KR20110061611A

KR20110061611A - 백신 보조제 조합

Info

Publication number: KR20110061611A
Application number: KR1020117007880A
Authority: KR
Inventors: 미셀 팔라오로; 데렉 오하겐; 리노 랍푸올리
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2008-09-18
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2011-06-09
Also published as: EP2331127A2; US20110236489A1; AU2009294318A1; WO2010032138A3; NZ591768A; JP2012502972A; CN102159242A; CA2737455A1; AU2009294318B2; WO2010032138A2

Abstract

면역 보조제는 수중유 에멀젼, 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머를 포함하며, 올리고뉴클레오티드 및 폴리머는 서로 이상적으로 결합되어 복합체를 형성한다. 보조제는 백신을 제조하기 위해 면역원과 조합될 수 있다.

Description

백신 보조제 조합{VACCINE ADJUVANT COMBINATIONS}

이 출원은 2008년 9월 18일 출원된 미국 가특허 출원 61/192,577에 의거하여 우선권을 주장하며, 이것의 완전한 내용은 본원에 참고로써 포함된다.

이 발명은 백신 보조제 및 그것의 조합의 분야에 관한 것이다.

수중유 에멀젼은 백신 보조제로서 사용에 대해 공지되어 있고, FLUAD™ 생성물은 수중 스쿠알렌 'MF59' 보조제를 포함한다. 본 발명의 목적은 변형되고 개선된 에멀젼 보조제를 제공하는 것이다.

본 발명은 수중유 에멀젼, 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머를 포함하는 면역 보조제를 제공한다. 올리고뉴클레오티드 및 폴리머는 서로 이상적으로 결합되어 복합체를 형성한다.

본 발명은 또한 수중유 에멀젼과 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머의 복합체를 혼합하는 단계를 포함하는 본 발명의 면역 보조제의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (i) 본 발명의 보조제와 (ii) 면역원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 (i) 본 발명의 보조제와 (ii) 이뮤노겐을 혼합하는 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조방법을 제공한다.

면역원, 에멀젼, 올리고뉴클레오티드 및 폴리머는 임의의 순서로 혼합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 (i) 수중유 에멀젼과 (ii) 면역원을 혼합하는 단계; 및 그 다음에 에멀젼/면역원 혼합물과 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머를 혼합하는 단계를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (i) 전형적으로 복합체의 형태로 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머와 (ii) 면역원을 혼합하는 단계; 및 그 다음에 올리고뉴클레오티드/폴리머/면역원 혼합물과 수중유 에멀젼을 혼합하는 단계를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (i) 본 발명의 보조제를 함유하는 제 1 용기; 및 (ii) 면역원 및/또는 추가 보조제를 함유하는 제 2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 (i) 수중유 에멀젼을 함유하는 제 1 용기; 및 (ii) 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머를 함유하는 제 2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 제 1 및 제 2 용기 중 하나 또는 둘 다는 면역원을 포함할 수 있다. 따라서 두 용기의 내용물이 합쳐져서(예를 들어, 사용시점에) 본 발명의 보조제 또는 면역원성 조성물을 형성할 수 있다. 이들 키트는 면역원 및/또는 추가 보조제를 함유하는 제 3 용기를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 흡착성 미립자 보조제의 입자들의 평균직경 및 에멀젼 내 유적의 평균직경이 둘 다 250nm 미만(예를 들어, ≤220nm, ≤200nm, ≤190nm, ≤180nm, ≤150nm, ≤120nm, ≤100nm 등)인, 수중유 에멀젼 및 흡착성 미립자 보조제를 포함하는 면역 보조제를 제공한다. 미립자 보조제가 직경의 범위로 입자들을 가진다면, 이들 직경은 유적 입자 크기와 중첩되지 않을 수도 있다(즉, 가장 큰 유적은 가장 작은 보조제 입자보다 더 작고, 가장 큰 보조제 입자는 가장 작은 유적보다 더 작다). 그러나 다른 구체예에서, 크기분포는 중첩될 수 있다. 일부 구체예에서, 보조제 입자의 평균 직경은 유적의 평균직경으로서 실질적으로 동일할 수 있고, 또는 이들 두 직경은, 예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 등으로써 다를 수 있다.

본 발명은 흡착성 미립자 보조제의 입자들의 평균 직경이 에멀젼 내 유적의 평균 직경보다 큰 수중유 에멀젼 및 흡착성 미립자 보조제를 포함하는 면역 보조제를 제공한다. 흡착성 미립자 보조제는 이상적으로는 (i) 불용성 알루미늄 또는 칼슘 염 또는 (ii) 폴리머 마이크로입자를 포함하지 않지만, 오히려 바람직하게는 (iii) 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머의 복합체이다. 수중유 에멀젼과 이러한 복합체를 혼합하는 단계는 본원에서 복합체들의 분석된 평균 직경을 감소시키는 것으로 나타난다.

본 발명은 또한 (i) 수중유 에멀젼을 포함하는 면역 보조제 및 흡수성 미립자 보조제를 포함하는 면역 보조제; 및 (ii) 면역원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 상기 설명한 바와 같이, 흡착성 미립자 보조제는 이상적으로 불용성 알루미늄 또는 칼슘염을 포함하지 않지만 바람직하게는 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머의 복합체이다. 전형적으로, 면역원은 흡착성 미립자 보조제에 적어도 부분적으로 흡수된다.

본 발명은 또한 면역촉진성 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 CpI 모티프(이노신에 결합되는 사이토신을 함유하는 디뉴클레오티드 서열)를 포함하는 수중유 에멀젼 및 면역촉진성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 면역 보조제를 제공한다. 올리고데옥시뉴클레오티드는 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상) CpI 모티프를 포함할 수 있고, 이것들은 직접적으로 반복될 수 있고(예를 들어, 서열 (CI)_x를 포함, x는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상임) 또는 서로로부터 분리될 수 있다(예를 들어, 서열 (CIN)_x를 포함, x는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상이고, 각각의 N은 독립적으로 하나 이상의 뉴클레오티드를 나타낸다). 올리고뉴클레오티드 내 사이토신 잔기는 이상적으로 비메틸화된다. 본 발명은 또한 수중유 에멀젼과 CpI-함유 면역촉진성 올리고뉴클레오티드의 혼합 단계를 포함하는 이런 면역 보조제의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 (i) 이 보조제 및 (ii) 면역원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 (i) 이 보조제 및 (ii) 면역원을 혼합하는 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 또한 (i) 수중유 에멀젼 및 (ii) 면역원을 혼합하는 단계; 및 그 다음에 에멀젼/면역원 혼합물을 CpI-함유 면역촉진성 올리고뉴클레오티드와 혼합하는 단계를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (i) CpI-함유 면역촉진성 올리고뉴클레오티드와 (ii) 면역원을 혼합하는 단계; 및 그 다음에 올리고뉴클레오티드/면역원 혼합물을 수중유 에멀젼과 혼합하는 단계를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물의 제조방법을 제공한다.

수중유 에멀젼

본 발명과 함께 사용되는 수중유 에멀젼은 전형적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 생분해가능하고(대사가능하고) 생체에 적합한 오일(들) 및 계면활성제(들)와 함께 포함한다.

에멀젼 내 유적은 일반적으로 5μm 미만의 직경이며, 이상적으로 마이크로플루이다이저로 달성되는 작은 크기로, 서브-미크론 직경을 가져서 안정한 에멀젼을 제공한다. 220nm 미만의 크기를 갖는 점적은 여과멸균될 수 있기 때문에 바람직하다. 일부 유용한 에멀젼에서 적어도 80%(수로써)의 유적은 500nm 미만의 직경을 가진다.

에멀젼은 오일, 예컨대 동물(예컨대, 어류) 또는 식물성 공급원으로부터의 오일을 포함할 수 있다. 식물성 오일에 대한 공급원은 견과류, 종자 및 곡물을 포함한다. 땅콩 오일, 대두 오일, 코코넛 오일, 및 올리브 오일, 및 가장 흔히 이용가능하게는, 견과류 오일을 예시한다. 호호바 오일은 예를 들어, 호호바 빈(bean)으로부터 얻어 사용될 수 있다. 종자 오일은 홍화 오일, 면실 오일, 해바라기씨 오일, 참깨씨 오일 등을 포함한다. 곡물군에서, 옥수수 오일은 가장 용이하게 이용가능하지만, 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프, 라이밀 등과 같은 다른 곡물의 오일이 또한 사용될 수 있다. 한편 종자오일에서 자연적으로 발생하지 않는 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 6-10 탄소 지방산 에스테르는 견과류 및 종자 오일로부터 출발하는 적절한 재료의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수 있다. 포유동물의 젖으로부터 지방 및 오일은 대사가능하고 따라서 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 동물 공급원으로부터 순수한 오일을 획득하는데 필요한 분리, 정제, 비누화 및 기타 수단을 위한 절차는 당업계에 잘 공지되어 있다. 대부분의 어류는 용이하게 회수될 수 있는 대사가능한 오일을 함유한다. 예를 들어, 대구간유, 상어간유 및 경랍과 같은 고래기름은 본원에서 사용될 수 있는 몇몇 어류 오일을 예시한다. 다수의 분지쇄 오일은 5-탄소 이소프렌 단위로 생화학적으로 합성되고 일반적으로 테르페노이드로서 언급된다. 상어간유는 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥산으로서 알려진 분지, 불포화된 테르페노이드를 함유한다. 스쿠알란, 스쿠알렌에 대한 포화 유사체가 또한 사용될 수 있다. 스쿠알렌 및 스쿠알란은 상업적 공급원으로부터 용이하게 이용가능하고 또는 당업계에 공지된 방법에 의해 획득될 수 있다. 스쿠알렌이 바람직하다.

다른 유용한 오일은 유리하게는 노인 피험자에게 사용을 위한 백신에 포함되는 토코페롤인데, 이는 비타민 E가 이 피험자 군의 면역반응에 긍정적인 효과를 가지는 것으로 보고되었기 때문이다. 그것들은 또한 에멀젼을 안정화시킬 수 있는 항산화 특성을 가진다. 다양한 토코페롤이 존재하지만(α, β, γ, δ, ε 또는 ξ), 보통 α가 사용된다. 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이다. α-토코페롤 숙시네이트는 인플루엔자 백신과 호환되고, 또 다른 수은함유 화합물로서 유용한 보존제인 것으로 알려져 있다.

오일의 혼합물은, 예를 들어, 스쿠알렌 및 α-토코페롤이 사용될 수 있다.

2-20% (부피)의 범위에서의 오일 함량이 전형적이다.

계면활성제는 그것의 'HLB'(친수성/친유성 밸런스)에 의해 분류될 수 있다. 본 발명에 유용한 일부 계면활성제는 적어도 10, 예를 들어, 적어도 15 또는 적어도 16의 HLB를 가진다. 본 발명은, 제한되는 것은 아니지만, 다음을 포함하는 계면활성제와 함께 사용될 수 있다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(통상적으로 Tweens으로서 언급됨), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; DOWFAX™ 상표명 하에서 판매되는 에틸렌 옥사이드(EO)의 공중합체, 프로필렌 옥사이드(PO), 및/또는 부틸렌 옥사이드(BO), 예컨대, EO/PO 블록 공중합체; 특정 관심의 옥톡시놀-9 (Triton X-1OO, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)와 함께 반복적인 에톡시(옥시-1,2-에탄디일) 기의 수를 달리할 수 있는 옥톡시놀; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린(레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 예컨대, Tergitol™ NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알코올로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방 에스테르(Brij 계면활성제로서 알려짐), 예컨대, 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); 및 소르비탄 에스테르(통상적으로 SPAN으로서 알려짐), 예컨대, 소르비탄 트리올레에이트(Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트. 비-이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀젼에 포함을 위한 가장 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트; Tween 80)이다.

계면활성제의 혼합물은 예를 들어, Tween 80/Span 85 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및 옥톡시놀의 조합이 또한 적당하다. 다른 유용한 조합은 라우레스 9 + 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.

계면활성제의 유용한 양(중량%)은: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예컨대 Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1%; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예컨대, Triton X-100, 또는 기타 Triton 시리즈의 세제), 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르(예컨대, 라우레스 9) 0.1 내지 20%, 예를 들어, 0.1 내지 10% 및 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%이다.

스쿠알렌-함유 에멀젼은, 특히 폴리소르베이트 80을 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명에 유용한 특이적 수중유 에멀젼 보조제는, 제한되는 것은 아니지만,

● 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80, 및 소르비탄 트리올레이트의 서브미크론 에멀젼. 부피로써 에멀젼의 조성은 약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% Span 85일 수 있다. 중량 용어에서, 이들 비율은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% Span 85가 된다. 이 보조제는 참고문헌 4의 Chapter 10 및 참고문헌 5의 chapter 12에서 더욱 상세하기 설명되는 바와 같은 'MF59' [1-3]로서 알려져 있다. MF59 에멀젼은 유리하게는, 시트르산염 이온, 예를 들어, 1OmM 시트르산나트륨 버퍼를 포함한다.

● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 폴리소르베이트 80의 서브미크론 에멀젼. 이들 에멀젼은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% 폴리소르베이트 80을 가질 수 있고, 이것이 더욱 안정한 에멀젼을 제공할 수 있기 때문에 스쿠알렌:토코페롤의 중량비는 바람직하게는 ≤1 (예를 들어, 0.90)이다. 스쿠알렌 및 폴리소르베이트 80은 약 5:2의 부피비 또는 약 11:5의 중량비로 존재할 수 있다. 하나의 이러한 에멀젼은 PBS 중에 Tween 80을 용해시키는 것에 의해 2% 용액을 제공하는 단계, 그 다음에 90ml의 이 용액을 (5g의 DL-α-토코페롤 및 5ml 스쿠알렌)의 혼합물과 혼합하는 단계, 그 다음에 혼합물을 마이크로플루이다이징하는 단계에 의해 만들어질 수 있다. 결과 에멀젼은 예를 들어, 100 내지 250nm, 바람직하게는 약 180nm의 평균 직경을 가지는 서브미크론 유적을 가진다. 에멀젼은 또한 3-탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3d-MPL)를 포함할 수 있다. 이런 종류의 다른 유용한 에멀젼은, 인간 용량 당, 0.5-10 mg 스쿠알렌, 0.5-11 mg 토코페롤, 및 0.1-4 mg 폴리소르베이트 80 [6]을 포함할 수 있다.

● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 Triton 세제(예를 들어, Triton X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 에멀젼은 인산염 버퍼를 함유할 수 있다.

● 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 80), Triton 세제(예를 들어, Triton X-100) 및 토코페롤(예를 들어, α-토코페롤 숙시네이트)를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 약 75:11:10 (예를 들어, 750μg/ml 폴리소르베이트 80, 110μg/ml Triton X-100 및 lOOμg/ml α-토코페롤 숙시네이트)의 질량비로 이들 3가지 성분을 포함할 수 있고, 이들 농도는 항원으로부터 이들 성분의 어떤 분포를 포함하여야 한다. 에멀젼은 또한 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다. 수층은 인산염 버퍼를 함유할 수 있다.

● 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401("Pluronic™ L121")의 에멀젼. 에멀젼은 인산완충식염수, pH 7.4에서 제형으로 될 수 있다. 이 에멀젼은 무라밀 디펩티드에 대해 유용한 전달 비히클이며, "SAF-1" 보조제 [7] (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80)에서 트레오닐-MDP와 함께 사용되었다. 또한 "AF" 보조제 [8] (5% 스쿠알렌, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80)에서와 같이 Thr-MDP 없이 사용될 수 있다. 마이크로유동화가 바람직하다.

● 스쿠알렌, 수용성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리옥시에틸렌(12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르, 예컨대, 소르비탄 모노올레이트 또는 'Span 80')를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 바람직하게는 열가역적이고 및/또는 200 nm 미만의 크기를 가지는 유적(부피)의 적어도 90%를 가진다 [9]. 에멀젼은 또한 하나 이상의 알디톨; 동결 억제제(예를 들어, 당, 예컨대 도데실말토사이드 및/또는 수크로오스); 및/또는 알킬폴리글리코시드를 포함할 수 있다. 에멀젼은 TLR4 작용제를 포함할 수 있다[10]. 이러한 에멀젼은 동결건조될 수 있다.

● 스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀젼 [11]. 보조 백신에서 이들 성분의 최종 농도(중량)는 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머 105(플루로닉 폴리올) 및 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴/카프릭 트리글리세라이드)이다.

● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질, 및 0.05-5%의 비-이온성 계면활성제를 갖는 에멀젼. 참고문헌 12에서 설명되는 바와 같은, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카르디올리핀이 바람직하다. 서브미크론 입경이 유리하다.

● 대사가능하지 않은 오일(예컨대, 경미네랄 오일) 및 적어도 하나의 계면활성제(예컨대, 레시틴, Tween 80 또는 Span 80). 첨가제는, 예컨대, QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성 콘쥬게이트(예컨대, GPI-0100, 참고문헌 13에서 설명됨, 글루쿠론산의 카르복실기를 통해 데사실사포닌에 지방족 아민의 첨가에 의해 생성됨), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스(2-히드록시에틸)프로판디아민이 포함될 수 있다.

● 사포닌(예를 들어, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)이 나선형 미셀과 관련되는 에멀젼[14].

● 미네랄 오일, 비-이온성 친수성 에톡실화된 지방 알코올, 및 비-이온성 친유성 계면활성제(예를 들어, 에톡실화된 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 차단 공중합체)를 포함하는 에멀젼 [15].

상기 언급한 바와 같은, 스쿠알렌을 포함하는 수중유 에멀젼이 특히 바람직하다. 일부 구체예에서, 백신 용량 내 스쿠알렌 농도는 5-15mg의 범위에 있다(즉, 10-30mg/ml의 농도, 0.5ml 용량 부피를 추정). 그러나 예를 들어, 용량 당 <5mg 또는 용량당 <1.1mg을 포함하는 스쿠알렌[16,17]의 농도를 감소시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 인간 용량은 용량 당 9.75mg 스쿠알렌을 포함할 수 있고(FLUAD™ 생성물과 마찬가지로: 0.5ml 용량 부피 중 9.75mg 스쿠알렌, 1.175mg 폴리소르베이트 80, 1.175mg 소르비탄 트리올레이트), 또는 그것의 부분적인 양, 예를 들어, 3/4, 2/3, 1/2, 2/5, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 또는 1/10을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 용량 당 4.875 스쿠알렌(따라서 각각의 폴리소르베이트 80 및 소르비탄 트리올레이트 0.588mg), 3.25mg 스쿠알렌/용량, 2.438mg/용량, 1.95mg/용량, 0.975mg/용량 등을 포함할 수 있다. FLUAD™-강도 MF59의 어떤 이것의 부분적인 희석물은 스쿠알렌:폴리소르베이트 80:소르비탄-트리올레이트를 8.3 : 1 : 1(질량)로 유지하면서 본 발명과 함께 사용될 수 있다.

면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머

본 발명은 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머를 사용한다. 이것들은 서로 이상적으로 결합되어 유용하게는 TLR9 작용제인 미립자 복합체를 형성한다. 면역촉진성 올리고뉴클레오티드는 유용한 보조제로서 알려져 있다. 그것들은 종종 CpG 모티프(구아노신에 연결된 메틸화되지 않은 사이토신을 함유하는 디뉴클레오티드 서열)를 함유하며, 그것의 보조제 효과는 참고문헌 18-23에서 논의된다. TpG 모티프, 회문식 서열, 복수의 연속적 티미딘 뉴클레오티드(예를 들어, TTTT), 복수의 연속적 시토신 뉴클레오티드(예를 들어, CCCC) 또는 다중(dG) 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 또한 이중-가닥 RNA로서 공지된 면역촉진제이다. 이들 중 어떤 다양한 면역촉진성 올리고뉴클레오티드가 본 발명과 함께 사용될 수 있지만, 데옥시이노신 및/또는 데옥시우리딘을 함유하는 올리고데옥시뉴클레오티드, 및 이상적으로는 데옥시이노신 및 데옥시사이토신을 함유하는 올리고데옥시뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직하다. 이노신-함유 올리고데옥시뉴클레오티드는 CpI 모티프(이노신에 연결된 사이토신을 함유하는 디뉴클레오티드 서열)를 포함할 수 있다. 올리고데옥시뉴클레오티드는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 이상)의 CpI 모티프를 포함할 수 있고, 이것들은 직접 반복될 수도 있고(예를 들어, 서열 (CI)x를 포함, x는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상이다) 또는 서로로부터 분리될 수도 있다(예를 들어, 서열 (CIN)x를 포함, x는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상이고, 각각의 N은 독립적으로 하나 이상의 뉴클레오티드를 나타낸다). 사이토신 잔기는 이상적으로 비메틸화된다.

올리고뉴클레오티드는 전형적으로 10 내지 100개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 15-50개의 뉴클레오티드, 20-30개의 뉴클레오티드, 또는 25-28개의 뉴클레오티드를 가질 것이다. 이는 전형적으로 단일-가닥일 것이다.

올리고뉴클레오티드는 배타적으로 천연 뉴클레오티드, 배타적으로 비-천연 뉴클레오티드, 또는 둘 다의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합(들)을 포함할 수 있고 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 가질 수 있다.

본 발명과 함께 사용을 위한 바람직한 올리고뉴클레오티드는 26-mer 서열 5'-(IC)₁₃-3' (SEQ ID NO: 1)을 포함하는 단일-가닥의 데옥시뉴클레오티드이다. 이 올리고데옥시뉴클레오티드는 다중양이온 폴리머와 안정한 복합체를 형성하여 양호한 보조제를 제공한다.

다중양이온 폴리머는 이상적으로 다중양이온 펩티드이다. 폴리머는 하나 이상의 류신 아미노산 잔기(들) 및/또는 하나 이상의 리신 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다. 폴리머는 하나 이상의 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다. 이는 이들 아미노산 중 하나, 예를 들어, 하나 이상의 Leu-Leu 디펩티드 서열(들), 하나 이상의 Lys-Lys 디펩티드 서열(들), 또는 하나 이상의 Arg-Arg 디펩티드 서열(들)의 적어도 한 번의 직접반복을 포함할 수 있다. 이는 적어도 하나의(바람직하게는 복수, 예를 들어, 2 또는 3) Lys-Leu 디펩티드 서열(들) 및/또는 적어도 하나의(바람직하게는 복수, 예를 들어 2 또는 3) Lys-Leu-Lys 트리펩티드 서열(들)을 포함할 수 있다.

펩티드는 서열 R₁-XZXZ_xXZX-R₂를 포함할 수 있고, x는 3, 4, 5, 6 또는 7이고; 각각의 X는 독립적으로 양으로 하전된 천연 및/또는 비-천연 아미노산 잔기이고; 각각의 Z는 독립적으로 아미노산 잔기 L, V, I, F 또는 W이고; R¹ 및 R²는 -H, -NH₂, -COCH₃, 또는 -COH로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구체예에서, X-R₂는 펩티드의 C-말단 아미노산 잔기의 아미드, 에스테르 또는 티오에스테르일 수 있다.

다중양이온 펩티드는 전형적으로 5 내지 50개의 아미노산, 예를 들어, 6-20개의 아미노산, 7-15개의 아미노산, 또는 9-12개의 아미노산을 가질 것이다.

펩티드는 배타적으로 천연 아미노산, 배타적으로 비-천연 아미노산, 또는 이 둘의 혼합물을 포함할 수 있다. 이는 L-아미노산 및/또는 D-아미노산을 포함할 수 있다. L-아미노산이 전형적이다.

펩티드는 천연 N-말단(NH₂-) 또는 변형된 N-말단, 예를 들어, 히드록실, 아세틸 등을 가질 수 있다. 펩티드는 천연 C-말단(-COOH) 또는 변형된 C-말단, 예를 들어, 히드록실, 아세틸 등을 가질 수 있다. 이러한 변형은 펩티드의 안정성을 개선시킬 수 있다.

본 발명과 함께 사용을 위한 바람직한 펩티드는 모든 L-아미노산과 함께 11-mer KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 2)이다. N-말단은 탈아미노화될 수 있고, C-말단은 히드록실화될 수 있다. 바람직한 펩티드는 모든 L-아미노산과 함께 H-KJLKL₅KLK-OH이다. 이 올리고펩티드는 공지된 항균물질[24], 호중성 활성제[25] 및 보조제[26]이고 면역촉진성 올리고뉴클레오티드와 함께 안정한 복합체를 형성하여 양호한 보조제를 제공한다.

면역촉진성 올리고뉴클레오티드와 다중양이온 폴리머의 가장 바람직한 혼합물은 올리고데옥시뉴클레오티드 SEQ ID NO: 1과 다중양이온 올리고펩티드 SEQ ID NO: 2의 흡착복합체인 IC31™ [27-29]로서 알려진 TLR9 작용제이다.

올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드는 함께 다양한 비율로 혼합될 수 있지만, 그것들은 일반적으로 과량의 몰비로 펩티드와 혼합될 것이다. 과량의 몰비는 적어도 5:1, 예를 들어, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1 등일 수 있다. 약 25:1의 몰 비가 이상적이다[30,31]. 이 과량의 비율로 혼합하는 단계는 올리고뉴클레오티드와 올리고펩티드 사이의 불용성 미립자 복합체의 형성을 초래할 수 있다. 복합체는 수중유 에멀젼과 합쳐질 수 있다.

올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드는 전형적으로 수성 조건하에서 혼합될 것이고, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 용액은 원하는 비율로 올리고펩티드의 용액과 혼합될 수 있다. 두 용액은 물 또는 버퍼에서 건조된(예를 들어 동결건조된) 물질을 용해시켜 그 다음에 혼합될 수 있는 저장용액을 형성함으로써 제조될 수 있다.

복합체는 참고문헌 32에 개시된 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 그것들은 이상적으로 에멀젼 중의 유적의 평균 직경보다 더 큰 평균 직경을 가진다. 1μm-20μm 범위에서 평균 직경을 가지는 복합체가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 에멀젼과 복합체의 크기 분포 사이에는 중첩이 없으며, 즉, 에멀젼 중의 가장 큰 방울은 가장 작은 복합체보다 더 작다(또는 가장 큰 복합체는 가장 작은 방울보다 더 작다). 그러나 다른 구체예에서, 방울 및 복합체 직경의 범위는 중첩될 수 있다.

폴리-아르기닌 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 유사하게 복합체를 형성한다[33].

복합체는 예를 들어, 물 또는 버퍼 내 수성 현탁액 중에서 유지될 수 있다. 복합체와 함께 사용을 위한 전형적인 버퍼는 인산염 버퍼(예를 들어, 인산완충식염수), 트리스 버퍼, 트리스/소르비톨 버퍼, 붕산염 버퍼, 숙신산염 버퍼, 시트르산염 버퍼, 히스티딘 버퍼 등이다. 또 다르게는, 복합체는 때때로 동결건조될 수 있다.

수성 현탁액 중의 복합체는 원심분리되어 그것들을 벌크 배지로부터 분리시킬 수 있다(예를 들어, 흡입, 디캔팅 등). 이들 복합체는 그 후 수중유 에멀젼과 같은 또 다른 배지에서 재현탁될 수 있다.

에멀젼 , 올리고뉴클레오티드 및 폴리머의 혼합

본 발명의 보조제 조성물은 통상적으로 수중유 에멀젼을 올리고뉴클레오티드/폴리머 복합체와 혼합하여 제조될 것이다. 본 에멀젼은 액체이며 복합체는 전형적으로 액체 형태로 유지되고, 따라서 본 발명의 보조제는 2가지의 액체를 혼합하여 형성될 수 있다.

일부 구체예에서, 혼합이 본 발명의 면역원성 조성물을 제공하기 위해서 액체 중 하나 또는 둘 다는 면역원을 포함한다. 다른 구체예에서, 액체가 면역원을 포함하지 않고, 따라서 혼합된 생성물(즉, 본 발명의 보조제 조성물)은 이후에 면역원과 혼합되어 본 발명의 면역원성 조성물을 제공한다.

2가지의 액체가 혼합된다면, 혼합을 위한 부피는 다양할 수 있지만(예를 들어, 20:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 5:1 내지 1:5, 2:1 내지 1:2 등) 이상적으로는 약 1:1이다. 두 액체 중의 성분들의 농도는 원하는 최종 농도가 혼합 후 달성되도록 선택될 수 있고, 예를 들어, 혼합이 최종의 원하는 농도를 제공하도록 둘 다 2x 강도로 제조될 수 있다. 다른 구체예에서, 복합체는 액체 형태가 아니고(예를 들어, 그것들은 원심분리 또는 동결건조되었다) 그것들은 에멀젼과 조합될 수 있다(예를 들어, 용해).

올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머의 다양한 농도는, 예를 들어, 참고문헌 27, 30 또는 31, 또는 참고문헌 34에서 사용되는 어떤 농도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 다중양이온 올리고펩티드는 1100μM, 1000μM, 350 μM, 220μM, 200μM, 110μM, 100μM, 11μM, 1OμM, 1μM, 50OnM, 5OnM 등으로 존재할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 44 nM, 40 nM, 2OnM, 14 nM, 4.4 nM, 4 nM 등으로 존재할 수 있다. 2000nM 미만의 다중양이온 올리고펩티드 농도가 전형적이다. 1:25의 몰 비로 혼합된 SEQ ID NOs: 1 및 2에 대해, 본 발명의 3가지 구체예에서 mg/mL의 농도는 따라서 0.311 및 1.322, 또는 0.109 및 0.463, 또는 0.031 및 0.132일 수 있다.

ml 당 성분의 최종적인 양을 스쿠알렌, 4.9mg; 폴리소르베이트 80, 588 μg; 양이온성 올리고펩티드, 500 nMol 또는 50 nMol; 올리고뉴클레오티드, 20 nMol 또는 2 nMol로 제공하기 위해 수중 스쿠알렌 에멀젼을 IC31의 수성제제와 1:1 부피비로 혼합하는 것이 사용될 수 있다.

약학 조성물

본 발명의 보조제 조성물은 통상적으로 에멀젼, 올리고뉴클레오티드 및 폴리머에 부가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 그것들은 전형적으로 한 가지 이상의 약학적으로 허용가능한 성분을 포함한다. 이러한 성분은 또한 보조제 조성물 또는 다른 조성물을 만드는 본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 성분의 완전한 논의는 참고문헌 35에서 이용가능하다.

조성물은 티오머살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 백신은 실질적으로 수은 함유 물질이 없는(예를 들어, <10μg/ml), 예를 들어, 티오머살이 없는 것이 바람직하다. 수은을 함유하지 않는 백신은 더 바람직하다. 보존제가 없는 백신이 특히 바람직하며, α-토코페롤 숙시네이트는 인플루엔자 백신 내 또 다른 수은 함유 화합물로서 포함될 수 있다.

등장성을 조절하기 위해, 조성물은 나트륨 염과 같은 생리적 염을 포함할 수 있다. 염화나트륨(NaCl)이 바람직하며, 1 내지 20 mg/ml로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산나트륨, 및/또는 염화마그네슘 등을 포함한다.

조성물은 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 예를 들어, 240-360 mOsm/kg의 삼투압을 가질 수 있고, 280-330 mOsm/kg 또는 290-310 mOsm/kg의 범위 내에 있을 수 있다. 조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 더 전형적으로는 6.0 내지 8.0, 예를 들어, 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다.

조성물은 바람직하게는 멸균이다. 조성물은 바람직하게는 비-발열성이며, 예를 들어, 용량 당 <1 EU (내독소 단위, 표준 측정), 및 바람직하게는 용량 당 <0.1 EU를 함유한다. 조성물은 바람직하게는 글루텐이 없다.

면역원성 조성물은 일회의 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있고, 또는 복수의 면역화를 위한 물질(즉, '다회투여' 키트)을 포함할 수 있다. 보존제의 포함은 다회투여 방식에 유용하다. 다회투여 조성물에 보존제를 포함하는 대안으로서(또는 추가로), 조성물은 물질의 제거를 위한 무균 어댑터를 갖는 용기에 함유될 수 있다.

조성물은 일반적으로 투여시 수성 형태일 것이다. 때때로 절반의 용량(즉, 약 0.25ml)이 예를 들어 어린이에게 투여될 수 있지만, 백신은 전형적으로 약 0.5ml의 투약 부피로 투여된다. 본 발명의 일부 구체예에서, 조성물은 더 높은 용량, 예를 들어, 약 1ml, 예를 들어 2번 0.5ml 부피와 혼합 후 투여될 수 있다.

면역원

본 발명의 보조제 조성물은 면역원과 조합하여 동물에게 투여되어 면역 반응을 유발할 수 있다. 본 발명은 넓은 범위의 질병에 대해 치료하고 또는 보호하기 위해 넓은 범위의 면역원과 함께 사용될 수 있다. 면역원은 바이러스 질병(예를 들어, 외피보유 또는 외피 비보유 바이러스에 기인), 박테리아 질병(예를 들어, 그램 음성 또는 그램 양성 박테리아), 진균 질병, 기생충 질병, 자가면역 질병, 또는 어떤 기타 질병에 대해 보호하는 면역반응을 유발할 수 있다. 면역원은 또한 예를 들어, 종양/암, 알츠하이머 질병, 또는 중독에 대한 면역치료에 유용할 수 있다.

면역원은, 다양한 형태, 예를 들어, 전체 기관, 외막 소포, 단백질, 당류, 당지질, 콘쥬게이트(예를 들어, 담체와 합텐, 또는 담체와 당류 또는 당지질) 등 을 취할 수 있다.

면역원은 인플루엔자 A 및 B 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 수중유 에멀젼 보조제의 존재(특히 스쿠알렌을 포함하는 것)는 계절적인[36] 및 판데믹[37,38] 인플루엔자 백신에 대한 면역 반응의 균주 교차반응을 향상시키는 것으로 나타났다. 인플루엔자 바이러스 면역원의 다양한 형태는 현재 전형적으로 살아있는 바이러스 또는 불활성 바이러스를 기초로 이용가능하다. 불활성 백신은 전체 비리온, 스플리트 비리온, 또는 정제된 표면 항원을 기초로 할 수 있다. 인플루엔자 항원은 또한 비로좀의 형태로 존재할 수 있다. 헤마그글루티닌은 현재 불활성 백신 내 주요 면역원이며, 백신 용량은 전형적으로 SRID에 의해 측정되는 HA 수준을 기준으로 표준화된다. 존재하는 백신은, 예를 들어, 어린이에게, 또는 판데믹 상황에서, 또는 보조제로서 사용될 때 더 낮은 용량이 사용될 수 있지만, 균주 당 약 15μg의 HA를 함유한다. 더 높은 용량(예를 들어, 3x 또는 9x 용량[39,40])을 가지더라도, 부분적인 투여량, 예컨대 ¹/₂ (즉, 균주 당 7.5μg HA), ¹/₄ 및 ¹/₈이 사용되었다. 따라서 조성물은 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 150μg의 HA, 바람직하게는 0.1 내지 50μg, 예를 들어, 0.1-20μg, 0.1-15μg, 0.1-10μg, 0.1 -7.5μg, O.5-5μg 등을 포함할 수 있다. 특정 용량은, 예를 들어, 균주 당 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 1.9, 약 1.5 등을 포함한다. 백신 내 포함된 각 균주에 대해 실질적으로 동일한 질량의 HA를 포함하는 것이 보통이며, 예를 들어, 각 균주에 대해 HA 질량은 균주 당 평균 HA 질량의 10% 내, 바람직하게는 평균의 5% 내이다. 살아있는 백신에 대해, 용량은 HA 함량보다 오히려 50%조직배양 감염량(TCID₅₀)에 의해 측정되며, 균주 당 10⁶ 내지 10⁸의 TCID₅₀(바람직하게는 10^6.5-10^7.5)이 전형적이다. 바이러스 성장을 위한 기질로서 SPF 달걀의 사용보다는, 바이러스가 달걀의 감염된 요막액으로부터 수확된다면, 인플루엔자 바이러스 복제를 지지하는 셀라인이 사용될 수 있다. 셀라인은 전형적으로 포유동물 기원, 예를 들어, MDCK일 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스 면역원은 어떤 적당한 HA 서브타입 균주, 예를 들어, H1, H3, H5, H7, H9 등, 예컨대, H1N1, H3N2 및/또는 H5N1 균주일 수 있다.

면역원은 칸디다(Candida) 진균, 예컨대 칸디다 알비칸스(C. albicans)에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 예를 들어, 면역원은 담체 단백질에 콘쥬게이트될 수 있는 β-글루칸일 수 있다. 글루칸은 β-1,3 및/또는 β-1,6 결합을 포함할 수 있다. 적당한 면역원은 참고문헌 41 및 42에서 개시되는 것을 포함한다.

면역원은 스트렙토코쿠스 아갈락티에(S. agalactiae), 스트렙토코쿠스 뉴모니에(S.pneumoniae) 및 스트렙토코쿠스 피오게네스(S.pyogenes)을 포함하는 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 박테리아에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 예를 들어, 면역원은 담체 단백질에 콘쥬게이트될 수 있는 캡슐 당류일 수 있다. 스트렙토코쿠스 아갈락티에(S.agalactiae)에 대해, 당류는 항원형 Ia, Ib, II, III, 및/또는 V 중 하나 이상 일 수 있다. 스트렙토코쿠스 뉴모니에(S. pneumoniae)에 대해, 당류는 항원형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 및/또는 23F 중 하나 이상일 수 있다. 캡슐 당류 면역원(들)에 더하여(또는 대신에), 폴리펩티드 면역원이 보호하는 항-스트렙토코쿠스 면역 반응을 유발하는데 사용될 수 있다.

면역원은 수막구균성 박테리아(N. meningitidis)에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 예를 들어, 면역원은 담체 단백질에 콘쥬게이트될 수 있는 캡슐 당류일 수 있다. 캡슐 당류 및 다른 콘쥬게이트는 수막구균성 항원형 A, C, W135 및/또는 Y에 대한 보호에 특히 유용하다. 캡슐 당류 면역원(들)에 추가로(또는 대신에), 폴리펩티드 면역원 및/또는 외막 소포는 보호 항-수막구균성 면역 반응을 유발하는데, 특히 예를 들어, 참고문헌 43에서 개시되는 바와 같은 항원형 B에 대한 사용에 사용될 수 있다.

면역원은 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스 및/또는 C형 간염 바이러스와 같은 간염 바이러스에 대해 면역 반응을 유발할 수 있다. 예를 들어, 면역원은 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg)일 수 있다.

면역원은 호흡기세포융합바이러스에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 면역원은 A RSV군 및/또는 B RSV군일 수 있다. 적당한 면역원은 참고문헌 44 및 45에서 개시되는 바와 같은 F 및/또는 G 글리코단백질 또는 그것의 부분을 포함할 수 있다.

면역원은 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis) 및 클라미디아 뉴모니에(C. pneumoniae)를 포함하는 클라미디아(Chlamydia) 박테리아에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 적당한 면역원은 참고문헌 46-52에서 개시되는 것을 포함한다.

면역원은 장관외 병원성 균주를 포함하는 대장균(Escherichia coli) 박테리아에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 적당한 면역원은 참고문헌 53-55에 개시된 것을 포함한다.

면역원은 인간 SARS 코로나바이러스와 같은 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 적당한 면역원은 스파이크 글리코단백질과 같은 면역 반응을 유발할 수 있다.

면역원은 헬리코박터 파일로리 박테리아에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 적당한 면역원은 CagA [56-59], VacA [60,61], 및/또는 NAP [62-64]를 포함한다.

면역원은 광견병 바이러스에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 적당한 면역원은 불활성 광견병 바이러스[65, RabAvert™]이다.

면역원은 인유두종 바이러스에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 유용한 면역원은 바이러스 유사 입자(VLP)로서 알려진 구조를 형성하여 모일 수 있는 L1 외피 단백질이다. VLP는 효모 세포 내(예를 들어, S. cerevisiae) 또는 곤충 세포 내(예를 들어, Spodoptera 세포, 예컨대, S. frngiperda, 또는 Drosophila 세포 내) L1의 재조합 발현에 의해 생성될 수 있다. 효모 세포에 대해, 플라스미드 벡터는 L1 유전자(들)를 전달할 수 있고; 곤충 세포에 대해, 바큐로바이러스벡터는 L1 유전자(들)을 전달할 수 있다. 더 바람직하게는, 조성물은 HPV-16과 HPV-18 균주로부터 L1 VLP를 포함한다. 이런 2가의 조합은 매우 효과적인 것으로 나타났다[66]. HPV-16 및 HPV-18 균주에 더하여, HPV-6 및 HPV-11 균주로부터 L1 VLP를 포함하는 것이 가능하다.

면역원은 MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3 (MAGE-A3), MART-1/Melan A, 티로시나아제, gp1OO, TRP-2 등과 같은 종양 항원에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 면역원은 폐암, 흑색종, 유방암, 전립선암 등에 대한 면역치료 반응을 유발할 수 있다.

면역원은 담체 단백질에 콘쥬게이트된 합텐에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는데, 합텐은 마약성 약물이다[67]. 예는, 제한되는 것은 아니지만, 아편제, 마리화나, 암페타민, 코카인, 바르비투르산염, 글루테티미드, 메티프릴론, 클로랄 수화물, 메타콸론, 벤조디아제핀, LSD, 니코틴, 항콜린 효능성 약, 항정신병약물, 트립타민, 기타 향정신 약물, 진정제, 펜시클리딘, 실로시빈, 휘발성 아질산염 및 육체 및/또는 정신적 의존을 유발하는 기타 약물을 포함한다.

다양한 다른 면역원이 사용될 수 있다.

면역원성 조성물이 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머를 포함하는 경우, 면역원은 보통 복합체에 흡착될 것이지만, 이것이 요구되지는 않는다. 따라서, 원심분리 후 항원이 흡수를 나타내는 복합체와 결합될 수 있다. 면역원이 복합체에 "적어도 부분적으로 흡착되는" 것으로 설명되는 경우, 조성물 내 면역원의 총 양의 적어도 10(중량)%, 예를 들어, >20%, >30%, >40% 또는 그 이상으로 흡착되는 것이 바람직하다. 면역원이 복합체에 "흡착되는" 것으로 설명된다면, 조성물 내 면역원의 총 량의 적어도 50%가 예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상으로 흡착되는 것이 바람직하다. 일부 구체예에서, 면역원은 전체적으로 흡착되며, 즉, 벌크 액체 배지로부터 복합체를 분리하기 위해 원심분리 후 상청액에서 검출되는 것은 없다. 다른 구체예에서, 흡착이 없다.

조성물 또는 키트 성분의 패키징

본 발명의 보조제 조성물, 면역원성 조성물 및 키트 성분을 위한 적당한 용기는 바이알, 시린지(예를 들어, 일회용 주사기) 등을 포함한다. 이들 용기는 멸균되어야 한다. 용기는 키트를 만들기 위해, 예를 들어, 동일한 상자에서 함께 포장될 수 있다.

성분이 바이알에 위치한다면, 바이알은 유리 또는 플라스틱 재료로 만들어질 수 있다. 바이알은 바람직하게는 조성물이 그것에 첨가되기 전에 멸균된다. 라텍스-민감성 피험자와의 문제를 피하기 위해, 바이알은 바람직하게는 라텍스가 없는 마개로 밀봉되며, 모든 패키징 물질 내에서 라텍스의 부존재가 바람직하다. 바이알은 일회량의 백신을 포함할 수 있고, 또는 1회 용량 이상('다회 용량' 바이알), 예를 들어, 10회 용량을 포함할 수 있다. 유용한 바이알은 무색의 유리로 만들어진다. 붕규산 유리는 소다 석회 유리보다 바람직하다. 바이알은 부틸 고무로 만든 마개를 가질 수 있다.

주사기가 캡에 삽입될 수 있도록 바이알은 조정된 캡(예를 들어, 루어락)을 가질 수 있다. 봉인 또는 덮개가 캡이 접근될 수 있기 전에 제거되도록 하기 위해서 바이알 캡은 봉인 또는 덮개 내부에 위치될 수 있다. 바이알은 특히 다회 용량 바이알에 대해 그것의 내용물의 무균성 제거를 허용하는 캡을 가질 수 있다.

성분이 주사기에 패키지되면, 주사기는 그것에 부착되는 니들을 가질 수 있다. 니들이 부착되지 않는다면, 개개의 니들은 조립 및 사용을 위해 주사기와 함께 공급될 수 있다. 이러한 니들은 피복될 수 있다. 주사기 내 플런저는 호흡 동안 플런저가 우연히 제거되는 것을 방지하기 위한 마개를 가질 수 있다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 가질 수 있다. 일회용 주사기는 일회량의 백신을 함유한다. 주사기는 일반적으로 니들의 부착 전 팁을 밀봉하기 위한 팁 캡을 가질 것이고, 팁 캡은 부틸 고무로 만들어질 수 있다. 주사기 및 니들이 개별적으로 패키징된다면 니들은 바람직하게는 부틸고무 쉴드를 구비한다. 유용한 주사기는 상표명 "Tip-Lok"™ 하에서 시판된다.

용기는 예를 들어, 어린이에게 전달을 용이하게 하기 위한 절반-용량 부피를 나타내도록 표시될 수 있다. 예를 들어, 0.5ml 용량을 함유하는 주사기는 0.25ml 부피를 나타내는 표시를 가질 수 있다.

피험자 투여를 위해 필요로 되는 것보다 더 많은 물질을 포함하는 다-성분 제품이 보통이며, 따라서 물질 이동에서 어떤 비능률에도 불구하고 완전한 최종 용량 부피가 얻어진다. 따라서, 개개의 용기는, 예를 들어, 5-20부피%로 가득 채우는 것을 포함할 수 있다.

치료 방법, 및 면역원 조성물의 투여

본 발명의 조성물은 인간 피험자에 투여에 적당하고, 본 발명은 피험자에 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 피험자에서 면역 반응을 상승시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 키트의 용기(또는 주사기의 챔버)의 내용물을 혼합하는 단계 및 피험자에 혼합된 내용물을 투여하는 단계를 포함하는 피험자에서 면역 반응을 상승시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 예를 들어, 피험자에서 면역 반응을 상승시키기 위한 사용을 위해 약제로서 사용을 위한 본 발명의 조성물 또는 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 피험자에서 면역 반응을 상승시키기 위한 약제의 제조에서 수중유 에멀젼, 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머의 사용을 제공한다. 이 약제는 면역원과 조합하여 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 피험자에서 면역 반응을 상승시키기 위한 약제의 제조에서 수중유 에멀젼, 면역촉진성 올리고뉴클레오티드, 다중양이온 폴리머 및 면역원의 사용을 제공한다.

이들 방법 및 사용은 항체 반응, 바람직하게는 보호 항체 반응을 일으키도록 사용될 것이다.

본 발명의 조성물은 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 보통의 면역화 경로는 근육내 주사에 의하지만(예를 들어, 팔 또는 다리), 다른 이용가능한 경로는 피하 주사, 비강내, 경구, 구강, 혀밑, 피내, 피부경유, 경피 등을 포함한다.

본 발명에 따라서 제조되는 면역원 조성물은 어린이와 성인 모두를 치료하기 위한 백신으로서 사용될 수 있다. 피험자는 1세 미만, 1-5세, 5-15세, 15-55세, 또는 적어도 55세일 수 있다. 백신을 수용하기 위한 바람직한 피험자는 노인(예를 들어, ≥50세, ≥60세, 및 바람직하게는 ≥65세), 영아(예를 들어, ≤5세), 입원환자 피험자, 의료계 종사자, 무장 서비스 및 군의 요원, 임산부, 만성병 환자, 면역결핍 피험자, 해외여행객 등이다. IC31™은 유아 집단에서 유효한 것으로 나타났다[34, 68]. 그러나 백신은 이들 군에 대해 단독으로 적당하지 않고, 집단에서 더 일반적으로 사용될 수 있다.

치료는 일회량 스케쥴 또는 다회투여 스케줄일 수 있다. 다회투여는 주된 면역화 스케줄로 및/또는 부스터 면역 스케줄로 사용될 수 있다. 다회량 스케줄에서, 다양한 용량이 동일 또는 다른 경로, 예를 들어, 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등으로써 주어질 수 있다. 1 용량 이상의 투여(전형적으로 2 용량)는 면역학적으로 나이브한(naive) 피험자에서 특히 유용하다. 다회 투여는 전형적으로 적어도 1주(예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 12주, 약 16주 등)으로 투여될 것이다.

일반

용어 "포함하는"은 "포함하는"뿐만 아니라 "이루어지는"을 포함하며, 예컨대, X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 이루어질 수도 있고 또는 부가적인 것, 예컨대 X+Y를 포함할 수도 있다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수도 있다. 필요하다면, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.

수치 값에 대한 용어 "약"은 선택적이며, 예를 들어, x+10%을 의미한다.

달리 명확하게 언급되지 않는다면, 2 이상의 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 방법은 어떤 특정의 혼합 순서를 필요로 하지는 않는다. 따라서 성분들은 임의의 순서로 혼합될 수 있다. 3가지 성분들이 있다면, 2가지 성분은 서로 조합될 수 있고, 조합은 3번째 성분 등과 조합될 수 있다.

동물(및 특히 소) 재료가 세포의 배양에 사용된다면, 그것들은 '전염성 해면양뇌증(TSE)이 없는, 특히 광우병(BSE)이 없는 공급원으로부터 획득되어야 한다. 전반적으로, 동물-유래 물질의 전체적인 부재하에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다.

화합물이 조성물의 부분으로서 신체에 투여되면, 화합물은 또 다르게는 적당한 프로드러그에 의해 치환될 수 있다.

세포 기질이 유전자 재편성 또는 역유전학 방법에 대해, 또는 바이러스 성장에 대해 사용된다면, 인간 백신 생성에서 사용을 위해, 예를 들어, Ph Eur general chapter 5.2.3.에서 승인된 것이 바람직하다.

도 1은 IC31과 MF59의 혼합물에서 입자 직경을 나타낸다. y-축은 부피(%)를 나타내고 x-축은 입자 직경(μm)을 나타낸다. 도 2 내지 5는 (2) 시간 0; (3) 30분; (4) 6 시간; 및 (5) 24 시간에 보조된 H5N1 항원에 대한 동일한 분석을 나타낸다. 도 6은 IC31 단독으로 보조된 H5N1 항원에 대한 동일한 분석을 나타낸다. 도 7 및 8은 감염 전 3일부터 감염 후 5일 까지 시간에 따른 체온(℃)을 나타낸다.

보조제

수중스쿠알렌 에멀젼, MF59는 참고문헌 4의 Chapter 10에서 논의되는 바와 같이 제조되었다. IC31은 참고문헌 31에서 개시되는 바와 같이 높고 낮은 농도(10-배 차)로 제조되었다. 보조제 조합은 1:1 부피비 또는 5:1 부피비 중 하나로 MF59와 IC31^high 또는 IC31^low를 혼합함으로써 만들어진다. 3가지의 개개의 보조제(MF59, IC31^high, IC31^low), 및 2가지의 혼합물(MF59+IC31^high, MF59+IC31^low)은 다양한 면역원과 조합되었고, 다양한 포유동물에 투여되어 그것의 효능을 평가하였다.

게다가, IC31^high, IC31^low는 1:1 부피비로 MF59-보조된 인플루엔자 백신(FLU AD™)과 혼합되었다. 인간 피험자에 대해, 혼합은 면역화 전에 즉시 수행된다("bedside mix").

인플루엔자 바이러스

IC31^high, IC31^low 중 하나를 FLUAD™에 첨가 후, 인플루엔자 항원은 IC31 복합체와 빠르게 결합한다(흡착한다). 실온에서, IC31^high을 첨가하는 30분 내에 항원의 적어도 98%는 IC31 입자에 흡착한다. 96% 흡착은 실온에서 IC31^low를 첨가하고 2시간 후에 보였다. 24시간 동안 낮은 온도(4℃)에서, 97% (IC31^high) 또는 91% (IC31^low) 흡착이 보였다. 삼투압 및 pH는 IC31^high과 IC31^low 둘 다에 대해 실온에서 24시간에 걸쳐 실질적으로 계속해서 유지되었다. 에멀젼과 IC31 복합체의 입자 크기는 혼합 후 유지된다.

인플루엔자 항원은 MF59 (FLUAD™), IC31 (IC31^high 또는 IC31^low) 또는 MF59+IC31의 조합(동일한 부피의 수성 IC31과 혼합한 50μL FLUAD™; 두 보조제는 2x 강도에서 혼합되어 희석 후 최종 1x를 제공한다)으로 보조된다. 2용량의 다양한 조성물을 마우스에 투여하였고 HI 적정농도를 평가하였다. 단일 샘플을 기초로, 인플루엔자 A 바이러스의 H1N1 균주에 대해 두번째 투여 후 적정농도는 다음과 같다:

모든 3가지의 균주에 대해 풀링 샘플을 보면, HI 적정농도는 하기와 같다.

따라서, MF59와 IC31의 조합은 특히 인플루엔자 A 바이러스에 대해 보조제 단독보다 HI 적정농도를 향상시킬 수 있다.

CD4+T 세포를 평가하여 보조제가 Th1-타입 또는 Th2-타입 반응을 유발하는지 여부를 결정하였다. MF59가 Th2-타입 반응에 치우친 반응을 제공하고, IC31은 Th1-타입 반응에 치우친 반응(둘 다의 투여에서)을 제공하는 반면(MF59보다는 강하지 않게 치우침), 합한 보조제는 Th1-타입과 Th2-타입 반응 사이에서 더 균형을 이룬다.

FLUAD™에 IC31의 부가가 HI 적정농도에 큰 영향을 가지지 않지만, 이는 면역 반응의 균형을 이동시킨다.

C형 간염 바이러스

C형 간염 바이러스 E1E2 단백질을 마우스를 면역화하는데 사용하였다. MF59+IC31를 사용하여 달성한 항체 반응은 MF59와의 반응 단독과 유사하지만, 3회의 투여 후 CD81 결합의 가장 큰 억제가 MF59+IC31^low에 나타났다.

ExPEC

장관외 병원성 E.coli 균주로부터 항원 124를 알룸, IC31, MF59 또는 IC31+MF59로 보조하였다. 보호율은 하기와 같다:

혈청형 B 수막염균

참고문헌 43의 수막염균 혈청형 B 백신으로부터의 항원을 MF59, IC31^high, IC31^low 또는 그것의 조합으로 보조하였다. 백신은 3가지의 재조합 항원(Ag1, Ag2 & Ag3)을 포함하며 이것들에 대한 총 IgG 수준은 다음과 같다:

따라서, 항원 'Ag3'을 제외하고, 가장 높은 IgG 수준을 MF59와 IC31의 혼합물을 사용할 때 나타냈다.

혈청들을 또한 다양한 수막염균 균주에 대해 그것들의 박테리아 활성을 시험하였다. 대표적인 결과는 다음을 포함한다:

따라서 일부 예외로, 가장 높은 박테리아 적정농도는 MF59와 IC31의 혼합물을 사용할 때 나타났다.

수막염균의 다중 혈청군

이들 수막염균 B 단백질 항원을 또한 혈청군 A, C, W135 및 Y 항원으로부터의 콘쥬게이트된 당류 항원과 결합하였고, 동일한 보조제 혼합물로 시험하였다. 각 혈청군으로부터 시험 균주에 대한 박테리아 적정농도는 다음과 같다:

따라서, 혈청군 A를 제외하고, 가장 높은 살균 적정농도는 MF59와 IC31의 혼합물을 사용할 때 나타났다.

판데믹 인플루엔자

IC31^high을 MF59 또는 버퍼와 1:1 비율로, 또는 MF59 및 버퍼와 1:0.5:0.5 비율로 합하였다. 따라서 MF59를 그것의 정상 농도에서 또는 절반 농도에서 시험하였다. 보조제를 인플루엔자 바이러스의 H5N1 균주로부터 표면항원 백신과 조합하였다(A/Vietnam/1193/04). 조합의 안정성 및 면역원성을 시험하였다.

시점 0, 그 후 20분 또는 6시간 후에 실온에서 저장물의 pH, 삼투압, 흡착 및 입자 크기를 시험하여 안정성을 평가하였다. pH는 7.23 내지 7.26의 범위에서 안정하였다. 삼투압은 280-286 mOsm/kg 범위에서 안정하였다. 흡착 항원의 비율은 6시간에 걸쳐 76%에서 80%로 상승하였고, 30분 시점에 약간 떨어졌다. 이 도표는 MF59가 없는 대조군 조성물과 유사하며, 약간 더 낮은 삼투압(273-275 mOsm/kg), 약간 더 높은 pH(7.32-7.35), 및 약간 더 낮은 비율의 흡착 항원(54-68%)을 가진다.

시점 0에 PBS 중의 IC31^high:MF59 1:1 혼합물의 입자 크기를 도 1에 나타낸다. 에멀젼 방울(평균 직경 161nm)은 부피의 46.4% 및 IC31 복합체(평균 직경 15.9μm)에 대해 53.6%를 차지한다. 도 2 내지 5는 유사한 분석이지만 실온에서 0 내지 24시간에 H5N1 항원을 포함하는 보조 백신에 대해 나타낸다:

MF59 단독(IC31 없음)과 조합한 H5N1 항원은 151nm의 평균 방울 직경을 가졌다. IC31^high(그러나 MF59 없음)과 조합한 H5N1 항원은 38.4μm의 평균 입자 직경을 가졌다(도 6). 따라서 MF59와 IC31의 혼합은 MF59 입자의 분석된 직경을 약간 증가시켰고(여전히 멸균 여과를 허용하는 동안) IC31 복합체의 직경을 감소시켰다. 모든 경우에, 혼합물은 안정하다.

페릿(Mustela putorius furo) 모델은 판데믹 후보 인플루엔자 백신의 효능을 제공하는 바람직한 동물 모델이다. 따라서 항원(헤마그글루티닌 투여)의 3.75μg 중 1 μg이 있는 보조 백신을 8군의 페릿에 투여하였다. 페릿은 초회량 및 촉진량을 받고, 그 후에 이종 H5N1 균주로 챌린지하였다.

페릿의 체온을 챌린지 전 및 후에 모니터링하였다. 도 7 및 8은 두 실시예 마우스, D군 중 한 마리(도 7) 및 E군 중 한 마리(도 8)의 온도를 보여준다.

HAI 적정농도를 제0일, 제21일, 제42일 및 제49일에 백신 균주에 대해 평가하였다. 평균 적정농도는 다음과 같다:

따라서 IC31와 MF59 (B군 및 E군) 의 조합은 가장 높은 적정농도를 제공한다.

예비 데이타는 영향받은 폐 조직(거시적 폐 병변의 영역의 추정) 및 상대적인 폐 무게의 백분율(1.0 이하는 건강한 폐를 나타낸다)을 보였다. 군 마다 평균 결과는 하기와 같다:

IC31와 MF59의 조합은 MF59 또는 IC31 단독과 비교할 때 이 모델에서 폐 병리를 개선하였다.

따라서 IC31과 MF59 수중유 에멀젼 보조제의 조합은 페릿에게 안정하고 양호한 면역원성 및 판데믹 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 보호를 제공한다.

A군 스트렙토코쿠스 및 칸디다

스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) 및 칸디다 알비칸스(C. albicans) 항원은 또한 MF59™+IC31™로 보조되었다.

본 발명은 단지 예로써 설명되었고, 본 발명의 범주 및 정신의 범위 내에서 유지되는 동안 변형이 만들어질 수 있다는 것이 이해될 것이다.

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Claims

수중유 에멀젼, 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머를 포함하는 면역 보조제.
제 1 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 및 폴리머가 복합체 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 보조제.
제 2 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 및 폴리머의 복합체는 흡착제인 것을 특징으로 하는 보조제.
제 3 항에 있어서, 흡착 복합체의 평균 직경은 에멀젼 내 유적의 평균 직경보다 큰 것을 특징으로 하는 보조제.
제 4 항에 있어서, 복합체는 1-20μm 범위의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 보조제.
제 5 항에 있어서, 유적은 220nm 미만의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 보조제.
제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 에멀젼과 복합체의 크기 분포 사이에 중첩이 없는 것을 특징으로 하는 보조제.
수중유 에멀젼 및 흡착 미립자 보조제를 포함하는 면역 보조제로서, 흡착 미립자 보조제 내 입자의 평균 직경이 에멀젼 내의 유적의 평균 직경보다 크고, 흡착 미립자 보조제는 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머의 복합체인 것을 특징으로 하는 면역 보조제.
수중유 에멀젼 및 면역촉진성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 면역 보조제로서, 면역촉진성 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 CpI 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 보조제.
수중유 에멀젼 및 흡착 미립자 보조제를 포함하는 면역 보조제로서, 흡착 미립자 보조제 내 입자의 평균 직경 및 에멀젼 내 유적의 평균 직경이 둘 다 250nm 미만인 것을 특징으로 하는 면역 보조제.
수중유 에멀젼과 면역촉진성 올리고뉴클레오티드 및 다중양이온 폴리머의 복합체를 혼합하는 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 보조제의 제조방법.
(i) 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 보조제 및 (ii) 면역원을 포함하는 면역원성 조성물.
(i) 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 보조제와 (ii) 면역원을 혼합하는 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 숙주에 투여될 때 면역원이 바이러스 질병, 박테리아 질병, 진균 질병, 기생충 질병 또는 자가-면역 질병에 대해 보호하는 면역 반응을 유발하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 면역원은 H5N1 인플루엔자 A 바이러스와 같은 인플루엔자 A 또는 B 바이러스에 대해 면역 반응을 유발하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.