KR20110097785A

KR20110097785A - 줄기 세포를 활성화시키는 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20110097785A
Application number: KR1020117011962A
Authority: KR
Inventors: 메레디스 한스; 더그 부처; 엘리엇 그루스킨; 스티븐 혼즈비; 멜리사 브라운
Original assignee: 신세스 게엠바하
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2011-08-31
Also published as: EP2344631B1; CN102272289B; CN102272289A; US10494604B2; US20100119492A1; EP3613845A1; BRPI0921726B1; US20160222351A1; JP2015037433A; JP5932000B2; KR20160132133A; CA2741426C; JP5701765B2; CA2741426A1; BRPI0921726B8; JP2012507285A; BRPI0921726A2; WO2010051032A1; EP2344631A1; CN104357381A

Abstract

여기에서 설명된 본 발명의 구체예는 줄기 세포내 간엽 줄기 세포가 뼈를 형성할 수 있는 골아세포로 분화되는 것을 자극하는 방법 및 장치를 포함한다. 여기에서 설명된 장치 및 방법은 골수 흡인물, 지방 조직 및/또는 정제된 동종이형 줄기 세포과 같은 줄기 세포 소스를 활성 물질에 활성화된 줄기 세포를 형성하는데 효과적인 방식으로 노출시키는 것을 포함한다.

Description

줄기 세포를 활성화시키는 방법 및 장치{METHOD AND DEVICE FOR ACTIVATING STEM CELLS}

관련 출원

본 특허 출원은 U.S. 가출원 61/110,096 (2008년 10월 31일자로 제출됨), "DEVICE EOR ACTIVATING BONE MARROW ASPIRATE USING EX VIVO STIMULATION BY GROWTH FACTORS FOR IMPROVED BONE FORMATION", 및 U.S. 가출원 61/152,335 (2009년 2월 13일자로 제출됨) "METHOD AND DEVICE FOR FORMING A BONE MARROW ASPIRATE PRODUCT"을 우선권으로 주장하여, 전문은 참고문헌에 통합된다.

분야

여기에서 설명된 발명의 주제는 생체외 자극을 이용하여 골수 흡인물(aspirate)에 있는 줄기 세포를 활성화시키는 것을 포함한 줄기 세포를 활성화시키는 장치 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 주제는 또한 활성화된 줄기 세포를 함유하는 이식물에 관한 것이다.

최대한 뼈를 형성시키기 위하여, 골아세포 표현형을 이미 가지고 있는 세포를 이식하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이와 같은 세포는 골-형성 활성을 적절하게 나타내기 때문이다. 그러나, 골수 줄기 세포가 골아세포로 시험관내 분화는 골형성 배지 (Jaiswal et al . 1997. J Cell Biochem 64: 295-312)에 배양하는 것을 포함하며, 그리고 시험관에서 이와 같은 세포의 감소된 증식으로 이어질 수 있다. 더욱이, 골형성 배지의 사용은 세포에게 성분들(가령, 성장 인자들)의 추가를 포함하는데, 이 성분들은 세포와 함께 환자에게 투여될 경우 원하지 않는 영향을 줄 수 있다.

따라서, 인간의 골수 줄기 세포와 같은 줄기 세포로부터 골조상세포(osteoprogenitors), 골아세포 또는 골아세포 표현형 세포를 만들고, 골조상세포, 골아세포 또는 골아세포 표현형 세포를 만드는데 이용된 인자들로부터 원하는 세포를 바로 분리시키는, 간단하고 신뢰성있는 방법이 당업계에서 여전히 필요하다.

발명의 요약

본 발명의 한 측면은 포유류에서 뼈 성장을 촉진시키는 이식 조성물을 제조하는 방법이며, 이 방법은 (a) 활성화된 줄기 세포를 만들기 위하여 24시간 미만 동안 하나 이상의 활성 성분에 줄기 세포를 접촉시키고, (b) 실질적으로 활성 성분들이 없는, 활성화된 줄기 세포군을 만들기 위하여, 활성화된 줄기 세포로부터 활성 물질을 분리시키고, 그리고 (c) 실질적으로 활성 성분들이 없는, 활성화된 줄기 세포군을 뼈이식 대체제(substitute)와 접촉시켜, 포유류에서 뼈 성장을 촉진시키기 위한 이식 조성물을 조제하고, 여기서 적어도 한 가지 활성 물질은 줄기 세포가 골형성 세포 또는 골형성 전구 세포로의 분화를 촉진한다. 골형성 세포 및/또는 골형성 조상 세포은 골조상세포, 골아세포 또는 골아세포 표현형 세포가 될 수 있다. 일부 구체예에서, 줄기 세포는 하나 이상의 활성 물질과 5분 내지 1시간 동안 접촉된다. 다른 구체예에서, 줄기 세포는 하나 이상의 활성 물질과 5분 내지 0.5시간 동안 접촉된다. 줄기 세포는 예를 들면, 골수, 지방 조직, 근육 조직, 제대혈, 배 난황낭, 태반, 제대, 골막, 태아 피부, 사춘기 피부, 또는 혈액으로부터 수득하거나 분리될 수 있다. 줄기 세포는 태아, 출생직후 또는 성인 줄기 세포가 될 수 있다. 일부 구체예에서, 줄기 세포는 자기조직(autologous), 동종이계(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic)다. 줄기 세포는 간엽(mesenchymal) 줄기 세포를 포함할 수 있다. 이와 같은 간엽 줄기 세포는 자기조직 골수 흡인물을 함유할 수 있다. 골수 흡인물은 면역-흡착에 의해 뽑아낼 수 있다. 줄기 세포를 얻은 후, 불필요한 지질을 제거하기 위하여 농축될 수 있다. 대안으로, 처음 줄기 세포를 얻은 조직 또는 액체로부터 줄기 세포를 분리시킬 수 있다.

활성 물질은 예를 들면, 세포 성장 및/또는 분화를 조절할 수 있고, 소분자, 펩티드, 성장 인자들, 사이토킨, 리간드, 호르몬 및 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 활성 물질의 예는 형질변환 성장 인자 β (TGF-β), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), 뼈 형태발생학적 단백질 (BMP), 인슐린 성장 인자 (IGF), 인터루킨-I (IL-I), 인터루킨-11 (IL-11), 심바스타신, 덱사메타손, 옥시스테롤, 소닉 헷지호그(sonic hedgehog), 인터페론, 종양 괴사 인자, 신경 성장 인자 (NGF), 피브로넥틴, RGD 펩티드, 인테그린, 상피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 켈틴생성세포 성장 인자, 골형성 단백질, 이의 복합물과 같은 활성 물질을 포함한다. 일부 구체예에서, 활성 물질은 BMP-2, TGF-β3, PSGF-AB, PDGF-BB, FGF-2, TGF-β1, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8, IL-11, 심바스타신, 덱사메타손, 옥시스테롤, sonic hedgehog, 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 활성 물질은 TGF-β 및 FGFb을 포함하고, PDGF를 더 포함할 수 있다. 활성 물질은 자기조직 소스로부터 얻을 수 있다. 활성 물질은 용액내에 포함되어 방법에 이용될 수 있다. 활성 물질은 용액내에서 방법에 이용될 때, 활성화된 줄기 세포는 여과, 겔 여과, 접선 유입 여과, 면역침전, 면역-흡착, 컬럼 크로마토그래피 또는 이의 복합을 포함하는 과정에 의해 활성 물질로부터 단계(b)에 따라 분리된다. 다른 구체예에서, 활성 물질은 고형 지지물에 부착된다. 예를 들면, 활성 물질의 최소한 일부는 공유적 부착, 흡착, 비-공유적 상호작용 및/또는 이의 복합에 의해 고형 지지물에 직간접적으로 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, 활성 물질의 최소한 일부는 펩티드, 항체, 화학적 교차 링커, 알킬렌 쇄 또는 이의 복합을 통하여 고형 지지물에 부착된다. 뼈이식 대체제는 칼슘염과 같은 물질을 포함할 수 있다. 이와 같은 칼슘염은 예를 들면, 인산 일칼슘 일함수화물, α-인산삼칼슘염, β-인산삼칼슘염, 탄산칼슘염, 또는 이의 복합을 포함한다. 뼈이식 대체제는 탈염된 뼈, 인산나트륨염, 폴리머 또는 이의 복합를 더 포함할 수 있다. 이와 같은 폴리머는 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 히알루론산염, 하이드록시프로필셀룰로오즈 (HPC), 카르복시메틸셀룰로오즈 (CMC), 하이드록시프로틸 메틸셀룰로오즈 (HPMC), 하이드록시에틸셀룰로오즈 (HEC), 산탄검, 구아르검, 알긴산염 또는 이의 복합이 될 수 있다. 일부 구체예에서, 이 방법은 줄기 세포에서 알칼리 포스포타제 및/또는 뼈 형태발생학적 단백질(BMP) 수용체 소단위의 발현을 증가시킨다. 이와 같은 방법은 환자에게 이식 조성물을 이식하는 것을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면은 여기에서 설명된 방법에 의해 제조된 이식 조성물이다.

본 발명의 또 다른 측면은 대상체의 뼈 손상, 질환 또는 이상을 치료하는 방법인데, 이 방법은 대상체의 뼈 손상, 질환 또는 이상 부위로 여기에서 설명된 이식 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이와 같은 뼈 손상, 질환 또는 이상은 뼈 골절, 뼈 결손, 뼈 이식(bone transplant), 뼈이식(bone graft), 뼈암, 관절교체, 관절 복구, 뼈 융합, 뼈 면 복구, 뼈 퇴화, 치아 이식물, 치아 복구, 관절염, 뼈 재구성, 또는 이의 조합이 될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면은 줄기 세포를 활성화시키는 장치로서, 고형 지지물과 줄기 세포의 골형성 세포 또는 골형성 전구 세포로의 분화를 촉진시키는 적어도 한 가지 활성 물질을 포함하며, 여기서 장치는 (i) 줄기 세포를 적어도 한 가지 활성 물질로 항온처리하고, 그리고 (ii) (i)의 항온처리 단계 후 줄기 세포로부터 적어도 한 가지 활성 물질을 분리시키기 위해 개조된다. 예를 들면, 적어도 한 가지 활성 물질은 형질변환 성장 인자 β (TGF- β), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), 뼈 형태발생학적 단백질 (BMP), 인슐린 성장 인자 (IGF), 인터루킨-I (IL-I), 인터루킨-11 (IL-11), 심바스타신, 덱사메타손, 옥시스테롤, sonic hedgehog, 인터페론, 종양 괴사 인자, 신경 성장 인자 (NGF), 피브로넥틴, RGD 펩티드, 인테그린, 상피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 켈틴생성세포 성장 인자, 골형성 단백질, 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 적어도 한 가지 활성 물질은 BMP-2, TGF-β3, PSGF-AB, PDGF-BB, FGF-2, TGF- β1, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8, IL-11, 심바스타신, 덱사메타손, 옥시스테롤, sonic hedgehog, 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 적어도 한 가지 활성 물질은 TGF-β 및 FGFb을 포함하고, PDGF를 더 포함할 수 있다. 적어도 한 가지 활성 물질은 예를 들면, 자기조직 소스로부터 수득될 수 있다. 활성 물질은 고형 지지물내에 용액안에 있거나 또는 고형 지지물에 부착될 수 있다. 활성 물질은 예를 들면, 적어도 한 가지 활성 물질에 결합하는 항체 또는 펩티드를 통하여 고형 지지물에 부착될 수 있다.

고형 지지물은 컬럼 매트릭스 물질, 필터, 배양 플레이트, 튜브 또는 접시, 미량적정 플레이트, 비드, 디스크, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 고형 지지물은 용기일 수 있다. 고형 지지물은 플라스틱, 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 유도체, 자석 입자들, 니트로셀룰로오즈, 유리, 섬유유리, 라텍스, 또는 이의 복합을 포함할 수 있다. 고형 지지물은 적어도 한 가지 활성 물질을 제거하기 위하여 친화력 매트릭스를 또한 포함할 수 있다. 고형 지지물에 필터가 있을 경우, 필터는 세포 및 뼈이식 대체제 물질은 유지시키지만 적어도 한 가지 활성 물질은 통과하도록 한다. 대안으로, 필터는 적어도 한 가지 활성 물질은 유지시키고, 줄기 세포는 통과시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 고형 지지물은 줄기 세포에 결합하거나 줄기 세포와 유해하게 상호작용하지 않는다. 다른 구체예에서, 고형 지지물은 줄기 세포와 유해하게 상호작용 없이 줄기 세포에 결합할 수 있다.

장치는 줄기 세포를 적어도 한 가지 활성 물질과 항온처리를 위한 시간을 조절하는 타이머를 더 포함한다. 예를 들면, 타이머는 항온처리 단계 (i) 이후 줄기 세포로부터 적어도 한 가지 활성 물질의 분리를 유발시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 타이머가 있는 장치는 줄기 세포를 적어도 한 가지 활성 물질과 항온처리하는 시간을 24시간 이하로 조절한다. 다른 구체예에서, 타이머가 있는 장치는 줄기 세포를 적어도 한 가지 활성 물질과 항온처리하는 시간을 5분 내지 1시간으로 조절한다.

본 발명의 또 다른 측면은 줄기 세포 소스내 간엽 줄기 세포를 자극하여 골아세포를 분화시키는데 효과적인 방식으로 줄기 세포 소스를 활성 물질에 노출시키는 제 2 성분을 함유하는 뼈 형성 장치이고, 여기서 골아세포는 뼈 복구 및/또는 생성에 유용한 이식 조성물에 통합될 수 있다. 줄기 세포 소스는 자기조직 골수 흡인물, 지방 조직 및/또는 정제된 동종이형 줄기 세포를 포함하는 골수 흡인물이 될 수 있다. 활성 물질은 BMP-2, TGF-β3, PSGF-AB, PDGF-BB5 FGF-2, TGF-β1, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8, IL- 11, 심바스타신, 덱사메타손, 옥시스테롤 및/또는 sonic hedgehog이 될 수 있다. 활성 물질은 장치의 고형 지지물에 바로 부착되거나 또는 고형 지지물에, 예를 들면, 링커를 통하여 매달 수 있다. 한 구체예에서, 연결줄(tether)은 알킬렌 쇄, 펩티드, 항체, 화학적 교차 링커, 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택된다.

한 구체예에서, 활성 물질은 용액내에 있고, 제 2 성분은 간엽 줄기 세포로부터 활성 물질을 제거하기 위한 필터 성분 또는 친화력 매트릭스 (가령, 펩티드 또는 항체)를 더 포함할 수 있다.

한 구체예는 골수 흡인물을 활성화시키는 장치를 포함한다. 장치는 뼈이식 대체제와 환자로부터 빼낸 골수 흡인물을 혼합하여 혼합물을 만드는 성분을 포함한다. 장치는 골아세포 표현형을 강화시키도록 간엽 줄기 세포를 유도하는데 효과적인 방식으로 고정된 또는 매달린 활성 물질에 혼합물을 일시적으로 노출시키는 성분을 포함한다.

또 다른 구체예는 골수 흡인물을 활성화시키는 장치를 포함하는데, 이 장치는 환자로부터 빼낸 골수 흡인물을 다루기위한 성분을 포함한다. 장치는 골아세포 표현형을 강화시키도록 간엽 줄기 세포를 유도하는데 효과적인 방식으로 고정된 또는 매달린 활성 물질에 혼합물을 노출시키는 성분을 포함한다.

골수 흡인물을 활성화시키는 또 다른 장치를 설명하는데, 이 장치는 혼합물을 만들기 위하여 뼈이식 대체제와 환자로부터 빼낸 골수 흡인물을 혼합시키는 성분을 포함한다. 장치는 골아세포 표현형을 강화시키도록 간엽 줄기 세포를 유도하는데 효과적인 방식으로 고정된 또는 매달린 활성 물질에 혼합물을 일시적으로 노출시키는 성분을 더 포함한다. 노출 후, BMA는 매달린 또는 고정된 활성 물질로부터 분리되고, 뼈이식 대체제와 혼합될 수 있다.

한 구체예에서, 이 방법은 활성 물질에 줄기 세포 소스(가령, 자기조직 골수 흡인물을 포함하는 골수 흡인물)를 노출시키는 것을 포함하며, 여기서 줄기 세포 소스의 간엽 줄기 세포는 골아세포로 분화되도록 자극을 받는다. 한 구체예에서, 골수 흡인물은 환자로부터 빼내고 및/또는 환자로부터 빼낸 형태로 이용된다. 대안으로, 골수 흡인물은 환자로부터 빼낸 후 추가 농축될 수 있다. 이 방법은 또한 자극된 또는 활성화된 줄기 세포 (가령, 간엽 줄기 세포)와 합성된 뼈이식 대체제를 혼합시켜 혼합물을 만드는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 노출은 골아세포 표현형을 강화시키도록 간엽 줄기 세포를 유도하는데 효과적인 방식으로 고정된 또는 매달린 활성 물질에 혼합물을 일시적으로 노출시키는 것을 포함한다.

한 구체예에서, 활성 물질은 기질에 결합되어, 결합된 기질을 만든다. 이 구체예에서, 줄기 세포 소스는 5분 내지 24시간, 또는 5분 내지 1시간, 또는 15분 내지 1시간 동안 결합된 활성 물질과 항온처리된다. 한 구체예에서, 항온처리에 의해 뼈에서 뼈 형태발생학적 단백질 (BMP) 수용체 소단위에서 상향 조절된다.

한 구체예에서, 활성 물질에 줄기 세포 소스의 노출은 줄기 세포 용액에서 일어나며, 이 방법은 친화력 매트릭스의 형성 및/또는 여과와 같이 줄기 세포 용액으로부터 활성 물질을 제거하는 것을 더 포함한다.

또 다른 구체예에서, 뼈 형성을 자극할 수 있는 조상 세포를 형성하기 위한 방법이 제공된다. 방법은 골수 흡인물 (BMA)을 활성 물질과 혼합시키고, 그리고 활성 물질을 이용하여, 골아세포 표현형을 강화시키도록 간엽 줄기 세포 (MSCs)를 유도한다. 이와 같은 방법은 골아세포 표현형을 강화 또는 발생시키도록 간엽 줄기 세포를 유도할 수 있다. 이 방법은 또한 뼈이식 대체제와 환자로부터 빼낸 골수 흡인물을 혼합하여 혼합물을 만들고, 그리고 골아세포 표현형을 강화시키도록 간엽 줄기 세포를 유도하는데 효과적인 방식으로 고정된 또는 매달린 활성 물질에 혼합물을 일시적으로 노출시키는 것을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 이 방법은 환자에게 자극된 간엽 줄기 세포를 이식하는 것을 더 포함하는데, 활성 물질을 줄기 세포 소스와 함께 이식하는 것을 포함할 수 있다.

도 1은 본 발명의 구체예에서, 원발성 인간 MSCs에 의해 발현된 알칼리 포스파타제의 수준을 그래프로 설명한다. 세포를 섬유아세포 성장 인자 (이하 "FGF-2") (100 ng/ml) 또는 TGF β3 (250 ng/ml)으로 1시간 처리한 후 분화 배지에서 배양시켰다. 실시예 1에서 설명된 분석을 이용하여, 세포에 의해 발현된 알칼리 포스파타제 수준을 측정하였다.
도 2는 세포를 24시간 동안 활성 물질에 노출시킨 후, 원발성 인간 간엽 세포 (이하 "MSCs")에서 뼈 형태발생학적 단백질 (이하 "BMP") 수용체 단위의 세 가지 유형들, 즉, BMPR-IA ("IA"), BMPR-IB ("IB") 및 BMPR-II ("IT)의 상대적인 mRNA 카피 수를 그래프로 설명한다. 이용된 활성 물질은 혈소판 유도된 성장 인자 (이하 "PDGF BB"), 섬유아세포 성장 인자 (이하 "FGF b"), 그리고 형질변환 성장 인자 (이하 "TGF β3")를 1 ng/ml, 10 ng/ml 및 100 ng/ml의 농도에서 24시간 노출시켰다. 실시예 1에서 설명된 것과 같이, 세포를 수거하였고, 세 가지 BMP 수용체 단위, 즉-IA, -IB 및 II에 대한 정량적인 폴리메라제 쇄 반응(이하 “PCR”)을 실시하였다.
도 3은 원발성 MSCs를 1시간 동안 PDGF BB, FGF b 및 TGF β3을 1 ng/ml, 10 ng/ml 및 100 ng/ml 농도로 노출시킨 후, 세 가지 BMP 수용체 단위(즉, -IA5 -IB 및 II)의 상대적인 mRNA 카피 수를 그래프로 설명한다. 실시예 1에서 설명된 것과 같이, 세포를 수거하였고, 세 가지 BMP 수용체 단위(즉 -IA, -IB 및 II)에 대한 정량적인 PCR을 실시하였다.

상세한 설명

당업계의 현재 기술로, 골수 흡인물 (이하 "BMA")을 수술하는 동안 환자로부터 빼내고, 뼈이식 대체제와 혼합하고, 뼈 치료를 촉진시키기 위하여 외과수술 부위에 재이식하였다. 그러나, 골수 흡인물은 골아세포를 생산할 수 있는 일부 결합조직 선조세포를 포함할 수 있지만, 실질적으로 뼈 형성을 촉진시키는 골형성 세포의 수와 유형은 환자마다 상당히 다양하다.

BMA 또는 줄기 세포 혼합물에서 세포 수를 증가시키거나 또는 선조세포의 골형성 능력을 증가시켜, 줄기 세포(가령, BMA)의 성능을 개선시키는 방법, 장치 및 이식물을 여기에서 설명한다. 여기에서 설명된 구체예들은 과정 중에서 간단하게 하나 이상의 외생성 활성 물질에 줄기 세포를 생체외(ex vivo) 노출시켜, 뼈 성장을 촉진시킬 수 있는 선조 세포를 만드는 방법과 장치를 포함하고, 여기서 활성 물질은 줄기 세포 (가령, 활성 물질에 의해 활성화된 선조세포)로부터 제거된다. 활성 물질은 예를 들면, 소분자, 펩티드, 성장 인자, 사이토킨, 리간드 또는 기타 인자가 될 수 있다. 활성 물질은 자기조직 소스로부터 캡쳐되거나, 시판되는 소스로부터 얻거나 또는 만들 수 있다(가령, 재조합 과정에 의해).

일부 구체예에서, 활성 물질은 줄기 세포 혼합물의 선조 세포에서 뼈 형태발생학적 단백질(이하 BMP) 수용체 소단위의 발현을 증가시킬 수 있다. 활성 물질에 의한 치료는 예를 들면, 뼈 손상 또는 뼈 외과술 부위에서 내생성 BMP에 반응하는 선조세포의 능력을 강화시키는 것을 돕는다. 활성 물질을 이용한 이와 같은 치료는 줄기 세포가 골아세포 경로로 분화되도록 이끌 수 있다. 줄기 세포는 여기에서 설명된 것과 같이 상당시간(가령, 수일간) 동안 사이토킨으로 처리하여 활성화되었으며, 이와 같은 연장된 시간 동안 줄기 세포를 활성 물질에 노출시킬 필요가 없다: 줄기 세포는 단지 15분 내지 약 3시간 동안 활성 물질에 노출시키면 활성화될 수 있고, 골형성 능력을 나타낼 수 있다. 더욱이, 일부 연구에서 시험관에서 뼈 전구 세포의 성장에 필수적일 수도 있는 보조 세포 집단의 존재를 나타낸다. 따라서, 고도로 정제된 뼈 전구 세포는 골형성 사이토킨 칵테일이 존재할 때도 증가되지 못할 수 있다. 따라서, 줄기 세포의 연장된 배양이 유익하지 않을 수 있다. 여기에서 설명된 방법 및 장치는 장시간 세포를 항온처리하는 것을 포함하지 않고, 시간을 단축시켜, 연장된 세포 항온처리와 관련된 오염 및 비용을 줄일 수 있다.

여기에서 설명된 것과 같이, 골형성 능력을 가진 줄기 세포의 강화, 활성화 및/또는 분화는 장치에 활성 물질을 고정시켜, 줄기 세포 혼합물내에 함유된 세포가 활성화되고, 장치로부터 세포를 제거함으로써, 활성물질로부터 용이하게 분리시킬 수 있다. 세포의 이식전에 세포로부터 활성 물질을 분리시키면 활성 물질 자체로 인한 원치않는 부작용 가능성을 감소시킨다(원치 않는 반응을 자극 또는 유해한 면역 반응을 유도).

줄기 세포 소스

여기에서 설명된 방법, 장치 및 이식물은 임의의 통상적인 소스로부터 줄기 세포를 이용할 수 있다. 그러나, 골형성 능력을 가진 또는 골형성 능력을 가진 세포를 생성시키도록 처리될 수 있는(가령, 분화된) 줄기 세포가 바람직하다.

여기에서 설명된 방법, 장치 및 이식물에 이용될 수 있는 줄기 세포의 소스는 골수, 지방 조직, 근육 조직, ex vivo 배양된 자기조직 간엽 줄기 세포, 동종이계 off-the-shelf 간엽 줄기 세포, 제대혈, 배 난황낭, 태반, 제대, 골막, 태아 및 사춘기 피부, 그리고 혈액을 포함한다. 일부 구체예에서, 줄기 세포는 간엽 줄기 세포 또는 간엽 줄기 세포 (가령, 골수 흡인물)를 포함하는 세포 혼합물이다. 줄기 세포는 자기조직, 동종이계이거나 또는 이종 소스로부터 구한 것이다. 줄기 세포는 태아 또는 출생직후 또는 성인 소스의 것일 수 있다.

골수 흡인물은 여기에서 설명된 방법, 장치 및 이식물에 유용한 줄기 세포의 한 소스다. 이와 같은 골수 흡인물은 자기조직, 동종이계 또는 이종 소스로부터 구할 수 있다. 일부 구체예에서, 골수 흡인물은 자기조직이다.

골수 흡인물은 조혈 줄기 세포, 적혈구 및 백혈구 세포 그리고 이들의 전구세포, 간엽 줄기 및 선조세포, 간엽세포 및 이들의 전구세포, 그리고 섬유아세포, 망상적혈구, 지방세포, 그리고 “기질”로 불리는 결합조직 네트워크를 형성하는 내피세포를 포함하는 세포군의 복합 혼합물을 포함한다. 기질로부터 세포는 세포 표면 단백질 및 성장 인자들의 분비에 의한 직접적인 상호작용을 통하여 조혈 세포의 분화를 형태학적으로 조절하고, 그리고 뼈 구조의 토대 및 지지에 관계한다. 골수는 연골, 뼈, 및 다른 결합조직 세포로 분화되는 능력을 가진 “사전-기질(pre-stromal)”세포를 함유한다고 연구에서 암시한다. Beresford " Osteogenic Stem Cell and the Stromal System of Bone and Marrow ", Clin . Orthop ., 240:270, 1989. 최근 연구에서, 전분화능(pluripotent) 기질 줄기 세포 또는 간엽 줄기 세포라고 불리는 이들 세포는 활성화될 때 몇 가지 상이한 유형의 세포계 (가령, 골세포, 연골세포, 지방세포, 등)을 생성하는 능력을 가진다. 그러나, 간엽 줄기 세포는 골수 흡인물에 다양한 다른 종류의 세포(가령, 적혈구, 혈소판, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기성세포, 지방세포, 등)와 함께 매우 소량으로 존재한다. 또한, 결합 조직 유형별로 분화되는 능력은 흡인물에 매우 다양한 생활성 인자들의 존재 뿐만 아니라 제공자의 나이에 따라 어느 정도 달라진다. 여기에서 설명된 방법 및 장치는 줄기 세포 시료의 세포 수를 개선시키고, 골아세포로 분화되는 능력을 개선시켜 이와 같은 문제점을 해결한다.

일부 구체예에서, 줄기 세포는 간엽 줄기 세포를 포함한다.

간엽 줄기 세포는 당업자가 이용할 수 있는 과정에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 간엽 줄기 세포는 콜로니 형성 단위(CFU-f)를 통하여 또는 간엽 줄기 세포에 의해 일반적으로 발현되는 표식을 이용한 유동 세포분석기를 통하여 확인될 수 있다. 간엽 줄기 세포는 일반적으로 CD271⁺, CD105⁺, CD73⁺와 같은 표식을 발현시키지만, CD34^- 및 CD45^- 표현형도 나타낸다.

골수 세포를 이용할 때, 이들 세포는 장골릉, 넓적다리마디(femora), 경골, 등뼈, 늑골 또는 다른 수질 공간으로부터 수득될 수도 있다. 일부 구체예에서, 줄기 세포는 자기조직 유체(가령, 골수 흡인물)로부터 얻는다. 골수 흡인물은 간엽 줄기 세포의 우수한 소스다.

줄기 세포는 일부 구체예에서, 원심분리, 크기별 여과, 면역자석 선택 등과 같은 분리 과정을 거쳐 “무관”한 세포를 걸러내고, 그리고 활성화 단계의 효율을 개선시키거나 또는 이식물 물질에서 뼈 형성을 실시할 수 있는 간엽 줄기 세포를 사전-선택할 수 있다. 세포 유형을 구별하거나 또는 간엽 줄기 세포를 정제할 필요는 없지만, 일부 구체예에서는 이와 같은 것들이 바람직할 수 있다.

세포 유형을 구별하는 것이 바람직한 경우, 예를 들면, 골수를 함유하는 생물학적 시료를 원심분리하여, 시료의 성분들은 밀도에 기초하여 간엽 줄기 세포와 같은 결합조직 성장 촉진 성분이 농축된 분취물을 포함한, 다양한 분취물로 분리된다. 결합조직 성장 촉진 성분이 농축된 분취물을 분리시킬 수 있다. 또한, 원심분리되는 생물학적 시료는 세포 배양물로부터 자유롭게 할 수 있다. 일부 구체예에서, 원심분리되는 생물학적 시료는 환자의 조직 물질 (가령 혈액 또는 다른 조직 물질과 선택적으로 복합된 골수 물질)로 구성되며, 생성된 분리되고, 활성화된 줄기 세포는 나중에 환자에게 이식된다.

활성 물질

활성 물질은 줄기 세포를 형성시키고, 골형성 세포로 분화를 촉진시키기 위하여 여기에서 설명된 방법 및 장치에 이용된다. 이와 같은 활성 물질은 예를 들면, 소분자, 펩티드, 성장 인자들, 사이토킨, 리간드, 호르몬, 그리고 성장 및 분화를 조절할 수 있는 기타 분자들이 될 수 있다. 활성 물질은 자기조직 소스로부터 캡쳐되거나, 시판되는 소스로부터 얻거나 또는 만들 수 있다(가령, 재조합 과정에 의해).

이용될 수 있는 활성 물질의 예는 TGF, FGF, PDGF, BMP, IGF, 인터루킨, IL-I, IL-11 , TGF, NGF, EGF, HGF, 심바스타신, 덱사메타손, 옥시스테롤, sonic hedgehog, 인터페론, 피브로넥틴, "RGD" 또는 인테그린 펩티드 및/또는 단백질, 켈틴생성세포 성장 인자, 골형성 단백질s, MSX1, NFKB1, RUNX2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SOX9, TNF, TWIST1, VDR., AHSG, AMBN, AMELY, BGLAP, ENAM, MINPP1, STATH, TUFT1, BMP1, COL11A1, SOX9, ALPL, AMBN, AMELY, BGLAP, CALCR, CDH11, DMP1, DSPP, ENAM, MINPP1, PHEX, RUNX2, STATH, TFIP11, TUFT1, BGLAP, BMP3, BMP5, BMP6, COL1OA1, COL12A1, COL1A1, COL1A2, COL2A1, COMP, FGFR1, GDF1O, IGF1, IGF2, MSX1, ANXA5, CALCR, CDH11, COMP, DMP1, EGF, MMP2, MMP8, COL1OA1, COL14A1, COL15A1, COL3A1, COL4A3, COL5A1, EGFR, FGF1, FGF3, IGF1R, TGFB2, VEGFA, VEGFB, COL4A3, CSF3, FLT1, IGF1, IGF1R, IGF2, PDGFA, SMAD3, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR2, VEGFA, VEGFB, BMP1, CSF2, CSF3, FGFR1, FGFR2, FLT1, GDF1O, IGF1, IGF1R, IGF2, PDGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TGFBR2, VEGFA, VEGFB, AHSG, SERPINHl, CTSK, MMPlO, MMP9, PHEX, AMBN, AMELY, ENAM, STATH, TUFT1, BGN, COMP, DSPP, GDF1O, CDH11, ICAM1, ITGB1, VCAM1, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGAM, ITGB1, CD36, COMP, SCARBl, AMH, GDF2 (BMP9), GDF3 (Vgr-2), GDF5 (CDMP-1), GDF6, GDF7, IGFBP3, IL6, INHA (인히빈 a), INHBA (인히빈 BA), LEFTY 1, LTBP1, LTBP2, LTBP4, NODAL, ACVR1 (ALK2), ACVR2A, ACVRL1(ALK1), AMHR2, BMPR1A (ALK3), BMPR1B (ALK6), BMPR2, ITGB5 (인테그린 B5), ITGB7 (인테그린 B7), LTBP1, NROB1, STAT1, TGFB1I1, TGFBR1, (ALK5) TGFBR2, TGFBR3, TGFBRAP1, CDC25A, CDKN1A (p21WAF1/p21CIP1), CDKN2B (p15LNK2B), FOS, GSC(goosecoid), IGFBP3, ITGB5 (인테그린 B5), ITGB7 (인테그린 B7), JUN, JUNB, MYC, SERPINE1 (PAI-1), TGFB1I1, TSC22D1 (TGFB1I4), TGIF1, DLX2, ID1, ID2, JUNB, SOX4, STAT1, BAMBI, BMPER, CDKN2B (p15LNK2B), CER1 (cerberus), CHRD (chordin), CST3, ENG (Evi-1), EVI1, FKBP1B, HIPK2, NBL1 (DAN), NOG, PLAU (uPA), RUNX1 (AMLl), SMURF1 그리고 성장 및 분화를 조절하는 기타 분자들, 뿐만 아니라 이들 인자들의 복합도 포함한다.

일부 구체예에서, 활성 물질은 형질변환 성장 인자 β (TGF-β), 섬유아세포 성장 인자 (FGF, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 (FBFa 또는 FBFb를 포함), 및/또는 섬유아세포 성장 인자-8 (FGF-8)), 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), 뼈 형태발생학적 단백질 (BMP) 패밀리(가령, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 및/또는 BMP-7), 인슐린 성장 인자 (IGF) 패밀리의 멤버(가령, 인슐린 유사 성장 인자-I 및/또는 II), 인터루킨-I (IL-I), IL-11, 심바스타신, 덱사메타손, 옥시스테롤, sonic hedgehog, 인터페론, 종양 괴사 인자, 신경 성장 인자 (NGF), 피브로넥틴, "RGD" 또는 인테그린 서열, 상피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 켈틴생성세포 성장 인자, 골형성 단백질s (Ops; 가령, OP-1, OP-2, OP-3), 그리고 성장 및 분화를 조절하는 기타 분자들, 뿐만 아니라 이들 인자들의 복합도 포함한다.

펩티드 활성 물질은 온전한 단백질로 동일한 활성 반응을 유도하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, TGF-β, FGFb 및/또는 PDGF에 유사한 작용을 하는 단백질의 아미노산 단편 또는 펩티드도 이용될 수 있다. 여기에서 설명된 임의의 활성 물질의 펩티드 활성 물질 또는 줄기 세포를 활성화시키는 능력을 가진 것으로 알려진 펩티드 활성 물질이 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 소분자 활성화물질이 줄기 세포를 활성화시키는데 이용될 수 있다.

많은 구체예에서, TGF-β 패밀리 멤버는 여기에서 설명된 방법 및 장치에 활성 물질로 포함된다. TGF-β 패밀리는 구조적으로 관련된 단백질 군을 포함하는데, 태아 발생 동안 광범위한 분화 과정에 영향을 준다. TGF/3 패밀리의 함유물은 7개 시스테인 잔기 보존을 포함하는 일차 아미노산 서열 유사성에 근거한다. 패밀리는 예를 들면, 다음을 포함한다: Mullerian 저해 물질(MIS)을 포함하는데, 이 물질은 정상적인 남성 발달에 필요하다(Behringer , et al ., Nature , 345 : 167, 1990); 초파리(Drosophila)의 decapentaplegic (DPP) 유전자 산물을 포함하는데, 이 유전자 산물은 등-배 축 형성 및 성충 디스크의 형태형성에 요구된다(Padgett , et al ., Nature , 325:81-84, 1987); Xenopus Vg-1 유전자 산물을 포함하는데, 이는 난의 식물극에 모여있고(Weeks , et al ., Cell , 51 :861-867, 1987); 악티빈(activins)을 포함하는데(Mason , et al ., Biochem , Biophys . Res . Commun ., 135:957-964, 1986), 이는 Xenopus 배에서 중배엽 형성 및 전방 구조 형성을 유도할 수 있으며(Thomsen , et al., Cell , 63:485, 1990), 그리고 뼈 형태발생학적 단백질 (BMP, 가령 BMP-2 내지 BMP-15)을 포함하는데, 이것은 처음부터 연골 및 뼈 형성을 유도할 수 있다(Sampath , et al ., J. Biol . Chem ., 265:13198, 1990). TGF-β 유전자 산물은 지방세포분화, 골세포분화, 연골세포분화, 조혈, 및 상피세포 분화를 포함하는 다양한 분화 과정에 영향을 줄 수 있다(Massague , Cell 49:437, 1987), 이 문헌은 참고문헌에 통합된다. TGF-β 패밀리의 단백질은 초기에 큰 전구 단백질로 합성되고, 후속적으로 C-말단으로부터 대략 110-140개 아미노산의 기본 잔기 클러스트에서 단백질분해성 절단을 받는다. 단백질의 C-말단 부분들은 모두 구조적으로 관련되어 있고, 상이한 패밀리 멤버는 이들의 상동성 정도에 근거하여 별개의 하위군으로 분류될 수 있다. 특정 하위군내에 상동성은 70% 내지 90% 아미노산 동일성 범위를 가지지만, 하위군 사이에 상동성은 상당히 더 낮아서, 20% 내지 50% 정도에 불과하다. 각 경우에, 활성 종은 C-말단 단편의 이황화결합-연결된 이량체가 있다. 연구된 대부분의 패밀리에서, 동종이량체 종이 생물학적 활성이 있는 것으로 나타났으며, 인히빈(Ung , et al ., Nature , 321 :779, 1986) 및 TGF-β(Cheifetz , et al ., Cell , 48:409, 1987) 같은 다른 패밀리 멤버의 경우, 이종이량체도 탐지되었으며, 이들은 각 동종이량체와는 상이한 생물학적 활성을 가지는 것으로 보인다. TGF-β 유전자의 슈퍼 패밀리 멤버는 TGF-β3, TGF-β2, TGF-β4 (닭), TGF-β1, TGF-β5 (Xenopus), BMP-2, BMP-4, 초파리(Drosophila) DPP, BMP-5, BMP-6, Vgrl, OP-l/BMP-7, 초파리 6OA, GDF-I, Xenopus Vgf, BMP-3, 인히빈-βA, 인히빈-βB, 인히빈-α, 및 MIS를 포함한다. 이들 유전자들은 Massague , Ann . Rev . Biochem . 67:753-791, 1998에서 논의되었으며, 이 문헌은 참고문헌에 통합된다.

일부 구체예에서, 여기에서 설명된 장치 및 방법에 이용된 TGF-β 패밀리 멤버는 TGF-β3다.

섬유아세포 성장 인자들 및 이들의 수용체 섬유아세포 성장 인자들 (FGFS)은 형태형성, 혈관신생형성, 및 조직 재형성을 포함하는 다양한 생물학적 프로세스 뿐만 아니라 다양한 질병의 발병(Ornitz , Bioessays 22: 108, 2000, 전문이 참고문헌에 통합된다.)에 관련된 발생학적으로 보존된 폴리펩티드 패밀리를 포함한다. 이와 같은 패밀리의 다양한 멤버들은 간엽부터 상피 및 신경외배엽 기원에 이르는 다양한 범위의 세포의 증식을 시험관 및 생체에서 자극한다. 발생 동안 엄격한 일시적 패턴으로 FGFs가 발현되며, 패턴형성 및 사지 형성에 중요한 역할을 한다 (Ornitz, Bioessays 22:108, 2000).

FGF 패밀리의 모든 멤버들은 약 120개 아미노산의 상동성 코어 도메인을 공유하며, 이중 28개 아미노산 잔기는 매우 보존되어 있고, 6개는 동일하다 몇 가지 FGFs의 구조적 연구에서 코어 부분을 포함하는 β-루프에 서로 인접한 12개의 역평행 β 가닥을 확인하였는데, 패밀리간에 보존된다. 코어 도메인은 주요 FGFR 및 및 헤파린 결합 부위를 포함한다. 수용체 결합 부분은 헤파린 결합 부분과는 다르다 (Ornitz and Itoh , Gen . Biol . 2, 3005.1, 2001).

일부 구체예에서, 여기에서 설명된 장치 및 방법에 이용된 FGF의 패밀리 멤버는 FGF-2다.

인간 혈소판의 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF)는 두 개 폴리펩티드 서열 - PDGF-B 및 PDGF-A 폴리펩티드(Antoniades , H. N. and Hunkapiller , M., Science 220:963-965, 1983)을 포함한다. PDGF-B는 염색체 7에 위치한 유전자에 의해 인코드되고(Betsholtz , C. et al ., Nature 320:695-699), 그리고 PDGF-A는 염색체 22에 위치한(Dalla - Favera , R., Science 218:686-688, 1982) sis 종양유전자에 의해 인코드된다(Doolittle , R. et al ., Science 221 :275-277, 1983). sis 유전자는 원숭이 살코마 바이러스(SSV)의 형질변형 단백질을 인코드하며, 이는 PDGF-2 폴리펩티드와 상당히 관련있다. 인간 세포 c-sis는 또한 PDGF-A 쇄를 인코드한다(Rao , C. D. et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 83:2392-2396, 1986). PDGF의 두 개 폴리펩티드 쇄는 별도의 염색체에 위치한 두 개의 상이한 유전자에 의해 인코드되기 때문에, 인간 PDGF는 PDGF-B 및 PDGF-A의 이황화결합-연결된 이종이량체로 구성되거나, 또는 두 개의 동종이량체의 혼합물(PDGF-BB 동종이량체 및 PDGF-AA 동종이량체), 또는 이종이량체와 두 개의 동종이량체의 혼합물로 구성될 수 있다.

PDGF는 시판되는 것으로부터 얻거나, 또는 인간 조직 또는 세포, 가령, 혈소판으로부터 고형 상 펩티드 합성, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 수득될 수 있다. 유인원 살코마 바이러스에 감염된 배양물에 있는 PDGF-A 쇄를 인코드하는 유전자를 포함하는 포유류 세포는 PDGF-A 폴리펩티드를 합성할 수 있고, 이 폴리펩티드를 이황화결합-연결된 동종이량체로 프로세스시킨다(Robbins et al ., Nature 305:605-608, 1983). 또한, PDGF-A 동종이량체는 인간 PDGF에 대항하여 생성된 항혈청과 반응하고, 그리고 분비된 PDGF-A 동종이량체의 기능적 성질은 혈소판-유도된 PDGF것들과 유사하다. 재조합 PDGF-B 동종이량체는 발현 벡터를 이용하여 c-sis/PDGF-B 유전자의 cDNA 클론을 마우스 세포내로 이입시켜 수득할 수 있다. 이와 같은 발현에 이용되는 c-sis/PDGF-B 클론은 정상적인 인간의 배양된 내피세포로부터 수득되었다 (Collins , T., et al ., Nature 216:748-750, 1985).

많은 활성 물질이 골형성 줄기 세포를 활성화시키는 용도를 가지고 있지만, 일부 구체예에서 본 발명의 발명자가 만든 데이터로 TGF-β3, FGF-2 그리고 PDGF의 다양한 형태가 유용하다는 것을 알 수 있다. 다른 구체예에서, 줄기 세포를 활성화시키는 장치 및 방법은 활성 물질로써 최소한 TGF-β3 및 FGF-2를 포함한다.

일부 구체예에서, 활성 물질은 줄기 세포 혼합물의 선조세포에서 뼈 형태발생학적 단백질 수용체 소단위의 발현을 증가시킬 수 있다. 이와 같은 활성 물질로 치료하면, 예를 들면, 뼈 손상 또는 뼈 외과술 부위에서 내생성 뼈 형태발생학적 단백질에 반응하는 선조세포의 능력을 강화시키는데 도움이 된다. 활성 물질로 치료하면 줄기 세포가 골아세포 경로로 분화되도록 몰아갈 수 있다.

뼈 형태발생학적 단백질(BMPs)은 뼈 및 연골 형성을 유도하고, 다양한 세포 유형에 광범위한 효과를 가지는 다기능 사이토킨도 유도한다(Hogan et al ., Gene Dev . 10:1580-1594 (1996); Reddi et al., Cytokines Growth Factor Rev . 8:11-20 (1997)). BMPs는 TGF/3 슈퍼패밀리의 멤버다. 남자에게는 대략 15-20개 BMPs 유전자, 세 개의 BMP 수용체, 그리고 BMP 길항제로 기능을 하는 BMP 관련 단백질이 얼마간 있다(Yamashita et al . Bone 19:569-574 (1996)). BMP는 세 가지 BMP 수용체, BMPR-IA, -IB, 및 II을 통하여 Smad 신호 변환 경로를 통하여 기능한다. BMP 이량체가 타입 II 수용체에 결합되면, 복합체를 형성하고, 그리고 Smad 경로를 활성화시키는 타입 I 수용체를 포스포릴화한다.

원발성 골아세포를 외생성 성장 인자들에게 노출시키면 이들 수용체의 발현을 조절할 수 있다. Singhatanadgit et. al. (J. Cell Physiol . 209(3): 912-22 (2006))는 원발성 골아세포의 TGF-β1, FGF-2, PDGF-AB, 및 BMP-2 처리를 테스트하였으며, 그리고 이들 세포 표면에 세포내 수용체에 대한 이들 성장 인자들의 일부 효과를 테스트하였다. Yeh et. al. (J. Cell . Physiol . 190(3): 322-31 (2002); J. Cell Physiol . 191(3): 298-309 (2002))는 OP-1에 노출시킨 후, 쥐의 태아 두개골 세포에서 수용체 소단위 mRNA의 분화 조절 패턴을 관찰하였다. Xu et. al. (Growth Factors 24(4): 268-78 (2006))는 BMPR-IB에서 TGFβ3의 효과를 테스트하였다. 이들 각 수용체에 결합된 BMP의 신호 경로에 관련된 인자들은 일반적으로 이해되고 있지만, 수용체 소단위의 조절 및 발현 패턴은 완전히 밝혀지지 않았다. 더욱이, 연구자들은 줄기 세포 (가령, 골수)를 성장 인자들로 단기간 처리하면, 골형성 세포 및/또는 골형성 선구물질의 형성 및/또는 형성을 자극할 수 있다는 것을 인지하지 못하였다.

줄기 세포의 활성화

여기에서 설명된 것과 같이, 줄기 세포는 활성 물질에 일시적으로 노출되어 골형성적으로 활성화될 수 있다. 이와 같이 활성화된 줄기 세포는 골조상세포, 골아세포 및/또는 골아세포 표현형 세포로 분화된다. 더욱이, 활성화된 줄기 세포로부터 활성 물질을 제거하면, 대상체로 이식되었을 때 원하지 않는 부작용을 가질 수도 있는 성장인자들 및 사이토킨을 포함하지 않는 세포 혼합물을 만든다. 따라서, 생물학적 활성 분자들의 칵테일에서 줄기 세포 배양물을 몇 일간 둘 필요가 없으며, 이것은 치료를 기다리는 환자에게 지속적은 고통 및 부동성을 초래하고, 뼈 손상의 초기 복구후 이식물 삽입을 위한 추가적인 외과술이 필요하고, 배양된 세포의 오염이 있을 수 있으며, 줄기 세포군 또는 뼈 흡인물에서 원치 않는 세포 유형의 성장 뿐만 아니라 배양물을 유지시키고, 부상자를 돌보기 위한 추가적인 시간 및 비용이 든다.

대신, 줄기 세포를 짧은 시간 동안 활성 물질로 항온처리하면, 이식 및 뼈 성장 및 자극용으로 활성화될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 환자가 뼈 손상 또는 이상 치료를 위해 입원하면, 환자가 외과술을 받는 동안, 자기조직 또는 동종이형 줄기 세포 (가령, 골수 흡인물)가 활성화될 수 있고, 활성화된 줄기 세포는 바로 이식될 수 있다(필요하다면, 뼈이식 대체제와 함께).

여기에서 사용된, "줄기 세포를 활성화시키는"이란 줄기 세포가 골형성 전구 세포로 분화되도록 유도되어, 골-형성 세포를 증식 및 분화시킬 수 있다는 것을 의미한다. 이와 같은 골-형성 세포는 골아세포 및 골아세포 선조를 포함한다. 뼈- 형성 세포는 알칼리 포스파타제, 오스테오칼신, 오스테오폰틴 및 BMP 수용체과 같은 골특이적 표식의 발현에 의해 인지된다.

여기에서 나타낸 것과 같이, 줄기 세포의 활성화는 짧은 시간, 예를 들면, 5 분 내지 24시간 범위가 될 수 있다. 줄기 세포를 활성 물질에 노출시키는 다른 선택적 시간은 10분 내지 2시간, 또는 15분 내지 1시간이다. 일부 구체예에서, 줄기 세포는 하나 이상의 활성 물질에 5분 내지 1시간 동안 노출되거나, 또는 줄기 세포는 하나 이상의 활성 물질에 5분 내지 0.5시간 동안 접촉된다. 여기에서 설명된 것과 같이, 단지 한 시간 동안 골수 흡인물을 활성 물질에 노출시켜, 알칼리 포스파타제 및 BMP 수용체 소단위의 발현을 상향 조절할 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 포유류에서 뼈 성장을 촉진시키기 위한 이식물을 만드는 방법이다. 이 방법은 줄기 세포를 하나 이상의 활성 물질에 24시간 미만으로 노출시켜(가령, 약 5 분 내지 24시간, 또는 약 10 분 내지 2시간 , 또는 약 15분 내지 1시간 동안) 활성화된 줄기 세포를 만들고, 하나 이상의 활성 물질로부터 활성화된 줄기 세포를 분리하여 실질적으로 활성 성분들이 없는, 활성화된 줄기 세포군을 만들고, 그리고 실질적으로 활성 성분들이 없는, 활성화된 줄기 세포군을 뼈이식 대체제와 혼합시켜, 포유류에서 뼈 성장을 촉진시키기 위한 이식물을 만드는 것을 포함한다. 줄기 세포는 줄기 세포가 골형성 또는 골형성 전조 표현형으로 활성화되는데 충분한 농도의 하나 이상의 활성 물질에 노출된다. 당업자는 이와 같은 농도는 예를 들면, 어떤 농도에서 알칼리 포스파타제 및 BMP 수용체 소단위의 발현의 증가 또는 발현을 상향 조절이 일어나는지를 관찰하여 용이하게 판단할 수 있다. 활성 물질의 적절한 농도의 예는 약 0.01 ng/ml 내지 약 1 μg/ml 농도의 활성 물질을 이용하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 활성 물질은 약 0.1 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 또는 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 농도로 이용된다.

여기에서 설명된 것과 같이, 줄기 세포는 임의의 통상적인 소스의 것일 수 있다.

그러나, 골형성 능력을 가진 또는 골형성 능력을 가진 세포를 만들도록 처리될 수 있는(가령, 분화된) 줄기 세포가 바람직하다. 여기에서 설명된 방법, 장치 및 이식물에 이용될 수 있는 줄기 세포 소스는 골수, 지방 조직, 제대혈, 배 난황낭, 태반, 제대, 골막, 태아 및 사춘기 피부, 및 혈액을 포함한다. 일부 구체예에서, 줄기 세포는 간엽 줄기 세포 또는 간엽 줄기 세포를 포함하는 세포 혼합물을 포함한다. 줄기 세포는 자기조직, 동종이계이거나 또는 이종 소스의 것이 될 수 있다. 줄기 세포는 태아 또는 출생직후 또는 성인 소스로부터 구한 것일 수도 있다. 일부 구체예에서, 줄기 세포는 자기조직 또는 동종이형 골수 흡인물이다.

일반적으로, 비-줄기 세포로부터 줄기 세포를 분리시키거나, 또는 다른 세포 유형으로부터 활성화된 (골형성) 줄기 세포를 분리시킬 필요가 없다. 그러나, 비-줄기 세포로부터 줄기 세포를 정제하거나, 또는 비-활성화된 줄기 세포 및 기타 세포 유형으로부터 활성화된 골형성 줄기 세포를 정제하기를 원한다면, 당업자는 임의의 통상적인 과정을 이용하여 정제할 수 있다. 예를 들면, 골수를 원심분리하여 밀도에 기초하여 흡인물의 성분들을 다양한 분취물로 분리시킬 수 있고, 그리고 간엽 줄기 세포가 풍부한 분취물을 수득할 수 있다. 세포는 활성화된 골형성 줄기 세포의 세포 표면에 발현되는 인자들(가령, BMP 수용체)을 인지하고, 이에 결합하는 항체를 이용하여 면역정제를 받을 수 있다.

여기에서 나타낸 바와 같이, 줄기 세포를 활성화시키기 위하여 여기에서 설명된 방법 및 장치에 이용되는 활성 물질은 줄기 세포의 골형성 활성을 활성화시킬 수 있는 임의의 활성물질이 될 수 있다. 여기에서 실시예가 언급되고, 그리고 설명된다.

줄기 세포가 활성화될 때, 골형성 조상 세포의 특징적인 인자들을 발현하기 시작한다. 예를 들면, 여기에서 설명된 것과 같이, 원발성 인간 간엽 줄기 세포에 의해 발현되는 골아세포 분화의 초기 표식이 되는 알칼리 포스파타제 수준이 증가된다. 예를 들면, 도 1에서, 처리안된 기준 세포와 비교하였을 때, 단지 1시간 동안 TGFβ3 (▲) 또는 FGF-2 (■)로 처리된 간엽 줄기 세포는 시간이 경과함에 따라 알칼리 포스파타제 발현이 증가되었으며, 처리된 세포가 더 강력한 분화 반응을 나타낸다는 것을 말한다.

일부 구체예에서, 여기에서 설명된 방법 및 장치를 이용한 줄기 세포 활성화는 BMP 수용체 소단위의 수준 또한 증가시킬 수 있다. 여기에서 설명된 것과 같이, 원발성 간엽 줄기 세포에서 세 가지 BMP 수용체 단위(즉 BMPR-IA, BMPR-IB 및 BMPR-II)의 mRNA 카피수는 활성 물질 (PDGF BB, FGFb 및 TGFβ3, 농도 1 ng/ml, 10 ng/ml 및 100 ng/ml)에 딱 한 시간(도 3) 또는 24 시간(도 2) 노출시킨 후에 증가되었다. 따라서, 외과 수술 부위로 이식시키지 전 짧은 시간 동안 줄기 세포 (가령, 간엽 줄기 세포)를 활성 물질에 노출시키는 처리는 이식 후 세포가 내생성 BMP에 대해 더 강력한 반응을 가질 수 있도록 한다. 활성화된 줄기 세포는 임의의 통상적인 방법에 의해 노출된 하나 이상의 활성 물질로부터 분리되어, 실질적으로 활성 성분들이 없는, 활성화된 줄기 세포군을 만든다. 줄기 세포 조성물 (또는 이식 조성물)의 투여를 막을 수 있는 활성 물질로부터 부작용을 나타내지 않을 때, 줄기 세포군은 실질적으로 활성 성분들을 함유하지 않는다. 따라서, 활성 물질의 양이, 예를 들면, 10 ng/ml 미만, 또는 1 ng/ml 미만, 또는 0.1 ng/ml 미만 또는 0.01 ng/ml 미만이 되는 한, 활성 물질의 소량이 활성화된 줄기 세포군 (또는 이식 조성물)에 남아있을 수 있다. 작고 큰 분자로부터 세포를 분리시키는 과정은 당업계에서 이용할 수 있는 것들이다. 예를 들면, 세포를 배지 또는 염에 현탁시키고, 원심분리에 의해 세포를 수거하여, 줄기 세포가 세척될 수 있다. 이와 같은 몇 차례 세척으로 실질적으로 활성 성분들이 없는, 활성화된 줄기 세포군이 생성된다. 또 다른 예에서, 세포를 컬럼을 통하여 통과시켜 활성 물질로부터 세포를 분리시킬 수 있으며, 여기서 컬럼은 활성 물질은 유지시키지만 세포는 컬럼을 통하여 통과시킨다. 이와 같은 컬럼은 활성 물질에 결합하는 또는 활성 물질을 유지시키는 매트릭스를 담고 있다; 예를 들면, 컬럼은 겔 여과 컬럼, 친화력 정제 컬럼, 또는 이온-교환 컬럼이 될 수 있다.

따라서, 활성 물질은 용액내 줄기 세포 소스 (가령, 골수 흡인물)로 이입될 수 있다. 주어진 항온처리 시간 후, 여과, 겔 여과, 면역침전, 면역-흡착, 컬럼 크로마토그래피 또는 이의 복합을 포함하는 과정에 의해 활성 물질로부터 활성화된 줄기 세포가 분리된다. 예를 들면, 항체 또는 결합 단백질 또는 펩티드를 이용하여 활성 물질을 고정시켜, 줄기 세포로부터 활성 물질을 제거 또는 분리시킴으로써, 활성 물질이 제거될 수 있다. 일부 구체예에서, 용액내 활성 물질은 용액으로부터 활성 물질을 작업 중 제거를 위하여, 적절한 분자량이 차단되는 접선 유입 여과와 같은 작업중 여과 과정을 통하여 세포로부터 제거될 수 있다.

또 다른 구체예는, 분리된 줄기 세포는 뼈이식 대체제에 통합되어, 여기에서 설명된 활성 물질에 노출된다. 줄기 세포/뼈이식 대체제 복합물로부터 통상적인 과정에 의해 활성 물질이 제거될 수 있는데, 예를 들면, 활성 물질을 포함하는 액체 상청액 세척액을 제거하고 줄기 세포/뼈이식 대체제 복합체를 침강시키는 몇 차례 과정을 반복하여 제거될 수 있다.

일부 구체예에서, 여기에서 설명된 장치를 이용하여 노출된 하나 이상의 활성 물질로부터 활성화된 줄기 세포가 분리된다.

줄기 세포를 활성화시키는 장치

본 발명의 또 다른 측면은 뼈 성장을 자극할 수 있는 세포 (가령, 골형성 조상 세포, 골아세포 및 이와 유사한 것들)로 분화될 수 있도록 줄기 세포를 활성화시키는 장치다. 여기에서 설명된 방법에서 장치를 사용하면, 줄기 세포, 줄기 세포 혼합물 및 줄기 세포 조성물(가령, 이식 조성물)을 줄기 세포를 활성화시키는데 충분한 시간 동안 적어도 한 가지 활성 물질과 항온처리시키고, 그 다음 적어도 한 가지 활성 물질로부터 활성화된 줄기 세포를 분리하여, 활성 성분들이 없는, 활성화된 줄기 세포 조성물을 만든다.

따라서, 예를 들면, 본 발명의 한 측면은 고형 지지물에 부착된 고형 지지물 및 하나 이상의 활성 물질을 포함하는 장치다. 활성 물질은 직접적으로 고형 지지물에 부착될 수 있고(가령, 흡착에 의해 또는 공유 결합을 통하여) 또는 활성 물질은 고형 지지물에 간접적으로 부착될 수 있다(가령, 링커, 항체, 펩티드, 압타머, 알킬렌 쇄, 바이오틴-스트렙타아비딘, 등을 통하여).

고형 지지물은 활성 물질이 직간접적으로 부착될 수 있는 임의의 물질이며, 여기서 이 물질은 줄기 세포에 결합하거나 또는 유해한 방식으로 줄기 세포와 상호작용하지 않는다. 따라서, 고형 지지물은 컬럼 매트릭스 물질, 필터, 배양 플레이트, 튜브 또는 접시, 미량적정 플레이트 (또는 미량적정 플레이트의 웰), 비드 (가령, 자석 비드), 디스크, 그리고 줄기 세포와 양립가능한 기타 물질이 될 수 있다. 고형 지지물은 플라스틱, 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 유도체, 자석 입자들, 니트로셀룰로오즈, 유리, 섬유유리, 라텍스, 및 기타 기질 물질과 같은 다양한 물질로 만들 수 있다. 원하는 경우, 고형 지지물은 줄기 세포의 결합을 억제시키는 또는 고형 지지물내 물질의 반응성을 감소시키는 물질로 피복될 수 있다.

활성 물질은 특허 및 과학 문헌에 충분히 설명된, 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 고형 지지물에 부착될 수 있으며, 본 발명의 내용에서 "부착된" 또는 "부착"은 흡착과 같은 비공유적 연합 및 공유적 부착 (활성 물질과 지지물에 있는 기능기 사이에 직접적인 연결을 통하여 또는 간접 연결을 통하여) 모두를 지칭한다. 고형 지지물 물질 (가령, 플라스틱)상에 흡착은 적절한 완충액내의 활성 물질을 적절한 시간 동안 고형 지지물에 접촉시켜 이루어질 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 달라지지만, 일반적으로 약 1시간 내지 약 1일 이다. 일반적으로, 예를 들면, 플라스틱 미량적정 플레이트 (가령, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)의 웰을 약 10 ng 내지 약 10 μg, 그리고 바람직하게는 약 100 ng 내지 약 1 μg 범위의 활성 물질에 접촉시키면, 적정량의 활성 물질을 고정시킨다.

활성 물질을 고형 지지물에 공유적 부착은 지지물과 활성 물질에 있는 기능기, 가령, 하이드록실 또는 아미노 기와 반응할 수 있는 이기능성 시약으로 지지물을 우선 반응시켜 이루어질 수 있다. 예를 들면, 활성 물질은 벤조퀴논을 이용하여 적절하게 폴리머 피복된 지지물에 공유적으로 부착시키거나 또는 지지물에 있는 알데히드기와 결합 짝에 있는 아민과 활성 수소의 축합에 의해 부착될 수 있다(가령, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook , 1991, at A12-A13). 이기능성 시약은 교차결합 시약, 두 개 기능기를 가진 링커, 펩티드, 알킬렌 쇄, 압타머, 또는 기타 이기능 분자가 될 수 있다.

활성 물질은 고형 지지물에 항체와 같은 결합제를 통하여 비-공유적으로 부착될 수 있는데, 여기서 항체는 고형 지지물에 부착 또는 흡착되며, 활성 물질에 비공유적으로 결합한다. 대안으로, 활성 물질은 고형 지지물에 바이오틴-스트렙타아비딘을 통하여 비-공유적으로 부착될 수 있는데, 여기서 바이오틴 또는 스트렙타아비딘은 고형 지지물에 부착된다. 스트렙타아비딘이 고형 지지물에 부착되고, 바이오틴은 활성 물질에 부착된다. 활성 물질에 연결된 바이오틴은 스트렙타아비딘에 결합할 것이며, 따라서 고형 지지물상의 활성 물질을 고정시킨다.

한 예로서, 활성 물질이 공유적으로 결합되는 컬럼 매트릭스 또는 필터 물질이 포함된다. 줄기 세포 (가령, 골수 흡인물)는 일정 시간 동안, 예를 들면, 5분 내지 24시간동안 이 기질을 통과하거나, 이와 함께 항온처리되며, 최적의 시간은 15분 내지 1시간이다.

활성 물질에 노출로 BMP 수용체 소단위 및 알칼리 포스파타제 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 예를 들면, 도 2와 3은 세 가지 활성 물질 (PDGF BB, FGF b, 및 TGF-β3)이 BMPR-IB 소단위를 상향 조절하고, 그리고 특정 농도에서 BMPR-IA 및 BMPR-II 소단위는 배경이상으로 증가되었다. 이와 같은 활성 물질에 노출은 간엽 줄기 세포에 의해 골아세포 표현형을 강화시키도록 줄기 세포를 활성화 또는 유도시키는 작용을 한다.

따라서, 활성 물질은 FGF b, TGF-β3 및/또는 PDGF BB가 될 수 있다. 다른 구체예에서, 고형 지지물상의 활성 물질은 BMP 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 기타 활성 물질, 예를 들면, 여기에서 열거된 임의의 활성 물질 또한 고형 지지물 상에 부착될 수 있다. 활성 물질은 자기조직 소스, 및 동종이형으로부터 기인되거나 또는 제조될 수 있다(가령, 재조합 기술을 통하여). 몇 가지 또는 많은 활성 물질이 동일한 고형 지지물에 부착될 수 있다. 예를 들면, BMPs는 동종이량체 제제보다는 이종이량체 (가령, BMP-2/ BMP-7 조합)에서 더 효과가 크고, 이들은 현재 시판되고 있다. 결과적으로, 여기에서 설명된 장치 및 방법의 구체예에서, 활성 물질은 고형 지지물에 부착될 수 있고, 재이식 전 BMA로부터 분리될 수 있다. 따라서, 여기에서 설명된 현재 장치 및 방법에 이용될 수 있는 다중 활성 물질 이용 가능성에 대해 추가 유연성이 있다.

일부 구체예에서, 장치는 이식 조성물내 줄기 세포를 활성화시키기 위하여, 선택된 시간 동안(가령, 24시간 미만 및/또는 여기에서 설명된 다른 시간) 하나 이상의 활성 물질에 이식 조성물을 노출시키도록 개조된다. 이와 같은 장치는 이식 조성물을 여기에서 설명된 적어도 한 가지 활성 물질과 항온처리되고, 이식 조성물로부터 활성 물질의 분리를 허용하도록 개조된다. 따라서, 활성 물질이 제거되는 동안 이식 조성물내 이식물질 (가령, 뼈이식 대체제) 및 줄기 세포는 장치에 유지될 수 있다. 장치를 이용하여 실질적으로 활성 성분들이 없는, 이식 조성물을 만든다. 따라서, 이 장치는 활성 물질로부터 줄기 세포 및/또는 뼈이식 대체제를 분리시키는 수단을 포함할 수 있다. 예를 들면, 장치는 줄기 세포 및/또는 뼈이식 대체제와 같은 더 큰 물질을 배제시키고, 용액에 있는 활성 물질은 필터 물질의 통과를 허용하는 필터를 포함하여, 활성 물질로부터 줄기 세포 및/또는 뼈이식 대체제를 분리시킬 수 있다. 이식 조성물을 활성 물질과 항온처리시킨 후, 이식 조성물 및 활성 물질을 유지하고 있는 항온처리 챔버는 유출시켜, 적절한 배지 (가령, 완충액, 염, 완충된 염, 배양 배지)로 세척한다. 따라서, 장치는 활성화된 줄기 세포을 포함하고, 실질적으로 활성 물질이 없는 줄기 세포 조성물(가령, 이식 조성물)을 만들 수 있다.

여기에서 설명된 장치는 줄기 세포와 적어도 한 가지 활성 물질의 항온처리 시간을 조절하는 타이머를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 타이머는 항온처리 단계 (i)후 줄기 세포로부터 적어도 한 가지 활성 물질의 분리를 시작하게 할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 타이머는 적어도 한 가지 활성 물질을 함유하는 용액의 배수 또는 제거를 시작할 수 있다. 추가적으로, 또는 대안으로, 타이머는 줄기 세포 및/또는 뼈이식 대체제 물질을 세척하기 위한 용액 첨가를 시작할 수 있다. 일부 구체예에서, 타이머가 있는 장치는 줄기 세포를 적어도 한 가지 활성 물질로 항온처리하는 시간을 24시간 미만으로 조절한다. 다른 구체예에서, 타이머가 있는 장치는 줄기 세포를 적어도 한 가지 활성 물질로 항온처리하는 시간을 5분 내지 1시간으로 조절한다.

이식물

한 구체예에서, 여기에서 설명된 것과 같이 준비된 활성화된 줄기 세포 (가령, 골수 흡인물)는 합성된 뼈이식 대체제, 가령, β 인산삼칼슘염 (β-TCP)과 복합되어 이식 조성물을 형성한다. 한 실시예에서, 활성화된 줄기 세포 (가령, 활성화된 골수 흡인물)와 합성된 뼈이식 대체제의 합성물은 조직 이식물을 대신하여 이용된다. 줄기 세포가 활성 물질에 노출되어 활성화되기 전 또는 후 줄기 세포는 합성된 뼈이식 대체제와 복합될 수 있다. 그러나, 이식전, 줄기 세포는 활성 물질에 노출 또는 활성 물질과 접촉하며, 이식 조성물내 줄기 세포는 활성화된 줄기 세포다. 뼈이식 대체제는 적절한 조건하에 살아있는 뼈에 위치하거나 또는 이와 나란하게 위치하였을 때 골-형성 활성화된 줄기 세포에 의해 새로운 뼈 형성을 위한 비계로 작용하는 고형 물질이 될 수 있다. 이용할 수 있는 예시적인 뼈이식 대체제는 U.S. 특허 5,383,931; 6,461,632; 7,044,972; 7,494,950; 미국 특허 출원 20060008504에서 제공되며, 이들 각 전문이 참고문헌에 통합된다.

뼈이식 대체제는 칼슘 염-함유 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 뼈이식 대체제는 인산 일칼슘 일함수화물, α-인산삼칼슘염, 탄산칼슘염, 탈염된 뼈, 인산나트륨염 그리고, 선택적으로, 폴리머를 포함할 수 있다. 폴리머는 재흡수가능한 폴리머가 될 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리머는 약 15 mm이하의 섬유 길이, 약 50:1 내지 약 1000:1의 가로세로 비, 또는 또는 이 둘을 가진 동종폴리머 또는 코폴리머를 포함한다(그리고 선택적으로 연속 강화 섬유도 포함할 수 있다). 폴리머는 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 히알루론산염, 하이드록시프로필셀룰로오즈 (HPC), 카르복시메틸셀룰로오즈 (CMC), 하이드록시프로틸 메틸셀룰로오즈 (HPMC), 하이드록시에틸셀룰로오즈 (HEC), 산탄검, 구아르검, 및/또는 알긴산염이 될 수 있다.

이용될 수 있는 예시적인 뼈이식 대체제는 β-TCP (가령, Synthes에서 제조된 chronOS), 콜라겐, 생체유리 (가령, 45S5 BioGlass), BioOss (칼슘 인산염 기반 뼈이식 대체제), Pepgen P-15 (하이드록시아파타이트 자연형에 결합된 P-15 펩티드) 및 AlloGraft (탈염된 뼈 매트릭스, 동종이식편-기반 뼈이식 대체제)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 활성화된 줄기 세포는 뼈 이식대체제와 항온처리 또는 혼합되어 이식 조성물을 형성한다. 일부 구체예에서, 이식 조성물은 퍼티(putty)이며; 다른 구체예에서, 이식 조성물은 주사기 바늘을 통과할 수 있을 정도의 충분한 유동성을 가진다. 예를 들면, 이식 조성물은 고체 성분에 대한 액체 성분 비율이 약 0.3 내지 약 0.0 또는 약 0.41 내지 약 0.55을 가질 수 있다.

또 다른 구체예는 줄기 세포를 골아세포 하위 경로로 분화시키기 위하여 짧은 시간 동안(가령, 5분 내지 60분) 줄기 세포 소스 (가령 BMA)와 복합된 활성 물질의 이용을 포함한다. 생체외 항온처리 후, 줄기 세포 및 활성 물질이 함께 이식된다.

치료 방법

활성화된 줄기 세포 및 뼈이식 대체제를 함유하고 있는 이식 조성물은 뼈 손상, 질환 및 이상을 복구 및 치료하는데 유용한다. 이와 같은 뼈 손상, 질환 및 이상은 뼈 손실(골감소증 또는 골용해) 또는 뼈 손상 또는 손상을 특징으로 한다. 이러한 뼈 손상, 질환 및 이상은 뼈 골절, 뼈 결손, 뼈 이식(bone transplant), 뼈이식(bone graft), 뼈암, 관절교체, 관절 복구, 뼈 융합, 뼈 면 복구, 뼈 퇴화, 치아 이식물, 치아 복구, 관절염과 같은 질환으로 인한 뼈 결손, 뼈 재구성 외과술로 인한 뼈 결손 및 뼈 및 뼈 조직과 관련된 기타 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 뼈 결손의 예는 뼈에 틈, 변형 또는 불유합 골절을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 뼈 퇴화의 예는 골감소증 또는 골다공증을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 뼈 결핍은 왜소증 때문이다. 조성물은 관절 대체 또는 복구에 유용하며, 여기서 관절은 척추, 무릎, 엉덩이, 발목, 지골, 팔꿈치, 복사뼈, 천장관절 또는 기타 분절성/비-분절성 관절이다.

이식 조성물은 뼈 부위로 조성물을 압착 또는 결합시켜, 또는 이식 조성물을 주사하여 투여될 수 있다. 주사를 이용하여 투여될 때, 주사기는 약 12 내지 약 18 가우지 바늘을 가질 수 있고, 이용되는 최대 주사압력은 약 40 파운드 이하다. 한 구체예에서, 조성물은 또한 연속성 보강 섬유를 포함할 수 있다.

다음의 비-제한적인 실시예는 본 발명의 특정 측면들을 추가 설명한다.

실시예 l: 재료 및 방법

다음의 재료 및 방법은 본 발명의 특정 측면을 개발하는데 이용되었다.

세포의 분화

계대 3의 인간 간엽 줄기 세포 (Lonza, Walkersville, MD)를 기본 배지에서 (Stem Cell Technologies, Vancouver , Canada) 6×10⁴개의 세포/35mm well의 농도로 접종시키고, 37℃에서 2일간 배양시켰다. 세포를 PBS로 세척하고, 1시간 동안 새로운 기본 배지내 lOOng/ml의 성장 인자 (FGF-2 또는 TGFβ3, R&D Systems , Minneapolis , MN)를 이용하여 활성화시키고, PBS로 헹군 후, 새로운 기본 배지 또는 또는 골형성 분화 배지 (Stem Cell Technologies , Vancouver , Canada)로 37℃에서 7-14일간 항온처리하였다.

실시간 PCR

전체 RNA는 RNeasy Plus Mini Kit 및 QIA shredder Mini Spin 컬럼(Qiagen)를 이용하여 다양한 활성 물질로 처리된 세포로부터 준비하였다.

전체 RNA는 처리안된 세포로부터 준비하여, 기준으로 삼았다. cDNA는 무작위 헥사머 및 Oligo dT를 이용하여 TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)에서 만들었다. 실시간 PCR용 프라이머 및 프로브 세트는 다음과 같다:

huBMPR1A_2 fwd (서열 번호:1): 5'-TAACCAGTATTTGCAACCCAC

ACT-3'. huBMPR1A_2 rev (서열 번호2): 5' -GAGC AAAACC AGCC ATCGAA-3'.

huBMPR1A_2 Probe (서열 번호3): 5'-CCC CCT GTT GTC ATA GGT CCG TTT TTT GAT-3'(FAM/TAMRA).

huBMPR1B_l fwd (서열 번호4): 5'-CCA AAG GTC TTG CGT TGT AAA

TG -3'. huBMPR1B_l rev (서열 번호5): 5'-CAT CGT GAA ACAATA TCC GTC

TGT-3'.

huBMPRIBJ Probe (서열 번호: 6): 5'-CCA CCA TTG TCC AGA AGA CTC AGT CAA CAA-3 '(FAM/TAMRA)

huBMPR2_2 fwd (서열 번호:7): 5'-TGC CCT GGC TAC CAT GGA-3'

huBMPR2_2 rev (서열 번호: 8): 5'-CGC ACA TAG CCGTTCTTGATT-3'

huBMPR2_2 Probe (서열 번호: 9): 5'-TCA GCA CTG CGG CTG CTT COGS' (F AM/TAMRA)

샘플을 β 2 마이크로글루블린 내생성 기준(VIC/TAMRA) (Applied Biosystems)과 함께 다중 반응으로 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System에서 진행되었다.

알칼리 포스파타제 분석

계대 3의 인간 간엽 줄기 세포 (Lonza, Walkersville, MD)를 기본 배지에서 (Stem Cell Technologies, Vancouver , Canada) 6×10⁴개의 세포/35mm well의 농도로 접종시키고, 37℃에서 2일간 배양시켰다. 세포를 PBS로 세척하고, 1시간 동안 새로운 기본 배지내 lOOng/ml의 성장 인자 (FGF-2 또는 TGFβ3, R&D Systems , Minneapolis , MN)를 이용하여 활성화시키고, PBS로 헹군 후, 새로운 기본 배지 또는 또는 골형성 분화 배지 (Stem Cell Technologies , Vancouver , Canada)로 37℃에서 7-14일간 항온처리하였다. 분석 시에, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 100μl/35mm well 용해 완충액에서 수거하고, 액화 질소에서 2차례 냉동/해동시켰다.

알칼리 포스파타제 활성은 20μl 용해물을 1mg/ml p-니트로페닐 인산염 20㎕로 3분간 항온처리하고, 405nm에서 생성된 발광을 측정하여 결정되었다. 알칼리 포스파타제 활성은 CyQuant (Invitrogen, Carlsbad, CA) DNA 정량화에 의해 결정된 세포 카운트에 따라 표준화되었다.

고정화( Immobilization )

초기 연구에서, 활성 물질 (가령, 성장 인자들)은 다음과 같은 미량적정 웰에 고정되었다.

바이오티닐화된 항-성장 인자 항체 (500 ng) (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 스트렙타아비딘-피복된 96-웰 플레이트에서 200㎕ PBS/웰에서 30분간 항온처리하고, PBS로 3회 헹구고, 30분간 200μl PBS에서 증가된 양의 성장 인자에 결합된다. PBS로 3회 헹군 후, 성장 인자의 존재는 0.1% BSA를 포함하는 200㎕ PBS에 있는 1μg의 제 2의 라벨안된 항-성장 인자 항체와 30분간 항온처리하여 탐지되었다. 웰을 PBS로 3회 세척하고, 0.1% BSA를 포함하는 200㎕ PBS에 있는 1μg의 양고추냉이 과산화효소-콘쥬게이트된 2차 항체와 30분간 항온처리하고, PBS로 다시 3회 세척한다. 고정된 항체-성장 인자-2차 항체는 1분간 200μl의 강화된 화학발광 기질과 항온처리한다. 고정된 양고추냉이 과산화효소 제2 항체의 정량화은 가시 파장에서 화학발광 방출을 측정하여 실행되었다.

활성 분석

줄기 세포 활성화 단계전 매달려 있는 활성 물질의 생체 활성을 결정하기 위하여, 다음 분석을 실행하였다. FGF-2 관련된 연구에서, Swiss Albino 3T3 세포 (ATCC, Manassas, VA)는 4×10⁵개/35㎜웰의 밀도로 10% 혈청 기본 배지에 접종하고, 1일간 37℃에서 배양하고, PBS로 3회 세척하고, 그 다음 37℃에서 1일간 0.5% 혈청 기본 배지에서 동기화되었다. FGF2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 50배 과량의 바이오티닐화된 항-FGF2 항체 (R&D Systems, Minneapolis, MN)는 15분간 0.5% 혈청 기본 배지에서 복합되었다. 동기화된(synchronized) 세포를 PBS로 3회 세척하고, 그 다음 FGF2/바이오티닐화된 항-FGF2 항체 복합체로 37℃에서 30분간 처리하였다. 분석 종료시점에서, 세포를 PBS로 3회 헹구고, SDS 시료 완충액에서 수거하고, 90℃에서 10분간 가열하였다. 생성된 용해물은 SDS-PAGE로 분취하고, PVDF 막으로 옮기고, 항-포스포-ERK 항체 1:10000의 희석액으로 순차적으로 프로브시키고(Cell Signaling Technology, Beverly, MA), 그 다음 양고추냉이 과산화효소-콘쥬게이트 2차 항체 1:10000의 희석액으로 프로브시킨다(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). 양고추냉이 과산화효소 활성은 1분간 강화된 화학발광기질에 노출시키고, CCD 카메라로 확인하고, 밀도분석에 의하여 정량화시켜 결정하였다.

TGFβ3 활성 분석의 경우, Mv1Lu 밍크 폐 세포 (ATCC, Manassas, VA)를 96웰 플레이트에 4×10³ 세포의 밀도로 기본 배지에 접종하고, 37℃에서 1일간 배양하였다. TGFβ3 (R&D Systems, Minneapolis, MN)와 50배 과량의 바이오티닐화된 항-TGFβ3 항체 (R&D Systems, Minneapolis, MN)는 15분간 기본 배지에서 복합되었다. PBS로 3회 세척 후, 세포는 TGFβ3/바이오티닐화된 항-TGFβ3 항체 복합체로 37℃에서 3일간 처리하였다. 분석 시, TGFβ3 처리된 배지에 CellTiter-Glo ATP 탐지 시약(Promega, Madison, WI)이 보충되고, 5분간 항온처리하고, 세포 수는 가시 파장에서 화학발광 측정으로 정량화하였다.

실시예 2: 결과

원발성 인간 간엽 줄기 세포는 골아세포 하위 계통으로 분화될 수 있다. 이는 덱사메타손, 아스코르브산 및 β-글리세로포스페이트를 포함하나 이에 한정되지 않는 골형성 칵테일에 세포를 배양하여 시험관에서 증명된다. 이와 같은 배양 조건하에, 세포는 골아세포 분화 표식들의 상향 조절을 보였고, 표식중 가장 흔한 것이 초기 표식 알칼리 포스파타제다.

도 1은 예상된 것과 같이 10일 내지 12일간 처리안된 간엽 줄기 세포 (●)에서 알칼리 포스파타제 활성을 약간 상향조절한 것을 보여주었다. 그러나, 간엽 줄기 세포를 TGFβ3 (▲) 또는 FGF-2 (■)으로 1시간 처리후, 분화 배지에서 물질과 배양물을 제거한 후, 알칼리 포스파타제 활성 수준이 약 2-3배 증가되었다.

이와 같은 데이터는 간엽 줄기 세포를 TGFβ3 또는 FGF-2로 당일(day 0) 1시간 정도 처리하면, 골아세포 분화에 영향을 줄 수 있고, 골아세포 형성의 표식이 처리후 10일간 상향 조절되었다는 것을 나타낸다.

간엽 줄기 세포는 골아세포 표현형을 생체 및 시험관에서 유도하기 위하여 뼈 형태발생학적 단백질에 반응한다. BMPs는 세 가지 소단위, BMPR-IA, BMPR-IB, 및 BMPR-II로 구성된 수용체 복합체를 통하여 작용한다. MSCs는 24시간 동안 선택된 활성 물질 (PDGF-BB, TGFβ3, 및 FGF- 2)로 처리되었고, BMPR-EB 유전자의 상대적인 카피 수는 처리안된 세포에 비해 상당히 증가하였다. 그러나, 도 3은 딱 1시간 처리후에도 유사한 반응이 관찰되었다는 것을 보여준다.

이와 같은 데이터들은 BMP 리간드에 대한 수용체 수준을 처리안된 세포에 비해 증가시키도록, MSC를 활성 물질로 처리하는데 딱 1시간의 일정이 충분하다는 것을 말한다.

간엽 줄기 세포에 BMP 수용체가 증가된 수준으로 존재하면, 생체내 BMP-2 골형성 반응에 대해 이들 세포를 강화시키고, 더 강력한 뼈 치료를 할 수 있다.

여기에서 언급한 모든 특허 및 공개는 본 발명이 속하는 당업계 기술 수준을 나타내며, 이들 언급된 특허 또는 공개는 개별적으로 또는 통합적으로 첨부된 것과 같이 참고문헌에 통합된다. 출원인은 이와 같이 언급된 임의의 특허 또는 공개에 기재된 모든 물질 및 정보를 본 명세서에 물리적으로 결합시킬 권리를 가진다.

여기에서 설명된 특정 방법 및 조성물은 바람직한 대표적인 구체예이며, 본 발명의 범위를 제한시키고자 하는 의도는 아니다. 다른 목적들, 측면들 및 구체예들은 본 명세서를 고려할 때 당업자에게 나타날 수 있으며, 청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 범주에 포함된다. 당업자는 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 본 발명에 대해 다양한 치환 및 수정이 있을 수 있다는 것을 바로 인지할 것이다. 본 발명은 임의의 요소들 없이 실시될 수 있으며, 여기에서 설명된 것에 특별히 제한하지 않는다. 여기에서 설명되는 방법 및 과정은 단계의 순서를 달리하여 실시될 수 있으며, 반드시 여기에서 설명된 순서로 제한시킬 필요는 없다. 여기에서 설명된 그리고 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형은 다른 명시가 없는 한 복수 개념을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "항체"는 이와 같은 복수의 항체(예를 들면, 항체 용액 또는 항체 조제물 시리즈) 포함한다. 어떠한 경우라도 이들 특허가 여기에서 설명된 특정 실시예 또는 구체예 또는 방법에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 특허가 심사관 또는 특허청의 임의의 관리 또는 고용인이 작성한 통지서에서 특별히 그리고 출원인의 답변에서 명시적으로 조건 또는 자격 없이 채택되지 않았다면 이 통지서에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.

이용된 용어 및 표현들은 명세서의 용어로 사용되며, 제한을 두지 않으며, 이와 같은 용어 및 표현들의 사용은 여기에서 설명된 특징에 임의 등가의 것을 배지하려는 의도는 없으며, 다만, 이와 같은 변형은 청구된 본 발명의 범위내에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명은 바람직한 구체예 및 임의의 특징에 의해 특이적으로 설명되어 있지만, 여기에서 설명된 개념의 변형 및 변이는 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이와 같은 수정 및 변이도 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주된다.

본 발명은 여기에서 광범위하게 그리고 일반적으로 설명된다. 각각의 더 좁은 종 및 일반 기술내용에 속하는 하위 군도 본 발명의 일부를 형성한다. 여기에는 한 종류로부터 임의의 대상 물질을 제외시키는 음성적 제한도 포함되며, 제외된 물질이 본 내용에 명시 여부와는 무관하다.

기타 구체예들은 다음의 청구범위에 속한다. 또한, 본 발명의 특징 또는 측면은 Markush 그룹으로 설명되며, 당업자는 Markush 그룹의 개별 멤버 또는 멤버의 하위 군에 형식으로 설명되었다는 것을 인지할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Synthes GmbH Hans, Meredith Buechter, Doug Gruskin, Elliott Hornsby, Stephen Brown, Melissa <120> METHOD AND DEVICE FOR ACTIVATING STEM CELLS <130> 060960-5067 <140> 12589956 <141> 2009-11-09 <150> US 61/110,096 <151> 2008-10-31 <150> US 61/152,335 <151> 2009-02-13 <160> 9 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 taaccagtat ttgcaaccca cact 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gagcaaaacc agccatcgaa 20 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ccccctgttg tcataggtcc gttttttgat 30 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ccaaaggtct tgcgttgtaa atg 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 catcgtgaaa caatatccgt ctgt 24 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ccaccattgt ccagaagact cagtcaacaa 30 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tgccctggct accatgga 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cgcacatagc cgttcttgat t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tcagcactgc ggctgcttcg c 21

Claims

포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 이식 조성물을 만드는 방법으로서,
다음을 포함하는 방법:
(a) 줄기 세포를 하나 이상의 활성 물질과 24시간 이하 동안 접촉시켜 활성화된 줄기 세포를 준비하고;
(b) 활성화된 줄기 세포군으로부터 활성 물질을 분리시켜, 실질적으로 활성 성분들이 없는, 활성화된 줄기 세포군을 만들고; 그리고
(c) 실질적으로 활성 성분들이 없는, 활성화된 줄기 세포군과 뼈이식 대체제를 혼합하여, 포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 이식 조성물을 제조하고,
여기서 적어도 한 가지 활성 물질은 줄기 세포가 골형성 세포 또는 골형성 전구 세포로 분화되는 것을 촉진시킨다.
청구항 1에 있어서, 여기서 줄기 세포는 하나 이상의 활성 물질과 5분 내지 1시간 동안 접촉되는 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 여기서 줄기 세포는 하나 이상의 활성 물질과5분 내지 0.5시간 동안 접촉되는 방법.
청구항 1-3중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 줄기 세포는 골수, 지방 조직, 근육 조직, 제대혈, 배 난황낭, 태반, 제대, 골막, 태아 피부, 사춘기 피부, 또는 혈액로부터 기인된 방법.
청구항 1-4중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 줄기 세포는 자기조직, 동종이계 또는 이종인 방법.
청구항 1-5중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 줄기 세포는 태아, 출생직후 또는 성인 줄기 세포인 방법.
청구항 1-6중 임의의 항에 있어서, 여기서 줄기 세포는 간엽 줄기 세포를 포함하는 방법.
청구항 1-4중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 줄기 세포는 자기조직 골수 흡인물을 포함하는 방법.
청구항 8에 있어서, 여기서 골수 흡인물은 수술중 빼내는 방법.
청구항 8에 있어서, 여기서 골수 흡인물내 세포는 분리되거나 농축된 방법.
청구항 1-10중 임의의 항에 있어서, 여기서 활성 물질은 세포 성장 및/또는 분화를 조절하고, 그리고 소분자, 펩티드, 성장 인자들, 사이토킨, 리간드, 호르몬 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
청구항 1-11중 임의의 항에 있어서, 여기서 활성 물질은 형질변환 성장 인자 β (TGF-β), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), 뼈 형성 단백질 (BMP), 인슐린 성장 인자 (IGF), 인터루킨-I (IL-I), 인터루킨-11 (IL-11), 심바스타신, 덱사메타손, 옥시스테롤, sonic hedgehog, 인터페론, 종양 괴사 인자, 신경 성장 인자 (NGF), 피브로넥틴, RGD 펩티드, 인테그린, 상피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 켈틴생성세포 성장 인자, 골형성 단백질, 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
청구항 1-12중 임의의 항에 있어서, 여기서 활성 물질은 BMP-2, TGF-β3, PSGF-AB, PDGF-BB, FGF-2, TGF-β1, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8, IL-11, 심바스타신, 덱사메타손, 옥시스테롤, sonic hedgehog, 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
청구항 1-13중 임의의 항에 있어서, 여기서 활성 물질은 TGF-β 및 FGFb를 포함하는 방법.
청구항 14에 있어서, 여기서 활성 물질은 PDGF을 포함하는 방법.
청구항 1-15중 임의의 항에 있어서, 여기서 활성 물질은 용액안에 있는 방법.
청구항 1-15중 임의의 항에 있어서, 여기서 활성 물질은 고형 지지물에 부착된 방법.
청구항 16에 있어서, 여기서 활성 물질의 최소한 일부는 펩티드, 항체, 화학적 교차 링커, 또는 이의 복합을 통하여 고형 지지물에 부착된 방법.
청구항 1-18중 임의의 항에 있어서, 여기서 활성화된 줄기 세포는 여과, 겔 여과, 접선 유입 여과, 면역침전, 면역-흡착, 친화력 크로마토그래피, 컬럼 크로마토그래피 또는 이의 복합을 포함하는 과정에 의해 활성 물질로부터 분리된 방법.
청구항 1-19에 있어서, 여기서 뼈이식 대체제는 칼슘 염을 포함하는 방법.
청구항 20에 있어서, 여기서 칼슘 염은 인산 일칼슘 일함수화물, α-인산삼칼슘염, β-인산삼칼슘염, 탄산칼슘염, 또는 이의 복합을 포함하는 방법.
청구항 20 또는 21에 있어서, 여기서 뼈이식 대체제는 탈염된 뼈, 인산나트륨염, 폴리머 또는 이의 복합을 더 포함하는 방법.
청구항 22에 있어서, 여기서 폴리머는 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 히알루론산염, 하이드록시프로필셀룰로오즈 (HPC), 카르복시메틸셀룰로오즈 (CMC), 하이드록시프로틸 메틸셀룰로오즈 (HPMC), 하이드록시에틸셀룰로오즈 (HEC), 산탄검, 구아르검, 알긴산염 또는 이의 복합물인 방법.
청구항 1-23중 임의의 항에 있어서, 여기서 방법은 줄기 세포에서 알칼리 포스파타제 및/또는 a 뼈 형태발생학적 단백질 (BMP) 수용체 소단위의 발현을 증가시키는 방법.
청구항 1-24중 임의의 항에 있어서, 환자에게 이식 조성물을 이식하는 것을 더 포함하는 방법.
청구항 1-25중 임의의 항에 따른 방법에 의해 제조된 이식 조성물.
대상체의 뼈 손상, 질환 또는 이상을 치료하는 방법으로서, 대상체의 뼈 손상, 질환 또는 이상 부위로 청구항 26의 이식 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
청구항 27에 있어서, 여기서 뼈 손상, 질환 또는 이상은 뼈 골절, 뼈 결손, 뼈 이식, 뼈이식, 뼈암, 관절교체, 관절 복구, 뼈 융합, 뼈 면 복구, 뼈 퇴화, 치과 이식물, 치아 복구, 관절염, 뼈 재구성, 또는 이의 복합을 포함하는 방법.
줄기 세포를 활성화시키는 장치로서, 고형 지지물과 줄기 세포의 골형성 세포 또는 골형성 전구 세포로의 분화를 촉진시키는 적어도 한 가지 활성 물질을 포함하며, 여기서 장치는 (i) 줄기 세포를 적어도 한 가지 활성 물질로 항온처리하고, 및 (ii) (i)의 항온처리 단계 후 줄기 세포로부터 적어도 한 가지 활성 물질을 분리시키기 위해 개조된 장치.
청구항 29에 있어서, 여기서 적어도 한 가지 활성 물질은 형질변환 성장 인자 β (TGF-β), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), 뼈 형성 단백질 (BMP), 인슐린 성장 인자 (IGF), 인터루킨-I (IL-I), 인터루킨-11 (IL-11), 심바스타신, 덱사메타손, 옥시스테롤, sonic hedgehog, 인터페론, 종양 괴사 인자, 신경 성장 인자 (NGF), 피브로넥틴, RGD 펩티드, 인테그린, 상피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 켈틴생성세포 성장 인자, 골형성 단백질, 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택된 장치.
청구항 29 또는 30에 있어서, 여기서 적어도 한 가지 활성 물질은 BMP-2, TGF-β3, PSGF-AB, PDGF- BB, FGF-2, TGF-β1, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8, IL-11, 심바스타신, 덱사메타손, 옥시스테롤, sonic hedgehog, 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택된 장치.
청구항 29, 30 또는 31에 있어서, 여기서 적어도 한 가지 활성 물질은 TGF-β 및 FGFb을 포함하는 장치.
청구항 32에 있어서, 여기서 적어도 한 가지 활성 물질은 PDGF를 더 포함하는 장치.
청구항 29-33중 임의의 항에 있어서, 여기서 적어도 한 가지 활성 물질은 용액에 있는 장치.
청구항 29-33중 임의의 항에 있어서, 여기서 적어도 한 가지 활성 물질은 고형 지지물에 부착된 장치.
청구항 29-35중 임의의 항에 있어서, 여기서 고형 지지물은 컬럼 매트릭스 물질, 필터, 배양 플레이트, 튜브 또는 접시, 플라스크, 미량적정 플레이트, 비드, 디스크, 또는 이의 복합을 포함하는 장치.
청구항 29-36중 임의의 항에 있어서, 여기서 고형 지지물은 플라스틱, 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 유도체, 자석 입자들, 니트로셀룰로오즈, 유리, 섬유유리, 라텍스, 또는 이의 복합을 포함하는 장치.
청구항 29-38중 임의의 항에 있어서, 여기서 고형 지지물은 적어도 한 가지 활성 물질을 제거하기 위하여 친화력 매트릭스를 포함하는 장치.
청구항 29-38중 임의의 항에 있어서, 여기서 고형 지지물은 적어도 한 가지 활성 물질에 결합하는 스트렙타아비딘, 바이오틴, 교차링커, 항체 또는 펩티드를 포함하는 장치.
청구항 29-39중 임의의 항에 있어서, 여기서 고형 지지물은 용기를 포함하는 장치.
청구항 29-40중 임의의 항에 있어서, 여기서 고형 지지물은 필터를 포함하는 장치.
청구항 41에 있어서, 여기서 필터는 세포 및 뼈이식 대체제 물질은 유지시키고, 적어도 한 가지 활성 물질은 통과시키는 장치.
청구항 41에 있어서, 여기서 필터는 적어도 한 가지 활성 물질은 유지시키고, 줄기 세포를 통과시키는 장치.
청구항 29-43중 임의의 항에 있어서, 여기서 고형 지지물 물질은 줄기 세포에 결합하거나 줄기 세포와 유해하게 상호작용하지 않는 장치.
청구항 29-44중 임의의 항에 있어서, 여기서 줄기 세포는 골수, 지방 조직, 근육 조직, 제대혈, 배 난황낭, 태반, 제대, 골막, 태아 피부, 사춘기 피부, 또는 혈액으로부터 얻은 장치.
청구항 29-45중 임의의 항에 있어서, 여기서 줄기 세포는 간엽 줄기 세포를 포함하는 장치.
청구항 29-46중 임의의 항에 있어서, 여기서 줄기 세포는 자기조직 골수 흡인물을 포함하는 장치.
청구항 29-47중 임의의 항에 있어서, 줄기 세포를 적어도 한 가지 활성 물질과 항온처리하는 시간을 조절하는 타이머를 더 포함하는 장치.
청구항 48에 있어서, 여기서 타이머는 항온처리 단계 (i) 이후 줄기 세포로부터 적어도 한 가지 활성 물질 분리를 유도하는 장치.
청구항 48에 있어서, 여기서 타이머는 줄기 세포를 적어도 한 가지 활성 물질과 항온처리하는 시간을 24시간 이하로 조절하는 장치.
청구항 48에 있어서, 여기서 타이머는 줄기 세포를 적어도 한 가지 활성 물질과 항온처리하는 시간을 5분 내지 1시간으로 조절하는 장치.
청구항 48에 있어서, 여기서 타이머는 줄기 세포를 적어도 한 가지 활성 물질과 항온처리하는 시간을 5분 내지 0.5시간으로 조절하는 장치.