KR20110097869A - Ｓｉｒｔ1에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 ｓｉｒｔ1 관련된 질환의 치료 - Google Patents

Ｓｉｒｔ1에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 ｓｉｒｔ1 관련된 질환의 치료 Download PDF

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Abstract

올리고뉴클레오티드 화합물은 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드 및 이의 인코드된 산물들의 발현 및/또는 기능을 조절한다. Sirtuin 1(SIRT1))와 연관된 질병의 치료 방법은 SIRT1 천연 안티센스 전사체를 억제하도록 기획된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

Description

ＳＩＲＴ1에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 ＳＩＲＴ1 관련된 질환의 치료{TREATMENT OF SIRTUIN 1(SIRT1) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO SIRTUIN 1}
관련 출원의 교차-참고
본 출원은 2008년 12월 4일자 출원된 U.S. 가특허출원 61/119,965, 2009년 3월 4일자 출원된 U.S. 가특허출원 61/157,255, 그리고 2009년 11월 6일자 출원된 U.S. 가특허출원 61/259,072를 우선권으로 주장하며, 이들 각 서류는 전문이 참고문헌에 통합된다.
발명의 분야
본 발명의 구체예들은 SIRT1 및 관련 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
DNA-RNA 및 RNA-RNA 하이브리드화(Hybridization)는 DNA 복제, 전사 및 해독을 포함하는 여러 측면의 핵산 기능에 중요하다. 하이브리드화는 특정 핵산을 탐지하거나 또는 이의 발현을 변경시키는 다양한 기술의 중심이다. 안티센스 뉴클레오티드는 표적 RNA에 하이브리드되어, RNA 접합(splicing), 전사, 해독, 및 복제를 간섭함으로써 유전자 발현을 붕괴시킨다. 안티센스 DNA는 DNA-RNA 하이브리드가 대부분의 세포 유형에 존재하는 리보뉴클레아제 H의 활성에 의해 절단되는 기질로서의 기능을 하는 추가된 특징을 가진다. 안티센스 분자들은 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODNs)의 경우 세포안으로 운반될 수 있거나, 또는 내생성 유전자로부터 RNA 분자들로 발현될 수 있다. FDA는 최근 안티센스 약물, VITRAVENE™ (사이토메갈로바이러스 레티니티스(cytomegalovirus retinitis) 치료용)을 승인하였는데, 이는 안티센스가 치료요법적 유용성을 가진다는 것을 반영한다.
발명의 요약
본 요약은 본 발명의 성질 및 물질을 간략하게 나타내는 본 발명의 요약으로 제공된다. 이는 청구범위의 범주 또는 의미를 해석하거나 제한하는데 이용되어서는 안된다는 것을 인지해야 한다.
한 구체예에서, 본 발명은 상응하는 센스 유전자를 상향-조절하는 천연 안티센스 전사체의 임의 부분에 표적되는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써, 천연 안티센스 전사체의 작용을 억제하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에서는 천연 안티센스 전사체의 억제는 siRNA, 리보자임 및 소분자들에 의해 이루어질 수 있으며, 이 또한 본 발명의 범주내에 있는 것으로 간주된다.
한 구체예는 환자의 세포 또는 조직에서 SIRT1 폴리뉴클레오티드의 기능 또는 발현을 생체내 또는 시험관에서 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 길이가 5 내지 30개의 뉴클레오티드인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 상기 세포 또는 조직과 접촉시키고, 이때, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호:2 (도 8)의 뉴클레오티드 1-1028 또는 서열 번호:3의 뉴클레오티드 1 내지 429, 또는 서열 번호: 4의 뉴클레오티드 1 내지 156 또는 서열 번호:5의 뉴클레오티드 1 내지 593 (도 11)내의 5 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 역 상보성(reverse complement)과 최소한 50% 서열 동일성(Sequence identity)을 보유하며; 따라서, 환자의 세포 또는 조직에서 생체내 또는 시험관에서 SIRT1 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 SIRT1 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스 서열, 예를 들면, 서열 번호:2 내지 5에 제공되는 폴리뉴클레오티드, 및 이에 대한 임의의 변이체들, 대립유전자들, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 상보성 서열들을 표적한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예시는 서열 번호: 6-47에서 제시하고 있다.
또다른 구체예는 환자의 세포 또는 조직에서 SIRT1 폴리뉴클레오티드의 기능 또는 발현을 생체내 또는 시험관에서 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 길이가 5 내지 30개의 뉴클레오티드인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 상기 세포 또는 조직과 접촉시키고, 이때, 올리고뉴클레오티드는 SIRT1 폴리뉴클레오티드의 안티센스의 역 보체(reverse complement)와 최소한 50% 서열 동일성을 보유하며; 따라서, 환자의 세포 또는 조직에서 생체내 또는 시험관에서 SIRT1 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 것을 포함한다.
또다른 구체예는 환자의 세포 또는 조직에서 SIRT1 폴리뉴클레오티드의 기능 또는 발현을 생체내 또는 시험관에서 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 길이가 5 내지 30개의 뉴클레오티드인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 상기 세포 또는 조직과 접촉시키고, 이때, 올리고뉴클레오티드는 SIRT1 안티센스 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 올리노뉴클레오티드와 최소한 50% 서열 동일성을 보유하며; 따라서, 환자의 세포 또는 조직에서 생체내 또는 시험관에서 SIRT1 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 것을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 센스 및/또는 안티센스 SIRT1 폴리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 또는 치환된 뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 결합(bonds)을 포함한다.
또다른 구체예에서, 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산, 또는 잠금 핵산 (LNA:locked nucleic acids) 분자들을 포함하는 변형된 염기들을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 뉴클레오티드는 α-L-LNA을 포함하는 잠금 핵산 분자들이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 환자의 피하, 근육내, 정맥내 또는 복막내로 투여된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약학 조성물로 투여된다. 치료 섭생은 환자에게 안티센스 화합물을 최소한 한 번 투여하는 것을 포함하지만, 이와 같은 치료는 시간을 두고 다중 약량을 포함하는 것으로 변형될 수 있다. 치료는 하나 이상의 상이한 유형의 치료법과 병용될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 리포좀 안에 포집된다.
다른 측면들은 하기에서 설명된다.
참고문헌에 통합
본 명세서에서 언급되는 모든 공개, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 공개, 특허 또는 특허 출원이 참고문헌에 명시적으로 그리고 개별적으로 통합되는 것과 동일한 수준으로 참고문헌에 통합된다.
본 발명의 새로운 특징들은 첨부된 청구범위에서 더욱 상세하게 제시된다. 본 발명의 원리를 이용하는 실례가 되는 구체예를 제시하는 다음의 발명의 상세한 설명을 참고하면 본 발명의 특징들과 장점들을 더 잘 이해할 수 있으며, 첨부된 도면들은 다음과 같다:
도 1은 SIRT 안티센스 CV396200로 기획된 올리고뉴클레오티드의 실시간 PCR 결과를 나타낸다. 이 결과에서, HepG2 세포내에서 SIRT1 mRNA 수준은 sirtas (sirtas_5, P=0.01)로 기획된 siRNAs중 하나로 치료한 후 48시간에 상당히 증가되었다. 동일한 샘플에서, sirtas RNA 수준은 sirtas_5로 치료한 후 상당히 감소하였으며, sirtas_6 and sirtas_7으로 치료한 후에는 변화가 없었고, 또한 SIRT1 mRNA 수준에도 효과가 없었다(도 1b). sirtas_5, sirtas_6 및 sirtas_7은 차계로 서열 번호: 29, 30 및 31에 대응한다.
도 2는 SIRT 안티센스 CV396200에 대한 올리고뉴클레오티드 워크 크로스의 결과를 나타낸다. 실시간 PCR의 결과에서 HepG2 세포안에서 SIRT1 mRNA의 수준은 sirtas로 기획된 세 가지 안티센스 올리고뉴클레오티드로 치료된 후 48시간에 상당히 증가되었다. CUR-0292 내지 CUR-309는 차례로 서열 번호: 6 내지 23에 대응한다.
도 3은 HepG2 (도 3a) 및 Vero76 세포(도 3b)에서의 PS, LNA 및 2O Me 변형된 올리고뉴클레오티드에 대한 결과를 나타낸다. 실시간 PCR 결과에서, HepG2 세포에서의 SIRT1 mRNA의 수준은 SIRT1 안티센스에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드로 기획된 PS, LNA, 2O Me 및 2O Me mixmer로 치료한 후 48시간에 상당히 증가되었다. Vero 세포내에서 SIRT1 mRNA의 수준은 SIRT1 안티센스에 대한 PS 및 LNA 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드로 치료한 후 48시간에 역시 증가되었다. CUR-0245, CUR-0736, CUR-0688, CUR-0740 및 CUR-0664으로 표시된 막대는 차례로 서열 번호:24 내지 28에 대응한다.
도 4는 원숭이 지방 생검의 PCR 결과를 나타낸다. 실시간 PCR 결과에서 SIRT1 안티센스 CV396200.1에 대해 기획된 올리고뉴클레오티드, CUR-963이 투여된 원숭이의 지방 생검에서 SIRT1 mRNA 수준이 증가되었다. CUR-963은 서열 번호: 25에 대응한다.
도 5는 원숭이의 주요 간 세포의 PCR 결과다. 실시간 PCR 결과에서 SIRT1 안티센스에 대한 올리고뉴클레오티드, CUR-0245로 치료후 SIRT1 mRNA 수준이 증가되었다. CUR-0245로 표시된 막대는 서열 번호: 24에 대응한다.
도 6은 SIRT 안티센스 CV396200에 대해 기획된 올리고뉴클레오티드의 결과를 나타낸다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포내에서 SIRT1 mRNA 수준이 SIRT1 안티센스 CV396200로 기획된 올리고뉴클레오티드중 하나에서 상당히 증가되었다. CUR-1230, CUR-1231, CUR-1232 및 CUR-1233으로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 32 내지 35에 대응한다.
도 7은 SIRT 안티센스 CV428275에 대해 기획된 올리고뉴클레오티드의 결과를 나타낸다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포에서의 SIRT1 mRNA 수준은 SIRT1 안티센스 CV428275에 대해 기획된 올리고뉴클레오티드중 두 개에서 상당히 증가된다. CUR-1302, CUR-1304, CUR-1303 및 CUR-1305로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 36 내지 39 에 대응한다.
도 8은 실시간 PCR 결과다. 결과에서 SIRT 안티센스 BE717453에 대해 기획된 올리고뉴클레오티드중 하나로 치료한 후 HepG2 세포내에서 SIRT1 mRNA 수준이 상당히 증가되었다. CUR-1264, CUR1265 및 CUR-1266으로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 40 내지 42에 대응한다.
도 9는 실시간 PCR 결과다. 결과에서 SIRT 안티센스 AV718812에 대해 기획된 올리고뉴클레오티드중 세 개의 올리고뉴클레오티드로 치료한 후 HepG2 세포내에서 SIRT1 mRNA 수준이 상당히 증가되었다. CUR-1294, CUR-1297, CUR-1295, CUR-1296 및CUR-1298로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 43 내지 47에 대응한다.
도 10은 서열 번호: 1: 호모 사피엔스 시르투인(Homo sapiens sirtuin) (침묵 메이팅 유형 정보 조절 2 상동체) 1 (S. cerevisiae) (SIRT1), mRNA (NCBI 수탁번호: NM_012238.3)을 나타내며 및 서열 번호: 1a는 SIRT의 게놈 서열을 나타낸다(엑손은 대문자, 인트론은 소문자로 나타낸다)
도 11에서는 다음을 나타낸다:
서열 번호: 2: 확장된 천연 안티센스 서열 (CV396200 - 확장됨)
서열 번호: 3: 천연 안티센스 서열 (CV428275)
서열 번호: 4: 천연 안티센스 서열 (BE717453)
서열 번호: 5: 천연 안티센스 서열 (AV718812)
도 12는 서열 번호: 6 부터 23을 나타내며, *는 포스포티오에이트 포스포티오에이트 결합을 나타낸다.
도 13은 서열 번호: 24 내지 28을 나타내는데, *는 포스포티오에이트 결합을 나타내며, + 는 LNA을 나타내고, 그리고 m은 2O Me를 나타낸다.
도 14는 서열 번호: 29 내지 31을 나타내는데, SIRT 안티센스 CV396200에 대해 기획된 이중 가닥의 테스트 올리고뉴클레오티드의 안티센스 서열이며, 차례로 sirtas_5, sirtas_6 및 sirtas_7에 대응한다.
도 15는 SIRT1 안티센스 CV396200에 대해 기획된 서열 번호: 32, 33, 34 및 35를 나타낸다.
도 16은 SIRT1 안티센스 CV428275에 대해 기획된 서열 번호:36, 37, 38 및 39를 나타낸다.
도 17은 SIRT1 안티센스 BE717453에 대해 기획된 서열 번호:40, 41 및 42를 나타낸다.
도 18은 SIRT1 안티센스 AV718812에 대해 기획된 서열 번호:43, 44, 45, 46 및 47을 나타낸다.
도 19는 서열 번호: 48 내지 51를 나타낸다. 서열 번호: 38은 SIRT1 천연 안티센스 CV396200의 엑손 4에 대응하고, 서열 번호: 49, 50 및 51은 forward 프라이머 서열, reverse 프라이머 서열 그리고 리포터 서열을 차례로 나타낸다.
도 20은 CUR 962에 대응하는 서열 번호: 52를 나타내고, *는 포스포티오에이트 결합을 나타내며, + 는 LNA을 나타낸다.
본 발명의 몇 가지 측면들이 설명을 위한 실시예를 참고하여 하기에서 설명된다. 본 발명의 충분한 이해를 제공하기 위하여 많은 특정 설명들, 상관관계 및 방법들이 제시되어 있다. 당업자는 그러나, 하나 이상의 특정 세부 사항 없이도 또는 다른 방법들을 이용하여 본 발명을 실시할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 발명은 실시 또는 과정의 순서에 제한을 받지 않는데, 그 이유는 일부 실시는 상이한 순서로 또는 다른 실시 또는 과정과 동시에 일어날 수도 있기 때문이다. 또한, 본 발명에 따른 방법을 이행하는데 설명된 모든 실시 또는 과정이 필요한 것은 아니다.
여기에서 설명된 모든 유전자, 유전자 이름 및 유전자 산물들은 여기에서 설명된 방법 및 조성물을 적용시킬 수 있는 임의의 종으로부터 얻은 상도체들에 상응하다. 따라서, 용어들은 인간 및 마우스의 유전자 및 유전자 산물들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 종으로부터의 유전자 또는 유전자 산물들이 설명되어 있을 때, 이 내용은 예를 든 것이며, 명백하게 다른 표시가 없는 한 이것에 한정시키는 것으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 여기에서 설명된 유전자의 경우, 예를 들면, 일부 구체예에서, 포유류 핵산 및 아미노산 서열들은 다른 포유류, 물고기, 양서류, 파충류 및 조류를 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 동물로부터 얻은 상동성 및/또는 동족(orthologous) 유전자 및 유전자 산물들을 포함한다. 바람직한 구체예들에서, 유전자 또는 핵산 서열들은 인간의 것이다.
정의
여기에서 설명된 용어는 특정 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 본 발명을 이에 한정시키고자 하는 의도는 아니다. 여기에서 사용된 것과 같이, 단수형( "a", "an" 및 "the")은 명시적으로 다른 언급이 없는 한 복수의 개념을 포함한다. 더욱이, 포함하는(including), 포함하다(includes), 가지는(having), 가지다(has), ~와 함께(with) 또는 이의 변형은 명세서 또는 청구범위에 사용되었을 때, “포함하는(comprising)”과 유사한 의미로 이용된다.
"약" 또는 "대략"은 당업자가 결정할 수 있는 특정 값의 수용가능한 오차 범위내에 있다는 것을 말하며, 이 값이 어떻게 측정되는지 또는 결정되는 지에 따라 부분적으로 달라지며, 가령, 측정 시스템의 제한에 의해 부분적으로 달라질 수 있다. 예를 들면, "약" 은 해당 기술 분야의 실행시 1 또는 1 이상의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더욱 바람직하게는 최대 5%, 그리고 여전히 바람직하게는 최대 1%의 범위가 된다. 대안으로, 생물학적 시스템 또는 프로세스에 대해 특히, 이 용어는 크기의 배수, 바람직하게는 해당 값의 5배, 더욱 바람직하게는 2배 범위 내에 있음을 의미한다. 명세서 및 청구범위에서 특정 값이 사용되었을 때, 다른 언급이 없는 한, “약”은 특정 값의 허용가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 간주되어야 한다.
여기에서 사용된 것과 같이, "mRNA"는 표적 유전자의 현재 공지의 mRNA 전사체 및 밝혀질 수 있는 임의의 추가 전사체들을 포함한다.
"안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "안티센스 화합물"은 또 다른 RNA 또는 DNA (표적 RNA, DNA)에 결합하는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 예를 들면, 이것이 RNA 올리고뉴클레오티드이면, RNA-RNA 상호작용에 의해 또다른 RNA 표적에 결합하고, 그리고 표적 RNA의 활성을 변경시킨다(Eguchi et al ., 1991 Ann . Rev . Biochem . 60, 631-652). 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 기능을 상향 또는 하향 조절할 수 있다. 이 정의는 치료, 진단 또는 다른 관점에서 유용한 임의의 외부 RNA 또는 DNA 분자를 포함한다. 이러한 분자들은 예를 들면, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자들, 간섭 RNA (RNAi), 마이크로(micro) RNA, 디코이 RNA 분자들, siRNA, 효소적 RNA, 치료요법적 에디팅(therapeutic editing) RNA 그리고 항진 및 길항 RNA, 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 유도 서열(EGS: external guide sequence) 올리고뉴클레오티드, 선택적 스플라이스(alternate splicers), 프라이머, 프로브, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 하이브리드되는 기타 올리고머 화합물들을 포함한다. 이와 같이, 이들 화합물들은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 단일-가닥, 또는 환형 올리고머 화합물들의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 내용에서, "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머 또는 이의 모방체(mimetics)를 말한다. "올리고뉴클레오티드"는 천연 및/또는 변형된 모노머 또는 링키지의 선형 또는 원형 올리고머를 포함하는데, 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 치환된 그리고 이의 알파-아노머 형, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 그리고 이와 유사한 것을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 왓슨-크릭 형태의 염기쌍, Ho또는 역 Ho유형의 염기쌍 또는 이와 유사한 것과 같은 모노머-대-모노머 상호작용의 정기적 패턴 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다.
올리고뉴클레오티드는 상이한 부분들로 구성된 “키메라”가 될 수 있다. 본 발명의 내용에서, "키메라" 화합물은 두 개 이상의 화학적 부분, 예를 들면, DNA 구역, RNA 구역, PNA 구역 등을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 각 화학적 구역은 최소한 한 개의 모노머 단위, 가령, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우는 뉴클레오티드로 구성된다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 최소한 한 가지 구역을 포함하는데, 여기서 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 원하는 성질을 나타내기 위하여 변형된다. 올리고뉴클레오티드의 원하는 성질은 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 저항성, 증가된 세포 흡수(uptake), 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화력을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 올리고뉴클레오티드의 상이한 구역들은 따라서 상이한 성질들을 가질 수 있다. 본 발명의 키메라 올리고뉴클레오티드는 상기에서 설명된 것과 같이, 두개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 유사체들의 혼합형 구조로 형성될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 즉, 고유 DNA와 같이 구성적으로 연결되거나 또는 스페이스(spacer)를 통하여 연결될 때, 모노머가 “리지스터(register)”에서 연결될 수 있는 구역으로 구성될 수 있다. 스페이스들은 구역 사이에서 공유 “다리”를 구성하도록 의도되며, 그리고 바람직한 경우에 길이는 약 100개 탄소 원자를 초과하지 않는다. 스페이스들은 상이한 기능을 수행할 수 있는데, 예를 들면, 음성 또는 양성 전하를 가지며, 특정 핵산 결합 성질(삽입자[intercalators], 홈 결합자[groove binders], 독소, 형광체 등), 친지성(lipophilic)화, 예를 들면, 알파-헬릭스를 유도하는 알라닌 함유 펩티드와 같은 특정 2차 구조를 유도하는 기능을 수행할 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이 "SIRT1" 및 "Sirtuin 1"은 모든 패밀리 멤버들, 돌연변이체들, 대립유전자들, 단편들, 종, 코딩 및 넌-코딩 서열들, 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 스트랜드를 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, "SIRT1"는 침묵 메이팅 유형 정보 조절 2 상동체(Silencing mating type information regulator 2 homolog)를 말하며, 그리고 SIRTuin 데아세틸라제 단백질 패밀리의 구성원이다. SIRT1의 아미노산 서열은 Genbank Accession number NP.sub.--08509에서 볼 수 있다. SIRT1은 효모 Sir2 단백질의 이간 상동체이며, NAD-의존성 데아세틸라제 활성을 나타낸다.
여기에서 사용된 것과 같이, Sirtuin1, SIRT1, sirtuin, silent mating type information regulation 2 homolog 1, hSIR2, hSIRT1, NAD-의존성 데아세틸라제 sirtuin-1, SIR2L1, SIR2-유사 단백질 1은 문헌에서 동일한 것으로 간주되며, 본 출원에서 호환된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "~에 특이적인 올리고뉴클레오티드 " 또는 "올리고뉴클레오티드 표적"은 (i) 표적 유전자의 일부와 안정적인 복합체를 형성할 수 있는, 또는 (ii) 표적 유전자의 mRNA 전사체의 일부분과 안정적인 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 복합체와 듀플렉스 의 안정성은 이론적인 계산 및/또는 시험관 분석에 의해 결정될 수 있다. 하이브리드화 복합체 및 듀플렉스의 안정성을 결정하는 예시적인 분석들은 하기 실시예에서 설명된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "표적 핵산"은 DNA로부터 전사된 DNA, RNA(premRNA 및 mRNA를 포함한), 그리고 RNA, 코딩, 넌코딩 서열들, 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드로부터 유도된 cDNA를 포함한다. 올리고머 화합물과 이의 표적 핵산의 특이적 하이브리드화는 핵산의 정상적인 기능을 간섭한다. 핵산에 특이적으로 하이브리드하는 화합물들에 의한 표적 핵산의 이와 같은 기능의 조절을 일반적으로 "안티센스"라고 한다. 간섭되는 DNA 기능은 예를 들면, 복제 및 전사를 포함한다. 간섭되는 RNA의 기능은 모든 중요한 기능들, 예를 들면, RNA가 단백질 해독 부위로 전위(translocation), RNA로부터 단백질의 해독, 하나 이상의 mRNA 종을 생산하기 위하여 RNA의 접합 및 RNA가 참여하거나 RNA에의해 수행되는 촉매 활성을 포함한다. 표적 핵산 기능에 대해 이와 같은 간섭 효과는 인코드된 산물 또는 올리고뉴클레오티드의 발현 조절이다.
RNA 간섭 "RNAi"은 "표적" 핵산 서열들에 대해 서열-특이적 상동성을 가지는 이중 가닥의 RNA(dsRNA) 분자들에 의해 중재된다(Caplen , N. J., et al .(2001), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:9742-9747). 본 발명의 특정 구체예에서, 중개물질들은 5-25개의 뉴클레오티드 "작은 간섭(Small interference)" RNA 듀플렉스 (siRNAs)다. siRNAs는 Dicer로 알려진 RNase 효소에 의해 dsRNA의 프로세싱으로부터 유도된다(Bernstein , E., et al .(2001), Nature 409:363-366). siRNA 듀플렉스 산물들은 RISC로 불리는 다중-단백질 siRNA 복합체 용어(RNA Induced Silencing Complex)로 모인다. 임의의 특정 이론에 결합되지 않고, RISC는 표적 핵산 (적합하게는 mRNA)으로 유도되는 것으로 보이는데, 여기서 siRNA 듀플렉스는 촉매적 방식으로 절단을 중개하기 위한 서열-특이적 방식으로 상호작용한다(Bernstein , E., et al .(2001), Nature 409:363-366; Boutla , A., et al.(2001), Curr . Biol . 11:1776-1780 ). 본 발명에 따라 이용될 수 있는 작은 간섭 RNAs는 당분야에 잘 알려진 과정 및 당업자에 친숙할 수 있는 과정에 따라 합성되고, 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 이용되는 작은 간섭 RNAs는 적합하게는 약 1 내지 약 50개 뉴클레오티드 (nt) 사이를 포함한다. 비-제한적인 구체예에서, siRNAs는 약 5 내지 약 40 nt, 약 5 내지 약 30 nt, 약 10 내지 약 30 nt, 약 15 내지 약 25 nt, 또는 약 20-25 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
적절한 올리고뉴클레오티드의 선택은 자동적으로 핵산 서열들을 배열하고, 동일 또는 상동 구열을 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 실시된다. 이와 같은 프로그램을 이용하여 수득된 핵산 서열들을 비교하는데, 예를 들면, GenBank와 같은 데이터베이스를 조사하거나 또는 PCR 산물들의 서열화에 의해 비교된다. 종간의 핵산 서열들의 비교로 종간에 적절한 동일성 정도를 나타내는 핵산 서열들의 선택이 가능하다. 서열화되지 않은 유전자의 경우, 서든 블랏을 실행하여, 표적이 되는 종과 다른 종간에 유전자의 동일성 수준을 결정한다. 당분야에 공지된 것과 같이, 다양한 수준의 엄격성(stringency)에서 서든 블랏을 실행함으로써, 동일성의 거의 정확한 측정이 가능하다. 이와 같은 과정으로 제어되어야 하는 개체에서 표적 핵산 서열에 대해 높은 수준의 상보성(complementarity)을 나타내고, 다른 종의 대응 핵산 서열들에 대해 더 낮은 수준의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오티드를 선택할 수 있다. 당업자는 본 발명에 이용되는 유전자에서 절절한 구역을 선택하는데 있어서 상당한 허용 범위가 있다는 것을 인지할 것이다.
"효소적 RNA"라는 의미는 효소 활성을 가진 RNA 분자를 말한다 (Cech , 1988 J. American . Med . Assoc. 260, 3030-3035). 효소적 핵산(리보자임)은 표적 RNA에 우선적으로 결합함으로써 작용한다. 이와 같은 결합은 표적 RNA를 절단하기 위하여 작용하는 분자의 효소적 부분에 아주 근접해 있는 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 일어난다. 따라서, 효소적 핵산은 우선 표적 RNA를 인지하고, 그다음 염기-쌍을 통하여 표적 RNA에 결합하고, 일단 정확한 부위에 결합되면, 표적 RNA를 절단하기 위하여 효소적으로 작용한다.
"디코이(decoy) RNA"란 리간드용 천연 결합 도메인을 닯은 RNA 분자를 말한다. 따라서, 디코이 RNA는 특정 리간드에 결합하는 것에 대하여 천연 결합 표적과 경쟁한다. 예를 들면, HIV 트란스-활성화 반응(TAR) RNA의 과다 발현은 "디코이"로 작용하여 HIV tat 단백질에 효과적으로 결합하고, 이에 의해 HIV RNA에 인코드된 TAR 서열에 결합되는 것이 방해되는 것으로 알려져 있다(Sullenger et al., (1990), Cell , 63, 601-608). 이것은 특정 실시예를 말한다. 당업자는 이것이 하나의 예시일 뿐이며, 당분야에 일반적으로 공지된 기술을 이용하여 다른 구체예들을 만들 수 있다는 것을 인지할 것이다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "모노머"는 모노머 단위 가령 약 3-4개에서 수백개의 모노머 단위 범위의 올리고뉴클레오티드를 만들기 위하여, 포스포디에스테르 결합 또는 이의 유사체들에 의해 연결된 모노머를 일반적으로 나타낸다. 포스포디에스테르 링키지의 예로는 아래에서 더 상세하게 설명하겠지만, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포르네이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포르아미데이트 그리고 이와 유사한 것을 포함한다.
본 발명의 내용에서, 용어 “뉴클레오티드”는 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드 뿐만 아니라 비-자연적으로 생성되는 뉴클레오티드를 포함한다. 기존에“비-자연적으로 생성되는”것으로 간주되는 다양한 뉴클레오티드들이 후속적으로 자연계에서 발견되고 있다는 것을 당업자는 분명하게 알 것이다. 따라서, "뉴클레오티드"는 공지의 퓨린 및 피리미딘 이종고리(heterocycles) 뿐만 아니라 이종고리 유사체 및 이의 호변체(tautomers)를 포함한다. 다른 유형의 뉴클레오티드의 실예는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실, 퓨린, 산틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노시토신, N6,N6-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-(C3-C6)-알키닐시토신, 5-플루오르우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소시토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 이노신을 포함하는 분자들, 그리고 Benner et al ., U.S. Pat No. 5,432,272에서 설명된 "비-자연적으로 생성되는" 뉴클레오티드가 있다. 용어 "뉴클레오티드"는 이들 모든 실시예 및 이의 유사체 그리고 및 호변체를 포함한다. 특히, 관심대상이 되는 뉴클레오티드들은 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 및 우라실을 포함하는 것들과, 인간에서 치료 및 진단 용도와 연관하여 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드로 간주된다. 뉴클레오티드는 Kornberg and Baker , DNA Replication , 2 nd Ed . ( Freeman , San Francisco , 1992)에서 설명된 것과 같이, 천연 2'-데옥시 및 2'-하이드록시 당 뿐만 아니라 이들의 유사체를 포함한다.
뉴클레오티드와 관련된 "유사체들"은 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 슈가 모이어티를 가지는 합성 뉴클레오티드를 포함하고, 이들은 Scheit , Nucleotide Nucleotides , John Wiley , New York, 1980; Freier & Altmann , (1997) Nucl . Acid . Res ., 25(22), 4429-4443, Toulm , J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18; Manoharan M.,(1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Research , 25:4429-4443, Uhlman , E., (2000) Drug Discovery & Development , 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisence & Nucleic Acid Drug Dev ., 10:297-310); 2'-O, 3`-C- linked [3.2.0] bicycloarabinonucleosides(N.K Christiensen ., et al , (1998) J. Am . Chem . Soc ., 120: 5458-5463, Prakash TP , Bhat B. (2007) Curr Top Med Chem . 7(7):641-9; Eun Jeong Cho , Joo - Woon Lee , Andrew D. Ellington Applications of Aptamers as Sensors Annual Review of Analytical Chemistry , July 2009, Vol . 2, Pages 241-264에서 설명되어 있다. 이와 같은 유사체들은 가령, 듀플렉스 또는 트리플렉스 안정성, 특이성 또는 이와 유사한 것과 같은 결합 성질들을 강화시키도록 기획된 합성 뉴클레오시드를 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, "하이브리드화"는 올리고머 화합물들의 실질적인 상보성 가닥들이 쌍을 이루는 것을 의미한다. 쌍을 이루는 한 가지 기전은 즉 올리고머 화합물들의 상보성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기(뉴클레오티드) 사이에 수소 결합을 형성하는 것으로, 이것들은 Watson-Crick, Ho또는 역 Ho수소 결합이 될 수 있다. 예를 들면, 아데닌 및 티민은 수소 결합 형성을 통하여 쌍을 이루는 상보성 뉴클레오티드이다. 하이브리드화는 다양한 환경에서 일어날 수 있다.
안티센스 화합물은 화합물이 표적 핵산에 결합하여 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여, 기능 및/또는 활성의 조정이 야기될 때 “특이적으로 하이브리드가능”하며, 그리고 특이적 결합이 바람직한 조건들, 가령, 시험관 분석 또는 치료요법적 처치의 경우 생리학적 조건들, 그리고 시험관 분석의 경우 분석이 실행되는 조건하에서 비-표적 핵산 서열들에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있는 충분한 수준의 상보성이 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, "엄격한(stringent) 하이브리드화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 본 발명의 화합물이 이의 표적 서열에 하이브리드할 수 있지만, 다른 서열에는 소수로 하이브리드되는 조건을 말한다. 엄격한 조건은 서열-의존성으로, 상이한 환경에서 달라지며, 본 내용에서, 올리고머 화합물이 표적 서열에 하이브리드되는 “엄격한 조건”은 조사되는 올리고머 화합물의 조성 및 성질 그리고 이를 조사하는 분석에 의해 결정된다. 일반적으로, 엄격한 하이브리드화 조건은 Na++ 또는 K++ (가령, 낮은 이온 강도)와 같은 무기 양이온을 가진 저농도 염(<0.15M), 20℃ 내지 25℃ 이상의 온도, 올리고머 화합물:표적 서열 복합체의 Tm 미만, 및 포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드 또는 계면활성제 도데실 설페이트 나트륨(SDS)과 같은 변성제의 존재를 포함한다. 예를 들면, 하이브리드화 비율은 각 1% 포름아미드에 대해 1.1% 감소된다. 높은 엄격성 하이브리드화 조건의 예는 60℃에서, 30분간, 0.1× 염화나트륨-구연산나트륨 완충액(SSC)/0.1% (w/v) SDS이다.
여기에서 사용된 것과 같이, "상보성(complementary)"은 하나 또는 두 개의 올리고머 가닥상에서 두 개 뉴클레오티드 사이에 정확한 쌍을 형성하는 능력을 말한다. 예를 들면, 안티센스 화합물의 특정 위치에서 뉴클레오티드는 표적 핵산의 특정 위치에 있는 뉴클레오티드와 수소 결합을 할 수 있고, 이 표적 핵산이 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자이면, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에 수소 결합 위치는 상보성 위치로 간주된다. 올리고머 화합물 및 추가 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자는 각 분자에서 충분한 수의 상보성 위치를 서로 수소 결합을 할 수 있는 뉴클레오티드가 차지하고 있을 때, 서로에 대해 상보성이다. 따라서, "특이적으로 하이브리드가능한" 및 "상보성"은 올리고머화합물과 표적 핵산 사이에 안정적이고 특이적인 결합이 발생되도록 충분한 수의 뉴클레오티드에서 정확한 쌍 또는 상보성 수준을 나타내는데 이용된다.
올리고머 화합물의 서열은 특이적으로 하이브리드될 수 있는 이의 표적 핵산의 서열에 대해 100% 상보성일 필요가 없다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드는 중재 또는 인접 단편들이 하이브리드화 이벤트에 관여하지 않는 하나 이상의 단편들(가령, 루프 구조, 미스메치 또는 헤어핀 구조)에 대해 하이브리드할 수 있다. 본 발명의 올리고머 화합물은 이들이 표적하는 표적 핵산 서열내에 표적 구역에 대해 최소한 약 70%, 또는 최소한 약 75%, 또는 최소한 약 80%, 또는 최소한 약 85%, 또는 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%, 또는 최소한 약 99% 서열 상보성을 포함한다. 예를 들면, 20개 뉴클레오티드의 안티센스 화합물중 18개 뉴클레오티드가 표적 구역에 상보성이며, 따라서, 특이적으로 하이브리드될 수 있고, 이는 90% 상보성을 나타낸다. 이 실시예에서, 나머지 비-상보성 뉴클레오티드는 뭉쳐있거나 상보성 뉴클레오티드와 함께 산재되어 있을 수 있고, 그리고 서로 또는 상보성 뉴클레오티드에 인접해있을 필요는 없다. 이와 같이, 표적 핵산과 완벽한 상보성을 가지는 두 구역에 인접한 4개의 비-상보성 뉴클레오티드를 가지는, 길이가 18개 뉴클레오티드인 안티센스 화합물은 표적 핵산과 77.8%의 전체적인 상보성을 가질 것이며, 따라서, 이는 본 발명의 범위내에 있다. 표적 핵산의 구역과 안티센스 화합물의 상보성 비율은 당분야에 공지된 BLAST 프로그램 (기초적인 로컬 배열 조사 도구) 및 PowerBLAST 프로그램(Altschul et al ., (1990) J. Mol . Biol ., 215, 403-410; Zhang and Madden , (1997) Genome Res ., 7, 649-656)를 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 상동성 비율, 서열 동일성 또는 상보성은 예를 들면, Gap 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package , Version 8 for Unix , Genetics Computer Group , University Research Park , Madison Wis .)에 의해 결정될 수 있다(Smith and Waterman ( Adv . Appl . (1981) Math ., 2, 482-489)의 알고리즘을 이용하는 디폴트 세팅 이용).
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "열적 융점(Tm)"은 정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도에서 표적 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 하이브리드되는 온도를 말한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 최소한 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도(또는 다른 염)이고, 온도는 짧은 올리고뉴클레오티드 (가령, 10개 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우 최소한 약 30℃가 된다. 엄격한 조건들은 포름아미드와 같은 불안정화 물질을 첨가하여 얻을 수도 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, "조절(modulation)"은 유전자 발현에서 증가(자극) 또는 감소(억제)를 의미한다.
폴리뉴클레오티드 서열의 내용에서 이용된 용어 "변이체(variant)"는 야생형 유전자와 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 정의는 예를 들면, "대립유전자(allelic)" "접합(splice)," "종(species)" 또는 "다형(polymorphic)" 변이체들를 포함할 수 있다. 접합 변이체는 기준 분자에 대해 상당한 동일성을 가질 수 있지만, 일반적으로 mRNA 프로세싱 동안 엑손의 대체 접합으로 인하여 어느 정도의 숫자의 폴리뉴클레오티드를 가질 것이다. 대응하는 폴리펩티드는 추가 기능을 하는 도메인을 가지거나 또는 도메인이 없을 수 있다. 종 변이체들은 종간에 다양한 폴리뉴클레오티드 서열들이다. 본 발명에서는 야생형 유전자 산물들의 변이체들이 특히 유용하다. 핵산 서열에서 최소한 한 가지 돌연변이로 인하여 변이체들이 만들어지며, 그리고 이는 변경된 mRNA 또는 폴리펩티드가 만들어질 수 있는데, 이들의 구조 또는 기능은 변경되거나 변경되지 않을 수 있다. 임의의 주어진 자연 또는 재조합 유전자는 대립유전자적 형태가 없거나, 또는 하나 또는 많은 대립유전자적 형태를 가질 수 있다. 변이체를 야기시키는 공통의 돌연변이적 변화는 일반적으로 뉴클레오티드의 자연적 결손, 추가 또는 치환 때문이다. 이들 각 변화의 유형은 단독으로 발생되거나 주어진 서열에서 1회 이상 다른 것들과 함께 조합적으로 발생될 수 있다.
생성된 폴리펩티드는 일반적으로 서로에 대해 상당한 아미노산 동일성을 가질 것이다. 다형(polymorphic) 변이체는 주어진 종의 개체간에 특정 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열에서 변이다. 다형 변이체들은 또한 "단일 뉴클레오티드 다형" (SNPs) 또는 한 개 염기에 의해 폴리뉴클레오티드 서열이 변화되는 단일 염기 돌연변이를 포함한다. SNPs의 존재는 질병 상태에 대한 경향 즉, 민감성 대 저항성을 가진 특정 집단의 지표가 될 수 있다.
유도체 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 수소를 알킬, 아실 또는 아미노 기로 대체되는 화학적 변형을 받게 되는 핵산을 포함한다. 유도체들, 가령, 유도체 올리고뉴클레오티드는 변형된 슈가 모이어티 또는 인터-슈가 링키지와 같은 비-자연적으로 생성되는 부분을 포함할 수 있다. 이들중 예를 들면, 당분야에 공지된 포스포로티오에이트 및 기타 황 함유 종이 된다. 유도체 핵산은 또한 방사능뉴클레오티드, 효소, 형광 물질, 화학적 발광 물질, 발색성 물질, 기질, 공인자, 억제제, 자석 입자들 그리고 이와 유사한 것을 포함하는 라벨을 가질 수 있다.
"유도체" 폴리펩티드 또는 펩티드는 예를 들면, 글리코실화, 페길화, 포스포릴화, 황산화, 환원/알킬화, 아실화, 화학적 결합, 또는 약하게 포르말린 처리에 의해 변형된 것이다. 유도체는 방사능동위원소, 형광물질 및 효소 라벨을 포함하나 이에 한정되지 않는, 직간접적으로 탐지가능한 라벨을 포함하도록 변형될 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "동물" 또는 "환자"는 예를 들면, 인간, 양, 엘크, 사슴, 뮬 사슴, 밍크, 포유류, 원숭이, 말, 소, 돼지, 염소, 개, 고양이, 쥐, 마우스, 새, 닭, 파충류, 물고기, 곤충 및 거미류를 포함한다는 의미다.
"포유류"는 일반적으로 건강관리를 받는 온혈 포유류(가령, 인간 및 길들여진 동물들)을 포함한다. 예로는 고양이과, 개과, 말과, 소 그리고 인간을 포함한다.
"치료하는(Treating 또는 treatment)"는 포유류에서 질병 상태를 치료하는 것을 말하는데, (a) 포유류에서 질병 상태의 발생을 방지하고, 특히 이와 같은 포유류가 해당 질병에 걸리기 쉬우나 아직 걸린 것으로 진단되지 않은 경우; (b) 질병 상태를 억제, 가령, 질병의 발생을 억제하는; 및/또는 (c) 질병의 상태를 경감시키는, 예를 들면, 원하는 지점에 도달할 때까지 질병 상태를 회복시키는 것을 포함한다. 또한, 치료는 질병의 증상을 개선(가령, 통증 또는 불편함을 줄이는)을 포함하는데, 이와 같은 개선이 질병에 직접적으로 영향(가령, 원인, 전파, 발현 등)을 주거나 주지 않을 수 있다.
"신경퇴행성 질환"은 예를 들면 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 알츠하어머 질환, 근위축성 측색 경화증(ALS), 치매, 다발성 경색 및 신경게 세포 사멸과 관련된 다른 질환 및 질병을 포함하는 광범위한 중추 및 말초 신경계 질환 및 질병을 말한다.
"대사질환"은 예를 들면, 인슐린 저항성, 당뇨병, 비만, 손상된 내당, 높은 혈액 콜로스테롤, 고혈당, 이상지혈증 및 과지혈증을 포함하는 광범위한 내분비계 질환 및 질병을 말한다.
폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 조성물 및 분자들
"SIRT1 단백질"은 sirtuin 데아세틸라제의 sir2 페밀리 구성원을 말한다. 한 구체예에서, SIRT1 단백질은 효모 Sir2 (GenBank Accession No. P53685), C. 엘레간스(C. elegans) Sir-2.1 (GenBank Accession No. NP.sub.--501912), 인간 SIRT1 (GenBank Accession No. NM.sub.--012238 and NP.sub.--036370 (or AF083106))을 포함한다.
SIRT1 "Sirtuins"는 Pfam 패밀리"SIR2"- PF02146 (별첨에 첨부된)에서 hits 로 기록된 아미노산 서열로 특정된 도메인인 SIR2 도메인을 포함하는 단백질이다. 이 패밀리는 INTERPRO 데이타베이스에서 INTERPRO 기재(entry IPR003000)으로 언급된다. 단백질 서열내에 "SIR2" 도메인의 존재를 확인하고, 그리고 관심대상의 폴리펩티드 또는 단백질이 특정 프로파일을 가지는 지를 판단하기 위하여, 단백질의 아미노산 서열은 디폴트 매개변수 (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search)를 이용하여 HMMs의 Pfam 데이터베이스(가령, Pfam 데이타베이스, release 9)에 대해 조사될 수 있다. SIR2 도메인은 Pfam에서는 PF02146으로 나타내고, 그리고 INTERPRO에서는 INTERPRO 기재로(entry IPR003000) 나타낸다. Pfam 데이터베이스의 기재사항은 "The Pfam Protein Families Database " Bateman A et al . (2002) Nucleic Acids Research 30(l):276-280 and Sonhammer et al . (1997) Proteins 28(3):405-420에서 볼 수 있으며 그리고HMMs의 상세한 설명은 예를 들면 Gribskov et al . (1990) Meth . Enzymol . 183:146-159; Gribskov et al . (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:4355-4358; Krogh et al . (1994) J. Mol . Biol. 235:1501-1531; and Stultz et al . (1993) Protein Sci . 2:305-314에서 볼 수 있다.
표적: 한 구체예에서, 표적은 SIRT1와 연합된 센스 및/또는 안티센스 넌코딩 및/또는 코딩 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 Sirtuin 1(SIRT1)의 핵산 서열들을 포함한다.
바람직한 구체예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1 (SIRT1) 관련된 질환 또는 질병의 예방 또는 치료에 이용된다. sirtuins (SIRTs)는 모든 유기체에서 편재 분포된 단백질-변형 효소다. SIRT1는 효모 니코틴아미드-아데인-디뉴클레오티드-의존성 데아세틸라제 침묵 정보 조절자 2(Sir2로 공지됨)의 포유동물 동사체이며, 가장 잘 특징화된 SIRT 패밀리 멤버다. SIRT1는 지방세포 계통의 세포들의 생리 기능을 조절한다. SIRT1 활성의 조절물질들을 이용하여 지방의 생리기능과 연관된 질병 및 질환, 가령, 비만, 비만-관련 질환 또는 지방-관련된 대사 질환을 개선, 치료 또는 예방할 수 있다.
SIRT1는 몇 가지 모델 유기체에서 수명을 조절하고, 그리고 세포 생존, 분화, 그리고 대사를 포함하는 포유동물 세포에서 몇 가지 공정에 관련된다. 레스베라트롤( resveratrol)과 같은 SIRT-활성화 화합물에 의한 SIRT1 유도, 또는 칼로리 제한과 관련된 대사 조절은 신경보호성 성질을 가질 수 있어, 신경퇴행성 프로세스를 지연시켜, 수명을 촉진시킬 수 있다(Han SH , (2009) J Clin Neurol . Sep;5(3):120-5.; Michan S, et al . (2007) Biochem J. 404(1): 113.).
신경계에서 SIRT1에 대한 축색 보호성 역할을 뒷받침하는 몇 가지 보고서가 있다. 축색 퇴행은 알츠하이머 질환(AD) 및 근위축성 측색 경화와 같은 말초 신경 장애 및 신경 퇴행성 질환 모두에서 관찰되는 주요 형태학적 특징이다(Fischer LR , et al . (2004) Exp Neurol 185:232240; Stokin GB , et al . (2005) Science 307:12821288). 축색 퇴행은 일반적으로 퇴행 과정의 초기 단계에서 주로 발생하고, 그리고 인지 감퇴와 같은 임상 증후에 선행하거나 밀접하게 관련된다(Yamamoto H, et al. (2007) Mol Endocrinol . 21 (8): 1745-1755).
바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 넌코딩 구역을 포함하나 이에 한정되지 않은 SIRT1의 폴리뉴클레오티드에 특이적이다. SIRT1 표적은 SIRT1의 변이체들; SNP를 포함하는 SIRT1의 돌연변이체들; SIRT1의 넌코딩 서열들; 대립유전자들, 단편들 그리고 이와 유사한 것을 포함한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 분자다.
본 발명의 구체예에 따르면, 표적 핵산 분자는 SIRT1 폴리뉴클레오티드 단독에 국한되지 않고, SIRT1의 동소체, 수용체, 상동체들, 넌-코딩 구역 및 상동체들, 그리고 이와 유사한 것 중 임의의 것까지 확장된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 변이체들, 대립유전자들, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 상보성 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 SIRT1 표적의 자연적 안티센스 서열(코딩 및 넌-코딩 구역에 자연적 안티센스)을 표적으로 한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 또는 DNA 분자이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고머 화합물들은 화합물에 있는 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에서 상이한 염기가 존재하는 변이체들도 포함한다. 예를 들면, 첫번째 뉴클레오티드가 아데닌이라면, 변이체들은 이 위치에 티미딘, 구아노신, 시티딘 또는 이 위치에 있는 기타 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드를 포함하도록 만들어질 수 있다. 안티센스 화합물의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 그 다음 이들 화합물은 표적 핵산의 발현을 억제하는 이들 능력을 측정하기 위하여 여기에서 설명된 방법에 의해 테스트된다.
일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 50% 내지 약 60%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 60% 내지 약 70%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 70% 내지 약 80%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 80% 내지 약 90%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.
안티센스 화합물은 화합물이 표적 핵산에 결합하여 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 활성을 잃게 만들 때 특이적으로 하이브리드가능하며, 그리고 특이적 결합이 바람직한 조건들하에서 안티센스 화합물이 비-표적 핵산 서열에 비-특이적 결합을 피할 수 있도록 충분한 상보성이 있다. 이와 같은 조건은 생체내 분석 또는 치료요법적 처리의 경우 생리학적 조건, 그리고 분석이 시험관 분석의 경우에 실시되는 조건등을 포함한다.
DNA, RNA, 키메라, 치환된 등의 안티센스 화합물은 표적 DNA 또는 RNA 분자에 화합물이 특이적으로 결합하여 표적 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 간섭하여, 활성을 잃게 만들 때 특이적으로 하이브리드가능하며, 그리고 특이적 결합이 바람직한 조건들하에서 안티센스 화합물이 비-표적 핵산 서열에 비-특이적 결합을 피할 수 있도록 충분한 상보성이 있다. 이와 같은 조건은 생체내 분석 또는 치료요법적 처리의 경우 생리학적 조건, 그리고 분석이 시험관 분석의 경우에 실시되는 조건등을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 예를 들면, PCR, 하이브리드화 등을 이용하여 확인되고, 확장된, 서열 번호: 6 내지 47에서 제시된 하나 이상의 서열, 그리고 이와 유사한 것인 안티센스 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는 SIRT1의 표적화는 SIRT1의 기능 또는 발현을 조절한다. 한 구체예에서, 기준과 비교하였을 때, 발현 또는 기능은 상향 조절된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 기준과 비교하였을 때, 발현 또는 기능은 하향 조절된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 PCR, 하이브리드화 등을 이용하여 확인되고, 확장된 안티센스 서열들을 포함하는, 서열 번호: 6 내지 47에서 제시된 핵산 서열들을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더 짧은 또는 더 긴 단편들, 변형된 결합 그리고 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 변형된 결합 또는 뉴클레오티드간(internucleotide) 링키지의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 이와 유사한 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 뉴클레오티드는 인(phosphorus) 유도체이다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드내 슈가 또는 슈가 유사 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 인산염 기)는 일인산염, 이인산염, 삼인산염, 알킬인산염, 알칸인산염, 포스포로티오에이트 그리고 이와 유사한 것이 될 수 있다. 상기 명시된 인산염 유사체의 준비 및 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드으로의 결합은 당분야에 공지되어 있기 때문에, 여기에서 설명할 필요는 없다.
안티센스의 특이성 및 감응도는 치료 용도로 당업자에 의해 이용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 동물 및 사람에게서 질병 상태를 치료하는 치료 모이어티로 이용될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간에게 안전하고 효과적으로 투여되었으며, 여러 임상 시도가 현재 진행중이다. 따라서 올리고뉴클레오티드는 세포, 조직, 동물 특히 인간의 치료를 위한 치료 섭생에 유용하도록 설정될 수 있는 유용한 치료요법적 형태가 될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 올리고머 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자들에 결합하고, 표적 유전자에 의해 인코드된 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 간섭되는 DNA의 기능은 예를 들면, 복제 및 전사를 포함한다. 간섭되는 RNA의 기능은 예를 들면, RNA를 단백질 해독 부위로 전위, RNA로부터 단백질 해독, 하나 이상의 mRNA 종을 만들기 위한 RNA의 접합 및 RNA가 관여하거나 RNA에 의해 실시될 수 있는 촉매 활성과 같은 모든 중요한 기능을 포함한다. 기능은 원하는 기능에 따라 상향-조절되거나 억제될 수 있다.
안티센스 화합물들은 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 유도 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, 선택적 스플라이스, 프라이머, 프로브, 및 표적 서열의 최소한 일부에 하이브리드되는 다른 올리고머 화합물을 포함한다. 이와 같이, 이들 화합물들은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 단일-가닥, 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 내용에서 특정 핵산 분자에 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 프로세스가 될 수 있다. 이 프로세스는 통상적으로 기능이 조절되는 표적 핵산의 확인으로 시작된다. 이 표적 핵산은 예를 들면, 유전자의 발현이 특정 질환 또는 질병 상태와 연관된 세포 유전자(또는 이 유전자로부터 전사된 mRNA) 또는 감염성 물질의 핵산 분자가 될 수 있다. 본 발명에서 표적 핵산은 Sirtuin 1(SIRT1)을 인코드한다.
표적화 프로세스는 발현의 조절과 같은 원하는 효과를 얻기 위하여 안티센스 상호작용을 위하여 표적 핵산 내 최소한 하나의 표적 구역, 단편 또는 부위의 결정을 통상적으로 포함한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "구역(region)"은 최소한 한 가지 확인가능한 구조, 기능 또는 성질을 가지는 표적 핵산의 일부로 정의된다. 표적 핵산의 구역내에 단편이 있다. 단편(Segments)은 표적 핵산 내에 구역의 더 작은 또는 하위 부분으로 정의된다. 본 발명에서 사용된 부위(Sites)는 표적 핵산내에 위치로 정의된다.
바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1)의 천연 안티센스 서열들에 결합하고, 그리고 Sirtuin 1(SIRT1)(서열 번호: 1)의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 안티센스 서열들의 예로 서열 번호: 2-5를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 단편에 결합하고, 그리고 SIRT1의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 단편들은 Sirtuin 1(SIRT1) 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1)의 천연 안티센스 서열들에 특이적이며, Sirtuin 1(SIRT1)의 천연 안티센스 서열들에 올리고뉴클레오티드의 결합으로 Sirtuin 1(SIRT1)의 발현 및/또는 기능이 조절된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 화합물은 서열 번호: 6 내지 47에서 제시된 서열들을 포함하는데, 이의 안티센스 서열들은 예를 들면, PCR, 하이브리드화 등을 이용하여 확인되고 연장된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더 짧은 또는 더 긴 단편들, 변형된 결합 그리고 이와 유사한 것을 포함한다. 변형된 결합 또는 뉴클레오티드간 링키지의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 이와 유사한 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 뉴클레오티드는 인 유도체를 포함한다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드내에 슈가 또는 슈가 유사체 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 인산염 기)는 일인산염, 이인산염, 삼인산염, 알킬인산염, 알칸인산염, 포스포로티오에이트 그리고 이와 유사한 것이 될 수 있다. 상기 명시된 인산염 유사체의 준비 및 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드으로의 결합은 당분야에 공지되어 있기 때문에, 여기에서 설명할 필요는 없다.
당분야에 공지된 것과 같이, 해독 개시 코돈은 일반적으로 5'-AUG (전사된 mRNA 분자들에서; 대응하는 DNA 분자에서는 5'-ATG)이기 때문에, 해독 개시 코돈은 "AUG 코돈" "시작 코돈" 또는 "AUG 시작 코돈"으로 지칭되기도 한다. 소수의 유전자는 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG을 가지는 해독 개시 코돈을 가지며; 그리고 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG는 생체에서 기능을 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 용어 "해독 개시 코돈" 및 "시작 코돈"은 많은 코돈 서열들을 포함하는데, 각 경우에 시작 아미노산은 일반적으로 메티오닌(진핵세포의 경우) 또는 포르밀메티오닌(원핵생물의 경우)이다. 진핵생물 및 원핵생물 유전자는 두 개 이상의 대체 시작 코돈을 가지는데, 이들중 임의의 것이 특정 세포 유형 또는 조직에서, 또는 특정 조건하에서 해독 개시에 선호적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 내용에서, "시작 코돈" 및 "해독 개시 코돈"은 코돈의 서열과 무관하게, Sirtuin 1(SIRT1)을 인코드하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 해독을 생체내에서 개시하는데 이용되는 코돈을 지칭한다. 유전자의 해독 종료 코돈 (또는 "중지 코돈")은 다음 세 개 서열중 하나를 가질 수 있다; 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA (대응하는 DNA 서열들은 차례로 각각 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA이다).
용어 "시작 코돈 구역" 및 "해독 개시 코돈 구역"은 해독 개시 코돈으로부터 임의의 방향(가령, 5' 또는 3')으로 약 25 내지 약 50 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부분을 지칭한다. 유사하게, 용어 "중지 코돈 구역" 및 "해독 종료 코돈 구역"은 해독 종료 코돈으로부터 어느 방향이건(5' 또는 3') 약 25개 내지 약 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부분을 말한다. 결과적으로, "시작 코돈 구역" (또는 "해독 개시 코돈 구역") 및 "중지 코돈 구역" (또는 "해독 종료 코돈 구역")은 본 발명의 안티센스 화합물에 효과적으로 표적화되는 모든 구역이다.
오픈 리딩 프레임(ORF) 또는 해독 개시 코돈과 해독 종료 코돈 사이에 구역을 말하는 것으로 당분야에 공지된 "코딩 구역"은 효과적으로 표적화될 수 있는 구역이다. 본 발명의 내용 범위내에서, 표적화된 구역은 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 해독 개시 또는 종료 코돈을 포함하는 유전자내 구역이다.
또 다른 표적 구역은 해독 개시 코돈으로부터 5' 방향으로 mRNA의 일부분을 지칭할 때 당분야에서 공지된 5' 무해독 구역(5'UTR)을 포함하면, 따라서 5' 캡 부위와 mRNA의 해독 개시 코돈 사이에 뉴클레오티드(또는 이 유전자에서 상응하는 뉴클레오티드)도 포함된다. 또 다른 표적 구역은 해독 종료 코돈으로부터 3' 방향으로 mRNA의 일부분을 지칭할 때 당분야에서 공지된 3' 무해독 구역(3'UTR)을 포함하면, 따라서 해독 종료 코돈과 mRNA의 5' 말단 사이에 뉴클레오티드(또는 이 유전자에서 상응하는 뉴클레오티드)도 포함된다. mRNA의 5' 캡 부위는 5'-5' 삼인산염 링키지를 통하여 mRNA의 5'-최말단 잔기에 결합된 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5' 캡 구역은 5' 캡 구조 자체 뿐만 아니라 캡 부위에 인접한 첫 50개 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명에 적합한 또 다른 표적 구역은 5' 캡 구역이다.
일부 진핵 mRNA 전사체는 바로 해독되며, 많은 것들은 “인트론”이라고 공지된 하나 이상의 구역을 포함하는데, 이는 해독되기 전에 전사체로부터 잘려나간다. 나머지(그리고 해독된) 구역들은 “엑손”으로 알려져 있으며, 함께 접목되어, 연속 mRNA를 형성한다. 한 구체예에서, 접목 부위 가령, 인트론-엑손 접합 또는 엑손-인트론 접합 부위를 표적화하는 것은 질병에 이상 접합이 연관되거나 또는 특정 접합 산물의 과다 생산이 질병과 연관되는 상황에서 특히 유용하다. 재배열 또는 결손으로 인한 이상 융합 접합은 표적 부위의 또 다른 구체예다. 상이한 유전자 소스로부터 두 개(또는 그 이상)의 mRNA의 접합 프로세스를 통하여 생산된 mRNA 전사체는 "융합 전사체"로 공지되어 있다. 인트론은 예를 들면, DNA 또는 pre-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 화합물을 이용하면 효과적으로 표적화될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 코딩 및/또는 넌-코딩 구역에 결합하여, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 천연 안티센스 폴리뉴클레오티드에 에 결합하여, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 센스 폴리뉴클레오티드에 결합하여, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
대체(alternative) RNA 전사체는 DNA의 동일한 게놈 구역으로부터 만들어질 수 있다. 이와 같은 대체 전사체들은 일반적으로 "변이체들"로 알려져 있다. 좀더 특이적으로, "pre-mRNA 변이체들"은 동일한 게놈 DNA로부터 생산되지만, 동일한 게놈 DNA로부터 만들어진 다른 전사체와 이들의 시작 또는 중지 위치에서 상이하며, 인트론 및 엑손 서열을 모두 포함하고 있는 전사체다.
접합 동안 하나 이상의 엑손 또는 인트론 구역 또는 이의 일부분을 잘라낼 때, pre-mRNA 변이체들은 더 작은 "mRNA 변이체들"을 만든다. 결과적으로, mRNA 변이체들은 pre-mRNA 변이체들로 프로세스되고, 각 독특한 pre-mRNA 변이체들은 접합의 결과로 독특한 mRNA 변이체를 항상 만들어낸다. 이와 같은 mRNA 변이체들은 또한 "대체 접합 변이체들"로 공지되어 있다. pre-mRNA 변이체의 접합이 발생되지 않는다면, pre-mRNA 변이체는 mRNA 변이체와 동일하게 된다.
변이체들은 전사의 시작 또는 중지에 대한 대체 신호를 이용하여 만들어질 수 있다. Pre-mRNAs 및 mRNAs는 하나 이상의 시작 코돈 또는 중지 코돈을 보유할 수 있다. 대체 시작 코돈을 이용하는 pre-mRNA 또는 mRNA으로부터 기인된 변이체들은 pre-mRNA 또는 mRNA의 “대체 시작 변이체들”로 공지되어 있다. 대체 중지 코돈을 이용하는 이들 전사체들은 pre-mRNA 또는 mRNA의 "대체 중지 변이체들"로 공지되어 있다. 대체 중지 변이체중 한 가지 특정 유형은 "polyA 변이체"이며, 만들어진 다중 전사체들은 전사 기전에 의해 “polyA 중지 신호”중 하나의 대체 선택하고, 따라서, 독특한 polyA 부위에서 종료된 전사체를 만듦으로써 생성된 것이다. 본 발명의 내용 범위에서, 여기에서 설명된 변이체들의 유형이 표적 핵산의 구체예이기도 하다.
안티센스 화합물이 하이브리드되는 표적 핵산 상의 위치는 활성 안티센스 화합물이 표적으로 하는 표적 구역의 최소한 5개 뉴클레오티드 부분으로 정의된다.
특정 예시적인 표적 단편들의 특이적 서열이 여기에서 제시되어 있지만, 당업자는 이들은 본 발명의 범위내에서 특정 구체예를 설명하고, 묘사하기 위함이라는 것을 인지할 것이다. 추가적인 표적 단편들은 본 내용을 근거하여 당업자들이 용이하게 인지할 수 있다.
설명된 바람직한 표적 단편으로부터 선택된 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 길이가 5-100개 뉴클레오티드 표적 단편들은 표적화에 적합한 것으로 간주된다.
표적 단편은 설명된 바람직한 표적 단편의 5'-말단으로부터 최소한 5개 연속 뉴클레오티드(나머지 뉴클레오티드는 표적 단편의 5' 말단의 바로 상류에서 시작하고, DNA 또는 RNA가 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드를 포함할 때 까지 연속되는동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치다)를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열들을 포함할 수 있다. 유사하게, 바람직한 표적 단편은 바람직한 표적 단편의 3'-말단으로부터 최소한 5개 연속 뉴클레오티드(나머지 뉴클레오티드는 표적 단편의 3' 말단의 바로 하류에서 시작하고, DNA 또는 RNA가 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드를 포함할 때 까지 연속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치다)를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열들을 포함할 수 있다. 표적 단편을 갖춘 기술 분야에 당업자는 과도한 실험없이 추가적으로 바람직한 표적 단편을 확인할 수 있을 것이다.
하나 이상의 표적 구역, 단편 또는 부위가 확인되었다면, 안티센스 화합물은 표적에 충분한 상보성을 가진, 가령, 충분히 잘 하이브리드되고, 원하는 효과를 제공하기 위하여 충분한 특이성을 가진 것이 선택된다.
본 발명의 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 특정 표적의 안티센스 가닥에 결합한다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 최소한 5개 뉴클레오티드이며, 그리고 표적 뉴클레오티드의 전체 길이를 수용하도록 합성하기 위하여, 서열들을 중첩하는 각 올리고뉴클레오티드 표적이 되도록 합성될 수 있다. 표적은 또한 코딩 뿐만 아니라 넌-코딩 구역을 포함한다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 특정 핵산을 표적하는 것이 바람직하다. 특정 핵산에 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 프로세스다. 프로세스는 기능이 조절되는 핵산 서열의 확인으로 통상적으로 시작된다. 이는 예를 들면, 유전자의 발현이 특정 질환 또는 질환 상태와 연관되는 세포 유전자(또는 이 유전자로부터 전사된 mRNA), 또는 넌코딩 RNA(ncRNA)와 같은 넌코딩 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.
RNAs는 (1) 메신져 RNAs (mRNAs), 이는 단백질로 해독되며, 및 (2) 단백질-넌코딩 RNAs (ncRNAs)로 분류될 수 있다. ncRNAs는 마이크로RNAs, 안티센스 전사체 및 고밀도의 중지 코돈을 포함하며, 임의의 광범위한 “오픈 리딩 프레임”이 부족한 다른 전사 단위 (TU)를 포함한다. 많은 ncRNAs는 단백질-코딩 좌의 3' 무해독 구역 (3'UTRs)에서 개시 부위로부터 시작되는 것으로 보인다. ncRNAs는 아주 드물고, FANTOM 협회에 의해 서열화된 ncRNA의 최소한 절반은 폴리아데닐화되지 않는 것으로 간주된다. 대부분의 조사자들은 분명한 이유로 프로세스되고, 세포질로 배출된 폴리아데닐화된 mRNA에 초점을 맞추고 있다. 최근, 폴리아데닐화안된 핵 RNA 세트는 매우 크고, 이와 같은 전사체중 많은 것들은 소위 인터진(intergenic) 구역에서 생성된다(Cheng , J. et al . (2005) Science 308 (5725), 1149-1154; Kapranov , P. et al . (2005). Genome Res 15 (7), 987-997). ncRNAs가 유전자 발현을 조절할 수 있는 기전은 표적 전사체와의 염기쌍에 의한 것이다. 염기쌍에 의해 기능을 하는 RNA는 (1) 동일한 유전적 위치에서, 그러나 이들이 작용하는 RNA에 반대 가닥상에서 인코드되어, 이들 표적에 대해 완벽한 상보성을 나타내는 cis-인코드된 RNAs, 및 (2) 이들이 작용하는 RNA와는 별개의 염색체 위치에서 인코드되며, 표적과 완벽한 염기쌍을 일반적으로 나타내지 않는 trans-인코드된 RNAs로 분류될 수 있다.
이론에 구애되지 않고, 여기에서 설명되는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 안티센스 폴리뉴클레오티드의 혼란은 상응하는 센스 메신져 RNA의 발현을 변경시킬 수 있다. 그러나, 이와 같은 조절은 부조화적(discordant)(안티센스 녹다운은 메신져 RNA 상승을 결과한다) 또는 조화적(concordant)(안티센스 녹다운은 수반되는 메신져 RNA 감소를 결과한다). 이와 같은 경우에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 전사체의 중첩 또는 중첩되지 않는 부위로 표적화되어, 표적의 녹다운 또는 제거를 초래할 수 있다. 코딩 뿐만 아니라 넌-코딩 안티센스는 동일한 방식으로 표적화될 수 있으며, 그리고 어느 쪽이든 조화 또는 비조화 방식으로 상응하는 센스 전사체를 조절할 수 있다. 표적에 대항하여 이용되는 새로운 올리고뉴클레오티드를 확인하는데 사용되는 전략은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 안티센스 RNA 전사체의 녹다운 또는 원하는 표적을 조절하는 임의의 다른 수단에 기초될 수 있다.
전략 1: 부조화적인 조절의 경우, 안티센스 전사체의 녹다운은 통상적(센스) 유전자의 발현을 상승시킨다. 후자 유전자가 공지의 또는 가상 약물 표적에 인코드한다면, 이의 안티센스 반대편의 녹다운은 수용체 항진 또는 효소 자극물질의 작용을 의식적으로 모방할 수 있다.
전략 2: 조화적 조절의 경우, 안티센스 및 센스 전사체 모두 동시에 녹다운 시킬 수 있어, 통상의(센스) 유전자 발현의 상승적 환원을 얻을 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 녹다운을 얻는데 이용된다면, 이 전략은 센스 전사체를 표적으로 하는 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 그리고 상응하는 안티센스 전사를 표적으로 하는 또 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 중첩 센스 및 안티센스를 동시에 표적으로 하는 단일 대칭적 안티센스 올리고뉴클레오티드에 적용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 안티센스 화합물들은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 외부 유도 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, siRNA 화합물, 단일 또는 이중-가닥 RNA 간섭 (RNAi) 화합물, 가령 siRNA 화합물, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 하이브리드하여, 이의 기능을 조절하는 기타 올리고머 화합물들을 포함한다. 이와 같이, 안티센스 화합물들은 DNA, RNA, DNA-like, RNA-like, 또는 이의 혼합물이 될 수 있거나, 또는 하나 이상의 상기 것들의 모방체가 될 수 있다. 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물이 될 수 있으며, 그리고, 내부에 또는 말단이 중배(bulges), 미스메치 또는 루프와 같은 구조적 요소를 포함할 수 있다. 안티센스 화합물은 선형으로 준비될 수 있지만, 결합되거나 원형 및/또는 분지형으로 준비될 수 있다. 안티센스 화합물은 두 가작이 하이브리드되어 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하거나 또는 하이브리드화를 허용하고, 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 위하여 충분히 자가-상보성을 가진 단일 가닥과 같은 구조체를 포함할 수 있다. 두 개 가닥이 서로 자유 3' 또는 5' 말단을 남기고 내부적으로 연결되거나 또는 연속적인 헤어핀 구조 또는 루프를 형성하도록 연결될 수 있다. 헤어핀 구조는 단일 가닥으로 된 연장부를 만드는 5' 또는 3' 말단상에 오버행(overhang)을 포함할 수 있다. 이중 가닥의 화합물은 선택적으로 양단에 오버행을 포함할 수 있다. 추가 변형은 말단, 선택된 뉴클레오티드 위치, 슈가 위치중 하나에 부착된, 또는 인터뉴클레오티드 링키지 중 하나에 부착된 콘쥬게이트 군을 포함할 수 있다. 대안으로, 두 개 가닥은 비-핵산 모이어티 또는 링커 군을 통하여 링크될 수 있다. 한 개 가닥으로부터만 형성된 경우, dsRNA는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서, dsRNAs는 완전히 또는 부분적으로 이중 가닥이 될 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조절은 유전자전이 세포계에서 dsRNA 헤어핀의 안정적 발현에 의해 이루어질 수 있지만, 그러나, 일부 구체예에서, 유전자 발현 또는 기능은 상향 조절된다. 두 개 가닥으로부터 형성될 때, 또는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취하는 단일 가닥의 경우, 두 개 가닥(또는 단일 가닥의 듀플렉스 형성 구역)은 Watson-Crick 방식으로 염기쌍을 이루는 상보성 RNA 가닥이다.
일단 시스템내로 도입되면, 본 발명의 화합물들은 점유-기반 기전(occupancy-based mechanisms)을 통하여 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 얻기 위하여 하나 이상의 효소 또는 구조적 단백질의 작용을 유도할 수 있다. 일반적으로, 핵산 (올리고뉴클레오티드를 포함)은 "DNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-데옥시 슈가를 가지고, 그리고 U 염기 대신 일반적으로 T를 가짐) 또는 "RNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-하이드록시 또는 2'-변형된 슈가를 가지고, 그리고 T 염기 대신 U 염기를 일반적으로 가짐)으로 설명될 수 있다. 핵산 헬릭스는 한 가지 이상의 구조 유형을 채택할 수 있지만, 가장 흔하게는 A- 및 B-형이 된다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-like"이며, 그리고 A-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-like"이다. 일부(키메라) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형 구역을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 바람직한 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 화합물은 최소한 하나의 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드, 변형된 링키지를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 간섭 RNA (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA); 마이크로, 간섭 RNA (miRNA); 작은, 일시적, RNA (stRNA); 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA); 작은 RNA-유도된 유전자 활성(RNAa); 작은 활성화 RNAs (saRNAs), 또는 이의 조합을 포함한다.
dsRNA는 또한 “작은 RNA-유도된 유전자 활성화” 또는 RNAa 기전인 유전자 발현을 활성화시킬 수 있다. dsRNAs 표적화 유전자 프로모터는 관련 유전자의 강력한 전사 활성화를 유도한다. RNAa는 “작은 활성화 RNA(saRNA)"로 불리는 합성 dsRNA를 이용하여 인산 세포에서 설명되었다. 현재까지 다른 유기체들에서 RNAa가 보존되는지는 밝혀지지 않았다.
작은 이중-가닥 RNA (dsRNA), 가령, 작은 간섭 RNA (siRNA) 및 마이크로RNA (miRNA)는 RNA 간섭(RNAi)로 알려진 진화론적으로 보존된 기전의 촉발자로 밝혀졌다. RNAi는 리모델링 크로마틴을 통하여 유전자 침묵을 일관되게 유도하여, 전사 억제, 상보성 mRNA 분해 또는 단백질 해독을 차단시킨다. 그러나, 실시예 부분에서 상세하게 설명된 경우에서, 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드 및 이의 인코드된 산물들의 발현 및/또는 기능을 증가시크는 것으로 보인다. dsRNAs는 작은 활성화된 RNAs (saRNA)으로 작용할 수 있다. 이론에 구애되지 않고, 유전자 프로모터에서 서열들을 표적화함으로써, saRNAs는 dsRNA-유도된 전사 활성화 (RNAa)로 불리는 현상에서 표적 유전자 발현을 유도할 수 있다.
추가 구체예에서, 여기에서 확인된 "바람직한 표적 단편"은 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 추가 화합물을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. "조절물질(modulators)"은 Sirtuin 1(SIRT1)을 인코드하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 화합물이며, 바람직한 표적 단편에 상보성인 최소한 5개-뉴클레오티드 부분을 포함한다. 스크리닝 방법은 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 핵산 분자의 바람직한 표적 단편을 하나 이상의 후보 조절물질과 접촉시키고, 그리고 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드(가령, 서열 번호: 6-47)를 인코드하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 하나 이상의 후보 조절물질을 선택하는 단계로 구성된다. Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 핵산 분자의 발현을 조절(가령, 감소 또는 증가)시킬 수 있는 것으로 일단 확인되면, 그 다음 조절물질은 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 기능의 추가 연구, 또는 본 발명에 따른 연구, 진단 또는 치료 물질로 이용될 수 있다.
안티센스 서열의 표적화는 바람직하게는 표적 유전자의 기능을 조절한다. 예를 들면, SIRT1 유전자(수탁번호 NM_012238.3;; UCSC 게놈 데이터베이스). 바람직한 구체예에서, 표적은 Sirtuin 1 유전자의 안티센스 폴리뉴클레오티드다. 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드(가령, 수탁번호 NM_012238.3 서열번호: 1, 도 10))의 센스 및/또는 천연 안티센스 서열들, 변이체들, 대립유전자들, 이소폼, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 이들의 상보성 서열들이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자이며, 그리고 표적은 안티센스 및/또는 센스 SIRT1 폴리뉴클레오티드의 코딩 및 넌코딩 구열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 표적 단편은 본 발명의 각 상보성 안티센스 화합물과 복합되어 안정화된 이중-가닥 (duplexed) 올리고뉴클레오티드를 형성할 수도 있다.
이와 같은 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 모이어티는 당분야에서 표적 발현을 조절하고, 해독을 조절하고 뿐만 아니라 안티센스 기전을 통하여 RNA 프로세싱을 조절하는 것으로 알려져 있다. 더욱이, 이중-가닥 모이어티는 화학적 변형을 받을 수도 있다(Fire et al ., (1998) Nature , 391, 806-811; Timmons and Fire , (1998) Nature , 395, 854; Timmons et al ., (2001) Gene , 263, 103-112; Tabara et al ., (1998) Science , 282, 430-431; Montgomery et al ., (1998) Proc . Natl . Acad. Sci . USA , 95, 15502-15507; Tuschl et al ., (1999) Gene Dev ., 13, 3191-3197; Elbashir et al., (2001) Nature , 411, 494-498; Elbashir et al ., (2001) Gene Dev . 15, 188-200). 예를 들면, 이와 같은 이중-가닥 모이어티는 표적에 대한 듀플렉스의 안티센스 가닥의 고유한 하이브리드화에 의해 표적을 저해하여, 표적의 효소적 분해를 촉발시키는 것으로 알려져 있다. (Tijsterman et al ., (2002) Science , 295, 694-697).
바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드 (가령, 수탁번호 NM_012238.3), 변이체들, 대립유전자들, 이소폼, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 이의 상보성 서열들을 표적한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자다.
본 발명의 구체예에 따르면, 표적 핵산 분자는 Sirtuin 1(SIRT1)에만 국한되지 않으며, Sirtuin 1(SIRT1) 분자들의 이소폼, 수용체, 상동체들 그리고 이와 유사한 것까지 확장된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 SIRT1 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스 서열, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드(서열 번호: 2-5) 및 이의 임의의 변이체들, 대립유전자들, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 상보성 서열들을 표적한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 서열 번호: 6 내지 47에서 제시된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드와 연합된 넌코딩 센스 및/또는 안티센스 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 Sirtuin 1(SIRT1) 안티센스의 핵산 서열에 상보성이거나 또는 이에 결합하고, 그리고 Sirtuin 1(SIRT1) 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 SIRT1 천연 안티센스의 핵산 서열(서열 번호: 2 내지 5)에 상보성이거나 또는 이에 결합하고, 그리고 SIRT1 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 6 내지 47의 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드 서열들을 포함하고, Sirtuin 1(SIRT1) 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
폴리뉴클레오티드 표적은 SIRT1의 패밀리 멤버, SIRT1의 변이체들; SNP를 포함하는, SIRT1의 돌연변이체들 ; SIRT1의 넌코딩 서열들; SIRT1의 대립유전자들; 종 변이체들, 단편들 그리고 이와 유사한 것을 포함하는 SIRT1를 포함한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자다.
또 다른 바람직한 구체예에서, Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드를 표적화하는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA, 간섭 RNA (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA); 마이크로 간섭 RNA (miRNA); 작은, 일시적 RNA (stRNA); 또는 짧은, 헤어핀 RNA (shRNA); 작은 RNA-유도된 유전자 활성화 (RNAa); 또는, 작은 활성화 RNA (saRNA)를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드(가령, 서열 번호: 6 내지 47)의 표적화는 이들 표적의 발현 또는 기능을 조절한다. 한 구체예에서, 발현 또는 기능은 기준과 비교하였을 때 상향-조절된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 발현 또는 기능은 기준과 비교하였을 때 하향-조절된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열 번호: 6 내지 47에서 제시된 것과 같은 서열들을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더 짧은 또는 더 긴 단편들, 변형된 결합 그리고 이와 유사한 것을 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 서열 번호: 6 내지 47은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
바람직한 표적 핵산의 조절은 당분야에 공지된 몇 가지 방식으로 실행될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등. 효소적 핵산 분자들(가령, 리보자임)은 뉴클레오티드 염기 서열-특이적 방식으로 다른 별도의 핵산 분자들을 반복적으로 절단하는 능력을 포함하여 하나 이상의 다양한 반응을 촉매할 수 있는 핵산 분자들이다. 이러한 효소적 핵산 분자들은 예를 들면, 임의의 RNA 전사체를 실질적으로 표적화시키는데 이용될 수 있다 (Zaug et al ., 324, Nature 429 1986; Cech, 260 JAMA 3030, 1988; and Jefferies et al ., 17 Nucleic Acids Research 1371, 1989).
이들의 서열-특이성 때문에, 효소적 핵산 분자들의 trans-절단은 인간 질환에 대한 치료 물질로써 가능성을 보여준다 (Usman & McSwiggen , (1995) Ann . Rep . Med . Chem . 30, 285-294; Christoffersen and Marr , (1995) J. Med . Chem . 38, 2023-2037). 효소적 핵산 분자들은 세포성 RNA의 배경내에 특이적 RNA 표적을 절단하도록 고안될 수 있다. 이러한 절단 이벤트는 mRNA 비-기능성을 제공하여, 이 RNA로부터 단백질 발현을 폐기시킨다. 이러한 방식에서, 질환 상태와 연관된 단백질의 합성이 선택적으로 억제될 수 있다.
일반적으로, RNA 절단 활성을 가진 효소적 핵산은 먼저 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 이와 같은 결합은 표적 RNA를 절단하기 위하여 작용하는 분자의 효소적 부분에 근접하게 유지된 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 일어난다. 따라서, 효소적 핵산은 우선 표적 RNA를 인지하고, 그 다음 상보성 염기 쌍을 통하여 표적 RNA에 결합하고, 그리고 정확한 부위에 일단 결합되면, 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단한다. 이러한 표적 RNA의 전략적 절단으로 인코드된 단백질의 합성을 지시하는 능력을 파괴시킬 것이다. 효소적 핵산이 이의 RNA표적에 결합하여 이를 절단시킨 후, RNA로부터 방출되어 또 다른 표적을 찾고, 새로운 표적에 반복적으로 결합하고, 이를 절단할 수 있다.
이와 같은 시험관 선별(발달)의 몇 가지 전략(Orgel , (1979) Proc . R. Soc . London , B 205, 435)이 이용되어, 절단, 및 포스포디에스테르 링키지와 아미드 링키지의 결찰과 같은 다양한 반응을 촉매할 수 있는 새로운 핵산 촉매를 개발하였다(Joyce , 1989, Gene , 82, 83-87; Beaudry et al ., 1992, Science 257, 635-641; Joyce , 1992, Scientific American 267, 90-97; Breaker et al ., 1994, TIBTECH 12, 268; Bartel et al ., 1993, Science 261:1411-1418; Szostak , 1993, TIBS 17, 89-93; Kumar et al ., 1995, FASEB J., 9, 1183; Breaker , 1996, Curr . Op . Biotech ., 7, 442).
촉매 활성을 조절할 수 있는 리보자임의 개발은 유전자 발현을 조절하기 위한 목적으로 RNA-절단 리보자임을 이용하는 임의의 전략에 상당히 기여할 수 있다. 해머 머리모양의 리보자임은 예를 들면, Mg2 + 공인자의 포화 농도 존재(10mM)하에 약 1min-1의 촉매속도(kcat)로 기능을 한다. 인위적인 "RNA 리가아제" 리보자임은 약 100 min-1의 속도로 상응하는 자가-변형 반응을 촉매하는 것으로 나타났다. 또한, DNA로 구성된 기질 결합 팔(arm)을 가지고 있는 특정 변형된 해머머리 리보자임은 100 min-1에 근접한 다중 턴-오버 속도로 RNA 절단을 촉매한다. 최종적으로, 특정 뉴클레오티드 유사체를 가진 해머머리의 촉매 코어내에 특이적 잔기의 대체는 촉매 속도에서 약 10배 개선 변형된 리보자임을 제공한다. 이와 같은 발견은 리보자임이 대부분의 자가-절단 리보자임에 의해 시험관에서 보여주는 것보다 상당히 큰 촉매 속도로 화학적 변형을 촉진시킬 것이라는 것을 설명한다. 그 다음 특정 자가-절단 리보자임의 구조를 최적화시켜 최대 촉매 활성을 제공하거나, 또는 전제적으로 RNA 포스포디에스테르 절단에 대해 상당히 더 빠른 속도를 보여주는 새로운 RNA 모티프를 만드는 것이 가능하다.
“해머머리” 모델을 적용시킨 RNA 촉매에 의해 RNA 기질의 분자내 절단은 1987년 처음 나타났다(Uhlenbeck , O. C. (1987) Nature , 328: 596-600). RNA 촉매가 회수되었고, 다중 RNA 분자들과 반응되었는데, 이는 진정한 촉매임을 설명하는 것이다.
“해머머리” 모티프에 기초하여 고안된 촉매적 RNA를 이용하여 표적 서열들과 필수적인 염기쌍을 유지하도록 하기 위하여 촉매 RNA내에 적절한 염기 변화를 만듦으로써 특이적 표적 서열들을 절단하였다(Haseloff and Gerlach , (1988) Nature , 334, 585; Walbot and Bruening , (1988) Nature , 334, 196; Uhlenbeck , O. C. (1987) Nature , 328: 596-600; Koizumi , M., (1988) FEBS Lett ., 228: 228-230). 이것은 특이적 표적 서열들을 절단하기 위하여 촉매 RNA의 사용을 허락하며, 그리고 "헤머머리" 모델에 따라 고안된 촉매 RNA는 생체에서 특이적 기질 RNA를 절단하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다(Haseloff and Gerlach , (1988) Nature , 334, 585; Walbot and Bruening , (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck , O. C. (1987) Nature , 328: 596-600 참고).
RNA 간섭 (RNAi)은 포유류 및 포유류 세포에서 유전자 발현을 조절하는 강력한 도구가 되었다. 이와 같은 방식은 발현 플라스미드 또는 바이러스 및 siRNA로 프로세스되는 작은 헤어핀 RNA에 대한 코딩 서열을 이용하여 RNA 자체로 또는 DNA로 작은 간섭 RNA(siRNA) 운반을 요구한다. 이 시스템은 pre-siRNA를 세포질로 효과적으로 운반할 수 있는데, 세포질에서 이들 RNA는 활성이 있으며, 유전자 발현을 위하여 조절된 그리고 조직 특이적인 프로모터의 사용을 허용한다.
바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 화합물은 리보핵산 (RNA) 및/또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머, 또는 이의 모방체, 키메라, 유사체 또는 동사체를 포함한다. 이 용어는 자연적으로 생성된 뉴클레오티드, 슈가들 및 공유적 인터뉴클레오시드 (기본골격) 링키지로 구성된 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라, 유사하게 기능을 하는 비-자연적으로 생성되는 부분들을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이와 같은 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 강화된 세포성 취입, 표적 핵산에 대해 강화된 친화력 그리고 뉴클레아제 존재시 증가된 안정성과 같은 바람직한 성질들 때문에 고유 형태를 능가하는 것이 종종 바람직하다.
본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드 또는 "안티센스 화합물"은 안티센스 올리고뉴클레오티드 (가령 RNA, DNA, 이의 모방체, 키메라, 유사체 또는 동사체), 리보자임, 외부 유도 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, siRNA 화합물, 단일- 또는 이중-가닥 RNA 간섭 (RNAi) 화합물 가령, siRNA 화합물, saRNA, aRNA, 및 표적 핵산의 최소한 일부분에 하이브리드되어 이의 기능을 조절하는 기타 올리고머 화합물을 포함한다. 이와 같이, 올리고뉴클레오티드 또는 "안티센스 화합물"은 DNA, RNA, DNA-like, RNA-like, 또는 이의 혼합물들일 수 있고, 또는 하나이상의 이들의 모방체가 될 수도 있다. 이들 화합물들은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물이 될 수 있으며, 그리고 내부 또는 말단 불룩한 부분, 미스메치 또는 루프와 같은 구조적 요소들을 포함할 수 있다. 안티센스 화합물들은 일반적으로 선형으로 준비되지만, 원형 및/또는 가지형이 되기 위해 결합하거나 다른 방식으로 준비될 수 있다. 안티센스 화합물은 예를 들면, 두 개 가닥이 하이브리드되어 완전하게 완전하게 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하거나 또는 하이브리드화 및 완전하게 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 허용하기 위하여 충분한 자가-상보성을 가진 단일 가닥과 같은 구조체를 포함할 수 있다. 두 가닥은 내부적으로 연결되어 자유 3' 또는 5' 말단을 남겨놓거나 또는 연속 헤어핀 구조 또는 루프를 형성하기 위해 연결될 수 있다. 헤어핀 구조는 5' 또는 3' 말단에 단일 가닥의 연장부를 만드는 오버행을 포함할 수 있다. 이중 가닥의 화합물들은 선택적으로 양단에 오버행을 포함할 수 있다. 추가 변형은 말단, 선택된 뉴클레오티드 위치, 슈가 위치중 하나에 부착된, 또는 인터뉴클레오티드 링키지 중 하나에 부착된 콘쥬게이트 군을 포함할 수 있다. 대안으로, 두 개 가닥은 비-핵산 모이어티 또는 링커 군을 통하여 링크될 수 있다. 한 개 가닥으로부터만 형성된 경우, dsRNA는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서, dsRNAs는 완전히 또는 부분적으로 이중 가닥이 될 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조절은 유전자전이 세포계에서 dsRNA 헤어핀의 안정적 발현에 의해 이루어질 수 있다(Hammond et al ., (1991) Nat . Rev . Genet ., 2, 110-119; Matzke et al., (2001) Curr . Opin . Genet . Dev ., 11, 221-227; Sharp , (2001) Gene Dev ., 15, 485-490). 두 개 가닥으로부터 형성될 때, 또는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취하는 단일 가닥의 경우, 두 개 가닥(또는 단일 가닥의 듀플렉스 형성 구역)은 Watson-Crick 방식으로 염기쌍을 이루는 상보성 RNA 가닥이다.
일단 시스템내로 도입되면, 본 발명의 화합물들은 점유-기반 기전(occupancy-based mechanisms)을 통하여 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 얻기 위하여 하나 이상의 효소 또는 구조적 단백질의 작용을 유도할 수 있다. 일반적으로, 핵산 (올리고뉴클레오티드를 포함)은 "DNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-데옥시 슈가를 가지고, 그리고 U 염기 대신 일반적으로 T를 가짐) 또는 "RNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-하이드록시 또는 2'-변형된 슈가를 가지고, 그리고 T 염기 대신 U 염기를 일반적으로 가짐)으로 설명될 수 있다. 핵산 헬릭스는 한 가지 이상의 구조 유형을 채택할 수 있지만, 가장 흔하게는 A- 및 B-형이 된다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-like"이며, 그리고 A-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-like"이다. 일부(키메라) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형 구역을 포함한다.
본 발명에 따른 안티센스 화합물은 길이가 약 5 내지 약 80 뉴클레오티드 (가령, 약 5 내지 약 80개의 링크된 뉴클레오시드)의 안티센스 부분을 포함할 수 있다. 이는 안티센스 가닥 또는 안티센스 화합물의 일부분의 길이를 말한다. 환언하면, 본 발명의 단일-가닥 안티센스 화합물은 약 5 내지 약 80 뉴클레오티드를 포함하며, 그리고 본 발명의 이중-가닥 안티센스 화합물(예를 들면, dsRNA)은 길이가 5개 내지 약 80개 뉴클레오티드로 된 안티센스 가닥 또는 일부분을 포함한다. 이것은 길이가 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 또는 80개 뉴클레오티드 또는 이 범위내 임의의 수의 안티센스 부분을 포함한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 길이가 10개 내지 50개 뉴클레오티드의 안티센스 부분을 가진다. 이것은 길이가 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 또는 50개 뉴클레오티드 또는 이 범위내 임의의 수의 안티센스 부분으로 구체화된다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 길이가 12개 또는 13개 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 부분을 가진다. 이것은 길이가 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 뉴클레오티드 또는 이 범위내 임의의 수의 안티센스 부분으로 구체화된다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
바람직한 구체예에서, Sirtuin 1(SIRT1)의 임의의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 표적화하는 최소한 한 가지 올리고뉴클레오티드를 투여하면 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드 및 이의 인코드된 산물들의 비정상적 발현 또는 기능과 연관된 질환 또는 기타 관련 질환을 예방 또는 치료한다. 안티센스 화합물로 치료될 수 있는 질병의 예는 암(가령, 유방암, 직장암, CCL, CML, 전립선암), 신경퇴행성 질환(Alzheimer 질환(AD), 헌팅턴 질환, ALS, 파킨슨 질환, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증, 그리고 폴리글루타민 응집으로 인한 질환들); 골근육 질환(가령, Duchene 근위축증, 골근육 위축중, Becker 영양실조, or 근육영양장애); 대사질환(가령, 인슐린 저항성, 당뇨병, 비만, 내당능장애, 혈중 고콜레스테롤, 고혈당, 이상지질혈증 및 고지혈증); 성인기 발증형 당뇨병, 당뇨병증 신증, 신경장애(가령, 감각 신경장애, 자율 신경장애, 운동 신경장애, 망막증); 골질환(가령, 골다공증), 혈액 질환(가령, 백혈병); 간질환(가령, 알코올중독 또는 간염으로 인한); 비만; 골 재흡수, 노인성 시력감퇴, AIDS 관련 치매, ALS, 안면신경마비, 아테롬성 동맥경화증, 심장질환(가령, 부정맥, 만성 울혈성 심부전, 허혈성 발작, 관상 대동맥 질환 및 심근증), 만성 퇴행성 질환(가령, 심근질환), 만성 신부전, 타입 2 당뇨병, 궤양, 백내장, 노시, 사구체신염, Guillan-Barre 증후군, 출혈성 발작, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, SLE, Crohn 병, 골관절염, 골다공증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐렴, 피부 노화 및 뇨실금을 포함한다. 다른 예는 신경 세포 사멸, 노화와 관련된 질환 및 장애 또는 원치않는 세포 상실을 특징으로 하는 기타 질환을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고머 화합물은 화합물내에 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 상이한 염기가 존재하는 변이체를 포함한다. 예를 들면, 첫번째 뉴클레오티드가 아데노신이라면, 변이체들은 이 위치에 티미딘, 구아노신 또는 시티딘을 포함하도록 만들어질 수 있다. 안티센스 또는 dsRNA 화합물의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 이들 화합물은 표적 핵산의 발현을 억제하는 이들 능력을 측정하기 위하여 여기에서 설명된 방법에 의해 테스트된다.
일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 40% 내지 약 60%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 60% 내지 약 70%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 70% 내지 약 80%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 80% 내지 약 90%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 서열 번호:6 내지 47에 제시된 핵산 분자들과 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환 또는 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA)으로 치환된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 SIRT1 및 서열 번호: 1 내지 5의 서열과 연관된 코딩 및/또는 넌코딩 서열들의 핵산 분자들 센스 및/또는 안티센스의 하나 이상의 구역을 표적한다. 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 1 내지 5의 중첩 구역을 표적한다.
본 발명의 특정 바람직한 올리고뉴클레오티드는 키메라 올리고뉴클레오티드다. 본 발명의 내용에서 "키메라 올리고뉴클레오티드" 또는 "키메라"는 두개 이상의 화학적으로 별개의 구역을 포함하며, 각 구역은 최소 한 개의 뉴클레오티드로 구성되는, 올리고뉴클레오티드다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 하나 이상의 유익한 성질(예를 들면, 증가된 뉴클레아제 저항성, 세포내로의 증가된 취입, 표적에 대한 증가된 결합 친화력)을 부여하는 변형된 뉴클레오티드의 최소 한 구역과 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 기질이 되는 구역을 포함한다. 예를 들면, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제다. 따라서, RNase H의 활성화는 RNA 표적의 절단을 초래하여, 유전자 발현의 안티센스 조절의 효과를 강화시킨다. 결과적으로, 동일한 표적 구역에 하이브리드되는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드와 비교하였을 때, 키메라 올리고뉴클레오티드가 사용되면, 더 짧은 올리고뉴클레오티드로 필적할 수 있는 결과를 종종 얻을 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동 및 필요하다면, 당분야에 공지된 핵산 하이브리드 기술와 연합하여 일반적으로 탐지될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 표적 결합 친화력을 증가시키도록 변형된 최소한 한 구역과, RNAse H에 대한 기질로 작용하는 한 구역을 포함한다. 올리고뉴클레오티드가 이의 표적에 대한 친화력(이 경우, ras를 인코드하는 핵산)은 올리고뉴클레오티드/표적 쌍의 Tm을 측정함으로써 일반적으로 결정되는데, 이것은 올리고뉴클레오티드와 표적이 분리되는 온도이며; 해리는 분광광도계에 의해 탐지된다. Tm이 높을수록 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화력이 커진다.
본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기에서 설명된 것과 같이 두개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 혼성 구조로 형성될 수 있다. 이와 같은 화합물을 당분야에서 하이브리드(hybrids) 또는 겜퍼(gapmers)라고 한다. 이와 같은 하이브리드 구조의 제조에 대해 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: US 특허 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5,220,007호; 제5,256,775호; 제5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 구역은 슈가의 2'위치에서 변형된 최소한 뉴클레오티드를 포함하는데, 바람직하게는 2'-O알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오르-변형된 뉴클레오티드이다. 다른 바람직한 구체예에서, RNA 변형은 피리미딘의 리보즈, 염기가 소실된 잔기(abasic residues) 또는 RNA의 3' 말단에서 역전된 염기상에 2'-플루오르, 2'-아미노 및 2' O-메틸 변형을 포함한다. 이와 같은 변형은 올리고뉴클레오티드에 통상적으로 통합되며, 그리고 이들 올리고뉴클레오티드는 주어진 표적에 대해 2'-데옥시올리고뉴클레오티드보다 더 높은 Tm(가령, 더 높은 표적 결합 친화력)을 가지는 것을 보여주었다. 증가된 친화력의 효과는 유전자 발현의 RNAi 올리고뉴클레오티드 억제를 상당히 강화시키는 것이다. RNAse H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이며; 따라서, 이 효소의 활성화로 RNA 표적이 절단되며, 그리고 RNAi 억제의 효과는 상당히 강화될 것이다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동에 의해 통상적으로 설명될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레아제 저항성을 강화시키기 위하여 변형된다. 세포는 핵산을 분해시킬 수 있는 다양한 엑소- 및 엔도-뉴클레아제를 포함한다. 다수의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 변형은 고유한 올리고데옥시뉴클레오티드 보다 뉴클레아제 절단에 더 저항성을 가지도록 올리고뉴클레오티드가 통합된 것들이다. 뉴클레아제 저항성은 올리고뉴클레오티드를 세포 추출물 또는 분리된 뉴클레아제 용액과 항온처리하고, 통상적으로 겔 전기영동에 의해 시간이 경과한 후에 남아있는 고유 올리고뉴클레오티드의 수준을 측정함으로써 결정된다. 뉴클레아제 저항성을 강화시키도록 변형된 올리고뉴클레오티드는 변형안된 올리고뉴클레오티드보다 더 긴 시간 동안 고유한 상태로 존재한다. 다양한 올리고뉴클레오티드 변형이 뉴클레아제 저항성을 강화시키거나 부여한다는 것이 설명되었다. 최소한 하나의 포스포로티오에이트 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 더 바람직하다. 일부 경우, 표적 결합 친화력이 강화된 올리고뉴클레오티드 변형은 독립적으로 뉴클레아제 저항성을 강화시킨다. 일부 바람직한 변형은 De Mesmaeker et al . (1995) Acc . Chem . Res . 28:366-374에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에서 구상된 일부 바람직한 올리고뉴클레오티드의 특정 예는 변형된 기본골격을 포함하는 것들, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 짧은 쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터슈가 링키지 또는 짧은 쇄 이형원자 또는 이형사이클 인터슈가 링키지를 포함한다. 가장 바람직한 것은 포스포로티오에이트 기본골격을 가진 올리고뉴클레오티드 및 이형원자 기본골격을 가진 올리고뉴클레오티드, 특히, CH2--NH--O--CH2, CH,--N(CH3)--O--CH2 [메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 기본골격으로 공지됨], CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2 및 O--N (CH3)--CH2--CH2 기본골격을 가지며, 이때 고유 포스포디에스테르 기본골격은 O--P--O--CH로 나타낸다). De Mesmaeker et al . (1995) Acc . Chem . Res . 28:366-374)에서 설명된 아미드 기본골격 또한 바람직하다. 몰포리노 기본골격 구조를 가진 올리고뉴클레오티드 또한 바람직하다(Summerton and Weller, U.S. 특허 제5,034,506호). 다른 바람직한 구체예에서, 펩티드 핵산 (PNA) 기본골격와 같은 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 기본골격은 폴리아미드 기본골격과 대체되며, 뉴클레오티드는 폴리아미드 기본골격의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합된다 (Nielsen et al . (1991) Science, 254, 1497). 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 슈가 모이어티를 또한 포함할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 또는 O(CH2)nCH3 이때, n은 1 내지 약 10이다; C1 내지 C10 저가알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저가 알킬, 알카릴 또는 아랄킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S--, 또는 N-알킬; O--, S--, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실일; RNA 절단기; 리포터기; 삽입기(intercalator); 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 개선시키는 기; 또는 올리고뉴클레오티드 및 유사한 성질을 가진 다른 치환기의 약리역학적 성질을 개선시키는 기. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸)로 공지되기도 함]을 포함한다(Martin et al ., (1995) Helv . Chim . Acta , 78, 486). 다른 바람직한 변형은 2'-메톡시 (2'-O--CH3), 2'-프로폭시 (2'-OCH2 CH2CH3) 및 2'-플루오르 (2'-F)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드상의 다른 위치에 유사한 변형이 있을 수 있는데, 특히, 3' 말단 뉴클레오티드과 5' 말단 뉴클레오티드의 5'위치의 슈가의 3' 위치에 있을 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토퓨라노실기 대신 사이클로부틸과 같은 슈가 모방체를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 또한 추가적으로 또는 대안으로, 뉴클레오티드 (당분야에서 흔히 간단히 “염기”라고 부른다) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, "변형안된" 또는 "천연" 뉴클레오티드는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 천연 핵산에 드물게 또는 일시적으로 발견되는 뉴클레오티드, 가령, 하이포산틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신 (5-메틸-2'데옥시시토신이라고 하기도 하고, 당분야에서 5-Me-C 라고 지칭하기도 함), 5-하이드록시메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC 및 겐토바이오실 HMC, 뿐만 아니라 합성 뉴클레오티드, 가령, 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸일알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다(Kornberg , A., DNA Replication , W. H. Freeman & Co ., San Francisco , 1980, pp75 -77; Gebeyehu , G., et al . (1987) Nucl . Acids Res . 15:4513). 당분야에 공지된 “범용(universal)” 염기, 가령, 이노신이 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환은 0.6-1.2℃로 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 확인되었고,(Sanghvi , Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu , B., eds ., 안티센스 Research and Applications , CRC Press , Boca Raton, 1993, pp . 276-278) 그리고 현재 가장 바함직한 염기 치환이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성 또는 세포성 취입을 강화시키는 올리고뉴클레오티드 하나 이상의 모이어티 또는 콘쥬게이트에 화학적으로 연결된 것을 포함한다. 이러한 모이어티는 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티(Letsinger et al ., (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 86, 6553), 콜린산(Manoharan et al . (1994) Bioorg . Med . Chem. Let . 4, 1053), 티오에테르, 가령, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al . (1992) Ann . N.Y. Acad. Sci . 660, 306; Manoharan et al . (1993) Bioorg . Med . Chem . Let . 3, 2765), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al ., (1992) Nucl . Acids Res . 20, 533), 알파 쇄, 가령, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison - Behmoaras et al . EMBO J. 1991, 10, 111; Kabanov et al . (1990) FEBS Lett . 259, 327; Svinarchuk et al . (1993) Biochimie , 75, 49), 포스포리피드, 가령, 디-헥사데실--rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al . (1995) Tetrahedron Lett . 36, 3651; Shea et al . Nucl . Acids Res . 1990, 18, 3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(Manoharan et al . (1995) Nucleosides & Nucleotides , 14, 969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al . (1995) Tetrahedron Lett . 36, 3651)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 친지성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 이와 같은 올리고뉴클레오티드를 준비하는 방법들은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, U.S. 특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호.
주어진 올리고뉴클레오티드의 모든 위치들이 균일하게 변형될 필요는 없으며, 그리고 전술한 변형중 하나 이상이 단일 올리고뉴클레오티드에 통합되거나 또는 올리고뉴클레오티드내 단일 뉴클레오티드에만 통합될 수 있다. 본 발명은 여기에서 정의된 키메라 올리고뉴클레오티드가 되는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 염기가 소실된(abasic) 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 폴리하이드로카본 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 또 다른 모이어티와 콘쥬게이트된다. 이들 분자들은 슈가, 염기 또는 인산염 기의 몇 군데 위치에서 핵산 분자를 포함하는 임의의 하나 이상의 뉴클레오티드에 링크될 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
본 발명에 이용된 올리고뉴클레오티드는 잘 알려진 고형상 합성 기술을 통하여 통상적으로 그리고 일상적으로 만들어질 수 있다. 이와 같은 합성을 위한 장비는 Applied Biosystems을 포함하는 몇 군데 업자들이 판매한다. 이와 같은 합성을 위한 임의의 기타 수단들이 이용될 수 있으며; 올리고뉴클레오티드의 실질적인 합성은 본 발명의 분야에 숙지된 자의 능력 범위내에 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체들과 같은 다른 올리고뉴클레오티드를 준비하기 위한 유사한 기술을 이용하는 것 또한 공지되어 있다. 형광 라벨된, 바이오티닐화된 또는 콜레스테롤-변형된 올리고뉴클레오티드와 같은 기타 변형된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위하여 유사한 기술 및 시판되는 변형된 아미디트(amidites) 및 조절된 포어 글라스(CPG) 산물들, 가령, 바이오틴, 플로오레신, 아크리딘 또는 솔라렌(psoralen)-변형된 아미디트 및/또는 CPG (Glen Research, Sterling VA)으로부터 시판되는 것 이용)을 이용하는 것 또한 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 효과, 특이성 및 작용 기간을 강화시키기 위하여 LNA 모노머와 같은 변형을 이용하면, MOE, ANA, FANA, PS 등과 같은 현재 화학물질로 구성된 올리고뉴클레오티드의 투여 경로를 확장시킨다(ref : Recent advances in the medical chemistry of 안티센스 oligonucleotide by Uhlman, (2000) Current Opinions in Drug Discovery & Development Vol 3 No 2). 현재 올리고뉴클레오티드에서 일부 모노머를 LNA 모노머로 치환시키면 이루어질 수 있다. LNA 변형된 올리고뉴클레오티드는 부모 화합물과 유사한 크기를 가질 수 있고, 또는 더 큰, 또는 바람직하게는 더 작은 크기를 가질 수 있다. 이와 같은 LNA-변형된 올리고뉴클레오티드는 약 70% 미만의, 더욱 바람직하게는 약 60% 미만의, 가장 바람직하게는 약 50% 미만의 LNA 모노머를 포함하며, 이들 크기는 약 5개 내지 25개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 12개 내지 20 개 뉴클레오티드 사이가 된다.
바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 기본골격은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3'알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 링키지를 가진 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 링크된 유사체들, 그리고 역전된 극성을 가진 것들(이때, 뉴클레오티드 단위의 인접된 쌍은 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 링크된)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 염, 혼합된 염 및 자유 산 형태도 포함된다.
상기 인-함유 링키지의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: US 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
인 원자를 포함하지 않는 바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 기본골격은 짧은 쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 링키지, 혼합된 이형원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 링키지, 또는 하나 이상의 짧은 쇄 이형원자 또는 이형사이클 인터뉴클레오시드 링키지에 의해 형성된 기본 골격을 가진다. 이들은 몰포리노 링키지 (뉴클레오티드의 슈가 부분으로부터 일부 형성된); 실로옥산 기본골격; 설파이드, 술포옥시드 및 술폰 기본골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 기본골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 기본골격s; 알켄 함유 기본골격; 술파메이트 기본골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 기본골격; 술포네이트 및 술폰아미드 기본골격; 아미드 기본골격; 그리고 N, O, S 및 CH2 성분 부분이 혼합된 것을 가지는 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다; 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
기타 바람직한 올리고뉴클레오티드 모방체에 있어서, 슈가 및 인터뉴클레오시드 링키지, 가령, 뉴클레오티드 단위의 기본 골격은 신규한 군으로 대체된다. 염기 단위는 적합한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 올리고머 화합물중 하나인, 우수한 하이브리드화 성질을 가진 것으로 확인된 올리고뉴클레오티드 모방체를 펩티드 핵산 (PNA)이라 지칭한다. PNA 화합물, 올리고뉴클레오티드의 슈가-기본 골격은 아미드 함유 기본골격, 특히 아미도에틸글리신 기본골격으로 치환된다. 뉴클레오티드는 보유되며, 기본 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 US 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다. PNA 화합물의 추가 교시는 Nielsen et al ., Science , 1991, 254, 1497-1500에서 볼 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 포스포로티오에이트 기본골격를 가진 올리고뉴클레오티드, 이형원자 기본골격, 특히, CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-(메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 기본골격으로 공지됨), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3) CH2- 및-O-N(CH3)-CH2-CH2-를 가진 올리고뉴클레오티드가 되며, 이때, 고유 포스포디에스테르 기본골격은 상기 언급된 US 특허 제5,489,677호의 -O-P-O-CH2-, 그리고 상기 언급된 US 특허 제5,602,240호의 아미드 기본 골격이다. 또한, 상기 언급된 US 특허 제5,034,506호의 몰포리노 기본골격 구조를 가진 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 슈가 모이어티를 포함할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S-또는 N-알키닐; 또는 O 알킬-O-알킬, 이때, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 치환안된 C 내지 CO 알킬 또는 C2 내지 CO 알케닐 및 알키닐이다. 특히 바람직한 것은 O(CH2)nOmCH3, O(CH2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2n)ON(CH2)nCH3)2 이며, 이때 n과 m은 1 내지 약 10이 될 수 있다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: C 내지 CO, (저가 알킬, 치환된 저가 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실일, RNA 절단기; 리포터기; 삽입기(intercalator); 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 개선시키는 기; 또는 올리고뉴클레오티드 및 유사한 성질을 가진 다른 치환기의 약리역학적 성질을 개선시키는 기. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 공지되기도 함]을 포함한다(Martin et al ., (1995) Helv . Chim . Acta , 78, 486). 다른 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE으로 공지되기도 함) (Martin et al ., (1995) Helv. Chim . Acta , 78, 486-504) 가령, 알콕시알콕시 기를 포함한다. 추가 바람직한 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 가령, O(CH2)2ON(CH3)2 기, (하기 실시예에서 설명되는 것과 같이 2'-DMAOE로 공지되기도 함) 그리고 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당분야에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE), 가령, 2'-O-CH2-O-CH2-N (CH2)2을 포함한다.
다른 바람직한 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-O CH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오르 (2'-F)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드에서 3' 위치의 슈가 또는 2'-5' 링크된 올리고뉴클레오티드에서, 그리고 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에 유사한 변형이 만들어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토퓨라노실 슈가 대신 사이클로부틸 모이어티와 같은 슈가 모방체를 가질 수 있다. 이와 같은 변형된 슈가 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: US 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
올리고뉴클레오티드는 또한 추가적으로 또는 대안으로, 뉴클레오티드 (당분야에서 흔히 간단히 “염기”라고 부른다) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, "변형안된" 또는 "천연" 뉴클레오티드는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 산틴, 하이포산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체들, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체들, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도-우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오르메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸무아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 그리고 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 다른 합성 및 천연 뉴클레오티드를 포함한다.
또한, 뉴클레오티드는 미국 특허 No. 3,687,808호, 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering' , pages 858-859, Kroschwitz , J.I., ed . John Wiley & Sons , 1990, those disclosed by Englisch et al ., ' Angewandle Chemie , International Edition' , 1991, 30, page 613, 및 Sanghvi , Y.S., Chapter 15, ' Antisence Research and Applications' , pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu , B. ea ., CRC Press , 1993에 설명된 것들을 포함한다. 이와 같은 뉴클레오티드의 일부는 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화력을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정도를 0.6-1.2℃ 증가시킨 것으로 나타났고(Sanghvi , Y.S., Crooke , S.T. and Lebleu , B., eds , 'Antisence Research and Applications' , CRC Press , Boca Raton , 1993, pp . 276-278) 그리고 2'-O메톡시에틸 슈가 변형과 복합하였을 때 특히 바람직한 염기 치환이다.
상기 변형된 뉴클레오티드 및 기타 변형된 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: US 특허 제3,687,808호, 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,750,692호, 및 제5,681,941호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 기타 변형은 올리고뉴클레오티드 하나 이상의 모이어티 또는 콘쥬게이트에 화학적으로 연결되는 것을 포함하는데, 이는 활성, 세포 분포 또는 올리고뉴클레오티드의 세포 취입을 강화시킨다.
이와 같은 모이어티는 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 1989, 86, 6553-6556), 담즙산(Manoharan et al ., (1994) Bioorg . Med . Chem . Let ., 4, 1053-1060), 티오에테르, 가령, 헥실-S-트리릴티올 (Manoharan et al ., (1992) Ann . N. Y. Acad . Sci ., 660, 306-309; Manoharan et al ., (1993) Bioorg . Med . Chem . Let ., 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al ., (1992) Nucl . Acids Res ., 20, 533-538), 지방족 쇄 가령, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Kabanov et al ., (1990) FEBS Lett ., 259, 327-330; Svinarchuk et al ., Biochimie , 1993, 75, 49-54), 인지질 가령, 디-헥사데실--rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al ., (1995) Tetrahedron Lett ., 36, 3651-3654; Shea et al ., (1990) Nucl . Acids Res ., 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(Mancharan et al ., (1995) Nucleoside & Nucleotide , 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al ., (1995) Tetrahedron Lett ., 36, 3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., (1995) Biochim . Biophys . Acta , 1264, 229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-t 옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al ., (1996) J. Pharmacol . Exp . Ther ., 277, 923-937)와 같은 지질 모이어티를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드 모이어티의 제법을 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: US 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호; 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
약물 발견: 본 발명의 화합물은 약물 발견 및 표적 유효화 분야에 적용시킬 수 있다. 본 발명은 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드와 질병 상태, 표현형 또는 조건 사이에 존재하는 상관 관계를 설명하기 위하여 약물 발견 노력에서 여기에서 확인된 화합물의 이용 및 바람직한 표적 단편의 이용을 포함한다. 이들 방법은 SIRT1 폴리뉴클레오티드를 탐지 또는 조절하는 것을 포함하며, 시료, 조직, 세포 또는 유기체를 본 발명의 화합물과 접촉시키고, Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 핵산 또는 단백질 수준을 측정하거나 및/또는 처치후 일정 시간에서 관련된 표현형 또는 화학적 엔드포인트를 측정하고, 그리고 선택적으로 처리안된 샘플의 측정된 값과 본 발명의 화합물로 처리된 화합물의 값을 비교하는 것을 포함한다. 이들 방법은 표적 유효화 프로세스를 위하여 미지의 유전자 기능을 결정하기 위하여, 또는 특정 질환, 상태 또는 표현형의 치료 또는 예방을 위한 표적으로 특정 유전자 산물의 유효성을 결정하기 위한 다른 실험과 나란히 또는 복합하여 실행될 수 있다.
유전자 발현의 상향 조절 또는 억제의 평가:
외인성 핵산을 숙주 세포 또는 유기체로의 전달은 세포 또는 유기체내 핵산이 존재하는 것을 직접적으로 탐지함으로써 평가될 수 있다. 이와 같은 탐지는 당분야에 공지된 몇 가지 방법에 의해 실현될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산의 존재는 서든 블랏 또는 핵산과 연합된 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용한 폴리메라제 쇄 반응(PCR)에 의해 탐지될 수 있다. 외인성 핵산의 발현은 유전자 발현 분석을 포함하는 통상적인 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산으로부터 생성된 mRNA는 노던 블랏 또는 역 전사 PCR (RT-PCR)을 이용하여 탐지되고 정량화될 수 있다.
외인성 핵산으로부터의 RNA 발현 또한 효소적 활성 또는 리포터 또는 리포터 단백질 활성을 측정함으로써 탐지될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산이 효과물질 RNA를 생산하고 있다는 것을 나타내는 것과 같이 표적 핵산 발현에서 증가 또는 감소로써 안티센스 조절 활성을 간접적으로 측정할 수 있다. 서열 보존에 근거하여, 프라이머를 고안하고, 이를 표적 유전자의 코딩 구역을 증폭시키는데 이용할 수 있다. 우선, 각 유전자의 가장 많이 발현된 코딩 구열을 이용하여 모델 기준 유전자를 구축할 수 있는데, 이때 임의의 코딩 또는 넌코딩 구역이 이용될 수 있다. 리포터 코딩 구역과 이의 폴리(A) 신호 사이에 각 코딩 구역을 삽입시켜 각 기준 유전자를 어셈블리한다. 이와 같은 플라스미드는 유전자의 상류 부분에 리포터 유전자를 가지고, 그리고 3' 넌-코딩 구역에 잠재적인 RNAi 표적을 가지는 mRNA를 만든다. 리포터 유전자를 조절함으로써 개별 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 분석할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 리포터 유전자는 아세토하이드록시산 합성효소 (AHAS), 알칼리 포스파타제(AP), 베타 갈락토시다제(LacZ), 베타 글루코로니다제(GUS), 클로람페니콜 아세틸전이효소(CAT), 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 청록색 형광 단백질 (CFP), 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 루시페라제(Luc), 호팔린 합성효소 (NOS), 옥토파인 합성효소 (OCS), 그리고 이들의 유도체들을 포함한다. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 젠타마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리친, 퓨로마이신 및 테트라사이클린에 저항성을 부여하는 다중 선택성 마커가 이용된다. 리포터 유전자의 조절을 결정하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 이들 방법은 형광 측정법(가령, 형광 분광학, 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 형광 현미경), 항생제 저항성 측정을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
키트 , 연구 시약, 진단제 및 치료제
본 발명의 화합물을 진단, 치료 및 예방용으로 이용하거나 연구 시약 및 키트 성분으로 이용할 수 있다. 더욱이, 당업자들은 정교한 특이성으로 유전자 발현을 저해시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 특정 유전자의 기능을 밝히거나 또는 생물학적 경로의 다양한 구성부의 기능들을 구별한다.
키트, 진단 그리고 다양한 생물학적 시스템에 사용하기 위하여, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 화합물 또는 치료제와 복합하여, 세포 및 조직에서 발현되는 유전자의 일부 또는 전체의 발현 패턴을 밝히기 위한 차등적 및/또는 복합적 분석에 도구로 유용하다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "생물학적 시스템" 또는 "시스템"은 Sirtuin 1(SIRT1) 유전자의 산물들을 발현시키는, 또는 이를 발현시키도록 능력을 갖춘 임의의 유기체, 세포, 세포 배양물 또는 조직으로 정의된다. 시스템에는 인간, 유전자전이 동물, 세포, 세포 배양물, 조직, 이형이식편, 이식물 및 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
비-제한적 실시예로써, 하나 이상의 안티센스 화합물로 처리된 세포 또는 조직에서의 발현 패턴은 안티센스 화합물로 처리안된 기준 세포 또는 조직과 비교되며, 그리고 생성된 패턴은 검사되는 유전자의 질병 연관성, 신호 경로, 세포 국소화, 발현 수준, 크기, 구조 또는 기능에 관련되기 때문에 차등적인 유전자 발현 수준에 대해 분석된다. 자극된 또는 자극되지 않은 세포, 그리고 발현 패턴에 영향을 주는 다른 화합물들의 존부하에 이와 같은 분석들이 실행될 수 있다.
당분야에 공지된 유전자 발현 분석 방법의 예로는 DNA 어래이 또는 마이크로어래이 (Brazma and Vilo, (2000) FEBS Lett ., 2000 480, 17-24; Celis , et al ., (2000) FEBS Lett ., 480, 2-16), SAGE (유전자 발현의 일련의 분석)(Madden , et al ., (2000) Drug Discov . Today , 2000, 5, 415-425), READS (절단된 cDNAs의 제한 효소 증폭) (Prashar and Weissman , (1999) Methods Enzymol ., 303, 258-72), TOGA (total gene expression analysis) (Sutcliffe , et al ., (2000) Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A., 97, 1976-81), 단백질 어래이 및 단백체학(proteomics) (Celis , et al ., (2000) FEBS Lett ., 480, 2-16; Jungblut , et al ., Electrophoresis , 1999, 20, 2100-10), 발현된 서열 tag (EST) 서열화(Celis , et al ., (2000) FEBS Lett ., 480, 2-16; Larsson , et al ., (2000) J. Biotechnol., 80, 143-57), 차감성 RNA 핑거프린팅 (SuRF) (Fuchs , et al ., (2000) Anal . Biochem., 286, 91-98; Larson , et al ., (2000) Cytometry , 41, 203-208), 차감성 클로닝, 차등적 디스플레이(DD) (Jurecic and Belmont , (2000) Curr . Opin . mircobiol ., 3, 316-21), 비교성 게놈 하이브리드화 (Carulli , et al ., (1998) J. Cell Biochem . Suppl ., 1998, 31, 286-96), FISH (형광 원위치 하이브리드화) 기술 (Going and Gusterson , (1999) Eur . J. Cancer , 35, 1895-904) 및 대량 분광학 방법(To , Comb . (2000) Chem . High Throughput Screen , 3, 235-41)을 포함한다.
본 발명의 화합물은 이들 화합물이 Sirtuin 1(SIRT1)을 인코드하는 핵산에 하이브리드하기 때문에 연구 및 진단에 유용하다. 예를 들면, 효과적인 Sirtuin 1(SIRT1) 조절물질로써 여기에서 설명되는 조건 및 효과를 가지고 하이브리드되는 올리고뉴클레오티드는 유전자 증폭 또는 탐지에 유리한 조건하에 효과적인 프라이머 또는 프로브다. 이들 프라이머 및 프로브는 Sirtuin 1(SIRT1)을 인코드하는 핵산 분자들의 특이적 탐지를 요구하는 방법 및 Sirtuin 1(SIRT1) 탐지 또는 추가 연구에 유용한 이들 핵산 분자들의 증폭에 유용하다. 당분야에 공지된 방법에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 본 발명의 프라이머 및 프로브와 Sirtuin 1(SIRT1)을 인코드하는 핵산의 하이브리드를 탐지할 수 있다. 이와 같은 수단은 올리고뉴클레오티드에 효소의 콘쥬게이션, 올리고뉴클레오티드의 방사능라벨링 또는 임의의 다른 적합한 탐지 수단을 포함할 수 있다. 샘플에서 Sirtuin 1(SIRT1)의 수준을 탐지하기 위한 탐지 수단을 이용한 키트를 준비할 수 있다.
치료요법적 용도로 당업자는 안티센스의 특이성 및 감응성을 이용한다. 인간을 포함하는 동물의 질병 상태를 치료하는데 치료요법적 모이어티로 안티센스 화합물을 이용하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 약물은 인간에게 안전하고 효과적으로 투여되었으며, 그리고 다수의 임상 시험이 현재 진행중이다. 따라서, 안티센스 화합물은 세포, 조직 및 동물, 특히 인간의 치료용 치료 섭생에 유용하도록 설정되는 유용한 치료 양식이 될 수 있다.
치료용으로, Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하여 치료될 수 있는 질환 또는 장애에 민감한 동물, 특히 인간을 본 발명에 따른 안티센스 화합물을 투여함으로써 치료한다. 예를 들면, 한 가지 비-제한적인 구체예에서, 이 방법은 치료를 요하는 동물에게 Sirtuin 1(SIRT1) 조절물질의 치료요법적 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 Sirtuin 1(SIRT1) 조절물질은 Sirtuin 1(SIRT1) 단백질의 활성을 효과적으로 조절하거나 또는 Sirtuin 1(SIRT1) 단백질의 발현을 효과적으로 조절한다. 한 구체예에서, 동물에서 Sirtuin 1(SIRT1)의 활성 또는 발현은 기준과 비교하여 약 10% 저해된다. 바람직하게는, 동물에서 Sirtuin 1(SIRT1)의 활성 또는 발현은 약 30% 저해된다. 더욱 바람직하게는, 동물에서 Sirtuin 1(SIRT1)의 활성 또는 발현은 약 50% 또는 그 이상으로 저해된다. 따라서, 올리고머 화합물은 Sirtuin 1(SIRT1) mRNA의 발현을 기준과 비교하였을 때 최소한 10%, 최소한 50%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 조절한다.
한 구체예에서, 동물에서 Sirtuin 1(SIRT1)의 활성 또는 발현은 기준과 비교하였을 때 약 10% 증가된다. 동물에서 Sirtuin 1(SIRT1)의 활성 또는 발현은 기준과 비교하였을 때 약 30% 증가된다. 더욱 바람직하게는, 동물에서 Sirtuin 1(SIRT1)의 활성 또는 발현은 기준과 비교하였을 때 약 50% 또는 그 이상 증가된다. 따라서, 올리고머 화합물은 Sirtuin 1(SIRT1) mRNA의 발현을 기준과 비교하였을 때, 최소한 10%, 최소한 50%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 조절한다.
예를 들면, Sirtuin 1(SIRT1)의 발현 환원은 혈청, 혈액, 지방 조직, 간 또는 임의의 기타 체액, 동물의 조직 또는 기관에서 측정될 수 있다. 바람직하게는, 분석될 체액, 조직 또는 기관에 포함된 세포는 Sirtuin 1(SIRT1) 펩티드를 인코드하는 핵산 분자 및/또는 Sirtuin 1(SIRT1) 단백질 자체를 포함한다.
본 발명의 화합물들은 적절한 약리학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어에 효과량의 화합물을 첨가하여 약학 조성물로 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물의 용도 및 방법은 예방학적으로 유용하다.
콘쥬게이트( Conjugates )
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 취입을 강화시키는 하나 이상의 모이어티 또는 콘쥬게이트에 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 연결시키는 것을 포함한다. 이와 같은 모이어티 또는 콘쥬게이트는 1차 또는 2차 하이드록시기와 같은 기능기에 공유적으로 결합된 콘쥬게이트기를 포함한다. 본 발명의 콘쥬게이트기는 삽입자, 리포터 분자들, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약력학 성질을 강화시키는 기, 그리고 올리고머의 약동학 성질을 강화시키는 기를 포함한다. 일반적인 콘쥬게이트기는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 바이오틴, 페나진, 폴레이트, 페탄트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다. 본 발명의 내용에서 올리고머의 약력학 성질을 강화시키는 기는 취입을 개선시키고, 분해에 저항성을 강화시키고, 및/또는 표적 핵산과 서열 특이적 하이브리드를 강화시키는 기들을 포함한다. 본 발명의 내용에서 올리고머의 약동학 성질을 강화시키는 기는 본 발명의 화합물의 취입, 분포, 대사 또는 배출을 개선시키는 기들을 포함한다. 대표적인 콘쥬게이트 기는 국제 특허 출원 PCT/US92/09196 (1992년 10월 23일 출원) 및 U.S. 특허 제6,287,860호에서 설명되며, 참고문헌에 통합된다. 콘쥬게이트 모이어티는 콜레스테롤 모이어티, 콜린산, 티오에테르, 가령, 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 가령, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질 가령, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜, 쇄 또는 마다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티와 같은 지질 모이어티를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 활성 약물 물질, 예를 들면, 아스피린, 와르파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카르프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리요호드벤조산, 풀루페나민산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 술파 약물, 당뇨병치료제, 항균제 또는 항생제에 콘쥬게이트될 수도 있다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 U.S. 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
제제( Formulations )
본 발명의 화합물은 다른 분자들, 화합물의 분자 구조 또는 혼합물, 예를 들면, 리포좀, 수용체-표적화된 분자들, 흡수(uptake), 분포 및/또는 흡수를 지원하는 경구, 직장, 국소 또는 기타 제제와 혼합, 포집, 콘쥬게이트 또는 연합될 수 있다. 취입, 분포 및/또는 흡수-지원 제제를 만드는 방법을 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: U.S. 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,165호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 5,580,575호; 및 5,595,756호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
비록 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 발현 및/또는 기능을 조절하기 위하여 벡터로 투여할 필요는 없지만, 본 발명의 구체예는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 발현을 위한 발현 벡터 구조체에 관계하는데, 이 벡터 구조체는 프로모터, 하이브리드 프로모터 유전자 서열들를 포함하며, 그리고 강력한 구성 프로모터 활성 프로모터 활성 또는 원하는 경우 유도될 수 있는 프로모터 활성을 보유한다.
구체예에서, 본 발명은 적절한 핵산 운반 시스템와 함께 전술한 안티센스 올리고뉴클레오티드중 최소한 하나를 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 이 시스템은 폴리뉴클레오티드에 작용가능하도록 링크된 비-바이러스 벡터를 포함한다. 이와 같은 비-바이러스 벡터의 예는 올리고뉴클레오티드 만을 포함하거나(가령 서열 번호: 6 내지 47 중 임의의 하나 이상) 또는 적합한 단백질, 폴리사카라이드 또는 지질 제제와 복합된 것을 포함한다.
추가로 적합한 핵산 운반 시스템은 바이러스 벡터를 포함하는데, 일반적으로 아데노바이러스, 아데노바이러스-연합된 바이러스(AAV), 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 Japan-리포좀 (HVJ) 복합체의 헤마글루티닌 바이러스중 최소한 하나로부터 서열을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드에 작용가능하도록 링크된 강력한 진핵 프로모터 가령, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 포함한다.
추가적으로 바람직한 벡터는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 콘쥬게이트를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 및 HIV-계 바이러스를 포함한다. 한 가지 바람직한 HIV-계 바이러스 벡터는 최소한 두 개 벡터를 포함하는데, gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈의 것이며, env 유전자는 또 다른 바이러스에서 유래된 것이다. DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 이들 벡터들은 오소폭스(orthopox) 또는 아비폭스(avipox) 벡터와 같은 폭스 벡터, 허피스바이러스 벡터 예를 들면, 허피스 심플렉스 I 바이러스(HSV) 벡터[Geller , A.I. et al ., (1995) J. Neurochem, 64: 487; Lim , F., et al ., in DNA Cloning : Mammalian Systems , D. Glover , Ed . (Oxford Univ . Press , Oxford England ) (1995); Geller , A.I. et al ., (1993) Proc Natl . Acad . Sci.: U.S.A.:90 7603; Geller , A.I., et al ., (1990) Proc Natl . Acad . Sci USA : 87:1149], Adenovirus Vectors [ LeGal LaSalle et al ., Science , 259:988 (1993); Davidson , et al ., (1993) Nat. Genet . 3: 219 ; Yang , et al ., (1995) J. Virol . 69: 2004 ] 및 아데노-연합된 바이러스 벡터[Kaplitt , M.G., et al ., (1994) Nat . Genet . 8:148]를 포함한다.
본 발명의 안티센스 화합물은 임의의 약리학적으로 수용가능한 염, 에스테르 도는 이와 같은 에스테르의 염, 또는 인간을 포함하는 동물에게 투여시 생물학적 활성 대사물질 또는 이의 잔기를 직간접적으로 제공할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함한다.
용어 "약리학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적 그리고 약리학적으로 허용가능한 염을 지칭하는데, 가령, 부모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하지만, 화합물에 바람직하지 못한 독성 효과를 부여하지 않는 염을 말한다. 올리고뉴클레오티드의 경우, 약리학적으로 허용가능한 염의 바람직한 예시 및 이의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다.
본 발명은 본 발명의 안티센스 화합물을 포함하는 약학 조성물 및 제제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 그리고 치료될 부위에 따라 여러 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(눈, 질 및 직장 운반을 포함하는 점막 포함), 네블리라이즈를 포함하여 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 들여마시는 것을 통하여 폐; 기관내(intratracheal), 비강, 상피 또는 경피, 구강 또는 장관외가 될 수 있다. 장관외(Parenteral) 투여는 정맥, 동맥내, 피하, 복막 또는 근육 주사 또는 주입; 또는 두개내(intracranial), 가령, 수막강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다. 최소한 하나의 2'-O-메톡시에틸 변형을 가진 올리고뉴클레오티드는 경구 투여용으로 특히 유용한다. 국소 투여를 위한 약학 조성물 및 제제는 경피 패취, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약, 스프레이, 액상 및 분말을 포함한다. 통상적인 약리학적으로 캐리어, 수용성, 분말 또는 오일 베이스, 농후제 그리고 이와 유사한 것이 필수적이거나 바람직할 수 있다. 피복된 콘돔, 장갑 그리고 이와 유사한 것이 유용할 수 있다.
본 발명의 약학 제제는 통상적으로 단위 약형으로 제공될 수 있는데, 이는 약학 산업분야에 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 이와 같은 기술은 활성 성분들을 약학적 캐리어 또는 부형제와 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분들을 액상 캐리어 또는 미세하게 분할된 캐리어 또는 이들 모두와 연합되도록 하고, 그 다음 필요에 따라 산물의 모양을 만들어 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌약 및 관장제를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 가능한 약형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 액상, 비-액상 또는 혼합형 매질에 현탁액으로 조제될 수 있다. 수용성 현탁액은 카르복시메틸셀룰로오즈, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 용액, 에멸젼, 리포좀-함유 조제물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물 및 제제는 하나 이상의 침투 강화제, 캐리어, 부형제 또는 기타 활성 또는 비활성 성분을 포함할 수 있다.
에멸젼은 일반적으로 액체에 0.1 μm를 초과하는 방울의 형태로 분산된 또 다른 액체로 구성된 이종(heterogeneous) 시스템이다. 에멸젼은 분산된 상에 추가하여 추가 성분, 그리고 수용성 상, 오일상 또는 별도의 상에 용액으로 존재하는 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예로 마이크로에멸젼이 포함된다. 에멸젼 및 이의 용도는 당분야에 공지되어 있으며, U.S. 특허 제6,287,860호에서 추가 설명된다.
본 발명의 제제는 리포좀 제제를 포함한다. 본 발명에 이용된 것과 같이, 용어 "리포좀"은 구형 이중층 또는 이중층에 배열된 양쪽성 지질로 구성된 소포를 말한다. 리포좀은 단층라멜라 또는 다층라멜라로 친지성 물질로 형성된 막과 운반될 조성물을 포함하는 수용성 내부를 가진다. 양이온성 리포좀은 안정한 복합체를 형성하기 위하여 음전하를 띈 DNA 분자들과 상호작용하는 것으로 보이는 양전하를 띈 리포좀이다. pH-민감성 또는 음전하를 띈 리포좀은 복합체보다는 DNA를 포집하는 것으로 간주된다. 양이온성 및 비-양이온성 리포좀은 세포로 DNA을 운반하는데 이용된다.
리포좀은 또한 “공간적으로 안정화된” 리포좀을 포함하는데, 여기에서 사용된 이 용어는 하나 이상의 특화된 지질을 포함하는 리포좀을 말한다. 리포좀에 통합되었을 때, 이와 같은 특화된 지질은 이와 같은 특화된 지질이 없는 리포좀과 비교하였을 때 순환 반감기가 강화된 리포좀을 만든다. 공간적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀의 소포-형성된 지질 부분이 하나 이상의 글리코리피드를 포함하거나 또는 하나 이상의 친지성 폴리머, 가령, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티로 유도화된 것들이다. 리포좀 및 이의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 설명되고 있다.
본 발명의 약학 제제 및 조성물은 계면활성제 또한 포함할 수 있다. 약물, 제제 및 에멸젼에서 계면활성제의 이용은 당분야에 잘 공지되어 있다. 계면활성제 및 이의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다.
한 구체예에서, 본 발명은 핵산, 특히 올리고뉴클레오티드의 효과적인 운반을 위하여 다양한 침투 강화제를 이용한다. 세포 막을 가로질러 비-친지성 약물의 융합을 지원하는 것에 추가하여, 침투 강화제는 또한 친지성 약물의 침투성을 강화시킨다. 침투 강화제는 계면활성제, 지방산, 담즙산, 킬레이트제 그리고 비-킬레이트 비-계면활성제로 된 5가지 넓은 범주중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 침투 강화제 및 이의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다.
당업자는 제제는 투여 경로와 같은 이들의 의도된 용도에 따라 통상적으로 기획된다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드와 국소 운반제가 혼합된 국소 투여용 바람직한 제제가 포함되는데, 국소 운반제는 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제등이 된다. 바람직한 지질 및 리포좀은 중성(가령, 디올레일-포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성(가령, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온(가령, 디올레일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레일-포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다.
국소 또는 기타 투여용으로, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 리포좀내에 포집되거나 양이온 리포좀에 복합체를 형성할 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드는 지질, 특히, 양이온 지질에 복합될 수 있다. 바람직한 지방산 및 에스테르, 이의 약리학적으로 허용가능한 염 그리고 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되어 있다.
경구 투여용 조성물 및 제제는 분말 또는 과립, 미립자, 나노입자, 물 또는 비-수용성 매질에서의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사셋, 태블릿 도는 미니테블릿을 포함한다. 농후제, 향료, 희석제, 에멸젼화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 바람직한 경구 제제는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 침투 강화제, 계면활성제 및 킬레이터와 함께 투여되는 것들이다. 바람직한 계면활성제는 지방산 및/또는 이의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 이의 염을 포함한다. 바람직한 담즙산/염 그리고 지방산 및 이의 용도들은 U.S. 특허 제 6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다. 침투 강화제, 예를 들면, 지방산/염과 담즙산/염의 복합 또한 바람직하다. 특히 바람직한 조합은 라우르산, 카프리산 및 UDCA의 나트륨염이다. 추가 침투 강화제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 분무된 건조 과립을 포함하는 과립형으로 경구로 운반될 수 있고, 또는 미립자 또는 나노입자를 형성하기 위하여 복합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 복합제 및 이의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에 추가 설명되어 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다.
장관외, 기관내 또는 심실내 투여를 위한 조성물 및 제제는 완충액, 희석액 및 기타 적합한 첨가제(침투 강화제, 캐리어 화합물 및 기타 약리학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하나 이에 한정되지 않음)을 포함하는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예는 하나 이상의 올리고머 화합물 및 항-안티센스 기전에 의해 기능을 하는 하나 이상의 다른 치료제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이와같은 화학요법제의 예로는 다우노루비신, 다우노마이신, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 에소루비신, 블레오마이신, 마포스파미드, 이포스파미드, 시토신 아라비노시드, 비스클로로에틸-니트로조우레아, 부술판, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 프레드니손, 하이드록시프로게스테론, 테스토스테론, 탐옥시펜, 다카르바진, 프로카르바진, 헥사메틸멜라민, 펜타메틸멜라민, 미토산트론, 암사크린, 클로람부칠, 메틸사이클로헥실니트로조우레아, 질소 무스타드, 멜파란, 사이클로포스파미드, 6-멀캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-아자시티딘, 하이드록시우레아, 데옥시코포르미신, 4-하이드록시퍼옥시사이클로-포스포라미드, 5-플루오르우라실 (5-FU), 5-플루오르데옥시우리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜치신, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드(VP-16), 트리메트레세이트, 이리노테칸, 포토테칸, 겜시타빈, 테니포시드, 시스플라틴 및 디에틸스틸베스트롤(DES)과 같은 암 화학치료 약물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 화합물과 함께 이용되면, 이와 같은 화학요법제는 개별적으로 (가령, 5-FU 및 올리고뉴클레오티드), 연속적으로(가령, 일정 시간동안 5-FU 및 올리고뉴클레오티드, 그 다음 MTX 및 올리고뉴클레오티드), 또는 하나 이상의 다른 화학요법제(가령, 5-FU, MTX 및 올리고뉴클레오티드, 또는 5-FU, 방사능요법 및 올리고뉴클레오티드)와 병용하여 이용될 수 있다. 비-스테로이드성 소염제를 포함하나 이에 한정되지 않는 소염제 약물 그리고 코르티코스테로이드, 항바이러스 약물(리비비린, 비다라빈, 아시클로비르 및 강시클로비르를 포함하나 이에 한정되지 않는)이 본 발명의 조성물에 복합될 수 있다. 안티센스 화합물 및 다른 비-안티센스 약물의 복합 또한 본 발명의 범위안에 있다. 두 개 이상의 복합 화합물이 함께 또는 연속적으로 이용될 수 있다.
다른 관련된 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 제1핵산을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드 그리고 제 2 핵산 표적을 표적으로 하는 하나 이상의 추가 안티센스 화합물을 포함한다. 예를 들면, 제1 표적은 Sirtuin 1(SIRT1)의 특정 안티센스 서열이 되며, 그리고 제 2 표적은 또 다른 뉴클레오티드 서열의 구역이 될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 조성물은 동일한 Sirtuin 1(SIRT1)핵산 표적의 상이한 구역을 표적으로 하는 두 개이상의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 다양한 안티센스 화합물의 예들이 여기에서 설명되며, 기타 화합물들은 당분야에 공지된 적합한 화합물들 중에서 선택될 수 있다. 두 개 이상의 복합 화합물이 함께 또는 연속적으로 이용될 수 있다.
약액주입 ( Dosing ):
치료 조성물의 제제 및 이의 후속적인 투여(약액주입)은 당분야의 기술에 속한다. 약액주입은 수 일 내지 수개월 지속되는 치료 과정, 또는 치료 효과 또는 질병 상태의 감소가 수득되는 날까지의 치료 과정과 함께 치료될 질병 상태의 중증도, 반응성에 따라 달라진다. 최적의 약액주입 일정은 환자의 신체에 약물 축적 측량으로부터 계산될 수 있다. 당업자는 최적의 주입량, 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다. 최적의 약량은 개별 올리고뉴클레오티드의 상대적 효능에 따라 다양해질 수 있으며, 그리고 일반적으로 시험관 및 생체내 동물 모델에서 효과가 발견되는 EC50에 근거하여 예측된다. 일반적으로, 투약량은 체중 kg당 0.01㎍ 내지 100 g이 되며, 매일, 주단위, 월단위 또는 년단위로 한번 또는 2년마다 내지 20년마다 한번씩 제공될 수 있다. 당업자는 측정된 잔류 시간 및 체액 또는 조직에서 약물의 농도에 근거하여 약액주입에 대한 반복률을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 성공적인 처치후, 질병 상태의 재발을 방지하기 위하여 환자가 유지요법을 받도록 하는 것이 바람직하며, 이때 올리고뉴클레오티드는 체중 kg당 0.01 ㎍ 내지 100 g 범위의 유지 약량으로, 하루에 1회 이상 내지 매 20년마다 1회로 투여된다.
본 발명의 다양한 구체예들이 상기에서 설명되었는데, 이는 예를 든 것이며, 이에 한정되지 않음을 인지해야 한다. 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고, 본 발명의 내용에 따라 설명된 구체예에 대해 여러 변화가 만들어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 설명된 임의의 구체예에 한정되어서는 안된다.
여기에서 언급된 모든 문헌들은 참고문헌에 통합된다. 본 출원에서 언급된 모든 공고 및 특허 문헌은 각 공개 또는 특허 문헌이 개별적으로 언급된 것과 같은 수준으로 모든 목적을 위하여 참고문헌에 통합된다. 본 서류에 다양한 참고문헌에서, 출원인은 이들을 본 발명의 “선행 기술”로 인정하지 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법의 구체예는 다음의 실시예에서 설명된다.
실시예
다음의 비-제한적 실시예는 본 발명의 선택된 구체예들을 설명하는 것이다. 나타낸 성분들에서 비율의 변화 및 대체 성분은 당업자에 자명하며, 본 발명의 구체예의 범위내에 있다.
실시예 1:
Sirtuin 1( SIRT1 ) 폴리뉴클레오티드의 핵산 분자 안티센스 및/또는 센스 가닥에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 기획
상기에서 명시된 것과 같이, 용어 "~특이적인 올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드 표적"은 (i) 표적 유전자의 부분과 안정적인 복합체를 형성할 수 있는, 또는 (ii) 표적 유전자의 mRNA 전사체의 일부분과 안정적인 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 말한다.
적절한 올리고뉴클레오티드의 선택은 핵산 서열들을 자동으로 배열하고, 동일 또는 동사체 구열을 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 실사한다. 이와 같은 프로그램을 이용하여 GenBank와 같은 데이터베이스를 조사하거나 또는 PCR 산물들을 서열화하여 수득된 핵산 서열들을 비교한다. 특정 종 범위로부터 핵산 서열을 비교하면, 종간에 적절한 동일성 수준을 나타내는 핵산을 선택할 수 있다. 유전자사 서열화안된 경우, 서든 블랏을 실시하여 표적 종과 다른 종의 유전자 사이에 동일성 수준을 결정한다. 다양한 엄격성 수준에서 서든 블랏을 실시함으로써, 당분야에 공지된 바와 같이, 적절한 동일성 수준을 얻을 수 있다. 이 과정에 의해 조절되어야 할 개체에서 표적 핵산 서열에 대해서는 높은 수준의 상보성을 나타내고, 그리고 다른 종의 대응하는 핵산 서열들에 대해서는 낮은 수준의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오티드의 선택이 허용된다. 당업자는 본 발명에 사용하기 위한 유전자의 적절한 구역을 선택하는 것에 상당한 허용범위가 있다는 것을 인지할 것이다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 화합물이 결합하여, 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 기능 및/또는 활성이 조절되어 “특이적으로 하이브리드가능하며”, 그리고 특이적 결합이 바람직한 조건들, 가령, 생체 분석 또는 치료요법적 처치의 경우 생리학적 조건, 또는 분석이 시험관 분석으로 실행되는 경우의 조건하에서 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있도록 충분한 수준의 상보성이 있다.
여기에서 설명된 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화 성질은 당분야에 공지된 하나 이상의 시험관 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 여기에서 설명된 올리고뉴클레오티드의 성질은 용융 곡선 분석(Melting curve assay)을 이용하여 표적 천연 안티센스와 잠재적인 약물 분자들 사이에 결합 강도를 측정함으로써 수득될 수 있다.
표적 천연 안티센스와 잠재적인 약물 분자(Molecule) 사이에 결합 강도는 용융 곡선 분석과 같은 분자간 상호작용의 강도를 측정하는 확립된 방법중 임의의 것을 이용하여 예측될 수 있다.
용융 곡선 분석은 천연 안티센스/분자 복합체에서 이중 가닥으로부터 단일 가닥 형태로 신속하게 전이가 일어나는 온도를 결정한다. 이 온도는 두 개 분자 사이에 상호작용 강도의 신뢰성있는 척도로 광범위하게 인정된다.
용융 곡선 분석은 실제 천연 안티센스 RNA 분자 또는 분자의 결합 부위에 상응하는 합성 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 cDNA 복사체를 이용하여 실시된다. 이 분석을 실행하기 위하여 모든 필수 시약을 포함하는 다중 키트를 이용한다(가령 Applied Biosystems Inc . MeltDoctor kit). 이들 키트들은 이중 가닥 DNA (dsDNA) 결합 염료 (가령, ABI HRM 염료, SYBR Green, SYTO, 등) 중 하나를 포함하는 적절한 완충액을 포함한다. dsDNA 염료의 성질은 이들이 자유형에서는 형광을 방출하지 않지만, dsDNA에 결합되면 상당한 형광성이라는 것이다.
이 분석을 실행하기 위하여, cDNA 또는 대응하는 올리고뉴클레오티드를 특정 제조업자의 프로토콜에 명시된 농도에서 분자와 혼합시킨다. 혼합물을 95℃로 가열시켜, 모든 미리-형성된 dsDNA 복합체를 해리시키고, 그 다음 실온으로 서서히 냉각시키거나 또는 키트 제조업자가 정한 다른 낮은 온도로 냉각시켜, DNA 분자들이 어닐(anneal)되도록 한다. 새로 형성된 복합체를 다시 95℃ 가열시키고, 반응에 의해 생성된 형광물질의 양에 대한 데이터를 동시에 수집한다. 형광 강도는 반응에 존재하는 dsDNA의 양에 역비례한다. 키트에 사용가능한 실시간 PCR 장비(가령 ABI’s StepOne Plus 실시간 PCR 시스템 또는 LightTyper instrument, Roche Diagnostics, Lewes, UK)를 이용하여 데이터를 수거할 수 있다.
적합한 소프트웨어(예를 들면, LightTyper (Roche) 또는 SDS Dissociation Curve, ABI)를 이용하여 온도(x-축)에 대해 온도에 따른 형광물질의 네가티브 유도체를 플롯팅하여(y축상에 -d(Fluorescence)/dT) 용융 피크를 만든다. dsDNA 복합체에서 단일 가닥 분자들로의 신속한 전이 온도를 확인하기 위하여 데이터를 분석한다. 이 온도를 Tm 이라고 하며, 두 분자간의 상호작용 강도에 직접적으로 비례한다. 일반적으로, Tm은 40℃를 넘는다.
실시예 2: SIRT1 폴리뉴클레오티드의 조절
재료 및 방법:
세포를 다음중 하나의 방법으로 처리하였다:
방법 1: HepG2 세포를 네이키드 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리:
ATCC (cat# HB-8065)의 HepG2 세포를 37℃, 5% CO2에서 성장 배지(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 0.5×105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 성장 배지 1.5 ㎖/well로 대체하였다.
모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 물에 희석시켰다. 이 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 혼합시키고, HepG2 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 72시간 후, 세포에 상기에서 설명한 것과 같이 재투여하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 두 번째 투여후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation 시스템(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assasy: Hs00202021_m1, Applied Biosystems Inc., Foster City CA)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, StepOne Plus 실시간 PCR Machine(Applied Biosystems)을 이용하여 [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회. 처리된 샘플과 위장-처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
결과:
실시간 PCR 결과에서, HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA 수준은 SIRT1 안티센스 CV396200에대한 일부 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 48시간에 상당히 증가되었다는 것을 보여준다(도 2, 3a).
실시간 PCR 결과에서, HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA 수준은 SIRT1 안티센스 CV396200에 대해 기획된 한 개의 안티센스 올리고뉴클레오티드에서 상당히 증가되었다는 것을 보여준다. CUR-1230, CUR-1231, CUR-1232 및 CUR-1230으로 나타낸 막대는 서열 번호: 32-35에 대응한다.(도 6)
실시간 PCR 결과에서, HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA 수준은 SIRT1 안티센스 CV428275에 대해 기획된 두 개의 안티센스 올리고뉴클레오티드에서 상당히 증가되었다는 것을 보여준다. CUR-1302, CUR-1304, CUR-1303 및 CUR-1305으로 나타낸 막대는 서열 번호: 36-39에 대응한다.(도 7)
결과에서, SIRT 안티센스 BE717453에 대해 기획된 올리고뉴클레오티드중 하나로 치료한 후 48시간 후 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA 수준이 상당히 증가되었음을 볼 수 있다. CUR-1264, CUR1265 및 CUR-1266으로 나타낸 막대는 서열 번호: 40-42에 대응한다.(도 8)
결과에서, SIRT 안티센스 AV718812에 대해 기획된 세 개의 올리고뉴클레오티드로 치료한 후 48시간 후 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA 수준이 상당히 증가되었음을 볼 수 있다. CUR-1294, CUR-1297, CUR-1295, CUR-1296 및 CUR-1298으로 나타낸 막대는 차례로 서열 번호: 43-47에 대응한다.(도 9)
Vero76 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리:
Vero76 세포[ATCC (cat# CRL-1587)]를 37℃, 5% CO2에서 (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI)에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 1.5×105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 성장배지로 대체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 물로 희석시켰다. 이 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 혼합시키고, Vero76 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation 시스템(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다.
600 ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_ml, Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여 [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회. 처리된 샘플과 위장-처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
결과:
실시간 PCR 결과에서, Vero 세포에서 SIRT1 mRNA 수준은 SIRT1 안티센스 CV396200에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 48시간에 상당히 증가되었다는 것을 보여준다(도 3b).
실시예 3: SIRT1 유전자 발현 조절
재료 및 방법
네이키드 안티센스 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포 처리
ATCC (cat# HB8065)의 HepG2 세포를 성장 배지 (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, or Mediatech cat # MT10010CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35 011CV) + 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30002CI))에서, 37℃ 및 5% CO2에서 성장시켰다. 실험 하루 전, 세포를 6개 웰 플레이트상에 0.5 × 105/ml의 밀도로 재도말시키고, 37℃ 및 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트의 배지를 웰당 1.5㎖의 새로운 성장 배지로 교체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드는 20 μM의 농도가 되도록 물로 희석하였다. 이 용액 2 μl를 400 μl의 OptiMEM media (Gibco cat#31985070) 및 4 ul의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 항온처리하였고, 6개의 플레이트의 각 웰에 HepG2 세포와 함께 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사한 용액을 이용하여 허위 형질감염된 기준에 이용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 3-18시간 항온처리 후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 추가후 72시간 시점에 상기에서 설명된 것과 같이 세포에 재투여하였다. 두 번째 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여후 48시간 시점에서 배지를 제거하고, 제조업자의 지시에 따라 SV Total RNA Isolation System from Promega (cat # Z3105) 또는 RNeasy Total RNA Isolation kit from Qiagen (cat# 74181)을 이용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다.
600 ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_ml, Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여 [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회. 처리된 샘플과 위장-처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
엑손 4에 대한 주문에 의해 기획된 Taqman 분석용 프라이머와 프로브:
SIRT1 mRNA 천연 안티센스 CV396200의AACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCA (서열 번호: 48)
Forward Primer Seq. CCATCAGACGACATCCCTTAACAAA (서열 번호: 49)
Reverse Primer Seq. ACATTATATCATAGCTCCTAAAGGAGATGCA (서열 번호: 50)
Reporter Seq. CAGAGTTTCAATTCCC (서열 번호: 51)
결과:
결과에서, HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA 수준은 sirtas에 대한 한 개의 siRNA 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 48시간에 상당히 증가되었다는 것을 보여준다(sirtas_5, P=0.01). 동일한 시료에서, sirtas_5으로 처리한 후 sirtas RNA의 수준이 상당히 증가되었지만, sirtas_6 및 sirtas_7으로 처리한 후에는 변화가 없었고, 또한 SIRT1 mRNA 수준에 영향을 주지 못하였다(도 1b). sirtas_5, sirtas_6 및 sirtas_7은 차례로 서열 번호: 29, 30 및 31에 대응한다.
원숭이의 일차 간세포의 처리.
RxGen Inc에 의해 배양물로 원숭이 일차 간세포를 배양물에 도입하였고, 6개 웰 플레이트에 도말하였다. 이 세포들은 다음과 같이 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 6개 웰 플레이트의 배지를 5% FBS, 50 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 4㎍/㎖ 인슐린, 1 uM 덱사메타손, 10 ug/㎖ Fungin (InVivogen, San Diego CA)이 보충된 William의 Medium E (Sigma cat#W4128)로 구성된 새로 준비된 성장 배지로 교환하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 혼합시키고, 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation 시스템(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00978340_ml 모두 Applied Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, Mx4000 thermal cycler (Stratagene)을 이용하여 [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회. 처리된 샘플과 위장-처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
결과:
결과는 도 5에 나타낸다. 실시간 PCR 결과에서 SIRT1 안티센스에 대한 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 SIRT1 mRNA 수준이 증가되었음을 보여준다.
실시예 4: 아프리카 사바나 원숭이(African Green Monkey)에서 CUR -963의 작용 연구의 효과 및 지속 기간
본 연구의 목적은 인간이 아닌 영장류 모델에서 정맥 투여후 SIRT1 유전자를 조절하는 부조화 넌코딩 안티센스 서열의 안티센스 녹다운 효과를 평가하고 비교하는 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 SIRT1 조절 서열들을 억제하도록 기획된 안티센스 올리고뉴클레오티드 테스트 물질을 CUR-963으로 지정하였다.
CUR 963: +G*+T*C*T*G*A*T*G*G*+A*+G*+A (서열 번호: 25).
CUR 962 (기준): +G*+C*T*A*G*T*C*T*G*+T*+T*+G (서열 번호: 52).
조절 테스트 지침( REGULATORY TEST GUIDELINES )
본 연구는 용인된 독성 원리에 따라 기획되었으며, International Conference of Harmonization (ICH) Harmonized Tripartite Guidelines (약학 ICH M3(m)의 인간의 임상 시험 실행을 위한 비-임상적 안정성 연구, 2000 November 9)을 준수하고, 그리고 전반적으로 치료제의 테스트를 위한 일반적으로 용인된 과정을 준수하였다.
테스트 및 기준 물질
테스트 물질 확인 및 준비
테스트 물질, CUR-963은 화학적으로 안정화된 안티센스 올리고뉴클레오티드다. 정맥 운반용 비이클은 인산염-완충된 염(PBS)이다.
비이클 특징
PBS 비이클용으로, 공급업자로부터 조성물, 배치 번호(batch number), 유효 기한, 및 저장 조건(온도 및 명암)을 얻었다.
테스트 물질 보관 및 취급
테스트 물질 및 비이클은 공급업자 및 제조업자가 제공하는 용인된 보관 조건에 따라 보관되었다.
테스트 물질 제제의 분석
테스트 물질 제제의 샘플은 테스트 물질 제제의 농도, 안정성 및 균질성 분석을 위하여 냉동보관될 것이다.
테스트 시스템 원리
영장류는 잠재적 위험의 지표로써 적합한 비-설치류 종이며, 단속 당국에서 용인하고, 이용할 수 있는 광범위한 배경 데이터가 있다. 아프리카 사바나 원숭이는 특히 다양한 인간의 생리 및 질병 상태와 매우 임상적으로 관련된 모델이다.
정맥 투여 경로는 가능한 인간의 치료 경로에 상응한다. 테스트 물질의 약량은 아프리카 사바나 원숭이에서 기존에 실시된 유사한 화합물의 약량 발견 연구에 기초하였다.
아프리카 사바나 원숭이는 영장류중에서 테스트 물질의 표적 서열이 100% 유사성을 가지고 종간에 보존되었기 때문에 선택 영장류로 선택되었다. 추가적으로 테스트 물질은 합성 올리고뉴클레오티드다. 결과적으로 영장류에 약액주입으로 이들 화합물의 효과의 우수한 측정이 가능하고, 이는 다른 종보다는 인간에게서 볼 수 있는 취입을 더 반영할 것이다.
동물
종
클로로세부스 사베우스(Chlorocebus sabaeus), 인간이 아닌 영장류
품종
St. Kitts가 원산인 아프리카 사바나 원숭이.
출처
RxGen, Lower Bourryeau, St. Kitts, West Indies.
예상 나이
테스트 동물들은 모두 다자란 것들이다.
예상 체중
원숭이는 대략 3-4 kg 체중이 나간다. 실제 범위는 달라질 수 있지만, 데이터에 제공될 것이다.
성별
테스트 동물들은 모두 다자란 암컷이다.
동물의 숫자
연구에 등록하기에 적합한 8마리 동물을 확인하기 위하여 10마리를 스크리닝하였다.
연구에 사용된 숫자
암컷: 8 마리
연구에 사용된 수에 대한 정당화
본 연구는 가능한 적은 수의 동물을 이용하도록 기획되었으며, 이는 아프리카 사바나 원숭이에서 테스트 물질의 치료 효과를 평가하는 1차 목적에 부합되며, 그리고 이 종에서 본 올리고뉴클레오티드 타입의 전신 투여에 대한 기존 연구와도 부합된다.
동물 설명
연구에는 3~4kg의 체중을 가진 10마리 다자란 아프리카 사바나 원숭이가 이용되었다. 이 원숭이들은 섬에 거주하는 야생 집단으로부터 인도적으로 잡아들인 약물-경험이 없는(drug-na) 다자란 동물이다. 잡힌 동물에게 임의의 내장 기생충을 제거하기 위하여 기생충약을 먹이고, 연구 등록을 위하여 스크리닝하기전 최소 4주간 격리하여 관찰하였다. 잡힌 원숭이의 나이는 체격과 치아로 예측하였고, 연구에는 나이가 든 동물을 제외시켰다. 연구 등록전, 운동 및 손동작 기민성을 포함한 임상 검사를 각 원숭이에서 실시하였다. 혈액 샘플을 취하고, 전체적인 임상 화학 및 완전한 혈액 카운트 및 지질 프로파일을 위하여 Antech Diagnostics (Memphis, TN)로 보냈다(설명을 위하여 단락 9.2 및 319567928을 참고). St. Kitts 거주지에서 원숭이에 대해 확립된 정상 범위와 비교하여 비정상적인 lab 값을 가진 원숭이들은 연구에서 배제하였다. 이 기준에 만족하는 8마리 원숭이들을 확인하기 위하여, 10 마리 원숭이들을 스크리닝하였고, 필요에 따라 추가 동물을 스크리닝하였다. 연구 개시전, 선택된 원숭이들을 개별 우리로 보내, 1주일간 개별 우리에 적응시켰다. 실험에 적합한 것으로 간주되는 동물만을 연구에 등록시킬 것이다. 연구 시작시에 실제(또는 예상) 나이 및 체중 범위를 가공되지 않은 데이터 및 최종 보고서에 상세하게 기술할 것이다.
동물 건강 및 복지
동물 복지의 최대 기준은 St. Kitts 농림부(Department of Agriculture) 및 U.S. 보건복지부(Department of Health and Human Services)에서 규정하는 지침에 따랐다. 모든 연구들은 실험실 동물의 관리 및 보호를 위한 요건 및 모든 적용가능한 실행 지침에 따라 실시될 것이다. 수의학적 관리, 수술에 대한 모든 적용가능한 기준과, 동물 관리 및 이용에 관하여 NIH 지침에 포함된 것을 검토한다. St. Kitts 설비는 프로토콜을 점검하고 지침이 요구하는 것과 같이 설비를 감독하는 동물 연구 위원회를 유지한다. 재단은 지침 #A4384-01 (Axion Research Foundation/St. Kitts Biomedical Foundation)에서 요구하는 것과 같이, 실험동물복지국(Office of Laboratory Animal Welfare)에 제출된 승인보증을 가진다. 본 연구에서 명시된 연구에 의해 야기된 특별한 비-인간 영장류 수의학적 관리 문제 및 생물학적 위험 문제는 없다.
주거 및 환경
임의의 치료-관련된 임상적 징후를 탐지할 수 있도록, 외과술 전, 그리고 수술후부터 죽이기 전까지 동물들을 개별적으로 가두었다. 개별 우리가 위치하는 영장류 건물은 환경광에 의해 전체적으로 조명되며, U.S. D.H.H.S 지침에서 권장하는 바와 같이, 북위 약 17도에서 12시간-명암 주기에 근접하다. RxGen 영장류 건물은 외부로 완벽하게 공기가 통한다. 년간 St. Kitts의 전형적인 기온이 되는 23-25℃의 일정한 표적 온도를 유지하기 위하여 천정의 팬을 이용하여 추가적인 환기가 제공된다. 24시간 극한 온도 및 상대적 습도(조절안될 수 있을 것이다)를 매일 측정하였다. 연구 동안 우리는 정기적으로 청소되었다.
음식물 및 물
각 동물에게 원숭이 표준 임식물이 매일 약 90g 제공되었다(TekLad, Madison, WI). 음식물의 특정 영양 조성물은 기록되었다. 미생물 순도를 위하여 물을 주기적으로 분석하였다. 보관 음식물 및 물 공급원에서 오염물질의 수용가능한 수준에 대한 기준은 음식물 제조업자가 설정한 분석학적 명세서 및 주기적 설비의 물 평가 범위내에 있었다. 물은 인간이 마시기에 적합한 검정에 필요한 모든 기준을 충족하였다.
실험안
동물 확인 및 무작위화
체중 및 혈장 콜레스테롤 프로파일에 기초하여 계층화 무작위 배정 수단을 이용하여 배치하였다. 그룹으로 배정 전후, 각 동물의 배에 문신으로 표시하였다. 문신은 일반적인 건강 관찰 과정에서 식별 수단으로 모든 거주 동물에 실시한다. 가둔 동물을 개별적으로 확인하기 위하여 우리 플랜(cage plan)을 작성하였고, 동물의 각 우리에 부착된 라벨 테그로 개별 원숭이들을 추가적으로 식별할 수 있다.
그룹 크기, 약량 및 식별 번호
동물들을 2개 치료군으로 할당하였고, 각 군에는 4마리 동물이 포함된다. 시설의 넘버링 체계에 따라, 특정 동물 식별 번호가 각 원숭이에게 제공된다. 이 시스템은 각 원숭이에게 처음 문자와 그 다음 세 자리 숫자를 부여하는 가령, Y032에 의해 독특하게 각 원숭이를 구별한다.
투여 경로 및 빈도
동물에게 10분에 걸쳐 수동 주입에 의해 정맥으로 1일, 3일, 5일에 매일 1회 투여하였다. 주입 속도는 24 mL/kg/h이다. 약액 주입 과정 전과 주입동안 케타민 및 실라진으로 동물을 진정시켰다. 정맥 카테테르(Terumo 미니 정맥 주입 세트, 20 가우지 바늘, 또는 유사한 적합한 주입 세트)를 복재동맥(saphenous vein)으로 삽입하였다. 각 원숭이에게 약액주입은 동물이 깨어난 직후 음식을 먹기전 오전 8:00 내지 10:00 사이에 실시된다. Blood Chemistry 부분에서 설명되어 있는 것과 같이, 혈장 콜레스테롤 및 기타 지질 수준을 평가하기 위한 혈액 샘플을 각 주입직전에 수거하였다. 콜레스테롤 측정에서 음식물의 영향을 최소화시키기 위하여 두 가지 샘플링 간격에서 채혈을 음식물 섭취 전에 실시한다.
임상적 관찰
치료에 대한 모든 시각적인 반응 징후를 약액 주입일에 기록하였다. 또한, 외양 및 전반적인 상태와 같은 물리적인 특징에 대해 매주 최소 한 번씩 검사하였다.
체중
치료하는 동안 그리고 치료후 기간 동안 주단위로 체중을 기록하였다.
음식 소비
개별적인 음식 소비는 정량화하지 않았다. 그러나, 소비 패턴을 모니터하였고, 임의의 변화가 있을 경우 기록하였다.
사망률 및 질병률(Mortality and Morbidity)
사망률 및 질병률을 기록할 것이다. 가능다면, 연구 책임자의 스폰서의 모니터 요원들과 상담을 한 후 조기 희생(죽임)에 대한 임의의 결정을 내릴 것이다. 조기에 죽었거나 죽여야 하는 동물은 조직병리학을 위한 부검용으로 간, 신장, 심장, 그리고 비장, 폐 조직을 수거할 것이다. 조기 희생의 경우, 채혈(가능하다면)하여, 매개변수들을 측정할 것이다. 정규적인 작업 시간 후 죽은 것으로 발견되는 동물들은 하룻밤 냉동하여, 그 다음 작업일에 부검을 실시하였다. 동물의 상태가 조기에 희생시켜야 하는 경우라면, 펜토바르비탈 나트륨 과량을 정맥으로 제공하여 안락사시킬 것이다. 모든 연구는 동물 사용에 관한 규정(Principles for Use of Animals)에 의해 통제된다. RxGen은 영장류 설비에 대한 미국 보건복지부 표준에 따르도록 요구받았으며, 연구 동안 과정의 가혹함을 기록하는데, 보통, 반드시 준수와 같이 명시해야 한다.
임상적 실험실 연구
지방 생검
배꼽 아래 1cm 중앙 절개를 통하여 조직 추출에 의해 연구 26일 시점에 Y775를 제외한 모든 연구 원숭이들에게서 피하 지방 생검을 실시하였다. 생검은 2㎖의 RNAlater(Qiagen)을 포함하는 라벨된 크리오관에 즉시 담구고, 4℃에서 하룻밤동안 항온처리한 후, RNAlater를 흡입한 후, 샘플 튜브는 액화 질소에 급속 냉동시켰다. 액화 질소에서 수송한 후, 표적 유전자의 실시간 qPCR을 위하여 전체 RNA를 분리하였다.
결과:
실시간 PCR 결과에서, 시험관에서 SIRT1 mRNA 발현에 효과가 없었던 올리고뉴클레오티드 CUR962 (ApoA1 안티센스 DA327409에 대해 기획된, 데이터 없음)(서열 번호: 52)를 투여한 원숭이와 비교하여, SIRT1 안티센스 CV396200.1에 대해 기획된 올리고뉴클레오티드, CUR963이 투여된 원숭이의 지방 생검에서는 SIRT1 mRNA 수준이 증가되었다. mRNA 수준은 실시간 PCR에 의해 결정되었다 (도 4).
본 발명은 하나 이상의 실행에 대해 설명되고 묘사되었지만, 본 명세서 및 첨부된 도면을 이해하면 당업자는 동등한 변형 및 변화가 있을 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또한, 본 발명의 특정 성질들은 몇 가지 실행중 하나에 대해 설명되었지만, 이와 같은 성질이 다른 하나 이상의 성질과 복합될 수 있으며, 이는 임의의 주어진 또는 특정 부분에 바람직할 수 있다.
내용의 요약은 기술 내용을 신속하게 확인할 수 있도록 도와줄 것이다. 이는 다음의 청구범위의 범위 또는 영역을 이해하거나 범위를 한정하는데 이용되어서는 안될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CuRNA, Inc. Collard, Joseph Khorkova Sherman, Olga Coito, Carlos De Leon, Belinda <120> TREATMENT OF SIRTUIN 1 (SIRT1) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO SIRTUIN 1 <130> 37092-705601 <140> PCTUS0966445 <141> 2010-07-07 <150> PCT/US2009/066445 <151> 2009-12-02 <150> 61/157255 <151> 2009-03-04 <150> 61/259072 <151> 2009-11-06 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4107 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtcgagcggg agcagaggag gcgagggagg agggccagag aggcagttgg aagatggcgg 60 acgaggcggc cctcgccctt cagcccggcg gctccccctc ggcggcgggg gccgacaggg 120 aggccgcgtc gtcccccgcc ggggagccgc tccgcaagag gccgcggaga gatggtcccg 180 gcctcgagcg gagcccgggc gagcccggtg gggcggcccc agagcgtgag gtgccggcgg 240 cggccagggg ctgcccgggt gcggcggcgg cggcgctgtg gcgggaggcg gaggcagagg 300 cggcggcggc aggcggggag caagaggccc aggcgactgc ggcggctggg gaaggagaca 360 atgggccggg cctgcagggc ccatctcggg agccaccgct ggccgacaac ttgtacgacg 420 aagacgacga cgacgagggc gaggaggagg aagaggcggc ggcggcggcg attgggtacc 480 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429 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (373)..(373) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (400)..(400) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 cgacganaac ataagcactt ttaatttcct ctctattatg ctacagacaa ggccgaagac 60 tgggtttttt aggttgttta aggctgtaaa gaaaacaaag aacatatgac agagacccta 120 tgcagtctgc aaagcatact acatatttac taccaggccc taccttacta cagaaagttt 180 gctgatccag ctgtgaacat ataccccgat gcagatgaaa acaaatacaa aacaaaccta 240 acttgccatt ttggtcacaa gagcaagtaa gtagcagagc cctgttttga tatgaaaatc 300 cagcactgga ctgggcaaca tggcgagacc ccatctctac caaaaatact aaaaaaatag 360 ccgggcatgg tgnggcacat ctgtagtact agctacttgn gaggctgaga caggagaatc 420 atttgagcc 429 <210> 5 <211> 156 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cctgtatata cacacactat gcaatagtct taggtaacta attagctgca accctaaggt 60 agatcaaata gaaaatgtca agtcgccaca atcacatcat cttaattaat atggagggaa 120 ggtaggaatc tgttactctt cccaacacta agcttt 156 <210> 6 <211> 593 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (460)..(460) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (571)..(571) <223> n is a, c, g, or t <400> 6 tctcactgtc tcccaggctg gagcgcaatg gtgcaatctt ggctcgctgc aacctccaac 60 tcccaggttc aagtgattct cgtgcctcag cctcctgagt agctgggatt acaggcgcct 120 gccaccatgc ccggctaatt ttagtatttc tagtagagtt gggatttcac catgttggcc 180 aagctgttct cgaactcttg gcttcatggg atctgcccgc ctcggcttcc caaagtgcta 240 ggattacagg cgtgagccac tgcactcagc cagaaaagat tatttaaaat aattgaatgc 300 atgcaactgc agcatctttt gaaatcaaaa gcaaattaat atctgaggtt ttctataatt 360 aactgtcaag gccaatactt ctggttttat tatttttggt ttctactttt ctgaggttat 420 cgataaatgg agaaacatga ttaaataaat gctttatctn cacttctcga tggcagtcag 480 ctttaatgga aaatattttc ctataaacct aaattaattt ccggaaaccc cttttgaggt 540 taactaccat tgcactggaa taatctttgg natcccggaa ccctgttcaa ggg 593 <210> 7 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 7 ttggtattca caag 14 <210> 8 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 8 aaactggaaa ccta 14 <210> 9 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 9 gatctttatg agaa 14 <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 10 gatggagaaa ttgg 14 <210> 11 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 11 agtctgatgg agaa 14 <210> 12 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 12 tgttaaggga tgtc 14 <210> 13 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 13 aatctgcttt tgtt 14 <210> 14 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 14 agggaattga aatc 14 <210> 15 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 15 taaggcaaga tttc 14 <210> 16 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 16 taaatggagt taag 14 <210> 17 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 17 ttatttatag caca 14 <210> 18 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 18 ttgcttctgc ttat 14 <210> 19 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 19 aaaaaaatat ttgc 14 <210> 20 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 20 cagccttaaa aaaa 14 <210> 21 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 21 ttttaaaacc tctc 14 <210> 22 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 22 tagttcagat tttt 14 <210> 23 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 23 agcagttgct aaat 14 <210> 24 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 24 ctgagtgcag cagc 14 <210> 25 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 25 gtctgatgga ga 12 <210> 26 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 26 gtctgatgga ga 12 <210> 27 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 27 gtctgatgga ga 12 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 28 gmumctmgma tmgmgamgma 20 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 29 mgmumcmumg mamumgmgma mgma 24 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 30 actgacacct aattgtattc acatgaa 27 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 31 tgagcagcag ttgctaaatt agttca 26 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 32 tctacctaca ttatatcata gctccta 27 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 33 ttggtattca caagtgaaa 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 34 ttgctaaatt agttcagat 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 35 gcagcagcag ttgctaaat 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 36 gcagttgcta aattagttc 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 37 gccatgttgc ccagtccagt 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 38 gggctctgct acttacttgc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 39 cccagtcttc agccttgtct 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 40 gggtctctgt catatgttct t 21 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 41 ttcctacctt ccctccata 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 42 attcctacct tccctccat 19 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 43 ccttagggtt gcagctaatt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 44 atcccagcta ctcaggaggc 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 45 tctggctgag tgcagtggct 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 46 cctgggagtt ggaggttgca 20 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 47 cagatcccat gaagccaaga g 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 48 ctgactgcca tcgagaagtg g 21 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 49 aactggagct ggggtgtctg tttca 25 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 50 ccatcagacg acatccctta acaaa 25 <210> 51 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 51 acattatatc atagctccta aaggagatgc a 31 <210> 52 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 52 cagagtttca attccc 16 <210> 53 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 53 gctagtctgt tg 12

Claims (34)

  1. 환자의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 생체내 또는 시험관에서 조절하는 방법에 있어서, 이 방법은
    세포 또는 조직을 길이가 5 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 이때 올리고뉴클레오티드는 서열 번호:2의 뉴클레오티드 1-1028 또는 서열 번호: 3의 뉴클레오티드 1 내지 429 또는 서열 번호:4의 뉴클레오티드 1 내지 156 또는 서열 번호:5의 뉴클레오티드 1 내지 593 안에 5 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는(도 11) 폴리뉴클레오티드의 역 보체에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며; 그리고
    생체내 또는 시험관에서 환자의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현이 조절되는 것을 포함하는, 방법.
  2. 환자의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 생체내 또는 시험관에서 조절하는 방법에 있어서, 이 방법은
    세포 또는 조직을 길이가 5 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 이때 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 안티센스의 역 보체에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며; 그리고
    생체내 또는 시험관에서 환자의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현이 조절되는 것을 포함하는, 방법.
  3. 환자의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 생체내 또는 시험관에서 조절하는 방법에 있어서, 이 방법은
    세포 또는 조직을 길이가 5 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 이때 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드에 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대해 최소한 50% 서열 동일성을 가지며; 그리고
    생체내 또는 시험관에서 환자의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현이 조절되는 것을 포함하는, 방법.
  4. 환자의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 생체내 또는 시험관에서 조절하는 방법에 있어서, 이 방법은
    세포 또는 조직을 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스의 부분을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 그리고
    생체내 또는 시험관에서 환자의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현이 조절되는 것을 포함하는, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, Sirtuin 1(SIRT1)의 발현 및/또는 기능은 기준에 대해 증가된 생체내 또는 시험관에서 증가된, 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스를 표적하는, 방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적은 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 코딩 및/또는 넌-코딩 핵산 서열들을 포함하는 핵산 서열을 표적하는, 방법.
  8. 청구항 4에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 중첩 및/또는 비-중첩 서열들을 표적하는 방법.
  9. 청구항 4에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 슈가 모이어티, 변형된 인터뉴클레오시드 링키지, 변형된 뉴클레오티드 및/또는 이의 조합을 포함하는 하나 이상의 변형을 포함하는, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 변형된 슈가 모이어티는 2'-O-메톡시에틸 변형된 슈가 모이어티, 2'-메톡시 변형된 슈가 모이어티, 2'-O-알킬 변형된 슈가 모이어티, 또는 바이사이클(bicyclic) 슈가 모이어티를 포함하는, 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 변형된 인터뉴클레오시드 링키지는 포스포로티오에이트, 2'-O-메톡시에틸(MOE), 2'-플루오르, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세타마이데이트, 카르복시메틸 에스테르, 및/또는 이의 복합을 포함하는, 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 펩티드 핵산, 잠금 핵산 (LNA) 분자들, 아라비노-핵산 (FANA), 펩티드 핵산 (PNAs), 유사체 또는 이의 유도체들을 포함하는 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드를 선택적으로 가지는, 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 6 내지 47에 제시된 최소한 하나의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  14. 포유류의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 유전자의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법에 있어서, 이 방법은
    세포 또는 조직을 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 안티센스 폴리뉴클레오티드에 특이적인 길이가 5 내지 30개의 짧은 간섭 RNA (siRNA) 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 이때 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 안티센스 및/또는 센스 핵산 분자의 최소한 약 5개 연속 핵산의 상보성 서열에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며; 그리고 생체내 또는 시험관에서 포유류의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 유전자의 기능 및/또는 발현이 조절되는 것을 포함하는, 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 안티센스 및/또는 센스 핵산 분자의 최소한 약 5개 연속 핵산의 상보성 서열에 최소한 80% 서열 동일성을 가지는 방법.
  16. 포유류의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 유전자의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법에 있어서, 이 방법은
    세포 또는 조직을 Sirtuin 1(SIRT1) 분자를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 센스 및/또는 천연 안티센스 가닥의 넌코딩 및/또는 코딩 서열에 특이적인 길이의 약 5 내지 30개의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키고, 이때 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 1 내지 5에 제시된 최소한 하나의 핵산 서열에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며; 그리고 생체내 또는 시험관에서 포유류의 세포 또는 조직내 Sirtuin 1(SIRT1) 유전자의 기능 및/또는 발현이 조절되는 것을 포함하는, 방법.
  17. 최소한 하나의 변형을 포함하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드에 있어서, 이때 변형은 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세타아미데이트, 카르복시메틸 에스테르 또는 이의 복합의 최소한 하나의 인터뉴클레오티드 링키지를 포함하고, 이때 올리고뉴클레오티드는 정상적인 기준과 비교하였을 때, Sirtuin 1(SIRT1) 분자들에 하이브리드되어, 이들의 발현 또는 기능을 생체내 또는 시험관에서 조절하는 안티센스 화합물이 되는, 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
  18. 청구항 17에 있어서, 변형은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 링키지 및 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세타아미데이트, 카르복시메틸 에스테르 또는 이의 복합으로 구성된 군으로부터 선택된 최소한 하나의 인터뉴클레오티드 링키지의 복합을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  19. 청구항 17에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 최소한 하나의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 링키지를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  20. 청구항 17에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 최소한 하나의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 링키지의 기본 골격을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  21. 청구항 17에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 펩티드 핵산, 잠금 핵산 (LNA) 분자들, 유사체, 유도체들 및/또는 이의 복합을 포함하는 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드를 선택적으로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  22. 청구항 17에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메톡시에틸 변형된 슈가 모이어티, 2'-메톡시 변형된 슈가 모이어티, 2'-O-알킬 변형된 슈가 모이어티, 또는 바이사이클(bicyclic) 슈가 모이어티를 포함하는 변형된 슈가 모이어티를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  23. 청구항 17에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 최소한 약 5 개 내지 30개 뉴클레오티드이며, 그리고 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 안티센스 및/또는 센스 가닥에 하이브리드되며, 이때 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 안티센스 및/또는 센스 코딩 및/또는 넌코딩 핵산 서열들의 최소한 5개의 연속 핵산의 상보성 서열에 최소한 약 20% 서열 동일성을 가지는, 올리고뉴클레오티드.
  24. 청구항 17에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 안티센스 및/또는 센스 코딩 및/또는 넌코딩 핵산 서열들의 최소한 5개의 연속 핵산의 상보성 서열에 최소한 약 80% 서열 동일성을 가지는, 올리고뉴클레오티드.
  25. 청구항 17에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 최소한 하나의 Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드에 하이브리드되고, 그리고 정상 기준과 비교하였을 때, 생체내 또는 시험관에서, Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 기능을 조절하는 올리고뉴클레오티드.
  26. 청구항 17에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 6 내지 47에 제시된 최소한 하나의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  27. Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드에 특이적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 있어서, 이때 폴리뉴클레오티드는 안티센스 서열들, 상보성 서열들, 대립유전자들, 상동체들, 이소폼, 변이체들, 유도체들, 돌연변이체들 또는 이의 단편들을 포함하는 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 6 내지 47에서 제시되는 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 비교하였을 때 최소한 약 40%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 포함하는, 조성물.
  29. 청구항 27에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 1 내지 47에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
  30. 청구항 27에 있어서, 서열 번호: 6 내지 47에 제시된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 또는 치환된 뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  31. 청구항 27에 있어서, 변형된 뉴클레오티드는 포스포르티오레이트, 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산, 잠금 핵산 (LNA) 분자들을 포함하는 변형된 염기를 포함하는, 조성물.
  32. Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드 및/또는 이의 인코드된 산물들과 관련된 질병의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 이 방법은
    Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스 서열에 결합하여, Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 최소한 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 치료요법적 효과량을 환자에 투여하고; 그리고
    Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드 및/또는 이의 인코드된 산물들과 관련된 질병을 예방 또는 치료하는 것을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, Sirtuin 1(SIRT1) 폴리뉴클레오티드와 관련된 질병은 암(가령, 유방암, 직장암, CCL, CML, 전립선암), 신경퇴행성 질환(Alzheimer 질환(AD), 헌팅턴 질환, ALS, 파킨슨 질환, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증, 그리고 폴리글루타민 응집으로 인한 질환들); 골근육 질환(가령, Duchene 근위축증, 골근육 위축중, Becker 영양실조, 또는 근육영양장애); 대사질환(가령, 인슐린 저항성, 당뇨병, 비만, 내당능장애, 혈중 고콜레스테롤, 고혈당, 이상지질혈증 및 고지혈증); 성인기 발증형 당뇨병, 당뇨병증 신증, 신경장애(가령, 감각 신경장애, 자율 신경장애, 운동 신경장애, 망막증); 골질환(가령, 골다공증), 혈액 질환(가령, 백혈병); 간질환(가령, 알코올중독 또는 간염으로 인한); 비만; 골 재흡수, 노인성 시력감퇴, AIDS 관련 치매, ALS, 안면신경마비, 아테롬성 동맥경화증, 심장질환(가령, 부정맥, 만성 울혈성 심부전, 허혈성 발작, 관상 대동맥 질환 및 심근증), 만성 퇴행성 질환(가령, 심근질환), 만성 신부전, 타입 2 당뇨병, 궤양, 백내장, 노시, 사구체신염, Guillan-Barre 증후군, 출혈성 발작, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, SLE, Crohn 병, 골관절염, 골다공증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐렴, 피부 노화 및 뇨실금을 포함한다. 다른 예는 신경 세포 사멸, 노화와 관련된 질환 및 장애 또는 원치않는 세포 상실을 특징으로 하는 기타 질환을 포함하는 방법.
  34. 생체내 투여용 올리고뉴클레오티드를 선택하는 방법에 있어서, 이 방법은
    질병 상태와 연관된 표적 올리고뉴클레오티드를 선택하고;
    확인된 폴리뉴클레오티드에 상보성인 또는 안티센스 방향의 최소한 5개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 확인하고; 그리고
    엄격성(stringent) 하이브리드화 조건하에 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 폴리뉴클레오티드의 결합사이에 열용융점을 측정하고; 그리고
    생체내 투여용 올리고뉴클레오티드를 확인하고, 선택하는 것을 포함하는, 방법.
KR1020117014257A 2008-12-04 2009-12-02 Ｓｉｒｔ1에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 ｓｉｒｔ1 관련된 질환의 치료 KR101749352B1 (ko)

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