KR20110065799A - 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 제조방법 - Google Patents

중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중금속에 노출된 어류체내에서 메탈로티오닌(metallothionein;MT) 유전자의 발현에 따라 MT가 증폭 생성되는 특성을 나타내므로 중금속의 양식어류 등 식용어류의 오염여부를 알아 내는데 유용한 생체지표(biomarker)로 사용될 수 있는 메탈로티오닌의 효율적인 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 어류의 마취 후 염화카드뮴 등 중금속 염의 고농도용액을 생리식염수에 녹여 주사한 후 적절한 위생관리를 통하여 어류가 폐사되지 않도록 하여 메탈로티오닌의 고농도 유도가 용이하게 이루어지도록 하고, 아울러 유도기간 중 어류체내에 유도된 메탈로티오닌을 회수하는 데에 있어서도 복잡한 해부과정을 거쳐 간(liver)과 아가미(gill) 등의 장기와 기관의 적출 및 이에 수반되는 균질화 추출과정을 거치지 않고 혈액을 채취하여 회수된 어류의 혈액내로 유도된 메탈로티오닌을 어류의 혈청으로부터 간편한 음이온교환 크로마토그래피 과정을 통하여 어종별 메탈로티오닌 항체제작 및 분석용 표준품으로서 사용가능할 정도로 간편하게 정제할 수 있다. 따라서 본 발명에서 제시한 메탈로티오닌의 효율적 제조방법은 양식어류 등 식용어류의 중금속 오염여부에 대한 생체지표 검색기술 개발에 필수적인 원천기반기술의 하나로서, 이 방법에 따른 산물로서 생산되는 어류 메탈로티오닌의 활용을 통하여 중금속오염 생체지표에 대한 면역센서와 효소면역분석법 등의 분석법 개발이 촉진되어질 수 있을 것으로 기대된다.
중금속오염, 생체지표, 메탈로티오닌, 식용어류

Description

중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 제조방법{Manufacturing Method for Metallothionein, a Biomarker for Heavy Metal Contamination}
본 발명은 중금속에 노출된 어류체내에서 메탈로티오닌(metallothionein; MT) 유전자의 발현(expression)이 증폭됨에 따라 MT가 생성되는 특성을 나타내므로 중금속의 양식어류 등 식용어류의 오염여부를 알아 내는데 유용한 생체지표(biomarker)로 사용될 수 있는 메탈로티오닌의 효율적인 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 생체내의 중금속오염 생체지표(biomarker)인 메탈로티오닌(metallothionein)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생물체내에 축적되어 단백질기능 손상과 장기손상과 같은 심각한 부작용을 야기하는 것으로 확인되고 있는 생체이물(xenobiotics)로서의 중금속(heavy metals)의 양식어류 등 식용어류에의 오염여부를 알아내는데 유용한 생체지표인 메탈로티오닌의 효율적 제조방법에 관한 것이다.
중금속은 약 65개 정도의 금속원소들로 자연계에 존재하여 생명체 및 미생물개체에 대한 독성효과를 나타내는 원소로 정의되며, 아연(Zn), 철(Fe), 구리(Cu) 및 코발트(Co) 등과 같이 미량으로 존재할 때 생물체의 정상적인 생리기능 유지에 도움이 되는 것을 필수중금속이라 하고 수은(Hg), 납(Pb), 카드뮴(Cd) 등과 같이 환경공해물질로서 생물체에 해로운 영향을 미치는 것을 유해중금속이라 한다. 중금속은 생체내로 흡수되면 생체내 물질과 결합하여 잘 분해되지 않는 유기복합체를 형성하기 때문에 몸 밖으로 빨리 배출되지 않고 간장, 신장 등의 장기나 뼈에 축적되는 성질이 강한 물질이다. 특히 수은, 카드뮴, 납, 비소(As), 크롬(Cr) 등은 낮은 농도에서도 건강장해를 유발할 가능성이 매우 높은 물질이다.
인체가 중금속에 노출되는 과정은 산업폐기물 등을 통하여 자연계로 방출되는 중금속이 대기, 수질 그리고 토양을 오염시키며 이 때 수계로 부하된 중금속이온은 먹이사슬(food chain)상의 각종 조류와 플랑크톤을 거쳐 양식어류 등 식용어류에 축적되는데, 이들을 사람이 섭취하면 인체 내로 중금속이 축적된다. 따라서 어류는 인체가 중금속에 노출되는 주요한 매개체의 하나이므로 인체의 중금속 노출방지를 위하여 주요한 식이원의 하나인 어류에 대한 중금속 오염여부 검사기술에 대한 개발필요성이 점증하고 있다(Boreal Environment Research, Vol. 11, p. 185, 2006; International Journal of Environmental Science and Technology, Vol. 5, p. 179, 2008).
중금속에 노출된 잉어(carp), 게(crab), 새우(shrimp), 대구(cod), 메기류(catfish), 뱀장어(eel), 굴(oyster) 등 대부분의 어패류에서는 생체지표로서 메 탈로티오닌이 정상어류보다 현저하게 높게 발현되어 혈청 및 장기 중 농도가 수 mg/g 수준까지 증가하므로(Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 21, p. 1009, 2002), 이를 측정하면 식용으로 하는 이들 어류의 중금속 오염여부를 총체적으로 파악할 수 있고 이를 통하여 양성시료를 대상으로 기기분석법에 의한 정밀분석을 실행할 수 있는 근거를 제공할 수 있어 효소면역분석법, 형광면역분석법, 은 포화 분석법(Ag saturation assay)과 같은 메탈로티오닌 단백질에 대한 스크리닝기술이 전 세계적으로 개발되고 있다(Analytical Biochemistry, Vol. 228, p. 69, 1995; Environmental Toxicology, Vol. 21, p. 1009, 2002; Journal of Inorganic Biochemistry, Vol. 88, p. 123, 2002; Journal of Immunological Methods, Vol. 272, p. 247, 2003).
이와 같이 메탈로티오닌에 대한 간이검사법 개발을 위해서는 먼저 어종별 메탈로티오닌의 확보가 필요한데, 이를 위하여 사용할 수 있는 방법의 하나는 어류의 체내에서 메탈로티오닌을 고농도로 유도하여 증폭시키고 이를 회수하여 정제하는 것으로서, 이때 메탈로티오닌의 유도는 어류에 중금속 염을 주사하거나 스트레스를 가하여 이루어지게 되며, 이 때 유도과정의 조절은 전사수준(transcriptional level)에서 이루어지게 된다(Molecular and Cellular Biochemistry, Vol. 94, p. 175, 1990; Biomarkers, Vol. 9, p. 331, 2004; Toxicological Sciences, Vol. 80, p. 276, 2004).
메탈로티오닌은 단량체의 분자질량이 6,000∼8,000의 저분자 금속결합성 단 백질로서 시스테인(cysteine) 함량이 30％에 이르고 있어 산화환원반응이 손쉽게 일어나며 이와 같은 반응성에 따라 동물세포를 금속, 반응성 친전자체(reactive electrophile), 활성산소와 질소종(ROS/RNS)의 유독작용으로부터 보호해주는 역할을 한다. 메탈로티오닌을 구성하는 20개의 시스테인 잔기는 동물의 종류에 따라 높은 보존도를 나타내며 금속결합능을 지니는 알파(α) 및 베타(β)형의 thiolate cluster로 배열(Proceeding of the National Academy of Sciences, Vol. 80, p. 1501, 1983; Molecular and Cellular Biochemistry, Vol. 94, p. 175, 1990; Methods in Enzymology, Vol. 353, p. 268, 2002)되어 있다.
기존에는 메탈로티오닌을 제조하기 위하여 어류의 폐사방지를 위하여 중금속 염의 저 농도 용액을 어류체내에 주사함에 의하여 메탈로티오닌의 발현을 일정기간 유도하고 정제하는 과정에서 간과 아가미 등의 장기와 기관을 완충용액으로 균질화한 후 원심분리 하여 제조한 상등액을 다단계 방법을 사용하여 정제(Molecular and Cellular Biochemistry, Vol. 78, p. 55, 1987; Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, Vol. 62, p. 758, 1999)하였다.
그러나 생체지표의 유도를 위하여 어류체내로 유도제로서 중금속 염의 저농도용액을 주사하게 되면 목적하는 메탈로티오닌의 다량발현을 이룰 수 없는 문제점이 발생하여 결과적으로 바이오마커 단백질의 효율적 회수를 행할 수 없었다. 또한, 어류체내에 유도된 메탈로티오닌을 정제하는 과정에서 간과 아가미 등의 장기와 기관을 완충용액으로 균질화한 후 원심분리 하여 제조한 상등액을 다단계 방법을 사용하여 정제하는 기존의 방법(Molecular and Cellular Biochemistry, Vol. 78, p. 55, 1987; Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, Vol. 62, p. 758, 1999)은 어류에 대한 해부과정과 간의 적출 및 균질화 추출과정을 거쳐야 하므로 번거롭고 전문시설이 아닌 일상적인 실험실에서 보편적으로 행하기는 어려운 문제점이 있어 왔으므로 이를 개선하기 위한 새로운 방법의 개발이 필요한 실정이었다.
본 발명에서는 상기에서 제시된 문제점을 해결할 수 있는 새로운 방법을 제시하고 있다. 즉 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌을 제조하는데 있어, 어류의 마취 후 염화카드뮴 등 중금속 염의 고농도용액을 주사하여 어류의 체내에서 메탈로티오닌의 다량발현을 이루고, 이 과정에서 문제될 수 있는 어류에 부하된 과도한 스트레스와 사육과정에서 발생할 수 있는 주사침 부위 상처의 괴사 및 병균오염에 따른 어류의 폐사가능성(Aquatic Toxicology, Vol. 68, p. 109, 2004; North American Journal of Fisheries Management, Vol. 23, p. 962, 2003)을 해당 부위의 항생제 처치와 같이 적절한 위생관리를 통하여 방지한 결과로서 메탈로티오닌의 유도가 용이하게 이루어지도록 하였다. 아울러 간에서 유도되어 합성된 후 혈액내로 전이되는 생체지표인 메탈로티오닌(Journal of Toxicology and Environmental Health, Vol. 7, p. 251, 1981)을 정제하는데 있어, 간과 아가미 등의 장기와 기관을 완충용액으로 균질화한 후 원심분리 하여 제조한 상등액을 다단계 방법을 사용하여 정제하는 대신 혈액으로부터 회수하여 정제하며 그 회수과정에서도 혈청(blood serum)을 대상으로 하여 전체적으로 볼 때 생체지표에 대한 정제과정을 고도로 단순화시킨, 메탈로티오닌에 대한 효율적 제조방법에 대하여 기술하고 있 다.
앞에서 살펴본 바와 같이 어류의 중금속 오염여부를 판별할 수 있는 생체지표인 메탈로티오닌을 제조하는 기존의 방법은 효율성이 떨어져 상용화된 메탈로티오닌의 가격이 수 밀리그램 당 수백만 원에 이를 정도로 고가여서 결과적으로 메탈로티오닌에 대한 항체제작과 면역센서와 효소면역분석법에 기반한 메탈로티오닌에 대한 스크리닝기술의 개발을 어렵게 만드는 한 원인이 되고 있으므로, 이를 개선하여 어류 체내에서의 메탈로티오닌 유도를 위한 중금속 염의 고농도용액 주사 및 이 후의 사육과정에서의 적절한 위생관리를 통하여 어류에 가해지는 과도한 스트레스와 상처에 따른 높은 폐사율을 감소시켜 결과적으로 메탈로티오닌의 효율적 증폭을 이루고 아울러 이렇게 얻은 메탈로티오닌을 간편하게 회수하여 정제하는 새로운 기술개발이 긴요한 실정이며 이에 대한 필요성이 끊임없이 제기되어 왔다.
본 발명은 생물체내에 축적되어 단백질기능 손상과 장기손상과 같은 심각한 부작용을 야기하는 것으로 확인되고 있는 생체이물(xenobiotics)로서의 중금속(heavy metals)의 양식어류 등 식용어류에의 오염여부를 알아내는데 유용한 생체지표인 메탈로티오닌의 효율적 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 마취한 어류에 중금속 염의 고농도용액을 주사한 후 적절한 위생관리를 통하여 어류가 폐사되지 않도록 하며 사육하여 메탈로티오닌을 유도하는 단계; 상기 메탈로티오닌이 유도된 어류로부터 회수된 혈액에 단백질 가수분해효소 저해제를 첨가한 후, 원심분리를 하여 혈청을 얻고 이를 음이온교환 크로마토그래피 하는 단계를 포함하는 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 어류의 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌을 제조하는데 있다.
본 발명은 어류의 마취 후 염화카드뮴 등 중금속 염의 고농도용액을 생리식염수에 녹여 주사한 후 적절한 위생관리를 통하여 어류가 폐사되지 않도록 하여 메탈로티오닌의 고농도 유도가 용이하게 이루어지도록 하고, 아울러 어류체내에 유도된 메탈로티오닌을 회수하는 과정에서도 복잡한 해부과정을 거쳐 간과 아가미 등의 장기와 기관의 적출 및 이에 수반되는 균질화 추출과정을 거치는 대신 혈액을 채취하여 간편하게 행하며 아울러 혈액내로 증폭된 메탈로티오닌을 정제하는 과정에서도 혈장(blood plasma) 대신 혈청(blood serum)을 사용하여 단백질의 정제과정을 단순화시킨, 메탈로티오닌에 대한 효율적 제조방법을 확립하는데 있다.
본 발명은 어류의 폐사방지를 위한 적절한 위생관리 및 어류체내에 유도된 메탈로티오닌이 함유된 혈청으로부터 손 쉽게 메탈로티오닌을 제조할 수 있다.
본 발명은 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 어류에 고농도 중금속 염 주사액을 주입하고 주사침 주입부의 상처를 치료한 후, 사육하여 혈액내로 메탈로티오닌을 고농도로 유도하는 단계;
상기 메탈로티오닌이 유도된 어류로부터 혈액을 채취하여 회수된 혈액에 단백질 가수분해효소 저해제를 첨가한 후 원심분리 하여 혈청을 얻고 이를 음이온교환 크로마토그래피 하는 단계를 포함하는 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 고농도 중금속 염 주사액을 어류에 주입하기 전에 스트레스를 최소화하기 위하여 어류를 마취할 수 있다.
본 발명은 중금속 염으로는 염화카드뮴 또는 황산구리를 사용할 수 있다.
본 발명은 중금속 염 주사액 용매로 생리식염수를 사용할 수 있다.
본 발명은 중금속 염의 주사는 생리식염수에 녹인 주사액을 3차에 걸쳐서 나누어 주사할 수 있다. 이때 2차 부스팅 주사 시의 중금속 주사량을 초회 및 1차 부스팅 주사 시의 중금속 주사량의 2배 이상으로 증대시켜 어류체내에서의 메탈로티오닌 유도효과를 극대화할 수 있다.
본 발명은 고농도 중금속 염 주사액 주입 후의 병균오염 및 상처부위의 괴사방지를 위하여 주사침 주입부의 상처를 외용의 항생제 연고로 도포할 수 있다.
본 발명은 단백질 가수분해효소 저해제로서 메탈로(metallo), 세린(serine), 아스파르틱(aspartic) 및 시스테인(cysteine)계 단백질 가수분해효소와 아미노펩티다제(aminopeptidase)에 대한 광범위 저해제인 소디움 이디티에이(sodium EDTA), 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드(4-[2-aminoethyl]-benzenesulfonyl fluoride), 이-64(E-64), 류펩틴(leupeptin), 아프로티닌(aprotinin) 및 베스타틴(bestatin)을 포함할 수 있다.
본 발명은 음이온교환 크로마토그래피의 음이온교환 수지로 디 이 에이 이-셀룰로오스 수지의 하나인 디 이-52(DE-52) 등을 사용하고 염화나트륨 그래디언트를 걸어주는 완충용액으로는 3 내지 7 퍼센트의 단백질 가수분해효소 저해제를 포함하는 0.03 내지 0.07 몰 농도의 트리스-염산 완충용액(pH 8.0)을 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 마취한 어류에 중금속 염의 고농도용액을 주사한 후 적절한 위생관리를 통하여 어류가 폐사되지 않도록 하며 사육하여 메탈로티오닌을 유도하는 단계; 상기 메탈로티오닌이 유도된 어류로부터 회수된 혈액에 단백질 가수분해효소 저해제를 첨가한 후, 원심분리를 하여 혈청을 얻고 이를 음이온교환 크로마토그래피 하는 단계를 포함하는 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 제조방법을 제공한다.
상기에서 어류는 잉어, 도미, 광어, 송어, 대구, 연어, 우럭, 농어 등을 사용할 수 있고 메탈로티오닌을 유도하기 위한 중금속 염 주사액을 제조하는데 사용되는 중금속 염으로는 염화카드뮴(CdCl2), 황산구리(CuSO4), 황산아연(ZnSO4), 염화수은(HgCl2) 등이 사용된다.
본 발명자들은 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 경제적이고 간편한 제조방법을 검토한 결과, 어류를 마취하여 중금속 염의 고농도용액 주사를 행하고 피부표면에 남는 주사침 주입부의 상처는 외용의 항생제 연고로 도포함에 의하여 사육 중 조직의 괴사 및 병균오염을 방지하여 메탈로티오닌 유도기간 중에 어류의 폐사를 최소화할 수 있고, 아울러 복잡한 해부과정을 거쳐 간과 아가미 등의 장기와 기관의 적출 및 균질화 추출과정을 거쳐 메탈로티오닌을 정제하는 대신 어류의 혈액내로 증폭된 메탈로티오닌을 정제하며, 그 과정에서도 헤파린(heparin)을 사용하여 얻게 되는 혈장대신 채혈 후 일정시간 방치하여 얻은 혈청을 사용하여 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌을 간편하고 효율적으로 제조할 수 있고 아울러 다양한 어종으로부터의 메탈로티오닌 생산에 보편적으로 적용할 수 있는, 중금속 염의 고농도용액 주사와 이에 따른 폐사방지를 위한 적절한 위생관리 및 어류체내에 유도된 메탈로티오닌을 정제하는 과정에서 장기와 기관으로부터 메탈로티오닌을 추출·정제하여 제조하는 대신 간편하게 얻을 수 있는 혈청으로부터 메탈로티오닌을 정제함을 주요한 특징으로 하는 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
이하 본 발명을 제조단계별로 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 발명은 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌을 어류에서 효율적으로 제조하기 위해서 수돗물 조, 사육용수 조, 사육수조, 사육수조에 공기를 공급하기 위한 공기펌프, 유출수조 및 온도조절장치로 구성되어 있는 양어조의 사육수조에서 사전마취 후 중금속 염의 고농도용액 주사를 행하고 항생제 처치를 통하여 주사침 주입부의 위생관리를 행한 어류를 가하고 사육하면서 주사된 중금속 이온에 의한 전사수준에서의 메탈로티오닌 유도를 행할 수 있다. 그 다음으로 메탈로티오닌이 증폭된 어류의 혈액을 헤파린으로 처리하지 않고 일정시간 방치한 후 원심분리 하여 혈청을 얻을 수 있으며, 이를 간단한 크로마토그래피 과정을 통해 처리하여 메탈로티오닌을 정제할 수 있다.
(i) 중금속 염의 고농도용액 주사에 의한 어류로부터의 메탈로티오닌 유도공정
본 공정은 어류의 혈액내로 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌을 고농도로 증폭하기 위하여 수행한다.
메탈로티오닌을 어류체내에서 발현하기 위해서는 암수에 무관하게 어류에 중금속 염 주사를 놓아 간에서의 메탈로티오닌 유도 및 유도된 메탈로티오닌의 장기, 기관 및 혈액으로의 전이를 이루어야 하는데(Biochemical Pharmacology, Vol. 29, p. 2407, 1980), 주사된 중금속 염의 농도가 낮을 경우는 어류체내에서의 메탈로티오닌 유도가 충분치 이루어지지 못하는 문제점이 있다. 본 발명에서는 메탈로티오닌을 고농도로 증폭하기 위하여 중금속 염의 고농도용액을 생리식염수에 녹여 제조하여 어류에 주사하고 이로 인하여 발생할 수 있는 병균오염 및 이후의 사육과정에서 조직의 괴사로 인한 폐사를 적절한 위생관리를 통하여 방지하며 그 결과로서 어류체내에서 메탈로티오닌의 고농도 증폭을 가능하게 하는, 어류에서의 메탈로티오닌 유도공정을 확립할 수 있으며 그 구체적 방법은 다음과 같다.
염소를 제거하기 위하여 양어조의 수돗물 조에 미리 물을 받아놓고 1 내지 2일간 정치한 수돗물이나 해수를 사육용수로 하여 사육용수 조에 보관한다. 보관된 사육용수는 필요에 따라 사육수조로 이송하고 이송된 사육용수에 충분한 용존산소를 공급하기 위하여 사육수조에 공기펌프를 설치하며 사육용수의 수온은 어류의 생육을 원활하게 하기 위하여 15 내지 20℃ 수준으로 조절한다.
건강한 어류 5마리를 사육수조에서 1주일 정도 적응시킨 후 이중 3마리를 중금속 염 주사과정에서 어류에 스트레스를 주지 않기 위하여 최종농도 0.005 내지 0.015 퍼센트(％)가 되도록 마취제를 첨가한 마취용 수조의 사육용수에 집어넣고 2 내지 8분간 마취시킨다.
마취된 어류 3마리를 마취용 수조에서 꺼낸 후 이들에 대하여, 중금속 염 1 내지 3 밀리그램을 생리식염수 1 내지 3 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 어류중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 1 내지 3밀리그램이 되도록 복강주사(intraperitoneal injection)한 후, 사육과정 중 상처부위의 괴사로 인한 폐사방지를 위하여 주사침 주입부의 상처를 외용의 항생제 연고로 도포하여 준 후 이들을 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 담가 마취를 풀고 기력을 회복하면 사육수조에 집어넣는다.
중금속 염 주사를 행한 어류는 시판 양어용 사료를 하루에 1 내지 3회 정도 주면서 1 내지 3일간 사육하여 메탈로티오닌의 생성을 유도한다. 중금속 염의 1차 부스팅 주사를 위하여 앞서의 어류를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 마취제가 포함된 사육용수로 마취한 후 중금속 염 1 내지 5 밀리그램을 생리식염수 1 내지 3 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 어류중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 1 내지 5 밀리그램이 되도록 복강주사하고 주사침 주입부의 상처를 상기의 외용의 항생제 연고로 도포하여 치료한 후, 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 어류를 담가 마취를 푼 후 사육수조로 이송하여 상기의 사료를 하루에 1 내지 3회 정도 주면서 1 내지 3일간 사육하여 메탈로티오닌의 생성을 유도한다.
이 후 중금속 염의 1차 부스팅 주사를 받은 앞서의 어류를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 마취제가 포함된 사육용수로 마취한 후 중금속 염 1 내지 15 밀리그램을 생리식염수 1 내지 3 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 어류중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 5 내지 15밀리그 램이 되도록 복강주사하고 주사침 주입부의 상처를 상기의 외용의 항생제 연고로 도포하여 치료한 후, 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 어류를 담가 마취를 푼 후 사육수조로 이송하여 상기의 사료를 하루에 1 내지 3회 정도 주면서 5 내지 10일간 사육한다.
초기의 어류 5마리 중 두 마리는 대조군(control)으로 하여 중금속 염 주사를 행하지 않고 사육수조에 넣어 상기의 사료를 하루에 1 내지 3회 정도 주면서 7 내지 16일간 사육한다.
상기에서 주사침 주입부의 상처 치료는 트리암시놀론 아세토니드(triamcinolone acetonide), 베클로메타손 디프로피오네이트(beclomethasone dipropionate), 플루티카손(fluticasone)과 같은 외용 항생제 연고로 도포하는 것이 바람직하다.
중금속 염의 고농도용액 주사과정에서 적절한 위생관리를 통하여 어류에 병균오염과 조직의 괴사를 나타내지 않는, 상기의 메탈로티오닌 유도공정을 적용하면 실험개체수가 3마리인 경우 어류의 폐사는 전혀 발생하지 않으며 실험개체수가 훨씬 큰 경우에도 어류의 폐사율이 30 퍼센트 이하로 낮을 것으로 예상된 반면, 어류를 마취하지 않은 상태에서 중금속 염 주사를 행하여 어류에 스트레스가 가해지고 중금속 염 주사에 따른 주사침 주입부의 괴사방지를 위하여 항생제 연고의 도포를 행하지 않은 경우는 반복된 실험결과 80 내지 90 퍼센트에 이르는 대부분의 어류가 폐사하게 된다. 이로부터 상기에 기술된, 중금속 염의 고농도용액 주사에 의한 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 유도공정이 어류의 혈액내로 메탈로티오닌 농 도를 증폭하는 효율적인 방법임을 알 수 있다.
본 발명의 실시 예에서 상기의 공정을 통한 메탈로티오닌의 증폭정도를 알아보기 위하여 어류의 일례로서 잉어를 선택하여 병균오염과 상처부위 조직의 괴사를 야기하지 않도록 수행된 본 발명의 메탈로티오닌 유도공정을 적용해 본 결과, 중금속 염의 고농도용액을 주사한 잉어의 혈액에는 메탈로티오닌 유도의 결과로 단백질 농도가 높아져 7 퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)을 사용하고 50 퍼센트 메탄올 및 10 퍼센트 빙초산에 0.1 퍼센트 농도로 용해하여 제조한 쿠마씨 브릴리언트 블루 알-250(Coomassie Brilliant Blue R-250) 용액으로 염색하여 얻은 도 1의 에스 디 에스-전기영동사진의 4, 5, 6에서 볼 수 있는 것처럼 16.5 킬로달톤(killodalton, kDa)의 분자질량 표준마커 근처에서 14.4 킬로달톤의 메탈로티오닌 단백질 밴드(band)가 밀리리터 당 수십 밀리그램에 이르는 고농도로 증폭되어 나타난 반면, 도 1의 2, 3의 대조군의 혈액은 메탈로티오닌의 단백질 밴드가 나타나지 않아 본 발명의 공정을 통하여 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌이 높은 효율로 유도되어 증폭됨을 확인하였다.
(ii) 메탈로티오닌 증폭 어류 혈액으로부터 메탈로티오닌의 간편 정제공정
상기 공정 (i)에서 제조한, 메탈로티오닌이 증폭된 어류 혈액으로부터 메탈로티오닌을 회수하여 어류의 중금속 오염여부에 대한 스크리닝에 활용할 수 있도록 어종별로 메탈로티오닌에 대한 항체를 제작하고 효소면역분석법 및 면역센서 계측법 등의 정립을 위한 표준품을 제조하기 위해서는 혈액 중에 증폭된 메탈로티오닌 에 대한 정제과정을 거쳐야 한다.
본 발명에서는 간과 아가미 등의 장기와 기관의 적출 및 이에 수반되는 균질화 추출과정을 거치는 복잡한 방법 대신 헤파린을 사용하지 않고 채혈한 후 일정시간 방치하고 원심분리 하여 얻은, 불순물이 상대적으로 적은 혈청으로부터 메탈로티오닌을 정제하여 정제과정을 간편화 하고 정제효율도 향상시킬 수 있다. 메탈로티오닌이 증폭된 어류 혈액으로부터 메탈로티오닌을 간편하게 정제하는 구체적인 방법은 다음과 같다.
중금속 염의 2차 부스팅 주사를 행하여 양어조의 사육수조에서 5 내지 10일간 사육한 상기 공정 (i)의 어류를 사육수조에서 꺼내 0.005 내지 0.015 퍼센트의 마취제가 포함된 사육용수로 7 내지 13분간 마취한 후 어류 등줄의 뼈 사이에서 비스듬히 주사기를 찔러 넣어 대동맥으로부터 혈액을 뽑아 눈금이 부착된 시험관으로 옮기고 혈액 중에 존재하는 단백질 가수분해효소(protease)에 의한 메탈로티오닌의 분해를 방지하기 위하여 모아진 혈액부피의 3 내지 7 퍼센트(％)에 해당하는 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail for general use, 시그마사, MO, USA)을 첨가하여 잘 흔들어준다. 이 후 5 내지 25℃에서 20 내지 40분간 방치하여 적혈구가 응고되도록 한 후 분당 2,000 내지 6,000의 회전수(rpm)로 20 내지 40분 동안 원심분리 하여 상등액인 혈청을 얻는다.
상기에서 단백질 가수분해효소 저해제는 메탈로(metallo), 세린(serine), 아스파르틱(aspartic) 및 시스테인(cysteine)계 단백질 가수분해효소와 아미노펩티다제(aminopeptidase)에 대한 광범위 저해제인 소디움 이디티에이(sodium EDTA), 4- (2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드(4-[2-aminoethyl]-benzenesulfonyl fluoride), 이-64(E-64), 류펩틴(leupeptin), 아프로티닌(aprotinin) 및 베스타틴(bestatin)을 포함하는 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 메탈로티오닌이 증폭된 어류의 혈청을 음이온교환 수지가 충전된 음이온교환 칼럼에 가하고 3 내지 5℃에서 아래와 같이 음이온교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 행하여 메탈로티오닌을 정제한다. 먼저 완충용액 A(3 내지 7 퍼센트의 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 포함하는 0.03 내지 0.07 몰 농도의 트리스-염산 완충용액, pH 8.0)를 30 내지 50 밀리리터(㎖) 흘려준, 10 내지 30 밀리리터의 음이온교환 칼럼에 어류 혈청 3 내지 7 밀리리터를 분당 1 내지 2 밀리리터의 유속으로 흘려준다. 이후 완충용액 A를 20 내지 30 밀리리터 더 흘려주어 씻어준 후, 염화나트륨(NaCl) 그래디언트(gradient)를 걸어 완충용액 A와 완충용액 B(0.5 내지 1.5 몰 농도의 염화나트륨이 포함된 완충용액 A)를 각각 30 내지 50 밀리리터씩 흘려주면서 칼럼 용리액(eluent)의 분획을 받아 메탈로티오닌을 정제한다.
본 발명의 실시 예에서 본 공정을 통한 메탈로티오닌의 정제 정도를 알아보기 위하여 상기의 메탈로티오닌 간편 정제공정을 거친 어류의 일례로서 잉어를 선택하여, 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌이 유도된 잉어 혈청을 정제하여 얻은 칼럼 분획 및 300배 희석된 잉어 혈청 자체에 대하여 15 퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하고 50 퍼센트 메탄올 및 10 퍼센트 빙초산에 0.1 퍼센트 농도로 용 해하여 제조한 쿠마씨 브릴리언트 블루 알-250 용액으로 염색하는 과정을 거치는 에스 디 에스-전기영동을 행하였다. 그 결과, 도 2의 12에서 16까지의 분획에서 볼 수 있는 것처럼 16.5 킬로달톤의 분자질량 표준마커 근처에서 14.4 킬로달톤의 메탈로티오닌 단백질 밴드만이 뚜렷하게 나타나 상기의 정제공정이 효율적이어서 메탈로티오닌의 정제가 잘 이루어짐을 알 수 있었다.
이하 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시 예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
어류에서의 메탈로티오닌 유도 및 정제를 위하여 양어조의 사육수조에서 마취과정 없이 중금속 염 주사를 행한 잉어를 아래와 같이 사육하였다. 염소를 제거하기 위하여 수돗물 조에 미리 물을 받아놓고 2일 동안 정치한 수돗물을 사육용수 조에 보관하며, 보관된 사육용수는 필요에 따라 사육수조로 이송하고 사육용수에 충분한 용존산소를 공급하기 위하여 사육수조에 공기펌프를 설치하며 사육용수의 수온은 잉어의 생육에 적합하도록 18℃로 조절하였다.
체중 1,000 그램(g)의 건강한 잉어 5마리를 사육수조에서 상기의 시판 양어용 사료를 하루에 2회 주면서 1 주일 동안 적응시킨 후 이 중 3마리를 마취시키지 않은 채 중금속 염으로서 염화카드뮴 2 밀리그램을 생리식염수 1 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 어류중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 2밀리그램이 되도록 복강주사한 후, 사육수조에 집어넣고 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 2일간 사육하여 메탈로티오닌의 생성을 유도하였다.
염화카드뮴 용액의 1차 부스팅 주사는 앞서의 어류를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 염화카드뮴 3 밀리그램을 생리식염수 1 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 어류중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 3 밀리그램이 되도록 복강주사한 후 사육수조에 집어넣고 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 2일간 사육하여 메탈로티오닌의 생성을 유도하였다. 이 후 앞서의 잉어를 사육수조에서 꺼내 중금속 염의 2차 부스팅 주사를 상기와 동일한 과정에 따라 중금속 염 12.5 밀리그램을 생리식염수 1 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 어류중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 12.5 밀리그램이 되도록 복강주사한 후 사육수조에 집어넣고 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하여 메탈로티오닌의 생성을 유도하였다.
초기의 잉어 5마리 중 두 마리는 대조군으로 하여 염화카드뮴 용액의 주사를 행하지 않고 사육수조에 넣어 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 11일간 사육하고자 하였다.
그러나 이 경우, 잉어는 중금속 염 주사과정에서 심하게 저항하면서 스트레스를 많이 받아 주사침 주입부의 상처가 커졌으며 사육과정에서도 상처부위의 괴사가 현저하여 11일간의 총사육기간이 종료하였을 때 대조군의 잉어는 건강하였으나 염화카드뮴 처리구의 경우에는 전부 폐사하였으므로 잉어 체내에서의 효율적인 메탈로티오닌 유도를 위해서는 중금속 염 주사와 사육과정의 개선이 절실한 것으로 나타났다.
<실시예 2>
중금속 염 주사 후 사육과정에서 잉어가 폐사하는 실시 예 1의 문제점을 개선하여 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌을 효율적으로 제조하기 위하여 잉어를 대상으로 한 메탈로티오닌의 유도를 다음과 같이 행하였다.
염소를 제거하기 위하여 양어조의 수돗물 조에 미리 물을 받아놓고 2일간 정치한 수돗물을 사육용수 조에 보관하며, 보관된 사육용수는 필요에 따라 사육수조로 이송하고 사육용수에 충분한 용존산소를 공급하기 위하여 사육수조에 공기펌프를 설치하며 사육용수의 수온은 잉어의 생육에 적합하도록 18℃로 조절하였다. 체중 1,000 그램의 건강한 잉어 5 마리를 사육수조에서 상기의 사료를 하루 2회 주면서 1 주일 동안 적응시킨 후, 이 중 3마리를 중금속 염 주사과정에서 스트레스를 주지 않도록 최종농도 0.01 퍼센트가 되도록 마취제인 에틸 3-아미노벤조산(ethyl 3-aminobenzoate)을 가한 마취용 수조의 사육용수에 집어넣고 5분간 마취시켰다.
마취된 잉어 3마리를 마취용 수조에서 꺼낸 후 이들에 대하여, 중금속 염으로서 염화카드뮴 2 밀리그램을 생리식염수 1 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 어류중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 2밀리그램이 되도록 복강주사한 후, 주사침 주입부의 상처를 외용의 항생제 연고인 트리암시놀 론 아세토니드로 도포하여 이 후의 사육과정에서 상처부위의 괴사를 방지하여 준 후 이들을 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 담가 마취를 풀고 기력을 회복하면 사육수조에 집어넣었다.
염화카드뮴 주사를 행한 잉어는 시판 양어용 사료를 하루에 2회 주면서 2일간 사육하여 메탈로티오닌의 생성을 유도하였다. 중금속 염의 1차 부스팅 주사를 위하여 앞서의 잉어를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 마취제가 포함된 사육용수로 마취한 후 염화카드뮴 3 밀리그램을 생리식염수 1 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 잉어중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 3 밀리그램이 되도록 복강주사하고 주사침 주입부의 상처를 상기의 외용의 항생제 연고로 도포하여 치료한 후, 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 잉어를 담가 마취를 푼 후 사육수조로 이송하여 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 2일간 사육하여 메탈로티오닌의 생성을 유도하였다.
이 후 염화카드뮴의 1차 부스팅 주사를 받은 앞서의 잉어를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 마취제가 포함된 사육용수로 마취한 후 염화카드뮴 12.5 밀리그램을 생리식염수 1 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 어류중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 12.5 밀리그램이 되도록 복강주사하고 주사침 주입부의 상처를 상기의 외용의 항생제 연고로 도포하여 치료한 후, 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 잉어를 담가 마취를 푼 후 사육수조로 이송하여 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하였다.
초기의 잉어 5마리 중 두 마리는 대조군으로 하여 염화카드뮴 주사를 행하지 않고 사육수조에 넣어 상기의 사료를 하루에 2회 정도 주면서 11일간 사육하였다.
메탈로티오닌이 증폭된 잉어의 혈액으로부터 메탈로티오닌을 회수하기 위한 정제과정을 다음과 같이 행하였다. 즉 염화카드뮴의 2차 부스팅 주사를 행하여 양어조의 사육수조에서 7일간 사육한 상기의 잉어를 사육수조에서 꺼내 0.01 퍼센트의 상기 마취제가 포함된 사육용수로 10분간 마취한 후 잉어 등줄의 뼈 사이로 비스듬히 주사침을 찔러 넣어 대동맥으로부터 혈액을 뽑아 눈금이 부착된 시험관으로 옮기고 혈액 중에 존재하는 단백질 가수분해효소에 의한 메탈로티오닌의 분해를 방지하기 위하여 모아진 혈액부피의 5 퍼센트에 해당하는 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 첨가하여 잘 흔들어주었다. 이후 20℃에서 30분간 방치하여 적혈구가 응고되도록 한 후 분당 3,000의 회전수로 30분 동안 원심분리를 행하여 상등액인 혈청을 얻었다.
메탈로티오닌이 유도된 잉어의 혈청을 음이온교환 수지로서 디 이 에이 이-셀룰로오스(DEAE-Cellulose) 수지의 하나인 디 이- 52(DE-52)로 충전된 음이온교환 칼럼에 가하고 4℃에서 아래와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 메탈로티오닌을 정제하였다. 먼저 완충용액 A(5 퍼센트의 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 포함하는 0.05 몰 농도의 트리스-염산 완충용액, pH 8.0)를 40 밀리리터 흘려준, 20 밀리리터의 디 이-52 칼럼에 잉어 혈청 5 밀리리터를 분당 1.5 밀리리터의 유속으로 흘려주었다. 이 후 완충용액 A를 25 밀리리터 더 흘려주어 씻어준 후, 염화나트륨 그래디언트를 걸어 완충용액 A와 완충용액 B(1.0 몰 농도의 염화나트륨이 포함된 완충용액 A)를 각각 40 밀리리터씩 흘려주면서 칼럼 용리액의 분획을 받아 메탈로티오닌을 정제하였다.
중금속 염으로서 염화카드뮴 주사과정 및 이 후의 사육과정에서 잉어에 병균오염 및 조직의 괴사를 주지 않도록 수행된 본 실시 예의 메탈로티오닌 유도공정을 적용하였을 때 잉어의 폐사는 발생하지 않았으며 15 퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 에스 디 에스-전기영동 결과 염화카드뮴 처리구의 혈액에서 대조군에서는 거의 발견되지 않는 메탈로티오닌의 단백질 밴드가 밀리리터 당 50 밀리그램의 높은 농도로 나타나 메탈로티오닌의 고농도 유도가 잘 이루어졌음을 확인하였다. 아울러 본 실시 예에 따라 제조된, 메탈로티오닌이 증폭된 잉어 혈청을 정제하여 얻은 칼럼 분획에 대하여 15 퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 에스 디 에스-전기영동을 행하면 각각의 정제분획에서 메탈로티오닌의 단백질 밴드가 뚜렷하게 나타나 메탈로티오닌의 정제가 효율적으로 이루어졌음을 알 수 있었다.
<실시예 3>
잉어로부터 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 효율적 제조를 중금속 염으로서 황산구리를 사용하고 기타의 방법은 실시예 2에 따라 아래와 같이 행하였다. 즉 염소를 제거하기 위하여 양어조의 수돗물 조에 미리 물을 받아놓고 2일간 정치한 수돗물을 사육용수 조에 보관하며, 보관된 사육용수는 필요에 따라 사육수조로 이송하고 사육용수에 충분한 용존산소를 공급하기 위하여 사육수조에 공기펌프를 설치하며 사육용수의 수온은 잉어의 생육에 적합하도록 18℃로 조절하였다.
체중 1,000 그램의 건강한 잉어 5마리를 사육수조에서 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 1 주일 동안 적응시킨 후, 이 중 3마리를 중금속 염 주사과정에서 스트레스를 주지 않도록 최종농도 0.01 퍼센트가 되도록 마취제인 에틸 3-아미노벤조산을 가한 마취용 수조의 사육용수에 집어넣고 5분간 마취시켰다. 마취된 잉어 3마리를 마취용 수조에서 꺼낸 후 이들에 대하여, 중금속 염으로서 황산구리 2 밀리그램을 생리식염수 1 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 어류중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 2밀리그램이 되도록 복강주사한 후, 주사침 주입부의 상처를 외용의 항생제 연고인 트리암시놀론 아세토니드로 도포하여 이 후의 사육과정에서 상처부위의 괴사를 방지하여 준 후 이들을 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 담가 마취를 풀고 기력을 회복하면 사육수조에 집어넣었다.
황산구리 주사를 행한 잉어는 시판 양어용 사료를 하루에 2회 주면서 2일간 사육하여 메탈로티오닌의 생성을 유도하였다. 중금속 염의 1차 부스팅 주사를 위하여 앞서의 잉어를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 마취제가 포함된 사육용수로 마취한 후 황산구리 3 밀리그램을 생리식염수 1 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 잉어중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 3 밀리그램이 되도록 복강주사하고 주사침 주입부의 상처를 상기의 외용의 항생제 연고로 도포하여 치료한 후, 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 잉어를 담가 마취를 푼 후 사육수조로 이송하여 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 2일간 사육하여 메탈로티오닌의 생성을 유도하였다.
이 후 황산구리의 1차 부스팅 주사를 받은 앞서의 잉어를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 마취제가 포함된 사육용수로 마취한 후 황산구리 12.5 밀리그램을 생리식염수 1 밀리리터에 용해하여 얻은, 생리식염수 기반 주사액을 어류중량 1,000 그램 당 주사된 중금속 염의 양이 12.5 밀리그램이 되도록 복강주사하고 주사침 주입부의 상처를 상기의 외용의 항생제 연고로 도포하여 치료한 후, 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 잉어를 담가 마취를 푼 후 사육수조로 이송하여 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하였다.
초기의 잉어 5마리 중 두 마리는 대조군으로 하여 황산구리 주사를 행하지 않고 사육수조에 넣어 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 11일간 사육하였다.
메탈로티오닌이 유도된 잉어의 혈액으로부터 메탈로티오닌을 회수하기 위한 정제과정을 다음과 같이 행하였다. 즉 황산구리의 2차 부스팅 주사를 행하여 양어조의 사육수조에서 7일간 사육한 상기의 잉어를 사육수조에서 꺼내 0.01 퍼센트의 상기 마취제가 포함된 사육용수로 10분간 마취한 후 잉어 등줄의 뼈 사이로 비스듬히 주사침을 찔러 넣어 대동맥으로부터 혈액을 뽑아 눈금이 부착된 시험관으로 옮기고 혈액 중에 존재하는 단백질 가수분해효소에 의한 메탈로티오닌의 분해를 방지하기 위하여 모아진 혈액부피의 5 퍼센트에 해당하는 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 첨가하여 잘 흔들어주었다. 이후 20℃에서 30분간 방치하여 적혈구가 응고되도록 한 후 분당 3,000의 회전수로 30분 동안 원심분리를 행하여 상등액인 혈청을 얻었다.
메탈로티오닌이 유도된 잉어의 혈청을 디 이-52 수지로 충전된 음이온교환 칼럼에 가하고 4℃에서 아래와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 메탈로티오닌을 정제하였다. 먼저 완충용액 A(5 퍼센트의 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 포함하는 0.05 몰 농도의 트리스-염산 완충용액, pH 8.0)를 40 밀리리터 흘려준, 20 밀리리터의 디 이-52 칼럼에 잉어 혈청 5 밀리리터를 분당 1.5 밀리리터의 유속으로 흘려주었다. 이 후 완충용액 A를 25 밀리리터 더 흘려주어 씻어준 후, 염화나트륨 그래디언트를 걸어 완충용액 A와 완충용액 B(1.0 몰 농도의 염화나트륨이 포함된 완충용액 A)를 각각 40 밀리리터씩 흘려주면서 칼럼 용리액의 분획을 받아 메탈로티오닌을 정제하였다.
중금속 염으로서 황산구리 주사과정 및 이 후의 사육과정에서 잉어에 병균오염 및 조직의 괴사를 주지 않도록 수행된 본 실시 예의 메탈로티오닌 유도공정을 거친 잉어의 혈액내로의 메탈로티오닌의 증폭은 실시 예 2에서와 같이 현저히 높게 나타나 메탈로티오닌의 유도가 잘 이루어졌음을 알 수 있었다. 아울러 본 실시 예에 따라 제조된, 메탈로티오닌이 증폭된 잉어 혈청을 정제하여 얻은 칼럼 분획에 대하여 15 퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 에스 디 에스-전기영동을 행하면 각각의 정제분획에서 메탈로티오닌의 단백질 밴드를 뚜렷하게 관찰할 수 있어 메탈로티오닌의 정제가 효율적으로 이루어졌음을 알 수 있었다.
본 발명에 의한 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 효율적 제조방법은 어류의 체내에서 메탈로티오닌을 발현하기 위하여 생리식염수에 용해된 중금속 염 의 고농도용액을 주사하고 사육하는 과정에서 적절한 위생관리를 통하여 어류가 폐사되지 않도록 하고 메탈로티오닌의 고농도 유도가 용이하게 이루어지도록 하여 메탈로티오닌의 제조과정을 최적화할 수 있다. 또한 유도기간 중 어류체내에 유도된 메탈로티오닌을 회수하는 데에 있어서도 복잡한 해부과정을 거쳐 간과 아가미 등의 장기와 기관의 적출 및 이에 수반되는 균질화 추출과정을 거치지 않고 혈액을 채취하여 행하며, 회수된 어류의 혈액내로 유도된 메탈로티오닌을 어류의 혈청으로부터 간편한 크로마토그래피 과정을 통하여 효율적으로 정제하여 어종별 메탈로티오닌 표준품으로써 뿐만 아니라 메탈로티오닌 항체제작에도 사용할 수 있다. 또한 파급효과가 높은 중금속오염 생체지표 검색기술에 관련된 기반기술을 확립할 수 있으므로 산업적 이용 가능성이 있다.
도 1는 본 발명의 잉어 혈청 중에 증폭된 메탈로티오닌에 대한 에스 디 에스-전기영동 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 잉어 혈청 중에 증폭된 메탈로티오닌을 디 이-52 충전 음이온교환 칼럼으로 정제하여 얻은 각 분획에 대한 전기영동 사진을 나타낸 것이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1 : 분자질량 표준마커
2 : 염화카드뮴 주사로 메탈로티오닌 증폭을 유도하지 않은 300배 희석 대조군 수컷 잉어 1 혈청의 에스 디 에스-전기영동 패턴
3 : 염화카드뮴 주사로 메탈로티오닌 증폭을 유도하지 않은 300배 희석 대조군 암컷 잉어 1 혈청의 에스 디 에스-전기영동 패턴
4 : 염화카드뮴 주사로 메탈로티오닌이 증폭된 300배 희석 수컷 잉어 2 혈청의 에스 디 에스-전기영동 패턴
5 : 염화카드뮴 주사로 메탈로티오닌이 증폭된 300배 희석 암컷 잉어 2 혈청의 에스 디 에스-전기영동 패턴
6 : 염화카드뮴 주사로 메탈로티오닌이 증폭된 300배 희석 암컷 잉어 3 혈청의 에스 디 에스-전기영동 패턴
7 : 분자질량 표준마커
8 : 염화카드뮴 주사로 메탈로티오닌이 증폭된 300배 희석 잉어 혈청의 에 스 디 에스-전기영동 패턴
9 : 디 이-52 칼럼에 의한 메탈로티오닌 정제 시 플로-쓰루(flow-through) 분획 1에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴
10 : 디 이-52 칼럼에 의한 메탈로티오닌 정제 시 플로-쓰루 분획 2에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴
11 : 디 이-52 칼럼에 의한 메탈로티오닌 정제 시 플로-쓰루 분획 3에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴
12 : 디 이-52 칼럼에 의한 메탈로티오닌 정제 시 분획 1에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴
13 : 디 이-52 칼럼에 의한 메탈로티오닌 정제 시 분획 2에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴
14 : 디 이-52 칼럼에 의한 메탈로티오닌 정제 시 분획 3에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴
15 : 디 이-52 칼럼에 의한 메탈로티오닌 정제 시 분획 4에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴
16 : 디 이-52 칼럼에 의한 메탈로티오닌 정제 시 분획 5에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴

Claims (9)

  1. 어류에 고농도 중금속 염 주사액을 주입하고 주사침 주입부의 상처를 치료한 후, 사육하여 혈액내로 메탈로티오닌을 고농도로 유도하는 단계;
    상기 메탈로티오닌이 유도된 어류로부터 혈액을 채취하여 회수된 혈액에 단백질 가수분해효소 저해제를 첨가한 후 원심분리 하여 혈청을 얻고 이를 음이온교환 크로마토그래피 하는 단계를 포함하는 중금속오염 생체지표인 메탈로티오닌의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 고농도 중금속 염 주사액을 어류에 주입하기 전에 스트레스를 최소화하기 위하여 어류를 마취하는 것을 특징으로 하는 메탈로티오닌의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 중금속 염으로는 염화카드뮴 또는 황산구리를 사용하는 것을 특징으로 하는 메탈로티오닌의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 중금속 염 주사액 용매로 생리식염수를 사용하는 것을 특징으로 하는 메탈로티오닌의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 중금속 염의 주사는 생리식염수에 녹인 주사액을 3차에 걸 쳐서 나누어 주사하는 것을 특징으로 하는 메탈로티오닌의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 2차 부스팅 주사 시의 중금속 주사량을 초회 및 1차 부스팅 주사 시의 중금속 주사량의 2배 이상으로 증대시켜 어류체내에서의 메탈로티오닌 유도효과를 극대화하는 것을 특징으로 하는 메탈로티오닌의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 고농도 중금속 염 주사액 주입 후의 병균오염 및 상처부위의 괴사방지를 위하여 주사침 주입부의 상처를 외용의 항생제 연고로 도포하는 것을 특징으로 하는 메탈로티오닌의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 단백질 가수분해효소 저해제는 메탈로(metallo), 세린(serine), 아스파르틱(aspartic) 및 시스테인(cysteine)계 단백질 가수분해효소와 아미노펩티다제(aminopeptidase)에 대한 광범위 저해제인 소디움 이디티에이(sodium EDTA), 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드(4-[2-aminoethyl]-benzenesulfonyl fluoride), 이-64(E-64), 류펩틴(leupeptin), 아프로티닌(aprotinin) 및 베스타틴(bestatin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 메탈로티오닌의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 음이온교환 크로마토그래피는 음이온교환 수지로 디 이 에이 이-셀룰로오스 수지의 하나인 디 이-52 등을 사용하고 염화나트륨 그래디언트를 걸어주는 완충용액으로는 3 내지 7 퍼센트의 단백질 가수분해효소 저해제를 포함하는 0.03 내지 0.07 몰 농도의 트리스-염산 완충용액(pH 8.0)을 사용하는 것을 특징으로 하는 메탈로티오닌의 제조방법.
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