KR101750111B1

KR101750111B1 - 혼합 오일을 포함하는 면역증강용 조성물

Info

Publication number: KR101750111B1
Application number: KR1020150060775A
Authority: KR
Inventors: 남승옥; 이근순; 배지숙; 김진구; 황석연
Original assignee: 주식회사 불스원
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2017-06-23
Also published as: KR20160129199A

Abstract

본 발명은 5종의 혼합 정유를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 5종의 혼합 정유는 세포성 면역과 체액성 면역 모두에 있어 우수한 면역증강 작용을 나타내는 기능성 소재이다.

Description

혼합 오일을 포함하는 면역증강용 조성물{Compositions for immune enhancement comprising oil mixture}

본 발명은 5종의 혼합 정유를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.

오늘날 면역(Immunity)이란 다양한 외부의 유해물질이나, 종양 등의 내적 요인 등으로부터 인체의 정상 조직을 방어하는 생체 기능을 의미한다. 면역기구는 우리 몸의 생명을 유지하는 방어 시스템이다.

면역기구의 기능을 저하시키는 요인은 매우 많으며, 예를 들어, 항생물질, 스트레스, 일반 생활 속에서의 컴퓨터 디스플레이 유닛, 과다한 양의 설탕, 커피나 담배 및 알코올 음료와 같은 자극물, 알레르겐이 되는 식품류, 부정적인 사고, 직업상의 위험도, 영양상의 문제, 정신적인 충격, 비만, 정신적인 피로감, 대량의 포화지방산 섭취 및 과도한 불포화지방산의 섭취 및 단식 등이 있다. 또한, 몇 시간씩의 TV 시청도 TV에서 나오는 전자파로 인하여 면역기구의 기능 저하를 초래한다.

면역력 저하는 세균이나 바이러스에 대한 인체의 저항성의 약화를 초래하고, 두통, 불면증, 소화불량, 우울증, 비만, 고혈압, 당뇨, 알레르기, 과민성 대장증후군 등을 직간접적 원인이 될 수 있다. 이에 따라, 면역력 저하를 방지하고, 면역력을 증강시키기 위한 다양한 방법(마사지, 영양가가 높은 음식물의 섭취, 애정, 비타민류 및 미네랄 등의 섭취, 긍정적이고 개방적인 사고방식, 반사요법 등)이 이용되고 있다.

한편, 정유(essential oil)는 식물의 꽃, 꽃봉오리, 잎, 줄기, 뿌리, 천연수지(天然樹脂) 등에서 얻는 향기가 강한 휘발성 기름이다. 정유의 주성분은 아이소프렌이 중합한 모노 및 세스퀴테르펜 탄화수소와 여기에서 유도되는 알코올, 알데하이드, 케톤, 에스터 등의 테르펜 화합물이다. 현재 1,500여종 이상의 정유가 알려져 있다. 정유 중에는 나무가 분비하는 특유의 향인 휘발성의 복합 화합물질인 피톤치드(phytoncide)도 있다. 피톤치드는 식물이 방어를 위해 스스로 생성하여 발산하는 물질로서, 항균, 방충, 소취 및 탈취 등의 기능을 갖는 천연물질이다.

본 발명이 속하는 기술분야인 면역증진용 조성물에 관한 종래기술로는 커피박 발효물을 이용한 면역 증진용 조성물의 제조 방법에 관한 대한민국 등록특허 제10-1509220호와, 울금 포함 복합물 추출물을 함유한 면역증강용 조성물에 관한 대한민국 등록특허 제10-1484021호 등이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록특허 제10-1484021호 (2014.11.20 공개) 대한민국 등록특허 제10-1509220호 (2014.12.26 공개)

본 발명자들은 면역기능의 저하를 예방하고, 면역증강 작용을 나타내는 천연물 소재에 관한 연구를 수행하였다. 그 결과, 유칼립투스 오일, 페퍼민트 오일, 티트리 오일, 피톤치드 오일 및 라벤더 오일의 5종의 혼합 오일이 총 백혈구수, 림프구의 비율, 비장세포의 증식능과 사이토카인 분비능 등을 증가시켜 우수한 면역증강 작용을 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 혼합 정유를 포함하는 면역증강용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 유칼립투스 오일, 페퍼민트 오일, 티트리 오일, 피톤치드 오일 및 라벤더 오일의 조합을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 면역기능의 저하를 예방하고, 면역증강 작용을 나타내는 천연물 소재에 관한 연구를 수행하였다. 그 결과, 유칼립투스 오일, 페퍼민트 오일, 티트리 오일, 피톤치드 오일 및 라벤더 오일의 5종의 혼합 오일이 총 백혈구수, 림프구의 비율, 비장세포의 증식능과 사이토카인 분비능 등을 증가시켜 우수한 면역증강 작용을 나타냄을 확인하였다.

하기 실시예에서는, 면역 억제가 이루어진 마우스 모델을 이용하여, 5종의 혼합 정유를 투여한 후 실험동물의 체중 및 면역장기 무게의 변화, 총 백혈구수의 변화, 비장세포의 증식능 및 비장세포의 사이토카인 분비능 등을 종합적으로 분석하여 면역증강 기능성 소재로서의 가능성 여부를 탐색하였다. 그 결과, 면역억제 후 혼합 오일을 투여 받은 실험군(CPA + EO군)은 면역 억제만 이루어진 대조군(CPA군)과 비교하여, 체중 증가, 비장 조직의 무게 감소 및 흉선 무게의 증가, 총 백혈구수와 림프구 비율의 증가 및 호중구 비율의 감소, 비장세포의 증식능 증가와 사이토카인 분비능 증가 등 모든 시험평가 항목에서 개선된 결과를 나타내는 등, 5종의 혼합 정유는 우수한 면역증강 효과를 나타내었다.

본 명세서에서 사용된 용어, "면역증강"은 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대해 면역반응을 촉진하는 기능, 또는 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 기능을 의미한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 조성물은 10-40%(w/v)의 유칼립투스 오일, 5-20%(w/v)의 페퍼민트 오일, 5-20%(w/v)의 티트리 오일, 25-50%(w/v)의 피톤치드 오일 및 5-35%(w/v)의 라벤더 오일을 포함한다.

보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 조성물은 15-35%(w/v)의 유칼립투스 오일, 5-15%(w/v)의 페퍼민트 오일, 5-15%(w/v)의 티트리 오일, 30-45%(w/v)의 피톤치드 오일 및 10-30%(w/v)의 라벤더 오일을 포함한다.

보다 더 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 조성물은 15-30%(w/v)의 유칼립투스 오일, 5-10%(w/v)의 페퍼민트 오일, 10-15%(w/v)의 티트리 오일, 30-40%(w/v)의 피톤치드 오일 및 10-30%(w/v)의 라벤더 오일을 포함한다.

본 발명의 조성물은 사이토카인의 생성을 증가시킴으로써 면역증강 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 IL-2, IL-12, IFN-γ, TNF-α, IL-10 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 생성을 증가시킨다. IL-2, IL-12, IFN-γ 및 TNF-α는 세포성 면역을 조절하는 Th1 사이토카인이고, IL-10은 체액성 면역을 조절하는 Th2 사이토카인이며, 본 발명의 조성물은 Th1과 Th2 사이토카인의 생성을 모두 증가시킬 수 있기 때문에 세포성 면역과 체액성 면역 모두에 대하여 면역증진 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 면역증강용 조성물은 혼합 정유를 구비하는 다양한 제품의 형태로 구현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 방향제, 디퓨져, 향초, 마사지 오일, 바디 오일, 발향 램프, 아로마스틱, 스프레이제, 비누(예컨대, 미용 비누) 및 입욕제의 형태로 구현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 방향제 제형으로 구현될 수 있고, 이 경우 본 발명의 방향제 조성물은 혼합 정유 외에 방향제 제조에 통상적으로 첨가되는 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분으로는 향료, 방부제, 안정화제, 색소, 항균제, 탈취제, 살균제 등이 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 면역증강용 방향제 조성물이다. 보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 면역증강용 방향제 조성물은 차량용 조성물이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 5종의 혼합 정유를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명의 유효성분인 5종의 혼합 정유는 세포성 면역과 체액성 면역 모두에 있어 우수한 면역증강 작용을 나타내는 기능성 소재이다.

도 1은 수컷 C57BL/6J 마우스(7주령; n=10)의 체중 변화를 보여준다. 10마리 마우스의 체중을 평균 ± SD로 표현하였다.
##: 정상 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.01)
###: 정상 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.001)
도 2는 총 백혈구수, 적혈구수 및 백혈구 세포의 비율을 보여준다. 결과를 평균 ± SD로 표현하였다.
###: 정상 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.001)
도 3은 C57BL/6J 마우스의 면역장기의 상대 중량을 보여준다. 10마리 마우스의 결과를 평균 ± SD로 표현하였다.
##: 정상 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.01)
###: 정상 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.001)
*: 양성 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.05)
도 4는 비장세포 증식에 미치는 정유의 영향을 보여준다. 5마리 마우스의 결과를 평균 ± SD로 표현하였다.
#: 정상 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.05)
*: 양성 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.05)
도 5는 시클로포스파미드-투여 마우스에서의 비장세포의 사이토카인 생산에 미치는 정유의 영향을 보여준다. 5마리 마우스의 결과를 평균 ± SD로 표현하였다.
#: 정상 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.05)
##: 정상 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.01)
*: 양성 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.05)
도 6은 NC군, CPA군 및 CPA + EO군에서 확인된 비장의 조직병리학적 변화를 보여준다. 스케일 바: 300 ㎛.
도 7은 비장 내 CD3+ 세포(a) 및 CD4+ 세포(B)의 조직형태계측(histomorphometry) 변화를 보여준다. 스케일 바: 300 ㎛.
도 1 내지 7에서, NC군은 오직 증류수(D.W,)만 투여한 정상 대조군을 나타내며, CPA군은 시클로포스파미드와 증류수를 투여한 양성 대조군을 나타내고, CPA + EO군은 시클로포스파미드와 혼합 정유를 투여한 실험군을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

시험물질

실험에 사용한 물질을 표 1에 나타내었다.

시험방법

검역 및 순화

동물입수 시 모든 동물의 일반 건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시하였다. 시험을 실시하는데 적합하고 건강한 동물을 선별하기 위하여 1주간의 순화기간을 두었다.

군 분리

검역 상 이상이 없는 동물만을 사용하여 체중을 기준으로 Z배열법에 따라 3개의 그룹(n=10; NC군, CPA군, CPA + EO군)으로 분리하였으며, 군 분리 완료 후 각각의 사육 상자에 개체 식별카드(시험명, 시험군, 개체번호, 성별, 시험개시일 등 기재)를 부착하였다.

투여방법 및 시험기간

입고부터 시험기간 동안 정상 펠렛 사료를 식이로 급이하였고, 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. NC군(정상 대조군)은 증류수를 0일(day 0)과 3일째(day 3)에 2회 복강 투여하고, CPA군(양성 대조군)과 CPA + EO군은 면역 억제제인 시클로포스파미드(cyclophophamide)를 0일에 150 mg/kg, 3일째에 100 mg/kg을 복강 투여하여 면역 억제를 유도하였다. 시험물질은 흡입(inhalation)을 통하여 투여하였다. CPA군과 CPA + EO군은 시클로포스파미드 최초 투여(day 0) 후 24시간 후부터 각각 증류수(vehicle)와 시험물질(혼합 정유)을 매일 1회 20분 동안 흡입시켰다.

두께 1 cm의 뚜껑이 있는 투명아크릴 챔버(W50 x D50 x H30)의 덮개쪽 4개의 모서리 부근에 하단으로부터 10 cm 높이에 실을 설치한 후, 증류수와 시험물질을 0.3 g 탈지면(cotton wool) 4개에 각각 1 mL 용량을 흡수시킨 후 설치한 실에 걸어두었다. 마우스를 사육하고 있는 케이지에서 음수 및 사료를 제거하고, 군(2 cage)별로 아크릴 챔버에 넣은 후 20분간 흡입시켰다. 원활한 공기흐름을 위하여 덮개를 7 cm 열어두었다. 한 번의 투여가 끝난 다음 챔버를 40% 알코올로 닦아 챔버 속에 남아있는 향을 완전히 제거하여 다음 투여에 영향이 없게 하였다. 각 군의 마우스는 12일째(day 12)에 희생하여 시험 분석에 이용하였다.

사육관리

사육실 환경은 항온(20±2℃), 항습(50±20%), 12시간 간격(09:00-21:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하였고, 시험기간 동안 폴리설폰 케이지에 5마리의 사육밀도로 수용하여 관리하였다. 깔짚으로 실험동물 전용 연질 깔짚을 사용하였으며, 주 1회 사육 상자를 교환하였고, 사육실 내에서 사용되는 모든 기자재 및 깔짚은 121℃에서 20분간 고압 증기멸균하여 사용하였다.

체중측정 및 음수·사료 섭취량 측정

시험기간 중 체중 변화를 관찰하기 위하여, 시험 시작일(day 0), 중간일(day 5) 및 종료일(day 11)에 실험동물의 체중을 측정하였고, 실험종료일인 12일째(day 12)에 6시간 동안 절식시키고, 음수만 제공한 후 부검 전 절식체중을 측정하였다. 음수 및 사료 섭취량을 측정하기 위하여, 시험 시작 후 1회 일정시각에 측정한 후 24시간 경과 후 익일 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다.

평가항목

체중 변화 측정

시험개체별로 초기 체중과 시험 종료 시의 체중을 통하여 총 시험기간 동안의 체중 변화를 관찰하고, 각 시험그룹 간 평균값을 산출하였다.

체중 및 면역장기 무게 측정

실험 종료일에 6시간 동안 절식시키고 음수만 제공하였으며, 부검 전 절식체중을 측정하였다. 부검 시 에테르 흡입마취 하에서 개복하여 각각의 복대정맥에서 채취한 혈액을 EDTA 튜브에 보관하고 실험동물을 희생시킨 후, 간, 비장 및 흉선을 적출한 다음 그 무게를 측정하여 주요 면역장기의 절대 무게와 상대 무게를 측정하였다(상대 장기 중량(%) = 장기 무게(g) / 부검 전 절식 체중(g) x 100).

혈구 수 측정(CBC 검사)

EDTA 튜브에 보관한 혈액을 가지고 혈구계수기 장비(ADVIA 2120, US)를 이용하여 혈구검사를 실시하여, 총 백혈구수, 적혈구수 및 백혈구감별계수를 측정하여 각 군별로 그 변화를 관찰하였다.

비장 부유액(비장세포)의 준비

각 군별로 무작위로 5마리의 실험동물을 선정하여 채혈 후 복부를 70% 알코올로 완전히 도포한 후, 무균적으로 비장을 적출한 다음 중량을 측정하고, 비장 실질조직만을 4℃ 배양액(RPMI-1640, 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 mg/㎖ 스트렙토마이신)으로 2회 세척한 뒤, 배양액이 들어있는 에펜도르프 튜브에 담아 균질화하여 비장세포를 부유시켰다. 준비된 부유액을 40 ㎛ 나일론 세포 스트레이너(nylon cell strainer; BD Biosciences, CA, USA)에 여과하여 조직편 및 유리되지 않은 세포덩어리를 제거하고, 배양액으로 다시 1회 세척하고 원심분리 한 다음 red blood cell lysing buffer Hybri-Max(Sigma-aldrich, MO, USA)를 가하여 상온에서 20분간 반응시켜 적혈구를 파괴하고, 원심분리를 반복하여 세포를 세척한 다음 배양액에 현탁하여 시험에 사용하였다.

비장세포의 증식능 측정

비장세포가 2 x 10⁵ 세포/웰이 되도록 배양액 100 ㎕에 희석하여 96웰 플레이트에 분주한 후, 배양액에 희석한 10 ㎍/㎖, LPS(Lipopolysacchaides)와 Con A(concanavalin A) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 5% CO₂가 포함된 습도 90%, 37℃ 배양기에서 48시간 동안 배양한 후, cell counting-8 assay kit(Dojindo Molecular Technologies, MD, USA) 용액을 첨가(배양액의 10% 용량)한 후, 2시간 동안 배양한 다음 마이크로플레이트 리더기(Powerwave XS, BIO-TEK, VT, USA)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

비장세포의 사이토카인 분비능 측정

비장세포가 5 x 10⁶ 세포/웰이 되도록 배양액 500 ㎕에 희석하여 24웰 플레이트에 분주한 후, 배양액에 희석한 10 ㎍/㎖ LPS와 Con A 500 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 5% CO₂가 포함된 습도 90%, 37℃ 배양기에서 48시간 동안 배양한 후, 배양액을 취하여 IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IFN-γ 및 TNF-α의 유리를 ELISA kit(eBioscience, CA, USA)를 이용하여 제조사에서 제공하는 실험방법에 따라 실험한 후, 마이크로플레이트 리더기(Powerwave XS, BIO-TEK, VT, USA)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

병리조직학적 검사

간, 비장 및 흉선 조직은 적출 후 각 장기의 중량을 측정하고, 육안적인 소견을 관찰하였다. 비장은 10% 중성 포르말린에 고정한 후 파라핀 포매 과정을 거쳐 4 ㎛ 두께의 조직절편을 3장 제작하였다. 한 장의 슬라이드는 H&E로 염색한 후 광학현미경으로 비장 조직의 변화를 관찰하였다. 나머지 두 장의 슬라이드는 각각 1차 항체로 항-CD3 항체(abcam, Cambridge, UK), CD4 항체(Sino Biological Inc., Pennsylvania, USA)를 이용하여 면역조직화학염색을 실시하였고, 제조사에서 제공하는 실험방법에 따라 염색을 진행하였다. 면역조직화학염색 후 광학현미경을 이용하여 각각의 항체에 양성으로 반응하는 세포수의 변화를 관찰하였다.

통계학적 분석

모든 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표시하고, steden's t-test를 이용하여 통계처리 하였으며, p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.

실험결과

체중 변화 - 도 1

총 시험기간(12 days) 동안 실험동물의 체중 변화를 측정한 결과, NC군의 체중은 총 시험기간 동안 꾸준히 증가하였으나, 0 day의 NC군, CPA군 및 CPA + EO군의 체중은 각각 21.49 ± 0.69 g, 21.47 ± 0.67 g 및 21.47 ± 0.70 g이였고, CPA 투여한 이후 4 day의 NC군, CPA군 및 CPA + EO군의 체중은 각각 21.63 ± 0.73 g, 20.15 ± 0.84 g 및 20.35 ± 0.54 g였으며, NC군에 비하여 CPA군(p<0.001)과 CPA + EO군(p<0.001)에서 체중이 유의적으로 감소하였다. 이는 면역 억제제인 시클로포스파미드에 의한 체중감소로 판단되었다. 4 day 이후 10 day까지 NC군, CPA군 및 CPA + EO군의 체중이 꾸준히 증가하였고, 8 day와 10 day에서는 NC군과 비교하여 CPA군(p < 0.001)과 CPA + EO군(day 8 p<0.001, day 10 p<0.01)의 체중이 유의적으로 감소하였으며, CPA군과 비교하여 CPA + EO군에서 체중이 증가한 경향을 보였다.

혈구수 분석 - 도 2

실험종료 후 부검하여 혈액을 채취하여 혈구수를 측정한 결과, 총 백혈구수는 NC군 4.76 ± 1.74 x 10³, CPA군 1.26 ± 0.39 x 10³, CPA + EO군 1.60 ± 0.53 x 10³이었으며, 총 적혈구수는 NC군 9.86 ± 0.26 x 10⁶, CPA군 8.67 ± 0.33 x 10⁶, CPA + EO군 8.61 ± 0.24 x 10⁶이었고,NC군과 비교하여 CPA군(p<0.001)과 CPA + EO군(p<0.001) 모두 총 백혈구수와 적혈구수가 유의적으로 감소되었다.

또한, 백혈구감별계수에서 NC군, CPA군 및 CPA + EO군의 호중구 비율은, 각각 6.69 ± 1.70%, 38.66 ± 5.73% 및 38.41 ± 6.37%였으며, CPA군(p<0.001)과 CPA + EO군(p<0.001) 모두 NC군과 비교하여 호중구의 비율이 유의적으로 증가하였고, 림프구의 비율은 89.37 ± 3.19%, 50.43 ± 4.89% 및 52.27 ± 5.27%로 CPA군(p < 0.001)과 CPA + EO군(p<0.001) 모두 NC군과 비교하여 유의적으로 감소하였다(p<0.001). 이상의 결과를 통하여, 시클로포스파미드 투여군에서 면역 억제가 유도되었음을 확인할 수 있었다. CPA + EO군의 경우 CPA군과 비교하여 백혈구수가 증가하였고, 전체 백혈구 중 호중구의 비율은 감소하고, 림프구의 비율은 증가하는 경향을 보였다.

면역장기 무게 측정 - 표 2 및 도 3

실험종료 후 부검하여 주요면역장기인 비장, 간 및 흉선의 상대무게를 측정한 결과, 비장의 상대무게는 NC군, CPA군 및 CPA + PC군은 각각 0.29 ± 0.02%, 0.83 ± 0.10% 및 0.74 ± 0.06%였으며, NC군과 비교하여 CPA군(p<0.001)과 CPA + EO군(p<0.001) 모두 유의적으로 증가하였고, 흉선의 상대무게는 NC군, CPA군 및 CPA + PC군은 각각 0.22 ± 0.07%, 0.13 ± 0.02% 및 0.15 ± 0.01%였고, NC군과 비교하여 CPA군(p<0.01)과 CPA + EO군(p<0.01) 모두 유의적으로 감소하였다. 시험물질을 투여한 CPA + EO군은 NC군과 비교하여 비장(p<0.001)의 무게가 유의적으로 증가하였으며, 흉선의 무게는 유의적으로 감소(p<0.01)하였다.

CPA + EO군의 비장의 상대무게는 CPA군에 비해 유의적으로 감소하였고, 흉선의 상대무게는 CPA + EO군이 CPA군에 비해 증가하는 경향을 보였다. 상기의 결과로 시클로포스파미드 투여에 의해 성공적으로 면역력이 억제되었음을 확인할 수 있었다. 또한, CPA + EO군에서 CPA군에 비해 비장의 상대무게가 유의적으로 감소하고, 흉선의 상대무게가 증가한 결과는, 시험물질의 투여가 시클로포스파미드에 의해 유도된 면역 억제에 대하여 면역증강 효과를 나타내었음을 보여준다.

10마리 마우스 결과를 평균 ± SD로 나타내었다.

##: 정상 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.01)

###: 정상 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.001)

*: 양성 대조군에 대하여 유의성 있음(p < 0.05)

비장세포의 증식능 측정 결과 - 도 4

비장세포의 증식 정도를 CCK-8 assay 키트를 이용하여 측정한 후, 면역력을 억제시킨 CPA군의 세포증식 정도를 100%로 하고, 각 실험군의 증식 정도를 백분율로 나타내었다. 그 결과, 면역력을 억제시키지 않은 NC군의 비장세포 증식은 192.72 ± 55.77%(CPA군의 1.92배)로 나타나 시클로포스파미드의 투여가 비장세포의 증식을 억제함을 확인할 수 있었다.

CPA + EO군의 경우 비장세포 증식율은 156.82 ± 41.29%로 CPA군과 비교하여 약 1.56배 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 이는 시험물질의 투여가 시클로포스파미드에 의하여 면역 억제가 유도된 마우스에서 비장세포의 증식을 증가시켰음을 보여준다.

비장세포의 사이토카인 분비능 측정 - 도 5

NC군의 비장세포의 IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IFN-γ와 TNF-α 분비량은 각각 436.28 ± 53.41 pg/㎖, 290.60 ± 47.48 pg/㎖, 404.03 ± 44.90 pg/㎖, 6.16 ± 2.35 pg/㎖, 15859.96 ± 6111.02 pg/㎖ 및 467.12 ± 27.08 pg/㎖였고, CPA군의 비장세포의 사이토카인 분비량은 각각 148.47 ± 145.97 pg/㎖, 219.45 ± 215.03 pg/㎖, 326.45 ± 57.44 pg/㎖, 1.86 ± 1.61 pg/㎖, 11537.62 ± 5427.91 pg/㎖ 및 326.38 ± 100.97 pg/㎖였으며, CPA + EO군의 비장세포의 사이토카인 분비량은 각각 615.30 ± 275.00 pg/㎖, 185.98 ± 69.75, 347.52 ± 43.57 pg/㎖, 3.37 ± 0.99 pg/㎖, 14404.50 ± 1230.80 pg/㎖, 377.03 ± 41.38 pg/㎖으로 나타났다.

IL-4를 제외한 모든 사이토카인의 경우 CPA + EO군에서 CPA군에 비해 분비능이 증가한 경향을 보였다. 이상의 결과를 통하여, 면역 억제된 마우스에서 시험물질의 투여는 세포성 면역을 조절하는 Th1 사이토카인(IL-2, IL-12, IFN-γ 및 TNF-α)과 체액성 면역을 조절하는 Th2 사이토카인(IL-4, IL-10)의 분비에 영향을 주며, 특히 Th1 사이토카인의 분비를 증가시켜 면역증강 효과를 나타냄을 알 수 있다.

비장의 병리조직학적 평가 - 도 6

CPA군에서 급격한 비장 조직 내 백비수(white pulp)의 위축 및 림프액 고갈(lymphoid depletion)이 관찰되어 시클로포스파미드에 의한 면역력 억제가 확인되었다. 하지만, CPA + EO군에서는 비장의 백비수의 위축 및 림프액의 고갈의 정도가 덜하였다. 이러한 결과는, 시험물질의 투여가 면역 억제된 마우스에서 면역증강 효능을 나타내어 비장 조직 위축을 억제하는 효과가 나타났음을 보여준다.

비장의 면역조직화학적 평가 - 도 7

비장세포 내 CD3+ 및 CD4+ 세포의 양을 확인하기 위하여 면역조직화학 염색을 실시한 결과, CPA군에서 NC군에 비해 비장 조직 내 CD3와 CD4 항체에 양성으로 반응한 세포가 현저히 감소하였다. 반면, CPA + EO군에서는 CPA군에 비해 CD3와 CD4 항체에 양성으로 반응한 세포수가 현저히 증가하였고, 이를 통하여 정유의 노출로 인한 면역기능 항진 효과를 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

IL-2, IL-12, IFN-γ, TNF-α, IL-10 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 생성을 증가시키는 효과가 있는 유칼립투스 오일, 페퍼민트 오일, 티트리 오일, 피톤치드 오일 및 라벤더 오일의 조합을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 10-40%(w/v)의 유칼립투스 오일, 5-20%(w/v)의 페퍼민트 오일, 5-20%(w/v)의 티트리 오일, 25-50%(w/v)의 피톤치드 오일 및 5-35%(w/v)의 라벤더 오일을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 방향제, 디퓨져, 향초, 마사지 오일, 바디 오일, 발향 램프, 아로마스틱, 스프레이제, 비누 및 입욕제로 구성된 군으로부터 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.