KR100829895B1 - 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에스트로겐 활성을 나타내어 생태계 교란의 주요원인의 하나로 확인되고 있는 내분비계장애물질의 양식어류 등에의 오염 여부를 알아내는데 유용한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 효율적 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 어류의 마취 후 17 베타-에스트라디올 등의 에스트로겐 화합물을 주사하고 아울러 비텔로제닌 유도기간 중 주사부위 상처의 괴사가 없도록 적절한 위생관리를 통하여 어류의 폐사율을 획기적으로 낮추며, 어류의 혈액내로 유도된 비텔로제닌을 헤파린을 사용하지 않고 어류의 혈청으로부터 간편한 크로마토그래피 과정을 통하여 어종별 항체제작 및 분석용 표준품으로서 사용가능할 정도로 간편하게 정제할 수 있다. 따라서 본 발명에서 제시한 비텔로제닌의 효율적 제조방법은 내분비계장애물질 바이오마커 검색기술 개발에 필수적인 원천기반기술의 하나로서, 이 방법의 활용을 통하여 내분비계장애물질 바이오마커 단백질에 대한 면역센서와 효소면역분석법 등의 분석법 개발이 촉진될 수 있을 것으로 기대된다.

에스트로겐 활성, 바이오마커 단백질, 비텔로제닌

Description

에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 제조방법 {Efficient preparation method for vitellogenin, a biomarker protein for estrogenic activity}

도 1은 양어조의 구성도를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 잉어 혈청 중에 증폭된 비텔로제닌에 대한 에스 디 에스-전기영동 사진을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 잉어 혈청 중에 증폭된 비텔로제닌을 디 이-52 충전 음이온교환 칼럼으로 정제하여 얻은 각 분획에 대한 전기영동 사진을 나타낸 것이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

1 : 수돗물 조

2 : 사육용수 조

3 : 펌프

4 : 공기펌프

5 : 사육수조

6 : 유출수조

7 : 에어컨

8 : 분자질량 표준마커

9 : 17 베타-에스트라디올 주사로 비텔로제닌이 증폭된 500배 희석 수컷 잉어 1 혈청의 에스 디 에스-전기영동 패턴

10 : 17 베타-에스트라디올 주사로 비텔로제닌이 증폭된 500배 희석 수컷 잉어 2 혈청의 에스 디 에스-전기영동 패턴

11 : 17 베타-에스트라디올 주사로 비텔로제닌이 증폭된 500배 희석 암컷 잉어 1 혈청의 에스 디 에스-전기영동 패턴

12 : 17 베타-에스트라디올 주사로 비텔로제닌이 증폭된 500배 희석 암컷 잉어 2 혈청의 에스 디 에스-전기영동 패턴

13 : 17 베타-에스트라디올 주사로 비텔로제닌 증폭을 유도하지 않은 500배 희석 대조구 암컷 잉어 혈청의 에스 디 에스-전기영동 패턴

14 : 17 베타-에스트라디올 주사로 비텔로제닌 증폭을 유도하지 않은 500배 희석 대조구 수컷 잉어 혈청의 SDS-전기영동 패턴

15 : 분자질량 표준마커

16 : 고 분자질량 표준마커

17 : 저 분자질량 표준마커

18 : 17 베타-에스트라디올 주사로 비텔로제닌이 증폭된 500배 희석 잉어 혈청의 에스 디 에스-전기영동 패턴

19 : 디 이-52 칼럼에 의한 비텔로제닌 정제 시 플로-쓰루(flow-through) 분 획에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴

20 : 디 이-52 칼럼에 의한 비텔로제닌 정제 시 분획 1에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴

21 : 디 이-52 칼럼에 의한 비텔로제닌 정제 시 분획 2에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴

22 : 디 이-52 칼럼에 의한 비텔로제닌 정제 시 분획 3에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴

23 : 디 이-52 칼럼에 의한 비텔로제닌 정제 시 분획 4에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴

24 : 디 이-52 칼럼에 의한 비텔로제닌 정제 시 분획 5에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴

25 : 디 이-52 칼럼에 의한 비텔로제닌 정제 시 분획 6에 대한 에스 디 에스-전기영동 패턴

본 발명은 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌(vitellogenin)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 에스트로겐 활성을 나타내어 생태계 교란의 주요원인의 하나로 확인되고 있는 내분비계 장애물질(endocrine disruptor)의 양식어류 등에의 오염 여부를 알아내는데 유용한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 효율적 제조방법에 관한 것이다.

내분비계장애물질은 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 화학물질로 정의되며, 환경에 배출된 후 체내에 유입되어 마치 호르몬처럼 작용하는 특성을 지닌다. 내분비계장애물질은 그 화학구조가 생명체의 호르몬과 비슷하여 생명체에 흡수될 경우 정상적인 호르몬의 기능을 혼란시킴으로써 생태계를 파괴하고 먹이사슬(food chain)을 통하여 궁극적으로는 인간의 생식기능 저하, 기형, 성장장애, 암 등을 유발하는 물질로서 확인되고 있어 오존층 파괴, 지구 온난화 문제와 함께 세계의 3대 환경문제로 등장하고 있다.

내분비계장애물질에의 노출은 폐기물 소각장, 화학공장, 음식물의 잔류농약 등에서 유래한 화학물질이 먼저 수질, 대기, 토양 등의 환경을 오염시키고 다음으로 오염물질이 어류, 가축 및 그 가공제품에 축적된 다음 최종적으로 식이섭취를 통하여 인체에 들어오는 과정을 거쳐 이루어진다. 따라서 어류는 인체가 내분비계장애물질에 노출되는 주요한 매개체의 하나이므로 인체의 내분비계장애물질 노출방지를 위하여 주요한 식이원의 하나인 어류에 대한 내분비계장애물질 오염 여부 검사기술에 대한 개발필요성이 점증하고 있다(Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, p. 2812, 2000; Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 16, p. 543, 1997).

내분비계장애물질에 노출된 잉어(carp), 무지개송어(rainbow trout), 광어(flatfish), 도미(sea bream), 연어(atlantic salmon) 등 대부분의 어류에서는 바이오마커 단백질로서 에스트로겐(estrogen) 의존성의 난황 단백질 전구체인 비텔로제닌이 정상어류보다 현저하게 높게 발현되어 혈청 중 농도가 ㎎/㎖ 수준까지 증가하므로(Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 21, p. 47, 2002), 이를 측정하면 식용으로 하는 이들 어류의 내분비계 장애물질 오염 여부를 총체적으로 파악할 수 있고 이를 통하여 양성시료를 대상으로 기기분석법에 의한 정밀분석을 행할 수 있는 근거를 제공할 수 있어 면역침전법, 효소면역분석법 및 면역센서와 같은 비텔로제닌 단백질에 대한 스크리닝 기술이 전 세계적으로 개발되고 있다(Environmental Pollution, Vol. 128, p. 363, 2004; Marine Biotechnology, Vol. 3, p. 510, 561, 2001).

이와 같이 비텔로제닌에 대한 간이검사법 개발을 위해서는 먼저 어종별 비텔로제닌을 확보하여야 하는데 이를 위하여 사용할 수 있는 방법의 하나는 어류의 체내에서 비텔로제닌을 고농도로 증폭하여 발현시키고 이를 혈액으로부터 회수하여 정제하는 것으로서, 이때 비텔로제닌의 유도는 어류의 에스트로겐 수용기를 에스트로겐 화합물 주사로 자극하여 이루어지게 된다(Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 21, p. 47, 2002; General and Comparative Endocrinology, Vol. 110, p. 252, 1998).

난황단백질 전구체인 인지질 당단백질(phospholipoglycoprotein)로서의 비텔로제닌의 단량체(monomer)와 변성되지 않은 천연단백질(native protein)의 분자질량은 어종에 따라 각각 130_∼200 및 370_∼450 킬로달톤(killodalton)에 이른다고 보 고되고 있으며(Journal of Chromatography B, Vol. 799, p. 87, 2004; Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology and Pharmacology, Vol. 135, p. 305, 2003; General and Comparative Endocrinology, Vol. 110, p. 252, 1998), 보통의 경우 난소의 에스트로겐 화합물에 반응하여 암컷 어류의 혈액에만 존재한다. 그러나 에스트로겐 화합물이나 내분비계장애물질에 노출된 수컷 어류나 치어의 경우에도 비텔로제닌 유전자와 비텔로제닌의 대사조절에 필요한 에스트로겐 수용기를 지니고 있으므로 이들이 에스트로겐 활성을 지닌 물질에 노출되면 비텔로제닌 유전자가 유도되어 혈액내로 비텔로제닌이 축적되게 된다(Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 21, p. 47, 2002).

기존에는 비텔로제닌을 제조하기 위하여 에스트로겐 화합물을 코코아 버터와 같은 보조제(adjuvant)에 용해한 후 어류 체내에 주사함에 의하여 어류의 에스트로겐 수용기를 자극하여 비텔로제닌의 발현을 일정기간 유도하고 헤파린 처리한 시험관으로 꼬리정맥(caudal vein)으로부터 혈액을 채취한 후 원심분리를 행하여 혈장(blood plasma)을 제조하고 이를 다단계 방법을 사용하여 정제하였다(Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 21, p. 47, 2002; General and Comparative Endocrinology, Vol. 110, p. 252, 1998). 그러나 비텔로제닌의 유도를 위하여 에스트로겐 화합물 주사를 하는 과정에서 어류에 과도한 스트레스와 상처를 주게 되고 그 결과 폐사율(mortality)이 높아져(Aquatic Toxicology, Vol. 68, p. 109, 2004; North American Journal of Fisheries Management, Vol. 23, p. 962, 2003) 비텔로제닌 유도기간이 경과한 시점에서 생존한 호르몬처리 개체수가 현저하게 낮아지는 문제점이 발생하여 결과적으로 바이오마커 단백질의 효율적 증폭을 이룰 수 없었다.

또한, 어류의 혈액으로부터 유도된 비텔로제닌을 정제하는 과정에서 혈액응고를 방지하기 위하여 헤파린 처리된 시험관에 채혈한 후 원심분리 하여 혈장을 얻고 이를 크로마토그래피, 전기영동, 한외여과(ultrafiltration) 및 침전화(precipitation)와 같은 과정을 한 단계 이상 거쳐 비텔로제닌을 정제하였다(General and Comparative Endocrinology, Vol. 110, p. 252, 1998; Fish Physiology and Biochemistry, Vol. 8, p. 111, 1990; Fish Physiology and Biochemistry, Vol. 5, p. 59, 1988).

그러나 헤파린 처리 후 원심분리 하여 얻은 혈장에서는 혈구분리가 완벽하게 이루어지지 못하고 비텔로제닌과 함께 다량의 혈색소가 불순물로 섞여있으므로 이후의 정제과정이 복잡해지는 문제점이 있고 이에 따라 정제효율이 떨어지게 되므로 이를 개선하기 위한 새로운 방법의 개발이 필요한 실정이다.

앞에서 살펴본 바와 같이 어류의 내분비계장애물질 오염 여부를 판별할 수 있는 바이오마커 단백질인 비텔로제닌을 제조하는 기존의 방법은 효율성이 떨어져 상용화된 비텔로제닌의 가격이 수십 마이크로그램 당 수십만 원에 이를 정도로 고가여서 결과적으로 비텔로제닌에 대한 항체제작과 효소면역분석법 등의 비텔로제닌에 대한 스크리닝 기술 개발을 어렵게 만드는 한 원인이 되었으므로, 이를 개선하여 어류 체내에서의 비텔로제닌 유도를 위한 호르몬 주사 및 이 후의 사육과정에서, 어류에 가해지는 과도한 스트레스와 상처에 따른 높은 폐사율을 감소시켜 결과 적으로 비텔로제닌의 효율적 증폭을 이루고 아울러 이렇게 하여 얻은 비텔로제닌의 정제과정을 간편화할 수 있는 새로운 기술개발이 긴요한 실정이며 이에 대한 필요성이 끊임없이 제기되어 왔다.

종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 어류의 내분비계 장애물질 오염 여부에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌(vitellogenin)의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 어류의 내분비계 장애물질 오염 여부에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌을 제조하는데 있어서, 어류에 가해지는 스트레스를 감소시키고, 어류의 사육과정에서 발생할 수 있는 상처의 괴사 및 병균오염을 방지하여 어류의 폐사를 최소화하며 이를 통하여 어류 체내에서의 비텔로제닌의 효율적 유도(induction)를 이루고, 아울러 혈액내로 증폭된 비텔로제닌을 정제하는 과정에서도 헤파린(heparin)을 사용하지 않고 단백질의 정제과정을 단순화시킨, 비텔로제닌에 대한 효율적 제조방법을 확립하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 마취한 어류에 에스트로겐 화합물 주사액을 주입하고 주사침 주입부의 상처를 치료한 후, 사육하여 비텔로제닌을 유도하는 단계; 상기 비텔로제닌이 유도된 어류로부터 회수된 혈액에 단백질 가수분 해효소 저해제를 첨가한 후, 원심분리를 하여 혈청을 얻고 이를 음이온교환 크로마토그래피 하는 단계를 포함하는 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 제조방법을 제공한다.

상기에서 어류는 잉어, 광어, 송어, 도미, 연어, 우럭, 대구, 농어 등을 사용할 수 있다.

본 발명자들은 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 경제적이고 간편한 제조방법을 검토한 결과, 어류를 마취하여 호르몬 주사를 하고 피부표면에 남는 주사침 주입부의 상처는 외용의 항생제 연고로 도포함에 의하여 어류의 스트레스를 감소시키고 사육 중 조직의 괴사 및 병균오염을 방지하여 비텔로제닌 유도기간 중에 어류의 폐사를 최소화할 수 있고 아울러 어류의 혈액내로 증폭된 비텔로제닌을 정제하는 과정에서도 헤파린 사용 시 얻는 혈장 대신 채혈 후 일정시간 방치하여 얻은 혈청을 사용하면 목표로 하는 바이오마커 단백질을 간편하게 정제할 수 있다는 사실을 발견하고 예의 연구를 거듭한 결과, 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌을 효율적으로 제조할 수 있고 아울러 다양한 어종으로부터의 비텔로제닌 생산에 보편적으로 적용할 수 있는, 호르몬 주사 전 어류마취와 주사침 주입부에 상처를 치료하고, 헤파린을 사용하지 않고 얻은 혈청으로부터의 비텔로제닌 정제를 주요한 특징으로 하는 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이하 본 발명을 제조단계별로 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌을 어류에서 효율적으로 제조하기 위해서 도 1의 구성을 지니고 있는 양어조의 사육수조에서 사전마취 후 호르몬제인 에스트로겐 화합물 주사를 행하고 주사침 주입부의 상처를 치료한 어류를 가하고 사육하면서 주사된 호르몬제에 의한 에스트로겐 수용기의 자극을 통하여 비텔로제닌을 유도할 수 있다. 그 다음으로 비텔로제닌이 증폭된 어류의 혈액을 헤파린으로 처리하지 않고 일정시간 방치한 후 원심분리 하여 혈청을 얻을 수 있으며, 이를 간단한 크로마토그래피 과정을 통해 비텔로제닌을 정제할 수 있다.

(i) 호르몬 주사에 의한 어류로부터의 비텔로제닌 유도공정

본 공정은 어류의 혈액내로 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌을 고농도로 증폭하기 위하여 수행한다.

비텔로제닌을 제조하기 위해서는 암수에 무관하게 어류에 호르몬 주사를 놓아 혈액내로 비텔로제닌의 유도를 이루어야 하는데, 본 발명에서는 이러한 목적을 효율적으로 달성하기 위하여 호르몬 주사과정에서의 스트레스와 이후의 사육과정에서 조직의 괴사를 주지 않는, 어류에서의 비텔로제닌 유도공정을 확립할 수 있으며 그 구체적 방법은 다음과 같다.

염소를 제거하기 위하여 도 1의 수돗물 조에 미리 물을 받아놓고 1 내지 2일간 정치한 수돗물이나 해수를 사육용수로 하여 사육용수 조에 보관한다. 보관된 사육용수는 필요에 따라 사육수조로 이송하고 이송된 사육용수에 충분한 용존산소를 공급하기 위하여 사육수조에 공기펌프를 설치하며 사육용수의 수온은 어류의 생육을 원활하게 하기 위하여 15 내지 20℃ 수준으로 에어컨을 사용하여 조절한다.

건강한 어류 6마리를 사육수조에서 1주일 정도 적응시킨 후 이중 4마리를 호르몬 주사과정에서 어류에 스트레스를 주지 않기 위하여 최종농도 0.005 내지 0.015퍼센트가)가 되도록 마취제를 첨가한 마취용 수조의 사육용수에 집어넣고 2 내지 8분간 마취시킨다.

마취된 어류 각각 2마리를 마취용 수조에서 꺼낸 후 이들에 대하여, 에스트로겐 화합물 60 내지 100밀리그램 혹은 25 내지 75밀리그램을 보조제인 식용유 7 내지 13밀리리터 혹은 유기용매 0.4 내지 1.6밀리리터에 각각 용해하여 얻은, 식용유 기반 주사액 혹은 유기용매 기반 주사액을 어류 중량 100그램당 주사된 호르몬 양이 0.5 내지 1.5밀리그램이 되도록 복강 주사(intraperitoneal injection)한 후, 주사침 주입부의 상처를 외용의 항생제 연고로 도포하여 이 후의 사육과정에서 상처부위의 괴사를 방지하여 준 후 이들을 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 담가 마취를 풀고 기력을 회복하면 사육수조에 집어 넌다.

호르몬 주사를 행한 어류는 시판 양어용 사료를 하루에 1 내지 3회 정도 주면서 5 내지 9일간 사육하여 비텔로제닌의 생성을 유도한다. 이 후 에스트로겐 화합물의 부스팅 주사를 위하여 앞서의 어류를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 마취제가 포함된 사육용수로 마취한 후 상기와 동량의 에스트로겐 화합물을 2차 복강주사하고 주사침 주입부의 상처를 치료한 후, 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 어류를 담가 마취를 푼 후 사육수조로 이송하여 상기의 사료를 하루 에 1 내지 3회 정도 주면서 5 내지 9일간 사육한다. 초기의 어류 6 마리 중 두 마리는 대조구(control)로 하여 호르몬 주사를 행하지 않고 사육수조에 넣어 상기의 사료를 하루에 1 내지 3회 정도 주면서 10 내지 18일간 사육한다.

상기에서 주사침 주입부의 상처 치료는 트리암시놀론 아세토니드, 베클로메타손 디프로피오네이트(beclomethasone dipropionate), 플루티카손(fluticasone), 부데소나이드(budesonide) 또는 플루니솔라이드(flunisolide)와 같은 외용 항생제 연고로 도포하는 것이 바람직하다.

호르몬 주사과정에서 어류에 스트레스와 조직의 괴사를 나타내지 않는, 상기의 비텔로제닌 유도공정을 적용하면 실험개체수가 4 마리인 경우 어류의 폐사는 전혀 발생하지 않으며, 보 다 실험개체수가 훨씬 큰 경우에도 어류의 폐사율이 10퍼센트 이하로 낮을 것으로 예상된 반면, 어류를 마취하지 않은 상태에서 호르몬 주사를 행하여 어류에 스트레스가 가해지고 호르몬 주사에 따른 주사침 주입부의 괴사 방지를 위하여 항생제 연고의 도포를 행하지 않은 경우는 반복된 실험결과 80 내지 90퍼센트에 이르는 대부분의 어류가 폐사하게 된다. 이로부터 상기에 기술된, 호르몬 주사에 의한 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 유도공정이 어류의 혈액내로 비텔로제닌 농도를 증폭하는 효율적인 방법임을 알 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기의 공정을 통한 비텔로제닌의 증폭 정도를 알아보기 위하여 어류의 일례로서 잉어를 선택하여 스트레스와 상처부위 조직의 괴사를 야기하지 않도록 수행된 본 발명의 비텔로제닌 유도공정을 적용해 본 결과, 호르몬 처리한 잉어의 혈액은 단백질 유도의 결과로 점조성이 매우 높아져 유동성이 낮았고, 7퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)을 사용하고 50퍼센트 메탄올 및 10퍼센트 빙초산에 0.1퍼센트 농도로 용해하여 제조한 쿠마씨 브릴리언트 블루 알-250(Coomassie Brilliant Blue R-250) 용액으로 염색하여 얻은 도 2의 에스 디 에스-전기영동사진의 9, 10, 11 및 12에서 볼 수 있는 것처럼 116에서 205 킬로달톤의 분자질량 표준마커 사이에 존재하는 비텔로제닌의 단백질 밴드(band)가 밀리리터 당 수십 밀리그램에 이르는 고농도로 증폭되어 나타난 반면, 도 2의 13과 14의 대조구의 혈액은 유동성이 높았고 비텔로제닌의 단백질 밴드가 거의 나타나지 않아 본 발명의 공정을 통하여 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌이 높은 효율로 유도되어 증폭됨을 확인하였다.

(ii) 비텔로제닌이 증폭된 어류 혈액으로부터 비텔로제닌의 간편 정제공정

상기 공정 (i)에서 제조한, 비텔로제닌이 증폭된 어류 혈액으로부터 비텔로제닌을 회수하여 어류의 내분비계장애물질 오염 여부에 대한 스크리닝에 활용할 수 있도록 어종별로 비텔로제닌에 대한 항체를 제작하고 효소면역분석법 및 면역센서 계측법 등의 정립을 위한 표준품을 제조하기 위해서는 혈액 중에 증폭된 비텔로제닌에 대한 정제과정을 거쳐야 한다.

본 발명에서는 헤파린을 사용하지 않고 채혈하여 일정시간 방치한 후 원심분리 하여 얻은, 불순물이 상대적으로 적은 혈청으로부터 비텔로제닌을 정제하면 정제과정을 간편화할 수 있고 정제효율도 향상시킬 수 있다. 비텔로제닌이 증폭된 어 류 혈액으로부터 비텔로제닌을 간편하게 정제하는 구체적인 방법은 다음과 같다.

에스트로겐 화합물의 부스팅 주사를 행하여 도 1의 사육수조에서 5 내지 9일간 사육한 상기 공정 (i)의 어류를 사육수조에서 꺼내 0.005 내지 0.015퍼센트의 마취제가 포함된 사육용수로 7 내지 13분간 마취한 후 어류의 옆줄을 따라 비스듬히 주사기를 찔러 넣어 대동맥으로부터 혈액을 뽑아 눈금이 부착된 시험관으로 옮기고 혈액 중에 존재하는 단백질 가수분해효소(protease)에 의한 비텔로제닌의 분해를 방지하기 위하여 모아진 혈액부피의 3 내지 7퍼센트에 해당하는 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일 (protease inhibitor cocktail)을 첨가하여 잘 흔들어준다. 이 후 5 내지 25℃에서 20 내지 40분간 방치하여 적혈구가 응고되도록 한 후 분당 2,000 내지 6,000의 회전수(rpm)로 20 내지 40분 동안 원심분리 하여 상등액인 혈청을 얻는다.

상기에서 단백질 가수분해효소 저해제는 메탈로(metallo), 세린(serine), 아스파르틱(aspartic) 및 시스테인(cysteine)계 단백질 가수분해효소와 아미노펩티다제(aminopeptidase)에 대한 광범위 저해제인 소디움 이디티에이(sodium EDTA), 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드(4-[2-aminoethyl]-benzenesulfonyl fluoride), 이-64(E-64), 류펩틴(leupeptin), 아프로티닌(aprotinin) 및 베스타틴(bestatin)을 포함하는 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 비텔로제닌이 증폭된 어류의 혈청을 음이온교환 수지가 충전된 음이온교환 칼럼에 가하고 3 내지 5℃에서 아래와 같이 음이온교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 행하여 비텔로제닌을 정제한다. 먼저 완충용액 A(3 내지 7퍼센트의 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 포함하는 0.03 내지 0.07몰 농도의 트리스-염산 완충용액, pH 8.0)를 30 내지 50밀리리터 흘려준, 10 내지 30밀리리터의 음이온교환 칼럼에 5 내지 15배 희석된 어류 혈청 3 내지 7밀리리터를 분당 1 내지 2밀리리터의 유속으로 흘려준다. 이후 완충용액 A를 20 내지 30밀리리터 더 흘려주어 씻어준 후, 염화나트륨(NaCl) 그래디언트(gradient)를 걸어 완충용액 A와 완충용액 B(0.5 내지 1.5몰 농도의 염화나트륨이 포함된 완충용액 A)를 각각 30 내지 50밀리리터씩 흘려주면서 칼럼 용리액(eluent)의 분획을 받아 비텔로제닌을 정제한다.

본 발명의 실시예에서 본 공정을 통한 비텔로제닌의 정제 정도를 알아보기 위하여 상기의 비텔로제닌 간편 정제공정을 거친 어류의 일례로서 잉어를 선택하여, 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌이 유도된 잉어 혈청을 정제하여 얻은 칼럼 분획 및 500배 희석된 잉어 혈청 자체에 대하여 7퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하고 50퍼센트 메탄올 및 10퍼센트 빙초산에 0.1퍼센트 농도로 용해하여 제조한 쿠마씨 브릴리언트 블루 알-250 용액으로 염색하는 과정을 거치는 에스 디 에스-전기영동을 행하였다. 그 결과, 도 3의 22에서 25까지의 분획 3 내지 6에서 볼 수 있는 것처럼 116에서 205킬로달톤의 분자질량 표준마커 사이에 존재하는 비텔로제닌의 단백질 밴드만이 뚜렷하게 나타나 상기의 정제공정이 효율적이어서 비텔로제닌의 정제가 잘 이루어짐을 알 수 있었다.

이하 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시 예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시 예 1>

어류에서의 비텔로제닌 유도 및 정제를 위하여 도 1의 사육수조에서 마취과정 없이 에스트로겐 화합물 주사를 행한 주요 담수어의 하나인 잉어를 아래와 같이 사육하였다.

염소를 제거하기 위하여 도 1의 수돗물 조에 미리 물을 받아놓고 2일 동안 정치한 수돗물을 사육용수 조에 보관하며, 보관된 사육용수는 필요에 따라 사육수조로 이송하고 사육용수에 충분한 용존산소를 공급하기 위하여 사육수조에 공기펌프를 설치하며 사육용수의 수온은 잉어의 생육에 적합하도록 18℃로 에어컨을 사용하여 조절하였다.

체중 1,000그램의 건강한 잉어 6마리를 사육수조에서 1주일 동안 적응시킨 후 이중 4마리에 대하여 마취하지 않은 상태에서, 에스트로겐 화합물로서 17 베타-에스트라디올(17β- estradiol) 80밀리그램을 보조제인 땅콩유 10밀리리터에 용해하여 얻은, 땅콩유 기반 주사액을 잉어중량 100그램 당 주사된 호르몬 양이 1.0밀리그램이 되도록 복강 주사한 후 사육수조에 집어넣고 시판 양어용 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하여 비텔로제닌의 생성을 유도하였다. 이후 에스트로겐 화 합물의 부스팅 주사를 위하여 앞서의 잉어를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 2차 복강주사하고 사육수조에 담가 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하였다.

초기의 잉어 6마리 중 두 마리는 대조구로 하여 호르몬 주사를 행하지 않고 사육수조에 넣어 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 14일간 사육하였다.

그러나 이 경우, 잉어는 호르몬 주사과정에서 심하게 저항하면서 스트레스를 많이 받아 주사침 주입부의 상처가 커졌으며 사육과정에서도 상처부위의 괴사가 현저하여 14일간의 총사육기간이 종료하였을 때 대조구의 잉어는 건강하였으나 호르몬 처리구의 경우에는 전부 폐사하였으므로 잉어 체내에서의 효율적인 비텔로제닌 유도를 위해서는 호르몬 주사와 사육과정의 개선이 절실한 것으로 나타났다.

<실시 예 2>

호르몬 주사 후 사육과정에서 잉어가 폐사하는 실시 예 1의 문제점을 개선하여 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌을 효율적으로 제조하기 위하여 잉어를 대상으로 한 비텔로제닌의 유도를 다음과 같이 행하였다.

염소를 제거하기 위하여 도 1의 수돗물 조에 미리 물을 받아놓고 2일간 정치한 수돗물을 사육용수 조에 보관하며, 보관된 사육용수는 필요에 따라 사육수조로 이송하고 사육용수에 충분한 용존산소를 공급하기 위하여 사육수조에 공기펌프를 설치하며 사육용수의 수온은 잉어의 생육에 적합하도록 18℃로 에어컨을 사용하여 조절하였다. 체중 1,000그램의 건강한 잉어 6마리를 사육수조에서 1주일 동안 적응 시킨 후, 이 중 4마리를 호르몬 주사과정에서 스트레스를 주지 않도록 최종농도 0.01퍼센트가 되도록 마취제인 에틸 3-아미노벤조산(ethyl 3-aminobenzoate)을 가한 마취용 수조의 사육용수에 집어넣고 5분간 마취시켰다.

마취된 잉어 각각 2마리를 마취용 수조에서 꺼낸 후 이들에 대하여, 17 베타-에스트라디올 80밀리그램을 보조제인 땅콩유 10밀리리터에 용해하여 얻은, 땅콩유 기반 주사액을 잉어 중량 100그램당 주사된 호르몬 양이 1.0밀리그램이 되도록 복강주사한 후 주사침 주입부의 상처를 외용의 항생제 연고인 트리암시놀론 아세토니드(triamcinolone acetonide)로 도포하여 이 후의 사육과정에서 상처부위의 괴사를 방지하여 준 후 이들을 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 담가 마취를 풀고 기력을 회복하면 사육수조에 집어넣었다.

호르몬 주사를 행한 잉어는 시판 양어용 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하여 비텔로제닌의 생성을 유도하였다. 이후 에스트로겐 화합물의 부스팅 주사를 위하여 앞서의 잉어를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 마취제가 포함된 사육용수로 마취한 후 2차 복강주사하고 주사침 주입부의 상처를 상기의 항생제 연고로 도포한 후 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 잉어를 담가 마취를 풀고 사육수조로 이송하여 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하였다. 초기의 잉어 6마리 중 두 마리는 대조구로 하여 호르몬 주사를 행하지 않고 사육수조에 넣어 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 14일간 사육하였다.

비텔로제닌이 증폭된 잉어의 혈액으로부터 비텔로제닌을 회수하기 위한 정제과정을 다음과 같이 행하였다. 즉 에스트로겐 화합물의 부스팅 주사를 행하여 도 1 의 사육수조에서 7일간 사육한 상기의 잉어를 사육수조에서 꺼내 0.01퍼센트의 상기 마취제가 포함된 사육용수로 10분간 마취한 후 잉어의 옆줄을 따라 비스듬히 주사기를 찔러 넣어 대동맥으로부터 혈액을 뽑아 눈금이 부착된 시험관으로 옮기고 혈액 중에 존재하는 단백질 가수분해효소에 의한 비텔로제닌의 분해를 방지하기 위하여 모아진 혈액부피의 5퍼센트에 해당하는 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 첨가하여 잘 흔들어주었다. 이후 20℃에서 30분간 방치하여 적혈구가 응고되도록 한 후 분당 4,000의 회전수로 30분 동안 원심분리를 행하여 상등액인 혈청을 얻었다.

비텔로제닌이 증폭된 잉어의 혈청을 음이온교환 수지로서 디 이 에이 이-셀룰로오스(DEAE-cellulose) 수지의 하나인 디 이- 52(DE-52)로 충전된 음이온교환 칼럼에 가하고 4℃에서 아래와 같이 음이온교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 행하여 비텔로제닌을 정제하였다. 먼저 완충용액 A(5 퍼센트의 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일(Protease Inhibitor Cocktail for General Use, 시그마사, MO, USA)을 포함하는 0.05 몰 농도의 트리스-염산 완충용액, pH 8.0)를 40밀리리터 흘려준, 20밀리리터의 디 이-52 칼럼에 10배 희석된 잉어 혈청 5 밀리리터를 분당 1.5밀리리터의 유속으로 흘려주었다. 이 후 완충용액 A를 25밀리리터 더 흘려주어 씻어준 후, 염화나트륨 그래디언트를 걸어 완충용액 A와 완충용액 B(1.0 몰 농도의 염화나트륨이 포함된 완충용액 A)를 각각 40밀리리터씩 흘려주면서 칼럼 용리액의 분획을 받아 비텔로제닌을 정제하였다.

호르몬 주사과정 및 이 후의 사육과정에서 잉어에 스트레스와 조직의 괴사를 주지 않도록 수행된 본 실시 예의 비텔로제닌 유도공정을 적용하였을 때 잉어의 폐사는 전혀 발생하지 않았으며 7퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 에스 디 에스-전기영동 결과 호르몬 처리구의 혈액에서 비텔로제닌의 단백질 밴드가 대조구에 비해 현저하게 높은 강도로 나타나 비텔로제닌의 유도가 잘 이루어졌음을 확인하였다. 아울러 본 실시 예에 따라 제조된, 비텔로제닌이 증폭된 잉어 혈청을 정제하여 얻은 칼럼 분획에 대하여 7퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 에스 디 에스-전기영동을 행하면 각각의 정제분획에서 비텔로제닌의 단백질 밴드가 뚜렷하게 나타나 비텔로제닌의 정제가 효율적으로 이루어졌음을 알 수 있었다.

<실시 예 3>

에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 효율적 제조를 주요해수어의 하나인 광어(flatfish)를 대상으로 아래와 같이 행하였다. 즉 도 1의 사육용수 조에 바닷물을 가하여 보관하며, 보관된 사육용수는 필요에 따라 사육수조로 이송하고 사육용수에 충분한 용존산소를 공급하기 위하여 사육수조에 공기펌프를 설치하며 사육용수의 수온은 광어의 생육에 적합하도록 18℃로 에어컨을 사용하여 조절하였다. 체중 1,000그램의 건강한 광어 6마리를 사육수조에서 1주일 정도 적응시킨 후 이 중 4마리를 호르몬 주사과정에서 스트레스를 주지 않기 위하여 최종농도 0.01퍼센트가 되도록 마취제인 에틸 3-아미노벤조산을 가한 마취용 수조의 사육용수에 집어넣고 5분간 마취시켰다.

마취된 광어 각각 2마리를 마취용 수조에서 꺼낸 후 이들에 대하여, 17 베타 -에스트라디올 80밀리그램을 보조제인 땅콩유 10밀리리터에 용해하여 얻은, 땅콩유 기반 주사액을 광어 중량 100그램당 주사된 호르몬 양이 1.0밀리그램이 되도록 복강주사한 후 주사침 주입부의 상처를 외용의 항생제 연고인 트리암시놀론 아세토니드로 도포하여 이 후의 사육과정에서 상처부위의 괴사를 방지하여 준 후 이들을 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 담가 마취를 풀고 기력을 회복하면 사육수조에 집어넣었다.

호르몬 주사를 행한 광어는 시판 양어용 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하여 비텔로제닌의 생성을 유도하였다. 이후 에스트로겐 화합물의 부스팅 주사를 위하여 앞서의 광어를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 마취제가 포함된 사육용수로 마취한 후 2차 복강주사하고 주사침 주입부의 상처를 상기의 항생제 연고로 도포하고 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 광어를 담가 마취를 푼 후 사육수조로 이송하여 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하였다. 초기의 광어 6마리 중 두 마리는 대조구로 하여 호르몬 주사를 행하지 않고 사육수조에 넣어 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 14일간 사육하였다.

비텔로제닌이 증폭된 광어의 혈액으로부터 비텔로제닌을 회수하기 위한 정제과정을 다음과 같이 행하였다. 즉 에스트로겐 화합물의 부스팅 주사를 행하여 도 1의 사육수조에서 7일간 사육한 광어를 사육수조에서 꺼내 0.01퍼센트의 상기 마취제가 포함된 사육용수로 10분간 마취한 후 광어의 옆줄을 따라 비스듬히 주사기를 찔러 넣어 대동맥으로부터 혈액을 뽑아 눈금이 부착된 시험관으로 옮기고 혈액 중에 존재하는 단백질 가수분해효소에 의한 비텔로제닌의 분해를 방지하기 위하여 모 아진 혈액 부피의 5퍼센트에 해당하는 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 첨가하여 잘 흔들어주었다. 이후 20℃에서 30분간 방치하여 적혈구가 응고되도록 한 후 분당 4,000의 회전수로 30분 동안 원심분리를 행하여 상등액인 혈청을 얻었다.

비텔로제닌이 유도된 광어의 혈청을 디 이-52 수지로 충전된 음이온교환 칼럼에 가하고 4℃에서 아래와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 비텔로제닌을 정제하였다. 먼저 완충용액 A(5퍼센트의 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 포함하는 0.05 몰 농도의 트리스-염산 완충용액, pH 8.0)를 40밀리리터 흘려준, 20 밀리리터의 디 이-52 칼럼에 10배 희석된 광어 혈청 5밀리리터를 분당 1.5밀리리터의 유속으로 흘려주었다. 이후 완충용액 A를 25밀리리터 더 흘려주어 씻어준 후, 염화나트륨 그래디언트를 걸어 완충용액 A와 완충용액 B(0.5 몰 농도의 염화나트륨이 포함된 완충용액 A)를 각각 40밀리리터씩 흘려주면서 칼럼 용리액의 분획을 받아 비텔로제닌을 정제하였다.

호르몬 주사 및 이후의 사육과정에서 광어에 스트레스와 조직의 괴사를 주지 않도록 수행된 본 실시예의 비텔로제닌 유도공정을 적용하였을 때 광어의 폐사는 전혀 발생하지 않았다. 이때 비텔로제닌 유도공정을 거친 광어의 혈액내로 비텔로제닌의 증폭은 실시 예 2의 잉어의 경우와 마찬가지로 현저히 높게 나타나 비텔로제닌의 유도가 잘 이루어졌음을 확인하였다. 아울러 비텔로제닌이 증폭된 광어 혈청을 정제하여 얻은 칼럼 분획을 7퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 에스 디 에스-전기영동으로 분석하면 각각의 정제분획에서 비텔로제닌의 단백질 밴드를 뚜렷하게 관찰할 수 있어 비텔로제닌의 정제가 효율적으로 이루어졌음을 알 수 있었 다.

<실시 예 4>

잉어로부터 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 효율적 제조를 에스트로겐 화합물로서 17 알파-에티닐 에스트라디올(17α-ethynylestradiol)을 사용하고 기타의 방법은 실시 예 2에 따라 아래와 같이 행하였다. 즉 염소를 제거하기 위하여 도 1의 수돗물 조에 미리 물을 받아놓고 2일간 정치한 수돗물을 사육용수 조에 보관하며, 보관된 사육용수는 필요에 따라 사육수조로 이송하고 사육용수에 충분한 용존산소를 공급하기 위하여 사육수조에 공기펌프를 설치하며 사육용수의 수온은 잉어의 생육에 적합하도록 18℃로 에어컨을 사용하여 조절하였다.

체중 1,000그램의 건강한 잉어 6마리를 사육수조에서 1주일 정도 적응시킨 후 이 중 4마리를 호르몬 주사과정에서 스트레스를 주지 않도록 최종농도 0.01퍼센트가 되도록 마취제인 에틸 3-아미노벤조산을 가한 마취용 수조의 사육용수에 집어넣고 5분간 마취시켰다. 마취된 잉어 각각 2마리를 마취용 수조에서 꺼낸 후 이들에 대하여, 17 알파-에티닐 에스트라디올 80밀리그램을 보조제인 땅콩유 10밀리리터에 용해하여 얻은, 땅콩유 기반 주사액을 잉어 중량 100그램당 주사된 호르몬 양이 1.0밀리그램이 되도록 복강주사한 후 주사침 주입부의 상처를 외용의 항생제 연고인 트리암시놀론 아세토니드로 도포하여 이 후의 사육과정에서 상처부위의 괴사를 방지하여 준 후 이들을 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 담가 마취를 풀고 기력을 회복하면 사육수조에 집어넣었다.

호르몬 주사를 행한 잉어는 시판 양어용 사료를 하루에 2회 정도 주면서 7일간 사육하여 비텔로제닌의 생성을 유도하였다. 이 후 에스트로겐 화합물의 부스팅 주사를 위하여 앞서의 잉어를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 마취제가 포함된 사육용수로 마취한 후 2차 복강주사하고 주사침 주입부의 상처를 상기의 항생제 연고로 도포한 후 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 잉어를 담가 마취를 풀고 사육수조로 이송하여 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하였다. 초기의 잉어 6마리 중 두 마리는 대조구로 하여 호르몬 주사를 행하지 않고 사육수조에 넣어 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 14일간 사육하였다.

비텔로제닌이 증폭된 잉어의 혈액으로부터 비텔로제닌을 회수하기 위한 정제과정을 다음과 같이 행하였다. 즉 에스트로겐 화합물의 부스팅 주사를 행하여 도 1의 사육수조에서 7일간 사육한 상기의 잉어를 사육수조에서 꺼내 0.01퍼센트의 상기 마취제가 포함된 사육용수로 10분간 마취한 후 잉어의 옆줄을 따라 비스듬히 주사기를 찔러 넣어 대동맥으로부터 혈액을 뽑아 눈금이 부착된 시험관으로 옮기고 혈액 중에 존재하는 단백질 가수분해효소에 의한 비텔로제닌의 분해를 방지하기 위하여 모아진 혈액부피의 5 퍼센트에 해당하는 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 첨가하여 잘 흔들어주었다. 이후 20℃에서 30분간 방치하여 적혈구가 응고되도록 한 후 분당 4,000의 회전수로 30분 동안 원심분리를 행하여 상등액인 혈청을 얻었다. 비텔로제닌이 증폭된 잉어의 혈청을 디 이-52 수지로 충전된 음이온교환 칼럼에 가하고 4℃에서 아래와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 비텔로제닌 을 정제하였다.

먼저 완충용액 A(5 퍼센트의 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 포함하는 0.05 몰 농도의 트리스-염산 완충용액, pH 8.0)를 40밀리리터 흘려준, 20밀리리터의 디 이-52 칼럼에 10배 희석된 잉어 혈청 5밀리리터를 분당 1.5밀리리터의 유속으로 흘려주었다. 이후 완충용액 A를 25밀리리터 더 흘려주어 씻어준 후, 염화나트륨 그래디언트를 걸어 완충용액 A와 완충용액 B(1.0 몰 농도의 염화나트륨이 포함된 완충용액 A)를 각각 40밀리리터씩 흘려주면서 칼럼 용리액의 분획을 받아 비텔로제닌을 정제하였다.

호르몬 주사 및 이후의 사육과정에서 잉어에 스트레스와 조직의 괴사를 주지 않도록 수행된 본 실시 예의 비텔로제닌 유도공정을 적용하였을 때 잉어의 폐사는 전혀 발생하지 않았다. 이때 비텔로제닌 유도공정을 거친 잉어의 혈액내로 비텔로제닌이 현저히 높게 증폭되어 비텔로제닌의 유도가 잘 이루어졌음을 확인하였다. 아울러 비텔로제닌이 증폭된 잉어 혈청을 정제하여 얻은 칼럼 분획을 7퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 에스 디 에스-전기영동으로 분석하면 각각의 정제분획에서 비텔로제닌의 단백질 밴드를 뚜렷하게 관찰할 수 있어 비텔로제닌의 정제가 효율적으로 이루어졌음을 알 수 있었다.

<실시 예 5>

광어로부터 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 효율적 제조를 에스트로겐 화합물로서 17 알파-에티닐 에스트라디올을 사용하고 기타의 방법은 실시 예 3에 따라 아래와 같이 행하였다.

도 1의 사육용수 조에 바닷물을 가하여 보관하며, 보관된 사육용수는 필요에 따라 사육수조로 이송하고 사육용수에 충분한 용존산소를 공급하기 위하여 사육수조에 공기펌프를 설치하며 사육용수의 수온은 광어의 생육에 적합하도록 18℃로 에어컨을 사용하여 조절하였다. 체중 1,000그램의 건강한 광어 6마리를 사육수조에서 1주일 동안 적응시킨 후, 이중 4 마리를 호르몬 주사과정에서 스트레스를 주지 않기 위하여 마취제인 에틸 3-아미노벤조산을 최종농도 0.01퍼센트가 되도록 첨가한 마취용 수조의 사육용수에 집어넣고 5분간 마취시켰다.

마취된 광어 각각 2마리를 마취용 수조에서 꺼낸 후 이들에 대하여, 17 알파-에티닐 에스트라디올 80밀리그램을 보조제인 땅콩유 10밀리리터에 용해하여 얻은, 땅콩유 기반 주사액을 광어 중량 100그램당 주사된 호르몬 양이 1.0밀리그램이 되도록 복강주사 하였다. 주사침 주입부의 상처를 외용의 항생제 연고인 트리암시놀론 아세토니드로 도포하여, 이후의 사육과정에서 상처부위의 괴사를 방지하여 준 후 이들을 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 담가 마취를 풀고 기력을 회복하면 사육수조에 집어넣었다.

호르몬 주사를 행한 광어는 시판 양어용 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하여 비텔로제닌의 생성을 유도하였다. 이후 에스트로겐 화합물의 부스팅 주사를 위하여 앞서의 광어를 사육수조에서 꺼내 상기와 동일한 과정에 따라 마취제가 포함된 사육용수로 마취한 후 2차 복강주사하고 주사침 주입부의 상처를 상기의 항생제 연고로 도포하고 마취제가 포함되지 않은 사육용수에 광어를 담가 마취를 풀고 사육수조로 이송하여 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 7일간 사육하였다. 초기의 광어 6마리 중 두 마리는 대조구로 하여 호르몬 주사를 행하지 않고 사육수조에 넣어 상기의 사료를 하루에 2회 주면서 14일간 사육하였다.

비텔로제닌이 증폭된 광어의 혈액으로부터 비텔로제닌을 회수하기 위한 정제과정을 다음과 같이 행하였다. 즉 에스트로겐 화합물의 부스팅 주사를 행하여 도 1의 사육수조에서 7일간 사육한 광어를 사육수조에서 꺼내 0.01퍼센트의 상기 마취제가 포함된 사육용수로 10분간 마취한 후 광어의 옆줄을 따라 비스듬히 주사기를 찔러 넣어 대동맥으로부터 혈액을 뽑아 눈금이 부착된 시험관으로 옮기고 혈액 중에 존재하는 단백질 가수분해효소에 의한 비텔로제닌의 분해를 방지하기 위하여 모아진 혈액부피의 5퍼센트에 해당하는 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 첨가하여 잘 흔들어주었다. 이후 20℃에서 30분간 방치하여 적혈구가 응고되도록 한 후 분당 4,000의 회전수로 30분 동안 원심분리를 행하여 상징액인 혈청을 얻었다.

비텔로제닌이 증폭된 광어의 혈청을 디 이-52 수지로 충전된 음이온교환 칼럼에 가하고, 4℃에서 아래와 같이 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 비텔로제닌을 정제하였다. 먼저 완충용액 A(5퍼센트의 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일을 포함하는 0.05 몰 농도의 트리스-염산 완충용액, pH 8.0)를 40밀리리터 흘려준, 20밀리리터의 디 이-52 칼럼에 10배 희석된 광어 혈청 5밀리리터를 분당 1.5밀리리터의 유속으로 흘려주었다. 이 후 완충용액 A를 25밀리리터 더 흘려주어 씻어준 후, 염화나트륨 그래디언트를 걸어 완충용액 A와 완충용액 B(0.5 몰 농도의 염화나트륨이 포함된 완충용액 A)를 각각 40밀리리터씩 흘려주면서 칼럼 용리액의 분획을 받아 비텔로제닌을 정제하였다.

호르몬 주사 및 이 후의 사육과정에서 광어에 스트레스와 조직의 괴사를 주지 않도록 수행된 본 실시 예의 비텔로제닌 유도공정을 적용하였을 때 광어의 폐사는 전혀 발생하지 않았다. 이 때 비텔로제닌 유도공정을 거친 광어의 혈액내로 비텔로제닌이 현저히 높게 증폭되어 비텔로제닌의 유도가 잘 이루어졌음을 확인하였다. 아울러 비텔로제닌이 증폭된 광어 혈청을 정제하여 얻은 칼럼 분획을 7퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 에스 디 에스-전기영동으로 분석하면 각각의 정제분획에서 비텔로제닌의 단백질 밴드를 뚜렷하게 관찰할 수 있어 비텔로제닌의 정제가 효율적으로 이루어졌음을 알 수 있었다.

상술한 바에 따르면 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 상세히 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 예에 의하여 한정되지 않고 하기의 특허청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변경실시가 가능할 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명에 의한 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 효율적 제조방법은 어류의 체내에서 비텔로제닌을 발현하기 위하여 에스트로겐 화합물을 주사하고 사육하는 과정에서 스트레스와 상처를 주어 보편적으로 발생하는 폐사현상이 나타나지 않도록 비텔로제닌의 유도과정을 최적화할 수 있다.

또한, 어류의 혈액내로 증폭된 비텔로제닌을 혈청으로부터 회수하고 효율적으로 정제하여 비텔로제닌 표준품으로서 뿐만 아니라 어종별 비텔로제닌 항체제작에도 사용할 수 있도록 하여 파급효과가 높은, 내분비계 장애물질 바이오마커 검색기술과 관련된 기반기술을 확립한데 그 기술적 특징이 있다.

Claims (7)

1. 마취한 어류에 에스트로겐 화합물 주사액을 주입하고 주사침 주입부의 상처를 치료한 후, 사육하여 비텔로제닌을 유도하는 단계;

   상기 비텔로제닌이 유도된 어류로부터 회수된 혈액에 단백질 가수분해효소 저해제를 첨가한 후, 원심분리를 하여 혈청을 얻고 이를 음이온교환 크로마토그래피 하는 단계를 포함하는 에스트로겐 활성에 대한 바이오마커 단백질인 비텔로제닌의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 마취제는 에틸 3-아미노벤조산인 것을 특징으로 하는 비텔로제닌의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 에스트로겐 화합물은 17 베타-에스트라디올 또는 17 알파-에티닐 에스트라디올을 사용하는 것을 특징으로 하는 비텔로제닌의 제조방법.
4. 제1항에 있어서,

   에스트로겐 화합물 주사액은 용매로 식용유 또는 메탄올/클로로포름(1:1, 부피비율)을 사용하는 것을 특징으로 하는 비텔로제닌의 제조방법.
5. 제1항에 있어서,

   주사침 주입부의 상처 치료는 트리암시놀론 아세토니드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 플루티카손, 부데소나이드, 플루니솔라이드 중에서 선택된 어느 하나 이상의 외용 항생제 연고로 도포하는 것을 특징으로 하는 비텔로제닌의 제조방법.
6. 제1항에 있어서,

   단백질 가수분해효소 저해제는 메탈로(metallo), 세린(serine), 아스파르틱(aspartic) 및 시스테인(cysteine)계 단백질 가수분해효소와 아미노펩티다제(aminopeptidase)에 대한 광범위 저해제인 소디움 이디티에이(sodium EDTA), 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드(4-[2-aminoethyl]-benzenesulfonyl fluoride), 이-64(E-64), 류펩틴(leupeptin), 아프로티닌(aprotinin) 및 베스타틴(bestatin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 비텔로제닌의 제조방법.
7. 제1항에 있어서,

   음이온교환 크로마토그래피는 음이온교환 수지로 디 이 에이 이-셀룰로오스 수지의 하나인 디 이-52 등을 사용하고 염화나트륨 그래디언트를 걸어주는 완충용액으로는 3 내지 7부피퍼센트의 단백질 가수분해효소 저해제를 포함하는 0.03 내지 0.07 몰 농도의 트리스-염산 완충용액(pH 8.0)을 사용하는 것을 특징으로 하는 비텔로제닌의 제조방법.

Images