KR20110026456A - 병원성미생물에 대하여 항균활성을 나타내는 식물 또는 그 추출물을 유효성분으로 하는 항생용 조성물 - Google Patents
병원성미생물에 대하여 항균활성을 나타내는 식물 또는 그 추출물을 유효성분으로 하는 항생용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 대한 항생용 조성물, 그 제조방법 및 상기 조성물의 사료에 응용에 관한 것이다.
Description
본 발명은 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 대한 항생용 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 사이트러스 아우란티롤리아 스윙글(Citrus aurantifolia swingle;Lime), 사이트러스 아우란티롤리아 잎(Citrus aurantifolia swingle leaf;Lime leaf), 쿠르쿠마 도메스티가 바렌톤(Curcuma domestica Valeton;Turmeric), 세스바니아 그랜디프로라 (Sesbania grandiflora L). 및 파이퍼 사르멘토섬 로스브(Piper sarmentosum Roxb)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 및/또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 대한 항생용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 항생제는 인간뿐 아니라 축산업에 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 과거 축산의 발전에 따라서 단위 면적당 사육두수가 증가되고 생산성을 향상시키기 위하여 질병의 예방 및 치료는 성공적인 축산의 중요한 요인으로 작용하였다. 이에 다양한 항생제와 성장촉진제들이 개발되었고, 현장에서 사용되어져 왔다. 이러한 항생제 사용량의 증가는 축산물에 대한 오염을 초래하였고, 더 나아가 생물농축현상을 통하여 축산물을 소비하는 인간의 생명을 위협하는 상황까지도 초래하였다.
또 항생제의 사용은 축산업의 발전에 있어 중요한 역할을 하나 내성균의 발생 등 다양한 부작용을 초래하였고, 또한 최근 친환경 농산물의 소비량 증가 및 요구도 증가로 인하여 항생제의 사용에 대한 부정적인 인식이 증가하였다. 실제로 EU(European Union)에서는 avilamycin, flavophopholipidol, salinomycin, monensin 4 종류의 항생제만을 허용하는 등 항생제에 대한 사용 규제를 강화하고 있는 실정이다. 또한 현재와 같이 급변하는 자유무역 체계에서 축산업의 생존을 위해서는 항생제의 사용을 원천적으로 배제하고 환경친화적으로 가축을 사육하는 것이 축산업 발전 및 국가 농업 발전에 있어 매우 중요한 과제이다.
친환경 축산의 구축을 위하여 항생제의 기능을 대체할 수 있는 환경친화적인 물질의 개발이 중요한 과제이다. 친환경 항생제 대체제는 다양한 분야에서 접근되어져 왔으며, 크게 병원성 미생물에 대하여 직접적인 길항작용을 나타내는 유용 미생물들을 중심으로한 생균제 (Probiotics)분야와 식물 및 기타 천연물질로부터 항균활성을 나타내는 물질을 개발하여 상용화하는 추출물 분야로 나뉠 수 있다 (김수기. 2005. 사료첨가용 식물추출물의 이용과 기능, 월간 피드저널).
향료식물(herbs)과 같은 유용한 식물자원들은 직접적인 항균활성 기능 뿐만 아니라 수많은 생리활성물질 (bio-active chemical compounds)과 비타민, 칼슘, 철분 등의 다양한 영양소를 가지고 있어 질병예방 및 치료에 적용되어져 왔다.
다양한 식물자원중 향료 식물은 일반적으로 향기가 있는 다년생 식물로서 식용, 향료, 의약 등으로 사용되어져 왔다. 특히 마늘, 겨자무(horseradish), 겨자, oregano 등은 일반 식품으로 널리 사용하여 왔고, 인삼, 향 아카시아, 쑥, 국화, 꽃창포, 구절초, 장미, 백일초, 천일홍, 계피나무, 향나무, 유자, 탱자 등의 향료식물들은 생리활성 기능이 우수하여 널리 이용되어져오고 있다.
식물자원에는 생리활성 기능 외에 다양한 병원성 미생물에 대한 항균활성을 나타내는 물질을 함유하고 있고, 식물자원에 존재하는 항균성 물질을 항균소재로 이용하고자 하는 연구는 식품, 의약 및 생물공학산업 등에서 오래전부터 활발하게 연구되어져 오고 있다. (Shin. D.H, Kim. M.S, Han. J.S. 1997. Korean J. Food SCI. TECHNOL . Vol. 29, pp. 808~816; Yang. M.S, Ha. Y.L, Nam. S.H, Choi. S.U, Jang. D.S. 1995. Korean SOC . ApplI . Bio . Chem . Vol. 38, pp. 584~589).
항균활성 및 약리활성을 지닌 식물자원은 지구상에 약 250,000~500,000종이 존재하고 있으나 이중 단지 1%만이 항균활성 및 생리활성에 대한 가능성을 평가받은 실정이다 (Cowan. M.M. 1999. Clin. Microbiol. Rev. 14, 564.584.). 이에 다양한 식물자원의 탐색 및 항균활성 스크리닝 연구는 매우 가치가 있는 분야로서 항생제 대체물질 개발에 있어 중요한 역할을 할 수 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항생제의 사용을 대체할 수 있는 식물 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명은 또 다른 목적은 상기 식물 또는 그 식물 추출물의 사료의 용도를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 사이트러스 아우란티롤리아 스윙글(Citrus aurantifolia swingle;Lime), 사이트러스 아우란티롤리아 잎(Citrus aurantifolia swingle leaf;Lime leaf), 쿠르쿠마 도메스티가 바렌톤(Curcuma domestica Valeton;Turmeric), 세스바니아 그랜디프로라 (Sesbania grandiflora L), 및 파이퍼 사르멘토섬 로스브(Piper sarmentosum Roxb)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 또는 그 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 대한 항생용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 사이트러스 아우란티롤리아 스윙글(Citrus aurantifolia swingle;Lime), 사이트러스 아우란티롤리아 잎(Citrus aurantifolia swingle leaf;Lime leaf), 쿠르쿠마 도메스티가 바렌톤(Curcuma domestica Valeton;Turmeric), 세스바니아 그랜디프로라 (Sesbania grandiflora L), 및 파이퍼 사르멘토섬 로스브(Piper sarmentosum Roxb) 및 으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물을 물 또는 유기용매로 추출하고 정제하는 단계를 포함하는 병원성 미생물에 대한 항생용 조성물 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 사이트러스 아우란티롤리아 스윙글(Citrus aurantifolia swingle;Lime), 사이트러스 아우란티롤리아 잎(Citrus aurantifolia swingle leaf;Lime leaf), 쿠르쿠마 도메스티가 바렌톤(Curcuma domestica Valeton;Turmeric), 세스바니아 그랜디프로라 (Sesbania grandiflora L), 및 파이퍼 사르멘토섬 로스브(Piper sarmentosum Roxb)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 또는 그 식물의 추출물을 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명은 적합한 담체 또는 사료 보충물의 형태에 혼합된 상기 본 발명의 식물 또는 그 추출물물을 활성성분으로 구성된 수의 또는 축산 용도의 조성물에 관한 것이다.
언급된 조성물은 항생제의 결점과 부작용의 유발 없이, 동물 특히 가축 예를 들어 돼지(swine), 소(bovine), 양(ovine), 닭, 또는 말(equine) 등에 유용하게 사용될 수 있다.
복용량은 동물의 종(species), 크기(size), 무게(weight), 나이(age)와 같은 다수의 요인들에 좌우될 것이다. 원칙적으로, 전형적인 복용량은 동물/일 당 0.1 - 10 g의 추출물 또는 식물 범위일 것이다.
본 발명에 따른 사용 가능한 추출물은 다음과 같이 구성된 공정에 의해 제조될 수 있다 :a) 용매로 상기 식물을 추출하고, 그리고 선택적으로 b) 물 불용성으로부터 정제한다.
본 발명의 식물 또는 식물의 일부의 추출물을 생성하는 경우, 물, 유기 용매 또는 이의 혼합물은 전형적인 방법에 따라 제조될 수 있지만, 무수 증류물 또한 적용될 수 있다. 적합한 유기 용매의 예는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 메틸 에틸 에테르, 다이에틸 에테르, 메틸렌 클로라이드, 클로로폼, 사염화탄소, 벤젠, 톨루엔, 헥산, 바셀린 또는 아세톤이다. 본 발명의 추출은 또한 상기의 용매 추출 및/또는 기계적인 추출의 사용을 수반한다. 추출 온도는 5 ℃에서 선택된 용매의 끊는 온도까지의 범위가 가능하다.
천연 추출물은 물에 녹지 않는 것을 제거하여 정제시킬 수 있다(단계(b)).
단계(a)에서 천연 추출물은 용액에서 알콜(또는 위에 인용된 것들중 사용된 어떤 다른 용매)을 완전히 제거하는, 60 ℃의 감압 하에서 농축시키고, 다음으로 추출물은 5 % w/w - 55 % w/w, 바람직하게는 25 % w/w 건조 잔사로 농축시키고, 온도를 1 ℃ - 30 ℃, 바람직하게는 4 ℃로, 1 시간 - 32 시간, 바람직하게는 16 시간 동안 교반 없이 유지시켰다.
정제된 추출물로 구성하는, 얻어진 맑은 용액을 원심분리(centrifugation)시켜 불용물로부터 분리시켰다.
동물에 투여되는 성분의 총 양은 성분이 필수 화합물인지, 식물 물질의 추출물인지 식물 물질인지에 따른다. 성분이 단지 식물 물질로 구성되는 경우, 투여되는 양은 일반적으로 하루에 체중 1kg당 0.02 내지 10g이다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 성분이 아닌 다른 성분을 함유할 수 있다. 적합하게는 첨가제는 성장 촉진제, 향료, 흡수 지지체 및/또는 다른 사료 성분 뿐만 아니라, 0.1 내지 100중량%, 바람직하게는 0.2 내지 90중량%의 성분을 함유한다. 바람직하게는, 성장 촉진제, 향료, 흡수 지지체 및/또는 다른 사료 성분의 총 양은 첨가제의 10 내지 75중량%이다. 임의의 성분이 식물 물질인 경우, 이들은 첨가제 중의 임의의 다른 성분과 혼합되기 전에 적합하게 건조되고, 미립자 또는 분말로 분쇄된다.
적합한 성장 촉진 첨가제 및 향료의 예는 크레졸, 아네톨, 데카락톤, 운데카락톤 및/또는 도데카락톤, 이오논(ionone), 아이론(irone), 진저롤, 피페리딘, 프로필리덴 프탈라이드, 부틸리덴 프탈라이드, 캡사이신 및/또는 타닌산이다. 지지체는 예를 들면 40 내지 50중량%의 목재 섬유, 8 내지 10중량%의 스테아린, 4 내지 5중량%의 강황 분말, 4 내지 5중량%의 로즈마리 분말, 22 내지 28중량%의 석회석, 1 내지 3중량%의 고무, 예를 들면 아라비아 고무, 5 내지 50중량%의 당 및/또는 전분 및 5 내지 15중량%의 물을 함유할 수 있다. 다른 사료 성분은 적합하게는 비타민, 효소, 무기 염, 분쇄된 곡물, 단백질함유 성분, 탄수화물-함유 성분, 거친 밀가루 및/또는 밀기울로 구성된 군에서 선택된다. 첨가제는 적합하게는 사료가 0.4ppm 내지 80중량%의 성분을 함유하게 하는 양으로 본 발명에 따른 사료 조성물에 첨가된다.
본 발명에 따른 사료 조성물은 일반적으로, 사료의 건조 중량을 기준으로 계산하였을 때 다음과 같은 성분을 함유한다:
a) 0 내지 80 무수 중량%의 곡류,b) 0 내지 30 무수 중량%의 지방, c) 0 내지 85 무수 중량%의, 곡류 이외의 유형의 단백질-함유 영양 물질, 및 d) 10ppm 내지 40 무수 중량%의 본 발명의 성분. a) 내지 d)의 총 양은 바람직하게는 최소한 50무수중량%이다.
사료 조성물을 제조하는 경우, 첨가제는 곡류, 예를 들면 연마되거나 분쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 평지씨, 대두콩 및 해바라기 씨에 근거한 식물성 단백질 공급원; 동물성 단백질 공급원; 당밀; 및 우유 제품, 예를 들면 다양한 우유 분말 및 유장 분말로 구성된 건조 성분과 혼합될 수 있다. 모든 건조 성분과 혼합된 후, 액체 성분 및 가열후 액체가 된 성분을 첨가할 수 있다. 액체 성분은, 선택적으로 가열에 의해 액화된 지질, 예를 들면 지방, 예를 들면 식물성 지방, 및/또는 카복실산,예를 들면 지방산으로 구성될 수 있다. 완전히 혼합한 후, 성분의 연마도에 따라 가루 또는 입자상 농도가 수득된다. 저장하는 동안 분리되는 것을 방지하기 위해서, 물을 바람직하게는 동물 사료에 첨가해야만 하고, 이 사료는 후속적으로 종래의 펠렛화, 증량 또는 압출 공정으로 처리된다. 임의의 추가의 물을 건조에 의해 제거할 수 있다. 원하는 경우, 생성된 입자상 동물 사료를 더 작은 입자 크기로 분쇄할 수 있다. 개시된 사료 조성물은 일반적으로 건조된 녹색 꼴 및/또는 목초와 조합되어 투여된다.
식수 보충물은 1 무수 중량% 이상, 적합하게는 1 내지 99 무수 중량%, 바람직하게는 10 내지 50 무수 중량%의 성분을 함유할 수 있다. 하나 이상의 성분에 추가하여, 보충물은 더 많은 수의 다른 성분을 1 내지 99 무수 중량%로 함유할 수 있다.
다른 성분의 적합한 예는 광물성 염, 비타민, 건강 및 성장 개선 첨가제, 향료, 수용성 또는 수-분산성 담체, 예를 들면 당,분말 우유, 우유 부산물 및 셀룰로즈 유도체, 분산제 및 안정화제, 예를 들면 수용성 또는 수-분산성 중합체 및 이의 혼합물이다. 식수를 제조하는 경우, 보충물은 일반적으로 성분의 농도가 1ppm 내지 10중량%가 되는 양으로 물에 첨가된다.
본 발명의 범위 이내에서, 사료 조성물의 현탁액을 제조하는 것 또한 가능하다. 사료가 즉각적인 소비를 위해 제조되는 경우 이는 특히 편리하다.
본 발명에서는 가축에게 사용되는 항생제중 병원성 세균에 의한 질병을 예방 및 치료를 목적으로하는 항생제를 대체하기 위하여 잠재력이 있는 유용 식물자원을 탐색하고 항균활성 스펙트럼을 조사하기 위하여 수행되었다. 특히 약리기능이 우수한 것으로 잘 알려진 야생 식물 중, 비교적 서식지가 넓고 대량으로 자생하고 있는 식물들을 대상으로 가축의 소화기성 질병 및 호흡기 질병에 관여하는 주요 병원성 미생물에 대한 항균활성 스펙트럼을 조사하였다. 또한 항균활성 물질의 규명을 위하여 각 식물체에 대한 다양한 용매 추출 분획을 확보하고, 항균활성 스펙트럼을 조사하였다.
보다 세밀한 식물 추출물의 항균활성을 평가하기 위하여 열수추출 방법과 methanol, n-hexane, chloroform, ethtyl acetate 그리고 butanol 등 다양한 용매를 이용한 분획을 확보하였고, Clostridium perfringens Type E, Enterotoxigenic E. coli, Burkholderia sp, Pantoea agglomerans, Haemopillus parsuis, 그리고 Haemopillus somnus 등 가축의 질병을 유발하는 6종의 주요 병원성 세균에 대한 항균활성을 paper disc methods를 이용하여 평가하였다.
Piper sarmentosum Roxb(Wild Betal)의 경우 methanol 추출 분획에서 미약한 항균활성을 나타내었으며, Citrus aurantifolia swingle leaf(Lime leaf)의 경우 methanol, hexane 그리고 chloroform 추출분획에서 미약한 항균활성을 나타내었으며, Burkholderia sp에 특이적인 항균활성을 나타내었다. Curcuma domestica Valeton(Turmeric)의 경우 모든 용매 추출 분획에서 항균활성을 나타내지 않았으나 열수 추출 분획에서 Clostridium perfringens에 대하여 특이적인 항균활성을 나타내었으며, 항균력 또한 매우 우수하였다. Sesbania grandiflora L.경우 대부분의 추출분획에서 항균활성이 나타나지 않았으나, butanol fraction에서 Burkholderia sp.에 대한 항균활성이 나타났다. Citrus aurantifolia swingle(Lime)의 경우 열수추출분획과 methanol 추출 분획에서 매우 우수한 항균력을 나타내었으며, 다른 식물 추출물에 비하여 매우 우수한 항균력을 나타내었다.
항균활성이 확인된 물질들을 대상으로 MIC (minimum inhibition concentration)를 조사한 결과 Sesbania grandiflora L(Agati sesbania,Bai Khae)의 buthanol 추출물에서 호흡기 병원균인 Burkholderia sp에 대한 MIC 농도가 135 ㎍/㎖로 가장 강한 항균 활성을 나타내었다.
항산화활성 평가에서는 대부분의 식물들이 비교적 높은 항산화 활성을 나타내었고, 특히 Citrus aurantifolia swingle(Lime), Citrus aurantifolia swingle leaf(Lime leaf), Morinda citrifolia L. leaf(Beach mulberry leaf), Piper sarmentosum Roxb(Wild Betal), Curcuma domestica Valeton(Turmeric), Cassia siamea britt(Siamea Cassia) 등의 methnol 추출물이 높은 활성을 나타내었다.
일련의 본 발명의 결과를 종합한 결과 Sesbania grandiflora L(Agati sesbania,Bai Khae)의 buthanol 추출물에서 호흡기 병원균인 Burkholderia sp .에 대한 가장 강한 항균 활성을 나타내었고, 항산화활성 평가 대부분의 식물에서 비교적 높은 항산화 활성을 나타내었고, 특히 Citrus aurantifolia swingle(Lime), Citrus aurantifolia swingle leaf(Lime leaf), Piper sarmentosum Roxb(Wild Betal), Curcuma domestica Valeton(Turmeric) 등에서 유래한 추출물이 높은 활성을 나타내어 항생제 대체제로서 개발 가능성이 높다.
도 1은 본 발명에 사용된 열대식물의 사진이다. 사진에서 A.Citrus aurantifolia swingle; B.Citrus aurantifolia swingle leaf; C.Cassia siamea britt; D.Cocos nucifera L.; E.Morinda citrifolia L. leaf.; F.Sesbania grandiflora L.; G,Piper sarmentosum Roxb; H.Curcuma domestica Valeton를 나타낸다.
도 2는 열대 식물의 여러 추출단계를 나타낸다.
도 2는 열대 식물의 여러 추출단계를 나타낸다.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기의 실시예는 본 발명을 설명하는 것이지 하기 실시예에 의하여 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
실시예
1:후보 식물
다양한 병원균에 대한 항균활성이 우수한 천연 식물자원을 탐색하기 위하여 본 실험에서는 현재 열대지방에서 자생하고 있는 열대 식물들을 대상으로 항균활성을 평가하였다.
열대지방에서 자생하고 있는 Citrus aurantifolia swingle(Lime), Citrus aurantifolia swingle leaf(Lime leaf,), Morinda citrifolia L. leaf(Beach mulberry leaf), Sesbania grandiflora L.(Agati sesbania,), Piper sarmentosum Roxb(Wild Betal), Curcuma domestica Valeton(Turmeric), Cassia siamea britt(Siamea Cassia) 그리고 Cocos nucifera L.(Coconut)을 식물자원으로 사용하였고, 본 발명에 사용한 각 식물은 도 1 또는 표 1에서 보는 것과 같다.
각 식물체는 수집 후에 증류수를 이용하여 2~3회 세척하였고, 킴와이프 티슈를 이용하여 물기를 제거한 후 48시간 동안 음건하였고, 건조된 시료는 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후 추출시료로 사용하였다.
| 식물의 과학명 | 통상적인 이름 |
| Citrus aurantifolia swingle | Lime |
| Citrus aurantifolia swingle leaf | Lime leaf |
| Morinda citrifolia L. leaf | Beach mulberry leaf |
| Sesbania grandiflora L. | Agati sesbania |
| Piper sarmentosum Roxb | Wild Betal |
| Curcuma domestica Valeton | Turmeric |
| Cassia siamea britt | Siamea Cassia |
| Cocos nucifera L. | Coconut |
상기 표 1은 본 발명에 사용된 열대식물의 이름이다.
실시예
2: 항균활성 평가를 위한 추출물 및
분획물의
조제
각 식물체의 추출물 제조는 한 (2005)의 방법에 기초하여 단계별 추출 분획을 확보하였다. 상세한 추출 분획 회수 방법은 다음과 같다. 건조 후 분쇄된 각 식물체 3g을 메탄올 27 ml와 혼합한 후에 실온에서 약 6시간 동안 150rpm으로 교반 추출하였다. methanol 추출물은 여과지 (Whatman filter paper No 2)를 이용하여 잔사를 제거하고 여과액을 회수하였다. 여과액은 감압 농축하여 최종 methanol 분획으로 회수하였다. 회수된 methanol 분획은 일부 항균활성 평가에 사용하였고 나머지는 극성에 따라 n-hexane, chloroform, ethylacetate, butanol등 순차적으로 용매 분획하였다 (도 2).
감압 농축된 methanol 분획과 3차 증류수, 그리고 n-hexane을 1:1의 비율로 혼합한 후, voltex mixer를 이용하여 교반하였다. 용매 혼합액은 상온에서 정치시켜 tube내 층분리를 유도하였고, pasteur pippet를 이용하여 n-hexane 층을 회수하였다. 회수된 n-hexane 층은 감압 농축하여 항균활성 평가에 사용하였고, 나머지 물층은 3차증류수와 chloroform을 1:1의 비율로 혼합한 후 교반하였다. 교반 후에 정치시켜 층분리를 유도하였고 pasteur pippet를 이용하여 chloroform 층을 회수하였다. 회수된 chloroform 분획은 감압 농축하여 항균활성을 평가하였고 나머지 물층은 3차 증류수와 ethylacetate (1:1)와 혼합한 후에 chloroform 분획 회수 방법과 동일하게 ethylacetate 층과 물층을 분리하였고, ethylacetate 분획은 감압 농축하여 항균활성 평가에 사용하였고, 나머지 물층은 3차 증류수와 butanol (1:1)과 혼합한 후, 위와 동일한 방법으로 최종 butanol 분획을 회수하였다. 일련의 방법은 도 2에서 보는 것과 같다. 감압농축을 통하여 회수한 각 분획물은 해당 용매로 다시 용해시켜 4℃에서 보관하며 항균활성 평가에 사용하였다.
실시예
3: 가축 병원성 세균에 대한 식물 추출물의 항균활성 평가
다양한 용매로 분획된 추출물은 주요 가축병원성 세균에 대하여 항균활성을 평가하여, 우수한 식물 추출물을 선별하였다.
실시예
4: 병원균의 준비
본 발명에서 사용된 병원균은 가축의 소화기성 질병과 호흡기 질병 등을 유발하는 주요 병원성 세균으로 수의과학검역원에서 분양받아 사용하였고, 각 균주는 표 2에서 보는 것과 같다.
-70℃에 보관된 각 병원균은 멸균된 백금이를 이용하여 LB agar에 streak 한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. LB agar 표면에 나타난 각 병원성 세균의 colony 중 하나를 백금이를 이용하여 취한 후, LB broth에 옮겨 37℃ 진탕배양기에서 200rpm으로 24시간 배양한 후 피검균으로 사용하였다.
| 균주 명 | 질환 | Source* |
| Clostridium perfringens Type E |
장독소혈증(Enterotoxemia) | (NVRQS) |
| Enterotoxigenic E. coli | 돼지 및 소에서 대장균 감염 | (NVRQS) |
| Burkholderia sp . | 폐감염, 또는 호흡기 질환 | (NVRQS) |
|
Pantoea
agglomerans
partial |
호흡기 질환 | (NVRQS) |
| Haemopillus parsuis | 돼지에서 글래서병 | (NVRQS) |
| Haemopillus somnus | 호흡기 질환 | (NVRQS) |
표 2는 본 발명에 사용된 병원성 세균에 대한 리스트이고, *National Veterinary Research Quarantine Service(수의과학검역원)을 나타낸다.
실시예
5: 항균활성 평가를 위한 중층 배지의 제조
각 식물 추출물 분획의 항균활성을 평가하기 위하여, 병원균의 준비는 중층 배지 방법을 사용하였다. 항균활성 시험에 사용된 중층 배지는 0.8% agar (Bacto agar, Difco) 용액을 15ml screw cap tube 에 10ml 씩 나누어 담고, 121℃에서 15분간 멸균하여 준비하였고, tube의 agar가 굳지 않게 하기 위하여 50℃ water bath에서 보관하였다.
배양된 병원균은 최종 농도를 1×107 ~ 1×108 cfu/ml가 되게 희석한 후에 50℃ water bath 보관된 멸균 0.8% agar 용액 tube에 100㎕를 접종하였고, voltex mixer를 이용하여 교반한 후에 LB agar plate에 붓고 상온에서 식히면서 고형화시켰다.
실시예
6: 식물 추출물 분획의 항균활성 평가
일련의 과정을 통하여 확보된 식물 추출물 분획의 항균활성은 윤 등(2005)의 방법에 따라서 paper disc method를 통하여 평가하였다. 용매별로 추출된 분획을 멸균된 6mm filter paper disk (Whatman AA Discs)에 25㎕씩 흡수시키고 상온에서 각 용매가 휘발되도록 30분간 방치하였다. 각 용매가 휘발된 후에 병원성 세균이 도말된 중층배지 위에 올려놓은 후, 37℃ incubator에서 24~48시간 동안 배양하였다. 배양 후 paper disc 주변으로 형성된 생육저지 환을 관찰하여 항균활성의 유무와 정도를 평가하였다.
실시예
7: 식물 추출물 분획의 최소저해농도(
MIC
) 평가
각 균주의 최소저해농도(MIC)는 broth microdilution method에 의해 다음과 같이 측정하였다. 즉, 96웰 플레이트에 LB를 50㎕씩 분주하고 50㎕의 식물추출물을 two-fold dilution하여 농도를 조절한 후 균의 농도를 104~105 CFU/ml이 되도록 희석시켜 50㎕씩 첨가하였다. 그 후 37℃에서 16시간 이상 배양한 뒤, 600nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정하였다. Turbidity가 나타나지 않은 well의 해당 시료 농도를 MIC(minimum inhibition concentration)값으로 결정하였다.
실시예
8: 식물 추출물 분획의 항산화활성 평가
항산화 활성은 DPPH photometric assay를 사용하였다. Ethanal 990 ㎕에 식물추출액 10 ㎕를 첨가하여 1/100로 희석한 후 0.3 mM DPPH ethanal solution을 사용하여 실온에서 30 min 반응 후 518 nm에서 흡광도를 측정하고 다음의 식을 이용 항산화활성을 측정하였다.
항산화 활성 % = 100-[(샘플의 흡광도 - 브랭크의 흡광도) x 100/ 대조군의 흡광도]
상기의 실시예의 결과는 다음과 같다.
열대에서 자생하는 식물 8종에 대한 용매별 추출 분획의 항균활성을 평가한 결과 Piper sarmentosum Roxb(Wild Betal), Citrus aurantifolia swingle leaf(Lime leaf), Curcuma domestica Valeton(Turmeric), Sesbania grandiflora L.(Agati sesbania) 그리고 Citrus aurantifolia swingle(Lime)에서 항균활성이 검출되었고 특히 Citrus aurantifolia swingle(Lime)에서 매우 우수한 항균활성이 검출되었다. 그러나 Morinda citrifolia L. leaf(Beach mulberry leaf), Cassia siamea britt(Siamea Cassia) 그리고 Cocos nucifera L.(Coconut)에서는 다양한 용매에서 추출하였음에도 불구하고 항균활성이 관찰되지 않았다(표 3).
| 식물 | 병원성 세균 | 용매 추출1 | ||||||
| A | B | C | D | E | F | |||
| Piper sarmentosum Roxb | Pantoea agglomerans partial | - | + | - | - | - | - | |
| Enterotoxigenic E. coli | - | + | - | - | - | - | ||
| Burkholderia sp. | - | + | - | - | - | - | ||
| Haemopillus somnus | - | - | - | - | - | - | ||
| Haemopillus parsuis | - | ++ | - | - | - | - | ||
| Clostridium perfringens Type E | - | - | - | - | - | - | ||
| Citrus aurantifolia swingle leaf | Pantoea agglomerans partial | - | - | - | - | - | - | |
| Enterotoxigenic E. coli | - | - | - | - | - | - | ||
| Burkholderia sp. | - | + | + | + | - | - | ||
| Haemopillus somnus | - | ++ | - | - | - | - | ||
| Haemopillus parsuis | - | - | - | - | - | - | ||
| Clostridium perfringens Type E | - | - | - | - | - | - | ||
| Curcuma domestica Valeton | Pantoea agglomerans partial | - | - | - | - | - | - | |
| Enterotoxigenic E. coli | - | - | - | - | - | - | ||
| Burkholderia sp. | - | - | - | - | - | - | ||
| Haemopillus somnus | - | - | - | - | - | - | ||
| Haemopillus parsuis | - | - | - | - | - | - | ||
| Clostridium perfringens Type E | +++ | - | - | - | + | - | ||
| Sesbania grandiflora L. | Pantoea agglomerans partial | - | - | - | - | - | - | |
| Enterotoxigenic E. coli | - | - | - | - | - | - | ||
| Burkholderia sp. | - | - | - | - | - | + | ||
| Haemopillus somnus | - | - | - | - | - | - | ||
| Haemopillus parsuis | - | - | - | - | - | - | ||
| Clostridium perfringens Type E | - | - | - | - | - | - | ||
| Citrus aurantifolia swingle | Pantoea agglomerans partial | - | +++ | - | - | - | - | |
| Enterotoxigenic E. coli | - | +++ | - | - | - | - | ||
| Burkholderia sp. | + | ++ | - | - | - | - | ||
| Haemopillus somnus | +++ | +++ | - | - | - | ++ | ||
| Haemopillus parsuis | - | ++ | - | - | - | - | ||
| Clostridium perfringens Type E | - | - | - | - | - | - | ||
| Morinda citrifolia L. | Pantoea agglomerans partial | - | - | - | - | - | - | |
| Enterotoxigenic E. coli | - | - | - | - | - | - | ||
| Burkholderia sp. | - | - | - | - | - | - | ||
| Haemopillus somnus | - | - | - | - | - | - | ||
| Haemopillus parsuis | - | - | - | - | - | - | ||
| Clostridium perfringens Type E | - | - | - | - | - | - | ||
| Cassia siamea britt | Pantoea agglomerans partial | - | - | - | - | - | - | |
| Enterotoxigenic E. coli | - | - | - | - | - | - | ||
| Burkholderia sp. | - | - | - | - | - | - | ||
| Haemopillus somnus | - | - | - | - | - | - | ||
| Haemopillus parsuis | - | - | - | - | - | - | ||
| Clostridium perfringens Type E | - | - | - | - | - | - | ||
| Cocos nucifera L. | Pantoea agglomerans partial | - | - | - | - | - | - | |
| Enterotoxigenic E. coli | - | - | - | - | - | - | ||
| Burkholderia sp. | - | - | - | - | - | - | ||
| Haemopillus somnus | - | - | - | - | - | - | ||
| Haemopillus parsuis | - | - | - | - | - | - | ||
| Clostridium perfringens Type E | - | - | - | - | - | - | ||
표 3은 병원성 세균에 대한 열대식물의 용매 추출물의 항균활성을 나타낸 표로 1용매 분획: A. 물; B. 메탄올; C. 헥산; D. 클로로포름; E. 에틸 아세테이트 F. 부탄올을 나타내고, 항균 활성: -, no inhibition (8mm); +, very slight inhibition (9mm~11mm); ++, moderate inhibition (11mm~13mm); +++, heavy inhibition (13~17mm)으로 나타내었다.
1. 추출물과 용매별
분획물의
항균력
비교적 단단한 wax 층의 엽을 가진 향료 식물인 Citrus aurantifolia swingle leaf(Lime leaf)의 용매 추출 분획 중 methanol, n-hexane, Chloroform 분획에서 항균활성을 나타내었다. 그러나 각 항균활성 추출분획은 호흡기 질병의 원인균인 Burkholderia sp .과 Haemopillus somnus에 대하여 특이적인 항균활성을 나타내었고 다른 병원성 세균에 대하여서는 항균활성을 나타내지 않았다.
넓은 엽의 특성을 보이는 Piper sarmentosum Roxb(Wild Betal)에 대하여 다양한 용매로 추출한 분획의 항균력을 평가한 결과 methanol 추출물에서 미약한 항균활성이 검출되었고 착즙 및 기타 다른 용매에서는 항균활성이 검출되지 않았다. 특히 돼지 글래서병의 원인 균인 Haemopillus parasuis 대한 항균활성이 우수하였다.
근채류에 속하는 Curcuma domestica Valeton(Turmeric)은 Ethylacetate 분획에서 미약한 항균활성을 나타내었고 다른 용매 분획에서는 항균활성을 보이지 않았다. 그러나 가축의 장독혈증을 일으키는 Clostridium perfringens Type E 균주에 대하여서만 특이적인 항균활성을 나타내었고 항균활성 정도도 매우 우수하였다.
Sesbania grandiflora L.(Agati sesbania) 추출 분획은 Burkholderia sp에 대하여서만 항균활성을 나타내었다. 그러나 매우 미약한 활성만을 나타내었다.
과실류에 속하는 Citrus aurantifolia swingle(Lime)는 다른 식물 및 추출분획에 비하여 매우 넓은 항균활성 스팩트럼을 나타내었으며, 항균활성 정도도 매우 우수하였다. 특히 열수 추출한 분획은 Haemopillus somnus에 대하여 높은 항균활성을 보였으며, methanol 추출 분획은 다양한 병원균에 대하여 높은 항균활성을 나타내었다. 그러나 가축의 장독혈증을 유발하는 Clostridium perfringens Type E에 대하여서는 항균활성을 나타내지 않았다. 그 외 Morinda citrifola L. leaf, Cassia siamea britt 그리고 Cocos mucifera L.의 모든 추출분획들에서는 항균활성이 나타나지 않았다.
2. 식물 추출물 분획의 최소저해농도(
MIC
) 평가
항균활성이 확인된 물질들을 대상으로 MIC (minimum inhibition concentration)를 조사한 결과 Sesbania grandiflora L(Agati sesbania, BaiKhae)의 buthanol 추출물에서 호흡기 병원균인 Burkholderia sp에 대한 MIC 농도가 135 ㎍/㎖로 가장 강한 항균 활성을 나타내었다 (표 4).
| 식물 | 분획 | 병원균 | |||||
|
Pantoea
agglomerans |
Enterotoxigenic E. coli |
Burkholderia
sp . |
Haemopillus
somnus |
Haemopillus
parsuis |
Clostridium
perfringens |
||
| ---------- MIC(㎍/㎖) ---------- | |||||||
| Piper sarmentosum Roxb | Methanol | 2,010 | 502 | 1,005 | ND | 251 | ND |
| Citrus aurantifolia swingle leaf | Methanol | ND1 | ND | 281 | 2,250 | ND | ND |
| n-Hexane | ND | ND | 810 | ND | ND | ND | |
| Chloroform | ND | ND | 198 | ND | ND | ND | |
| Curcuma domestica Valeton | Ethylacetate | ND | ND | ND | ND | ND | 306 |
| Water | ND | ND | ND | ND | ND | 183 | |
| Sesbania grandiflora L. | Buthanol | ND | ND | 135 | ND | ND | ND |
| Citrus aurantifolia swingle | Methanol | 1,980 | 1,980 | 990 | 495 | 990 | ND |
| Buthanol | ND | ND | ND | 660 | ND | ND | |
| Water | ND | ND | 660 | 660 | ND | ND | |
| 1ND, Not detected | |||||||
표 4는 미생물에 대한 열대 식물의 분획 및 추출물의 최소 저해 농도(Minimum inhibitory concentration)를 나타내고, 표에서 ND : not detected를 나타낸다.
3. 식물 추출물 분획의 항산화활성 평가
대부분의 식물에서 비교적 높은 항산화 활성을 나타내었고, 특히 Citrus aurantifolia swingle(Lime), Citrus aurantifolia swingle leaf(Lime leaf), Morinda citrifolia L. leaf(Beach mulberry leaf), Curcuma domestica Valeton(Turmeric), Cassia siamea britt(Siamea Cassia) 등에서 methnol 추출물이 높은 활성을 나타내었다 (표 5).
| 분획 | Plant | |||||||
| Citrus aurantifolia swingle | Citrus aurantifolia swingle leaf | Morinda citrifolia L. leaf | Sesbania grandiflora L. | Piper sarmentosum Roxb | Curcuma domestica Valeton | Cassia siamea britt | Cocos nucifera L | |
| 메탄올 | 96.41% | 91.77% | 82.12% | 62.37% | 89.85% | 91.35% | 92.16% | 47.20% |
| n-헥산 | 28.25% | 18.18% | 29.06% | 22.92% | 61.21% | 14.16% | 18.68% | 13.68% |
| 클로로포름 | 22.58% | 15.94% | 34.83% | 15.77% | 94.37% | 95.31% | 62.98% | 15.60% |
| 에틸아세테이드 | 22.56% | 18.38% | 17.11% | 10.71% | 88.58% | 93.40% | 19.39% | 32.83% |
| 부탄올 | 25.07% | 13.16% | 12.15% | 10.75% | 30.76% | 61.52% | 15.01% | 22.19% |
| 물 | 31.06% | 39.54% | 21.31% | 14.55% | 19.68% | 25.35% | 23.73% | 12.75% |
| 압착 | 23.80% | 61.61% | 31.82% | 93.37% | 83.89% | 25.49% | 23.83% | 15.01% |
표 5는 열대 식물의 용매 추출물의 항산화활성을 나타낸다
Claims (8)
- 파이퍼 사르멘토섬 로스브(Piper sarmentosum Roxb) 또는 그 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 독소성 대장균(Enterotoxigenic E. coli), 버크홀데리아(Burkholderia sp), 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans), 또는 헤모필로스 파르수이스(Haemopillus parsuis)에 대한 항생용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 유기 용매에 의하여 추출되는 항생용 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 메틸 에틸 에테르, 다이에틸 에테르, 메틸렌 클로라이드, 클로로폼, 사염화탄소, 벤젠, 톨루엔, 헥산, 바셀린 또는 아세톤인 항생용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 호흡기 질환, 돼지 글래서 병, 또는 대장균 감염을 치료 또는 예방하는 것을 특징으로 하는 항생용 조성물.
- 파이퍼 사르멘토섬 로스브(Piper sarmentosum Roxb)를 유기용매로 추출하고 정제하는 단계를 포함하는 독소성 대장균(Enterotoxigenic E. coli), 버크홀데리아(Burkholderia sp), 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans), 또는 헤모필로스 파르수이스(Haemopillus parsuis)에 대한 항생용 조성물 제조방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 메틸 에틸 에테르, 다이에틸 에테르, 메틸렌 클로라이드, 클로로폼, 사염화탄소, 벤젠, 톨루엔, 헥산, 바셀린 또는 아세톤인 항생용 조성물 제조방법.
- 파이퍼 사르멘토섬 로스브(Piper sarmentosum Roxb) 또는 그 식물의 추출물을 포함하는 사료용 조성물.
- 제 7항에 있어서, 상기 사료용 조성물은 독소성 대장균(Enterotoxigenic E. coli), 버크홀데리아(Burkholderia sp), 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans), 또는 헤모필로스 파르수이스(Haemopillus parsuis)에 대한 항생효과를 가지는 것을 특징으로 하는 사료용 조성물.
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