 - 물과 접촉할 때, 90° 미만, 더 바람직하게는 30° 미만, 가장 바람직하게는 10° 미만의 접촉각을 칭한다.

본 발명의 특정 실시예에 따르면, 바디의 표면은 소수성이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "소수성의" 또는 "소수성"은 특히 물과 접촉할 때 90° 초과의 표면의 접촉각에 관련된다. 언급된 바와 같이, 본 발명에 의해 성취 가능한 특정 토포그래피는 비교적 높은 접촉각의 경우에도 현저한 골융합 특성이 얻어질 수 있게 한다. 따라서, 임플란트를 위한 매우 간단한 패키징 및 보관 수단이, 연장된 보관 기간 후에도 현저한 골융합 특성에 여전히 도달하면서 선택될 수 있다.

다른 특정 실시예에 따르면, 바디의 표면은 물과 접촉할 때, 90° 미만의 접촉각을 갖는 친수성이고, 더 구체적으로는 30° 미만의 접촉각을 갖는 초친수성이고, 가장 구체적으로는 10° 미만이다. 친수성 또는 초친수성인 표면은 혈액에 의한 임플란트의 순간적인 습윤, 및 따라서 그 내에 함유된 물 분자 및 이온의 고속 접촉, 이어서 표면 상의 혈액 응고- 및/또는 세포 부착-매개 단백질의 축적 및 부착을 유도한다. 이에 의해, 주위 조직과의 표면의 더욱 더 향상된 상호작용이 얻어질 수 있다.

전술된 프로세스와는 별개로, 본 발명은 또한 프로세스에 의해 얻어지는 것이 가능한 바디에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 그 표면이 마이크로스코픽 토포그래픽 형태에 의해 그리고 마이크로스코픽 토포그래픽 형태에 형성된 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태에 의해 형성되는 바디에 관한 것이다.

전술된 바와 같이, 마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 이하의 표면 파라미터,

i) 3차원에서 표면의 산술 평균 편차이고, 0.1 ㎛ 내지 2.0 ㎛의 범위이고, 바람직하게는 0.4 ㎛ 내지 1.8 ㎛, 더 바람직하게는 0.8 ㎛ 내지 1.7 ㎛, 가장 바람직하게는 0.9 ㎛ 내지 1.5 ㎛의 범위인 S_a;

ii) 3차원에서 최대 마루(peak) 대 골(valley) 높이이고 1.0 ㎛ 내지 20.0 ㎛의 범위이고, 바람직하게는 3.0 ㎛ 내지 18.0 ㎛, 더 바람직하게는 4.5 ㎛ 내지 13.0 ㎛, 가장 바람직하게는 6.0 ㎛ 내지 12.0 ㎛의 범위인 S_t; 그리고/또는

iii) 3차원에서 프로파일의 비대칭도이고 -0.6 내지 1.0, 바람직하게는 -0.4 내지 0.6, 더 바람직하게는 -0.3 내지 0.5의 범위인 S_sk

중 적어도 하나에 의해 규정된다.

구체적으로, 상기 값은 예를 들어, 당 기술 분야의 숙련자에게 공지된 WinSAM 소프트웨어[SAM (Surface Analysis Method) for Windows]에 의해 얻어지는 것이 가능한 값에 관련된다.

또한 언급된 바와 같이, 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 최대 1000 nm로 적어도 2차원으로 연장하는 서브마이크로스코픽 구조체를 포함하거나 이루어진다.

더욱 또한 그리고 전술된 프로세스에 따라, 서브마이크로스코픽 구조체의 적어도 일부는 적어도 하나의 직선 에지를 갖는 형상을 갖고, 구체적으로 날카로운 에지형 그리고/또는 톱니형이다. 대안적으로 또는 부가적으로, 서브마이크로스코픽 구조체는 서로에 관해 단차형 또는 캐스케이드형 방식으로 배열될 수 있다.

프로세스의 바람직한 특징으로서 전술된 모든 특징은 또한 본 발명의 바디의 바람직한 특징이고 그 반대도 마찬가지라는 것이 이해된다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 치과용 임플란트 또는 치과용 임플란트 지대치를 위한 이전의 청구항 중 임의의 하나에 따른 바디의 사용에 관한 것이다. 이와 관련하여, 바디는 치과용 임플란트 또는 치과용 임플란트 지대치로서 또는 치과용 임플란트 또는 치과용 임플란트 지대치의 부분으로서 사용될 수 있다. 바디가 치과용 임플란트 또는 치과용 임플란트 지대치의 부분으로서 사용될 때, 나머지 부분의 적어도 일부는 티타늄 또는 티타늄 합금 각각 이외의 재료로 제조될 수 있다는 것이 이해된다.

바디가 치과용 임플란트 지대치로서 사용되면, S_a, S_t 및 S_sk의 값은 특히 바디의 골 접촉면에 관한 것이 전술된 것들보다 바람직하게 낮다. 특히, S_a는 바람직하게는 0.05 ㎛ 내지 0.5 ㎛, 더 바람직하게는 0.05 ㎛ 내지 0.3 ㎛의 범위의 치과용 임플란트 지대치인 바디의 경우이다. 이는 치과용 임플란트 지대치 및 주위 연조직의 특히 강한 상호작용이 얻어질 수 있게 한다.

예

1. 체외 분석에 관한 예

1.1. 재료 및 방법

재료

5 mm 직경 및 1 mm 두께의 디스크가 바이메탈릭 TiZr 합금봉[(Roxolid (RXD); 13-17% Zr)으로부터 준비되었다.

"SLA" 처리

첫째로, 샘플은 "SLA®" 샘플을 준비하기 위한 프로토콜에 따라 처리되었다. 구체적으로, 샘플은 큰 그릿(입경 250 내지 500 ㎛)을 갖는 강옥을 사용하여 샌드-블라스팅되었고, 이어서 HCl과 H₂SO₄의 비등 혼합물 내에서 샌드-블라스팅된 표면을 에칭하였다.

샘플 "RXD SLA HF" 및 "RXD SLActive HF"

SLA® 처리[본 발명의 프로세스의 단계 a)를 수반함]에 의해 성취된 샘플의 제1 부분은 이어서 실온에서 2분 동안[프로세스의 단계 b)에 대응함] 0.2% 불화수소산(100 ml 체적: 0.5 ml 40% HF, 99.5 ml H₂O)을 포함하는 수용액에서 처리되었다.

샘플은 이어서 400 ml 초순수(ultrapure water) 내에 샘플을 함유하는 테플론 비이커(Teflon beaker)를 배치하고 샘플에 초음파처리를 3회(대략 20 ml 초순수 내에서 각각 1분) 실시함으로써 초순수 내에서 헹굼되었다. 샘플은 이어서 아르곤의 스트림 내에서 송풍 건조되었고 알루미늄 포일 내에서 건식 보관되었다.

이에 의해, 본 발명에 따른 샘플 "RXD SLA HF"가 성취되었다.

또한, 샘플 "RXD SLActive HF"가 준비되었는 데, 이는 섬유소 네트워크 형태의 평가의 맥락에서 설명될 것이다. 구체적으로, 이들 샘플은 전술된 "RXD SLA HF"와 유사하게, 그러나 공기 중에서 건조된 샘플을 보관하는 대신에, 보관이 상업적으로 입수 가능한 SLActive® 임플란트를 위해 사용된 유리병(vial) 내에서 0.9% NaCl 용액(대략 5의 pH) 내에서 수행되는 차이점을 갖고 준비되었다.

샘플 "RXD SLActive"

비교의 목적으로, SLActive® 프로토콜에 따르면, SLA® 처리에 의해 성취된 샘플의 제2 부분은 0.9% NaCl 용액 내에 직접 침지되어 보관되었는 데, 이에 의해 비교예 "RXD SLActive"가 성취되었다.

보관 및 살균

모든 샘플은 2개월의 최소 기간 동안 보관되었다.

RXD SLA HF 및 RXD SLActive 샘플은 이하에 설명된 평가 방법에 따라 이들의 표면을 분석하기 전에 γ(감마)-살균되었다(25-42 kGy). 살균 전후에 디스크 상에 수행된 비교 실험은 이하의 평가 방법에 의해 얻어진 결과에 대한 γ(감마)-살균의 영향의 지시를 나타내지 않았다.

1.2. 평가 방법

1.2.1. 접촉각 측정

접촉각 측정이 친수성 또는 소수성의 정도를 결정하기 위해 수행되었다. "RXD SLA HF" 및 "RXD SLActive"에 대해, 3개의 샘플 디스크가 분석되었다.

접촉각은 초순수로 정적 테스트(sessile drop test)(EasyDrop DSA20E, Kruss GmbH)를 사용하여 결정되었다. 0.3 ㎕(마이크로리터)의 액적 크기가 RXD SLA HF 샘플(즉, 건식 보관된 샘플)에 대해 선택되었고, 0.1 ㎕(마이크로리터)이 RXD SLActive 샘플(즉, 염수 용액 내에 보관된 샘플)에 대해 선택되었다. RXD SLActive 샘플이 접촉각 측정 전에 Ar의 스트림 내에서 송풍 건조되었다. RXD SLA HF 샘플이 수용된 바와 같이 측정되었다. 접촉각은 표면 상의 액적의 윤곽에 원형 세그먼트 함수를 피팅함으로써 계산되었다.

접촉각 측정의 결과가 표 11에 제공되어 있다.

	디스크 1 CA [°]	디스크 2 CA [°]	디스크 3 CA [°]	평균 CA [°]	Std CA [°]
RXD SLA HF	134.3	139.6	134.6	136.2	3.0
RXD SLActive	0	0	0	0

접촉각(제1 결과 세트)

표 11에 나타낸 바와 같이, 모든 RXD SLA HF 디스크는 순수와 접촉될 때 약 135°의 접촉각을 나타내는 소수성이었고, 반면에 RXD SLActive 디스크는 물에 의한 완전한 습윤을 나타내는 친수성이었다.

다른 실험에서, 또한 RXD SLActive HF 샘플이 이들 접촉각에 대해 평가되었고, 그 결과를 표 12에 나타낸다.

	디스크 1 CA [°]	디스크 2 CA [°]	디스크 3 CA [°]	평균 CA [°]	Std CA [°]
RXD SLA HF	140.7	138.2	135.8	138.2	2.5
RXD SLActive	0.0	0.0	0.0	0.0
RXD SLActive HF	0.0	0.0	0.0	0.0

접촉각(제2 결과 세트)

이들 결과는 RXD SLA HF 및 RXD SLActive 샘플에 관한 이전의 발견을 확증하고, 또한 RXD SLActive HF 샘플의 완전한 습윤을 나타내고, 따라서 그 표면은 또한 RXD SLActive 샘플의 표면의 경우에서와 같이, 전술된 정의 내에서 초소수성으로서 간주될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 서브마이크로스코픽 구조체는 이들이 형성되어 있는 표면의 친수성에 임의의 부정적인 영향을 미치지 않는다.

1.2.2. SEM(Scanning electron microscopy: 주사 전자 현미경)

나노구조체의 시각적 외관 및 형태학이 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 평가되었다.

SEM 측정은 각각의 유형의 표면에 대해 3개의 디스크 상에서 수행되었다. 측정은 유형 Zeiss Supra 55의 주사 전자 현미경 상에서 수행되었다. 개략 SEM 이미지는 에버하트-톤리(Everhart-Thornley) 검출기를 사용하여 20 kV의 가속 전압으로 성취되었고, 고해상도 이미지는 렌즈내 검출기를 사용하여 5 kV의 가속 전압으로 성취되었다.

샘플의 SEM 이미지는 첨부 도면에 제공되어 있고, 여기서

도 1은 약 1'000x의 배율의 샘플 RXD SLA HF의 표면의 SEM 이미지에 관련되고, 10 마이크로미터에 대응하는 스케일이 이미지의 좌하측 코너에 제공되어 있고;

도 2는 약 1'000x의 배율의 샘플 RXD SLActive HF의 표면의 SEM 이미지에 관련되고, 10 마이크로미터에 대응하는 스케일이 이미지의 좌하측 코너에 제공되어 있고;

도 3은 약 1'000x의 배율의 샘플 RXD SLActive의 표면의 SEM 이미지에 관련되고, 10 마이크로미터에 대응하는 스케일이 이미지의 좌하측 코너에 제공되어 있고;

도 4는 약 20'000x의 배율의 샘플 RXD SLA HF의 표면의 SEM 이미지에 관련되고, 200 나노미터에 대응하는 스케일이 이미지의 좌하측 코너에 제공되어 있고;

도 5는 약 50'000x의 배율의 샘플 RXD SLActive HF의 표면의 SEM 이미지에 관련되고, 200 나노미터에 대응하는 스케일이 이미지의 좌하측 코너에 제공되어 있고;

도 6은 약 20'000x의 배율의 샘플 RXD SLActive의 표면의 SEM 이미지에 관련되고, 200 나노미터에 대응하는 스케일이 이미지의 좌하측 코너에 제공되어 있다.

도 1 내지 도 6으로부터 볼 수 있는 바와 같이, 샘플은 SLA® 처리에 의해, 즉 샌드블라스팅 및 HCl과 H₂SO₄의 비등 혼합물 내의 샘플의 에칭에 의해 얻어진 매크로스코픽 및 마이크로스코픽 토포그래픽 형태를 나타내고 있다.

그러나, 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태의 외관의 뚜렷한 차이가 있다. 구체적으로, 서브마이크로스코픽 구조체는 서브트랙티브 프로세스 단계 b)에 의해, 즉 HF를 포함하는 에칭 용액을 사용하는 에칭에 의해 형성된다.

서브마이크로스코픽 구조체는 도 4로부터 특히 볼 수 있는 바와 같이, 적어도 하나의 직선형 에지를 갖는 형상을 갖는 데, 더 구체적으로 날카로운 에지형 또는 심지어 톱니형이다. 다른 실험은 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태가 NaCl 내에 또는 공기 중에 RXD SLA HF 샘플을 보관한 후에 유지되는 것을 나타내고 있다.

또한, 도 4 및 도 5에 의해 도시되어 있는 바와 같이(상이한 배율로 취해짐), SLA® 또는 SLActive® 표면이 시작점으로서 취해지면 유사한 구조체가 얻어졌다.

서브트랙티브 프로세스 단계 b)를 포함하는 본 발명의 프로세스에 의해 형성된 서브마이크로스코픽 구조체는, WO 2013/056844호에 설명된 기술에 따라 형성되고 따라서 시간 경과에 따라 점진적인 "성장" 또는 "축적"에 의해 형성되는 RXD SLActive 샘플 상의 나노구조체와는 크기 및 형상의 모두에서 완전히 상이하다.

1.2.3. 거칠기 파라미터 결정

거칠기 이미지는 20x 렌즈를 구비한 공초점 현미경(μsurf explorer, NanoFocus AG, 독일 오버하우젠)을 사용하여 획득되었다. 3개의 측정이 각각의 샘플 디스크 상에 수행되었고, 3개의 디스크가 각각의 유형의 표면을 위해 측정되었다. 거칠기 파라미터는 전술된 WinSAM 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 798 ㎛(마이크로미터)×798 ㎛(마이크로미터)의 크기를 갖는 전체 거칠기 이미지가 3D 거칠기 파라미터의 계산을 위해 사용되었다.

마이크로스코픽 토포그래픽 형태의 값(거칠기)이 30 ㎛(x = 31 ㎛, y = 30 ㎛, 20×19개의 이미지 점)의 차단 파장을 갖는 이동 평균 가우스 필터(Gaussian filter)를 사용하여 결정되었다. 다음에, 거칠기값은 진폭 밀도로부터 한계를 갖는 KFL 분석에 의해 계산되었다.

특히, S_a(3차원에서 표면의 산술 평균 편차), S_t(3차원에서 프로파일의 최대 마루 대 골 높이) 및 S_sk(비대칭도)가 2차원에서의 각각의 파라미터(R_a, R_t, R_sk)에 관한 EN ISO 4287에 유사하게 결정되었다. 3차원 파라미터에 대해, 기호(S_z)가 프로파일의 최대 마루 대 골 높이에 대해 사용되는[본 발명의 맥락에서 사용된 기호(S_t) 대신에] ISO 25178을 또한 참조한다.

표 21는 2개의 샘플의 마이크로거칠기값의 평균값을 제시하고 있다. 이 표는 적어도 RXD SLActive 및 RXD SLA HF의 모두의 S_a 및 S_t의 값이 SLA®/SLActive® 임플란트에 대해 통상적으로 관찰된 동일한 범위 내에 있다는 것을 나타내고 있다. 특히, RXD SLA HF의 S_a 및 S_t 값은 15% 미만만큼 RXD SLActive 샘플의 각각의 값으로부터 벗어난다.

	Sa [㎛]	Std Sa [㎛]	St [㎛]	Std St [㎛]	Ssk	Std Ssk
RXD SLA HF	1.080	0.024	6.81	0.13	0.261	0.037
RXD SLActive	0.970	0.046	6.38	0.26	0.192	0.051

마이크로스코픽 토포그래픽 형태의 값(제1 결과 세트)

다른 실험에서, 또한 RXD SLActive HF 샘플은 그 위에 형성된 마이크로스코픽 토포그래픽 형태에 대해 평가되었고, 그 결과(RXD SLA HF 및 RXD SLActive에 대한 것들 이외의)를 표 22에 나타낸다.

	Sa [㎛]	Std Sa [㎛]	St [㎛]	Std St [㎛]	Ssk	Std Ssk
RXD SLA HF	1.065	0.046	7.56	0.42	0.270	0.035
RXD SLActive	1.068	0.020	7.00	0.16	0.181	0.047
RXD SLActive HF	1.048	0.029	7.40	0.14	0.286	0.026

마이크로스코픽 토포그래픽 형태의 값(제2 결과 세트)

이들 결과는 RXD SLA HF 및 RXD SLActive 샘플에 관한 이전의 발견을 확증하고, RXD SLActive에 대해 결정된 것들에 비교하여 RXD SLActive HF 샘플에 대해 결정된 토포그래피 파라미터의 단지 약간의 편차만을 또한 나타내고 있다. 구체적으로, 15% 미만의 S_a 및 S_t 값의 편차는 RXD SLActive 샘플에 비교하여 RXD SLActive HF 샘플에 대해 발견되었다.

1.2.4. 단백질 흡착 측정

알부민[소혈청(bovine serum: BSA)으로부터, Alexa Fluor 647 배합체(conjugate), Invitrogen, 미국], 섬유소원[인간 플라즈마; HPF로부터, Alexa Fluor 546 배합체, Invitrogen, 미국] 및 섬유결합소[소 플라즈마; BSF로부터의 로다민 섬유결합소(Rhodamine Fibronectin), Cytoskeleton, Inc., 미국]이 형광성 스캐너를 사용하는 형광 현미경에 의해 상이한 표면 상에 그 흡착(또는 "부착") 거동을 연구하기 위해 모델 단백질로서 사용되었다.

0.5 mg/ml 알부민 및 0.5 mg/ml 섬유소원의 원액이 제품 설명서에 따라 제조되었다. 보관을 위해, 이들 원액은 0.5 ml 부분표본(aliquot)으로 분할되고 -20℃에서 동결되었다. 섬유결합소 용액은 원액을 제조하지 않고, 20 ㎍ 유리병으로부터 직접 제조되었다.

모든 단백질 흡착 용액은 10 M 4-(2-하이드록시에틸)-피페라진-1-에탄설폰산(HEPES) 및 pH 7.4를 갖는 150mM NaCl로 준비된 HEPES 2 버퍼로 제조되었다. 사용 전에, HEPES 2 버퍼는 필터링되었다(Whatman FP 30/0.2 CA-S, 크기 0.2 ㎛, 최대 압력 7 bar).

저단백질 농도 실험에 있어서, 단백질 용액은 필터링된 HEPES 2 및 규정된 농도의 형광 표지된 단백질(fluorescently labelled protein)로 이루어졌다(이하의 표 3 참조). 고농도 실험에 있어서, 비표지 단백질(unlabelled protein)이 인간 혈액 내의 실제 단백질 농도를 부가적으로 시뮬레이션하도록 첨가되었다(표 3). 비표지 단백질의 용해도를 향상시키기 위해, HEPES 2는 용액의 준비 전에 37℃로 가열되었다(수욕, INCO 2/108, Memmert GmbH&Co, 독일). 상이한 단백질이 개별적으로 테스트되었고; 따라서, 준비된 단백질 용액은 항상 단지 하나의 유형의 단백질만을 함유하였다. 표지 단백질은 비표지 단백질처럼 거동하는 것으로 가정된다.

형광 마커의 불안정성에 기인하는 결과의 가능한 불확실성을 감소시키기 위해, 단백질 용액은 흡착 실험 직전에 신선하게 준비되었다.

적용된 방법은 형광 표지된 단백질의 인가 및 강도 측정 뿐만 아니라 형광 스캐닝 이미지의 비교에 기초하였다.

알부민 및 섬유소원 실험을 위해, 샘플은 일반적으로 10분 동안 2 ml의 단백질 용액 내로 침지되었다. 흡착 프로세스는 24-우물 플레이트 내에서 수행되었다. 섬유결합소에 의한 실험은 96-우물 플레이트 내에서 0.3 ml 단백질 용액으로 또한 10분의 흡착 시간으로 수행되었다. 모든 흡착 실험은 실온에서 수행되었다.

표면 상에 흡착되지 않은 단백질은 10초 동안 2 ml의 순 HEPES 2 내에 샘플을 잠수시킴으로써 제거되었다. 다음에, 이들 단백질은 5초 동안 5 ml의 HEPES 2 내에서 피벗되고, 이어서 동일한 5 ml의 HEPES 2로 헹굼 단계가 이어졌다. 부가적으로, 샘플은 3초 동안 초순수로 헹굼되었고, 질소의 스트림 내에서 건조되었고(약 1 bar의 압력에서), 24-우물 플레이트 내에서 실온에서 보관되었다. 흡착된 단백질의 형광 표지의 표백을 회피하기 위해, 우물 플레이트는 알루미늄 포일로 커버되었다.

실험 조건은 이하의 표 3에 제공되어 있다:

단백질 농도 단백질 용액 시간 샘플

저단백질 농도

알부민 3 ㎍/mL 2 mL 10분 6 섬유소원 7 ㎍/mL 2 mL 10분 6 섬유 결합소 3 ㎍/mL 0.3 mL 10분 6

고단백질 농도

알부민 3 ㎍/mL + 10 ㎍/mL* 2 mL 10분 6 섬유소원 7 ㎍/mL + 1 ㎍/mL* 2 mL 10분 6 섬유 결합소 3 ㎍/mL + 0.2 ㎍/mL* 0.3 mL 10분 6

단백질 흡착 실험의 실험 조건

* = 비표지 단백질

표면에 부착된 단백질의 양은 마이크로어레이 형광 스캐너(Axon Genepix 4200A, Molecular Devices, 미국)를 사용하여 정량적으로 측정되었다. 강도 측정을 위해, 해상도는 100 ㎛/화소로 설정되었고, 단지 라인당 하나의 스캔만이 수행되었다. 이미징을 위해, 해상도는 5 ㎛/화소로 설정되었고, 라인당 3개의 스캔이 수행되었다. 알부민 흡착을 판독하기 위해, 635 nm의 파장을 갖는 레이저가 사용되었고, 반면에 섬유소원 및 섬유결합소 흡착된 표면의 스캐닝이 532 nm 레이저를 사용하여 수행되었다. 가장 양호한 초점 위치가 모든 샘플에 대해 개별적으로 결정되었다.

형광 스캐너의 광증배관(photo-multiplier tube: PMT)이 350 내지 600의 이득 사이에서 선형이 되도록 지정되었다. 이 이유로, 모든 스캔은 이 PMT 범위에서 수행되었다. 이득은 샘플의 형광 신호의 그레이스케일 한계 내에 체류하기 위해 표면, 단백질 및 농도의 각각의 조합에 대해 적응되었다. 선택된 모든 이득은 표 4에 열거되어 있다.

RXD SLActive RXD SLA HF

저단백질 농도

알부민 400 600 섬유소원 450 650 섬유 결합소 500 600

고단백질 농도

알부민 600 600 섬유소원 550 550 섬유 결합소 550 600

단백질 흡착을 측정하기 위한 샘플의 모든 배치(batch)에 대해 선택된 이득

단백질 흡착의 균질성을 평가하기 위해, 고해상도 이미지가 시각적 검사에 의해 서로 비교되었다.

형광 스캐닝에 의해 획득된 형광 강도 데이터는 첨부 도면에 제공되어 있다.

도 7은 상기에 규정된 저단백질 농도에서 RXD SLA HF 표면 상의 알부민, 섬유소원 및 섬유결합소에 대해 측정된 형광 강도에 관한 도면을 도시하고 있고;

도 8은 상기에 규정된 고단백질 농도에서 RXD SLA HF 표면 상의 알부민, 섬유소원 및 섬유결합소에 대해 측정된 형광 강도에 관한 도면을 도시하고 있다.

도 7 및 도 8에 제시된 모든 값은 SLActive® protocol(Ti SLActive)에 따라 처리된 티타늄 바디에 대해 측정된 각각의 강도로 정규화된다. 에러 바아는 표준 편차를 지시하고 있다.

도 7에 따르면, 저단백질 농도에서 친수성 Ti SLActive 및 RXD SLActive 표면에 대한 것보다 훨씬 더 낮은 모든 단백질의 흡수가 소수성 RXD SLA HF 표면에 대해 결정되었다.

고단백질 농도에서, 섬유소원의 매우 선택적 흡수가 도 8에 도시되어 있는 바와 같이, 양호하게 설정된 Ti SLActive 상에 흡착된 섬유소원 중 하나에 상응하는 강도를 갖는 본 발명에 따른 RXD SLA HF에 대해 결정되었다. 저단백질 농도 및 고단백질 농도의 모두에서, 알부민의 비특정 흡수는 비교예 Ti SLActive 및 RXD SLActive에 대한 것보다 RXD SLA HF에 대해 훨씬 더 낮았다.

1.2.5. 인간 전혈 배양 후에 섬유소 네트워크 형태의 평가

RXD SLActive HF 샘플은 인간 전혈로 배양되었고, SEM 및 CLSM(confocal laser scanning microscopy: 공초점 레이저 주사 현미경) 이미징에 의해 섬유소 네트워크 형태에 대해 분석되었다.

구체적으로, 건강한 지원자로부터 얻어진 인간 전혈은 3 IU/ml 나트륨 헤파린으로 직접 부분적으로 헤파린화되었고(최종 농도 0.5 IU 헤파린/ml 혈액), 회수 후 1시간 이내에 실험을 위해 사용되었다.

샘플은 샘플 홀더 내에 배치되었고, 모든 샘플이 4 mm 두께의 혈액층으로 커버될 때까지 신선하게 회수된 혈액이 첨가되었다. 공기와의 추가의 접촉을 방지하기 위해, 샘플 홀더는 뚜껑으로 폐쇄되었고 실온에서 10 rpm에서 텀블링 셰이커(tumbling shaker) 상에서 배양 전에 파라필름(parafilm)으로 밀봉되었다.

배양 시간은 각각의 실험에 대해 개별적으로 결정되었다. 이를 위해, 전혈은 표지된 섬유소원(Alexa488)으로 스파이크되었고(spiked), 이는 형광 현미경을 사용하여 샘플 상의 혈액 응고의 라이브 모니터링을 허용한다. 참조로서, 샘플 RXD SLActive(및 RXD SLA)가 사용되었고, 2개의 시점이 선택되었다(t1: 얇은, t2: 기준 샘플 상에 존재하는 두꺼운 섬유소 네트워크).

배양 후에, 혈액은 제거되었고, 샘플은 샘플 홀더 내에 미리 가온된 PBS를 첨가함으로써 3회 세척되었고, 이어서 각각의 세척 단계에 대해 1분 동안 10 rpm에서 텀블링 셰이커 상에서 배양되었다. 그 후에, 샘플은 추가의 처리를 위해 새로운 96-우물 플레이트 내로 이송되었다.

SEM 이미징을 위해, 샘플은 실온(RT)에서 1 h 동안 개질된 카르노브스키 용액(Karnovsky solution) 내에 고정되었고 이어서 PBS 내에서 2회 세척되었다. 그 후에, 샘플은 등차 급수의 에탄올(50, 70, 80, 90 및 100%)의 용액 내에 샘플을 침지하고, 이어서 30분 동안 헥사메틸디실라잔(HMDS) 내에서 배양에 의해 탈수되었다. 마지막으로, 샘플은 새로운 96-우물 플레이트 내에 배치되고 RT에서 밤새 건조되었다. 다음날, 샘플은 금/팔라듐으로 스퍼터 코팅되었다(고진공 코팅기 Leica EM ACE 600, 스위스). SEM 이미징은 2 kV의 가속 전압 및 10 ㎂ 전류 흐름에서 Hitachi S-4800(Hitachi High-Technologies, 캐나다)을 사용하여 수행되었다.

CLSM 분석을 위해, 샘플은 RT에서 1 h 동안 Alexa546-표지된 팔로이딘(phalloidin)으로 혈소판을 염색하기 전에 5% 염소 혈청 및 1% FCS로 PBS 내에서 30분 동안 배양되었다. 혈소판 및 섬유소 네트워크(Alexa488-표지된 섬유소원)가 CLSM (10x, 40x 배율)로 이미징되었다. SEM 이미징에 의해 보여지는 섬유소 네트워크의 커버리지 및 두께에 따라, 단지 하나의 시점(t1 또는 t2)이 이미징되었다. 표면 상의 섬유소에 의한 완전한 커버리지를 나타내는 샘플 상에서, 섬유소 네트워크의 두께는 z-스택 이미지로부터 측정되었다. 섬유소 네트워크의 두께를 평가하기 위해, 2개의 샘플의 4 z-스택 이미지(이미지당 4 내지 6개의 측정을 갖는 샘플당 2개의 이미지)가 Zeiss ZEN 소프트웨어의 측정 기능을 사용하여 샘플 표면으로부터 섬유소 네트워크의 상부면까지의 거리를 측정하도록 분석되었다. CLSM 분석은 3개의 독립적인 실험에 의해 수행되었다.

SEM 이미징의 반정량적 분석은 RXD SLActive 샘플에 비교하여 RXD SLActive HF 샘플의 더 높은 섬유서 네트워크 두께 및 더 큰 샘플 커버리지에 대한 경향을 나타낸다.

이는 이하의 도면에 의해 입증되고,

도 9는 약 800x의 배율의 14분 배향 후에 샘플 RXD SLActive HF의 표면의 SEM 이미지에 관련되고, 50 마이크로미터에 대응하는 스케일이 이미지의 우하측 코너에 제공되어 있고;

도 10은 약 800x의 배율의 14분 배향 후에 샘플 RXD SLActive의 표면의 SEM 이미지에 관련되고, 50 마이크로미터에 대응하는 스케일이 이미지의 우하측 코너에 제공되어 있다.

섬유소 네트워크의 존재, 분포 및 두께를 평가하여, SEM 이미지의 반정량적 분석이 표에 제공된 2개의 샘플에 대해 그리고 2개의 상이한 배향 주기에 대해 각각의 경우에 취해진 0 내지 4의 정량적 등급의 값을 4개의 상이한 실험에 대해 나타내고 있는 표 5에 요약되어 있는 데, 이 등급은 단지 적은 가시 섬유소 섬유를 갖는 혈액 세포의 패치(0)로부터 시작하여 샘플 표면을 완전히 커버하는 두꺼운 섬유소 네트워크(4)까지이다.

실험	배양 기간 (분)	RXD SLActive HF		RXD SLActive
1	10	1	2	1.5	1.5
	15	2	4	2	4
2	12	1.5	1.5	1	n.d.
	15	3.5	2	0.5	1
3	14	3	3	0.5	1
	17	4	2.5	4	2
4	15	4	4	4	4
	18	4	4	2	1.5

RXD SLActive HF 및 RXD SLActive 샘플 상에 수행된 4개의 상이한 실험에 대한 SEM 이미지의 반정량적 분석

15분 및 17분 각각 동안 전혈(부분적으로 헤파린화된 0.5 IU/ml)로 배양된 샘플 상에 형성된 섬유소의 두께는 전술된 바와 같이 평가되었고, 그 결과가 표 6에 제공되어 있다.

샘플	15분 배양		17분 배양
	섬유소층	두께 [㎛]	섬유소층	두께 [㎛]
RXD SLActive HF	균질	16.93	균질/ 스폿	14.29
RXD SLActive	균질	13.97	균질	9.86

RXD SLActive HF 및 RXD SLActive 샘플의 섬유소 층 두께의 분석

따라서, 비교 샘플에서보다 더 높은 섬유소 두께가 본 발명에 따른 샘플 상에서 결정되었다.

2. 체내 분석에 관한 예

토끼의 생물역학적 연구는 골융착에 대한 표면 토포그래피의 영향을 조사하기 위해 수행되었다. 뼈와 임플란트 사이의 부착은 뽑힘 저항 테스트(pull-out test)에 의해 직접 평가되었다.

2.1. 재료 및 방법

부가적으로, 토끼의 생물역학적 연구가 체내 티타늄 임플란트 디스크의 골융착을 조사하기 위해 수행되었다. 이들 부가의 연구를 위해, 디스크는 체외 실험을 위해 설명된 바와 같이, 그러나 6.2 mm 직경 및 2 mm 두께를 갖는 Roxolid 디스크를 사용하여 준비되었다. 각각의 샘플은 이하에 "RXD SLA HF II"라 칭한다.

2.2. 샘플의 표면의 특징화

샘플은 접촉각 측정 및 거칠기 파라미터 결정을 위해 전술된 시술을 사용하여 분석되었다.

접촉각 측정에 관하여, 123.2°의 평균값이 "RXD SLA HF II"에 대해 측정되었다.

거칠기 파라미터 결정은 표 7에 제공된 결과를 생성하였다.

	Sa [㎛]	Std Sa [㎛]	St [㎛]	Std St [㎛]	Ssk	Std Ssk
RXD SLA HF II	1.204	0.069	8.17	0.42	0.306	0.031

체내 연구의 RXD SLA HF II 샘플의 마이크로스코픽 토포그래픽 형태의 거칠기값

표 7에 제공된 결과는 상기에 얻어진 결과, 즉 적어도 RXD SLA HF II의 S_a 및 S_t의 값이 SLA®/SLActive® 임플란트에 대해 통상적으로 관찰된 동일한 범위 내에 있다는 것을 확증한다. 또한, 체내 연구의 샘플에 관하여, S_a, S_t 및 S_sk는 프로세스 단계 b), 즉 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태의 형성에 의해 단지 비실질적으로만 변화된다.

2.3. 생물역학적 뽑힘 저항 측정

전술된 바와 같이, 뽑힘 저항 연구가 토끼에 수행되었다. 이를 위해, 토끼는 진정되었고, 표준 수술 시술 중에, 경골당 2개의 디스크-임플란트, 즉 토끼당 총 4개의 임플란트를 수용하였다.

임플란트는 뼈 과성장으로부터 이들 임플란트를 보호하기 위해 테플론 캡을 구비하였고, 2개의 티타늄 나사로 피질골 내에 보유된 사전성형된 티타늄 밴드로 안정화되었다. 임플란트 시술 후에, 연조직층이 재배치되고 상처는 재흡수성 봉합부를 사용하여 폐쇄되었다.

골 임플란트 부착은 식립 4주 후에 테스트되었다.

수술 시술 뿐만 아니라 뽑힘 저항 테스트 설명에 관한 상세한 정보는 로놀드(Ronold) 및 엘링센(Ellingsen)[Biomaterials 23 (2002) 2201] 및 몬조(Monjo) 등[몬조 등, Biomaterials 29 (2008) 3771]에 의해 다른 문헌에 이미 공개되어 있다.

표 8은 식립 4주 후의 [N] 단위의 측정된 뽑힘 저항력을 제공한다.

	평균 뽑힘 저항력 [N]	Std	중간
RXD SLA HF II	50.3	23.32	50.9

식립 4주 후의 뽑힘 저항력

표 8로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 매우 높은 뽑힘 저항력이 본 발명에 따라 준비된 RXD SLA HF에 대해 결정되었다. RXD SLA HF의 표면의 비교적 높은 소수성이 주어지면, 이 결과는 가장 놀랍고, 본 발명의 서브트랙티브 프로세스 단계 b)에서 성취된 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태의 관련성을 강조한다.

Claims (18)

1. 티타늄 또는 티타늄 합금으로 제조된 바디 상에 향상된 혈액 응고 및/또는 세포 부착을 위한 토포그래피의 준비 방법으로서,
   a) 무기산을 포함하는 제1 에칭 용액으로 상기 바디의 표면의 적어도 일부를 에칭하는 단계, 및
   b) 상기 제1 에칭 용액과는 상이한 제2 에칭 용액 - 불화수소산을 포함함 - 으로 상기 단계 a) 하에서 에칭된 표면을 에칭하는 단계
   를 포함하는 토포그래피의 준비 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)에 따라 표면을 에칭함으로써, 마이크로스코픽 토포그래픽 형태가 형성되고, 상기 단계 b)에 따라 표면을 에칭함으로써, 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태가 상기 마이크로스코픽 토포그래픽 형태 내에 형성되는 것인 토포그래피의 준비 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 이하의 표면 파라미터,
   i) 3차원에서 표면의 산술 평균 편차이고, 0.1 ㎛ 내지 2.0 ㎛의 범위이고, 바람직하게는 0.4 ㎛ 내지 1.8 ㎛, 더 바람직하게는 0.8 ㎛ 내지 1.7 ㎛, 가장 바람직하게는 0.9 ㎛ 내지 1.5 ㎛의 범위인 S_a;
   ii) 3차원에서 최대 마루 대 골 높이이고, 1.0 ㎛ 내지 20.0 ㎛의 범위이고, 바람직하게는 3.0 ㎛ 내지 18.0 ㎛, 더 바람직하게는 4.5 ㎛ 내지 13.0 ㎛, 가장 바람직하게는 6.0 ㎛ 내지 12.0 ㎛의 범위인 S_t; 그리고/또는
   iii) 3차원에서 프로파일의 비대칭도(skewness)이고, -0.6 내지 1.0, 바람직하게는 -0.4 내지 0.6, 더 바람직하게는 -0.3 내지 0.5의 범위인 S_sk
   중 적어도 하나에 의해 규정되는 것인 토포그래피의 준비 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 단계 b)에서 형성된 상기 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태에 의해, 상기 단계 a)에서 형성된 상기 마이크로스코픽 토포그래픽 형태를 규정하고 S_a, S_t 및 S_sk로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 표면 파라미터가 최대 50%만큼, 최대 20%만큼, 더 바람직하게는 최대 10%만큼 변화되고, 가장 바람직하게는 본질적으로 불변 유지되는 것인 토포그래피의 준비 방법.
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 최대 1000 nm로 적어도 2차원으로 연장하는 서브마이크로스코픽 구조체를 포함하거나, 이 구조체로 본질적으로 이루어지는 것인 토포그래피의 준비 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a) 전에, 특히 샌드-블라스팅에 의해, 상기 표면에 매크로스코픽 토포그래픽 형태를 제공하는 단계를 더 포함하는 토포그래피의 준비 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바디는 티타늄 지르코늄 합금, 바람직하게는 13 내지 17% 지르코늄을 포함하는 바이메탈릭 티타늄 지르코늄 합금으로 제조되는 것인 토포그래피의 준비 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 에칭 용액 내의 불화수소산의 농도는 0.01 체적 % 내지 4 체적 %, 바람직하게는 0.05 체적 % 내지 2 체적 %, 더 바람직하게는 0.1 체적 % 내지 1 체적 %의 범위인 것인 토포그래피의 준비 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b) 하에서의 처리는 0.1분 내지 30분, 바람직하게는 0.5분 내지 20분, 더 바람직하게는 0.5분 내지 10분, 가장 바람직하게는 1분 내지 5분의 범위의 기간 동안 수행되는 것인 토포그래피의 준비 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)에서의 처리는 10℃ 내지 90℃, 바람직하게는 10℃ 내지 60℃, 더 바람직하게는 15℃ 내지 40℃, 더욱 더 바람직하게는 15℃ 내지 30℃의 범위의 온도, 가장 바람직하게는 실온에서 수행되는 것인 토포그래피의 준비 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 에칭 용액은 HCl과 H₂SO₄의 혼합물을 포함하거나, 이 혼합물로 본질적으로 이루어지는 것인 토포그래피의 준비 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바디는 치과용 임플란트 또는 치과용 임플란트 지대치이고, 상기 토포그래피는 사용시에 골조직 또는 연조직과 각각 접촉하도록 의도된 상기 바디의 표면의 적어도 일부 상에 제공되는 것인 토포그래피의 준비 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 토포그래피의 준비 방법에 의해 획득 가능한 바디.
14. 제13항에 있어서, 그 표면이 마이크로스코픽 토포그래픽 형태에 의해 그리고 상기 마이크로스코픽 토포그래픽 형태에 형성된 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태에 의해 형성되는 것인 바디.
15. 제14항에 있어서, 상기 마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 이하의 표면 파라미터,
    i) 3차원에서 표면의 산술 평균 편차이고, 0.1 ㎛ 내지 2.0 ㎛의 범위이고, 바람직하게는 0.4 ㎛ 내지 1.8 ㎛, 더 바람직하게는 0.8 ㎛ 내지 1.7 ㎛, 가장 바람직하게는 0.9 ㎛ 내지 1.5 ㎛의 범위인 S_a;
    ii) 3차원에서 최대 마루 대 골 높이이고, 1.0 ㎛ 내지 20.0 ㎛의 범위이고, 바람직하게는 3.0 ㎛ 내지 18.0 ㎛, 더 바람직하게는 4.5 ㎛ 내지 13.0 ㎛, 가장 바람직하게는 6.0 ㎛ 내지 12.0 ㎛의 범위인 S_t; 그리고/또는
    iii) 3차원에서 프로파일의 비대칭도이고, -0.6 내지 1.0, 바람직하게는 -0.4 내지 0.6, 더 바람직하게는 -0.3 내지 0.5의 범위인 S_sk
    중 적어도 하나에 의해 규정되는 것인 바디.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 서브마이크로스코픽 토포그래픽 형태는 최대 1000 nm로 적어도 2차원으로 연장하는 서브마이크로스코픽 구조체를 포함하거나, 이 구조체로 이루어지는 것인 바디.
17. 제16항에 있어서, 상기 서브마이크로스코픽 구조체의 적어도 일부는 적어도 하나의 직선 에지를 갖는 형상을 갖고, 구체적으로 날카로운 에지형 그리고/또는 톱니형인 것인 바디.
18. 치과용 임플란트 또는 치과용 임플란트 지대치를 위한 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 바디의 용도.

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