CN102159087A - 包含蛋白质水解产物组合物的冷冻甜食及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供冷冻甜食组合物和乳品类似物冷冻甜食组合物以及生产上述冷冻甜食组合物的方法。具体地讲，所述冷冻甜食包含蛋白质水解产物组合物，所述蛋白质水解产物组合物一般由多肽片段的混合物组成，所述多肽片段在每个羧基末端主要具有精氨酸残基或赖氨酸残基。
Description
发明领域
本发明总体而言提供包含可食用材料和蛋白质水解产物组合物，并且任选地可包括“乳品蛋白质”的冷冻甜食和制造所述冷冻甜食的方法。
背景技术
冷冻甜食，例如冰淇淋、冰糕、冰冻果子露等，多年来为各个年龄段的人们所喜爱。基于乳品的冷冻甜食通常由全脂乳、乳脂、和/或浓奶油、以及糖制成，而不基于乳品的冷冻甜食可包含高含量的糖和卡路里，以营养不合理为代价，例如不含任何纤维或蛋白质。虽然许多人可能喜爱冷冻甜食，但这些美食往往因各种原因被人回避。第一，由于冷冻甜食通常包含高含量的脂肪和卡路里，它们并非是有营养的产品。第二，一大部分的人不能食用基于乳品的冷冻甜食，因为他们不能代谢乳糖，一种存在于乳制品中的糖。第三，由于关于食用乳制品方面的宗教上的或个人的信仰，一些人选择不吃基于乳品的冷冻甜食。鉴于所有这些因素，存在对低乳或非乳品的并又有营养的冷冻甜食的需求。
基于乳品的冷冻甜食因为乳品的风味和奶油的质感而受人喜爱。经常在各种产品中被用于替代乳品的一种产品是大豆蛋白。众所周知，包含大豆的冷冻甜食存在于市场上。这些产品具有降低的乳品含量或不含乳品，并且可以是营养完善的。目前市场上用作冷冻甜食中的成分的大豆蛋白，容易导致冷冻甜食具有个人认为讨厌的或难吃的“青草味”或“豆腥味”。尽管出现了这些“健康的”冷冻甜食选项，似乎很明显的是，消费者并不愿意为了健康或为了回避乳品而牺牲他们最喜爱的嗜好物的口味和质感。因此，存在对致力于通过包含大豆蛋白产品解决健康或信仰限制，但仍保持着人们已了解和喜爱的口味和质感的非乳品的或低乳的冷冻甜食的需求。
发明概述
本发明的一个方面提供了包含蛋白质水解产物的冷冻甜食组合物，所述蛋白质水解产物包含多肽片段的混合物，所述多肽片段在每个羧基末端主要具有精氨酸残基或赖氨酸残基。这些产品任选地包括乳品蛋白质。此外，蛋白质水解产物组合物具有至少约0.2％的水解度，并且在pH大于约6.0时具有至少约80％的可溶性固体指数(SSI)。
本发明的其他方面和特征更详细地描述如下。
彩色图的参考
该专利申请包含至少一张彩色像片。具有彩色像片的该专利申请公布的复印件应请求并在支付必要费用后可由政府机关提供。
附图描述
图1示出了通过镰孢属胰蛋白酶样肽链内切酶(TL1)水解的大豆分离蛋白。显示的是考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的图像。泳道3(L3)包含未水解的大豆分离蛋白(
500E)。泳道4(L4)、泳道5(L5)、泳道6(L6)、泳道7(L7)和泳道8(L8)分别包含具有0.3％、2.2％、3.1％、4.0％和5.0％的水解度(DH)的TL1水解产物。泳道9(L9)包含蛋白质分子量标准品，在凝胶右侧，大小用千道尔顿(KD)指示。
图2给出了含5.0％固体的TL1水解产物和水解产物的诊断评分，该评分由经过培训的评估员进行评估。在每个曲线图下方给出了每一水解产物的同一性和水解度(％DH)。正评分指示水解产物具有比对照样品更多的感官特性，而负评分指示水解产物具有比对照样品更少的感官特性。对照样品是未水解的大豆分离蛋白。(A)显示了水解度小于约2.5％DH的TL1和
(ALC)水解产物的评分。(B)显示了水解度大于3％DH的TL1和
(ALC)水解产物的评分。
图3比较了
和TL1水解产物的溶解度。酶和各自的水解度(％DH)显示于每管下方。(A)显示了于pH 7.0在4℃存储了两周的(ALC)和TL1水解产物(2.5％固体)管。(B)显示了于pH 8.2在4℃存储了三周的TL1和
(ALC)水解产物(2.5％固体)。
图4是TL1和
水解产物的溶解度曲线图。将每一水解产物(2.5％固体)的可溶性固体百分比(即，可溶性固体指数)作为pH的函数进行了作图。每一水解产物的特性和水解度(％DH)显示于每一曲线图下方。(A)显示了TL1水解产物的溶解度曲线。(B)显示了
(ALC)水解产物的溶解度曲线。(C)显示了经过选择的TL1和
(ALC)水解产物的溶解度之间的直接比较。
图5示出了中试规模的大豆蛋白材料TL1水解结果。显示的是考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的图像，TL1水解产物和对照样品溶解在其中。泳道1(L1)和泳道3(L3)包含未水解的大豆蛋白；泳道2(L2)包含2.7％DH的TL1水解产物；泳道4(L4)包含水解的对照样品(用酶混合物将
XT 219水解至2.8％)；泳道5-11(L5-L11)包含分别具有1.3、2.0、3.8、0.3、0.9、1.6和5.2％DH的TL1水解产物。泳道12(L12)包含分子量标准品，在凝胶右侧，大小用千道尔顿(KD)指示。
图6是中试TL1水解产物和对照样品的溶解度曲线图。在图下方给出了每一水解产物的水解度(％DH)。
图7是中试TL1水解产物和对照样品的粘度曲线图。在图下方给出了每个水解产物的水解度(％DH)。
图8是粘度和溶解度[即，可溶性固体指数(SSI)和可溶性氮指数(NSI)]作为中试TL1水解产物的水解度的函数的曲线图。
图9显示与对照样品相比，调味剂挥发成份在TL1水解产物中的水平更低。(A)显示了在具有不同水解度(％DH)的对照样品和TL1水解产物中，总活性挥发成份和己醛的水平。(B)显示了在具有不同水解度(％DH)的对照样品和TL1水解产物中，所指示的风味剂挥发成份的水平。
图10是中试TL1水解产物和对照样本的诊断评分的曲线图。对照样本为未水解的大豆分离蛋白。正评分表示水解产物比对照样品具有更高程度的感官属性，而负评分表示水解产物比对照样品具有更低程度的感官属性。(A)显示对照物、0.3％DH、和1.6％DH样品的评分。(B)显示对照物、1.3％DH、和5.2％DH样品的评分。(C)显示对照物、2.7％DH、和0.9％DH样品的评分。(D)显示对照物、2.0％DH、和3.8％DH样品的评分。
图11是TL1水解产物的感官评分作为水解度(DH)的函数的总曲线图。上图是总体嗜好评分，下图是苦味评分。菱形图标代表预测的评分，正方形图标代表实际的评分。
图12示出了用几种不同的胰蛋白酶样蛋白酶水解大豆分离蛋白的结果。给出了考马斯亮蓝染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶的图像，其中溶解了未水解的大豆蛋白和酶处理的大豆蛋白样本。在凝胶左侧的泳道1包含指示大小的分子量标记。泳道3和泳道9包含未处理的大豆分离蛋白。泳道2和泳道4-8分别包含用TL1、SP3、TL5、TL6、猪胰蛋白酶和牛胰蛋白酶处理的大豆。
图13示出了大豆和乳品蛋白组合的TL1水解产物的溶解度对应于pH的函数。
图14示出了其他植物蛋白质通过TL1的水解。所显示的是考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶图像，其中分析了未经处理的和经处理的蛋白质样品。泳道1(L1)包含分子量标记(在凝胶左侧，用KD指示)。泳道2(L2)、泳道4(L4)和泳道6(L6)分别包含未水解的玉米胚芽、低芥酸菜籽(canola)和麦芽精样本。泳道3(L3)、泳道5(L5)和泳道7(L7)分别包含玉米胚芽、低芥酸菜籽和麦芽精的TL1水解产物。
图15为柱状图，显示与全乳品的对照冰淇淋相比，包含10％、20％、30％、40％、50％的乳品替代物
XF8020的香草冰淇淋的风味谱。
图16为柱状图，显示与全乳品的对照冰淇淋相比，包含10％、20％、30％、40％、50％的乳品替代物120的香草冰淇淋的风味谱。
图17为柱状图，显示与全乳品的对照冰淇淋相比，包含10％、20％、30％、40％、50％的乳品替代物
760的香草冰淇淋的风味谱。
图18为柱状图，显示与全乳品的对照冰淇淋相比，包含10％、20％、40％的乳品替代物
XF8020的香草冰淇淋的接受度。
图19为柱状图，显示与全乳品的对照冰淇淋相比，包含10％、20％、40％的乳品替代物120的香草冰淇淋的接受度。
图20为柱状图，显示与全乳品的对照冰淇淋相比，包含10％、20％、40％的乳品替代物
760的香草风味冷冻甜食的接受度。
图21为用
120、
XF 8020 100％替代乳品与一种商品化全植物冷冻甜食Soy Delicious之间的比较。
发明详述
本发明提供包含蛋白质水解产物组合物的冷冻甜食和制造所述冷冻甜食的方法。用于冷冻甜食中的蛋白质水解产物组合物由多肽片段的混合物组成，所述多肽片段在每个羧基末端主要具有精氨酸残基或赖氨酸残基。除所述蛋白质水解产物组合物之外，本发明的冷冻甜食产品还任选地包括乳品蛋白质。有利的是，如实施例中所示，包含本文所述的蛋白质水解产物组合物的本发明的冷冻甜食组合物，与包含不同的大豆蛋白的冷冻甜食产品相比，具有改良的风味、质感、口感和芳香。
(I)冷冻甜食组合物
本发明的一个方面提供冷冻甜食组合物，所述冷冻甜食组合物包含多种比例的乳品蛋白质和大豆蛋白水解产物组合物的混合物，所述比例最高为且包括100％的大豆水解产物。本发明的另一方面提供仅包含蛋白质水解产物组合物而不含乳品蛋白质的冷冻甜食组合物。所述蛋白质水解产物的组成和特性详述于下文部分(I)A中。以包含百分之百乳品的冷冻甜食作为基准，与包含其他大豆蛋白的冷冻甜食相比，包含多种比例的蛋白质水解产物组合物的本发明的冷冻甜食组合物，一般具有改善的风味和质感特性。
与包含百分之百乳品蛋白质的冷冻甜食产品相比，当产品被冷冻时，本发明的蛋白质水解产物形成不同的冰晶。而且，当更多的蛋白质水解产物被加入产品中时，包含蛋白质水解产物组合物的冷冻甜食在冷冻前还表现出更高的粘度。更高的混合物粘度可以带来更高的俘获空气的效率，从而缩短冻结时间。
A.蛋白质水解产物组合物
蛋白质水解产物组合物与蛋白质原料相比将包含不同长度和分子量的多肽片段的混合物。每个肽段通常将在其羧基末端具有精氨酸或赖氨酸残基(如实施例3、4、13和18所示)。多肽片段的大小在约75道尔顿至约50,000道尔顿的范围内，或者更优选地在约150道尔顿至约20,000道尔顿的范围内。在一些实施方案中，所述多肽片段的平均分子大小可小于约20,000。在其他实施方案中，所述多肽片段的平均分子大小可小于约15,000。在又一些实施方案中，所述多肽片段的平均分子大小可小于约10,000。在另外的实施方案中，所述多肽片段的平均分子大小可小于约5000。
取决于蛋白材料的来源、使用的肽链内切酶和水解反应的完成度，本发明蛋白质水解产物组合物的水解度能够并且将会不同。水解度(DH)是指裂解的肽键对肽键起始数目的百分比。例如，如果将包含五百个肽键的起始蛋白质水解至五十个肽键被裂解，则所得水解产物的DH为10％。水解度可使用如实施例中详述的三硝基苯磺酸(TNBS)色度方法或邻苯二醛(OPA)方法进行测定。水解度越高，蛋白水解程度越大。通常，因为蛋白被进一步水解(即DH升高)，肽段的分子量降低，相应的肽表达谱发生改变，混合物的粘度降低。DH可以在完整水解产物(即全部片段)中进行测量或在水解产物的可溶解片段中(即水解产物在约500-1000×g离心约5至10分钟后的上清液片段)进行测量。
一般来讲，蛋白质水解产物的水解度将至少为约0.2％。在一个实施方案中，蛋白质水解产物的水解度可在约0.2％至约2％之间。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物的水解度可在约2％至约8％之间。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物的水解度可在约8％至约14％之间。在一个替代的实施方案中，蛋白质水解产物的水解度可在约14％至约20％之间，在另外的实施方案中，蛋白质水解产物的水解度可大于约20％。
取决于蛋白原料的来源、使用的肽链内切酶和组合物的pH，蛋白质水解产物组合物的溶解度能够并且将会不同。可溶性固体指数(SSI)是包括蛋白质水解产物组合物的固体(即多肽片段)溶解度的量度。可溶性固体的量可通过在离心(例如在约500-1000×g离心约5至10分钟)前后测量溶液中固体的量进行估计。作为另外一种选择，可溶性固体的量可通过使用本领域熟知的技术(如二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定比色检测分析法)估计离心前后组合物中蛋白质的量进行测定。
一般来讲，在高于约pH 6.0的pH下，本发明的蛋白质水解产物组合物，无论其水解度如何，均具有至少约80％的可溶性固体指数。在一个实施方案中，在高于约pH 6.0的pH下，所述蛋白质水解产物组合物可具有约80％至约85％的可溶性固体指数。在另一个实施方案中，在高于约pH 6.0的pH下，所述蛋白质水解产物组合物可具有约85％至约90％的可溶性固体指数。在另一个实施方案中，在高于约pH6.0的pH下，所述蛋白质水解产物组合物可具有约90％至约95％的可溶性固体指数。在另一个替代的实施方案中，在高于约pH 6.0的pH下，所述蛋白质水解产物组合物可具有约95％至约99％的可溶性固体指数。
此外，本发明的蛋白质水解产物组合物的溶解度在约pH4.0至约pH5.0时对应于水解度的函数可能不同。例如，在约pH4.0至约pH5.0时，具有大于约3％的水解度的大豆蛋白质水解产物组合物比那些具有小于约3％的水解度的大豆蛋白质水解产物组合物趋于更易溶解。
一般而言，在约pH 7.0至约pH 8.0的pH下，具有约1％至约6％的水解度的大豆蛋白水解产物组合物是稳定的。稳定性是指随着时间流逝并不形成沉淀。蛋白质水解产物组合物可在室温(即，～23℃)下贮存或在冷却温度(即，～4℃)下贮存。在一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可稳定约一周至约四周。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可稳定约一个月至约六个月。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可稳定超过约六个月。
蛋白质水解产物组合物可以是干燥的。例如，可以喷雾干燥蛋白质水解产物组合物。喷雾干燥机入口的温度可以在约500°F至约600°F的范围内，出口温度可以在约180°F至约100°F的范围内。作为另外一种选择，蛋白质水解产物组合物可以被真空干燥、冷冻干燥、或使用本领域已知的其他程序进行干燥。
在那些蛋白质水解产物来源于大豆蛋白的实施方案中，水解度可以在约0.2％至约14％范围，并且更优选约1％至约6％范围。除影响所形成的多肽片段的数量，如实施例中所示之外，水解度通常还影响所得到的大豆蛋白水解产物组合物的其他物理特性和感官特性。通常，当水解度约1％增加到约6％时，大豆蛋白质水解产物组合物的透明性或半透明性增加，而谷物和大豆/豆类感官特性降低。此外，当水解度小于约2％时，与当水解度大于约2％时相比，大豆蛋白水解产物组合物具有大体上较低的苦的感官特性。换句话说，较高的水解度降低了谷物和大豆/豆类感官特性，而较低的水解度降低了苦的感官特性。在实例中详述了感官特性以及测定它们的方法。
此外，在那些蛋白质水解产物来源于大豆的实施方案中，所述大豆蛋白水解产物组合物可包含选自SEQ ID NO：5-177和270-274的多肽。在一个实施方案中，所述大豆蛋白水解产物可包含至少一种多肽，所述多肽具有对应于或来源于SEQ ID NO：5-177和270-274的氨基酸序列。在一个替代的实施方案中，所述大豆蛋白水解产物可包含至少约十种选自SEQ ID NO：5-177和270-274的多肽和片段。在另一个实施方案中，所述大豆蛋白水解产物可包含至少约20种选自SEQ ID NO：5-177和270-274的多肽和片段。在另一个实施方案中，所述大豆蛋白水解产物可包含至少约40种选自SEQ ID NO：5-177和270-274的多肽和片段。在另一个实施方案中，所述大豆蛋白水解产物可包含至少约80种选自SEQ ID NO：5-177和270-274的多肽和片段。在另一个实施方案中，所述大豆蛋白水解产物可包含至少约120种选自SEQ ID NO：5-177和270-274的多肽和片段。在另一个实施方案中，所述大豆蛋白水解产物可包含至少约178种选自SEQ ID NO：5-177和270-274的多肽和片段。
在蛋白质水解产物来源于大豆蛋白和乳品的组合的那些其他实施方案中，所述组合的大豆/乳品蛋白水解产物组合物可包含选自SEQ IDNO：5-197和270-274的多肽。在一个实施方案中，所述组合的大豆/乳品蛋白水解产物可包含至少一种多肽，所述多肽具有对应于或来源于SEQ ID NO：5-197和270-274的氨基酸序列。在一个替代的实施方案中，所述组合的大豆/乳品蛋白水解产物可包含至少约十种选自SEQ IDNO：5-197和270-274的多肽和片段。在另一个实施方案中，所述组合的大豆/乳品蛋白水解产物可包含至少约50种选自SEQ ID NO：5-197和270-274的多肽和片段。在另一个实施方案中，所述组合的大豆/乳品蛋白水解产物可包含至少约100种选自SEQ ID NO：5-197和270-274的多肽和片段。在另一个实施方案中，所述组合的大豆/乳品蛋白水解产物可包含至少约150种选自SEQ ID NO：5-197和270-274的多肽和片段。在另一个实施方案中，所述组合的大豆/乳品蛋白水解产物可包含至少约198种选自SEQ ID NO：5-197和270-274的多肽和片段。
在蛋白质水解产物来源于低芥酸菜籽的那些其他实施方案中，所述蛋白质水解产物组合物可包含选自SEQ ID NO：198-237的多肽。在一个实施方案中，所述低芥酸菜籽水解产物可包含至少一种多肽，所述多肽具有对应于或来源于SEQ ID NO：198-237的氨基酸序列。在一个替代的实施方案中，所述低芥酸菜籽水解产物可包含至少约十种选自SEQ ID NO：198-237的多肽和片段。在另一个实施方案中，所述低芥酸菜籽水解产物可包含至少约20种选自SEQ ID NO：198-237的多肽和片段。在另一个替代的实施方案中，所述低芥酸菜籽水解产物可包含至少约三十九种多肽，所述多肽具有对应于或来源于SEQ IDNO：198-237的氨基酸序列。
在蛋白质水解产物来源于玉米的那些其他实施方案中，所述蛋白质水解产物组合物可包含选自SEQ ID NO：238-261的多肽。在一个实施方案中，所述玉米水解产物可包含至少一种多肽，所述多肽具有对应于或来源于SEQ ID NO：238-261的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述玉米水解产物可包含至少十种多肽，所述多肽具有对应于或来源于SEQ ID NO：238-261的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述玉米水解产物可包含至少24种多肽，所述多肽具有对应于或来源于SEQ ID NO：238-261的氨基酸序列。
此外，在蛋白质水解产物来源于小麦的那些其他实施方案中，所述蛋白质水解产物组合物可包含选自SEQ ID NO：262-269的多肽。在一个实施方案中，所述小麦水解产物可包含至少一种多肽，所述多肽具有对应于或来源于SEQ ID NO：262-269的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述小麦水解产物可包含至少八种多肽，所述多肽具有对应于或来源于SEQ ID NO：262-269的氨基酸序列。
本发明也可包括任何可从本发明的大豆蛋白质水解产物组合物、大豆/乳品蛋白质水解产物组合物、低芥酸菜籽蛋白质水解产物组合物、玉米蛋白质水解产物组合物或小麦蛋白质水解产物组合物纯化得到的多肽或它们的片段。通常，在给定的纯化样本中纯化多肽片段构成了按重量计至少约80％，优选地90％，甚至更优选地至少约95％的总多肽。可通过色谱方法纯化多肽片段，如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水性交互作用色谱法、反相色谱法等。例如，所述多肽片段可选自SEQ ID NO：5-274。此外，本发明还包括与选自SEQ ID NO：5-274的那些多肽片段在序列上充分相似的多肽片段。在一个实施方案中，多肽片段与选自SEQ ID NO：5-274的多肽片段可具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88或89％的序列同一性。在另一个实施方案中，所述多肽片段与选自SEQ ID NO：5-274的多肽片段可具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性。用于确定多肽片段与本发明的序列是否拥有某一序列同一性百分比的方法描述于上文中。
还设想本发明的蛋白质水解产物组合物还可包含未水解(即完整)蛋白质。未水解蛋白质可存在于基本上完整的制备物中(例如豆腐、玉米粗粉、牛奶等。)此外，未水解蛋白质可分离自植物来源的蛋白质源(例如，蛋白质源如苋属植物、竹芋、大麦、荞麦、低芥酸菜籽、木薯、桃豆(鹰嘴豆)、豆类、兵豆、羽扇豆、玉米、小米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、裸麦、高粱、向日葵、木薯、黑小麦、小麦等等)或分离自动物蛋白材料(合适的动物分离蛋白的实例包括酸酪蛋白、酪蛋白酸盐、乳清、白蛋白、明胶等)。在优选的实施方案中，蛋白质水解产物组合物还包含未水解蛋白质，该未水解蛋白质选自大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、大豆、小麦、动物、乳品、蛋类、以及它们的组合。取决于涉及的蛋白和组合物的期望用途，蛋白质水解产物和未水解蛋白质的相对比例能够并且将会不同。
B.制备蛋白质水解产物的方法
用于制备包含多肽片段混合物(其中所述多肽片段在每个羧基末端主要具有精氨酸残基或赖氨酸残基)的蛋白质水解产物的方法包括：使蛋白材料与肽链内切酶接触，所述肽链内切酶特异性地在精氨酸残基或赖氨酸残基的羧基末端侧裂解所述蛋白材料的肽键，从而产生蛋白质水解产物。用于制备蛋白质水解产物的蛋白材料或蛋白材料的组合可以并且将会不同。合适的蛋白材料的实例详述如下。
(a)大豆蛋白材料
在一些实施方案中，蛋白材料可为大豆蛋白材料。可在本发明的方法中使用多种大豆蛋白材料以生成蛋白质水解产物。一般来讲，大豆蛋白材料可根据本领域已知的方法源自于全大豆。全大豆可以是标准大豆(即，非转基因大豆)、转基因大豆(如具有经修饰的脂肪的大豆、具有经修饰的碳水化合物的大豆、具有经修饰的蛋白的大豆，等等)或它们的组合。大豆蛋白材料的合适实例包括大豆提取物、豆奶、豆奶粉、豆腐、大豆粉、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、以及它们的混合物。
在一个实施方案中，该方法中使用的大豆蛋白材料可以是大豆分离蛋白(也称为分离大豆蛋白或ISP)。一般来讲，大豆分离蛋白基于无水基具有至少约90％大豆蛋白的蛋白含量。大豆分离蛋白可包括完整的大豆蛋白或部分水解的大豆蛋白。大豆分离蛋白可具有高含量的贮藏蛋白亚基如7S、11S、2S等。可用作本发明原料的大豆分离蛋白的非限制性实例可商购获得，例如从Solae，LLC(St.Louis，MO)，并且它们中包括ALPHATM5800、120、
500E、545、
620、
670、
760、EX 33、
PLUS 2600F、
PLUS 2640DS、
PLUS 2800、PLUS 3000、
XF 8020、XF 8021，以及它们的组合。
在另一个实施方案中，大豆蛋白材料可为大豆浓缩蛋白，其具有按无水基计约65％至小于约90％的蛋白质含量。可用于本发明中的适宜大豆浓缩蛋白的实例包括PROCONTM产品系列、ALPHATM12和ALPHATM5800，所有这些产品可从Solae，LLC商购获得。作为另外一种选择，大豆浓缩蛋白可与大豆分离蛋白共混以作为大豆蛋白材料的来源取代部分大豆分离蛋白。通常，如果用大豆浓缩蛋白替代一部分大豆分离蛋白，则大豆浓缩蛋白最多可替代按重量计最多约40％的大豆分离蛋白，且更优选可替代按重量计最多约30％的大豆分离蛋白。
在另一个实施方案中，所述大豆蛋白质材料可以是大豆粉，其具有按无水基计约49％至约65％的蛋白质含量。大豆粉可为脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、或全脂大豆粉。大豆粉可以与大豆分离蛋白或大豆浓缩蛋白共混。
在另一个实施方案中，大豆蛋白材料可以是基于离心机中的沉淀已被分成四种主要贮藏蛋白片段或亚基(15S、11S、7S和2S)的材料。一般来讲，11S片段高度富集了大豆球蛋白，而7S片段高度富集了β-大豆伴球蛋白。在另一个实施方案中，大豆蛋白材料可以是来自高油酸大豆的蛋白质。
(b)其他蛋白材料
在另一个实施方案中，蛋白材料可来自非大豆的植物。作为非限制性实例，合适的植物包括苋属植物、竹芋、大麦、荞麦、低芥酸菜籽、木薯、桃豆(鹰嘴豆)、豆类、兵豆、羽扇豆、玉米、小米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、裸麦、高粱、向日葵、木薯、黑小麦、小麦、以及它们的混合物。尤其优选植物蛋白包括大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、以及它们的组合。在一个实施方案中，植物蛋白材料可以是低芥酸菜籽粗粉、低芥酸菜籽分离蛋白、低芥酸菜籽浓缩蛋白、或它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是玉米或谷物蛋白粉、玉米或谷物浓缩蛋白、玉米或谷物分离蛋白、玉米或谷物胚芽、玉米或谷物谷蛋白、玉米或谷物谷蛋白粗粉、玉米或谷物面粉、玉米蛋白、或它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是大麦粉、大麦浓缩蛋白、大麦分离蛋白、大麦粗粉、大麦面粉、或它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是羽扇豆粉、羽扇豆分离蛋白、羽扇豆浓缩蛋白、或它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是燕麦片、燕麦粉、燕麦蛋白粉、燕麦分离蛋白、燕麦浓缩蛋白、或它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是豌豆粉、豌豆分离蛋白、豌豆浓缩蛋白、或它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是马铃薯蛋白粉、马铃薯分离蛋白、马铃薯浓缩蛋白、马铃薯粉、或它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是米粉、大米粗粉、大米蛋白粉、大米分离蛋白、大米浓缩蛋白、或它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可以是小麦蛋白粉、小麦谷朊粉、麦芽精、面粉、小麦分离蛋白、小麦浓缩蛋白、可溶性小麦蛋白、或它们的组合。
在另一个实施方案中，蛋白材料可来源于动物。在一个实施方案中，动物蛋白材料可来源于蛋类。合适的蛋类蛋白的非限制性实例包括蛋粉、干燥蛋固体、干燥蛋清蛋白、液体蛋清蛋白、蛋清蛋白粉、分离卵清蛋白、以及它们的组合。蛋类蛋白可来源于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋、或其他鸟类的蛋。在另一个实施方案中，蛋白材料可来源于乳品。合适的乳蛋白包括脱脂奶粉、分离乳蛋白、浓缩乳蛋白、酸酪蛋白、酪蛋白酸盐(例如酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙等)、乳清分离蛋白、乳清浓缩蛋白、以及它们的组合。乳蛋白材料可以来源于母牛、山羊、绵羊、驴子、骆驼、羊驼、牦牛、水牛等。在另一个实施方案中，蛋白可来源于陆栖动物或水栖动物的肌肉、器官、结缔组织、或骨骼。例如动物蛋白可为明胶，它通过部分水解胶原制备，胶原提取自牛或其他动物的骨、结缔组织、器官等等。
在本发明的方法中也设想使用大豆蛋白材料和至少一种其他蛋白材料的组合。即，可由大豆蛋白材料和至少一种其他蛋白材料的组合来制备蛋白质水解产物组合物。在一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可以由大豆蛋白材料和一种其他蛋白材料的组合制备，其他蛋白材料选自大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、动物材料、乳品和蛋类。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可以由大豆蛋白材料和两种其他蛋白材料的组合制备，其他蛋白材料选自大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、动物材料、乳品和蛋类。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可以由大豆蛋白材料和三种或更多种其他蛋白材料的组合制备，其他蛋白材料选自大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、动物材料、乳品和蛋类。
所用的大豆蛋白材料和其他蛋白材料的浓度可能并且将会不同。组合中使用的大豆蛋白材料的量可以在约1％至约99％总蛋白的范围内。在一个实施方案中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可以在约1％至约20％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可以在约20％至约40％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可以在约40％至约80％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可以在约80％至约99％总蛋白的范围内。同样的，组合中使用的其他蛋白材料(至少一种)的量可以在约1％至约99％总蛋白的范围内。在一个实施方案中，组合中使用的其他蛋白材料的量可以在约1％至约20％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的其他蛋白材料的量可以在约20％至约40％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的其他蛋白材料的量可以在约40％至约80％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的其他蛋白材料的量可以在约80％至约99％总蛋白的范围内。
(c)蛋白浆液
在本发明的方法中，通常将蛋白材料混合或分散在水中以形成按重量计包括约1％至约20％蛋白(基于“按原样”)的浆液。在一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约1％至约5％的蛋白(按原样)。在另一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约6％至约10％的蛋白(按原样)。在另一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约11％至约15％的蛋白(按原样)。在另一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约16％至约20％的蛋白(按原样)。
在将蛋白材料分散到水中后，可将蛋白材料的浆液加热到约70℃至约90℃约2分钟至约20分钟以失活推定的内源蛋白酶抑制剂。通常，对蛋白浆液的pH和温度进行调节以优化水解反应，特别是确保水解反应中使用的肽链内切酶的功能接近其最佳活性水平。蛋白浆液的pH可根据本领域一般已知的方法进行调节及监控。可将蛋白浆液的pH调节至并保持在约pH 5.0至约pH 10.0。在一个实施方案中，可将蛋白浆液的pH调节至并保持在约pH 7.0至约pH 8.0。在另一个实施方案中，可将蛋白浆液的pH调节至并保持在约pH 8.0至约pH 9.0。在一个优选的实施方案中，可将蛋白浆液的pH调节至并保持在约pH 8.0。在水解反应期间，优选地按照本领域已知的方法将蛋白浆液的温度调节至并保持在约40℃至约70℃。在一个优选的实施方案中，在水解反应期间可将蛋白浆液的温度优选地调节至并保持在约50℃至约60℃。一般来讲，高于此范围的温度可最终失活肽链内切酶，然而低于或高于此范围的温度趋于降低肽链内切酶的活性。
(d)肽链内切酶
水解反应一般由将肽链内切酶加入到蛋白材料浆液中引发。几种肽链内切酶在本发明的方法中适用。优选地，肽链内切酶将是食品级酶。肽链内切酶在如下的水解条件下可具有最佳活性：约pH 6.0至约pH 11.0，更优选约pH 7.0至约pH 9.0，温度约40℃至约70℃，更优选约45℃至约60℃。
一般来讲，肽链内切酶将是S1丝氨酸蛋白酶家族(MEROPSPeptidase Database，版本8.00A；//merops.sanger.ac.uk)的成员。优选地，肽链内切酶将在精氨酸、赖氨酸或两种残基的羧基末端侧裂解肽键。因此，肽链内切酶可以是胰蛋白酶样肽链内切酶，它在精氨酸、赖氨酸或两种残基的羧基末端侧裂解肽键。可将本发明上下文中的胰蛋白酶样肽链内切酶定义为具有大于100(参见实施例16)的胰蛋白酶比率的肽链内切酶。胰蛋白酶样肽链内切酶可以是赖氨酰肽链内切酶，它在赖氨酸残基的羧基末端侧裂解肽键。在优选的实施方案中，肽链内切酶可以是微生物来源的，更优选真菌来源的肽链内切酶。虽然胰蛋白酶和胰蛋白酶样肽链内切酶可以得自其他来源(例如动物来源)，动物来源的胰蛋白酶可能不能裂解蛋白原材料，如实施例14所示。
在一个实施方案中，肽链内切酶可以是来自尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)(美国专利5,288,627；美国专利5,693,520，每个专利均特此全文以引用方式并入本文)的胰蛋白酶样蛋白酶。该肽链内切酶被称作“TL1”并且在表A中给出了其蛋白质序列(SEQ ID NO：1)。TL1的登录号为SWISSPROT No.P35049，其MEROPS ID为S01.103。在另一个实施方案中，肽链内切酶可以是来自腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)(国际专利申请WO2005/040372-A1，其全文以引用方式并入本文)的胰蛋白酶样蛋白酶。该肽链内切酶被称作“TL5”并且在表A中给出了其蛋白质序列(SEQ ID NO：2)。TL5的保藏编号是GENESEQP：ADZ80577。在另一个实施方案中，肽链内切酶可以是来自腐皮镰孢菌相似种(Fusarium cf.solani)的胰蛋白酶样蛋白酶。该肽链内切酶被称作“TL6”，并且在表A中给出了其蛋白质序列(SEQ ID NO：3)。在另一个实施方案中，肽链内切酶可以是来自水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)的赖氨酰肽链内切酶。该肽链内切酶被称作“SP3”并且在表A中给出了其蛋白质序列(SEQ ID NO：4)。SP3的登录号为SWISSPROT No.15636，SP3的MEROPS ID为S01.280。在一个示例性实施方案中，肽链内切酶可以是TL1。
表A：示例性胰蛋白酶样蛋白酶。
在另一个实施方案中，肽链内切酶可包含与SEQ ID NOs：1、2、3、4或它们的片段具有至少80％、81％、82％、83％、84％或85％序列同一性的氨基酸片段。在另一个实施方案中，肽链内切酶可包含与SEQ IDNOs：1、2、3、4或它们的片段具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％或92％序列同一性的氨基酸片段。在另一个实施方案中，肽链内切酶可包含与SEQ ID NOs：1、2、3、4或它们的片段具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸片段。这些具有蛋白酶活性的序列中的任何一个序列的片段可以是活性酶的氨基酸序列，例如在加工后，例如在任何信号肽和/或肽原已经被裂解后。优选的片段包括SEQ ID NO：1的氨基酸25-248、SEQ ID NO：2的氨基酸26-251、SEQ ID NO：3的氨基酸18-250、或SEQ ID NO：4的氨基酸21-653。
对于本发明而言，可使用Needle程序测定两个氨基酸序列的比对结果，该程序来自EMBOSS软件包(Rice，P.，Longden，I.和Bleasby，A.(2000)EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite.Trends in Genetics 16，(6)第276-277页；http://emboss.org)2.8.0版。Needle程序执行全序列比对算法，该算法描述于Needleman，S.b.和Wunsch，C.D.(1970)J.Biol.48，443-453。使用的取代矩阵为BLOSUM62，空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5。一般来讲，通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来测定序列同一性百分比，其中比较窗口中的氨基酸序列部分与参比序列(不包括添加或删除)相比可包括添加或删除(即间隙)以达到最佳的两序列比对效果。百分比通过以下方法进行计算：测定两序列中具有相同氨基酸以产生匹配位置的位置数目，将该匹配位置的数目除以比较窗口两序列中最短序列的位置总数，并且所得结果乘以100来获得序列同一性的百分比。
技术人员将理解一个氨基酸残基可被另一个具有相似侧链、不影响多肽功能的氨基酸残基取代。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸为苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯基丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。因此肽链内切酶可具有至少一个针对SEQ ID：1、2、3或4的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，肽链内切酶可具有约50个针对SEQ ID：1、2、3或4的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约40个针对SEQ ID：1、2、3或4的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约30个针对SEQ ID：1、2、3或4的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约20个针对SEQ ID：1、2、3或4的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约10个针对SEQ ID：1、2、3或4的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约5个针对SEQ ID：1、2、3或4的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约一个针对SEQ ID：1、2、3或4的保守氨基酸取代。
表B中给出了蛋白材料和肽链内切酶的多种组合。
表B：优选的组合。
| 蛋白材料 | 肽链内切酶 |
| 大豆 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆 | TL1 |
| 大豆 | TL5 |
| 大豆 | TL6 |
| 大豆 | SP3 |
| 大麦 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大麦 | TL1 |
| 大麦 | TL5 |
| 大麦 | TL6 |
| 大麦 | SP3 |
| 低芥酸菜籽 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 低芥酸菜籽 | TL1 |
| 低芥酸菜籽 | TL5 |
| 低芥酸菜籽 | TL6 |
| 低芥酸菜籽 | SP3 |
| 羽扇豆 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 羽扇豆 | TL1 |
| 羽扇豆 | TL5 |
| 羽扇豆 | TL6 |
| 羽扇豆 | SP3 |
| 玉米 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 玉米 | TL1 |
| 玉米 | TL5 |
| 玉米 | TL6 |
| 玉米 | SP3 |
| 燕麦 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 燕麦 | TL1 |
| 燕麦 | TL5 |
| 燕麦 | TL6 |
| 燕麦 | SP3 |
| 豌豆 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 豌豆 | TL1 |
| 豌豆 | TL5 |
| 豌豆 | TL6 |
| 豌豆 | SP3 |
| 马铃薯 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 马铃薯 | TL1 |
| 马铃薯 | TL5 |
| 马铃薯 | TL6 |
| 马铃薯 | SP3 |
| 大米 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大米 | TL1 |
| 大米 | TL5 |
| 大米 | TL6 |
| 大米 | SP3 |
| 小麦 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 小麦 | TL1 |
| 小麦 | TL5 |
| 小麦 | TL6 |
| 小麦 | SP3 |
| 蛋 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 蛋 | TL1 |
| 蛋 | TL5 |
| 蛋 | TL6 |
| 蛋 | SP3 |
| 乳品 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 乳品 | TL1 |
| 乳品 | TL5 |
| 乳品 | TL6 |
| 乳品 | SP3 |
| 动物蛋白(例如明胶) | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 动物蛋白(例如明胶) | TL1 |
| 动物蛋白(例如明胶) | TL5 |
| 动物蛋白(例如明胶) | TL6 |
| 动物蛋白(例如明胶) | SP3 |
| 大豆和大麦 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和大麦 | TL1 |
| 大豆和大麦 | TL5 |
| 大豆和大麦 | TL6 |
| 大豆和大麦 | SP3 |
| 大豆和低芥酸菜籽 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和低芥酸菜籽 | TL1 |
| 大豆和低芥酸菜籽 | TL5 |
| 大豆和低芥酸菜籽 | TL6 |
| 大豆和低芥酸菜籽 | SP3 |
| 大豆和羽扇豆 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和羽扇豆 | TL1 |
| 大豆和羽扇豆 | TL5 |
| 大豆和羽扇豆 | TL6 |
| 大豆和羽扇豆 | SP3 |
| 大豆和玉米 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和玉米 | TL1 |
| 大豆和玉米 | TL5 |
| 大豆和玉米 | TL6 |
| 大豆和玉米 | SP3 |
| 大豆和燕麦 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和燕麦 | TL1 |
| 大豆和燕麦 | TL5 |
| 大豆和燕麦 | TL6 |
| 大豆和燕麦 | SP3 |
| 大豆和豌豆 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和豌豆 | TL1 |
| 大豆和豌豆 | TL5 |
| 大豆和豌豆 | TL6 |
| 大豆和豌豆 | SP3 |
| 大豆和马铃薯 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和马铃薯 | TL1 |
| 大豆和马铃薯 | TL5 |
| 大豆和马铃薯 | TL6 |
| 大豆和马铃薯 | SP3 |
| 大豆和大米 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和大米 | TL1 |
| 大豆和大米 | TL5 |
| 大豆和大米 | TL6 |
| 大豆和大米 | SP3 |
| 大豆和小麦 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和小麦 | TL1 |
| 大豆和小麦 | TL5 |
| 大豆和小麦 | TL6 |
| 大豆和小麦 | SP3 |
| 大豆和蛋 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和蛋 | TL1 |
| 大豆和蛋 | TL5 |
| 大豆和蛋 | TL6 |
| 大豆和蛋 | SP3 |
| 大豆和乳品 | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和乳品 | TL1 |
| 大豆和乳品 | TL5 |
| 大豆和乳品 | TL6 |
| 大豆和乳品 | SP3 |
| 大豆和动物蛋白(例如明胶) | 胰蛋白酶样蛋白酶 |
| 大豆和动物蛋白(例如明胶) | TL1 |
| 大豆和动物蛋白(例如明胶) | TL5 |
| 大豆和动物蛋白(例如明胶) | TL6 |
| 大豆和动物蛋白(例如明胶) | SP3 |
取决于蛋白材料的来源、所需的水解度和水解反应的持续时间，加入到蛋白材料中的肽链内切酶的量能够并且将会不同。肽链内切酶的量可以在每千克蛋白材料约1mg酶蛋白至约5000mg酶蛋白的范围内。在另一个实施方案中，它的量可以在每千克蛋白材料10mg酶蛋白至约2000mg酶蛋白的范围内。在另一个实施方案中，它的量可以在每千克蛋白材料约50mg酶蛋白至约1000mg酶蛋白的范围内。
技术人员将会认识到水解反应的持续时间能够并且将会不同。一般来讲，水解反应的持续时间可以在几分钟至多个小时的范围内，例如约30分钟至约48小时。为了终止水解反应，可将组合物加热至足以失活肽链内切酶的温度。例如，把组合物加热至大约90℃将基本上热失活肽链内切酶。
(II)包含蛋白质水解产物的冷冻甜食的制备
详述于上文的(I)部分中的冷冻甜食，由任何详述于(I)A部分中的蛋白质水解产物组合物和任何可食用的材料组成。作为另外一种选择，所述冷冻甜食可包含任何代替乳品的蛋白质水解产物组合物。作为另外一种选择，所述冷冻甜食可包括可食用材料和任何本文所述的分离多肽片段。
A.蛋白质水解产物组合物的内含物
蛋白质水解产物在冷冻甜食中的浓度能够并且将会根据所制造的产品而变化。在包含高百分比的乳品蛋白质的实施方案中，蛋白质水解产物的百分比将较低。而在不加入乳品蛋白质的实施方案中，蛋白质水解产物在各种冷冻甜食中的百分比将较高。因此，在各种冷冻甜食中的蛋白质成分中，蛋白质水解产物的浓度可以是按重量计少于约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。
取决于所期望的冷冻甜食产品，选择的与可食用材料组合的特定蛋白质水解产物组合物能够并且将会不同。在一些实施方案中，蛋白质水解产物组合物可来源于大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、动物、蛋类、或它们的组合。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可来源于大豆和至少一种其他蛋白来源的组合，其他蛋白来源选自大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、动物、乳品和蛋类。在可供选择的实施方案中，蛋白质水解产物组合物可包含不同蛋白质水解产物的组合。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可包含分离的或合成的多肽，该多肽选自由SEQ ID NO：5-274组成的氨基酸序列。
取决于用于制造水解产物和所期望的冷冻甜食的原料，蛋白质水解产物组合物的水解度也将不同。例如，当类似冰淇淋的冷冻甜食包含一定量的含大豆的蛋白质水解产物组合物时，在一些可能期望使苦的感官特性最小化的实施方案中，可选择具有接近或小于1％而非6％的水解度的大豆蛋白水解产物组合物。此外，在可供选择的实施方案中，当可能期望在冷冻甜食中使谷物和大豆/豆类感官特性最小化时，可选择具有接近或大于6％而非1％的水解度的大豆蛋白水解产物组合物。
B.任选的与乳品的混合
蛋白质水解产物组合物可任选地与乳品混合。在一些实施方案中，乳品的浓度按重量计可以为约95％、90％、80％、70％、60％或50％，而蛋白质水解产物的浓度按重量计可以为约5％、10％、20％、30％、40％或50％。在其他实施方案中，乳品的浓度按重量计可以为约40％、30％、20％、10％、5％或0％，而蛋白质水解产物的浓度按重量计可以为约60％、70％、80％、90％、95％或100％。在一个实施方案中，乳品的浓度按重量计可在约50％至约95％的范围内，而蛋白质水解产物的浓度按重量计可在约5％至约50％的范围内。在另一个实施方案中，乳品的浓度按重量计可在约0％至约50％的范围内，而蛋白质水解产物的浓度按重量计可在约50％至约100％的范围内。
C.加工为冷冻甜食产品
用于制造包含蛋白质水解产物的冷冻甜食的方法，与用于用百分之百的乳品制造冷冻甜食的方法相似。
包含蛋白质水解产物的冷冻甜食将被加工为具有多种形状的多种冷冻甜食产品。所生产的冷冻甜食能够是行业中已知的任何冷冻甜食产品。在一个优选的实施方案中，冷冻甜食可以是冰淇淋或类似冰淇淋。冷冻甜食的非限制性实例包括冰冻果子露、冰糕、无乳油冰淇淋、冷冻酸奶、软质奶油冰淇淋、棒冰、沙冰、意大利冰淇淋或它们的组合。冷冻甜食可与其他可食用成分相结合，所述可食用成分例如薄酥饼、如冰淇淋三明治或冰淇淋甜筒中的饼干或甜筒、或者如圣代冰淇淋中的适当的调味料(例如焦糖、巧克力调味料、水果调味料等)。此外，冷冻甜食可包含可食用的内含物(例如巧克力碎、水果片、糖果、蛋糕块、布朗尼块、饼干面团、饼干块、坚果等)或不可食用的内含物(棒冰棍等)冷冻甜食也可被成型为挤出型。
一般而言，冷冻甜食中的可食用材料由脱脂乳、减脂乳、2％乳、全脂乳、奶油、炼乳、酸奶、酪乳、奶粉、脱脂奶粉、乳蛋白、酸酪蛋白、酪蛋白酸盐、(例如，酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙等)、乳清浓缩蛋白、乳清分离蛋白、大豆分离蛋白、大豆蛋白水解产物、乳清水解产物、巧克力、可可粉、咖啡、茶、果汁、蔬菜汁，以及行业中已知的和使用的任何其他成分组成。冷冻甜食可进一步包含甜味剂(例如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖糊精、三氯蔗糖、玉米糖浆(液体或固体)、蜂蜜、枫糖浆等)、调味剂(例如巧克力、巧克力提取物、可可粉、香草精、香草醛、香草风味剂、麦芽粉、水果香料、薄荷、焦糖、绿茶、榛果、姜、椰子、开心果、盐等)、乳化或增稠剂(例如卵磷脂、角叉菜胶、纤维素胶、纤维素凝胶、淀粉、阿拉伯胶、黄原胶以及行业中已知的和使用的任何其他增稠剂)；稳定剂、脂质材料(例如低芥酸菜籽油、向日葵油、高油酸向日葵油、脂肪粉末等)、防腐剂(例如山梨酸钾、山梨酸以及行业中已知的和使用的任何其他防腐剂)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、抗坏血酸钠等)、着色剂、维生素、矿物质、或它们的组合。
在一个优选的实施方案中，冷冻甜食产品可类似于冰淇淋。所述“冰淇淋”产品可通过所有冰淇淋产品通用的方法成形，所述方法包括成分的共混、巴氏灭菌、均化、冷却、熟化、冷冻、包装和硬化。调味剂可以在巴氏灭菌步骤之后于调味剂槽中加入。成分可以是液体或是干燥的，或者是二者的组合。产品可通过分批方法或连续方法制造。共混温度取决于成分的性质，但其必须高于任何脂肪的熔点，并足以水合用作稳定剂的胶。巴氏灭菌一般在高温下进行较短时间，其中匀化器被整合进巴氏灭菌体系，尤其如FDA的细菌学分析手册(Bacteriological Analytical Manual)所述，该文献以引用方式并入本文。可基于典型的行业标准进行冷冻和包装，以完成加工过程并生产出在等于或低于0°F维持在架藏稳定的温度的产品。
用于制备本发明的冷冻甜食组合物的方法可进一步包括热处理，以对所述冷冻甜食组合物进行巴氏灭菌或消毒。巴氏灭菌在所述甜食组合物冻结前进行。巴氏灭菌一般包括：在约155°F至约270°F，更典型地约175°F至约195°F的温度加热；约0.1至约10个大气压，更典型地约1至约1.5个大气压的压力；约3秒至约30分钟，更典型地约4秒至约25秒的时间。加热、压力和时间参数彼此独立。
用于制备本发明的冷冻甜食组合物的方法可进一步包括在所述甜食组合物冻结前使其均化，以帮助蛋白质在所述冷冻甜食组合物中均匀分布。冷冻甜食组合物通常在145°F至170°F的温度范围进行均化。具体地讲，均化通过将脂肪滴的大小减小至非常小的直径或粒度，使冷冻甜食组合物能够具有更加均匀的脂肪悬浮液。适当地，冷冻甜食组合物能够采用单阶段均化过程，在约1000磅/平方英寸至约4000磅/平方英寸进行高速、高剪切混合。作为另外一种选择，也可采用多阶段均化过程，其中所有阶段的总压力为约1000磅/平方英寸至约4000磅/平方英寸之间。例如，在一个两阶段过程中，第一均化阶段为约2000磅/平方英寸至约3,000磅/平方英寸，而第二均化阶段为约250磅/平方英寸至约750磅/平方英寸。
巴氏灭菌和均化过程可以彼此独立地进行，或者可以顺序地进行，即，巴氏灭菌和均化过程均被采用，其中首先进行巴氏灭菌，然后进行均化。巴氏灭菌和均化的参数，当它们被单独采用时与二者均被采用时是相同的。
当使用本文所述的蛋白质水解产物组合物在冷冻甜食产品中替代其他蛋白质源时，优选的蛋白质替代量为最多100％。当使用本文所述的蛋白质水解产物组合物在冷冻甜食中部分替代乳品蛋白质时，优选的蛋白质替代量为20-35％，最优选的蛋白质替代量为30％。
定义
为了更好的理解本发明，下文定义了几个术语。
术语“冷冻甜食”宽泛地指安全和适当的成分组合的冷冻的混合物，所述成分包括但不限于乳、甜味剂、稳定剂、乳化剂、着色剂和调味剂。也可包括例如蛋制品和淀粉水解产物的其他成分。具体的冷冻甜食包括冰淇淋及其低脂肪品种、软质奶油冰淇淋、无乳油冰淇淋(包含植物脂肪的冷冻甜点)、冰冻果子露和冰糕。这些产品中的一些以软质冷冻或硬质冷冻的形式被提供。作为冷冻甜食被包括在内的还有parevine类产品(非乳品的冷冻甜点)，此类产品与冰淇淋及其各种形式相似，不同的是乳品已被安全和适当的成分替代。
术语“水解度”指裂解的肽键占总数的百分比。
术语“肽链内切酶”是指在低聚肽或多肽链中水解内部肽键的酶。肽链内切酶类包括酶亚类EC 3.4.21至25(国际生物化学与分子生物学联盟酶分类体系)。
“食品级酶”是公认安全(GRAS)认可的并且当被生物体如人消耗时是安全的酶。通常，酶和可从其中得到酶的产品可根据适用的法律法规进行制备。
“水解产物”是当化合物通过水效应裂解时获得的反应产物。在热降解、化学降解或酶降解后产生蛋白质水解产物。反应期间大分子裂解成较小的蛋白、可溶性蛋白、肽段和游离氨基酸。
如那些用于描述术语象“谷物”、“大豆/豆类”、或“苦味”的术语“感官特性”，根据如实施例6中详述的SQS评分体系进行测定。
术语“可溶性固体指数”是指可溶性蛋白或可溶性固体的百分比。
如本文所用，术语“分离大豆蛋白”或“大豆分离蛋白”是指具有基于不含水分至少约90％的大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。大豆分离蛋白由大豆形成，其形成方式为：将大豆的皮和胚芽从子叶上去除，将子叶压成片或碾碎并将片状或碾碎的子叶去油，将子叶的大豆蛋白和碳水化合物与子叶纤维分离，然后将大豆蛋白与碳水化合物分离。
如本文所用，术语“大豆浓缩蛋白”是指具有基于不含水分约65％至小于约90％的大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。大豆浓缩蛋白也包含大豆子叶纤维，通常基于不含水分按重量计约3.5％至最多约20％的大豆子叶纤维。大豆浓缩蛋白由大豆形成，其形成方式为：去除大豆的皮和胚芽，将子叶压成片或碾碎并将片状或碾碎的子叶去油，然后将大豆蛋白和大豆子叶纤维与子叶的可溶碳水化合物分离。
如本文所用，术语“大豆粉”是指脱脂的、部分脱脂的、或全脂的大豆材料的粉碎形式，其尺寸使得颗粒可通过100目(美国标准)筛网。利用常规的大豆研磨方法将大豆饼、碎片、薄片、粗粉、或这些材料的混合物粉碎成大豆粉。大豆粉具有基于不含水分约49％至约65％的大豆蛋白含量。优选将所述粉末研磨地非常细，最优选使得有小于约1％的粉末保留在300目(美国标准)筛网上。
如本文所用，术语“大豆子叶纤维”是指包含至少约70％的饮食纤维的大豆子叶多糖部分。大豆子叶纤维通常包含一些微量大豆蛋白，但是也可为100％纤维。如本文所用，大豆子叶纤维不涉及或包括大豆皮纤维。一般来讲，大豆子叶纤维由大豆形成，其形成方式为：去除大豆的外壳和胚芽，将子叶压成片或碾碎，并且从压成片或碾碎的子叶中移除油，然后将大豆子叶纤维与子叶中的大豆材料及碳水化合物分离。
“胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”是一种优先在精氨酸残基或赖氨酸残基的羧基末端侧裂解肽键的酶。
当介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词“一个”和“所述”旨在表示一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在表示包容性并且表示除列出要素外还可以有其他要素。
在不脱离本发明范围的条件下，可对以上化合物、产品和方法进行各种更改，这意味着可将上文描述和下文实施例中包含的所有内容理解为例证性的而非限定性的。
实施例
以下实施例示出了本发明的实施方案。
实施例1：用胰蛋白酶样肽链内切酶TL1水解大豆分离蛋白
将大豆分离蛋白水解成更小的肽段以试图提高其溶解度并改进其感官特性。真菌胰蛋白酶样肽链内切酶TL1来自尖孢镰孢菌，其序列表示为本专利申请的SEQ ID NO：1，选择该酶是因为它裂解精氨酸或赖氨酸残基的C末端侧的肽链，而其他肽酶已被证实裂解大豆蛋白的任意肽键。
通过采用温和混合以减少起泡，将320g
500E(Solae，St.Louis，MO)分散于3680g水中，制备了8％的大豆分离蛋白(ISP)浆液。如需要的话加入两滴消泡剂。将该溶液加热到80℃5分钟以失活任何可能存在的丝氨酸蛋白酶抑制剂。将混合物冷却到50℃并用食品级KOH(50％w/w溶液)将pH调节到8.0。在存在0、75mg、350mg、650mg、或950mg TL1/kg大豆蛋白的情况下，将8％大豆蛋白浆液的等分试样(800mL)在50℃培养60分钟。将样本加热到85℃并保持5分钟以失活所述酶。用冰冷却样本并将其贮存于4℃。
水解度(％DH)是指被水解的特定肽键的百分比(即，裂解肽键的数目占起始蛋白质中存在的肽键总数的百分比)。使用三硝基苯磺酸(TNBS)方法评估％DH。该方法是一种用于测定食物蛋白质水解产物水解度的精确的、可重复的和一般适用的方法。就该方法而言，将0.1g大豆蛋白质水解产物溶解在100mL的0.025N氢氧化钠中。将水解产物溶液的等分试样(2.0mL)与8mL的0.05M硼酸钠缓冲液(pH9.5)混合。用0.20mL 10％三硝基苯磺酸处理两mL经缓冲的水解产物溶液，然后室温暗处培养15分钟。加入4mL 0.1M亚硫酸钠-0.1M磷酸钠溶液(1∶99比率)终止反应，在420nm处读取吸光度。使用0.1mM的甘氨酸溶液作为标准品。下列计算被用于测定甘氨酸标准溶液的回收百分比：[(420nm的甘氨酸吸光度-420nm的空白吸光度)×(100/0.710)]。94％或更高的值被认为是可接受的。
表1给出了每个样本的TNBS平均值和％DH。它显示水解在6％DH左右时开始保持稳定水平，这能反映出易于裂解的精氨酸和赖氨酸位点的数目。该实验表明用350mg/kg的TL1消化一小时能生产足够的水解产物。
表1：大豆蛋白水解产物的水解度
实施例2：TL1水解产物的SDS-PAGE分析
基本如实施例1所述制备了具有0.3％、2.2％、3.1％、4.0％和5.0％DH的TL1水解产物。通过采用标准程序的SDS-PAGE，分析了上述每一个的等分试样以及未水解的大豆分离蛋白。该分析允许比较大豆水解产物中的多肽和那些起始大豆蛋白的分子大小。图1示出了考马斯亮蓝(Coomassie)染色凝胶的图像。未水解大豆分离蛋白包括大小约5kDa至约100kDa的多肽。虽然0.3％DH水解产物中的多肽大小范围与原料的大小范围相似，但该水解产物包含附加的小多肽片段。％DH更高的水解产物基本上没有大于约20至30kDa的多肽，而是都有附加的小(＜5kDa)多肽。2.2％、3.1％和4.0％DH的水解产物的多肽模式相当类似。然而5.0％DH的水解产物具有比其他水解产物更窄的多肽大小范围(～0.1-20kDa)。具体地讲，在5.0％DH水解产物中不存在7S和11S亚基条带(参见图1，泳道8)。
实施例3：通过LC-MS对TL1水解产物中肽片段的分析
通过液相色谱质谱(LC-MS)鉴定实施例1制备的TL1水解产物中的肽段。通过将包含2mg各TL1水解产物的等分试样与0.1％甲酸(1mL)在玻璃小瓶中混合并旋涡振荡1-2分钟，制备了用于LC-MS的样品。将混合物于13,000rpm离心5分钟。上清液的一份等分试样(25μL)被注入C18 HPLC分析柱(15cm×2.1mm id，5μm；Discovery Bio WidePore，Supelco，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，在HP-1100(HewlettPackard；Palo Alto，CA)HPLC仪上。表2中示出了色谱流出曲线；溶剂A是0.1％甲酸；溶剂B是在乙腈中的0.1％甲酸，流量为0.19mL/min，柱温为25℃。
表2：HPLC溶剂色谱流出曲线。
用分路器体系将LC洗脱液的等分试样(10μL)递送到ESI-MS源以进行MS分析。使用Thermo Finnigan LCQDeca离子阱质谱仪分析所述肽，该仪器配备具有动态排除扫描功能的数据依赖型MS/MS。ESI-MS在阳离子模式下运行，毛细管温度为225℃，电喷雾针设置为电压5.0kV，扫描范围为m/z 400-2000。通过Sequest搜索引擎(BIOWORKSTM软件，Thermo Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)而不设置酶搜索参数去卷积原始的MS/MS数据。通过搜索标准数据库对肽进行鉴定，如在National Institutes of Health的National Center forBiotechnology Information(NCBI)或来自Swiss Institute ofBioinformatics的Swiss-Prot。
肽显示于表3中。几乎每一肽片段都在羧基末端具有精氨酸或赖氨酸(三个片段在羧基末端具有谷氨酰胺)。末端是精氨酸残基的片段大约是末端是赖氨酸残基的片段的两倍。
肽段鉴定揭示了β-大豆伴球蛋白α-亚基、β-大豆伴球蛋白β-亚基、大豆球蛋白亚基G1、大豆球蛋白亚基G3和大豆球蛋白Gy4的水解产物存在于每个TL1水解产物中。在每个水解产物中检测到了许多相同的肽段。5.8％DH和6.1％DH水解产物还包含来自P24油质蛋白异构体A的片段。6.1％DH水解产物揭示了来自其他蛋白质的片段的存在，即胰蛋白酶抑制剂Kti3。
表3：具有不同水解度(DH)的水解产物中的肽段
实施例4：通过MALDI-MS分析具有高水解度的TL1水解产物中
的肽段
还通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)分析了在实施例1中制备的6.1％DH的大豆水解产物中的肽段。如实施例3所述制备样本并通过HPLC分析样本，不同的是将最后的洗脱步骤延长至50分钟并在Bio-Rad组分收集器上每隔1分钟收集组分。组分#4-48在Genevac蒸发器，在＜30℃条件下被完全蒸发。
就此而言，将干燥样本溶解在200μL 1％三氟乙酸(TFA)的50％乙腈溶液中。将每一样品的等分试样(1.5μL)与1.5μL的MALDI基质溶液(6.2mg α-氰基-4-羟基肉桂酸/ml 36％甲醇(v/v)，56％乙腈(v/v)和8％水)。将样品旋涡振荡、离心，并将1μL点样于不锈钢MALDI点样板上。选择十三个具有高质量MS谱的样本用于进一步纯化和MS/MS分析。在PCR管中干燥每个组分并将其重悬浮在10μL 0.1％甲酸的1％乙腈溶液中，涡旋30秒，2000rpm离心10秒。重复涡旋和离心步骤5次。使用NuTip(10μL多孔石墨碳SPE枪头)纯化肽混合物。使用预湿的(0.1％甲酸的60％乙腈溶液，随后用0.1％甲酸平衡)枪头从包含样本的PCR管中提取肽。将完整的样本溶液吸入枪头，然后排回管中，反复50次。然后用0.1％甲酸(10μL)洗涤(吸入和排出)加入样本的枪头五次。最后，用10μL0.1％甲酸的60％乙腈溶液从枪头洗脱所述肽。使用相同的溶剂混合物(10μL)重复洗脱过程十次。在高速真空下干燥所有样本洗脱液，然后将其重悬浮在1.5μL 1％TFA的50％乙腈溶液中和1.5μL MALDI基质溶液中。涡旋混合物30秒，2000rpm离心5秒，然后加样1μL在MALDI靶板上。在MALDI-TOF/TOF仪器(ABI-4700)上进行MS分析。该仪器配备ND:YAG(335nm)，并且在MS和MS/MS模式下以200Hz的重复频率运行。用20KeV加速度能量，在第一TOF处记录数据，并将单透镜间电压设置为6KeV。通过MASCOT搜索引擎(MATRIX SCIENCE)，用无酶搜索参数解卷积MS/MS数据。通过搜索标准数据库如NCBI或Swiss-Prot来鉴定所述肽。
通过MALDI-MS鉴定的肽显示于表4中。在这一分析中鉴定出了一些与LC-MS(ESI)所鉴定出的相同的肽片段。例如，β-大豆伴球蛋白的α-亚基、β-大豆伴球蛋白的β-亚基、大豆球蛋白亚基G1和大豆球蛋白Gy4的片段在两种分析中都存在。MALDI-MS分析检测到了其他多肽的片段，如β-大豆伴球蛋白的α主亚基、大豆球蛋白亚基G2和62K蔗糖-结合蛋白前体及种子成熟蛋白，LEA4。
表4：6.1％DH水解产物中的肽片段-MALDI-MS
实施例5：用TL1或
水解大豆分离蛋白
用TL1或
2.4L水解大豆分离蛋白以便能够比较不同水解产物的感官特性和功能，
2.4L是得自Novozymes(Bagsvaerd，Denmark)的微生物枯草杆菌蛋白酶。通过将72g
500E与828g自来水共混，温和混合5分钟，制备了8％的大豆分离蛋白浆液。加入了两滴消泡剂。用2N KOH将浆液pH调节至8.0。将浆液的等分试样(800g)混合加热至50℃。加入了不同量的TL1肽酶或
(ALC)蛋白酶，以获得0、1、2、4和6％的目标水解度。使用自动滴定仪将反应的pH保持在pH 8.0。在50℃孵育一段时间以产生所期望的水解度之后，样品被加热至85℃维持5分钟，以使酶失活，溶液被调节至pH 7.0。样品被置于冰上冷却并存储于4℃。使用TNBS方法(如实施例1所述)测定水解度(％DH)。表5给出了加入酶的量、反应时间、反应期间滴定pH时加入的KOH体积、平均TNBS值和％DH。
表5：TL1和
水解产物。
实施例6：TL1和
水解产物的感官分析
专有的感官筛选方法，舒莱定性筛选(Solae Qualitative Screening，SQS)方法，被用于评价实施例5中制备的TL1和
水解产物的感官特性。该方法基于试验样品与对照样品之间的直接比较，它既提供定性的也提供定向定量的差异。向一组七名经培训的评估员提供每个样本(稀释至5％浆液)的等分试样和对照样本，对照样本是未水解的大豆分离蛋白的5％浆液。用食品级磷酸将每个溶液的pH调节至7.0。
评估规程包括涡旋样本杯三次，保持杯底部在桌上。样本静置2秒钟后，每个评估员呷入约10mL(2茶匙)样本，在口中漱口10秒钟后吐出。评估员然后根据表6给出的量表评估试验样本和对照样本间的差异。
表6：SQS评分体系
表7给出了每个样本的平均SQS评分。TL1水解产物的评分一般为与对照样本(它是未处理的大豆分离蛋白)有中度差异。
(ALC)水解产物的评分为与对照样本有从轻微至极端的差异。
表7：TL1和水解产物的SQS评分
如果试验样本被评价为与对照样本不同(即，SQS评分为2、3、或4)，然后还可对试验样本进行进一步评估以提供关于试验样本如何不同于对照样本的诊断信息。因此，如果试验样本具有比对照样本轻微更多、中度更多、或极端更多的某项特性(参见表8)，那么赋予它们的评分分别是+1、+2、+3。同样的，如果试验样本具有比对照样本轻微更少、中度更少、或极端更少的某项特性，那么赋予它们的评分分别是-1、-2、-3。该分析提供了对试验样本和对照样本之间的定向定量差异的评估。
表8：SQS专门词汇
图2A和2B中给出了具有相似％DH水平的水解产物的九种风味特性的定向差异。在所有的％DH水平上，TL1水解产物与ALC水解产物相比在谷物和大豆/豆类特性方面有较大幅度的减少，在涩味和苦味特性方面有较小幅度的增加。％DH最高的ALC水解产物在苦味方面相对于对照物具有尤其大的增加。
实施例7：TL1和
水解产物的溶解度
实施例5中制备的每个TL1和水解产物的溶解度通过将水解产物稀释成2.5％固体并在pH7.0、4℃条件下贮藏一周进行估计。对样本进行视觉评估；图3A中给出了一个摄影图象。所有TL1水解产物具有少量沉淀，但是5.1％DH的TL1水解产物也具有相对于那些更低％DH的水解产物更高的透明性。相反的，具有最高％DH的ALC水解产物具有显著量的沉淀。图3B给出了6.1％DH TL1水解产物和13.8％DH ALC水解产物稀释成2.5％固体后在pH8.2、4℃条件下贮藏三周的管的图像。TL1水解产物无沉淀产生，这指示它在pH8.2、4℃条件下可长期保持稳定，然而ALC水解产物有沉淀产生。
对实施例5中制备的TL1和ALC水解产物测试了pH对溶解度的影响。每一水解产物的等分试样被调节至pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8或pH9，并于500×g将样品离心10分钟。将离心前溶液中固体物质的量与离心后溶液中固体物质的量进行比较，以给出可溶性固体指数(SSI)。TL1和ALC水解产物的％可溶性固体在图4A和4B中分别对应于pH的函数给出。所有溶液在约pH4至pH5的pH水平上具有降低的溶解度(即，大豆蛋白的等电点)，并且在更低的pH值时具有稍微提高的溶解度。然而，pH值更高时，所有TL1水解产物在pH水平高于pH6.0时具有优异的溶解度(图4A)，但是一些ALC水解产物在pH水平更高时具有降低的溶解度(图4B)。图4C给出了TL1和ALC水解产物的溶解度在低和高％DH时对应于pH函数的直接比较。
实施例8：TL1水解产物的光透射率
对实施例5中制备的一些TL1水解产物的透射率进行测量。就该测量而言，将1％DH和5.1％DH的TL1水解产物制备成不同的固体百分比(即，0.5％、1.0％、1.5％、2.0％和2.5％)。将每个蛋白浆液的等分试样放置在
Lab Expert unit(Formulaction，l’Union，France)中，并且记录每秒的透射率，总计60秒。表9给出了每个样本的平均透射百分比。5.1％DH的TL1水解产物在0.5％固体情况下具有37.4％的透射率，与之相比，1.0％DH的水解产物在0.5％固体情况下具有1.3％的透射率。这些数据证实了视觉观察的结果(参见图3A)。
表9：TL1水解产物的透射率
实施例9：用TL1或其他肽链内切酶制备的大豆水解产物的苦味
分析
基本上如实施例1和5所述，用TL1、
(ALC)或来自水解无色杆菌的赖氨酸肽链内切酶(SP3；SEQ ID NO：4)水解大豆分离蛋白。对酶浓度和反应条件进行选择，以产生约5-6％的％DH值，如实施例1所述的TNBS方法所测定。水解产物被呈递给五位评估人组成的小组进行评估，评估采用实施例6中所述的SQS方法，聚焦在苦味上。
平均SQS评分和诊断性苦味评分显示于表10中。TL1和SP3水解产物被评价为与对照样品(未水解的大豆分离蛋白)具有轻微差异。同样的，TL1和SP3水解产物的评分为苦味略少于对照样本。相反的，ALC水解产物的评分为与对照样本有极端差异，并且苦味比对照样本大得多。
表10：水解产物的SQS分析。
实施例10：中试TL1水解产物的物理特性
将大豆TL1水解产物的生产从小试规模提高到更大的中试规模，并且分析水解产物的感官特性和功能特性。就此而言，原料是大豆凝结蛋白。为了生产大豆凝结蛋白材料，用约pH6.5至约pH10的水溶液连续提取大豆粕、大豆粉、或大豆粗磨物，以将大豆粕/大豆粉/大豆粗磨物中的蛋白与不溶性材料如纤维分离开来。将低含量的亚硫酸盐加入到提取介质中，其浓度为基于大豆粕重量0.05％-0.15％。用约pH6.5-7.0的氢氧化钠水溶液对大豆粕、大豆粉、或大豆粗磨物进行第一次提取，然后用约pH8.5-10的溶液进行第二次提取。水与大豆粕/大豆粉/大豆粗磨物材料的重量比率为约8∶1至约16∶1。
在提取后，通过过滤或离心方法将提取物从不溶性材料中分离出来。然后用合适的酸将分离提取物的pH调节到约大豆蛋白的等电点(约pH4-5，或优选地pH4.4-4.6)附近以沉淀大豆凝结蛋白，以便大豆蛋白能从大豆可溶物中分离出来，大豆可溶物包括引起肠胃胀气的低聚糖和其他水溶性碳水化合物。合适的可食用酸包括盐酸、硫酸、硝酸、或乙酸。通过离心将沉淀的蛋白材料(凝结物)从提取物(乳清)中分离以生产大豆凝结蛋白材料。用水洗涤分离的大豆凝结蛋白材料以移除残余的可溶物，水与蛋白材料的重量比率为约5∶1至约12∶1。
用碱性溶液或碱土溶液如氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液将大豆凝结蛋白材料首先中和至约pH8.0至约pH9.0，优选地约pH8.0-8.5。将中和后的大豆凝结蛋白加热并冷却，优选地通过喷气加热和闪蒸冷却。然后，在有效水解大豆蛋白材料的温度和时间条件下，以TL1酶处理所述大豆蛋白材料，以使大豆蛋白水解产物具有约35-55的TNBS值。酶按从0.005％至0.02％酶蛋白(基于蛋白质凝乳加权标准)的浓度被加入大豆蛋白材料。酶与大豆凝结蛋白材料在40℃至60℃，优选地在约50℃下接触30分钟至120分钟，优选地50分钟至70分钟以水解蛋白。通过将水解的大豆蛋白材料加热至足以灭活酶的温度来终止水解。最优选地，水解的大豆凝结蛋白材料被如上所述喷气加热以灭活酶、闪蒸冷却然后喷雾干燥。
表11给出了一组典型的水解产物的反应参数。水解度采用TNBS方法测定，基本上如实施例1所述。每一样品的TNBS值和％DH也显示于表11中。对照样品包括未水解的大豆分离蛋白(即，
500E)和基本上可商购获得的大豆蛋白水解产物(即，用酶混合物水解至2.8％DH的XT 219)。
表11：中试TL1水解产物。
通过SDS PAGE使用标准方法分析TL1水解产物和对照样品，图5给出了凝胶的图像。该分析揭示TL1裂解了所有主要大豆贮藏蛋白亚基。
实施例11：中试TL1水解产物的溶解度和粘度
还检查了实施例10中制备的中试TL1水解产物和对照样品的溶解度。每一样品的等分试样被调节至pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8和pH9，并测定了可溶性固体指数(SSI)，基本上如实施例7中所述。如图6中所示，在pH6和更高的pH值，所有的TL1水解产物样品均几乎100％可溶，而水解的对照样品在pH6仅约40％可溶。此外，随着水解度的提高，在等电点(即，pH4-5附近)的溶解度增加。
几种TL1水解产物和对照样本的粘度在不同固体百分比(即，12-20％固体)条件下进行测定。样品使用小型瓦林混碎机，在总浆液含量为70克的条件下进行分散。样本共混总计四分钟，使用最小剪切力以减少泡沫。然后用布氏粘度计，使用小量样本承接器和锭子18在室温下分析样本。一式两份的制备和分析每个样本。图7是不同制备的粘度曲线图，单位是厘泊(cps)。批量分离物的粘度大于10,000cps-对布氏粘度计来说，在12％固体情况下它过于粘稠了。该分析揭示随着水解度提高，粘度降低，然而随着固体百分比提高，粘度提高。图8综合了粘度和溶解度数据。将溶解度表示为可溶性固体指数(SSI)和可溶性氮指数(NSI，它是水溶性氮百分比对应于总氮的函数)。如图8所示，随着水解度提高，粘度降低而溶解度增加
几种存在于TL1水解产物中的挥发性风味剂的量与存在于未水解大豆分离蛋白中的那些挥发性风味剂的量进行比较。使用标准GC技术测定挥发性风味剂。与未水解的大豆蛋白相比，TL1水解产物中的己醛、庚醛、戊醛、3-辛烯-2-酮和1-辛烯-3-醇的含量降低(图9A和9B)。
实施例12：中试TL1水解产物的感官分析
利用基本上如实施例6中所述的SQS方法，分析了实施例10中制备的中试TL1水解产物的风味谱。11或12位经过训练的评估人组成的小组通过与对照样品(即，未水解的大豆分离蛋白)的比较，对上述水解产物进行了评价。表12给出了平均SQS评分，图10A-D给出了诊断评分的曲线图。一般来讲，TL1水解产物相对于对照样品具有轻微减少的谷物和大豆/豆类特性以及较低的粘度，但是具有增加的苦味特性，尤其在水解度(％DH)较高的情况下更是如此。水解的对照样本(即，样本5-3)具有轻微减少的谷物特性，但是具有中度增加的苦味和收敛特性。因此，TL1水解产物的评分一般为苦味少于水解的对照样本。
表12：中试TL1水解产物的SQS评分。
| 样本编号 | 样本 | SQS评分 |
| 5-2 | 盲态对照物(未水解的对照物) | 4.8 |
| 5-3 | 对照物 | 3.2 |
| 5-7 | TL1，0.3％DH | 4.1 |
| 5-8 | TL1，0.9％DH | 3.6 |
| 5-4 | TL1，1.3％DH | 3.9 |
| 5-9 | TL1，1.6％DH | 3.7 |
| 5-5 | TL1，2.0％DH | 3.6 |
| 5-1 | TL1，2.7％DH | 3.2 |
| 5-6 | TL1，3.8％DH | 2.7 |
| 5-10 | TL1，5.2％DH | 2.7 |
图11给出了TL1水解产物的感官分析的总结，其中关键感官特性对应于水解度的函数进行绘图。当水解度增加时，水解产物的总体感官评分降低，然而当水解度增加时苦味评分提高。它显示具有小于约2％DH的水解产物风味最好，苦味最少。
实施例13：大豆TL1水解产物中肽片段的分析
具有不同水解度的TL1水解产物中的肽通过LC-MS分析进行鉴定，其中LC-MS使用
XL MS(Applied Biosystems Inc.(ABI)，Foster City，CA)和LCQ-Deca MS(ThermoFinnigan，Hertfordshire，Great Britain)。
大约(0.5-2.0mg)的每个样本被溶解于0.5mL的50mM碳酸氢铵中。将五μL加注到75μm内径柱上进行LC-MS/分析，使用数据依赖型采集(LC流量为180nL/min)。进行Nano-LC，LC Packings Ultimatenano-LC使用C18 PepMap100柱(Dionex，)/Eksigent 2D nano-LC使用C18 PepMap100柱(Dionex)。洗脱图谱显示于表13中。溶剂A为含5％乙腈、0.1％甲酸的MilliQ水，溶剂B为含95％乙腈、0.075％甲酸的MilliQ水)。
表13：LC-Pump梯度。
| 时间(分钟) | ％B |
| 0 | 5 |
| 3 | 5 |
| 8 | 25 |
| 40 | 60 |
| 45 | 95 |
样品分析采用配备有纳电喷雾源(Protana XYZ操纵器)的ABI
XL杂交QTOF MS/MS质谱仪进行。阳离子模式纳电喷雾由硼硅酸根纳电喷雾针在2.5kV条件下生成。用来自制造商的标准品每日校准仪器的m/z响应。使用Analyst QS软件中的信息依赖型数据采集(IDA)部件获取TOF质谱和产物离子质谱，采集参数如下：TOF MS和MS/MS的质谱范围分别是m/z 300-2000和70-2000。每秒累积一个TOF MS母离子谱，然后采集三个子离子谱，每个子离子谱3秒。从TOF MS向MS/MS的转换受肽的质量范围(m/z 300-2000)、母离子电荷态(2-4)和离子强度(＞50计数)触发。DP、DP2和FP设置分别为60、10和230，并且使用滚动碰撞能量。
使用Analyst QS软件(Applied Biosystems)处理肽电喷雾联用质谱。通过搜索标准数据库如NCBI或Swiss-Prot对肽进行鉴定，搜索使用MASCOT，版本1.9，同时有以下限制：没有酶具有最多一个不完全裂解位点；MS和MS/MS碎片离子的质量误差分别为0.8/2.0和0.8Da。选择的母离子电荷态为1-3。
就使用LCQ-Deca MS的LC-MS分析而言，样本通过以下方法制备：1)将包含2mg每个TL1水解产物的等分试样与0.1％甲酸(1mL)在玻璃小瓶中混合，涡旋1-2分钟，然后在离心机中13,000rpm离心混合物5分钟；或2)将包含3mg每个TL1水解产物的等分试样与0.1％甲酸(300uL)在微量离心管中混合，涡旋混合物1-2分钟。然后将全部混合物转移至预先清洁的C18枪头中(Glygen Corp.，Columbia，MD)用于肽分离。用0.1％甲酸的60％乙腈溶液(300μL)洗脱C18枪头进行清洁，并用0.1％甲酸(600μL)进行平衡。弃去用0.1％甲酸组分洗脱的材料，用0.1％甲酸的60％乙腈溶液(600μL)洗脱所述肽。将溶剂混合物在Genevac蒸发器上300℃蒸发10分钟，使得肽溶液的总体积减少到200μL。基本上如实施例3所述进行LC-MS分析。
表14给出了所有在大豆蛋白TL1水解产物中鉴定的肽。
表14：大豆TL1水解产物中的肽。
实施例14：用其他肽链内切酶水解大豆蛋白
用不同的肽链内切酶(例如SP3，来自镧素对镰孢菌的胰蛋白酶样蛋白酶(TL5；SEQ ID NO：2)、来自镧素对镰孢菌相似种的胰蛋白酶样蛋白酶(TL6；SEQ ID NO：3)、猪胰蛋白酶、或牛胰蛋白酶)处理大豆分离蛋白，以测定是否胰蛋白酶或来自另一来源的胰蛋白酶样蛋白酶能被用于水解大豆蛋白。
制备大豆分离蛋白的8％浆液(即，
500E)，调节至pH8，并与其中一种肽链内切酶混合使得终浓度为100mg蛋白酶/kg大豆蛋白。包括一种不包含蛋白酶的对照样本。浆液在50℃水浴混合培养2小时，然后加热灭活(80℃，30分钟)蛋白酶。将去离子水加入到每个样本中，得到终浓度5％的大豆蛋白。
为了评估水解度，在4-20％的三-甘氨酸凝胶(Novex Inc.，Wadsworth，OH)上通过SDS-PAGE对每个样品的等分试样进行了分析。如图12所示，TL1、SP3、TL5和TL6将大豆蛋白水解成更小的多肽片段，然而用猪或牛胰蛋白酶处理的大豆蛋白只有很少的水解或没有水解(参见泳道7和8)。在37℃和50℃(pH8)能观察到猪或牛胰蛋白酶不能裂解大豆蛋白的情况。
实施例15：通过Bowman-Birk抑制剂对胰蛋白酶样蛋白酶的抑制
猪或牛胰蛋白酶不能水解大豆蛋白材料的情况是可能的，因为大豆包含活性蛋白酶抑制剂，该抑制剂在大豆材料生产期间经热处理后依然存在。为了验证该假设，将蛋白酶与不同浓度的商业制备的Bowman-Birk抑制剂一起培养，然后测量残余酶活性。
用检测分析缓冲液(0.1M Tris，0.02％Brij 35，pH8.0)将蛋白酶稀释至0.001mg/mL，然后在微孔板的孔内与不同浓度的Bowman-Birk抑制剂(Cat#T-9777，Sigma-Aldrich)混合。板在室温下搅拌培养1小时。通过加入0.6mg/mL底物，Boc-Val-Leu-Gly-Arg-p-硝基苯胺(L-1205；Bachem Biosciences，Prussia，PA)，测量残余活性。在室温下，每隔10秒测量405nm处的吸光度，持续3分钟。从测得的405nm处吸光度的起始斜率计算活性。残余活性被计算为一个有抑制剂的孔中的活性相对于一个无抑制剂的孔中的活性的比值。
如表15所示，猪和牛胰蛋白酶与微生物蛋白酶相比，被浓度更低的Bowman-Birk抑制剂抑制。因此，它显示大豆材料包含抑制动物来源的胰蛋白酶活性的化合物。
表15：动物来源的蛋白酶的抑制
实施例16：胰蛋白酶比率和胰蛋白酶样蛋白酶的鉴定
开发了一种用于鉴定具有胰蛋白酶样活性的酶的检测分析法。就该方法而言，胰蛋白酶样活性使用显色底物和通式Suc-Ala-Ala-Pro-Xxx-pNA(Bachem Biosciences)进行测量，其中Xxx是二十种天然氨基酸残基中的任一种的三字母缩写形式，pNA为对-硝基苯胺。如果肽链内切酶在Xxx的羧基末端侧裂解了肽键，则会释放对-硝基苯胺，并且产生并基本如实施例15所述测量了泛黄的颜色。使用了十种pNA底物，其中Xxx为Ala、Arg、Asp、Glu、Ile、Leu、Lys、Met、Phe或Val。
测试以下肽链内切酶：SP3、TL1和猪胰蛋白酶。通过色谱法纯化所有酶以得到高纯度，即，在每个肽酶在考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上仅能看到一条带。测量每个酶的活性时，其pH值应使酶活性不低于最佳pH值时酶活性的一半，底物为Suc-Ala-Ala-Pro-Xxx-pNA。相对于这些底物，ALC的最佳pH是pH9，其他三种肽酶的最佳pH是pH10。检测缓冲液为100mM琥珀酸、100mMHEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl和0.01％Triton X-100，pH 9.0。二十μL的每一肽酶稀释液(稀释于0.01％Triton X-100中)被置于微量滴定板的十个孔中。将十种pNA底物的其中一种加入200μL到每个孔内，开始检测(将50mg底物溶解在1.0mLDMSO中，并用检测缓冲液进一步稀释到90x)。监控OD405是否开始提高，将其作为肽酶活性的量度。如果在4分钟的测量时间内不能获得线性曲线，则将肽酶进一步稀释并重复所述检测。
胰蛋白酶比率如下计算：底物包含精氨酸或赖氨酸时的最高活性除以底物为八种其他底物中的任何一种时的最高活性。将胰蛋白酶样肽链内切酶定义为一种具有大于100的胰蛋白酶比率的肽链内切酶。
表16给出了相对于底物为Suc-Ala-Ala-Pro-Xxx-pNA时的最高活性的活性水平，以及胰蛋白酶的比率。虽然该检测分析在pH9条件下进行并且三个受试肽酶的最佳pH大于pH9，这三个肽酶在pH9的活性大于在最佳pH时的活性的一半。因此，该分析显示水解无色杆菌蛋白酶(SP3)、镰孢属胰蛋白酶样蛋白酶(TL1)和猪胰蛋白酶是胰蛋白酶样肽链内切酶，而
(ALC)不是胰蛋白酶样肽链内切酶。
表16：不同肽酶的活性和胰蛋白酶比率。
实施例17：来源于大豆和乳品蛋白的组合的TL1水解产物
用TL1将大豆分离蛋白和乳品分离蛋白的组合水解至不同的水解度，以便能够评估该组合的功能特性和感官特性。
通过采用适度混合将大豆分离蛋白(
500E)和酪蛋白酸钠(Alanate 180，NZMP Inc../Fonterra Co-op Group Ltd.，Wellington，New Zealand)的50/50混合物分散在水中，制备了大豆和乳品蛋白的5％浆液。将混合物加热到80℃并保持五分钟，冷却至50℃，然后用1M NaOH将pH调节至8.0。上述浆液的等分试样被加热至50℃，同时中度混合，加入不同量的TL1(～17-600mg酶蛋白每kg完整蛋白)，以获得0、2％、4％和6％的目标％DH值。在50℃孵育一段时间(约60分钟)以产生所期望的水解度之后，样品被加热至90℃并维持3分钟以使酶失活。用冰冷却样本并将其贮存于4℃。使用TNBS方法(如实施例1所述)测定水解度(％DH)。
在两种大豆/乳品TL1水解产物(即，4.3％DH和6.7％DH)中测试pH对溶解度的影响。将每个等分试样调节至pH5、pH6、pH7、或pH8，并且样本在500×g离心10分钟。将离心前溶液中的固体物质的量与离心后溶液中的固体物质的量进行比较以得出可溶性固体指数(SSI)，以可溶性固体％作为pH的函数所作的图显示于图13中。两种溶液在约pH5(即，大豆蛋白的等电点附近)的pH水平均具有降低的溶解度。然而，两种大豆/乳品TL1水解产物在约pH6.0及更高的水平上都具有优异的溶解度。
实施例18：大豆/乳品TL1水解产物中肽片段的分析
实施例17中制备的大豆/乳品TL1水解产物中的肽段通过液相色谱质谱(LC-MS)、使用上文详述的方法(参见实施例3、4和13)进行鉴定。这一研究中鉴定的肽片段的序列列于表17中。鉴定到四种新的大豆来源的肽(即，SEQ ID NO：174、175、176和177)。乳品来源的序列是SEQ ID NO：178-197。
表17：大豆/乳品的TL1水解产物中的肽片段*。
实施例19：来源于其他蛋白材料的TL1水解产物
用TL1处理多种其他植物来源的蛋白材料以生成其他水解产物。小规模生产这些水解产物(即，实验室规模)。就此而言，低芥酸菜籽、小麦谷朊粉、或玉米胚芽蛋白的5％浆液在高于80℃的温度下变性五分钟。蛋白浆液用碱性溶液或碱土溶液如氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液中和至约pH8.0-8.5。然后用TL1酶在合适温度下处理每个蛋白浆液足够的时间。将TL1酶加入到蛋白浆液中，其浓度为基于凝结蛋白0.01％-0.08％的酶蛋白。该酶在约50℃接触凝结蛋白材料50分钟至70分钟以水解蛋白。通过将水解的大豆蛋白材料加热至足以灭活酶的温度来终止水解反应。
表18给出了一般的水解产物的反应参数。按摩尔氨基计，测量了TL1酶的活性。提高的TNBS值证明了酶的活性。酶活性显示受蛋白材料的悬浮状况或溶解度影响，虽然每个蛋白的活性不是最优化的。
表18：反应参数。
通过SDS PAGE使用标准方法分析TL1低芥酸菜籽、玉米、或小麦水解产物和未水解的对照样本。图14给出了凝胶的图像。该分析揭示TL1裂解了每个蛋白材料的所有主要蛋白亚基。
使用上文详述的方法鉴定低芥酸菜籽、玉米、或小麦TL1水解产物中的代表性的肽。表19、20和21分别给出了在低芥酸菜籽、玉米和小麦TL1水解产物中鉴定的代表性的肽。
表19：低芥酸菜籽的TL1水解产物中的肽。
表20：玉米粒(玉米)TL1水解产物中的肽。
表21：小麦TL1水解产物中的肽。
实施例20：大豆水解产物和完整乳品蛋白的组合的感官分析
大豆TL1水解产物与完整乳品蛋白进行组合(即，酪蛋白酸盐或乳清)。采用实施例6中所详述的SQS方法，将大豆水解产物和完整乳品蛋白的组合的感官谱与未水解(完整)的大豆和完整乳品蛋白的组合进行了比较。具有约2.1％DH水解度的TL1大豆水解产物被稀释为5％浆液。将未水解的大豆蛋白也稀释成5％浆液。在第一次试验中，TL1水解产物与酪蛋白酸钠混合(1∶1)并对对照样本进行评估，对照样本是未水解大豆蛋白与酪蛋白酸钠的混合物(1∶1)。在第二次试验中，TL1水解产物与甜味乳品乳清混合(4∶1)并对对照样本进行评估，对照样本是未水解大豆蛋白与甜味乳品乳清的混合物(4∶1)。
表22给出了每个样本的平均SQS评分和诊断评分。包括TL1水解产物的组合的评分一般为与对照样本有轻微差异。诊断评分显示TL1水解产物和完整乳品蛋白的组合相对于对照样本(即，未水解的大豆和完整乳品蛋白的组合)具有改善的感官特性。
表22：SQS分析。
实施例21：包含蛋白质水解产物(
XF8020)的冷冻甜食的分
析
利用TL1大豆水解产物
XF8020，在多种替代水平制备了类似冰淇淋的冷冻甜食产品。制备每一“冰淇淋”样品的第一步是在不锈钢容器中将磷酸盐加入水中并加热至100°F。加入所期望量的蛋白质水解产物(
XF8020)，使用螺旋桨式搅拌器中速混合上述组分5-10分钟，以分散蛋白质并使其水合。蛋白质彻底分散之后，将浆液温度升高至180°F，并低速混合浆液5分钟。将糖和玉米糖浆固体加入上述蛋白浆液，并以中速再连续混合3分钟。然后加入浓奶油和聚山梨酸酯60，以中速混合合并的成分3-5分钟，直到这些组分彻底分散。然后在180°F保持30秒，对混合物进行巴氏灭菌。巴氏灭菌之后，使用2阶段、单活塞匀化器均化上述混合物，其中匀化器设定为第二阶段500psi；第一阶段2500psi。均化之后，混合物被收集于事先灭菌的
瓶中并立即置于冰浴中，在冰浴中保持30分钟。冷却后的瓶子被置于35°F的步入式冷藏柜中并储存过夜。进行冷冻前，将香菜调味剂与上述冷却后的混合物混合。调味后的混合物被分配进泰勒批次冰淇淋冷柜(Taylor Batch Ice Cream Freezer)并在7分钟内冻结，达到24°F-26°F的温度。将混合物从冷柜中去除，并包装进有适当标记的1品脱Sweetheart K16A杯中。将样品杯底部向上置于塑料托盘上并置于气流冷冻器中于-20°F过夜，然后移至0°F冷柜中储存至接受评估。
表23至27显示在10％、20％、30％、40％和50％蛋白质水解产物替代水平的样品配方。
表23：采用10％蛋白质水解产物(
XF8020)的冷冻甜食配方
表24：采用20％蛋白质水解产物(
XF8020)的冷冻甜食产品配方
表25：采用30％蛋白质水解产物(
XF8020)的冷冻甜食产品配方
表26：采用40％蛋白质水解产物(
XF8020)的冷冻甜食产品配方
表27：采用50％蛋白质水解产物(
XF8020)的冷冻甜食产品配方
七名受过感官谱描述性分析方法训练的专门小组成员对一式三份的样品进行了评估。上述评估的目的，是通过与用百分之百的乳品制备的香草冰淇淋的风味特性相比较，定量根据本发明配制和生产的大豆蛋白“冰淇淋”产品的风味特性。以15分的强度标度对十九种风味特性进行了评估，在每一样品中，0分表示无/不适用而15分表示非常强/高。样品中检测的风味特性、风味特性的定义和所使用的风味特性强度标度参考样品列于表28中。
表28：香草风味冷冻甜食词汇
表29显示与对照(100％乳品)相比，专门小组成员对五种样品(10％、20％、30％、40％和50％)的平均强度评分。
表29：包含
XF8020的样品风味特性的平均评分
如图15和表29所示，大豆蛋白在样品中的存在直到替代水平等于或高于20％时才被检测到。大豆风味的强度在15分标度上保持在等于或低于2.0的强度水平，即使当样品包括50％大豆蛋白时也如此。实际上，乳香、乳脂味、焦糖味和复合香草香味相对于大豆/豆类在强度上均更强。此外，与100％乳品相比，10％大豆替代水平时乳香味仅有轻微减弱，而复合香草和香草/香草醛风味在10％大豆替代水平轻微增强，不过随着大豆替代水平升高至20％及以上，上述复合香草和香草/香草醛风味转而减弱。
图17显示由一组分别的74名消费者评估的在10％、20％和40％的大豆蛋白包含水平对大豆蛋白样品的接受度，上述消费者年龄为35-54，以愿意尝试香草风味甜点的身份被招募。样品以经过平衡的、顺序的单一方式呈递给每名消费者，其中每一样品被单独地提供，并在下一样品被评估前被拿走。提供的顺序经过循环和平衡，以使提供顺序效应导致的偏差最小化，与标准的感官测试规程相符。
如图17中的图所示，对产品样品平均的总体嗜好、外观嗜好、风味嗜好、口感嗜好和余味嗜好反应在10％和20％大豆蛋白包含水平与对全乳品冰淇淋对照样品的那些反应相比是相当的，不过平均嗜好评分在40％包含水平略微降低。
本实施例说明，包含一定量的替代乳品的大豆蛋白水解产物的、类似冰淇淋的冷冻甜食产品，可作为那些包含百分之百乳品的冷冻甜点产品的替代性冷冻甜点被接受。
实施例22：包含
120的冷冻甜食的分析
在不同的替代水平-10％、20％、30％、40％和50％，利用120制备了类似冰淇淋的冷冻甜点产品。制备每一“冰淇淋”样品的第一步是在不锈钢容器中将磷酸盐加入水中并加热至100°F。加入所期望量的
120，使用螺旋桨式搅拌器中速混合上述组分5-10分钟，以分散蛋白质并使其水合。蛋白质彻底分散之后，将浆液温度升高至180°F，并低速混合浆液5分钟。将糖和玉米糖浆固体加入上述蛋白浆液，并以中速再连续混合3分钟。将浓奶油和聚山梨酸酯60加入混合物中，以中速混合合并的成分3-5分钟，直到这些组分彻底分散。然后在180°F保持30秒，对混合物进行巴氏灭菌。巴氏灭菌之后，使用2阶段、单活塞匀化器均化上述混合物，其中匀化器设定为第二阶段500psi；第一阶段2500psi。均化之后，混合物被收集于事先灭菌的瓶中并立即置于冰浴中，在冰浴中保持30分钟。冷却后的瓶子被置于35°F的步入式冷藏柜中并储存过夜。进行冷冻前，将香菜调味剂与上述冷却后的混合物混合。调味后的混合物被分配进泰勒批次冰淇淋冷柜(Taylor Batch Ice Cream Freezer)并在7分钟内冻结，达到24°F至26°F的温度。将混合物从冷柜中去除，并包装进有适当标记的1品脱Sweetheart K16A杯中。将样品杯底部向上置于塑料托盘上并置于气流冷冻器中于-20°F过夜，然后移至0°F冷柜中储存至接受评估。
表30至34显示在10％、20％、30％、40％和50％分离蛋白替代水平的样品配方。
表30：采用10％
120的冷冻甜食产品配方
表31：采用20％
120的冷冻甜食产品配方
表32：采用10％
120的冷冻甜食产品配方
表33：采用40％
120的冷冻甜食产品配方
表34：采用50％
120的冷冻甜食产品配方
七名受过感官谱描述性分析方法训练的专门小组成员对一式三份的样品进行了评估。上述评估的目的，是通过与用百分之百的乳品制备的香草冰淇淋的风味特性相比较，定量根据本发明配制和生产的类似冰淇淋的大豆蛋白产品的风味特性。以15分的强度标度对十九种风味特性进行了评估，在每一样品中，0分表示无/不适用而15分表示非常强/高。样品中检测的风味特性、风味特性的定义和所使用的风味特性强度标度参考样品列于上文的表28中。
如图16所示，
120在样品中的存在直到替代水平等于或高于30％时才被检测到。大豆风味的强度在15分标度上保持在等于或低于2.5的强度水平，即使当样品包括50％大豆蛋白时也如此。实际上，乳香、焦糖味和复合香草香味相对于大豆/豆类在强度上均更强，即使在50％大豆包含水平也如此。此外，与100％乳品相比，20％大豆替代水平时乳香味和焦糖味仅有轻微减弱。
图18显示由一组分别的74名消费者评估的在10％、20％和40％的120包含水平对大豆蛋白样品的接受度，上述消费者年龄为35-54，以愿意尝试香草风味甜点的身份被招募。样品以经过平衡的、顺序的单一方式呈递给每名消费者，其中每一样品被单独地提供，并在下一样品被评估前被拿走。提供的顺序经过循环和平衡，以使提供顺序效应导致的偏差最小化，与标准的感官测试规程相符。
如图18中的图所示，对产品样品平均的总体嗜好、外观嗜好、风味嗜好、口感嗜好和余味嗜好反应与对全乳品对照样品的那些反应相比是相当的。例如，在10％大豆蛋白包含水平，总体嗜好、外观嗜好、风味嗜好、口感嗜好和余味嗜好的平均评分均等于或高于全乳品对照样品的对应分数。在20％大豆蛋白包含水平，外观嗜好评分高于全乳品对照样品的对应分数，而总体嗜好、风味嗜好、口感嗜好和余味嗜好的平均评分仅略微降低。在40％大豆蛋白包含水平，外观嗜好和口感嗜好的评分仅略低于全乳品对照样品的对应分数。
本实施例说明，包含一定量的替代乳品的120的、类似冰淇淋的冷冻甜食产品，可作为那些包含百分之百乳品的冷冻甜点产品的替代性冷冻甜点被顺利地接受。
实施例23：包含
760的冷冻甜食的分析
在不同的替代水平-10％、20％、30％、40％和50％，利用
760制备了类似冰淇淋的冷冻甜点产品。制备每一样品的第一步是在不锈钢容器中将磷酸盐加入水中并加热至100°F。加入所期望量的
760，使用螺旋桨式搅拌器中速混合上述组分5-10分钟，以分散蛋白质并使其水合。蛋白质彻底分散之后，将浆液温度升高至180°F，并低速混合浆液5分钟。将糖和玉米糖浆固体加入上述蛋白浆液，并以中速再连续混合3分钟。然后加入浓奶油和聚山梨酸酯60，以中速混合合并的成分3-5分钟，直到这些组分彻底分散。然后在180°F保持30秒，对混合物进行巴氏灭菌。巴氏灭菌之后，使用2阶段、单活塞匀化器均化上述混合物，其中匀化器设定为第二阶段500psi；第一阶段2500psi。均化之后，混合物被收集于事先灭菌的
瓶中并立即置于冰浴中，在冰浴中保持30分钟。冷却后的瓶子被置于35°F的步入式冷藏柜中并储存过夜。进行冷冻前，将香菜调味剂与上述冷却后的混合物混合。调味后的混合物被分配进泰勒批次冰淇淋冷柜(TaylorBatch Ice Cream Freezer)并在7分钟内冻结，达到24°F至26°F的温度。将混合物从冷柜中去除，并包装进有适当标记的1品脱SweetheartK16A杯中。将样品杯底部向上置于塑料托盘上并置于气流冷冻器中于-20°F过夜，然后移至0°F冷柜中储存至接受评估。
表35至39显示在10％、20％、30％、40％和50％分离蛋白替代水平的样品配方。
表35：采用10％
760的冷冻甜食产品配方
表36：采用20％
760的冷冻甜食产品配方
表37：采用30％
760的冷冻甜食产品配方
表38：采用40％
760的冷冻甜食产品配方
表39：采用50％760的冷冻甜食产品配方
七名受过感官谱描述性分析方法训练的专门小组成员对一式三份的样品进行了评估。上述评估的目的，是通过与用百分之百的乳品制备的香草冰淇淋的风味特性相比较，测定根据本发明配制和生产的大豆蛋白“冰淇淋”产品的接受水平。以15分的强度标度对十九种风味特性进行了评估，在每一样品中，0分表示无/不适用而15分表示非常强/高。样品中检测的风味特性、风味特性的定义和所使用的风味特性强度标度参考样品列于上文的表28中。
表40显示与对照(100％乳品)相比，专门小组成员对五种样品(10％、20％、30％、40％和50％)的平均强度评分。
表40：包含
760的样品风味特性的平均评分
如图17和表40所示，760在样品中的存在直到替代水平为50％时才被检测到。大豆风味的强度在15分标度上保持在等于或低于2.0的强度水平，即使当样品包括50％大豆蛋白时也如此。实际上，乳香、焦糖味和复合香草香味相对于大豆/豆类在强度上均更强，即使在50％大豆包含水平也如此。此外，与100％乳品相比，20％大豆替代水平时乳香味仅有轻微减弱。
图20显示由一组分别的74名消费者评估的在10％、20％和40％的760包含水平对大豆蛋白样品的接受度，上述消费者年龄为35-54，以愿意尝试香草风味甜点的身份被招募。样品以经过平衡的、顺序的单一方式呈递给每名消费者，其中每一样品被单独地提供，并在下一样品被评估前被拿走。提供的顺序经过循环和平衡，以使提供顺序效应导致的偏差最小化，与标准的感官测试规程相符。
如图20中的图所示，对包括大豆蛋白产品的样品平均的总体嗜好、外观嗜好、风味嗜好、口感嗜好和余味嗜好反应与对全乳品对照样品的那些反应是相当的。例如，在10％大豆蛋白包含水平，总体嗜好、外观嗜好、风味嗜好、口感嗜好和余味嗜好的平均评分均等于或仅略低于全乳品对照样品的对应分数。在20％大豆蛋白包含水平，外观嗜好、总体嗜好、风味嗜好、口感嗜好和余味嗜好的平均评分统计学上在95％置信度是较低的。在40％大豆蛋白包含水平，外观嗜好和口感嗜好统计学上在95％置信度也比全乳品对照样品的对应分数更低。
本实施例说明，包含一定量的替代乳品的
760的冷冻甜点产品，可作为那些包含百分之百乳品的冷冻甜点产品的替代性冷冻甜点被顺利地接受。
实施例24和25：包含大豆蛋白浆液的冷冻甜食的分析
在100％的乳品替代水平，利用大豆蛋白浆液制备了类似冰淇淋的冷冻甜点产品。制备样品的第一步是在不锈钢容器中将磷酸盐加入水中并加热至100°F。加入所期望量的大豆蛋白浆液，使用螺旋桨式搅拌器中速混合上述组分5-10分钟，以分散蛋白质并使其水合。蛋白质彻底分散之后，将浆液温度升高至180°F，并低速混合浆液5分钟。将糖和玉米糖浆固体加入上述蛋白浆液，并以中速再连续混合3分钟。然后加入椰子油、单和双甘油酯以及聚山梨酸酯60，以中速混合合并的成分3-5分钟，直到这些组分彻底分散。然后在180°F保持30秒，对混合物进行巴氏灭菌。巴氏灭菌之后，使用2阶段、单活塞匀化器均化上述混合物，其中匀化器设定为第二阶段3000psi；第一阶段2500psi。均化之后，混合物被收集于事先灭菌的
瓶中并立即置于冰浴中，在冰浴中保持30分钟。冷却后的瓶子被置于35°F的步入式冷藏柜中并储存过夜。进行冷冻前，将香菜调味剂与上述冷却后的混合物混合。调味后的混合物被分配进泰勒批次冰淇淋冷柜(Taylor Batch IceCream Freezer)并在7分钟内冻结，达到24°F至26°F的温度。将混合物从冷柜中去除，并包装进有适当标记的1品脱Sweetheart K16A杯中。将样品杯底部向上置于塑料托盘上并置于气流冷冻器中于-20°F过夜，然后移至0°F冷柜中储存至接受评估。
表41显示在100％蛋白浆液替代水平的样品配方。
六名受过感官谱描述性分析方法训练的专门小组成员对一式三份的样品进行了评估。表28中给出了风味特性的定义。平均风味特性强度总结在下文的表42中。
图21为用120、
XF 8020 100％替代乳品与一种商品化全植物冷冻甜食Soy Delicious之间的比较。
表42显示了专门小组成员的平均强度评分，如图21所示。
| 实施例24 | 实施例25 | Soy Delicious | |
| 芳香 | |||
| 总体风味影响 | 6.8b | 6.6b | 7.2a |
| 复合SWA | 3.4b | 2.8c | 3.8a |
| 焦糖化的 | 0.9a | 0.0b | 1.0a |
| 香草 | 0.1a | 0.4a | 0.4a |
| 香草醛 | 2.4a | 2.2a | 2.5a |
| 大豆/豆类 | 2.7ab | 2.6b | 2.9a |
| 谷物 | 0.3a | 0.0a | 0.3a |
| 果仁味 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 乳香 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 动物味 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 农场味 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 乳脂 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 纸板/木质 | 2.3a | 2.3a | 2.4a |
| 化学品 | 2.0b | 2.0b | 2.2a |
| 其他香味：涂料 | 2.5(17％) | 2.5(17％) | 0.0 |
| 其他香味：脂肪 | 2.0(17％) | 2.0(17％) | 2.0(17％) |
| 其他香味：醇 | 0.0 | 0.0 | 2.0(17％) |
| 其他香味：培乐多/水果 | 0.0 | 0.0 | 2.0(33％) |
| 基本味 | |||
| 甜味 | 7.6ab | 6.9B | 8.2A |
| 酸味 | 2.0A | 2.0A | 1.9B |
| 盐 | 1.6A | 1.5A | 1.5A |
| 苦味 | 2.1A | 2.1A | 1.9A |
| 化学感觉因素 | |||
| 涩味 | 1.9A | 1.9A | 2.1A |
| 灼烧感 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
来自消费者接受性数据的结果显示，就测试的每一享受特征而言，用Supro XF制备的香草味冷冻甜点(实施例24)的平均评分均显著高于(即更受喜爱)Soy Delicious香草味冷冻甜点；总体嗜好、外观嗜好、风味嗜好、质感嗜好和余味嗜好。
与用Supro 120制备的香草味冷冻甜点(实施例25)相比，Supro XF(实施例24)在总体嗜好、风味嗜好和余味嗜好方面的平均评分显著更高。
尽管本发明已就示例性实施方案进行了解释，但应当了解，当阅读本说明书时，其多种变型对本领域的技术人员将变得显而易见。因此，应当了解，本文所公开的发明旨在将此类变型涵盖在所附权利要求书的范围内。
Claims (16)
1.冷冻甜食，所述冷冻甜食包含：
(a)蛋白质水解产物组合物，所述组合物包含在每个羧基末端主要具有精氨酸残基或赖氨酸残基的多肽片段的混合物，所述组合物在pH大于约6.0时具有至少约0.2％的水解度和至少约80％的可溶性固体指数；和
(b)可食用材料。
2.权利要求1的冷冻甜食，其中所述蛋白质水解产物组合物来源于选自下列的蛋白质：大豆、大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、动物、蛋类、以及它们的组合。
3.权利要求1的冷冻甜食，其中所述蛋白质水解产物组合物来源于大豆和至少一种选自大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、动物、乳品和蛋类的蛋白质的组合。
4.权利要求1的冷冻甜食，其中所述蛋白质水解产物组合物来源于大豆，并且其水解度为约0.2％至约14％。
5.权利要求1的冷冻甜食，其中所述可食用材料选自脱脂乳、全脂乳、奶油、奶粉、脱脂奶粉、酪蛋白酸盐、大豆浓缩蛋白、大豆分离蛋白、乳清浓缩蛋白、乳清分离蛋白、以及它们的组合。
6.权利要求1的冷冻甜食，其中所述食品还包含选自下列的成分：甜味剂、乳化剂、增稠剂、稳定剂、脂质材料、防腐剂、调味剂、着色剂、以及它们的组合。
7.生产冷冻甜食组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将蛋白质水解产物组合物与至少一种可食用材料混合以制备甜食，所述组合物包含在每个羧基末端主要具有精氨酸残基或赖氨酸残基的多肽片段的混合物，所述组合物在pH大于约6时具有至少约0.2％的水解度和至少约80％的可溶性固体指数，以及
(b)冷冻所述甜食组合物以生产冷冻甜食。
8.权利要求7的生产冷冻甜食组合物的方法，所述方法还包括以约155°F至约270°F的温度、约0.1个大气压至约10个大气压的压力和约3秒至约45分钟的时间，对步骤(a)之后的甜食进行巴氏灭菌。
9.权利要求8的生产冷冻甜食组合物的方法，其中所述温度为约175°F至约195°F，压力为约1个大气压至约1.5个大气压，并且时间为约4秒至约25秒。
10.权利要求7的生产冷冻甜食组合物的方法，所述方法还包括以约1000磅/平方英寸至约4000磅/平方英寸，使步骤(a)之后的甜食均化。
11.权利要求10的生产冷冻甜食组合物的方法，其中所述均化为单阶段均化。
12.权利要求10的生产冷冻甜食组合物的方法，其中所述均化为多阶段均化。
13.权利要求12的生产冷冻甜食组合物的方法，其中所述多阶段均化为两阶段均化，其中第一阶段为约2000磅/平方英寸至约3000磅/平方英寸，并且其中第二阶段为约250磅/平方英寸至约750磅/平方英寸。
14.权利要求7的生产冷冻甜食组合物的方法，所述方法还包括对步骤(a)之后的甜食进行巴氏灭菌和均化，其中巴氏灭菌以约155°F至约270°F的温度、约0.1个大气压至约10个大气压的压力和约4秒至约45分钟的时间进行，并且其中均化为约1000磅/平方英寸至约4000磅/平方英寸。
15.权利要求14的生产冷冻甜食组合物的方法，其中所述均化为单阶段或多阶段的。
16.权利要求15的生产冷冻甜食组合物的方法，其中所述多阶段均化为两阶段均化，其中第一阶段为约2000磅/平方英寸至约3000磅/平方英寸并且其中第二阶段为约250磅/平方英寸至约750磅/平方英寸。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110817 |