KR20110076953A - 단백질 가수분해물 조성물을 포함하는 빙과 및 빙과의 제조방법 - Google Patents
단백질 가수분해물 조성물을 포함하는 빙과 및 빙과의 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20110076953A KR20110076953A KR1020117009106A KR20117009106A KR20110076953A KR 20110076953 A KR20110076953 A KR 20110076953A KR 1020117009106 A KR1020117009106 A KR 1020117009106A KR 20117009106 A KR20117009106 A KR 20117009106A KR 20110076953 A KR20110076953 A KR 20110076953A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- protein
- hydrolyzate
- soy
- composition
- dairy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
- A23G9/00—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor
- A23G9/32—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
- A23G9/38—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
- A23G9/00—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor
- A23G9/04—Production of frozen sweets, e.g. ice-cream
- A23G9/22—Details, component parts or accessories of apparatus insofar as not peculiar to a single one of the preceding groups
- A23G9/30—Cleaning; Keeping clean; Sterilisation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
- A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
- A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
- A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/185—Vegetable proteins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Confectionery (AREA)
Abstract
본 발명은 빙과 조성물 및 유제품-유사 빙과 조성물, 및 빙과 조성물의 제조방법을 제공한다. 특히, 빙과는 단백질 가수분해물 조성물을 포함하는데, 이는 일반적으로 각 카복실 말단에 아르기닌 잔기 또는 라이신 잔기 중 어느 하나를 주로 갖는 폴리펩티드 단편으로 구성된다.
Description
본 발명은 일반적으로 식용 재료 및 단백질 가수분해물 조성물을 포함하고, 임의로 유제품 단백질(dairy protein)을 포함할 수 있는 빙과, 및 빙과의 제조방법을 제공한다.
아이스 크림, 워터 아이스(water ice), 셔벗(sherbet) 등과 같은 빙과는 수년간 모든 연령의 사람들이 즐겨왔다. 유제(Dairy-based) 빙과는 전형적으로 전유(whole milk), 버터지방 및/또는 헤비 크림(heavy cream) 및 당으로 만들어지나, 비-유제 빙과는 영양학적인 완전함을 희생하면서, 예를 들어, 어떤 섬유질 또는 단백질도 함유하지 않고, 높은 수준의 당과 칼로리를 함유할 수 있다. 대다수가 빙과를 즐길 수 있으나, 이러한 대우는 수많은 이유로 회피되는 경향이 있다. 먼저, 빙과는 이들이 전형적으로 함유하는 높은 수준의 지방과 칼로리 때문에, 영양학적인 제품이 아니다. 두번째로, 많은 집단은 이들이 유제품에서 발견되는 당인 락토오스를 신진대사시킬 수 없기 때문에, 유제 빙과를 소비할 수 없다. 세번째로, 일부 사람들은 유제품의 소비를 둘러싼 종교적인 또는 개인적인 신념 때문에, 유제 빙과를 먹지 않는 선택을 한다. 모든 이들 인자들로 미루어 보아, 영양가도 높은 저-유제품 또는 비-유제품 빙과가 필요하다.
유제 빙과는 밀키한(milky) 향미와 크림같은 질감(creamy texture) 때문에 사랑받는다. 다양한 제품에서 유제품을 대체하는 데 통상적으로 사용되는 하나의 제품은 대두 단백질이다. 현재 시판되고 있는 대두 함유 빙과가 있는 것이 잘 알려져 있다. 이들 제품에는 유제품 함량이 감소되거나 없으며, 영양학적으로 완전할 수 있다. 빙과 중에 한 성분으로서 시장에서 사용되는 현재의 대두 단백질은 빙과가 개인이 불쾌하거나 식감에 맞지 않다고 여기게 하는 "풀냄새(grassy)" 또는 "콩냄새(beany)"를 갖게 유발하는 경향이 있다. 이들 "건강에 좋은(healthy)" 빙과 옵션의 출현에도 불구하고, 소비자는 건강에 좋거나 유제품을 피하기 위한 노력으로 이들의 좋아하는 맛과 질감의 탐닉을 희생하려하지 않는 것이 분명해 보인다. 따라서, 대두 단백질 제품을 함유함으로써 건강 또는 신념의 제한을 해결하려고 노력하나, 여전히 사람들이 알게 되고 사랑하게 되는 맛과 질감을 유지하는 비-유제품 또는 저-유제품 빙과가 필요하다.
본 발명의 일면은 각 카복실 말단에 아르기닌 잔기 또는 라이신 잔기 중 어느 하나를 주로 갖는 폴리펩티드 단편의 혼합물을 갖는 단백질 가수분해물을 포함하는, 빙과 조성물을 제공한다. 이들 제품은 임의로 유제품 단백질을 포함한다. 또한, 단백질 가수분해물 조성물은 가수분해도가 적어도 약 0.2%이며, 가용성 고형분 지수(soluble solids index, SSI)가 약 6.0 초과의 pH에서 적어도 약 80%이다.
본 발명의 다른 태양과 특징은 하기에서 더욱 상세히 설명된다.
컬러 도면에 대한 참고
본 출원은 컬러로 제작된 적어도 하나의 사진을 포함한다. 컬러 사진을 포함하는 본 특허 출원 공보의 복사본은 필요한 요금을 지불하고 요청하면 특허청에 의해 제공될 것이다.
<도 1>
도 1은 푸사리움(Fusarium) 트립신-유사 엔도펩티다아제(endopeptidase)(TL1)에 의한 단리된 대두 단백질의 가수분해를 예시한다. 쿠마시(Coomassie)-염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 이미지를 제시하였다. 레인 3(L3)은 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질(수프로(SUPRO®) 500E)을 함유한다. 레인 4(L4), 레인 5(L5), 레인 6(L6), 레인 7(L7) 및 레인 8(L8)은 가수분해도(DH)가 각각 0.3%, 2.2%, 3.1%, 4.0% 및 5.0%인 TL1 가수분해물을 함유한다. 레인 9(L9)는 단백질 MW 표준물을 함유하며, 킬로달톤(KD) 단위의 크기가 겔의 우측에 나타내어져 있다.
<도 2>
도 2는 숙달된 평가자가 평가한, 5.0% 고형분에서의 TL1 가수분해물 및 알칼라아제(ALCALASE®) 가수분해물의진단 점수를 제시한 것이다. 각각의 가수분해물의 아이덴티티(identity) 및 가수분해도(DH%)는 각 그래프 아래에 제시하였다. 양의 점수는 가수분해물이 대조군 샘플보다 더한 관능 속성을 가졌음을 나타내며, 음의 점수는 가수분해물이 대조군 샘플보다 덜한 관능 속성을 가짐을 나타낸다. 대조군 샘플은 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질이었다. (a)는 가수분해도가 약 2.5% DH 미만인 TL1 및 알칼라아제(ALC) 가수분해물에 대한 점수를 제시한 것이다. (b)는 가수분해도가 3% DH 초과인 TL1 및 알칼라아제(ALC) 가수분해물에 대한 점수를 제시한 것이다.
<도 3>
도 3은 알칼라아제 및 TL1 가수분해물의 용해도를 비교한다. 각각의 효소 및 가수분해도(DH%)는 각 튜브 아래에 제시하였다. (a)는 2주 동안 4℃에서 pH 7.0에서 보관된 알칼라아제(ALC) 및 TL1 가수분해물(2.5% 고형분)의 튜브를 제시한 것이다. (b)는 3주 동안 4℃에서 pH 8.2에서 보관된 TL1 및 알칼라아제(ALC) 가수분해물(2.5% 고형분)을 제시한 것이다.
<도 4>
도 4는 TL1 및 알칼라아제 가수분해물의 용해도 그래프를 제시한 것이다. 각각의 가수분해물(2.5% 고형분)의 가용성 고형분의 퍼센트(즉, 가용성 고형분 지수)는 pH의 함수로서 작도하였다. 각각의 가수분해물의 아이덴티티 및 가수분해도(DH%)는 각 그래프 아래에 제시하였다. (a)는 TL1 가수분해물에 대한 용해도 곡선을 제시한 것이다. (b)는 알칼라아제(ALC) 가수분해물에 대한 용해도 곡선을 제시한 것이다. (c)는 선택된 TL1 및 알칼라아제(ALC) 가수분해물의 용해도를 직접 비교한 것을 제시한 것이다.
<도 5>
도 5는 파일럿 플랜트(pilot plant) 규모에서 TL1을 가진 대두 단백질 물질의 가수분해를 예시한 것이다. TL1 가수분해물 및 대조군 샘플이 분리되어 있는, 쿠마시-염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 이미지를 제시하였다. 레인 1(L1)과 레인 3(L3)은 가수분해되지 않은 대두 단백질을 함유하며; 레인 2(L2)는 2.7% DH의 TL1 가수분해물을 함유하며; 레인 4(L4)는 가수분해된 대조군 샘플(효소의 혼합물을 이용하여 2.8%로 가수분해된 수프로 XT 219)을 함유하며; 레인 5 내지 레인 11(L5 내지 L11)은 각각 1.3, 2.0, 3.8, 0.3, 0.9, 1.6 및 5.2% DH를 갖는 TL1 가수분해물을 함유한다. 레인 12(L12)는 분자량 표준물을 함유하며, 킬로달톤(KD) 단위의 크기가 겔의 우측에 표시된다.
<도 6>
도 6은 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물 및 대조군 샘플의 용해도 그래프를 제시한 것이다. 각각의 가수분해물의 가수분해도(DH%)는 그래프 아래에 제시하였다.
<도 7>
도 7은 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물 및 대조군 샘플의 점도 그래프를 제시한 것이다. 각각의 가수분해물의 가수분해도(DH%)는 그래프 아래에 제시하였다.
<도 8>
도 8은 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물의 가수분해도의 함수로서, 점도 및 용해도(즉, 가용성 고형분 지수(SSI) 및 질소 가용성 지수(NSI))의 그래프를 제시한 것이다.
<도 9>
도 9는 향미 휘발물질(flavour volatile)의 수준이 대조군 샘플에 비하여 TL1 가수분해물에서 더 낮음을 예시한다. (a)는 대조군 샘플 및 상이한 가수분해도(DH%)를 갖는 TL1 가수분해물에서의 전체 활성 휘발물질 및 헥산알의 수준을 제시한 것이다. (b)는 대조군 샘플 및 상이한 가수분해도(DH%)를 갖는 TL1 가수분해물에서 표시된 향미 휘발물질의 수준을 제시한 것이다.
<도 10>
도 10은 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물 및 대조군 샘플의 진단 점수의 그래프를 제시한 것이다. 대조군 샘플은 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질이었다. 양의 점수는 가수분해물이 대조군 샘플보다 더한 관능 속성을 가졌음을 나타내며, 음의 점수는 가수분해물이 대조군 샘플보다 덜한 관능 속성을 가짐을 나타낸다. (a)는 대조군, 0.3% DH 및 1.6% DH 샘플에 대한 점수를 제시한다. (b)는 대조군, 1.3% DH 및 5.2% DH 샘플에 대한 점수를 제시한 것이다. (c)는 대조군, 2.7% DH 및 0.9% DH 샘플에 대한 점수를 제시한다. (d)는 대조군, 2.0% DH 및 3.8% DH 샘플에 대한 점수를 제시한 것이다.
<도 11>
도 11은 가수분해도(DH)의 함수로서 TL1 가수분해물의 관능 점수의 요약 그래프를 제시한 것이다. 전반적인 선호 점수를 위에 제시하였으며 쓴 맛(bitter) 점수를 아래에 제시하였다. 마름모는 예상 점수를 나타내고 사각형은 실제 점수를 나타낸다.
<도 12>
도 12는 몇몇 상이한 트립신-유사 프로테아제를 이용한 단리된 대두 단백질의 가수분해를 예시한 것이다. 가수분해되지 않은 대두 단백질과 효소-처리된 대두 단백질 샘플이 분리되어 있는, 쿠마시-염색된 SDS 폴리아크릴아미드 겔의 이미지를 제시하였다. 레인 1은 겔의 좌측에 나타낸 크기를 가진 분자량 마커를 함유한다. 레인 3 및 레인 9는 처리되지 않은 단리된 대두 단백질을 함유한다. 레인 2 및, 레인 4 내지 레인 8은 TL1, SP3, TL5, TL6, 돼지 트립신 및 소 트립신으로 각각 처리된 대두를 함유한다.
<도 13>
도 13은 pH의 함수로서 대두 단백질 및 유제품 단백질의 조합의 TL1 가수분해물의 용해도를 예시한 것이다.
<도 14>
도 14는 TL1에 의한 다른 식물 단백질 물질의 가수분해를 예시한 것이다. 미처리 및 처리 단백질 샘플이 분리되어 있는, 쿠마시-염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 이미지를 제시하였다. 레인 1(L1)은 분자량 마커(겔의 좌측에 KD 단위로 나타낸)를 함유한다. 레인 2(L2), 레인 4(L4) 및 레인 6(L6)은 각각 가수분해되지 않은 콘 배아(corn germ), 카놀라(canola) 및 밀 배아(wheat germ)의 샘플을 함유한다. 레인 3(L3), 레인 5(L5) 및 레인 7(L7)은 각각 콘 배아, 카놀라 및 밀 배아의 TL1 가수분해물을 함유한다.
<도 15>
도 15는 모두 유제품인(all-dairy) 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 XF8020으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체, 30%의 유제품 대체, 40%의 유제품 대체 및 50%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 아이스 크림에 대한 향미 프로파일을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 16>
도 16은 모두 유제품인 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 120으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체, 30%의 유제품 대체, 40%의 유제품 대체 및 50%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 아이스 크림에 대한 향미 프로파일을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 17>
도 17은 모두 유제품인 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 760으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체, 30%의 유제품 대체, 40%의 유제품 대체 및 50%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 아이스 크림에 대한 향미 프로파일을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 18>
도 18은 모두 유제품인 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 XF8020으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체 및 40%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 아이스 크림의 허용성을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 19>
도 19는 모두 유제품인 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 120으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체 및 40%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 아이스 크림의 허용성을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 20>
도 20은 모두 유제품인 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 760으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체 및 40%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 착향 빙과의 허용성을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 21>
도 21은 상업의 소이 딜리셔스 채소 빙과와 비교하여, 수프로 120, 수프로 XF 8020로의 100% 유제품 대체물이다.
도 1은 푸사리움(Fusarium) 트립신-유사 엔도펩티다아제(endopeptidase)(TL1)에 의한 단리된 대두 단백질의 가수분해를 예시한다. 쿠마시(Coomassie)-염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 이미지를 제시하였다. 레인 3(L3)은 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질(수프로(SUPRO®) 500E)을 함유한다. 레인 4(L4), 레인 5(L5), 레인 6(L6), 레인 7(L7) 및 레인 8(L8)은 가수분해도(DH)가 각각 0.3%, 2.2%, 3.1%, 4.0% 및 5.0%인 TL1 가수분해물을 함유한다. 레인 9(L9)는 단백질 MW 표준물을 함유하며, 킬로달톤(KD) 단위의 크기가 겔의 우측에 나타내어져 있다.
<도 2>
도 2는 숙달된 평가자가 평가한, 5.0% 고형분에서의 TL1 가수분해물 및 알칼라아제(ALCALASE®) 가수분해물의진단 점수를 제시한 것이다. 각각의 가수분해물의 아이덴티티(identity) 및 가수분해도(DH%)는 각 그래프 아래에 제시하였다. 양의 점수는 가수분해물이 대조군 샘플보다 더한 관능 속성을 가졌음을 나타내며, 음의 점수는 가수분해물이 대조군 샘플보다 덜한 관능 속성을 가짐을 나타낸다. 대조군 샘플은 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질이었다. (a)는 가수분해도가 약 2.5% DH 미만인 TL1 및 알칼라아제(ALC) 가수분해물에 대한 점수를 제시한 것이다. (b)는 가수분해도가 3% DH 초과인 TL1 및 알칼라아제(ALC) 가수분해물에 대한 점수를 제시한 것이다.
<도 3>
도 3은 알칼라아제 및 TL1 가수분해물의 용해도를 비교한다. 각각의 효소 및 가수분해도(DH%)는 각 튜브 아래에 제시하였다. (a)는 2주 동안 4℃에서 pH 7.0에서 보관된 알칼라아제(ALC) 및 TL1 가수분해물(2.5% 고형분)의 튜브를 제시한 것이다. (b)는 3주 동안 4℃에서 pH 8.2에서 보관된 TL1 및 알칼라아제(ALC) 가수분해물(2.5% 고형분)을 제시한 것이다.
<도 4>
도 4는 TL1 및 알칼라아제 가수분해물의 용해도 그래프를 제시한 것이다. 각각의 가수분해물(2.5% 고형분)의 가용성 고형분의 퍼센트(즉, 가용성 고형분 지수)는 pH의 함수로서 작도하였다. 각각의 가수분해물의 아이덴티티 및 가수분해도(DH%)는 각 그래프 아래에 제시하였다. (a)는 TL1 가수분해물에 대한 용해도 곡선을 제시한 것이다. (b)는 알칼라아제(ALC) 가수분해물에 대한 용해도 곡선을 제시한 것이다. (c)는 선택된 TL1 및 알칼라아제(ALC) 가수분해물의 용해도를 직접 비교한 것을 제시한 것이다.
<도 5>
도 5는 파일럿 플랜트(pilot plant) 규모에서 TL1을 가진 대두 단백질 물질의 가수분해를 예시한 것이다. TL1 가수분해물 및 대조군 샘플이 분리되어 있는, 쿠마시-염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 이미지를 제시하였다. 레인 1(L1)과 레인 3(L3)은 가수분해되지 않은 대두 단백질을 함유하며; 레인 2(L2)는 2.7% DH의 TL1 가수분해물을 함유하며; 레인 4(L4)는 가수분해된 대조군 샘플(효소의 혼합물을 이용하여 2.8%로 가수분해된 수프로 XT 219)을 함유하며; 레인 5 내지 레인 11(L5 내지 L11)은 각각 1.3, 2.0, 3.8, 0.3, 0.9, 1.6 및 5.2% DH를 갖는 TL1 가수분해물을 함유한다. 레인 12(L12)는 분자량 표준물을 함유하며, 킬로달톤(KD) 단위의 크기가 겔의 우측에 표시된다.
<도 6>
도 6은 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물 및 대조군 샘플의 용해도 그래프를 제시한 것이다. 각각의 가수분해물의 가수분해도(DH%)는 그래프 아래에 제시하였다.
<도 7>
도 7은 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물 및 대조군 샘플의 점도 그래프를 제시한 것이다. 각각의 가수분해물의 가수분해도(DH%)는 그래프 아래에 제시하였다.
<도 8>
도 8은 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물의 가수분해도의 함수로서, 점도 및 용해도(즉, 가용성 고형분 지수(SSI) 및 질소 가용성 지수(NSI))의 그래프를 제시한 것이다.
<도 9>
도 9는 향미 휘발물질(flavour volatile)의 수준이 대조군 샘플에 비하여 TL1 가수분해물에서 더 낮음을 예시한다. (a)는 대조군 샘플 및 상이한 가수분해도(DH%)를 갖는 TL1 가수분해물에서의 전체 활성 휘발물질 및 헥산알의 수준을 제시한 것이다. (b)는 대조군 샘플 및 상이한 가수분해도(DH%)를 갖는 TL1 가수분해물에서 표시된 향미 휘발물질의 수준을 제시한 것이다.
<도 10>
도 10은 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물 및 대조군 샘플의 진단 점수의 그래프를 제시한 것이다. 대조군 샘플은 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질이었다. 양의 점수는 가수분해물이 대조군 샘플보다 더한 관능 속성을 가졌음을 나타내며, 음의 점수는 가수분해물이 대조군 샘플보다 덜한 관능 속성을 가짐을 나타낸다. (a)는 대조군, 0.3% DH 및 1.6% DH 샘플에 대한 점수를 제시한다. (b)는 대조군, 1.3% DH 및 5.2% DH 샘플에 대한 점수를 제시한 것이다. (c)는 대조군, 2.7% DH 및 0.9% DH 샘플에 대한 점수를 제시한다. (d)는 대조군, 2.0% DH 및 3.8% DH 샘플에 대한 점수를 제시한 것이다.
<도 11>
도 11은 가수분해도(DH)의 함수로서 TL1 가수분해물의 관능 점수의 요약 그래프를 제시한 것이다. 전반적인 선호 점수를 위에 제시하였으며 쓴 맛(bitter) 점수를 아래에 제시하였다. 마름모는 예상 점수를 나타내고 사각형은 실제 점수를 나타낸다.
<도 12>
도 12는 몇몇 상이한 트립신-유사 프로테아제를 이용한 단리된 대두 단백질의 가수분해를 예시한 것이다. 가수분해되지 않은 대두 단백질과 효소-처리된 대두 단백질 샘플이 분리되어 있는, 쿠마시-염색된 SDS 폴리아크릴아미드 겔의 이미지를 제시하였다. 레인 1은 겔의 좌측에 나타낸 크기를 가진 분자량 마커를 함유한다. 레인 3 및 레인 9는 처리되지 않은 단리된 대두 단백질을 함유한다. 레인 2 및, 레인 4 내지 레인 8은 TL1, SP3, TL5, TL6, 돼지 트립신 및 소 트립신으로 각각 처리된 대두를 함유한다.
<도 13>
도 13은 pH의 함수로서 대두 단백질 및 유제품 단백질의 조합의 TL1 가수분해물의 용해도를 예시한 것이다.
<도 14>
도 14는 TL1에 의한 다른 식물 단백질 물질의 가수분해를 예시한 것이다. 미처리 및 처리 단백질 샘플이 분리되어 있는, 쿠마시-염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 이미지를 제시하였다. 레인 1(L1)은 분자량 마커(겔의 좌측에 KD 단위로 나타낸)를 함유한다. 레인 2(L2), 레인 4(L4) 및 레인 6(L6)은 각각 가수분해되지 않은 콘 배아(corn germ), 카놀라(canola) 및 밀 배아(wheat germ)의 샘플을 함유한다. 레인 3(L3), 레인 5(L5) 및 레인 7(L7)은 각각 콘 배아, 카놀라 및 밀 배아의 TL1 가수분해물을 함유한다.
<도 15>
도 15는 모두 유제품인(all-dairy) 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 XF8020으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체, 30%의 유제품 대체, 40%의 유제품 대체 및 50%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 아이스 크림에 대한 향미 프로파일을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 16>
도 16은 모두 유제품인 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 120으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체, 30%의 유제품 대체, 40%의 유제품 대체 및 50%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 아이스 크림에 대한 향미 프로파일을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 17>
도 17은 모두 유제품인 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 760으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체, 30%의 유제품 대체, 40%의 유제품 대체 및 50%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 아이스 크림에 대한 향미 프로파일을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 18>
도 18은 모두 유제품인 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 XF8020으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체 및 40%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 아이스 크림의 허용성을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 19>
도 19는 모두 유제품인 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 120으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체 및 40%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 아이스 크림의 허용성을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 20>
도 20은 모두 유제품인 대조군 아이스 크림과 비교하여, 수프로 760으로의 10%의 유제품 대체, 20%의 유제품 대체 및 40%의 유제품 대체를 포함하는 바닐라 착향 빙과의 허용성을 나타내는 막대 그래프이다.
<도 21>
도 21은 상업의 소이 딜리셔스 채소 빙과와 비교하여, 수프로 120, 수프로 XF 8020로의 100% 유제품 대체물이다.
본 발명은 단백질 가수분해물 조성물을 포함하는 빙과, 및 빙과의 제조방법을 제공한다. 빙과에 사용되는 단백질 가수분해물 조성물은 각각의 카복실 말단에 아르기닌 잔기 또는 라이신 잔기 중 어느 하나를 주로 갖는 폴리펩티드 단편의 혼합물로 구성된다. 본 발명의 빙과 제품은 단백질 가수분해물 조성물 외에, 임의로 유제품 단백질을 포함한다. 유리하게, 본 실시예에 예시된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 단백질 가수분해물 조성물을 함유하는 본 발명의 빙과 조성물은 상이한 대두 단백질을 함유하는 빙과 제품과 비교하여, 개선된 향미, 질감, 식감(mouth feel) 및 향을 갖는다.
(I) 빙과 조성물
본 발명의 일면은 100% 이하의 다양한 비의 대두 가수분해물의 유제품 단백질 및 대두 단백질 가수분해물 조성물의 혼합물을 포함하는 빙과 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 면은 단백질 가수분해물 조성물만을 포함하며, 유제품 단백질을 포함하지 않는 빙과 조성물을 제공한다. 단백질 가수분해물의 조성과 특성은 하기의 섹션 (I)A에 상술되어 있다. 다양한 비의 단백질 가수분해물 조성물을 포함하는 본 발명의 빙과 조성물은 일반적으로 100 퍼센트의 유제품을 포함하는 빙과를 기준으로 사용하여, 다른 대두 단백질로 구성된 빙과에 비해 개선된 향미와 질감 특징을 갖는다.
본 발명의 단백질 가수분해물은 100 퍼센트 유제품 단백질을 함유하는 빙과 제품과 비교하여, 제품이 동결될 때 상이한 얼음 결정을 형성한다. 또한, 단백질 가수분해물 조성물을 함유하는 빙과는 또한 더 많은 단백질 가수분해물이 제품에 첨가되는 경우, 동결 전에 더 높은 점도를 나타낸다. 더 높은 혼합물 점도는 더 효과적인 공기의 포집(trapping)을 야기할 수 있으며, 이는 동결 시간을 단축한다.
A. 단백질 가수분해물 조성물
단백질 출발 물질과 비교하여, 단백질 가수분해물 조성물은 다양한 길이와 분자량의 폴리펩티드 단편의 혼합물을 포함할 것이다. 각각의 펩티드 단편은 전형적으로 그의 카복실 말단에 아르기닌 또는 라이신 잔기 중 어느 하나를 가질 것이다(실시예 3, 4, 13 및 18에 나타낸 바와 같이). 폴리펩티드 단편은 크기가 약 75 달톤 내지 약 50,000 달톤, 또는 바람직하게는 약 150 달톤 내지 약 20,000 달톤의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 폴리펩티드 단편의 평균 분자 크기는 약 20,000 미만일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폴리펩티드 단편의 평균 분자 크기는 약 15,000 미만일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폴리펩티드 단편의 평균 분자 크기는 약 10,000 미만일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 폴리펩티드 단편의 평균 분자 크기는 약 5000 미만일 수 있다.
본 발명의 단백질 가수분해물 조성물의 가수분해도는 단백질 물질의 공급원, 사용되는 엔도펩티다아제 및 가수분해 반응의 완성도에 따라 달라질 수 있고, 달라질 것이다. 가수분해도(DH)는 시작점의 펩티드 결합 수에 대한 절단된 펩티드 결합의 퍼센트를 지칭한다. 예를 들어, 500개의 펩티드 결합을 포함하는 출발 단백질을 50개의 펩티드 결합이 절단될 때까지 가수분해한다면, 생성된 가수분해물의 DH는 10%이다. 실시예에 상술된 바와 같이, 트라이니트로벤젠 설포닉(TNBS: trinitrobenzene sulfonic) 비색법 또는 오르토-프탈다이알데히드(OPA: ortho-phthaldialdehye) 방법을 사용하여 가수분해도를 결정할 수 있다. 가수분해도가 높을수록 단백질 가수분해 정도가 커진다. 통상적으로, 단백질이 추가로 가수분해됨에 따라(즉, 가수분해도가 높을수록), 펩티드 단편의 분자량이 감소하며, 펩티드 프로파일이 이에 따라 변화하고, 혼합물의 점도가 감소한다. 전체 가수분해물(즉, 전체 분획)에서 DH를 측정하거나, 가수분해물의 가용성 분획(즉, 가수분해물을 약 500 내지 1000 x g에서 약 5분 내지 10분 동안 원심분리한 후의 상층액 분획)에서 DH를 측정할 수 있다.
일반적으로, 단백질 가수분해물의 가수분해도는 적어도 약 0.2%일 것이다. 일 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물의 가수분해도는 약 0.2% 내지 약 2%의 범위일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물의 가수분해도는 약 2% 내지 약 8%의 범위일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물의 가수분해도는 약 8% 내지 약 14%의 범위일 수 있다. 대안적인 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물의 가수분해도는 약 14% 내지 약 20%의 범위일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물의 가수분해도는 약 20% 초과일 수 있다.
단백질 가수분해물 조성물의 용해도는 출발 단백질 물질의 공급원, 사용되는 엔토펩티다제 및 조성물의 pH에 따라 달라질 수 있고, 달라질 것이다. 가용성 고형분 지수(SSI)는 단백질 가수분해물 조성물을 포함하는 고형분(즉, 폴리펩티드 단편)의 용해도의 척도이다. 원심분리(예를 들어, 약 5분 내지 10분 동안 약 500 내지 1000 x g) 이전 및 이후에 용액 내의 고형분의 양을 측정함으로써 가용성 고형분의 양을 추정할 수 있다. 대안적으로, 당업계에 주지된 기술(예를 들어, 바이신코닌산(BCA: bicinchoninic acid) 단백질 결정 비색 분석)을 사용하여 원심분리 이전 및 이후에 조성물 내의 단백질 양을 추정으로써 가용성 고형분의 양을 결정할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물은 가수분해도와 상관없이, 약 pH 6.0 초과의 pH에서 가용성 고형분 지수가 적어도 약 80%이다. 일 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 약 pH 6.0보다 큰 pH에서 가용성 고형분 지수가 약 80% 내지 약 85% 범위일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 약 pH 6.0 초과의 pH에서 가용성 고형분 지수가 약 85% 내지 약 90% 범위일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 약 6.0 초과의 pH에서 가용성 고형분 지수가 약 90% 내지 약 95% 범위일 수 있다. 또 다른 대안적인 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 약 6.0 초과의 pH에서 가용성 고형분 지수가 약 95% 내지 약 99% 범위일 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물의 용해도는 가수분해도의 함수에 따라 약 pH 4.0 내지 약 pH 5.0에서 변동될 수 있다. 예를 들어, 가수분해도가 약 3% 초과인 대두 단백질 가수분해물 조성물은 가수분해도가 약 3% 미만인 것보다 약 pH 4.0 내지 약 pH 5.0에서 더 가용성인 경향이 있다.
일반적으로 말하면, 가수분해도가 약 1% 내지 약 6%인 대두 단백질 가수분해물 조성물은 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0의 pH에서 안정하다. 안정성은 시간이 지남에 따른 침강 형성이 없음을 지칭한다. 단백질 가수분해물 조성물은 실온(즉, 약 23℃) 또는 냉장 온도(즉, 약 4℃)에서 보관할 수 있다. 한 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 약 1 주 내지 약 4 주 동안 안정할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 약 1 개월 내지 약 6 개월 동안 안정할 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 약 6 개월을 초과하여 안정할 수 있다.
단백질 가수분해물 조성물을 건조시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질 가수분해물 조성물을 분무건조시킬 수 있다. 분무 건조기 입구의 온도는 약 260℃(500℉) 내지 약 316℃(600℉)의 범위일 수 있으며, 배기 온도는 약 82℃(180℉) 내지 약 38℃(100℉)의 범위일 수 있다. 대안적으로, 단백질 가수분해물 조성물을 진공 건조시키거나, 동결 건조시키거나, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 건조시킬 수 있다.
단백질 가수분해물이 대두 단백질로부터 유래되는 실시형태에 있어서, 가수분해도는 약 0.2% 내지 약 14%, 더욱 바람직하게는 약 1% 내지 약 6% 범위일 수 있다. 실시예에 예시되는 바와 같이, 가수분해도는 전형적으로 형성되는 폴리펩티드 단편의 수 외에, 생성되는 대두 단백질 가수분해물 조성물의 물리적인 특성과 관능적 특성에 영향을 준다. 전형적으로, 가수분해도가 약 1%에서 약 6%로 증가함에 따라, 대두 단백질 가수분해물 조성물은 증가된 투명성 또는 반투명성 및, 감소된 그레인(grain) 및 대두/콩류 관능 속성을 갖는다. 또한, 대두 단백질 가수분해물 조성물은 가수분해도가 약 2% 미만인 경우에, 가수분해도가 약 2% 초과인 경우에 비하여, 실질적으로 덜 쓴 맛의 관능 속성을 갖는다. 달리 말하면, 더 높은 가수분해도는 그레인 및 대두/콩류 관능 속성을 감소시키고, 더 낮은 가수분해도는 쓴 맛의 관능 속성을 감소시킨다. 관능 속성 및 이들의 결정 방법은 실시예에 기재된다.
또한, 단백질 가수분해물이 대두로부터 유래되는 실시형태에 있어서, 대두 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 5-177 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 대두 단백질 가수분해물은 서열 번호 5-177 및 270-274로 이루어진 군에 상응하거나 이러한 군으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 대안적인 실시형태에 있어서, 대두 단백질 가수분해물은 서열 번호 5-177 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 10개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 대두 단백질 가수분해물은 서열 번호 5-177 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 20개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 대두 단백질 가수분해물은 서열 번호 5-177 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 40개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 대두 단백질 가수분해물은 서열 번호 5-177 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 80개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 대두 단백질 가수분해물은 서열 번호 5-177 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 120개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 대두 단백질 가수분해물은 서열 번호 5-177 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 178개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다.
단백질 가수분해물이 대두 단백질 및 유제품의 조합으로부터 유래되는 다른 실시형태에 있어서, 조합된 대두/유제품 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 5-197 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 조합된 대두/유제품 가수분해물은 서열 번호 5-197 및 270-274로 이루어진 군에 상응하거나 이러한 군으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 대안적인 실시형태에 있어서, 조합된 대두/유제품 가수분해물은 서열 번호 5-197 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 10개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 조합된 대두/유제품 가수분해물은 서열 번호 5-197 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 50개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 대안적인 실시형태에 있어서, 조합된 대두/유제품 가수분해물은 서열 번호 5-197 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 100개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 대안적인 실시형태에 있어서, 대두/유제품 가수분해물은 서열 번호 5-197 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 150개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 조합된 대두/유제품 가수분해물은 서열 번호 5-197 및 270-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 198개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다.
단백질 가수분해물이 카놀라(canola)로부터 유래되는 추가의 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 198-237로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 카놀라 가수분해물은 서열 번호 198-237로 이루어진 군에 상응하거나 이러한 군으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 대안적인 실시형태에 있어서, 카놀라 가수분해물은 서열 번호 198-237로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 10개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 카놀라 가수분해물은 서열 번호 198-237로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 약 20개의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 대안적인 실시형태에 있어서, 카놀라 가수분해물은 서열 번호 198-237로 이루어진 군에 상응하거나 이러한 군으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 39개의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
단백질 가수분해물이 옥수수로부터 유래되는 다른 추가의 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 238-261로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 옥수수 가수분해물은 서열 번호 238-261로 이루어진 군에 상응하거나 이러한 군으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 옥수수 가수분해물은 서열 번호 238-261로 이루어진 군에 상응하거나 이러한 군으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 10개의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 옥수수 가수분해물은 서열 번호 238-261로 이루어진 군에 상응하거나 이로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 24개의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
또한, 단백질 가수분해물이 밀로부터 유래되는 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 262-269로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 밀 가수분해물은 서열 번호 262-269로 이루어진 군에 상응하거나 이러한 군으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 밀 가수분해물은 서열 번호 262-269로 이루어진 군에 상응하거나 이러한 군으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 8개의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 대두 단백질 가수분해물 조성물, 대두/유제품 단백질 가수분해물 조성물, 카놀라 단백질 가수분해물 조성물, 옥수수 단백질 가수분해물 조성물, 또는 밀 단백질 가수분해물 조성물로부터 정제될 수 있는 임의의 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 전형적으로, 순수한 폴리펩티드 단편은 주어진 정제된 샘플 중의 총 폴리펩티드의 적어도 약 80 중량%, 바람직하게는 90 중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95 중량%를 구성한다. 폴리펩티드 단편은 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피 방법에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 단편은 서열 번호 5-274로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 본 발명은 서열 번호 5-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 단편과 실질적으로 서열이 유사한 폴리펩티드 단편도 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 폴리펩티드 단편은 서열 번호 5-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 단편과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 또는 89%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폴리펩티드 단편은 서열 번호 5-274로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 단편과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 폴리펩티드 단편이 본 발명의 서열과 특정 퍼센트의 서열 동일성을 공유하는지를 결정하는 방법은 상기에 제시되었다.
또한, 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물이 가수분해되지 않은(즉, 온전한(intact)) 단백질도 또한 포함할 수 있음이 구상된다. 가수분해되지 않은 단백질은 본질적으로 온전한 제조품(preparation)(이를 테면, 두부(soy curd), 콘 밀(corn meal), 밀크 등)에 존재할 수 있다. 또한, 가수분해되지 않은 단백질은 식물-유래의 단백질 공급원(예를 들어, 아마란스(amaranth), 애로루트(arrowroot), 보리, 메밀, 카놀라, 카사바, 찬나(channa)(병아리콩(garbanzo)), 콩류, 편두(lentil), 루핀, 옥수수, 기장(millet), 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 호밀, 수수(sorghum), 해바라기, 타피오카, 라이밀(triticale), 밀 등과 같은 공급원)으로부터 단리되거나 동물 단백질 물질(적합한 단리된 동물 단백질의 예에는 산 카세인(acid casein), 카세이네이트, 유장, 알부민, 젤라틴 등이 포함된다)로부터 단리될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 대두, 밀, 동물, 유제품, 난(egg) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가수분해되지 않은 단백질을 추가로 포함한다. 단백질 가수분해물 대 가수분해되지 않은 단백질의 상대비는 포함되는 단백질과 조성물의 목적 용도에 따라 달라질 수 있고, 달라질 것이다.
B. 단백질 가수분해물의 제조방법
각각의 카복실 말단에 아르기닌 잔기 또는 라이신 잔기를 주로 갖는 폴리펩티드 단편의 혼합물을 포함하는 단백질 가수분해물의 제조방법은 단백질 물질을 아르기닌 잔기 또는 라이신 잔기의 카복실 말단 측의 단백질 물질의 펩티드 결합을 특이적으로 절단하는 엔도펩티다아제와 접촉시켜, 단백질 가수분해물을 생성하는 단계를 포함한다. 단백질 가수분해물을 제조하는 데 사용되는 단백질 물질 또는 단백질 물질의 조합은 달라질 수 있으며, 달라질 것이다. 적합한 단백질 물질의 예는 후술된다.
(a) 대두 단백질 물질
일부 실시형태에서, 단백질 물질은 대두 단백질 물질일 수 있다. 다양한 대두 단백질 물질을 본 발명의 방법에 사용하여 단백질 가수분해물을 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 대두 단백질 물질은 당업계에 공지된 방법에 따라 전대두(whole soybean)로부터 유래될 수 있다. 전대두는 표준 대두(즉, 유전적으로 변형되지 않은 대두), 유전자 변형 대두(예를 들어, 변형된 오일을 갖는 대두, 변형된 탄수화물을 갖는 대두, 변형된 단백질 서브유닛을 갖는 대두 등) 및 이들의 조합일 수 있다. 대두 단백질 물질의 적합한 예는 대두 추출물, 대두유, 대두유 분말(soymilk powder), 두부, 대두 가루(soy flour), 대두 단백질 단리물(soy protein isolate), 대두 단백질 농축물(soy protein concentrate) 및 이들의 혼합물을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 방법에 사용되는 대두 단백질 물질은 대두 단백질 단리물(단리된 대두 단백질 또는 ISP라고도 지칭함)일 수 있다. 일반적으로, 대두 단백질 단리물은 무수(moisture-free) 기준으로 적어도 약 90% 대두 단백질의 단백질 함량을 가진다. 대두 단백질 단리물은 온전한 대두 단백질을 함유하거나 부분적으로 가수분해된 대두 단백질을 함유할 수 있다. 대두 단백질 단리물은 고함량의 저장 단백질 서브유닛, 예를 들어 7S, 11S, 2S 등을 가질 수 있다. 본 발명에서 시물질로 사용될 수 있는 대두 단백질 단리물의 비한정적인 예는, 예를 들어 솔래, 엘엘씨(Solae, LLC)(미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 상업적으로 이용가능하며, 이중에서 알파(ALPHA™) 5800, 수프로 120, 수프로 500E, 수프로 545, 수프로 620, 수프로 670, 수프로 760, 수프로 EX 33, 수프로 플러스(PLUS) 2600F, 수프로 플러스 2640DS, 수프로 플러스 2800, 수프로 플러스 3000, 수프로 XF 8020, 수프로 XF 8021 및 이들의 조합을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 대두 단백질 물질은 무수 기준으로 단백질 함량이 약 65% 내지 약 90% 미만인 대두 단백질 농축물일 수 있다. 본 발명에 유용한 적합한 대두 단백질 농축물의 예는 프로콘(PROCON™) 제품군, 알파 12 및 알파 5800을 포함하며, 이들 모두는 솔래, 엘엘씨로부터 상업적으로 이용가능하다. 대안적으로, 대두 단백질 물질의 공급원으로서 대두 단백질 단리물의 일부를 대체하기 위하여 대두 단백질 농축물을 대두 단백질 단리물과 블렌딩할 수 있다. 통상적으로, 만일 대두 단백질 농축물이 대두 단백질 단리물의 일부를 대체한다면, 대두 단백질 농축물은 많아야 대두 단백질 단리물의 최대 약 40 중량%를 대체하며, 더욱 바람직하게는 대두 단백질 단리물의 최대 약 30 중량%를 대체한다.
또 다른 실시형태에서, 대두 단백질 물질은 대두 가루일 수 있으며, 대두 가루는 무수 기준으로 약 49% 내지 약 65%의 단백질 함량을 갖는다. 대두 가루는 탈지 대두 가루, 부분 탈지 대두 가루, 또는 전지 대두 가루일 수 있다. 대두 가루는 대두 단백질 단리물 또는 대두 단백질 농축물과 블렌딩될 수 있다.
대안적인 실시형태에 있어서, 대두 단백질 물질은 원심분리기에서의 침강을 기준으로 4개의 주요 저장 단백질 분획 또는 서브유닛(15S, 11S, 7S 및 2S)으로 분리되는 물질일 수 있다. 일반적으로, 11S 분획에는 글리시닌이 매우 풍부하고 7S 분획에는 베타-콘글리시닌이 매우 풍부하다. 또 다른 실시형태에 있어서, 대두 단백질 물질은 고 올레산 대두로부터의 단백질일 수 있다.
(b) 다른 단백질 물질
다른 실시형태에 있어서, 단백질 물질은 대두 이외의 식물로부터 유래될 수 있다. 비한정적인 예로서, 적합한 식물은 아마란스, 애로루트, 보리, 메밀, 카놀라, 카사바, 찬나(병아리콩), 콩류, 편두, 루핀, 옥수수, 기장, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 호밀, 수수, 해바라기, 타피오카, 라이밀, 밀 및 이들의 혼합물을 포함한다. 특히 바람직한 식물성 단백질은 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀 및 이들의 조합을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 식물성 단백질 물질은 카놀라 곡분, 카놀라 단백질 단리물, 카놀라 단백질 농축물 또는 이들의 조합일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 식물성 단백질 물질은 옥수수 또는 콘(corn) 단백질 분말, 옥수수 또는 콘 단백질 농축물, 옥수수 또는 콘 단백질 단리물, 옥수수 또는 콘 배아, 옥수수 또는 콘 글루텐, 옥수수 또는 콘 글루텐 곡분, 옥수수 또는 콘 가루, 제인(zein) 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 식물성 단백질 물질은 보리 분말, 보리 단백질 농축물, 보리 단백질 단리물, 보리 곡분, 보리 가루 또는 이들의 조합일 수 있다. 대안적인 실시형태에 있어서, 식물성 단백질 물질은 루핀 가루, 루핀 단백질 단리물, 루핀 단백질 농축물 또는 이들의 조합일 수 있다. 또 다른 대안적인 실시형태에 있어서, 식물성 단백질 물질은 오트밀(oatmeal), 귀리 가루, 귀리 단백질 가루, 귀리 단백질 단리물, 귀리 단백질 농축물 또는 이들의 조합일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 식물성 단백질 물질은 완두콩 가루, 완두콩 단백질 단리물, 완두콩 단백질 농축물 또는 이들의 조합일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 식물성 단백질 물질은 감자 단백질 분말, 감자 단백질 단리물, 감자 단백질 농축물, 감자 가루 또는 이들의 조합일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 식물성 단백질 물질은 쌀 가루, 쌀 곡분, 쌀 단백질 분말, 쌀 단백질 단리물, 쌀 단백질 농축물 또는 이들의 조합일 수 있다. 또 다른 대안적인 실시형태에 있어서, 식물성 단백질 물질은 밀 단백질 분말, 밀 글루텐, 밀 배아, 밀 가루, 밀 단백질 단리물, 밀 단백질 농축물, 가용화된 밀 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 단백질 물질은 동물성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 동물성 단백질 물질은 난으로부터 유래될 수 있다. 적합한 난 단백질의 비한정적 예는 분말형 난, 건조 난 고형분, 건조 난백 단백질, 액상 난백 단백질, 난백 단백질 분말, 단리된 오브알부민 단백질 및 이들의 조합을 포함한다. 난 단백질은 닭, 오리, 거위, 메추라기, 또는 기타 조류의 난으로부터 유래될 수 있다. 대안적인 실시형태에 있어서, 단백질 물질은 유제품 공급원으로부터 유래될 수 있다. 적합한 유제품 단백질은 탈지 분유(non-fat dry milk powder), 유단백질 단리물, 유단백질 농축물, 산 카세인(acid casein), 카세이네이트(예를 들어, 카세인산나트륨, 카세인산칼슘 등), 유장 단백질 단리물, 유장 단백질 농축물 및 이들의 조합을 포함한다. 유단백질 물질은 젖소(cow), 염소, 양, 당나귀, 낙타, 카멜리드(camelid), 야크, 물소 등으로부터 유래될 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 단백질은 육상 또는 수생 동물의 근육, 기관, 결합 조직 또는 골격으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 동물성 단백질은 소 또는 다른 동물의 뼈, 결합 조직, 기관 등으로부터 추출되는 콜라겐의 부분적 가수분해에 의해 생산되는 젤라틴일 수 있다.
본 발명의 방법에는 또한, 대두 단백질 물질 및 적어도 하나의 다른 단백질 물질의 조합도 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 즉, 대두 단백질 물질 및 적어도 하나의 다른 단백질 물질의 조합으로부터 단백질 가수분해물 조성물을 제조할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 대두 단백질 물질, 및 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀, 동물성 물질, 유제품 및 난으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 다른 단백질 물질의 조합으로부터 제조될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 대두 단백질 물질, 및 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀, 동물성 물질, 유제품 및 난으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 다른 단백질 물질의 조합으로부터 제조될 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 대두 단백질 물질, 및 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀, 동물성 물질, 유제품 및 난으로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 이상의 다른 단백질 물질의 조합으로부터 제조될 수 있다.
조합되어 사용되는 대두 단백질 물질 및 다른 단백질 물질의 농도는 달라질 수 있고, 달라질 것이다. 대두 단백질 물질의 양은, 조합되어 사용되는 총 단백질의 약 1% 내지 약 99%의 범위일 수 있다. 한 실시형태에 있어서, 대두 단백질 물질의 양은, 조합되어 사용되는 총 단백질의 약 1% 내지 약 20%의 범위일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 대두 단백질 물질의 양은, 조합되어 사용되는 총 단백질의 약 20% 내지 약 40%의 범위일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 대두 단백질 물질의 양은, 조합되어 사용되는 총 단백질의 약 40% 내지 약 80%의 범위일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 대두 단백질 물질의 양은, 조합되어 사용되는 총 단백질의 약 80% 내지 약 99%의 범위일 수 있다. 마찬가지로, (적어도 하나의) 다른 단백질 물질의 양은, 조합하여 사용된 총 단백질의 약 1% 내지 약 99%의 범위일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 다른 단백질 물질의 양은, 조합되어 사용되는 총 단백질의 약 1% 내지 약 20%의 범위일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 다른 단백질 물질의 양은, 조합되어 사용되는 총 단백질의 약 20% 내지 약 40%의 범위일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 다른 단백질 물질의 양은, 조합되어 사용되는 총 단백질의 약 40% 내지 약 80%의 범위일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 다른 단백질 물질의 양은, 조합되어 사용되는 총 단백질의 약 80% 내지 약 99%의 범위일 수 있다.
(c) 단백질 슬러리
본 발명의 방법에서, 통상적으로 단백질 물질은 물에 혼합 또는 분산되어 약 1 중량% 내지 약 20 중량% 단백질을 함유하는 슬러리를 형성한다("있는 그대로"를 기준으로 함("as is" basis)). 한 실시형태에 있어서, 슬러리는 약 1 중량% 내지 약 5 중량% 단백질(있는 그대로)을 함유할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 슬러리는 약 6 중량% 내지 약 10 중량% 단백질(있는 그대로)을 함유할 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 슬러리는 약 11 중량% 내지 약 15 중량% 단백질(있는 그대로)을 함유할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 슬러리는 약 16 중량% 내지 약 20 중량% 단백질(있는 그대로)을 함유할 수 있다.
단백질 물질을 물에 분산시킨 후에, 단백질 물질의 슬러리를 약 70℃ 내지 약 90℃로 약 2 분 내지 약 20 분 동안 가열하여 추정상의 내인성 프로테아제 저해제를 비활성화시킬 수 있다. 가수분해 반응을 최적화하기 위하여, 특히 가수분해 반응에 사용되는 엔도펩티다아제가 그의 최적 활성 수준 부근에서 기능함을 보장하기 위하여, 통상적으로 단백질 슬러리의 pH 및 온도를 조정한다. 당업계에 일반적으로 공지된 방법에 따라 단백질 슬러리의 pH를 조정하고 모니터링할 수 있다. 단백질 슬러리의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 10.0으로 조정하고 유지할 수 있다. 한 실시형태에 있어서, 단백질 슬러리의 pH를 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0으로 조정하고 유지할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 단백질 슬러리의 pH를 약 pH 8.0 내지 약 pH 9.0으로 조정하고 유지할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 단백질 슬러리의 pH를 약 pH 8.0으로 조정하고 유지할 수 있다. 단백질 슬러리의 온도를 바람직하게는 해당 분야에 공지된 방법에 따라 가수분해 반응 중에 약 40℃ 내지 약 70℃로 조정하고 유지한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 단백질 슬러리의 온도를 가수분해 반응 중에 약 50℃ 내지 약 60℃로 조정하고 유지할 수 있다. 일반적으로, 이러한 범위 초과의 온도는 결국에는 엔도펩티다아제를 불활성화시키는 한편, 이 범위 미만 또는 초과의 온도는 엔도펩티다아제의 활성을 늦추는 경향이 있다.
(d) 엔도펩티다아제
가수분해 반응은 일반적으로 엔도펩티다아제를 단백질 물질의 슬러리에 첨가함으로써 개시된다. 몇 가지 엔도펩티다아제가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 바람직하게는, 엔도펩티다아제는 식품 등급 효소일 것이다. 엔도펩티다아제는 약 pH 6.0 내지 약 pH 11.0, 더욱 바람직하게는 약 pH 7.0 내지 약 pH 9.0 및 약 40℃ 내지 약 70℃, 더욱 바람직하게는 약 45℃ 내지 약 60℃의 온도의 가수분해 조건 하에서 최적 활성을 가질 수 있다.
일반적으로, 엔도펩티다아제는 S1 세린 프로테아제 패밀리(MEROPS 펩티다아제 데이터베이스, 릴리스(release) 8.00A; //merops.sanger.ac.uk)의 구성원일 것이다. 바람직하게는, 엔도펩티다아제는 아르기닌, 라이신, 또는 이들 둘 모두의 잔기의 카복실 말단 측의 펩티드 결합을 절단할 것이다. 따라서, 엔도펩티다아제는 아르기닌, 라이신, 또는 이들 둘 모두의 카복실 말단 측의 펩티드 결합을 절단하는 트립신-유사 엔도펩티다아제일 수 있다. 본 발명의 내용에서 트립신-유사 엔도펩티다아제는 트립신 비가 100 초과인 엔도펩티다아제로 정의될 수 있다(실시예 16 참고). 트립신-유사 엔도펩티다아제는 라이신 잔기의 카복실 말단 측의 펩티드 결합을 절단하는 라이실 엔도펩티다아제일 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 미생물 기원의 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 진균류 기원의 것일 수 있다. 트립신 및 트립신-유사 엔도펩티다아제는 다른 공급원(예를 들어, 동물 공급원)으로부터 입수가능하지만, 동물 공급원으로부터의 트립신은 실시예 14에 나타낸 바와 같이, 출발 단백질 물질을 절단하지 못할 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로부터의 트립신-유사 프로테아제일 수 있다(미국 특허 제5,288,627호; 미국 특허 제5,693,520호, 이들 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). 이 엔도펩티다아제는 "TL1"으로 불리며, 이의 단백질 서열(서열 번호 1)을 표 A에 제시하였다. TL1의 수탁 번호는 SWISSPROT 번호 P35049이며 그 MEROPS ID는 S01.103이다. 다른 실시 형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)로부터의 트립신-유사 프로테아제일 수 있다(그의 전문이 본 명세서에 포함되는 국제특허 출원 제WO2005/040372-A1호). 이 엔도펩티다아제는 "TL5"로 불리며, 이의 단백질 서열(서열 번호 2)을 표 A에 제시하였다. TL5의 수탁 번호는 GENESEQP: ADZ80577이다. 또 다른 실시 형태에서, 엔도펩티다아제는 푸사리움 추정종 솔라니(Fusarium cf. solani)로부터의 트립신-유사 프로테아제일 수 있다. 이 엔도펩티다아제는 "TL6 "으로 불리며 그 단백질 서열(서열 번호 3)을 표 A에 제시하였다. 추가 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 아크로모박터 라이티쿠스(Achromobacter lyticus)로부터의 라이실 엔도펩티다아제일 수 있다. 이 엔도펩티다아제는 "SP3 "으로 불리며 그 단백질 서열(서열 번호 4)을 표 A에 제시하였다. SP3의 수탁 번호는 SWISSPROT 번호 15636이며 SP3의 MEROPS ID는 S01.280이다. 예시적인 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 TL1일 수 있다.
[표 A]
또 다른 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 서열 번호 1, 2, 3, 4 또는 이들의 단편과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 또는 85% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 서열 번호 1, 2, 3, 4 또는 이들의 단편과 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 또는 92% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 서열 번호 1, 2, 3, 4 또는 이들의 단편과 적어도 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 프로테아제 활성을 갖는 이들 서열의 임의의 것의 단편은 예를 들어 가공 후의, 예를 들어 임의의 신호 펩티드 및/또는 프로펩티드(propeptide)가 절단된 후의 활성 효소의 아미노산 서열일 수 있다. 바람직한 단편은 서열 번호 1의 아미노산 25-248, 서열 번호 2의 아미노산 26-251, 서열 번호 3의 아미노산 18-250, 또는 서열 번호 4의 아미노산 21-653을 포함한다.
본 발명을 위하여, 2개 아미노산 서열의 정렬은 EMBOSS 패키지(Rice, P., Longden, I. and Bleasby, A. (2000) EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277; http://emboss.org) 버전 2.8.0의 니들 프로그램(Needle program)을 사용하여 결정할 수 있다. 니들 프로그램은 문헌[Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453]에 기술된 전체 정렬 알고리즘(global alignment algorithm)을 실행한다. 사용된 치환 행렬은 블로섬(BLOSUM)62이고, 갭 오프닝 페널티(gap opening penalty)는 10이며, 갭 연장 페널티(gap extension penalty)는 0.5이다. 일반적으로, 서열 동일성의 퍼센트는 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교창(comparison window)에서 비교함으로써 결정되며, 여기서 2개 서열의 최적 정렬을 위하여 비교창 내의 아미노산 서열의 일부는 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 2개 서열 모두에서 동일한 아미노산이 나타나는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 일치하는 위치의 수를 비교창의 2개 서열 중 짧은 서열 내의 위치 총수로 나눈 후, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 산출함으로써 퍼센트를 계산한다.
폴리펩티드의 기능에 영향을 주지 않으면서도 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 가진 다른 아미노산 잔기로 치환할 수 있음을, 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-포함 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-포함 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존성(conservative) 아미노산 치환 그룹은 하기의 것들을 포함한다: 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민. 따라서, 엔도펩티다아제는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4에 대해 적어도 하나의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4에 대해 약 50개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4에 대해 약 40개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4에 대해 약 30개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 대안적인 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4에 대해 약 20개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4에 대해 약 10개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4에 대해 약 5개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4에 대해 약 1개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다.
단백질 물질과 엔도펩티다아제의 다양한 조합을 표 B에 제시하였다.
[표 B]
단백질 물질에 첨가되는 엔도펩티다아제의 양은 단백질 물질의 공급원, 목적하는 가수분해도 및 가수분해 반응의 지속 기간에 따라 달라질 수 있고, 달라질 것이다. 엔도펩티다아제의 양은 단백질 물질 킬로그램당 약 1 ㎎의 효소 단백질 내지 약 5000 ㎎의 효소 단백질의 범위일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제의 양은 단백질 물질 킬로그램당 10 ㎎의 효소 단백질 내지 약 2000 ㎎의 효소 단백질의 범위일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 엔도펩티다아제의 양은 단백질 물질 킬로그램당 약 50 ㎎의 효소 단백질 내지 약 1000 ㎎의 효소 단백질의 범위일 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 가수분해 반응의 지속 기간은 달라질 수 있고, 달라질 것이다. 일반적으로, 가수분해 반응의 지속 기간은 수 분 내지 수 시간, 예를 들어 약 30 분 내지 약 48 시간의 범위일 수 있다. 가수분해 반응을 종결시키기 위하여, 엔도펩티다아제를 불활성화시키기에 충분히 높은 온도로 조성물을 가열할 수 있다. 예를 들어, 조성물을 대략 90℃의 온도로 가열하면 엔도펩티다아제가 실질적으로 열-불활성화(heat-inactivate)될 것이다.
(II) 단백질 가수분해물을 함유하는 빙과 제조
상기 (I)에 기재된 빙과는 (I)A에 기재된 단백질 가수분해물 조성물 중 임의의 것 및 임의의 식용 재료로 구성된다. 대안적으로, 빙과는 유제품 대신에 단백질 가수분해물 조성물 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 빙과는 식용 재료 및 본 명세서에 기재된 단리된 폴리펩티드 단편 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
A. 단백질 가수분해물 조성물의 함유물(inclusion)
빙과 중의 단백질 가수분해물의 농도는 만들어지는 제품에 따라 달라질 수 있고, 달라질 것이다. 높은 퍼센트의 유제품 단백질을 포함하는 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물의 퍼센트는 낮을 것이다. 반면, 첨가되는 유제품 단백질이 없는 실시형태에서는 다양한 빙과 중의 단백질 가수분해물의 퍼센트가 높을 것이다. 따라서, 다양한 빙과 중의 단백질 성분의 단백질 가수분해물의 농도는 약 1 중량%, 2 중량%, 5 중량%, 10 중량%, 15 중량%, 20 중량 %, 25 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 45 중량%, 50 중량%, 60 중량%, 65 중량%, 70 중량%, 75 중량%, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 및 100 중량% 미만일 수 있다.
식용 재료와 합하기 위한 특정 단백질 가수분해물 조성물의 선택은 목적하는 빙과 제품에 따라 달라질 수 있고, 달라질 것이다. 일부 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀, 동물, 난 또는 이들의 조합으로부터 유래될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 대두, 및 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀, 동물, 유제품 및 난으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다른 단백질 공급원의 조합으로부터 유래될 수 있다. 대안적인 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 상이한 단백질 가수분해물의 조합을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물은 서열 번호 5-274로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택되는 단리된 또는 합성 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
또한, 단백질 가수분해물 조성물의 가수분해도는 가수분해물을 제조하는 데 사용되는 출발 물질 및 목적하는 빙과에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 소정량의 대두-함유 단백질 가수분해물 조성물로 구성되는 아이스 크림에 가까운 빙과에 있어서, 쓴 맛 관능 속성을 최소화하는 것이 바람직할 수 있는 특정 실시형태에서, 가수분해도가 6%보다는 1%에 가깝거나 1% 미만인 대두 단백질 가수분해물 조성물이 선택될 수 있다. 또한, 대안적인 실시형태에 있어서, 빙과에서 그레인 및 대두/콩류 관능 속성을 최소화하는 것이 바람직할 수 있는 경우, 가수분해도가 1%보다는 6%에 가깝거나 6% 초과인 대두 단백질 가수분해물 조성물이 선택될 수 있다.
B. 임의의, 유제품과의 블렌딩
단백질 가수분해물 조성물은 임의로 유제품과 블렌딩될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 유제품의 농도는 약 95 중량%, 90 중량%, 80 중량%, 70 중량%, 60 중량% 또는 50 중량%일 수 있으며, 단백질 가수분해물의 농도는 약 5 중량%, 10 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 40 중량% 또는 50 중량%일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 유제품의 농도는 약 40 중량%, 30 중량%, 20 중량%, 10 중량%, 5 중량% 또는 0 중량%일 수 있으며, 단백질 가수분해물의 농도는 약 60 중량%, 70중량%, 80 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 100 중량%일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 유제품의 농도는 약 50 중량% 내지 약 95 중량% 범위일 수 있으며, 단백질 가수분해물의 농도는 약 5 중량% 내지 약 50 중량% 범위일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 유제품의 농도는 약 0 중량% 내지 약 50 중량% 범위일 수 있으며, 단백질 가수분해물의 농도는 약 50 중량% 내지 약 100 중량% 범위일 수 있다.
C. 빙과 제품으로의 가공
단백질 가수분해물을 함유하는 빙과 제품을 제조하는 데 사용되는 방법은 100 퍼센트 유제품을 갖는 빙과를 제조하는 데 사용되는 방법과 유사하다.
단백질 가수분해물을 함유하는 빙과는 다양한 형상을 갖는 다양한 빙과 제품으로 가공될 것이다. 제조되는 빙과는 산업에서 알려진 임의의 빙과 제품일 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 빙과는 아이스 크림이거나 아이스 크림과 유사할 수 있다. 빙과의 비제한적인 예에는 셔벗, 워터 아이스, 멜로린(mellorine), 냉동 요거트, 냉동 카스타드(frozen custard), 아이스캔디(popsicles), 소르벳(sorbet), 젤라토(gelato) 또는 이들의 조합이 포함된다. 빙과는 아이스 크림 샌드위치 또는 아이스 크림 콘으로서 웨이퍼(wafer), 쿠키 또는 콘(cone)과 같은 다른 식용 성분, 또는 썬대(sundae)로서 적절한 소스(캐러멜, 초콜릿 소스, 과일 소스 등)와 조합될 수 있다. 또한, 빙과는 식용 함유물(이를 테면, 초콜릿 칩, 과일 조각, 캔디, 케이크 조각, 브라우니 조각, 쿠키 도우(cookie dough), 쿠키 조각, 견과 등) 또는 비식용 함유물(아이스캔디 막대 등)을 포함할 수 있다. 또한, 빙과는 압출형(extruded) 형상으로 형성될 수도 있다.
일반적으로, 빙과 내의 식용 재료는 스킴 밀크, 환원 지방 밀크, 2% 밀크, 전유, 크림, 증발유, 요거트, 버터밀크, 분유, 탈지 분유, 유단백질, 산 카세인, 카세이네이트(예를 들어, 카세인산나트륨, 카세인산칼슘 등), 유장 단백질 농축물, 유장 단백질 단리물, 대두 단백질 단리물, 대두 단백질 가수분해물, 유장 가수분해물, 초콜릿, 코코아 분말, 커피, 차, 과일 주스, 야채 주스 및 산업에 공지되고 사용되는 임의의 기타 성분으로 구성된다. 빙과는 추가로 감미제(예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 말토덱스트린, 수크랄로스, 콘 시럽(액체 또는 고체), 꿀, 메이플 시럽 등), 착향제(예를 들어, 초콜릿, 초콜릿 추출물, 코코아, 바닐라 추출물, 퓨어 바닐라, 바닐린, 바닐라 향료, 엿기름 가루(malt powder), 과일 향료, 민트, 캐러멜, 녹차, 헤이즐넛, 생강, 코코넛, 피스타치오, 소금 등), 유화제 또는 증점제(예를 들어, 레시틴, 카라기난, 셀룰로오스 고무, 셀룰로오스 젤, 전분, 아라비아 고무, 잔탄 고무 및 산업에 공지되고 사용되는 임의의 기타 증점제); 안정제, 지질 물질(예를 들어, 카놀라유, 해바라기유, 고 올레익 해바라기유, 지방 분말 등), 방부제(예를 들어, 소르브산칼륨, 소르브산 및 산업에 공지되고 사용되는 임의의 기타 방부제), 산화방지제(예를 들어, 아스코르브산, 아스코르브산나트륨 등), 착색제, 비타민, 미네랄 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 빙과 제품은 아이스 크림과 유사할 수 있다. "아이스 크림" 제품은 블렌딩, 살균(pasteurization), 균질화, 냉각, 숙성, 동결, 포장 및 경화된 성분을 포함하는 모든 아이스 크림 제품에 통상적인 방법에 의해 형성될 수 있다. 착향제는 향료 탱크에서 살균 단계 후에 첨가될 수 있다. 성분은 액체 또는 건성 중 어느 하나, 또는 둘 모두의 조합일 수 있다. 제품은 회분식(batch)으로 또는 연속적 과정에 의해 제조될 수 있다. 블렌딩 온도는 성분의 성질에 좌우되나, 이는 임의의 지방의 용융점보다 더 높아야 하며, 안정제로서 사용되는 고무를 수화시키기에 충분해야 한다. 살균은 특히 본 명세서에 참고로 포함되는 FDA의 세균학 분석 지침서(FDA's Bacteriological Analytical Manual)에 기재된 바와 같이, 일반적으로 고온에서 단기간의 시간 동안 수행되며, 여기에서 균질기가 살균 시스템에 도입된다. -18℃(0℉) 이하의 저장-안정성 온도에서 유지하는 제품을 생산하고, 과정을 완성하기 위한 전형적인 산업 표준에 기초하여, 동결 및 포장이 사용될 수 있다.
본 발명의 빙과 조성물의 제조방법은 동결된 빙과를 살균 또는 멸균하기 위하여 열 처리를 추가로 포함할 수 있다. 살균은 당과(confection) 조성물이 동결되기 전에 수행된다. 살균은 일반적으로 약 68℃(155℉) 내지 약 132℃(270℉), 더욱 전형적으로 약 79℃(175℉) 내지 약 91℃(195℉)의 온도, 약 10.1 내지 약 1013.3 ㎪(약 0.1 내지 약 10 대기압) 및 더욱 전형적으로는 약 101.3 내지 약 152.0 ㎪(약 1 내지 약 1.5 대기압)의 압력에서, 약 3 초 내지 약 30 분, 더욱 전형적으로는 약 4 초 내지 약 25 초의 시간의 가열을 포함한다. 가열, 압력 및 시간 파라미터는 서로 독립적이다.
본 발명의 빙과 조성물의 제조방법은 이것이 동결 전에 당과 조성물을 균질화시켜, 빙과 조성물 내에 단백질이 균일하게 분산되는 것을 도와 주는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 빙과 조성물은 균질화를 위하여 통상 63℃(145℉) 내지 77℃(170℉)의 온도에 있다. 특별히, 이러한 균질화는 지방 드롭렛(fat droplet)의 크기를 더 작은 직경 또는 입자 크기로 줄임으로써 빙과 조성물이 더 균일한 지방 현탁물을 갖게 한다. 적합하게는, 동결 전에 빙과 조성물은 단일 단계 균질화 절차를 사용하여 약 70.3 ㎏/㎠(제곱인치당 약 1000 파운드) 내지 약 281.3 ㎏/㎠(제곱인치당 약 4000 파운드)의 높은 전단 혼합에서, 고속으로 균질화될 수 있다. 대안적으로, 다단계 균질화 절차가 또한 사용될 수 있으며, 여기에서 모든 단계의 총 압력은 약 70.3 ㎏/㎠(제곱인치당 약 1000 파운드) 내지 약 281.3 ㎏/㎠(제곱인치당 약 4000 파운드)이다. 예를 들어, 2단계 절차에 있어서, 제1균질화 단계는 약 140.7 ㎏/㎠(제곱인치당 약 2000 파운드) 내지 약 211.0 ㎏/㎠(제곱인치당 약 3,000 파운드)이며, 제2균질화 단계는 약 17.6 ㎏/㎠(제곱인치당 약 250 파운드) 내지 약 52.7 ㎏/㎠(제곱인치당 약 750 파운드)이다.
살균 및 균질화 절차는 서로 독립적으로 수행되거나 순차적으로 수행될 수 있으며, 즉, 살균이 먼저 수행되고 이어서 균질화가 수행되면서, 살균 및 균질화 절차 둘 모두가 사용된다. 단독으로 사용되는 경우의 살균 및 균질화에 대한 파라미터는 둘 모두가 사용되는 경우의 파라미터와 동일하다.
본 명세서에 기재된 단백질 가수분해물 조성물을 사용하여 빙과 제품 내의 다른 단백질 공급원을 대체하는 경우, 바람직한 단백질 대체량은 최대 100%이다. 본 명세서에 기재된 단백질 가수분해물 조성물을 사용하여 빙과 내의 유제품 단백질을 부분적으로 대체하는 경우, 바람직한 단백질 대체량은 20-35%이고, 가장 바람직한 단백질 대체량은 30%이다.
정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위하여 몇 가지 용어를 하기와 같이 정의한다.
용어 "빙과"는 밀크, 감미료, 안정제, 유화제, 착색제 및 착향제를 포함하나 이에 한정되지 않는 안전하고 적합한 성분의 조합의 동결 혼합물을 광범위하게 지칭한다. 난 제품 및 전분 가수분해물과 같은 기타 성분도 또한 포함될 수 있다. 특정 빙과는 아이스 크림 및 이의 저지방 종류, 냉동 카스타드, 멜로린(식물성 지방을 포함하는 냉동 디저트), 셔벗 및 워터 아이스를 포함한다. 이들 제품의 일부는 연질 동결 또는 경질 동결 형태 중 하나로 제공된다. 또한, 유제품이 안전하고 적합한 성분으로 대체되는 것을 제외하고, 아이스 크림 및 이의 다양한 형태와 유사한 파레빈(parevine)-형 제품(비유제품 냉동 디저트)이 빙과로 포함될 것이다.
용어 "가수분해도"는 절단되는 전체 펩티드 결합의 퍼센트를 지칭한다.
용어 "엔도펩티다아제"는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 사슬의 내부 펩티드 결합을 가수분해하는 효소를 지칭한다. 엔도펩티다아제의 그룹은 효소 서브클래스 EC 3.4.21-25(국제 생화학 및 분자생물학연맹(International Union of Biochemistry and Molecular Biology) 효소 분류 시스템)를 포함한다.
"식품 등급 효소"는 일반적으로 안전한 물질로 승인되고(GRAS: generally recognized as safe), 인간과 같은 유기체가 섭취할 경우에 안전한 효소이다. 통상적으로, 효소 및 그 효소가 유래될 수 있는 제품은 적용가능한 법률 및 규제 지침에 따라 생산된다.
"가수분해물"은 물의 효과를 통해 화합물이 절단되는 경우에 얻어지는 반응 산물이다. 단백질 가수분해물은 열적, 화학적 또는 효소적 분해 후에 생성된다. 반응 중에, 큰 분자는 더 작은 단백질, 가용성 단백질, 펩티드 단편 및 유리 아미노산으로 분해된다.
"그레인 ", "대두/콩류", 또는 "쓴 맛"과 같은 용어를 기재하는 데 사용되는 것과 같은 용어 "관능 특징"은 실시예 6에 특이적으로 기술되는 바와 같은 SQS 스코어링(Scoring) 시스템에 따라 결정된다.
용어 "가용성 고형분 지수"는 가용성 단백질 또는 가용성 고형분의 퍼센트를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "대두 단백질 단리물" 또는 "단리된 대두 단백질"은, 무수 기준으로 적어도 약 90% 대두 단백질의 단백질 함량을 가진 대두 물질을 지칭한다. 대두 단백질 단리물은 대두의 깍지와 배(germ)를 자엽으로부터 제거하고, 자엽을 플레이크화하거나 분쇄하고 플레이크화되거나 분쇄된 자엽으로부터 오일을 제거하고, 대두 단백질과 자엽의 탄수화물을 자엽 섬유로부터 분리하고, 그 후 탄수화물로부터 대두 단백질을 분리함으로써 대두로부터 형성된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "대두 단백질 농축물"은 무수 기준으로 약 65% 내지 약 90% 미만의 대두 단백질의 단백질 함량을 가진 대두 물질이다. 대두 단백질 농축물은 또한 대두 자엽 섬유, 통상적으로 무수 기준으로 약 3.5 중량% 내지 최대 약 20 중량%의 대두 자엽 섬유를 함유한다. 대두 단백질 농축물은 대두의 깍지와 배를 제거하고, 자엽을 플레이크화하거나 분쇄하고 플레이크화되거나 분쇄된 자엽으로부터 오일을 제거하고, 대두 단백질과 대두 자엽 섬유를 자엽의 가용성 탄수화물로부터 분리함으로써 대두로부터 형성된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대두 가루"는, 입자가 100번 메쉬(미국 표준) 스크린을 통과할 수 있는 크기를 가진 탈지, 부분 탈지 또는 전지 대두 물질의 세분 형태를 지칭한다. 대두의 케이크, 칩, 플레이크, 곡분 또는 물질의 혼합물은 종래의 대두 분쇄 공정을 이용하여 대두 가루로 세분화된다. 대두 가루는 무수 기준으로 약 49% 내지 약 65%의 대두 단백질 함량을 가진다. 바람직하게는 가루가 매우 미세하게 분쇄되며, 가장 바람직하게는 가루의 약 1% 미만이 300 메시(미국 표준) 스크린에 보유되도록 분쇄된다.
본 명세서에 사용되는, 용어 "대두 자엽 섬유"는 적어도 약 70%의 식이 섬유를 함유한 대두 자엽의 다당류 부분을 지칭한다. 대두 자엽 섬유는 통상적으로 일부 소량의 대두 단백질을 함유하지만, 또한 100% 섬유일 수도 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 대두 자엽 섬유는 대두 깍지 섬유를 지칭하는 것도 아니며 그를 포함하는 것도 아니다. 일반적으로, 대두 자엽 섬유는 대두의 깍지와 배를 제거하고, 자엽을 플레이크화하거나 분쇄하고 플레이크화되거나 분쇄된 자엽으로부터 오일을 제거하고, 대두 물질과 자엽의 탄수화물로부터 대두 자엽 섬유를 분리함으로써 대두로부터 형성된다.
"트립신-유사 세린 프로테아제"는 바람직하게는 아르기닌 잔기 또는 라이신 잔기의 카복실 말단 측의 펩티드 결합을 절단하는 효소이다.
본 발명 또는 그의 바람직한 실시형태(들)의 요소를 도입하는 경우, 관사("a", "an", "the") 및 "상기"는 하나 이상의 요소들이 있음을 의미하는 것으로 의도된다 "포함하는", "구비하는" 및 "갖는"이라는 용어들은 포괄적인 것으로 열거된 요소들 이외에 부가적인 요소들이 있을 수 있음을 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명의 범위를 이탈하지 않으면서도 상기 화합물, 제품 및 방법에 다양한 변화가 이루어질 수 있으므로, 상기 명세서 및 하기에 제공되는 실시예에 포함된 모든 사항은 제한적 의미가 아닌 예시적인 것으로 해석되어야 함이 의도된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실시형태를 예시한다.
실시예
1. 트립신 유사
엔도펩티다아제
,
TL1
을 사용하는,
단리된
대두 단백질의 가수분해.
단리된 대두 단백질은 그의 용해도를 증가시키고, 그의 관능 특징을 개선하기 위한 시도로, 더 작은 펩티드 단편으로 가수분해된다. 서열이 본 출원의 서열 번호 1에 제시되는, 푸사리움 옥시스포룸으로부터의 진균류 트립신-유사 펩티다아제인 TL1은 이것이 아르기닌 또는 라이신 잔기의 C-말단 측에서 펩티드 결합을 절단하기 때문에 선택되는 한편, 다른 펩티다아제는 대두 단백질 중의 펩티드 결합을 무작위로 절단하는 것으로 보인다.
거품 생성(foaming)을 줄이기 위하여 적당한 혼합을 사용하여 320 g의 수프로 500E(솔래(미주리주 세인트 루이스 소재))를 3680 g의 물 중에 분산시킴으로써, 단리된 대두 단백질(ISP)의 8% 슬러리를 제조하였다. 필요에 따라, 2 방울의 소포제를 첨가하였다. 용액을 5분 동안 80℃로 가열하여, 존재할 수 있는 임의의 세린 프로테아제 억제제를 불활성화시켰다. 혼합물을 50℃로 냉각시키고, 식품 등급의 KOH(50 중량/중량% 용액)를 사용하여 pH를 8.0으로 조정하였다. 8% 대두 단백질 슬러리의 분취물(800 ㎖)을 대두 단백질 ㎏당 0, 75 ㎎, 350 ㎎, 650 ㎎, 또는 950 ㎎의 TL1의 존재 하에서, 50℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 5분 동안 85℃로 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 샘플을 얼음에서 냉각시키고 4℃에서 보관하였다.
가수분해도(DH%)는 가수분해된 특정 펩티드 결합(즉, 출발 단백질에 존재하는 펩티드 결합의 총수로부터의 절단된 수)의 퍼센트를 지칭한다. DH%는 트라이니트로벤젠 설폰산(TNBS) 방법을 이용하여 추산하였다. 이 절차는 식품 단백질 가수분해물의 가수분해도를 결정함에 있어서 정확하고, 재현가능하며, 일반적으로 적용가능한 절차이다. 이를 위하여, 0.1 g의 대두 단백질 가수분해물을 100 ㎖의 0.025 N NaOH에 용해시켰다. 가수분해물 용액의 분취물(2.0 ㎖)을 8 ㎖의 0.05 M 소듐 보레이트 완충액(pH 9.5)과 혼합하였다. 2 ㎖의 완충된 가수분해물 용액을 0.20 ㎖의 10% 트라이니트로벤젠 설폰산으로 처리한 후, 실온에서 15 분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. 4 ㎖의 0.1 M 소듐 설파이트-0.1 M 소듐 포스페이트 용액(1:99 비율)을 첨가하여 반응을 퀀칭(quenched)하고, 420 ㎚에서 흡광도를 판독하였다. 0.1 mM 글리신 용액을 표준으로 사용하였다. 하기 계산을 이용하여 글리신 표준 용액의 회수 퍼센트를 결정하였다: [(420 ㎚에서 글리신의 흡광도 - 420 ㎚에서 블랭크(blank)의 흡광도) × (100/0.710)]. 94% 이상의 값을 허용가능한 것으로 간주하였다.
표 1은 각 샘플의 평균 TNBS 값 및 DH%를 제시한 것이다. 가수분해는 약 6% DH에서 정체하기 시작하는 것으로 나타났으며, 이는 절단되는, 용이하게 이용가능한 아르기닌 및 라이신 부위의 수를 반영할 수 있다. 이 실험은 350 ㎎/㎏ 의 TL1을 이용한 한 시간 동안의 분해가 충분한 가수분해 생성물을 생성함을 시사한다.
[표 1]
실시예 2. TL1 가수분해물의 SDS-PAGE 분석
0.3%, 2.2%, 3.1%, 4.0% 및 5.0% DH를 갖는 TL1 가수분해물을 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 각각의 및 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질의 분취물을 표준 절차를 이용하여 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 이 분석은 대두 가수분해물 내의 폴리펩티드의 분자 크기와 출발 대두 단백질의 분자 크기의 비교를 가능하게 한다. 도 1은 쿠마시 염색된 겔의 이미지를 제시한 것이다. 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질은 약 5 kDa 내지 약 100 kDa 크기 범위의 폴리펩티드를 포함한다. 0.3% DH 가수분해물 내의 폴리펩티드의 크기 범위가 출발 물질의 크기 범위와 유사하지만, 이 가수분해물은 추가의 작은 폴리펩티드 단편을 함유하였다. 더 높은 DH%를 가진 가수분해물은 본질적으로 약 20 내지 30 kDa보다 더 큰 폴리펩티드가 결여되었으며, 모두 추가의 작은(< 5 kDa) 폴리펩티드를 가졌다. 2.2%, 3.1% 및 4.0% DH 가수분해물의 폴리펩티드 패턴은 상당히 유사하였다. 그러나, 5.0% DH 가수분해물은 다른 가수분해물보다 더 좁은 폴리펩티드 크기 범위(약 0.1 내지 20 kDa)를 가졌다. 특히, 7S 및 11S 서브유닛 밴드는 5.0% DH 가수분해물에 존재하지 않았다(도 1, 레인 8 참조).
실시예
3.
LC
-
MS
에 의한
TL1
가수분해물
내의 펩티드 단편의 분석.
실시예 1에서 제조된 TL1 가수분해물 내의 펩티드 단편을 액체 크로마토그래피 질량 분석법(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS)에 의해 확인하였다. 각각의 TL1 가수분해물 2 ㎎을 함유한 분취물을 유리 바이알에서 0.1% 포름산(1 ㎖)과 혼합하고 1 내지 2분 동안 와류(vortexing)시켜 LC-MS 분석을 위한 샘플을 제조하였다. 혼합물을 5분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하였다. 상층액의 분취물(25 ㎕)을 HP-1100 (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 휴렛 패커드(Hewlett Packard)) HPLC 기기 상의 C18 분석용 HPLC 컬럼(15 ㎝ × 2.1 ㎜ 내경, 5 ㎛; 디스커버리 바이오 와이드 포어(Discovery Bio Wide Pore), 수펠코(Supelco), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 내로 주입하였다. 용출 프로파일을 표 2에 나타내었다; 용매 A는 0.1% 포름산이었고; 용매 B는 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산이었으며, 유속은 0.19 ㎖/분이었고, 컬럼 온도조절장치의 온도는 25℃였다.
[표 2]
MS 분석을 위한 스플리터(splitter) 시스템을 사용하여 LC 용출액의 분취물(10 ㎕)을 ESI-MS 소스(source)에 전달하였다. 써모 피니간 LCQ-데카(Thermo Finnigan LCQDeca) 이온 트랩 질량 분광계를 이용하여 데이터 의존적 MS/MS 및 동적 배제 스캔 이벤트(dynamic exclusion scan event)를 가진 데이터 의존적 MS/MS로 펩티드를 분석하였다. 모세관 온도 225℃에서 양이온 모드로 ESI-MS를 수행하였으며, 전자분사 바늘(electrospray needle)은 전압 5.0 ㎸ 및 m/z 400-2000의 스캔 범위로 설정하였다. MS/MS 미가공(raw) 데이터를 시퀘스트(Sequest) 검색 엔진(바이오 웍스(BIOWORKS™) 소프트웨어, 펜실베니아주 피츠버그 소재의 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))으로 효소 검색 파라미터 없이 디콘볼루션시켰다(deconvoluted). 미국 국립보건원의 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 또는 스위스 생물정보학 연구소로부터의 Swiss-Prot과 같은 표준 데이터베이스를 검색함으로써 펩티드를 동정하였다.
펩티드를 표 3에 제시하였다. 거의 모든 펩티드 단편이 카복실 말단에서 아르기닌 또는 라이신을 가졌다(3개의 단편은 카복실 말단에서 글루타민을 가졌다). 약 2배 많은 단편이 라이신 잔기보다는 아르기닌 잔기로 종결되었다.
펩티드 단편의 동정으로, 베타-콘글리시닌의 알파-서브유닛, 베타-콘글리시닌의 베타-서브유닛, 글리시닌 서브유닛 G1, 글리시닌 서브유닛 G3 및 글리시닌 Gy4의 가수분해 생성물이 각 TL1 가수분해물에 존재함이 드러났다. 다수의 동일 펩티드 단편이 각 가수분해물에서 검출되었다. 5.8% DH 및 6.1% DH 가수분해물이 또한 P 24 올레오신 아이소형(isoform) A로부터의 단편을 함유하였다. 6.1% DH 가수분해물에는 추가의 단백질, 트립신 억제제 Kti3으로부터의 단편이 존재함이 드러났다.
[표 3]
실시예 4. MALDI-MS를 통한 높은 가수분해도를 가진 TL1 가수분해물 내의 펩티드 단편의 분석.
실시예 1에서 제조된 6.1% DH 대두 가수분해물 내의 펩티드 단편을 또한 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF/TOF-MS)에 의해 분석하였다. 최종 용출 단계를 약 50분으로 연장시켰으며 분획물을 1분 간격으로 바이오-라드(Bio-Rad) 분획물 수집기에서 수집한 것을 제외하고는, 실시예 3에 개시된 바와 같이 샘플을 제조하고 HPLC에 의해 분석하였다. 분획 번호 4 내지 48을 진백(Genevac) 증발기에서 30℃ 미만에서 완전히 증발시켰다.
이를 위해, 건조된 샘플을 50% 아세토니트릴 중의 1% 트라이플루오르아세트산(TFA)의 용액 200 ㎕에 용해시켰다. 각 샘플의 분취물(1.5 ㎕)을 1.5 ㎕의 MALDI 매트릭스 용액 (36% 메탄올 (v/v), 56% 아세토니트릴 (v/v) 및 8% 물 1㎖당 6.2 ㎎의 알파-시아노-4-하이드록시 신남산)과 혼합하였다. 샘플을 와류시키고, 원심분리하고, 1 ㎕를 MALDI 스테인레스 스틸 표적 플레이트에 스폿팅(spotted)하였다. 고품질 MS 스펙트럼을 가진 13개 샘플을 추가 정제 및 MS/MS 분석을 위해 선택하였다. 각 분획을 건조시키고 PCR 튜브 내에서 1% 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산 용액 10 ㎕에 재현탁시키고, 30초동안 와류시키고, 10초 동안 2000 rpm에서 원심분리하였다. 와류 및 스피닝(spinning)을 5회 반복하였다. 누팁(NuTip) (10 ㎕ 다공성 흑연 카본 SPE 팁)을 이용하여 펩티드 혼합물을 정제하였다. 사전 습윤시킨(60% 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산에 이어서 0.1% 포름산으로 평형화함) 팁을 이용하여 샘플을 함유한PCR 튜브로부터 펩티드를 추출하였다. 전체 샘플 용액을 팁 내로 흡인하고 다시 튜브 내로 방출하는 것을 총 50회 하였다. 그 다음, 샘플이 로딩된 팁을 0.1% 포름산 (10 ㎕)으로 5회 세정하였다(흡인하고 방출함). 마지막으로, 60% 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산 10 ㎕를 이용하여 팁으로부터 펩티드를 용출시켰다. 동일한 용매 혼합물 (10 ㎕)을 이용하여 용출 과정을 10회 반복하였다. 풀링된(pooled) 용출 샘플 용액을 고속 진공에서 건조시키고, 50% 아세토니트릴 중의 1% TFA의 용액 1.5 ㎕ 및 MALDI 매트릭스 용액 1.5 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 혼합물을 30초 동안 와류시키고, 2000 rpm에서 5초 동안 원심분리하고, 1 ㎕를 MALDI 표적 플레이트에 스폿팅하였다. MS 분석을 MALDI-TOF/TOF 기기(ABI-4700)에서 실시하였다. 이 기기는 ND:YAG(335 ㎚)를 구비하였으며 MS 및 MS/MS 모드 둘 모두에서 200 Hz의 반복 속도(repetition rate)로 작동시켰다. 데이터는 첫 번째 TOF에서 20 KeV 가속 에너지로 기록하였으며, 아인젤(Einzel) 렌즈에서의 전압을 6KeV로 설정하였다. MS/MS 데이터는 효소 검색 파라미터가 없는 마스콧트(MASCOT) 검색 엔진(매트릭스 사이언스(MATRIX SCIENCE))에 의해 디컨벌루션하였다. NCBI 또는 Swiss-Prot와 같은 표준 데이터베이스를 검색하여 펩티드를 동정하였다.
MALDI-MS에 의해 동정된 펩티드를 표 4에 제시하였다. LC-MS(ESI)로 동정되었던 동일한 펩티드 단편의 일부가 이분석에서 동정되었다. 예를 들어, 베타-콘글리시닌의 알파-서브유닛, 베타-콘글리시닌의 베타-서브유닛, 글리시닌 서브유닛 G1 및 글리시닌 Gy4의 단편이 분석 둘 모두에서 발견되었다. MALDI-MS 분석으로, 베타-콘글리시닌의 알파 프라임(prime) 서브유닛, 글리시닌 서브유닛 G2, 및 62 K 수크로오스-결합 단백질 전구체 및 종자 성숙 단백질(seed maturation protein) LEA4와 같은 추가 폴리펩티드의 단편을 검출하였다.
[표 4]
실시예 5. TL1 또는 알칼라아제를 이용한 단리된 대두 단백질의 가수분해.
단리된 대두 단백질을 TL1 또는 노보자임스(Novozymes)(덴마크 백스밸드)로부터 입수가능한 미생물 서브틸리신 프로테아제인 알칼라아제 2.4L로 가수분해하여, 상이한 가수분해물의 관능 속성과 기능성을 비교할 수 있었다. 72 g의 수프로 500E를 5분 동안 적당한 혼합을 이용하여 828 g의 수돗물에 블렌딩하여 8%의 단리된 대두 단백질 슬러리를 제조하였다. 소포제 두 방울을 첨가하였다. 슬러리의 pH를 2N KOH를 이용하여 8.0으로 조정하였다. 슬러리의 분취물(800 g)을 혼합하면서 50℃로 가열하였다. 다양한 양의 TL1 펩티다아제 또는 알칼라아제(ALC) 프로테아제를 첨가하여, 0%, 1%, 2%, 4% 및 6%의 목표 가수분해도를 성취하였다. 자동적정기(autotitrator)를 이용하여 반응물의 pH를 pH 8.0에서 일정하게 유지시켰다. 원하는 가수분해도를 생성하기 위하여 소정 기간 동안 50℃에서 인큐베이션한 후, 샘플을 5분 동안 85℃로 가열하여 효소를 불활성화시키고, 용액을 pH 7.0으로 조정하였다. 샘플을 얼음에서 냉각시키고 4℃에서 보관하였다. TNBS 방법(실시예 1에 개시됨)을 이용하여 가수분해도(DH%)를 결정하였다. 표 5는 첨가되는 효소의 양, 반응 시간, 반응 중에 pH를 적정하기 위하여 첨가되는 KOH의 부피, 평균 TNBS 값 및 DH%를 제시한 것이다.
[표 5]
실시예 6. TL1 및 알칼라아제 가수분해물의 관능 분석.
독점적인 관능 스크리닝법인 솔래 정성 스크리닝(Solae Qualitative Screening, SQS)법을 이용하여 실시예 5에서 제조된 TL1 및 알칼라아제 가수분해물의 향미 특징을 평가하였다. 이 방법은 시험 샘플과 대조군 샘플 사이의 직접 비교에 기초한 것이며, 이것은 정성적인 차이 및 지향성의 정량적 차이를 제공한다. 7명의 숙달된 평가자 패널에게 각 샘플의 분취물(5% 슬러리로 희석) 및 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질의 5% 슬러리인 대조군 샘플을 제공하였다. 각 용액의 pH를 식품 등급 인산으로 7.0으로 조정하였다.
평가 프로토콜은, 컵의 바닥이 테이블에 닿아있는 상태에서 컵을 3회 와류시키는 단계를 포함하였다. 샘플을 2 초 동안 정치시킨 후에, 각 평가자가 약 10 ㎖(2 티스픈)를 머금고, 그의/그녀의 입 안에서 10 초 동안 휘돌린 후에 뱉어내었다. 이어서 평가자는 표 6에 나타낸 척도에 따라 시험 샘플 및 대조군 샘플 사이의 상이점을 평가하였다.
[표 6]
표 7은 각 샘플의 평균 SQS 점수를 제시한 것이다. TL1 가수분해물은 일반적으로 대조군 샘플(미처리 단리 대두 단백질임)과 보통 상이한 것으로 평가되었다. 알칼라아제(ALC) 가수분해물은 대조군과 경미한 상이점으로부터 극심한 상이점을 갖는 것으로 평가되었다.
[표 7]
시험 샘플이 대조군 샘플과 상이한 것으로 평가되면(즉, 2, 3 또는 4의 SQS 점수를 가지면), 시험 샘플을 추가로 평가하여 시험 샘플이 대조군 샘플과 어떻게 상이한 지에 관한 진단적 정보를 얻었다. 따라서, 시험 샘플이 대조군 샘플에 비해 경미하게, 보통으로, 또는 극심하게 더한 속성을 가졌다면(표 8 참조), 각각 +1, +2, +3의 점수를 배정하였다. 마찬가지로, 시험 샘플이 대조군 샘플에 비해 경미하게, 보통으로, 또는 극심하게 덜한 속성을 가졌다면, 각각 -1, -2, -3의 점수를 배정하였다. 이 분석으로, 시험 샘플 및 대조군 샘플 사이의 지향성 정량적 상이점의 평가를 제공하였다.
[표 8]
유사한 DH 수준을 가진 가수분해물에 대한 9개 향미 속성의 지향성 상이점을 도 2a 및 2b에 제시하였다. 모든 DH 수준에서, TL1 가수분해물은 ALC 가수분해물에 비해 그레인 및 대두/콩류 속성에서 더 큰 감소를 가졌고 떫은 맛 및 쓴 맛에서 더 작은 증가를 가졌다. 가장 높은 DH% ALC 가수분해물은 대조군에 비해 특히 쓴 맛에서 큰 증가를 가졌다.
실시예
7.
TL1
및
알칼라아제
가수분해물의
용해도.
실시예 5에서 제조된 TL1 및 알칼라아제 가수분해물 각각의 용해도를 가수분해물을 2.5% 고형분으로 희석하고 이들을 1주일 동안 4℃에서 pH 7.0에서 보관함으로써 평가하였다. 샘플을 시각적으로 평가하였으며; 사진 이미지를 도 3a에 제시하였다. 모든 TL1 가수분해물은 침강이 거의 없었지만, 5.1% DH TL1 가수분해물은 또한 더 낮은 DH%를 가진 것에 비하여 투명성이 증가하였다. 대조적으로, 최고 DH%를 가진 ALC 가수분해물은 상당량의 침강이 있었다. 도 3b는 3주 동안 4℃에서 pH 8.2에서 보관한, 2.5% 고형분으로 희석된 6.1% DH TL1 가수 분해물 및 13.8% DH ALC 가수분해물의 튜브의 이미지를 제시한 것이다. TL1 가수분해물은 침강이 없었으며, 이는 상기 가수분해물이 4℃, pH 8.2에서 장시간 동안 안정했음을 나타내고, ALC 가수분해물은 침강이 있었다.
용해도에 대한 pH의 효과를 실시예 5에서 제조된 TL1 및 ALC 가수분해물 각각에서 시험하였다. 각각의 분취물을 pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, 또는 pH 9로 조정하였으며, 샘플을 10분 동안 500 x g에서 원심분리하였다. 원심분리 전의 용액 내의 고형분 물질의 양을 원심분리 후의 용액 내의 고형분 물질의 양과 비교하여 가용성 고형분 지수(SSI)를 얻었다. TL1 및 ALC 가수분해물의 가용성 고형분 %를 각각 도 4a와 4b에서 pH의 함수로서 제시하였다. 모든 용액이 약 pH 4 내지 pH 5의 pH 수준(즉, 대두 단백질의 등전점)에서 용해도가 감소되었으며, 더 낮은 pH 값에서는 용해도가 다소 증가되었다. 그러나, 더 높은 pH 값에서는, 모든 TL1 가수분해물은 pH 6.0 초과 수준에서 용해도가 뛰어났으나(도 4a), ALC 가수분해물 중 일부는 더 높은 pH 수준에서 용해도가 감소하였다(도 4b). 도 4c는 pH의 함수로서 낮은 그리고 높은 DH%에서의 TL1 및 ALC 가수분해물의 용해도의 직접 비교를 제시한 것이다.
실시예 8. TL1 가수분해물의 광투과율.
실시예 5에서 제조된 TL1 가수분해물의 일부의 투과율을 측정하였다. 이를 위해, 1% DH 및 5.1% DH TL1 가수분해물을 상이한 고형분 퍼센트로 제조하였다(즉, 0.5%, 1.0%, 1.5%. 2.0% 및 2.5%). 각 단백질 슬러리의 분취물을 터비스캔(TURBISCAN®) 랩 엑스퍼트 유닛(Lab Expert unit)(프랑스 르'유니온(l'Union) 소재의 포물랙션(Formulaction))에 두었으며 총 60초 동안 매초마다 투과율을 기록하였다. 표 9는 각 샘플의 평균 투과율 퍼센트를제시한 것이다. 5.1% DH TL1 가수분해물은 0.5% 고형분에서 37.4% 투과율을 가졌는데, 이는 0.5% 고형분에서의 1.0% DH 가수분해물에 대한 1.3% 투과율과 비교된다. 이들 데이터는 시각적으로 관찰된 것을 확인해 주는 것이다(도 3a 참조).
[표 9]
실시예
9.
TL1
또는 다른
엔도펩티다아제로
제조된 대두
가수분해물의
쓴 맛
분석.
단리된 대두 단백질을 본질적으로 실시예 1 및 실시예 5에서 기재된 바와 같이 TL1, 알칼라아제(ALC),또는 아크로모박터 라이티쿠스(SP3; 서열 번호 4)로부터의 라이실 엔도펩티다아제로 가수분해하였다. 효소 농도 및 반응 조건은 실시예 1에 개시된 TNBS법에 의해 결정할 때 약 5 내지 6%의 DH% 값을 제공하도록 선택하였다. 가수분해물을 실시예 6에 기재된 SQS법을 이용하여 쓴 맛에 중점을 둔 평가를 위하여 5명의 평가자 패널에게 제시하였다.
평균 SQS 점수 및 진단적 쓴 맛 점수를 표 10에 제시하였다. TL1 및 SP3 가수분해물은 대조군 샘플(가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질)과 약간 상이한 것으로 평가되었다. 마찬가지로, TL1 및 SP3 가수분해물은 대조군 샘플보다 약간 덜 쓴 것으로 평가되었다. 대조적으로, ALC 가수분해물은 대조군 샘플과 극심하게 상이하며 대조군 샘플보다 극심하게 더 쓴 것으로 평가되었다.
[표 10]
실시예 10. 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물의 물리적 특성.
대두의 TL1 가수분해물의 생성을 벤치 규모로부터 더 큰 파일럿 플랜트 규모로 규모를 키우고, 가수분해물의 관능 및 기능 특징을 분석하였다. 이를 위해 출발 물질은 대두 단백질 커드(curd)였다. 대두 단백질 커드 물질을 생성하기 위하여, 대두 플레이크, 대두 가루 또는 대두 그릿(grit)을 약 pH 6.5 내지 약 pH 10의 수성 용액으로 차례로 추출하여 섬유와 같은 불용성 물질로부터 상기 플레이크/가루/그릿 내의 단백질을 분리하였다. 낮은 수준의 아황산염을 플레이크 중량 기준으로 0.05 내지 0.15%로 추출 매질에 첨가하였다. 플레이크, 가루, 또는 그릿을 첫번째 추출을 위하여 약 pH 6.5 내지 7.0의 수산화나트륨 수용액으로 추출하고, 이어서 두번째 추출을 위하여 약 pH 8.5 내지 10의 용액으로 추출하였다. 물 대 대두 플레이크/가루/그릿 물질의 중량비는 약 8:1 내지 약 16:1이었다.
추출 후, 여과에 의해 또는 원심분리에 의해 추출물을 불용성 물질로부터 분리하였다. 이어서, 분리된 추출물의 pH를 적합한 산을 이용하여 대두 단백질의 등전점 주위(약 pH 4 내지 5, 또는 바람직하게는 pH 4.4 내지 4.6)로 조정하여 대두 단백질 커드를 침전시켜, 고창(flatulence)을 유도하는 올리고당 및 다른 수용성 탄수화물을 비롯한 대두 용해물질로부터 대두 단백질이 분리될 수 있도록 하였다. 적합한 식용 산은 염산, 황산, 질산 또는 아세트산을 포함한다. 침전된 단백질 물질(커드)을 원심분리에 의해 추출물(유장)로부터 분리하여 대두 단백질 커드 물질을 생성하였다. 분리된 대두 단백질 커드 물질을 약 5:1 내지 약 12:1의 물 대 단백질 물질의 중량비로 물을 사용하여 세정하여 잔류 용해물질을 제거하였다.
대두 단백질 커드 물질을 수산화나트륨 용액 또는 수산화칼륨 용액과 같은 수성 알칼리 용액 또는 수성 알칼리 토류 용액을 이용하여, 약 pH 8.0 내지 약 pH 9.0, 바람직하게는 약 pH 8.0 내지 8.5로 먼저 중화시켰다. 중화된 대두 단백질 커드를 바람직하게는 제트 쿠킹(jet cooking) 및 플래시 냉각(flash cooling)에 의해, 가열 및 냉각시켰다. 이어서, 대두 단백질 물질을 대두 단백질 물질을 가수분해하기에 효과적인 온도에서 그리고 그에 효과적인 시간 동안 TL1 효소로 처리하여 대두 단백질 가수분해물이 약 35 내지 55의 TNBS 값을 갖도록 하였다. 효소를 단백질 커드 중량 기준으로 0.005% 내지 0.02% 효소 단백질의 농도로 대두 단백질 물질에 첨가하였다. 효소를 40℃ 내지 60℃, 바람직하게는 약 50℃의 온도에서 30분 내지 120분, 바람직하게는 50분 내지 70분의 기간 동안 대두 단백질 커드 물질과 접촉시켜 단백질을 가수분해하였다. 가수분해는 가수분해된 대두 단백질 물질을, 효소를 불활성화시키기에 효과적인 온도로 가열하여 종결시켰다. 가장 바람직하게는, 가수분해된 대두 단백질 커드 물질을 상기에 설명한 바와 같이, 제트 쿠킹하여 효소를 불활성화시키고, 플래시 냉각하고 이어서 분무-건조하였다.
표 11은 전형적인 가수분해물 세트에 대한 반응 파라미터를 제시한 것이다. 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 TNBS법을 이용하여 가수분해도를 결정하였다. 각 샘플의 TNBS 값 및 DH%를 또한 표 11에 제시하였다. 대조군 샘플에는 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질(즉, 수프로 500E) 및 본질적으로 구매가능한 대두 단백질 가수분해물(즉, 효소 혼합물로 2.8% DH로 가수분해된 수프로 XT 219)을 포함시켰다.
[표 11]
TL1 가수분해물 및 대조군 샘플을 표준 절차를 이용하여 SDS PAGE에 의해 분석하였으며, 도 5는 겔의 이미지를 제시한 것이다. 이 분석으로, 모든 주요 대두 저장 단백질 서브유닛이 TL1에 의해 절단되었음이 드러났다.
실시예 11. 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물의 용해도 및 점도.
실시예 10에서 제조된 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물 및 대조군 샘플의 용해도를 또한 시험하였다. 각 샘플의 분취물을 pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 및 pH 9로 조정하였으며 가용성 고형분 지수(SSI)를 본질적으로 실시예 7에 개시된 바와 같이 결정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 모든 TL1 가수분해물 샘플이 pH 6 이상의 pH 수준에서 거의 100% 가용성이었으며, 가수분해된 대조군 샘플은 pH 6에서 단지 약 40% 가용성이었다. 더욱이, 가수분해도가 증가함에 따라 등전점(즉, pH 4 내지 5 근처)에서 용해도가 증가하였다.
몇몇의 TL1 가수분해물과 대조군 샘플의 점도를 다양한 고형분 퍼센트(즉, 12 내지 20% 고형분)에서 결정하였다. 작은 와링(Waring) 블렌더를 이용하여 70 g의 총 슬러리 함량으로 샘플을 분산시켰다. 샘플을 거품을 감소시키기 위하여 최소 전단을 이용하여 총 4분 동안 블렌딩하였다. 이어서, 작은 샘플 어댑터(sample adapter)와 스핀들(spindle) 18을 갖춘 브룩필드(Brookfield) 점도계를 이용하여 실온에서 샘플을 분석하였다. 각 샘플을 두벌로 제조하고 분석하였다. 도 7은 상이한 제제의 센티푸아즈(cP)단위의 점도 측정값을 작도한 것이다. 상품용 단리물은 10,000 cP보다 컸으며, 이것은 12% 고형분에서 브룩필드에 대해 너무 점성이었다. 이 분석으로, 가수분해도가 증가함에 따라 점도가 감소함이 드러났으며, 고형분 퍼센트가 증가함에 따라 점도가 증가함이 드러났다. 도 8은 점도 및 용해도 데이터를 요약한 것이다. 용해도는 가용성 고형분 지수(SSI) 및 질소 가용성 지수(NSI, 총 질소의 함수로서 수용성 질소의 퍼센트임)로 표현된다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 가수분해도가 증가함에 따라 점도는 감소하고 용해도는 증가하였다.
TL1 가수분해물 중 몇몇에 존재하는 향미 휘발물질의 양을 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질에 존재하는 양과 비교하였다. 표준 GC 기술을 이용하여 향미 휘발물질을 결정하였다. 헥산알, 헵탄알, 펩탄알, 3-옥텐-2-온 및 1-옥텐-3-올의 수준은 가수분해되지 않은 대두 단백질에 비하여 TL1 가수분해물에서 감소하였다(도 9a 및 도 9b).
실시예 12. 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물의 관능 분석.
실시예 10에서 제조된 파일럿 플랜트 TL1 가수분해물의 향미 프로파일은 본질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 SQS법을 이용하여 분석하였다. 11명 또는 12명의 숙달된 평가자 패널이 대조군 샘플(즉, 가수분해되지 않은 단리된 대두 단백질)과 비교하여, 가수분해물을 평가하였다. 표 12는 평균 SQS 점수를 제시한 것이며, 도 10a 내지 도 10d는 진단 점수의 그래프를 제시한 것이다. 일반적으로, TL1 가수분해물은 대조군 샘플에 비하여 약간 덜한 그레인 및 대두/콩류 속성 및 감소된 점도를 가졌지만, 특히 보다 높은 가수분해도(DH%)에서 증가된 쓴 맛 속성을 가졌다. 가수분해된 대조군 샘플(즉, 샘플 5-3)은 약간 감소된 그레인 속성을 가졌지만, 보통으로 증가된 쓴 맛 및 떫은 맛 속성을 가졌다. 따라서, 일반적으로 TL1 가수분해물은 가수분해된 대조군 샘플보다 약간 덜 쓴 맛으로 평가되었다.
[표 12]
도 11은 TL1 가수분해물의 관능 분석의 요약을 제시한 것이며, 여기서 핵심 관능 속성은 가수분해도의 함수로서 작도된다. 가수분해물의 전반적인 관능 점수는 가수분해도가 증가함에 따라 감소하였으며, 반면, 쓴 맛 점수는 가수분해도가 증가함에 따라 증가하였다. 약 2% 미만의 DH를 가진 가수분해물은 최소의 쓴 맛을 가지면서 최상의 향미를 갖는 것으로 나타났다.
실시예 13. 대두의 TL1 가수분해물 내의 펩티드 단편의 분석.
상이한 가수분해도를 가진 TL1 가수분해물 내의 펩티드를 Q-스타(Q-STAR®) XL MS(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드(Applied Biosystems Inc., ABI)) 및 LCQ-데카(Deca) MS(영국 허트포드셔 소재의 서모피니간(ThermoFinnigan))를 이용하여 LC-MS 분석에 의해 동정하였다.
약 (0.5 내지 2.0 ㎎)의 각 샘플을 50 mM 암모늄 바이카보네이트 0.5 ㎖ 중에 용해시켰다. 데이터-의존적 획득을 이용한 LC-MS/MS 분석(LC 유속은 180 nL/분이었음)을 위해 내경이 75 um인 컬럼에 5 ㎕를 주입하였다. C18 펩맵(PepMap)100 컬럼(디오넥스(Dionex))을 이용하는 LC 패킹즈 얼티밋(Packings Ultimate) 나노-LC/C18 펩맵 100 컬럼(디오넥스)을 이용하는 엑시젠트(Eksigent) 2D 나노-LC를 이용하여 나노-LC를 실시하였다. 용출 프로파일을 표 13에 제시하였다. 용매 A는 밀리큐(MilliQ) 물 중의 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산이었으며, 용매 B는 밀리큐 물 중의 95% 아세토니트릴, 0.075% 포름산이었다.
[표 13]
샘플 분석은 나노전기분무 소스(프로타나(Protana) XYZ 조작기)를 구비한 에이비아이 큐스타(ABI QSTAR®)XL 하이브리드 QTOF MS/MS 질량 분광계로 진행하였다. 2.5 ㎸에서 붕규산염 나노전기분무 니들(nanoelectrospray needle)로부터 양성 모드의 나노전기분무를 생성시켰다. 이 기기의 m/z 응답은 제조업자의 표준물로 매일 보정하였다. 하기 파라미터를 이용하여 애널리스트(Analyst) QS 소프트웨어에서 정보 의존적 데이터 획득(IDA) 특징을 이용하여 TOF 질량 스펙트럼과 생성물 이온 스펙트럼을 획득하였다: TOF MS와 MS/MS의 질량 범위는 각각 m/z 300-2000 및 70-2000이었다. 매초마다, TOF MS 전구체 이온 스펙트럼을 축적하였으며, 이어서 각각 3초 동안, 3개의 생성물 이온 스펙트럼을 축적하였다. TOF MS로부터 MS/MS로의 전환은 펩티드의 질량 범위 (m/z 300-2000), 전구체 전하 상태 (2-4) 및 이온 강도 (50 초과의 카운트)에 의해 촉발되었다. DP, DP2 및 FP 설정치는 각각 60, 10 및 230이었으며, 롤링 충돌 에너지(rolling collision energy)를 이용하였다.
애널리스트 QS 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템즈)를 이용하여 펩티드 전기분무 탠덤(tandem) 질량 스펙트럼을 처리하였다. 하기 제한사항을 갖고서 MASCOT 버전 1.9를 이용하여 NCBI 또는 Swiss-Prot와 같은 표준 데이터베이스를 검색함으로써 펩티드를 동정하였다: 최대 하나의 누락된 절단 부위를 가진 효소가 없음; MS 및 MS/MS 단편 이온에 대하여 각각 0.8/2.0 및 0.8 Da의 질량 허용오차. 선택된 전구체 이온의 전하 상태는 1-3이었다.
LCQ-데카 MS를 이용한 LC-MS 분석에 있어서, 1) 각각의 TL1 가수분해물 2 ㎎을 함유한 분취물을 유리 바이알에서 0.1% 포름산(1㎖)과 혼합하고, 1-2분 동안 와류시키고, 마이크로원심분리기에서 5분 동안 13,000 rpm에서 혼합물을 원심분리하거나; 또는 2) 각 TL1 가수분해물 3 ㎎을 함유한 분취물과 0.1% 포름산(300 uL)을 마이크로원심분리기용 튜브에서 혼합하고 1 내지 2분 동안 혼합물을 와류시켜 샘플을 제조하였다. 이어서, 펩티드 단리를 위하여 전체 혼합물을 사전-세정한 C18 팁(메릴랜드주 콜럼비아 소재의 글리겐 코포레이션(Glygen Corp.))으로 옮겼다. 60% 아세토니트릴(300 ㎕) 중의 0.1% 포름산으로 용출시켜 C18 팁을 세정하고 0.1% 포름산(600 ㎕)으로 평형화시켰다. 0.1% 포름산 분획으로 용출된 물질은 폐기하고 60% 아세토니트릴(600 ㎕) 중의 0.1% 포름산으로 펩티드를 용출시켰다. 용매 혼합물을 10분 동안 300℃에서 진벡 증발기에서 증발시켜 펩티드 용액의 총 부피를 200 ㎕로 감소시켰다. LC-MS 분석을 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 실시하였다.
표 14는 대두 단백질의 TL1 가수분해물에서 동정된 모든 펩티드를 제시한 것이다.
[표 14]
실시예 14. 다른 엔도펩티다아제를 이용한 대두 단백질의 가수분해.
단리된 대두 단백질을 상이한 엔도펩티다아제(예를 들어, SP3, 푸사리움 솔라니로부터의 트립신-유사 프로테아제(TL5: 서열 번호 2), 푸사리움 추정종 솔라니로부터의 트립신-유사 프로테아제(TL6: 서열 번호 3), 돼지 트립신, 또는 소 트립신)로 처리하여 다른 공급원으로부터의 트립신 또는 트립신-유사 프로테아제가 대두 단백질을 가수분해하기 위해 이용될 수 있는지를 결정하였다.
단리된 대두 단백질(즉, 수프로 500E)의 8% 슬러리를 제조하고, pH 8로 조정하고, 100 ㎎(프로테아제)/㎏(대두 단백질)의 최종 농도를 위해 엔도펩티다아제 중 하나와 혼합하였다. 프로테아제를 함유하지 않은 대조군 샘플을 포함시켰다. 슬러리를 혼합하면서 2시간 동안 50℃의 수조에서 인큐베이션하고, 이어서 프로테아제를 열-불활성화시켰다(30분 동안 80℃). 5% 대두 단백질의 최종 농도를 위해 탈이온수를 각 샘플에 첨가하였다.
가수분해도를 추산하기 위하여, 각 샘플 분취물을 4-20% 트리스-글리신 겔(미국 오하이오주 와즈워스 소재의 노벡스 인코포레이티드(Novex Inc.))에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, TL1, SP3, TL5, 및 TL6은 대두 단백질을 더 작은 폴리펩티드 단편으로 가수분해하였으며, 반면, 돼지 트립신 또는 소 트립신 중 어느 하나를 이용한 처리 후에는 대두 단백질의 가수분해가 거의 없거나 전혀 없었다(레인 7 및 8 참조). 돼지 및 소 트립신이 대두 단백질을 절단하지 못하는 것은 37℃와 50℃(pH 8에서) 둘 모두에서 관찰되었다.
실시예 15. 보우만-버크(Bowman-Birk) 억제제를 이용한 트립신-유사 프로테아제의 억제.
대두가 대두 물질의 생성 중에 열 처리를 견디는 활성 프로테아제 억제제를 함유하기 때문에, 돼지 및 소 트립신이 대두 단백질 물질을 가수분해할 수 없었을 수 있다. 이 가설을 시험하기 위하여, 프로테아제를 다양한 농도의 보우만-버크 억제제의 상업적 제제와 함께 인큐베이션하고 잔류 효소 활성을 측정하였다.
프로테아제를 분석 완충액 (0.1 M 트리스, 0.02% Brij 35, pH 8.0)을 사용하여 0.001 ㎎/㎖로 희석하고 다양한 농도의 보우만-버크 억제제 (카탈로그 번호 T-9777, 시그마-알드리치)와 마이크로타이터 플레이트의 웰(well)에서 혼합하였다. 플레이트를 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 0.6 ㎎/㎖의 기질, Boc-Val-Leu-Gly-Arg-p-니트로아닐리드(L-1205; 미국 펜실베니아주 프러시아 소재의 바켐 바이오사이언스즈(Bachem Biosciences))를 첨가하여 잔류 활성을 측정하였다. 흡광도를 실온에서 3분 동안 매 10초마다 405 ㎚에서 측정하였다. 405 ㎚에서 측정된 흡광도의 초기 기울기로부터 활성을 계산하였다. 억제제가 없는 웰에서의 활성과 비한 억제제가 있는 웰에서의 활성으로서 잔류 활성을 계산하였다.
표 15에 나타낸 바와 같이, 돼지 및 소 트립신은 미생물 프로테아제보다 낮은 농도의 보우만-버크 억제제에 의해 억제되었다. 따라서, 대두 물질은 동물-유래 트립신의 활성을 억제하는 화합물을 함유하는 것으로 보인다.
[표 15]
실시예 16. 트립신-유사 프로테아제의 트립신 비 및 동정.
트립신-유사 활성을 갖는 효소를 동정하기 위한 분석법을 개발하였다. 이를 위하여, 일반식 Suc-Ala-Ala-Pro-Xxx-pNA(바켐 바이오사이언스즈)를 가진 발색 기질을 이용하여 트립신-유사 활성을 측정하였으며, 상기 일반식에서 Xxx는 20개의 자연 아미노산 잔기 중 하나에 대한 3문자 약어이며 pNA는 파라-니트로아닐리드이다. 만일 엔도펩티다아제가 Xxx의 카복실 말단 측의 펩티드 결합을 절단하면, 파라-니트로아닐린이 유리되고, 본질적으로 실시예 15에 기재된 바와 같이 황색이 생성되어 측정되었다. 10가지의 pNA 기질을 이용하였으며, 여기서 Xxx는 Ala, Arg, Asp, Glu, Ile, Leu, Lys, Met, Phe 또는 Val이었다.
하기의 엔도펩티다아제를 시험하였다: 알칼라아제, SP3, TL1 및 돼지 트립신. 모든 효소를 크로마토그래피에 의해 고순도로 정제하였으며, 즉, 쿠마시 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 각 펩티다아제에 대해 단지 하나의 밴드만이 관찰되었다. 각 효소의 활성을 소정의 pH 값에서 측정하였으며, 여기에서 상기 활성은 Suc-Ala-Ala-Pro-Xxx-pNA 기질을 사용한 최적의 pH의 활성의 적어도 절반 값이었다. 이들 기질에 대하여, ALC의 최적의 pH는 pH 9였으며, 다른 세 펩티다아제의 최적의 pH는 pH 10이었다. 분석 완충액은 100 mM 숙신산, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KCl 및 0.01% 트리톤(Triton) X-100, pH 9.0이었다. 각 펩티다아제 희석액 20 ㎕(0.01% 트리톤 X-100에 희석됨)를 마이크로타이터 플레이트의 10개의 웰에 두었다. 10가지의 pNA 기질 중 하나의 200 ㎕를 각 웰에 첨가하여 분석을 시작하였다(50 ㎎을 1.0 ㎖ DMSO 중에 용해시키고 분석 완충액으로 90x 추가 희석하였다). OD405의 초기 증가를 펩티다아제 활성의 척도로서 모니터링하였다. 만일 선형 그래프가 4분간의 측정 시간 내에 성취되지 않으면, 펩티다아제를 추가로 희석하고 분석을 반복하였다.
트립신 비는, 8가지의 다른 기질 중 임의의 것이 갖는 최대 활성으로 나눈, Arg 또는 Lys 중 하나를 함유하는 기질이 갖는 최대 활성으로 계산하였다. 트립신-유사 엔도펩티다아제는 100보다 큰 트립신 비를 갖는 엔도펩티다아제로 정의되었다.
활성 수준은 최고 활성을 가진 Suc-Ala-Ala-Pro-Xxx-pNA 기질에 대한 활성과 비교한 활성으로서 표 16에 제시하였으며, 뿐만 아니라 트립신 비를 제시하였다. 분석이 pH 9에서 실시되었으며 시험된 펩티다아제 중 세 가지가 pH 9보다 큰 최적의 pH를 갖지만, pH 9에서 이들 세 펩티다아제의 활성은 최적의 pH에서의 활성의 절반보다 컸다. 따라서, 이 분석으로, 아크로모박터 라이티쿠스 프로테아제(SP3), 푸사리움 트립신-유사 프로테아제(TL1) 및 돼지 트립신이 트립신-유사 엔도펩티다아제인 반면, 알칼라아제(ALC)는 트립신-유사 엔도펩티다아제가 아님이 드러났다.
[표 16]
실시예 17. 대두 및 유제품 단백질의 조합물로부터 유래된 TL1 가수분해물.
단리된 대두 단백질과 단리된 유제품 단백질의 조합물을 TL1으로 상이한 가수분해도로 가수분해하여, 조합물의 기능적 특성과 관능 속성을 평가할 수 있었다.
단리된 대두 단백질(수프로 500E)과 카세인산나트륨(알라네이트(Alanate) 180, 뉴질랜드 웰링톤 소재의 NZMP 인코포레이티드(NZMP Inc.)/폰테라 협동 조합 리미티드(Fonterra Co-op Group Ltd.)의 50/50 혼합물을 적당한 혼합을 이용하여 물 중에 분산시켜 대두와 유제품 단백질의 5% 슬러리를 제조하였다. 혼합물을 80℃로 가열하고 5분 동안 유지하고, 50℃로 냉각하고, 1M NaOH를 이용하여 pH를 8.0으로 조정하였다. 슬러리 분취물을 중간 속도로 혼합하면서 50℃로 가열하고, 다양한 양의 TL1(온전한 단백질 ㎏당 약 17-600 ㎎의 효소 단백질)을 첨가하여 0, 2%, 4% 및 6%의 목표 DH% 값을 성취하였다. 원하는 가수분해도를 생성하기 위하여 소정 기간(약 60분) 동안 50℃에서 인큐베이션한 후, 샘플을 3분 동안 90℃로 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 샘플을 얼음에서 냉각시키고 4℃에서 보관하였다. TNBS법(실시예 1에 기재됨)을 이용하여 가수분해도(DH%)를 결정하였다.
용해도에 대한 pH의 영향을 대두/유제품 TL1 가수분해물 중 두 가지(즉, 4.3% DH 및 6.7% DH)에서 시험하였다. 각각의 분취물을 pH 5, pH 6, pH 7, 또는 pH 8로 조정하였으며, 샘플을 10분 동안 500 xg에서 원심분리하였다. 원심분리 전의 용액 중의 고형분 물질의 양을 원심분리 후의 용액 중의 고형분 물질의 양과 비교하여 가용성 고형분 지수(SSI)를 얻었으며, pH의 함수로서 가용성 고형분 %의 그래프를 도 13에 제시하였다. 두 용액 모두 약 pH 5의 pH 수준(즉, 대두 단백질의 등전점 부근)에서 용해도가 감소하였다. 그러나, 대두/유제품 TL1 가수분해물 둘 모두는 약 pH 6.0 이상의 수준에서 우수한 용해도를 가졌다.
실시예 18. 대두/유제품의 TL1 가수분해물 내의 펩티드 단편의 분석.
실시예 17에서 제조된 대두/유제품 TL1 가수분해물 내의 펩티드 단편을 상술한 방법을 이용하여(실시예 3, 실시예 4 및 실시예 13 참조), 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS)에 의해 동정하였다. 본 연구에서동정된 펩티드 단편의 서열을 표 17에 열거하였다. 4가지의 새로운 대두 유래 펩티드가 동정되었다(즉, 서열 번호 174, 175, 176 및 177). 유제품 유래 서열은 서열 번호 178-197이다.
[표 17]
실시예 19. 다른 단백질 물질로부터 유래된 TL1 가수분해물.
다양한 다른 식물 유래 단백질 물질을 TL1으로 처리하여 추가의 가수분해물을 생성하였다. 이들 가수분해물은 작은 규모(즉, 벤치 탑)로 생성하였다. 이를 위하여, 카놀라 밀 글루텐, 또는 콘 배아 단백질 중 하나의 5% 슬러리를 5분 동안 80℃ 초과 온도에서 변성시켰다. 단백질 슬러리를 수산화나트륨 용액 또는 수산화칼륨 용액과 같은 수성 알칼리 용액 또는 수성 알칼리 토류 용액을 이용하여, 약 pH 8.0 내지 8.5로 중화시켰다. 이어서 단백질 슬러리 각각을 단백질 물질을 가수분해하기에 충분한 시간 동안 및 그를 위한 충분한 온도에서 TL1 효소로 처리하였다. TL1 효소를 단백질 커드 중량 기준으로 0.01% 내지 0.08% 효소 단백질의 농도로 단백질 슬러리에 첨가하였다. 효소를 50분 내지 70분의 기간 동안 약 50℃의 온도에서 단백질 커드 물질과 접촉시켜 단백질을 가수분해시켰다. 가수분해 반응은 가수분해된 대두 단백질 물질을 효소를 효과적으로 불활성화시키는 온도에서 가열하여 종결시켰다.
표 18은 전형적인 가수분해물 세트에 대한 반응 파라미터를 제시하였다. TL1 효소의 활성은 아미노기 몰수에 기초하여 측정하였다. 증가된 TNBS 값은 효소 활성을 입증하는 것이다. 효소 활성은 각 단백질에 대해 최적화시키지 않지만, 단백질 물질의 현탁 또는 용해도에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다.
[표 18]
TL1 카놀라, 콘 또는 밀 가수분해물 및 가수분해되지 않은 대조군 샘플을 표준 절차를 이용하여 SDS PAGE에 의해 분석하였다. 도 14는 겔의 이미지를 제시한 것이다. 이 분석으로, 각 단백질 물질의 모든 주요 단백질 서브유닛이 TL1에 의해 절단되었음이 드러났다.
카놀라, 콘 또는 밀 TL1 가수분해물 내의 대표적인 펩티드는 상술한 절차를 이용하여 동정하였다. 표19, 표 20 및 표 21은 각각 카놀라, 콘, 및 밀의 TL1 가수분해물에서 동정된 대표적인 펩티드를 제시한 것이다.
[표 19]
[표 20]
[표 21]
실시예 20. 대두 가수분해물 및 온전한 유제품 단백질의 조합물의 관능 분석.
대두의 TL1 가수분해물을 온전한 유제품 단백질(즉, 카세이네이트 또는 유장)과 조합하였다. 대두 가수분해물과 온전한 유제품 단백질의 이들 조합물의 관능 프로파일을, 실시예 6에서 상술된 SQS법을 이용하여, 가수분해되지 않은(온전한) 대두 및 온전한 유제품 단백질의 조합물과 비교하였다. 약 2.1% DH의 가수분해도를 가진 TL1 대두 가수분해물을 5% 슬러리로 희석하였다. 가수분해되지 않은 대두 단백질을 또한 5% 슬러리로 희석하였다. 한 번의 시험을 위해, TL1 가수분해물을 카세인산나트륨과 혼합하고(1:1), 카세인산나트륨과 혼합된 가수분해되지 않은 대두 단백질(1:1)인 대조군 샘플에 대해 평가하였다. 두 번째 시험에서는, TL1 가수분해물을 감미 유제품 유장(sweet dairy whey)과 혼합하고(4:1), 감성 유장과 혼합된 가수분해되지 않은 대두 단백질(4:1)인 대조군 샘플에 대해 평가하였다.
표 22는 각 샘플의 평균 SQS 점수 및 진단 평가를 제시한 것이다. TL1 가수분해물을 포함하는 조합물은 일반적으로 대조군 샘플과 약간 상이한 것으로 평가되었다. 진단 점수는 TL1 가수분해물과 온전한 유제품 단백질의 조합물이 대조군 샘플(즉, 가수분해되지 않은 대두 및 온전한 유제품 단백질의 조합물)에 대하여 개선된 관능 특징을 가짐을 나타냈다.
[표 22]
실시예 21. 단백질 가수분해물(수프로 XF8020)을 포함하는 빙과의 분석.
아이스 크림과 유사한 냉동 디저트 제품을 TL1 대두 가수분해물, 수프로 XF8020를 다양한 대체 수준으로 사용하여 제조하였다. 먼저 인산염을 스테인리스 스틸 용기 내에서 물에 첨가하고, 38℃(100℉)로 가열함으로써, 각각의 "아이스 크림" 샘플을 형성하였다. 원하는 양의 단백질 가수분해물(수프로 XF8020)을 첨가하고, 프로펠러식 혼합기를 사용하여 성분을 중간의 속도로 5 내지 10분 동안 혼합하여, 단백질을 분산 및 수화시켰다. 단백질이 완전히 분산된 후에, 슬러리 온도를 82℃ (180℉)로 증가시키고, 슬러리를 저속으로 5분 동안 혼합하였다. 설탕 및 콘 시럽 고형분을 단백질 슬러리에 첨가하고, 중간의 속도로 3분 더 계속 혼합하였다. 그 다음, 헤비 크림 및 폴리소르베이트 60을 첨가하고, 성분이 완전히 분산될 때까지, 조합된 성분을 중간 속도에서 3분 내지 5분 동안 혼합하였다. 그 다음, 혼합물을 82℃(180℉)에서 30초의 지속 시간으로 살균하였다. 살균 후에, 혼합물을 제2단계에서는 3447 ㎪(500 psi); 제1단계에서는 17.2 ㎫(2500 psi)로 설정된 2단계의 단일 피스톤 균질기를 사용하여 균질화시켰다. 균질화 후에, 혼합물을 사전 멸균된 날진(Nalgene®) 병에 수집하고, 즉시 빙조에 두고, 30분 동안 유지시켰다. 냉장된 병을 2℃(35℉) 워크-인 쿨러(walk-in cooler)에 두고 밤새 보관하였다. 동결 전에, 바닐라 향료를 냉장된 혼합물과 블렌딩하였다. 그 다음, 착향된 혼합물을 테일러 뱃치(Taylor Batch) 아이스 크림 냉동고에 넣고, 7분에 걸쳐 혼합물을 동결시켜, -4℃(24℉) 내지 -3℃(26℉)의 온도에 도달시켰다. 혼합물을 냉동고에서 빼내고, 적절하게 표지된 1 파인트 스위트허트(Sweetheart) K16A 컵으로 포장하였다. 샘플 컵을 플라스틱 상자에서 엎어놓고, -29℃(-20℉)의 송풍 냉동고에 밤새 두고, 평가 시까지, 보관을 위하여 -18℃(0℉) 냉동고로 옮겼다.
표 23 내지 27은 10%, 20%, 30%, 40% 및 50%의 단백질 가수분해물 대체에서의 샘플의 제제를 나타낸 것이다.
[표 23]
[표 24]
[표 25]
[표 26]
[표 27]
관능 스펙트럼 서술적 프로파일링 방법(Sensory Spectrum Descriptive Profiling method)에 숙달된 7명의 패널이 샘플을 3중으로 평가하였다. 평가의 목적은 본 발명에 따라 제조되고 생산된 대두 단백질 "아이스 크림" 제품의 향미 특징을 100 퍼센트 유제품으로 제조된 바닐라 아이스 크림의 향미 특징과 비교하여 정량화시키는 것이었다. 19개의 향미 속성을 15-점 강도 척도로 평가하였으며, 각 샘플에서 없음/적용가능하지 않음에 대해서는 0이고, 매우 강함/높음에 대해서는 15였다. 샘플에서 시험한 향미 속성, 향미 속성의 정의 및 사용된 향미 강도 척도 참조 샘플을 표 28에 기재하였다.
[표 28]
표 29는 대조군(100% 유제품)과 비교하여, 5개의 샘플(10%, 20%, 30%, 40% 및 50%)에 대한 패널의 평균 강도 점수를 제시한 것이다.
[표 29]
도 15 및 표 29 둘 모두가 보여주는 바와 같이, 샘플 중의 대두 단백질의 존재는 대체 수준이 20% 이상이 될 때까지 검출되지 않았다. 심지어 샘플이 50%의 대두 단백질을 함유할 때조차도, 대두 향미의 강도는 15-점 척도에서 2.0 이하의 강도 수준으로 남아있다. 사실상, 밀키, 유지방, 캐러멜화 및 바닐라 복합물질 향은 모두 대두/콩류에 비해 강도가 더 세다. 또한, 100% 유제품에 비해 10% 대두 대체에서는 밀키 향의 약간의 감소만이 있었고, 10% 대두 대체에서 바닐라 복합물질 및 바닐라/바닐린 향미가 약간 증가하였으나, 대두 대체 수준이 20% 이상으로 증가됨에 따라 감소하였다.
도 17은 10%, 20% 및 40%의 대두 단백질 함유 수준에서, 바닐라 착향된 냉동 디저트를 시도하고자 채용된 35-54세의 74명의 개별 소비자 패널에 의해 평가된 대두 단백질 샘플의 허용성을 제시한 것이다. 샘플을 균형잡힌 순차적인 모나드(monadic) 방식으로 각 소비자에게 제시하였으며, 여기에서 각 샘플은 개별적으로 서빙하고, 다음 샘플을 평가하기 전에 치웠다. 표준 관능 시험 프로토콜에 맞게, 서빙 순서를 순환시키고, 균형을 이루게 하여, 서빙 순서 효과에 기인한 치우침을 최소화하였다.
도 17의 그래프가 예시하는 바와 같이, 10% 및 20% 대두 단백질 함유에서의 샘플 제품에 대한 평균의 전반적인 선호, 외양 선호, 향미 선호, 식감 선호 및 뒷맛 선호 반응은 모두 유제품인 아이스 크림 대조군 샘플의 것과 유사하였으나, 40% 함유에서 평균 선호 점수는 약간 감소하였다.
본 실시예는 유제품 대신 상당한 양의 대두 단백질 가수분해물을 함유하는 아이스 크림과 비슷한 빙과 제품이 바람직하게는 100 퍼센트 유제품을 함유하는 냉동 디저트 제품에 대한 대체의 냉동 디저트로 허용될 수 있음을 예시한다.
실시예 22. 수프로 120을 포함하는 빙과의 분석.
아이스 크림과 비슷한 냉동 디저트 제품은 다양한 대체 수준(10%, 20%, 30%, 40% 및 50%)으로 수프로 120을 사용하여 제조하였다. 먼저 스테인리스 스틸 용기 내에서 인산염을 물에 첨가하고, 38℃(100℉)로 가열함으로써 각각의 "아이스 크림" 샘플을 형성하였다. 원하는 양의 수프로 120을 첨가하고, 프로펠러식 혼합기를 사용하여 성분을 중간의 속도로 5 내지 10분 동안 혼합하여, 단백질을 분산 및 수화시켰다. 단백질이 완전히 분산된 후에, 슬러리 온도를 82℃(180℉)로 증가시키고, 슬러리를 저속으로 5분 동안 혼합하였다. 설탕 및 콘 시럽 고형분을 단백질 슬러리에 첨가하고, 중간의 속도로 3분 더 계속 혼합하였다. 헤비 크림 및 폴리소르베이트 60을 혼합물에 첨가하고, 성분이 완전히 분산될 때까지 조합한 성분을 중간 속도에서 3 내지 5분 동안 혼합하였다. 그 다음, 30초의 지속 시간을 가지고 혼합물을 82℃(180℉)에서 살균시켰다. 살균 후에, 혼합물을 제2단계에서는 3447 ㎪(500 psi); 제1단계에서는 17.2 ㎫(2500 psi)로 설정된 2단계의 단일 피스톤 균질기를 사용하여 균질화시켰다. 균질화 후에, 혼합물을 사전 멸균된 날진 병에 수집하고, 즉시 빙조에 두고, 30분 동안 유지시켰다. 냉장된 병을 2℃(35℉) 워크-인 쿨러에 두고 밤새 보관하였다. 동결 전에, 바닐라 향료를 냉장된 혼합물과 블렌딩하였다. 그 다음, 착향된 혼합물을 테일러 뱃치 아이스 크림 냉동고에 넣고, 7분에 걸쳐 혼합물을 냉동시켜, -4℃(24℉) 내지 -3℃(26℉)의 온도에 도달시켰다. 혼합물을 냉동고에서 빼내고, 적절하게 표지된 1 파인트 스위트허트 K16A 컵으로 포장하였다. 샘플 컵을 플라스틱 상자에서 엎어놓고, -29℃(-20℉)의 송풍 냉동고에 밤새 두고, 평가 시까지, 보관을 위하여 -18℃(0℉) 냉동고로 옮겼다.
표 30 내지 34는 10%, 20%, 30%, 40% 및 50% 단백질 단리물 대체에서의 샘플의 제제를 나타낸 것이다.
[표 30]
[표 31]
[표 32]
[표 33]
[표 34]
관능 스펙트럼 서술적 프로파일링 방법에 숙달된 7명의 패널이 샘플을 3중으로 평가하였다. 평가의 목적은 본 발명에 따라 제조되고 생산된 아이스 크림과 비슷한 대두 단백질 제품의 향미 특징을 100 퍼센트 유제품으로 제조된 바닐라 아이스 크림의 향미 특징과 비교하여 정량화시키는 것이었다. 19개의 향미 속성을 15-점 강도 척도로 평가하였으며, 각 샘플에서 없음/적용가능하지 않음에 대해서는 0이고, 매우 강함/높음에 대해서는 15였다. 샘플에서 시험한 향미 속성, 향미 속성의 정의 및 사용된 향미 강도 척도 참조 샘플을 상기 표 28에 기재하였다.
도 16이 보여주는 바와 같이, 샘플 중의 수프로 120의 존재는 대체 수준이 30% 이상이 될 때까지 검출되지 않았다. 심지어 샘플이 50%의 대두 단백질을 함유할 때조차도, 대두 향미의 강도는 15-점 척도에서 2.5 이하로 남아있었다. 사실상, 밀키, 캐러멜화 및 바닐라 복합물질 향은 심지어 50% 대두 함유에서도, 대두/콩류에 비해 강도가 모두 더 높았다. 또한, 100% 유제품에 비해 20% 대두 대체에서 밀키 및 캐러멜화 향의 약간의 감소만이 있었다.
도 18은 바닐라 착향된 냉동 디저트를 시도하고자 채용된 35-54세의 74명의 개별 소비자 패널에 의해 평가된, 10%, 20% 및 40%의 수프로 120의 함유 수준에서의 대두 단백질 샘플의 허용성을 제시한 것이다. 샘플을 균형잡힌 순차적인 모나드 방식으로 각 소비자에게 제시하였으며, 여기에서 각 샘플은 개별적으로 서빙하고, 다음 샘플을 평가하기 전에 치웠다. 표준 관능 시험 프로토콜에 맞게, 서빙 순서를 순환시키고, 균형을 이루게 하여, 서빙 순서 효과에 기인한 치우침을 최소화하였다.
도 18의 그래프가 나타내는 바와 같이, 샘플에 대한 평균의 전반적인 선호, 색상 선호, 향미 선호, 식감 선호 및 뒷맛 선호 반응은 모두 유제품인 아이스 크림 대조군 샘플의 것과 유사하거나, 그보다 더 높았다. 예를 들어, 10% 대두 단백질 함유에 있어서, 전반적인 선호, 외양 선호, 향미 선호, 식감 선호 및 뒷맛 선호 평균 점수는 모두 유제품인 대조군 샘플의 것과 모두 같거나 그보다 더 높았다. 20% 대두 단백질 함유에서, 외양 선호 점수는 모두 유제품인 대조군 샘플의 점수보다 더 높았으며, 전반적인 선호, 향미 선호, 식감 선호 및 뒷맛 선호 평균 점수만 약간 감소하였다. 40% 대두 단백질 함유에서, 외양 선호 및 식감 선호 점수는 모두 유제품인 대조군 샘플의 점수보다 오직 약간만 더 낮았다.
본 실시예는 유제품 대신 상당한 양의 수프로 120을 함유하는 아이스 크림과 비슷한 빙과 제품이 바람직하게는 100 퍼센트 유제품을 함유하는 냉동 디저트 제품에 대한 대체의 냉동 디저트로 허용될 수 있음을 예시한다.
실시예 23. 수프로 760을 포함하는 빙과의 분석.
아이스 크림과 비슷한 냉동 디저트 제품을 다양한 대체 수준(10%, 20%, 30%, 40% 및 50%)으로 수프로 760을 사용하여 제조하였다. 먼저 스테인리스 스틸 용기에서 인산염을 물에 첨가하고, 38℃(100℉)로 가열함으로써 각각의 샘플을 형성하였다. 원하는 양의 수프로 760을 첨가하고, 프로펠러식 혼합기를 사용하여 성분을 중간의 속도로 5 내지 10분 동안 혼합하여, 단백질을 분산 및 수화시켰다. 단백질이 완전히 분산된 후에, 슬러리 온도를 82℃(180℉)로 증가시키고, 슬러리를 저속으로 5분 동안 혼합하였다. 설탕 및 콘 시럽 고형분을 단백질 슬러리에 첨가하고, 중간의 속도로 3분 더 계속 혼합하였다. 그 다음, 헤비 크림 및 폴리소르베이트 60을 첨가하고, 조합된 성분을 성분이 완전히 분산될 때까지 3 내지 5분 동안 중간 속도로 혼합하였다. 그 다음, 혼합물을 82℃(180℉)에서 30초의 지속 기간을 가지고 살균시켰다. 살균 후에, 혼합물을 제2단계에서는 3447 ㎪(500 psi); 제1단계에서는 17.2 ㎫(2500 psi)로 설정된 2단계의 단일 피스톤 균질기를 사용하여 균질화시켰다. 균질화 후에, 혼합물을 사전 멸균된 날진 병에 수집하고, 즉시 빙조에 두고, 30분 동안 유지시켰다. 냉장된 병을 2℃(35℉) 워크-인 쿨러에 두고 밤새 보관하였다. 동결 전에, 바닐라 향료를 냉장된 혼합물과 블렌딩하였다. 그 다음, 착향된 혼합물을 테일러 뱃치 아이스 크림 냉동고에 넣고, 7분에 걸쳐 혼합물이 냉동시켜, -4℃(24℉) 내지 -3℃(26℉)의 온도에 도달시켰다. 혼합물을 냉동고에서 빼내고, 적절하게 표지된 1 파인트 스위트허트 K16A 컵으로 포장하였다. 샘플 컵을 플라스틱 상자에서 엎어놓고, -29℃(-20℉)의 송풍 냉동고에 밤새 두고, 평가 시까지, 보관을 위하여 -18℃(0℉) 냉동고로 옮겼다.
표 35 내지 39는 10%, 20%, 30%, 40% 및 50% 단백질 단리물 대체에서의 샘플의 제제를 나타낸 것이다.
[표 35]
[표 36]
[표 37]
[표 38]
[표 39]
관능 스펙트럼 서술적 프로파일링 방법에 숙달된 7명의 패널이 샘플을 3중으로 평가하였다. 평가의 목적은 본 발명에 따라 제조되고 생산된 대두 단백질 "아이스 크림" 제품의 허용성 수준을 100 퍼센트 유제품으로 제조된 바닐라 아이스 크림의 허용성 수준과 비교하여 결정하는 것이었다. 19개의 향미 속성을 15-점 강도 척도로 평가하였으며, 각 샘플에서 없음/적용가능하지 않음에 대해서는 0이고, 매우 강함/높음에 대해서는 15였다. 샘플에서 시험한 향미 속성, 향미 속성의 정의 및 사용된 향미 강도 척도 참조 샘플을 상기 표 28에 기재하였다.
표 40은 대조군(100% 유제품)과 비교하여, 5개의 샘플(10%, 20%, 30%, 40% 및 50%)에 대한 패널의 평균 강도 점수를 제시한 것이다.
[표 40]
도 17 및 표 40 둘 모두가 예시하는 바와 같이, 샘플 중의 수프로 760의 존재는 대체 수준이 50%에 있을 때까지 검출되지 않았다. 대두 향미의 강도는 심지어 샘플이 50% 대두 단백질을 함유하는 때조차도, 15-점 척도에서 2.0 이하로 남아있었다. 사실상, 밀키, 캐러멜화 및 바닐라 복합물질 향은 심지어 50% 대두 함유에서도, 대두/콩류에 비해 강도가 모두 더 높았다. 또한, 100% 유제품에 비해 20% 대두 대체에서 밀키 향의 약간의 감소만이 있었다.
도 20은 바닐라 착향된 냉동 디저트를 시도하고자 채용된 35-54세의 74명의 개별 소비자 패널에 의해 평가된, 10%, 20% 및 40%의 수프로 760의 함유 수준에서의 대두 단백질 샘플의 허용성을 제시한 것이다. 샘플을 균형잡힌 순차적인 모나드 방식으로 각 소비자에게 제시하였으며, 여기에서 각 샘플은 개별적으로 서빙하고, 다음 샘플을 평가하기 전에 치웠다. 표준 관능 시험 프로토콜에 맞게, 서빙 순서를 순환시키고, 균형을 이루게 하여, 서빙 순서 효과에 기인한 치우침을 최소화하였다.
도 20에서의 그래프가 예시하는 바와 같이, 대두 단백질 제품을 함유하는 샘플에 대한 전반적인 선호, 외양, 향미, 식감 및 뒷맛 선호 반응은 모두 유제품인 대조군 샘플의 것과 유사하였다. 예를 들어, 10% 대두 단백질 함유에 있어서, 전반적인 선호, 외양 선호, 향미 선호, 식감 선호 및 뒷맛 선호 평균 점수는 모두 유제품인 대조군 샘플의 것과 모두 같거나 그보다 오직 약간만 더 낮았다. 20% 대두 단백질 함유에서, 외양 선호, 전반적인 선호, 향미 선호, 식감 선호 및 뒷맛 선호 평균 점수는 95% 신뢰도에서 통계적으로 더 낮았다. 40% 대두 단백질 함유에서, 외양 선호 및 식감 선호 점수도 또한 95% 신뢰도에서 모두 유제품인 대조군 샘플의 점수보다 통계적으로 더 낮았다.
본 실시예는 유제품 대신 상당한 양의 수프로 760을 함유하는 냉동 디저트 제품이 바람직하게는 100 퍼센트 유제품을 함유하는 냉동 디저트 제품에 대한 대체 냉동 디저트로 허용될 수 있음을 보여준다.
실시예
24 및 25. 대두 단백질
슬러리를
포함하는 빙과의 분석.
아이스 크림과 비슷한 냉동 디저트 제품을 100%의 유제품 대체 수준으로, 대두 단백질 슬러리를 사용하여 제조하였다. 먼저, 스테인리스 스틸 용기 내에서 인산염을 물에 첨가하고, 38℃(100℉)로 가열함으로써 샘플을 형성하였다. 원하는 양의 대두 단백질 슬러리를 첨가하고, 프로펠러식 혼합기를 사용하여 성분을 중간의 속도로 5 내지 10분 동안 혼합하여, 단백질을 분산 및 수화시켰다. 단백질이 완전히 분산된 후에, 슬러리 온도를 82℃(180℉)로 증가시키고, 슬러리를 저속으로 5분 동안 혼합하였다. 설탕 및 콘 시럽 고형분을 단백질 슬러리에 첨가하고, 중간의 속도로 3분 더 계속 혼합하였다. 그 다음, 코코넛 오일, 모노- 및 다이-글리세리드 및 폴리소르베이트 60을 첨가하고, 조합된 성분을 성분이 완전히 분산될 때까지 3 내지 5분 동안 중간 속도로 혼합하였다. 그 다음, 혼합물을 82℃(180℉)에서 30초의 지속 기간을 가지고 살균시켰다. 살균 후에, 혼합물을 제2단계에서는 20.7 ㎫(3000 psi); 제1단계에서는 17.2 ㎫(2500 psi)로 설정된 2단계의 단일 피스톤 균질기를 사용하여 균질화시켰다. 균질화 후에, 혼합물을 사전 멸균된 날진 병에 수집하고, 즉시 빙조에 두고, 30분 동안 유지시켰다. 냉장된 병을 2℃(35℉) 워크-인 쿨러에 두고 밤새 보관하였다. 동결 전에, 바닐라 향료를 냉장된 혼합물과 블렌딩하였다. 그 다음, 착향된 혼합물을 테일러 뱃치 아이스 크림 냉동고에 넣고, 7분에 걸쳐 혼합물이 동결되게 하여, -4℃(24℉) 내지 -3℃(26℉)의 온도에 도달시켰다. 혼합물을 냉동고에서 빼내고, 적절하게 표지된 1 파인트 스위트허트 K16A 컵으로 포장하였다. 샘플 컵을 플라스틱 상자에서 엎어놓고, -29℃(-20℉)의 송풍 냉동고에 밤새 두고, 평가 시까지, 보관을 위하여 -18℃(0℉) 냉동고로 옮겼다.
표 41은 100% 단백질 슬러리 대체에서의 샘플의 제제를 나타낸 것이다.
[표 41]
관능 스펙트럼 서술적 프로파일링 방법에 숙달된 6명의 패널이 샘플을 3중으로 평가하였다. 향미 속성의 정의를 표 28에 제공하였다. 평균 향미 속성 강도를 하기의 표 42에 약술하였다.
도 21은 상업의 모든 소이 딜리셔스 채소 빙과와 비교하여, 수프로 120, 수프로 XF 8020로의 100% 유제품 대체물이다.
표 42는 도 21에 나타낸 바와 같은 패널의 평균 강도 점수를 나타낸 것이다.
[표 42]
소비자 허용성 데이터로부터의 결과는 수프로 XF(실시예 24)로 제조된 바닐라 냉동 디저트에 대한 평균 점수가 시험된 모든 헤도닉; 전반적인 선호, 외양 선호, 향미 선호, 질감 선호 및 뒷맛 선호에 대하여 소이 딜리셔스 바닐라 냉동 디저트보다 상당히 더 높은(더 선호되는) 것을 나타내었다.
수프로 120(실시예 25)으로 제조된 바닐라 냉동 디저트와 비교하여, 수프로 XF(실시예 24) 평균 점수는 전반적인 선호, 향미 선호 및 뒷맛 선호가 상당히 더 높았다.
본 발명을 그의 예시적인 실시형태와 관련하여 설명하였지만, 발명의 상세한 설명을 읽음으로써 당업자에게 그의 다양한 변형이 명백해질 것임이 이해되어야 한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 본 발명은 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 속하는 그러한 변형을 포함하고자 함이 이해되어야 한다.
Claims (16)
- (a) 각 카복실 말단에 아르기닌 잔기 또는 라이신 잔기 중 어느 하나를 주로 갖는 폴리펩티드 단편의 혼합물을 포함하며, 가수분해도가 적어도 약 0.2%이며, 가용성 고형분 지수(soluble solids index)가 약 6.0 초과의 pH에서 적어도 약 80%인 단백질 가수분해물 조성물; 및
(b) 식용 재료를 포함하는 빙과(frozen confection). - 제1항에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물이 대두, 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀, 동물, 난 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질로부터 유래된 빙과.
- 제1항에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물이 보리, 카놀라, 루핀, 옥수수, 귀리, 완두콩, 감자, 쌀, 밀, 동물, 유제품 및 난으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질과 조합된 대두로부터 유래된 빙과.
- 제1항에 있어서, 단백질 가수분해물 조성물이 대두로부터 유래되고, 가수분해도가 약 0.2% 내지 약 14%인 빙과.
- 제1항에 있어서, 식용 재료가 스킴 밀크(skim milk), 전유, 크림, 분유, 탈지 분유, 카세이네이트, 대두 단백질 농축물, 대두 단백질 단리물, 유장 단백질 농축물, 유장 단백질 단리물 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 빙과.
- 제1항에 있어서, 식료품이 감미료, 유화제, 증점제, 안정제, 지질 물질, 방부제, 착향제, 착색제 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 성분을 추가로 포함하는 빙과.
- (a) 각 카복실 말단에 아르기닌 잔기 또는 라이신 잔기 중 어느 하나를 주로 갖는 폴리펩티드 단편의 혼합물을 포함하며, 가수분해도가 적어도 약 0.2%이며, 가용성 고형분 지수가 약 6 초과의 pH에서 적어도 약 80%인 단백질 가수분해물 조성물을 적어도 하나의 식용 재료와 혼합하여, 당과(confection)를 제조하는 단계, 및
(b) 당과 조성물을 동결시켜, 빙과를 제조하는 단계를 포함하는, 빙과 조성물의 제조방법. - 제7항에 있어서, (a) 이후에, 약 68℃(155℉) 내지 약 132℃(270℉)의 온도, 약 10.1 ㎪(0.1 대기압) 내지 약 1013.3 ㎪(10 대기압)의 압력 및 약 3 초 내지 약 45 분의 시간으로 당과를 살균(pasteurizing)하는 단계를 추가로 포함하는 빙과 조성물의 제조방법.
- 제8항에 있어서, 약 101.3 ㎪(1 대기압) 내지 약 152.0 ㎪(1.5 대기압)의 압력 및 약 4 초 내지 약 25초의 시간에서 온도가 약 79℃(175℉) 내지 약 91℃(195℉)인, 빙과 조성물의 제조방법.
- 제7항에 있어서, (a) 이후에, 약 70.3 ㎏/㎠(제곱인치당 1000 파운드) 내지 약 281.3 ㎏/㎠(제곱인치당 4000 파운드)에서 당과를 균질화시키는 단계를 추가로 포함하는, 빙과 조성물의 제조방법.
- 제10항에 있어서, 균질화가 단일 단계 균질화인, 빙과 조성물의 제조방법.
- 제10항에 있어서, 균질화가 다단계 균질화인, 빙과 조성물의 제조방법.
- 제12항에 있어서, 다단계 균질화는 제1단계가 약 140.7 ㎏/㎠(제곱인치당 2000 파운드) 내지 약 211.0 ㎏/㎠(제곱인치당 3000 파운드)이며, 제2단계가 약 17.6 ㎏/㎠(제곱인치당 250 파운드) 내지 약 52.7 ㎏/㎠(제곱인치당 750 파운드)인 2단계의 균질화인 빙과 조성물의 제조방법.
- 제7항에 있어서, (a) 이후에, 당과를 살균 및 균질화시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기에서 살균은 약 68℃(155℉) 내지 약 132℃(270℉)의 온도, 약 10.1 ㎪(0.1 대기압) 내지 약 1013.3 ㎪(10 대기압)의 압력 및 약 4초 내지 약 45분의 시간으로 행하며, 균질화는 약 70.3 ㎏/㎠(제곱인치당 1000 파운드) 내지 약 281.3 ㎏/㎠(제곱인치당 4000 파운드)로 행하는 빙과 조성물의 제조방법.
- 제14항에 있어서, 균질화가 단일 단계 또는 다단계인, 빙과 조성물의 제조방법.
- 제15항에 있어서, 다단계 균질화는 제1단계가 약 140.7 ㎏/㎠(제곱인치당 2000 파운드) 내지 약 211.0 ㎏/㎠(제곱인치당 3000 파운드)이며, 제2단계가 약 17.6 ㎏/㎠(제곱인치당 250 파운드) 내지 약 52.7 ㎏/㎠(제곱인치당 750 파운드)인 2단계의 균질화인, 빙과 조성물의 제조방법.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US9893308P | 2008-09-22 | 2008-09-22 | |
US61/098,933 | 2008-09-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20110076953A true KR20110076953A (ko) | 2011-07-06 |
Family
ID=41328563
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020117009106A Withdrawn KR20110076953A (ko) | 2008-09-22 | 2009-09-22 | 단백질 가수분해물 조성물을 포함하는 빙과 및 빙과의 제조방법 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20110171360A1 (ko) |
EP (1) | EP2328422A1 (ko) |
JP (1) | JP2012502666A (ko) |
KR (1) | KR20110076953A (ko) |
CN (1) | CN102159087A (ko) |
CA (1) | CA2734277A1 (ko) |
WO (1) | WO2010033985A1 (ko) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20200049364A (ko) * | 2018-10-31 | 2020-05-08 | 씨제이제일제당 (주) | 대두 단백 농축물의 가수분해물을 제조하는 방법 |
KR20200090840A (ko) * | 2017-11-28 | 2020-07-29 | 코수크라 그루페 왈코잉, 소씨에떼 아노니메 | 펄스 단백질을 포함하는 크림 대용품 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015509370A (ja) * | 2012-03-08 | 2015-03-30 | バーコン ニュートラサイエンス (エムビー) コーポレイションBurcon Nutrascience (Mb) Corp. | 大豆タンパク質製品を使用するフローズンデザートミックス |
CA2905176A1 (en) * | 2013-03-11 | 2014-09-18 | Burcon Nutrascience (Mb) Corp. | Production of pulse protein product |
BR112017028200A2 (pt) | 2015-06-30 | 2018-08-28 | Unilever Nv | ?produto de confeitaria congelado? |
US20170071229A1 (en) * | 2015-09-15 | 2017-03-16 | Coolwhey Inc. | Protein based frozen dessert using alternative sugars and methods of making the same |
WO2017150548A1 (ja) * | 2016-02-29 | 2017-09-08 | 国立大学法人京都大学 | ペプチド |
JP6941113B2 (ja) * | 2016-03-15 | 2021-09-29 | ザ コカ・コーラ カンパニーThe Coca‐Cola Company | 加水分解エンドウ豆タンパク質を含有する冷凍飲料組成物 |
CN106259903A (zh) * | 2016-08-05 | 2017-01-04 | 深圳职业技术学院 | 一种凝固型大米蛋白酸奶的制备方法 |
WO2018047852A1 (en) * | 2016-09-07 | 2018-03-15 | Kyoto University | Peptides and peptide conjugates for treating mental disorders |
WO2019051058A1 (en) * | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Dippin Dots, L.L.C. | PARTICULATE ICE CREAM |
JP7290303B2 (ja) * | 2018-11-22 | 2023-06-13 | 奥野製薬工業株式会社 | 氷菓子の融解を抑制するための組成物 |
EP4030931A1 (en) * | 2019-09-19 | 2022-07-27 | Givaudan SA | Taste modifying ingredient derived from rice protein |
BR112022005221A2 (pt) | 2019-10-01 | 2022-06-14 | Unilever Ip Holdings B V | Confeito congelado |
US20210227849A1 (en) * | 2020-01-28 | 2021-07-29 | Ripple Foods, Pbc | Compositions and methods for frozen confections |
WO2021190981A1 (en) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Unilever Ip Holdings B.V. | Frozen confection |
US20240057627A1 (en) | 2021-01-05 | 2024-02-22 | Novozymes A/S | Process for Preparing a Plant-Based Fermented Dairy Alternative |
US11864566B2 (en) * | 2021-03-02 | 2024-01-09 | Conopco, Inc. | Plant-based frozen confection |
JP7333879B1 (ja) * | 2023-03-08 | 2023-08-25 | 株式会社ロッテ | 冷菓 |
NL2035379B1 (en) * | 2023-07-13 | 2025-01-28 | Hangzhou Vocational And Technical College | Method for detecting nutritional ingredients of food |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0325986A3 (en) * | 1988-01-28 | 1989-10-11 | Miles Inc. | Enzymatic hydrolysis of proteins |
JP3153237B2 (ja) * | 1990-03-09 | 2001-04-03 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | タンパク質加水分解物 |
JP2862418B2 (ja) * | 1990-09-20 | 1999-03-03 | 森永乳業株式会社 | 脂質代謝改善に有効な機能性食品 |
US6171640B1 (en) * | 1997-04-04 | 2001-01-09 | Monsanto Company | High beta-conglycinin products and their use |
JPH11103783A (ja) * | 1997-09-30 | 1999-04-20 | Fuji Oil Co Ltd | 冷菓の製造法 |
US6511694B2 (en) * | 2001-04-06 | 2003-01-28 | The Pillsbury Company | Stable soft frozen desserts |
EP1555884A4 (en) * | 2002-10-02 | 2006-04-12 | Novozymes As | BY TREATMENT WITH PROTEASE-IMPROVED MILK AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
US8222372B2 (en) * | 2007-04-16 | 2012-07-17 | Novozymes A/S | Whey protein hydrolysate |
US9034402B2 (en) * | 2007-04-16 | 2015-05-19 | Solae, Llc | Protein hydrolysate compositions having improved sensory characteristics and physical properties |
-
2009
- 2009-09-22 EP EP09736719A patent/EP2328422A1/en not_active Withdrawn
- 2009-09-22 KR KR1020117009106A patent/KR20110076953A/ko not_active Withdrawn
- 2009-09-22 WO PCT/US2009/057830 patent/WO2010033985A1/en active Application Filing
- 2009-09-22 US US13/119,422 patent/US20110171360A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-22 CA CA2734277A patent/CA2734277A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-22 CN CN2009801372615A patent/CN102159087A/zh active Pending
- 2009-09-22 JP JP2011528066A patent/JP2012502666A/ja active Pending
-
2013
- 2013-09-30 US US14/041,808 patent/US20140030416A1/en not_active Abandoned
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20200090840A (ko) * | 2017-11-28 | 2020-07-29 | 코수크라 그루페 왈코잉, 소씨에떼 아노니메 | 펄스 단백질을 포함하는 크림 대용품 |
KR20200049364A (ko) * | 2018-10-31 | 2020-05-08 | 씨제이제일제당 (주) | 대두 단백 농축물의 가수분해물을 제조하는 방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2328422A1 (en) | 2011-06-08 |
WO2010033985A1 (en) | 2010-03-25 |
CN102159087A (zh) | 2011-08-17 |
US20140030416A1 (en) | 2014-01-30 |
US20110171360A1 (en) | 2011-07-14 |
CA2734277A1 (en) | 2010-03-25 |
JP2012502666A (ja) | 2012-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20110076953A (ko) | 단백질 가수분해물 조성물을 포함하는 빙과 및 빙과의 제조방법 | |
KR101573084B1 (ko) | 개선된 관능 특징 및 물리적 특성을 가진 단백질 가수분해 조성물 | |
US20110097448A1 (en) | Protein Hydrolysate Compositions Stable Under Acidic Conditions | |
EP2384124B1 (en) | Protein hydrolysate compositions | |
KR101452756B1 (ko) | 단백질 가수분해물 및 제조 방법 | |
JP5210863B2 (ja) | 高分子量タンパク質画分及び低分子量タンパク質画分を有する単離ダイズタンパク質 | |
JP2011530274A5 (ko) | ||
JP2010524471A5 (ko) | ||
JP2024073533A (ja) | 改良された食品を得るためのペプチジルアルギニンデイミナーゼの使用 | |
WO2010065790A1 (en) | Non-dairy creamers comprising protein hydrolysate compositions and method for producing the non-dairy creamers | |
AU2002230286B2 (en) | Method of manufacturing an aerated carbohydrate containing food product | |
CN112236045A (zh) | 改性的油菜籽蛋白分离物 | |
AU2002230286A1 (en) | Method of manufacturing an aerated carbohydrate containing food product | |
JP5654540B2 (ja) | ダイズペプチド含有ゲル状食品 | |
EP1694140B1 (en) | Peptides having an ace inhibiting effect | |
Goertzen | The enzymatic modification of a chickpea protein isolate for improved nutritional and functional properties | |
JP5312817B2 (ja) | ダイズペプチド含有ゲル状食品 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PA0105 | International application |
Patent event date: 20110421 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
PG1501 | Laying open of application | ||
A201 | Request for examination | ||
PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20140922 Comment text: Request for Examination of Application |
|
PC1202 | Submission of document of withdrawal before decision of registration |
Comment text: [Withdrawal of Procedure relating to Patent, etc.] Withdrawal (Abandonment) Patent event code: PC12021R01D Patent event date: 20151124 |
|
WITB | Written withdrawal of application |