KR20110069432A - 매자나무 수피로부터 천연 코니페릴 알코올을 고수율로 분리하는 방법 및 그 단리 성분 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 매자나무 수피로부터 향장 제품의 착향제로 사용 가능한 천연 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol) 성분의 고수율 단리 방법과 그 단리 성분에 관한 것이다.
본 발명은 매자나무의 수피 부분을 대상으로 열수/초음파 추출 공정과 단계적인 분획 및 물질 분리 공정을 통해 향장 제품의 착향제로서 첨가가 가능한 천연 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol) 성분을 효율적으로 단리하는 데에 기본적인 특징이 있다.
매자나무, 초음파 추출, 복합 용매 분획법, 코닐페릴 알코올(Conilferyl alcohol), 천연 착향제
Description
본 발명은 매자나무 수피로부터 향장 제품의 착향제로 사용 가능한 천연 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol) 성분의 고수율 단리 방법과 그 단리 성분에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한국특산종 매자나무(Berberis koreana)의 수피 부분을 대상으로 열수/초음파 추출 공정과 단계적인 분획 및 물질 분리 공정을 통해 향장 제품의 착향제로서 첨가가 가능한 천연 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol) 성분의 고수율 단리 방법과 그 산물인 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol)에 관한 것이다.
본 발명에서 소재로 삼은 매자나무(Berberis Koreana Palibin)는 한국 특산종 수목자원으로 알미나리아재비목 매자나무과의 낙엽관목에 속한다.
매자나무과 목질은 민간에서는 소염 및 간염 치료제로 사용하고 있지만 국내 산 매자나무에 대해서는 그 약효 및 성분에 대한 연구가 미미하고 식품 및 의약품 소재로서의 활용이 거의 없는 상황이다. 현재까지 매자나무로부터 다양한 생리활성을 지닐 것으로 추정되는 페놀성 화합물 등의 성분이 보고되기는 하였지만 실제로 이들에 대한 구체적인 연구는 미미하고 기능성 식품 소재로의 산업적 이용도 이루어지지 않고 있다.
따라서 본 발명에서는 매자나무로부터 활성 성분을 탐색하여 기존에 매자나무로부터는 보고되지 아니한 화합물을 분리하여 그 화학구조를 규명하였는바, 이는 국내산 특산종인 매자나무의 기능성 소재로서의 부가가치를 높이고 더 나아가 국내산 수목자원의 활용도 증대를 통한 소득증대에 이바지할 수 있는 계기가 될 것이다.
본 발명을 통해 발명자들이 매자나무 수피로부터 동정하고 분리해낸 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)은 시나필 알코올(sinapyl alcohol) 및 쿠마릴 알코올(p-coumaryl alcohol)과 함께 리그닌을 이루는 성분이다. 리그닌은 탄수화물 다음으로 다량 존재하는 천연 고분자 화합물로서 초본류에 15-20%, 활엽수재에 20-25%, 그리고 침엽수재에 20-30% 정도 함유되어 있는 매우 중요한 유기자원 중의 하나이다. 리그닌은 산에 의하여 가수분해하기 어려운 고분자 무정형 물질이자 페놀성 물질로 이는 서로 교착되어 분해 곤란한 강력한 결합을 하고 있는 망상의 천연 중합 물질로 알려져 있다.
코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol)은 4-(3-하이드록시-1-프로페닐)-2-메톡 시페놀(4-(3-Hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenol), 4-하이드록시-3-메톡시신나밀 알코올(4-Hydroxy-3-methoxycinnamyl alcohol) 및 코니페롤(Coniferol)이라고도 불린다. 일반적으로 향장제품의 착향제로 사용되나 성분이 가지고 있는 잠재적인 독성으로 인해 알레르기 및 아토피 등의 피부질환을 유발하는 것으로 알려져, 현재 국내에서는 천연 에센스에서 자연적으로 함유된 경우를 제외한 인위적인 화학 합성을 통한 동일 성분 및 그 외의 동일 성분은 향장 제품 첨가제로서의 배합 금지 원료로 규정되어 있다.
본 발명에서는 매자나무로부터 열수추출/초음파 추출 공정 및 복합 용매 분획법을 사용하여 높은 수율의 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol)을 얻는 데 성공하였다. 본 발명에서 열수추출과 더불어 사용할 수 있는 초음파 공정은 초음파 진동의 특수한 형태를 이용하는 것으로 식품 및 기능성 소재 산업공정에서는 높은 파장의 20~40 KHz의 저주파 초음파 에너지를 많이 사용하고 있다. 초음파의 조사효과에는 식품의 절단, 충격파괴 작용, 응집작용, 건조작용, 교반작용, 발열작용 등의 물리적 작용과 함께 케비테이션(cavitation)에 의한 고온, 고압의 반응장을 이용한 화학작용, 생물학적 작용 등 다양한 효과가 나타난다. 특히 에너지가 높은 초음파는 물체를 전단 및 압축시켜 조직의 물리적 파괴, 유화 형성, 화학반응 촉진 등의 반응을 가지는 것으로 알려져 있으며 높은 에너지의 초음파가 추출공정의 전처리나 또는 직접적으로 사용되었을 때 높은 추출수율의 향상을 가져오는 것으로 보고되고 있다. 초음파에 의해 생성되는 충격파에 의해 액 중에 담겨있는 물질의 표면과 내부 깊숙한 보이지 않는 곳까지 전혀 손상을 입히지 않으면서 단시간 내에 물질의 내부까지 강력한 에너지가 전파되며 화학적/물리적 영향력으로 전달되어 지기 때문에 특히 용출이 어려운 식물의 경우 적절한 세기의 초음파는 식물 세포벽을 파괴하여 생리활성물질의 용출을 증진시켜주며 에너지에 의한 물질이동의 촉진에 의해 식물 세포내로 용출용매의 물질전달 효율을 향상시켜 준다.
매자나무로부터 천연 첨가제로 사용 가능한 물질을 분리하는 것은 최초의 시도로서 국내 특산 수목자원 연구의 활성화를 통해 향후 매자나무의 기능성 식품, 의약품 및 향장제품 등의 소재로 상품화에 적용할 경우 새로운 고부가가치를 창출하여 높은 경제성을 부여할 수 있으며 생물 사업 분야에 선점할 수 있을 것이라 사료된다. 또한 국가자원의 개발과 관련하여 본 발명의 기술이 기반기술로 활용될 것이라 생각된다.
앞에서 밝힌 바와 같이 현재까지 매자나무로부터 다양한 생리활성 및 각종 활성 성분이 보고되었음에도 불구하고 이들에 대한 연구 및 이러한 활성 성분의 상업적 적용은 미미할 뿐 아니라, 수목자원에서 천연 기능성 성분을 순수 분리하는 공정은 까다롭고 고가의 비용이 소요되는바, 본 발명에서는 매자나무로부터 향장 제품의 첨가제로서 사용 가능한 물질을 탐색하여 착향제로서 기능을 갖는 천연 물질을 효율적으로 분리하는 방법을 제시하고자 한다. 즉 본 발명의 목적은 약용 및 식용으로 사용할 수 있는 산림자원으로서 매자나무를 대상으로 초음파 추출 공정과 순차적인 복합 용매 분획 및 물질 단리 방법에 의해 활성 성분을 효율적으로 분리하는 데 있다.
본 발명의 발명자들은 위와 같은 방법의 효용을 검증하고, 그로부터 얻은 성분에 대한 화학적 구조를 동정하였다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 매자나무 수피로부터 향장 제품의 착향제로 사용 가능한 천연 성분의 단리 방법과 그 단리 성분에 관한 것임을 특징으로 한다.
구체적으로 본 발명에 따른 매자나무 수피로부터 천연 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol)을 고수율로 분리하는 방법은,
(1) 매자나무 수피로부터 열수 추출물을 얻는 단계;
(2) 위와 같이 수득한 매자나무 추출물의 수용액에 헥산(Hexane)과 부탄올(Butanol)의 혼합 용액을 첨가하여 물(water) 층과 헥산(Hexane)과 부탄올(Butanol)의 혼합 용액 층을 분리하는 단계;
(3) 위 (2)에서 얻은 물(water) 층에 다시 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액을 첨가하여 물(water) 층과 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액 층을 분리하는 단계;
(4) 위 (3)에서 얻은 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액 층을 분말화하는 단계;
(5) 위 (4)에서 얻은 성분을, n-Haxane과 Acetone을 전개용매로 하여 TLC에 전개시켜 7가지의 분획물로 분리하는 단계;
(6) 위 7가지 분획물 중 선택한 특정 분획물을 Benzene과 Ethly acetate를 용출용매로 사용하고 Silica gel을 충진제로 사용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)를 이용하여 12가지의 분취물로 분리하는 단계;
(7) 위 12가지 분취물 중 선택한 특정 분취물을 acetone을 용출용매로 사용하고 Sephadex LH-20을 충진제로 사용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)를 이용하여 3가지의 분취물로 분리하는 단계; 및
(8) 위 3가지 분취물 중 하나를 선택하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
이때 상기 (1)의 단계는, 매자나무 수피 부분만을 분리하여 100℃에서 24시간 동안 열수 추출한 후 60kHz에서 60분 동안 초음파 추출하는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 (6), (7), (8)의 단계에서 여러 가지 분획물이나 분취물 중 특정의 하나를 선택함에는, 획득된 각 분획물이나 분취물의 항산화 활성이 가장 큰 것을 선택하는 방법을 사용하는 것을 특징으로 한다.
나아가 상기 각 방법에 있어서,
상기 (4)에서 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액 층을 제외하고 남은 물(water) 층에 대해, 상기 (2)와 같이 헥 산(Hexane)과 부탄올(Butanol)의 혼합 용액을 첨가하여 물(water) 층만 분리해내고, 상기 (3)과 같이 이 물(water) 층에 다시 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액을 첨가하여 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액 층만을 분리해내는 단계를 순환적으로 연속하여 4회를 더 실시함으로써, 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액 층을 총 5번에 걸쳐 얻고,
이에 대해 상기 (5)의 단계를 실시하는 것을 특징으로 한다.
마지막으로 본 발명은 상기 각 방법에 의해 획득되는 천연 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 매자나무 수피부를 분리한 후 일반적인 열수 추출 또는 열수추출과 초음파 추출 공정을 함께 적용하여 매자나무 수피 추출물을 수득한다.
그리고 위와 같이 추출하여 수득한 매자나무 수피부 추출물을 물(Water), 헥산(Hexane)과 부탄올(Butanol), 클로로포름(Chloroform)과 에틸아세테이트(Ethyl actetate)를 추출 용매로 하여 순차적인 연속 복합 용매 분획법에 의해 가용 추출물을 얻는 분획공정을 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 공정으로 얻는 클로로포름 및 에틸아세테이트 가용부를 대상으로 n-Haxane과 Acetone을 전개용매로 TLC에 전개시켜 7가지의 분획물로 분리하고, 이 중 특정 분획물을 Benzene과 Ethly acetate를 용출용매로 사용하고 Silica gel을 충진제로 사용한 column chromatography를 이용하여 12가지의 분획물 을 얻으며, 수득한 12가지의 분취물 중 특정 분취물을 Acetone을 용출용매로 사용하고 Sephadex LH-20을 충진제로 사용한 column chromatography를 통해 다시 3가지의 분취물을 얻었으며, 이 중 특정 분취물에서 화합물을 얻었다. 특정 분취물을 얻는 수단은 분리된 각 분획물들을 대상으로 생리활성 실험을 실시하여 그 활성이 가장 유효한 것을 선택하였다.
본 발명자들은 상기 공정으로부터 최종적으로 수득한 화합물을 질량 스펙트럼(MS, mass spectrometry)과 1H-NMR, 13C-NMR, 1H-1H COSY(Correlation spectroscopy), NOESY(NOE Spectroscopy), DEPT(Distortioless Enhancement Polarization Transfer), HMQC(1H Detected multiple quantum coherence), HMBC(1H detected multiple bond connectivity)등의 핵자기공명(NMR, nuclear magnetic resonance, Varian UI 500 MHz) 스펙트럼을 통한 분석을 통해 성분을 규명하였다.
본 발명을 통해 한국 특산종 수목자원인 매자나무를 대상으로 수피질의 활성성분을 탐색하여 향장 제품의 첨가제로서 활용할 수 있는 천연 착향제를 분리하였다. 본 발명을 통해 분리된 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol)은 알레르기 및 아토피와 같은 피부질환을 유발할 수 있어 향장 제품의 첨가물로서 배합이 금지된 성분이며, 오로지 천연 에센스에 함유되어 있을 경우에만 착향제로서 사용이 가능하다.
본 발명을 통한 한국 특산종 매자나무 기능성 성분 분리 기술 및 분리된 성분의 활용은 향후 국내 수목자원을 이용한 생명공학 부분에서 앞선 기술을 선점할 수 있는 계기가 될 것이다. 또한 향장제품을 비롯한 식품 및 의약품의 첨가물 등으로 상품화 개발이 가능하여 새로운 고부가가치를 창출할 수 있다.
이하 본 발명의 매자나무로부터 활성 성분의 분리방법의 일례를 공정별로 상세히 설명한다.
1. 제1공정 : 매자나무 수피부의 초음파 추출물 수득 공정
목적하는 활성 성분을 분리하고자하는 매자나무 수피질 부분만을 분리하여 적당한 크기로 분쇄하였다. 추출용매로 물을 사용하여 100℃의 온도에서 24시간 열수 추출을 진행한 후 초음파 추출기(Asia industry Kor.)에서 60kHz의 초음파로 60분 동안 추출을 추가로 시행하였다. 그 다음 감압 여과를 통해 혼합물을 분리한 후 동결 건조를 통해 추출물을 파우더 상태로 수득하였다.
2. 제2공정 : 매자나무 추출물의 용매분획 공정
상기 공정으로부터 수득한 매자나무 추출물 100g을 증류수에 완전히 용해시켰다. 그 후 분획여두에 넣고 1:1의 Hexane과 Butanol을 용액을 300㎖ 첨가하여 Hexane 및 Butanol층과 Water층을 분리하였다. 이 Water층에 다시 1:1의 Chloroform 및 Ethyl acetate 용액을 300㎖ 첨가하여 Chloroform 및 Ethyl acetate층을 분리하였다.
Chloroform 및 Ethyl acetate층을 분리하고 남은 잔여 Water층을 동일한 방법으로 1:1의 Hexane과 Butanol을 용액을 300㎖ 첨가하여 Water층을 분리하고 이 Water층에 다시 1:1의 Chloroform 및 Ethyl acetate 용액을 300㎖ 첨가하여 Chloroform 및 Ethyl acetate 분획물을 얻었다. 목적하는 성분의 최대 수율을 얻기 위해 상기 공정을 총 5회 반복하여 실시하였다.
이로부터 얻은 모든 분획물을 감압 농축한 후 진공 건조하여 용매를 완전히 제거한 powder 상태로 제조하였다(표 1 참조).
표 1. 매자나무 수피 추출물의 분획 과정
3. 제3공정 : 분획물로부터 성분 분리 공정
매자나무 수피 열수 추출물의 분획을 통해 얻은 클로로포름 및 에틸아세테이트 가용부에 대해 n-Haxane과 Acetone을 전개용매로 TLC에 전개시켜 7가지의 분획물로 분리한 후 이 중 특정 분획물을 Benzene과 Ethly acetate를 용출용매로 사용하고 Silica gel을 충진제로 사용한 column chromatography를 이용하여 12가지의 분취물을 얻었다. 수득한 12가지의 분취물 중 특정 분취물을 Acetone을 용출용매로 사용하고 Sephadex LH-20을 충진제로 사용한 column chromatography 다시 3가지의 분취물을 얻었으며 이 중 특정 분취물에서 화합물을 얻었다(표 2 참조). 특정 분취물을 얻는 수단으로서는 분리된 각 분획물들을 대상으로 생리활성 실험을 실시하여 그 활성이 가장 유효한 것을 선택하는 방법을 취하였다.
표 2. 매자나무 수피 클로로포름 및 에틸아세테이트 분획물로부터의 목적 성분 분리 흐름도
4. 제4공정 : 성분 분리를 통해 얻은 분획물들의 생리활성 평가
항산화활성 중의 하나인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 안정한 free radical로서 이 홀전자로 인해 상자성(paramagnetism)을 띄게 되며 전자나 hydrogen radical(H·)을 받아들여 안정화시키기 쉽다. 또한 그 홀전자 때문에 517nm 근처에서 강한 흡수가 일어나기 때문에 용액은 짙은 보라색으로 보인다. 이 색은 다른 전자나 라디칼과 결합하여 전자쌍을 이루면 사라지게 된다. 메탄올 0.5㎖에 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎/㎖로 매자나무 추출물 및 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)를 조절하여 녹인다. 0.15mM의 DPPH 용액 2㎖을 첨가한 후 반응액을 완전히 섞기 위해서 10초간 vortexing 한다. 실온에서 30분간 반응시킨다. 남아있는 DPPH의 양을 측정하기 위해서 UV-vis spectrophotometer를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정한다.
5. 제5공정 : 단리 성분의 화학적 구조 규명 공정
상기 공정으로부터 얻는 화합물에 대한 분석을 위해 질량 스펙트럼(MS, mass spectrometry)과 1H-NMR, 13C-NMR, 1H-1H COSY(Correlation spectroscopy), NOESY(NOE Spectroscopy), DEPT(Distortioless Enhancement Polarization Transfer), HMQC(1H Detected multiple quantum coherence), HMBC(1H detected multiple bond connectivity)등의 핵자기공명(NMR, nuclear magnetic resonance, Varian UI 500 MHz) 스펙트럼을 사용하였다.
6. 제6공정 : 단리된 활성 성분의 활성 평가 공정
상기 공정으로 얻은 매자나무 활성 성분의 목적 생리활성을 확인하기 위해 세포독성, 항산화 활성을 측정한다.
이하 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
실시예 1. 추출성분의 분리
매자나무 수피 추출물을 분획하여 수득한 분획물 중 클로로포름 및 에틸아세테이트 가용부를 헥산(n-Hexane)과 아세톤(Acetone)을 15 대 1의 비율로 혼합한 용매로 분취하여 분취물을 얻었다. 헥산(Hexane)과 아세톤(Acetone)을 10:1(v/v)의 비율로 혼합한 용액을 전개용매로 사용하여 상기 수득된 분취물을 TLC(Thin layer chromatogram, silica gel 60 F254)에서 전개한 후 254 nm의 UV 램프에서 관찰하였다. 그 결과 BKC-1(1~22), BKC-2(23~39), BKC-3(40~56), BKC-4(57~210), BKC-5(211~257), BKC-6(258~340) 그리고 BKC-7(MeOH)의 7개로 분리된 분획물을 수득하였다. 이 중 BKC-7 분획물을 이용하여 벤젠(Benzene)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)를 2:1(v/v)로 혼합한 용액을 용출용매로, selica gel을 충진제로 사용한 column chromatography를 이용하여 1~204에서 UV 검색하였으며, 에틸아세테이트(Ethyl acetate)를 용출용매로 205~242로 UV 검색한 결과 BKC-7-1(1~11), BKC-7-2(12~29), BKC-7-3(30~40), BKC-7-4(41~122), BKC-7-5(123~127), BKC-7-6(128~144), BKC-7-7(145~166), BKC-7-8(167~204), BKC-7-9(205~219), BKC-7-10(220~230), BKC-7-11(231~242) 그리고 BKC-7-12(MeOH)의 12개의 분취물을 얻었다. 이 중 BKC-7-2 분취물을 충진제로 Sephadex LH-20을 사용하고 Acetone을 용출 용매로 이용하여 column chromatography를 통해 분취한 결과 BKC-7-2-1(1~3), BKC-7-2-2(4~14), BKC-7-2-3(15~50)의 3개의 분취물을 얻을 수 있었으며 이 중 BKC-7-2-2 분획물로부터 화합물을 얻었다.
실시예 2. 매자나무 분획물의 자유라디칼(free radical) 소거 활성 평가
한편, 위 실시예 1의 분취물 선택과 관련하여, DPPH 자유라디칼 소거활성을 통해 매자나무 분획물의 항산화 활성을 측정한 결과, 상기 분획 공정을 통해 얻어진 분획물 중 단계적으로 매자나무 클로로포름 및 에틸아세테이트 분획물, BKC-7, BKC-7-2, BKC-7-2-2 분리물이 37%, 40%, 66%, 70%로 각각의 분리 공정의 분획물 중 가장 소거활성이 큰 것으로 나타났다. 따라서 실시예 1에서는 각 단계에서 이들 분취물을 선택하여 실험을 진행한 것이다.
실시예 2. FAM-MS 분석을 통한 성분의 질량 분석
질량 분석(mass-spectrometer)의 기본은 중성 분자로부터 이온들을 형성시켜, 그 이온에서 발생되는 연속적인 분해과정을 알아보는 것이며 이러한 분해 과정을 통하여 물질의 구조를 알아내는 것으로 상기 공정으로 수득한 화합물의 분자량[M+]은 m/z 180으로 나타났다(그래프 1).
그래프 1. 매자나무로부터 수득한 성분의 FAM-MS 스펙트럼(FAM-MS Spectrum of Compound from Berberis koreana)
실시예
3.
NMR
(
nuclear
magnetic
resonance
) 스펙트럼을 이용한 성분 분석
강한 자기장 속에 위치한 원자의 핵은 그것이 가지는 고유한 양자적 특성에 의해 특정영역 주파수의 전자기파를 흡수하거나 내어 놓게 되는데 이러한 현상(공명)이 각각의 원자핵이 처한 환경에 따라 매우 다름을 이용하여 분자의 구조나 운동성 파악하여 시료를 비파괴적인 방법으로 물질 구조를 분석할 수 있는 NMR(Varian UI 500 MHz)을 이용하여 상기 공정으로 수득한 화합물의 구조를 분석하였다.
13C-NMR spectrum 결과의 peak를 확인한 결과 총 10개의 carbon signal이 나타났다(그래프 2).
DEPT spectrum는 Pulse 폭을 변화시켜 13C-NMR spectrum을 측정하는 것으로서 a spectrum(일반적인 13C)은 C, CH, CH2, CH3의 탄소 peak가 다 나타나고, b spectrum(900 pulse 13C)은 CH의 탄소 peak만이 나타나고, c spectrum(1350 pulse 13C)의 경우 CH2(짝수 proton을 갖는 탄소) peak는 아래로 CH, CH3(홀수 proton 갖는 탄소) peak는 위로 나타난다. 이들 a, b, c spectrum들을 비교해봄으로써 각각의 C, CH, CH2, CH3의 탄소 peak를 구별해 낼 수 있었다. 본 발명에서 실시한 DEPT spectrum을 통해서 매자나무로부터 분리한 화합물이 methine carbon이 5개, methylene carbon이 1개, methyl carbon이 1개, quaternary carbon이 3개임을 DEPT(45ㅀ, 90ㅀ, 135ㅀ)법에 의해 확인할 수 있었다(그래프 3).
1H-NMR spectrum(그래프 4)의 적분비로부터 수소의 개수가 12개임을 알 수 있었고, aromatic proton signal δ 6.72 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.83 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6), 6.99 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2)가 나타나서, 이 들 signal 분열 패턴으로부터 3개의 치환기를 갖는 benzene 환골결의 부분구조를 갖는 화합물임을 알 수 있었다. 또한, 1H-NMR spectrum에서 확인된 6개의 proton 중에서 2H에 해당하는 δ 6.49 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), δ 6.18 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8) signal의 결합정수가 16.0으로 이중 결합을 하고 있음을 나타내었고, 2H인 δ 4.18 (2H, dd, J = 1.0, 6.0 Hz, H-9)과 δ 6.18 (1H, m, J = 16.0 Hz, H-8)이 COSY spectrum(그래프 5)에서의 상관 peak로 존재하고 있음을 확인할 수 있었다.
HMBC spectrum(그래프 6)에서 δ 147.47 (s, C-3) peak와 교차 peak를 보인 1개의 methoxyl groups인 δ 3.85 (3H, s, OMe-3) peak가 3번 carbon에 존재함을 알 수 있었다. δ 6.72 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5) signal의 결합정수가 8.0으로 ortho 결합을 하고 있음을 나타내 H-5에 귀속하였으며, δ 6.83 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6), δ 6.99 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2) signal의 결합정수가 2.0와 2.0, 8.0으로 meta 결합과 ortho, meta 결합을 하고 있음을 나타내 H-2, H-6에 각각 귀속하였다. 또한 HMBC spectrum(그래프 6)에서 4번 carbon과 교차 peak를 보이고 ortho, meta 결합을 하고 있는 δ 6.83 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6) signal을 6번 proton에 귀속하였고, HMBC spectrum(그래프 7)에서 δ 4.18 (2H, dd, J = 1.0, 6.0 Hz, H-9) signal이 δ 125.43 (d, C-8), δ 130.48 (d, C-7)의 signal과 교차 peak를 나타냄으로써 9번의 위치에 이 결합되어 있는 것을 알 수 있다.
이상의 분석 결과, 상기와 같은 성분 분리 공정을 거쳐 수득된 매자나무 수피로부터 분리된 성분은 3번 위치에 methoxyl기를 가지며, 4번 위치에 hydroxyl기를 가지는 4-(3-hydroxypropenyl)-2-methoxyphenol (coniferyl alcohol)으로 동정하였다(그래프 8).
그래프 2. 매자나무로부터 수득한 성분의 13C-NMR 스펙트럼[13C-NMR Spectrum of Compound from Berberis koreana (MeOH-d 4)]
그래프 3. 매자나무로부터 수득한 성분의 DETP 스펙트럼[DETP Spectrum of Compound from Berberis koreana (MeOH-d 4)]
그래프 4. 매자나무로부터 수득한 성분의 1H-NMR 스펙트럼[1H-NMR Spectrum of Compound from Berberis koreana (MeOH-d 4)]
그래프 5. 매자나무로부터 수득한 성분의 COSY 스펙트럼[COSY Spectrum of Compound from Berberis koreana (MeOH-d 4)]
그래프 6. 매자나무로부터 수득한 성분의 HMBC 스펙트럼[HMBC Spectrum of Compound from Berberis koreana (MeOH-d 4)]
그래프 7. 매자나무로부터 수득한 성분의 HMBC 스펙트럼[HMBC Spectrum of Compound from Berberis koreana (MeOH-d 4)]
그래프 8. 매자나무로부터 수득한 성분의 화학 구조[Chemical Structure of Compound from Berberis koreana (coniferyl alcohol)]
실시예 4. 세포독성 측정
인간유래 섬유아세포(CCD986-sk)의 단백질 염색을 통해 세포의 증식이나 독성을 평가할 수 있는 SRB (sulforhodamine B) assay를 통해 매자나무로부터 분리한 활성 성분인 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)에 대한 정상세포 독성을 측정하였다.
실험에 앞서 상기의 정상세포의 농도를 4~5×104 cells/㎖가 되도록 배양한 후 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 활성을 측정하고자 하는 시료를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 0.1 ㎎/㎖의 농도로 조절한 후 상기의 방법으로 배양된 정상세포에 농도별로 각각 100 ㎕씩 첨가하 여 48시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양이 종료되면 상등액을 제거하고 4℃, 10%(w/v) TCA(trochloroacetic acid)을 100 ㎕씩 가하여 4℃에서 1시간 동안 정치한 후 증류수로 5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 완전히 건조하였다. 건조된 plate의 각 well에 1%(v/v) acetic acid로 녹인 0.4% (w/v) SRB 용액을 100 ㎕씩 첨가하여 상온에서 30분 동안 염색시킨 후 결합되지 않은 SRB 염색액을 제거하기 위해 1% acetic acid로 4~5회 세척한다. 실온에서 완전히 건조 후 10 mM Tris buffer 100 ㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540 nm에서 micropalte reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 정상세포에 대한 독성을 측정하였다.
그 결과, 코니페릴 알코올(coniferyl alcohol)이 최고농도 1.0 ㎎/㎖에서 신장 32.3%의 세포독성을 나타내었으며, 매자나무 조추출물이 동일 농도에서 40.9%의 독성을 나타내는 것과 비교할 때 비교적 낮은 독성을 확인할 수 있었다. 또한 67% 이상의 세포 생존율을 유지하는 것으로 미루어 보아 향장 소재로서의 활용이 충분이 가능할 것으로 사료된다(그래프 9).
그래프 9. 인간 섬유 아세포(CCD986-sk)에 대한 매자나무 추출물과 coniferyl alcohol의 세포독성
Claims (5)
- (1) 매자나무 수피로부터 열수 추출물을 얻는 단계;(2) 위와 같이 수득한 매자나무 추출물의 수용액에 헥산(Hexane)과 부탄올(Butanol)의 혼합 용액을 첨가하여 물(water) 층과 헥산(Hexane)과 부탄올(Butanol)의 혼합 용액 층을 분리하는 단계;(3) 위 (2)에서 얻은 물(water) 층에 다시 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액을 첨가하여 물(water) 층과 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액 층을 분리하는 단계;(4) 위 (3)에서 얻은 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액 층을 분말화하는 단계;(5) 위 (4)에서 얻은 성분을, n-Haxane과 Acetone을 전개용매로 하여 TLC에 전개시켜 7가지의 분획물로 분리하는 단계;(6) 위 7가지 분획물 중 선택한 특정 분획물을 Benzene과 Ethly acetate를 용출용매로 사용하고 Silica gel을 충진제로 사용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)를 이용하여 12가지의 분취물로 분리하는 단계;(7) 위 12가지 분취물 중 선택한 특정 분취물을 acetone을 용출용매로 사용하고 Sephadex LH-20을 충진제로 사용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)를 이용하여 3가지의 분취물로 분리하는 단계; 및(8) 위 3가지 분취물 중 하나를 선택하는 단계로 이루어지는,매자나무 수피로부터 천연 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol)을 고수율로 분리하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 (1)의 단계는, 매자나무 수피 부분만을 분리하여 100℃에서 24시간 동안 열수 추출한 후 60kHz에서 60분 동안 초음파 추출하는 것을 특징으로 하는,매자나무 수피로부터 천연 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol)을 고수율로 분리하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 (6), (7), (8)의 단계에서 여러 가지 분획물이나 분취물 중 특정의 하나를 선택함에는, 획득된 각 분획물이나 분취물의 항산화 활성이 가장 큰 것을 선택하는 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는,매자나무 수피로부터 천연 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol)을 고수율로 분리하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,상기 (4)에서 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액 층을 제외하고 남은 물(water) 층에 대해, 상기 (2)와 같이 헥 산(Hexane)과 부탄올(Butanol)의 혼합 용액을 첨가하여 물(water) 층만 분리해내고, 상기 (3)과 같이 이 물(water) 층에 다시 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액을 첨가하여 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액 층만을 분리해내는 단계를 순환적으로 연속하여 4회를 더 실시함으로써, 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(Ethly acetate)의 혼합 용액 층을 총 5번에 걸쳐 얻고,이에 대해 상기 (5)의 단계를 실시하는 것을 특징으로 하는,매자나무 수피로부터 천연 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol)을 고수율로 분리하는 방법.
- 제1항 내지 제3항의 분리방법에 의해 획득되는 것을 특징으로 하는,매자나무 수피로부터 얻어지는 천연 코니페릴 알코올(Coniferyl alcohol).
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