KR20110019262A

KR20110019262A - 와송 추출물을 포함하는 항혈전 조성물

Info

Publication number: KR20110019262A
Application number: KR1020090076898A
Authority: KR
Inventors: 정현주; 김세건; 최종원; 박희준; 이영미
Original assignee: 사단법인 진안군친환경홍삼한방산업클러스터사업단
Priority date: 2009-08-19
Filing date: 2009-08-19
Publication date: 2011-02-25
Also published as: KR101152003B1

Abstract

본 발명은 와송 추출물을 포함하는 항혈전 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 와송 추출물은 출혈시간 또는 응고시간을 연장시키거나 조직인자의 활성을 감소시킴으로써, 항혈전 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

와송, 항혈전, 출혈시간, 응고시간, 조직인자

Description

와송 추출물을 포함하는 항혈전 조성물{Composition for anticoagulation comprising orostachys japonicus extract}

본 발명은 와송 추출물을 유효성분으로 포함하는 항혈전 조성물에 관한 것이다.

혈전은 통상적으로 손상된 혈관의 과도한 출혈을 막기 위해서 형성되는데, 혈소판이 내피하층의 표면과 접촉하게 되면 다수의 양성 피드백 제어 기구가 혈전을 생성시켜 상처 입은 혈관계를 차단시키는 반응이 개시된다. 이러한 혈소판 응집, 피브린 생성 및 중합화의 과정을 지혈이라 일컬으며 상처 부위로부터 과도한 출혈을 막는데 있어 매우 중요하다.

혈전은 출혈하는 혈관 내에서 형성되는 것이 바람직하며, 손상되지 않은 혈관에서 혈전이 생성될 경우 병인으로 작용한다. 손상되지 않은 혈관에서 내피 세포 표면에 작은 변화가 생기거나 내피 내층의 파괴를 초래하는 부상이 생기는 경우 혈전이 생성될 수 있다. 이와 같이 혈관 내피세포 표면 또는 내층에 비교적 작은 변 형이 생겨나더라도 혈소판이 콜라겐과 접촉하여 지혈의 과정이 개시되는데, 이들 작은 변형은 여러 가지의 원인으로부터 일어난다. 이들 원인의 하나로 울체 (즉, 심방 또는 혈관에 있어서 혈액의 감소된 운동)를 예시할 수 있으며 이것은 산소의 결핍으로 인한 손상을 유발하여 전단력을 감소시킴으로써, 통상적으로 혈소판의 상호작용을 억제한다. 또 다른 원인은 아테롬성 동맥경화증의 과정이 내피의 내층상에 일으키는 손상으로서, 내피의 내층은 아테롬성 동맥 경화증 병변의 부위에서 파괴되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 내피의 내층에서 흔히 발견되는 이들 작은 변형에 기인하여 혈소판이 응집되는 것을 막는 약제를 발견하는데 수많은 연구들이 집중되어 왔으며, 이러한 연구의 성과로 혈소판이 초기에 응집하기 시작할 때 방출되는 응집 전구 물질 중 하나인 세로토닌의 길항제를 투여함으로써 혈소판 응집을 억제할 수 있음이 보고되었다 (Bush et al, Drug Dev elopment Research, 7:319-340, 1986).

혈전을 제거하기 위한 방법으로 크게 2가지 방법이 제시되고 있는데, 그 한가지는 피브린을 용해시키거나, 압축, 제거하는 방법으로서 혈전의 주 구성물질이 피브린이기 때문에 상당히 호응을 받고 있다. 현재 혈관에 관련된 질병을 치료하기 위해서 개발된 혈전 용해제로는 플라스미노겐을 활성화시켜 불용성의 피브린을 용해성 피브린 분해산물로 만드는 여러 플라스미노겐 활성 인자들이 있다. 또 다른 방법은 트롬빈 유사 효소를 이용하여 피브린의 전구물질인 피브리노겐의 양을 줄이는 방법이다. 트롬빈 유사 효소와 트롬빈에 의해서 형성된 피브린은 피브리노겐의 Aa 사슬로부터 피브린펩타이드 A를 내는 것은 동일하나 트롬빈 유사 효소로부터 생 성된 피브린은 불안전한 형태의 des-A-피브린을 형성하게 된다. 이것은 플라스민에 의해 트롬빈으로부터 생성된 피브린보다 분해가 잘 이루어지며, 상기 des-A-피브린은 플라스미노겐을 활성화시킨다고 보고된 바 있다 (Stocker, K. F., Medical Use of Snake Venom Proteins, 161-173, CRC press, 1990).

한편, 와송(瓦松, Orostachys japonicus)은 일명 바위솔로 불리는 쌍떡잎식물 장미목 돌나물과의 다년생 초본식물로, 한방고서에 항암효과, 해열, 지열, 간염, 습진, 화상 등에 특효가 있다고 기록되어 있다. 특히, 간암, 유방암, 췌장암, 골수암, 식도암, 자궁암, 임파선암, 위암, 대장암, 당뇨병, 중풍, 관절염, 위장병, 팔 다리 아프고, 손발 저림, 변비, 구토, 각종 성인병 등에 특효가 있다고 알려져 있다. 본원 발명자는 와송 추출물이 항고지혈증 및 항비만에 효과가 있음을 발견하고 출원한 바 있다(10-2008-0003650). 그러나 고지혈증은 혈액 내에 불필요한 지방 성분이 과다하게 분포되어 있는 증상으로서, 중성 지질, 킬로마이크로, 초밀도 지질단백질-트리글리세리드(VLDL), 및 저밀도 지질 단백질(LDL)의 합성은 증가하고 고밀고 지질 단백질(HDL)의 합성 및 리파제 활성이 감소하여 발생하므로 이와 같이 불필요한 지방 성분들을 제거하는 치료제의 개발이 필요함에 반하여, 혈전은 주로 혈소판과 섬유소로 구성된 혈액 성분이 응집한 것으로 혈소판 응집 억제 작용을 가지는 물질이 주로 항혈전제로 개발되고 있다는 점에서 항고지혈증과 항혈전증은 상이한 용도라고 볼 수 있다.

지금까지 분리·보고된 와송의 성분으로는 프리델린(friedelin), 에피-프리 델라놀(epi-friedelanol), 글루티논(glutinone), 글루티놀(glutinol)과 같은 트리테르페노이드(triterpenoid)류;β-시토스테롤(β-sitosterol),캄페스테롤(campesterol) 등의 스테롤(sterol) 계열 물질; 지방산 에스테르류 및 캠프페롤(kaempferol), 퀘르세틴과 같은 플라보노이드; 4-히드록시벤조산, 3,4-디히드록시벤조산, 갈릭산(gallic acid) 등의 방향족산(aromatic acid) 등이 있다.

상기한 바와 같이, 와송에 대해 다양한 약리학적 효과가 알려져 있지만, 항혈전 효과에 대해서는 아직까지 알려져 있지 않다. 이에, 본 발명자들은 와송 추출물의 항혈전 효능을 새로이 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 와송 추출물을 유효성분으로 포함하는 항혈전 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명은 와송 추출물을 유효성분으로 포함하는 항혈전 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 명세서 내 용어, "혈전"은 주로 혈소판과 세포성분을 둘러싼 섬유소로 구성된 혈액성분의 응집을 말하며, 혈액의 기타 형성된 혈액 요소와 뒤섞인 것으로 주로 혈소판 및 피브린의 응집물로 이루어진다.

본 발명의 명세서 내 용어, "출혈시간(bleeding time)"은 피부 혈관을 손상시켜서 출혈이 정지하는 데(지혈)까지 소요되는 시간으로 이는 혈소판들이 상처가 나서 손상된 혈관의 부위를 막는 과정에 영향을 받는다. 출혈시간의 측정 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 수행될 수 있으며 본 발명에 기재된 실시예로 제한되지 않는다.

본 발명의 명세서 내 용어, "조직인자(tissue factor; TF)"는 혈액응고를 가속화하는 막결합 당단백질로 치모겐 프로트롬빈(zymogen prothrombin)으로부터 트 롬빈이 형성되기 시작하기 위해 필요한 내피하층 피부, 혈소판, 백혈구 등에 존재하는 단백질이다.

와송을 물, 알콜 또는 물과 알콜의 혼합용매에 첨가하여 환류추출한다(3회 반복). 추출액을 여과한 후 감압농축하여 와송 조추출물을 얻는다. 상기 물과 알콜의 혼합용매는 10 내지 100%의 메탄올 또는 10 내지 100%의 에탄올 중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100%의 메탄올이다.

상기 와송 조추출물을 증류수에 현탁시키고, 클로로포름으로 3회 용매분획하여 와송 클로로포름 분획물을 얻는다. 그 다음 남은 수층을 에틸아세테이트로 3회 용매분획하여 와송 에틸아세테이트 분획물을 얻고, 남은 수층을 n-부탄올로 3회 용매분획하여 와송 부탄올 분획물을 얻는다. 남은 수층을 농축하여 물 분획물을 얻는다.

상기 순차적인 용매추출에 의해 와송으로부터 각종 용매 분획에 따라 추출된 시료들의 항혈전 활성을 시험한 결과, 에틸아세테이트, 부탄올, 메탄올, 클로로포름, 및 물 추출 분획물에서 항혈전 활성이 관찰되었고, 특히, 에틸아세테이트 분획의 항혈전 활성이 가장 우수하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 와송 추출물을 랫트에 비경구투여하여 in vivo 항혈전 활성을 조사한 결과, 고지방식이를 하고 와송 추출물을 투여하지않 은 랫트(대조군)와 비교하여 와송 추출물의 확연한 항혈전 효과가 관찰되었으며, 일반 식이를 먹인 랫트(정상군)에 근접한 출혈시간, 응고시간 및 조직인자의 활성을 보임을 확인하였다. 이하, 보다 구체적으로 기술한다.

본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트, 부탄올, 메탄올, 클로로포름, 및 물 추출 분획물을 투여한 랫트에서 출혈을 유도한 후 지혈될 때까지의 시간(출혈시간)을 측정한 결과, 대조군에서는 115.4±25.6 Sec이 소요되었으나 와송 에틸아세테이트 분획물 100 ㎎/㎏을 투여한 군에서는 210.3±29.8 Sec로 소요시간이 연장되어 267.5±30.4 Sec가 소요된 정상군에 근접한 출혈시간을 나타내었으며, 다른 와송 추출물 분획물에서도 이와 유사한 효과를 나타내었다.

또한, 와송 추출물의 응고시간에 미치는 효과를 확인한 결과, 대조군에서는 90.4±15.9 Sec이 소요되었으나 와송 에틸아세테이트 분획물 100 ㎎/㎏을 투여한 군에서는 178.8±25.5 Sec로 소요시간이 연장되어 유의한 결과를 나타내었으며, 다른 와송 추출물 분획물에서도 이와 유사한 효과를 나타내었다.

또한, 와송 추출물을 투여한 랫트의 뇌와 폐조직에서 수득한 조직인자의 활성도를 조사한 결과, 뇌 조직에서 수득한 조직인자의 경우 대조군에서는 7.43±0.49을 나타냈으나 와송 에틸아세테이트 분획물 100 ㎎/㎏을 투여한 군에서는 6.13±0.40로 감소하여 유의한 결과를 나타냈으며, 폐 조직에서 수득한 조직인자의 경우 대조군에서는 23.6±2.56을 나타냈으나 와송 에틸아세테이트 분획물 100 ㎎/㎏을 투여한 군에서는 18.6±0.87로 감소하여 유의한 결과를 나타냈고 다른 와송 추출물 분획물에서도 이와 유사한 효과를 나타냈다.

상기 실험 결과를 통하여, 본 발명의 와송 추출물, 특히 에틸아세테이트 분획물이 혈전의 형성을 효과적으로 저해하는 우수한 항혈전 활성을 가지고 있음을 확인하였다.

와송 추출물을 유효성분으로 포함하는 항혈전 조성물이 예방 또는 치료 효과를 가지는 질병은 다양하고, 예를 들어 고혈압, 심장병, 뇌졸증, 심근경색 등이 있으나 이에 제한되지 않으며 혈전 및 혈소판의 응집으로 생기는 질병은 모두 이에 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 와송 추출물과 함께 항혈전의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제;디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘,스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내주사 주입방식에 의한다. 비 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 와송 추출물, 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 와송 추출물의 일일 투여량은 약 1~1,000 ㎎/㎏, 바람직하게는 약 10~500 ㎎/㎏이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물은 항혈전의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 항혈전의 개선 또는 치료를 목적으로 식품에 첨가될 수 있다. 또한, 식품이란 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명의 와송 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 와송 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 와송 추출물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또 는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 와송 추출물은 우수한 항혈전 활성을 가져 혈액 및 조직 내 혈전의 형성을 효과적으로 저해하므로 이를 함유하는 조성물은 혈전 및 혈소판 응집으로 인한 고혈압, 심장병, 뇌졸중, 심근경색 등의 질병에 효과적인 항혈전 약학 조성물 및 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 준비

1. 실험동물 및 사육환경

SPF Sprague Dawley(SD)계 흰쥐[(주) BioLink(충북 음성)]로부터 4주령의 수컷를 구입한 후 1주일 간 검역과 순화사육을 거쳐 건강한 동물만을 실험에 이용하였다. 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 조명시간 12시간(07:00～19:00)로 설정된 경성대학교 약학대학 실험동물 사육실(TECNIPLAST, Italy)에서 사육하였다. 실험동물용 고형사료(중앙실험동물, 서울) 및 상수도를 자유 섭취시켰다. 실험 시간 전 24시간 동안 물만 주고 절식하였다. 이때 효소 활성의 일중 변동을 고려하여 실험동물을 일정시간(오전 10:00-12:00) 내에서 처치하였다.

2. 고지혈증유발

정상군에는 일반 식이 사료를 공급하였으며, 실험군에는 우지(beef tallow)를 첨가한 조제시료를 6주간 공급하여 식이성 고지혈증을 유발하였다. 조제 시료는 표 1에 나타내었다.

일반 식이 및 고지혈증 식이의 조성물

성분	일반 식이 (Basal Diet) (%)	고지혈증 식이 (Hyperlipidemic Diet) (%)
카제인	20.0	20.0
DL-메티오닌	0.3	0.3
옥수수 전분	15.0	15.0
수크로오스	50.0	34.5
셀룰로우스¹ ⁾	5.0	5.0
옥수스 오일	5.0	-
AIN-미네랄 혼합물² ⁾	3.5	3.5
AIN-비타민 혼합물³ ⁾	1.0	1.0
콜린 비타르트레이트	0.2	0.2
우지(Beef Tallow)	-	20.5

¹⁾셀룰로오스(Cellulose): Sigma Co. LTD., USA

²⁾Rogers과 Haper(1965)의 패턴에 기초한 미네랄 혼합물은 다음을 포함한다(g/kg diet): 제2인산칼슘(Calcium Phosphate Dibasic) 500.0, 염화나트륨(sodium chloride) 74.0, 포타슘 시트레이트 모노하이드레이트(potassium citrate monohydrate) 220.0, 황산칼륨(potassium sulfate) 52.0, 산화마그네슘(magnesium oxide) 24.0, 탄산마그네슘(magnesium carbonate) 3.5, 구연산철(ferric citrate) 6.0, 탄산아연(zinc carbonate) 1.6, 탄산구리(cupuric carbonate) 0.3, 요오드산칼륨(potassium iodate) 0.01, 크로뮴황산칼륨(chromium potassium sulfate) 0.55, 슈크로스(sucrose), 미세분말로 하여 1,000이 되게 함.

³⁾비타민 혼합물(Vitamin mixture)(g/kg diet): 티아민(thiamine) HCl 0.6, 비오틴(biotin) 0.02, 리보플라빈(riboflavin) 0.6, 시아노코발라민(cyanocobalamine) 0.001, 피리독신(pyridoxine) HCl 0.7, 레티닐아세테이트(retinyl acetate) 0.8, 니코틴산(nicotinic acid) 3.0, DL-토코페롤(DL-tocopherol) 3.8, Ca-판토텐산(Ca-pantothenate) 1.6, 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol) 0.0025, 엽산(folic acid) 0.2, 메티오닌(methionine) 0.005, 슈크로스(sucrose), 미세분말로 하여 1,000이 되게 함.

3. 시료의 투여

상지대학교로부터 수득한 와송 메탄올 분획물, 와송 물 분획물, 와송 클로로포름 분획물, 와송 에틸 아세테이트 분획물,및 와송 부탄올 분획물을 생리식염수에 용해한 4% 트윈 80을 사용하여 경구 존데(oral jonde)를 통해 실험동물에 경구투여하였다. 예비실험(진통, 항위염효과)을 통하여 얻은 용량 100 m/kg을 4주간 투여하였다.

4. 혈청, 조직의 분리 및 효소원의 조제

시료의 투입이 끝난 실험동물에 소듐 페노바르비탈(sodium phenobarbital) 200mg/kg을 복강 주사하여 마취시킨 후, 하기 실험예 2에 기재된 방법을 이용하여 출혈시간(bleeding time)을 측정하였다.

측정 후 CO₂로 가볍게 마취시키고 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하였다.

채취한 혈액의 일부는 30분간 방치한 후 3000rpm에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리하고 지질, 과산화지질(lipid peroxide), 하이드록실 레디칼(hydroxyl radical) 함량 및 SOD(superoxide dismutase) 활성의 측정에 사용하였다.

혈액의 나머지는 3.13% 구연산나트륨(sodium citrate) 용액이 혈액의 1/10이 되도록 하여 2500rpm에서 10분간 원심 분리한 후 혈장(citrated plasma)을 분리하여 혈장 응고시간(Plaasma clotting time) 및 조직인자 활성도(tissue factor activity)의 측정에 사용하였다.

뇌와 폐 조직은 1g 당 4배량의 0.15M 염화나트륨 용액(생리식염수)을 가하여 뇌조직은 2분간 글라스-테프론 호모지나이져(glass-teflon homogenizer)로 마쇄하였고, 폐 조직은 1분간 스테인리스-블레이드 호모지나이져(stainless-blade homogenizer)로 마쇄한 후 1분간 글라스-테프론 호모지나이져(glass-teflon homogenizer)로 마쇄하였다. 조직 마쇄액을 600×g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 다시 초원심분리기(ultracentrifuge)로 105,000×g에서 1시간 초원심분리한 후, 침전부분을 초원심분리한 후의 상청액과 같은 부피의 생리식염수로 현탁하여(glass-teflon) 이것을 Tissue Factor(TF) crude solution으로 사용하였다(도 1).

간은 0.9% 생리식염수로 관류시켜 조직 내 혈액을 제거하고 간을 적출하여 생리식염수로 씻은 다음 여지로 조직에 남아 있는 혈액 및 기타 이물질을 제거하였다. 그 후 간 조직에 1g 당 4 배량의 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.4)를 가하고 빙냉상에서 글라스-테프론 포모지나이져(glass-teflon homogenizer)로 마쇄하였다. 이 마쇄액은 호모제네이트(homogenate) 분획으로 하였으며, 이 분획을 냉장 원심분리기로 600×g에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 상청액을 고속 원심분리기로 10000×g에서 20분간 원심분리하였다. 그 후, 간 조직의 침전물은 동량의 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.4)용액을 가하여 현탁시킨 시료액을 다시 10000×g에서 30분간 재원심분리하여 미토콘드리아 분획을 얻었다. 또한, 상청액은 다시 105000×g에서 60분간 초원심분리하고 이를 통해 얻은 상청액을 시토졸 분획으로 그 침전물에 동일한 양의 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.4)와 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.4)를 각각 가하여 현탁시킨 시료액을 다시 105000×g에서 60분간 재원심분리하여 마이크로좀 분획으로 하였다. 이렇게 얻어진 호모제네이트(homogenate) 분획에서는 과산화지질 함량을 측정하였고, 시토졸 분획에서 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈, 카탈라아제, 글루타치온 퍼록시다제 활성의 측정의 효소원으로 사용하였다.(도 2)

실험예 1. 렙틴 및 인슐린 농도 측정

본 발명에 따른 와송 추출물이 랩틴 및 인슐린 농도에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 랫트 렙틴 및 인슐린 방사면역측정법 키트를 사용하였으며 γ-counter를 사용하여 1분간 cpm을 계수로 측정하였다.

와송 분획물의 혈청 렙틴 및 인슐린 수준에 미치는 효과

처리	용량 (㎎/㎏)	렙틴	인슐린
처리	용량 (㎎/㎏)	ng / ml
정상군		8.79±0.55^d	2.51±0.14^e
대조군		26.3±3.21^a	4.15±0.31^a
에틸 아세테이트 분획물	100	13.2±1.43^c	3.07±0.17^d
부탄올 분획물	100	15.6±0.99^c	3.31±0.26^cd
메탄올 분획물	100	19,3±1.43^b	3.62±0.33^bc
클로로포름 분획물	100	24.8±0.87^a	3.98±0.29^ab
물 분획물	100	26.0±1,13^a	3.82±0.22^ab

실험예 2. 항산화 효과 측정

본 발명에 따른 와송 추출물이 항산화 효과에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

* 단백질 정량 및 통계처리

단백질의 함량은 Lowry 등의 방법에 준하여 bovine serum albumin(Sigma, Fr. V)을 표준품으로 하여 측정하였다. 본 실험에서 얻어진 결과는 평균±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 그 유의성을 나타내었다.

1. 혈액 내 항산화 효과 측정

1-1. 과산화지질( Lipid peroxide ) 함량의 측정

Yagi 등의 방법에 따라 혈청 20㎕에 1/12N 황산 4.0㎖를 가하여 혼합하고 10% 0.5㎖를 가하여 실온에서 5분간 방치한 후 원심분리하여 침전물인 혈청 단백질만 취하고 다시 1/12N 황산 2.0㎖와 10% 텅스토인산 0.3㎖를 가하여 원심 분리하였다. 침전물만을 취하여 증류수 4.0㎖와 0.67% 티오바르비투릭산과 아세트산을 1:1로 혼합한 용액을 1.0㎖를 가하고 95℃에서 60분간 반응시켜 실온에서 냉각하였다. 그 후 n-BuOH을 5.0㎖를 첨가하여 3000rpm에서 15분간 원심분리한 후 생성된 홍색의 n-BuOH을 취해 형광광도계(spectrofluorometer)를 사용하여(Ex : 515nm, Em : 553nm) 흡광도를 측정하였다. 표준용액으로 테트라에톡시프로판 0.5n mole을 같은 방법으로 반응시켜 흡광도를 측정하고 다음의 식에 의해 혈청 과산화지질 함량을 산출하였다.

와송 분획물의 고지방식이를 섭취한 래트 내 혈중 과산화지질에 미치는 효과

처리	Dose (㎎/㎏)	함량
처리	Dose (㎎/㎏)	혈청 MDA nmole/ml
정상군		23.3±1.17^e
대조군		42.9±2.03^a
에틸아세테이트 분획물	100	32.9±2.19^d
부탄올 분획물	100	35.4±1.82^cd
메탄올 분획물	100	38.1±1.45^bc
클로로포름 분획물	100	41.6±1.53^a
물 분획물	100	40.9±1.66^ab

1-2-1. 하이드록실 라디컬 ( Hydroxyl radical ) 함량 측정

Kobatake 등의 방법에 따라 혈청 34.8㎕ 에 0.54M 염화나트륨, 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.4), 10mM 아지드화나트륨, 7mM 디옥시리보오스, 5mM 페로스 암모늄 설페이트(ferrous ammonium sulfate) 및 증류수로서 333.3㎕가 되도록 첨가하여 보르텍스(vortex)에서 잘 혼합하여 37℃에서 15 분간 정치하였다. 혈청 67㎕를 취하고 여기에 8.1% 소듐 도덱실 설페이트(소듐 도데실 설페이트) 75㎕, 20% 아세트산 500㎕ 및 재증류수 25㎕를 넣어 혼합한 다음, 여기에 다시 1.2% TBA(thiobarbituric acid) 333㎕ 를 가하여 중탕 냄비(water bath)(100℃)에서 30 분간 가열하였다. 그 후 실온에서 냉각한 다음 700×g에서 5 분간 원심분리하여 얻은 상층액을 파장 532㎚에서 흡광도를 측정하여 표준 검량선에 의하여 하이드록실 라디컬(nmole / mg protein)의 함량을 정량하였다.

1-2-2. 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 ( Superoxide dismutase ; SOD ) 활성의 측정

Mirsa 와 Fridovich의 방법에 따라 정량하였다. 즉, 혈청을 일정량 반응액[1 mmol/L 아데르날린(pH 2), 50 mmol/L 글리신(pH 10.2)]에 첨가하고 30^oC에서 3분간 반응시킨 후 480 nm에서 생성되는 아데노크롬(adrenochrome)의 생성량을 측정하였다. 효소의 활성도는 SOD의 U/g protein으로 표시하였다. SOD의 1 Unit는 50% 억제되는 아데노크롬의 생성율로서 산출하였다.

와송 분획물의 고지방식이를 섭취한 래트 내 혈청 하이드록실 라디컬 함량 및 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성에 미치는 효과

처리	Dose (㎎/㎏)	하이드록실 라디컬	SOD 활성도
처리	Dose (㎎/㎏)	nmole/mg protein	U/g protein
정상군		2.56±0.09^e	3.09±0.18^a
대조군		5.87±0.19^a	1.99±0.13^d
에틸 아세테이트 분획물	100	3.97±0.15^d	2.69±0.15^b
부탄올 분획물	100	4.23±0.21^d	2.46±0.16^bc
메탄올 분획물	100	4.85±0.26^c	2.27±0.13^cd
클로로크롬 분획물	100	5.42±0.32^b	2.03±0.17^d
물 문획물	100	5.58±0.28^ab	2.08±0.21^d

SOD 1 Unit : 아데노크롬 생성율을 50%로 저해시키는 효소의 양으로 정의

2. 조직 내 항산화 효과 측정

2-1. 간 조직의 지질 및 단백질 산화정도의 측정

Ohkawa등의 방법을 변경하여 간 조직 1g당 4배량의 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.4)를 가해 마쇄하고 이 마쇄액에 동일한 버퍼를 동량 가하여 3시간 프리인큐베이션(preincubation)시킨 후 8.1% 소듐 도데실 설페이트와 20% 아세테이트 버퍼(pH 3.5)및 발색의 목적으로 0.8% thiobarbituric acid를 가한 후 95^oC에서 1시간 동안 반응시켜 실온에서 냉각 후에 n-BuOH : 피리딘(15:1)을 첨가하여 15분간 원심 분리하여 생성된 홍색의 n-BuOH : 피리딘 층을 취하여 파장 532㎚에서 그 흡광도를 측정하였다. 이때 표준물질로 1,1,3,3-tetramethoxypropane(TMP)를 사용하였으며 측정한 값은 표준곡선에 대입시켜 malondialdehyde(MDA)의 양으로 환산하였다.

와송 분획물의 고지방식이를 섭취한 래트의 간 호모제네이트(homogenate) 내 단백질 카보닐 농도 및 TBARS에 미치는 효과

처리	Dose (㎎/㎏)	TBARS	카보닐 농도
처리	Dose (㎎/㎏)	MDA nmole/mg protein	nM/mg protein
정상군		13.7±4.87^d	2.56±0.46^d
대조군		38.9±5.43^a	4.93±0.98^a
에틸아세테이트	100	25.8±3.56^c	3.55±0.60^c
부탄올	100	29.6±2.11^bc	3.87±0.31^bc
메탄올	100	33.2±3.12^ab	4.13±0.42^abc
클로로포름	100	39.1±2,87^a	4.54±0.38^ab
물	100	36.2±2.76^a	4.61±0.46^ab

2-2. 간장 효소 활성의 측정

2-2-1. Superoxide dismutase ( SOD ) 활성의 측정

Oyanagui의 방법에 준하여 시토크롬 c, 2μM 잔틴 소듐, 50mM 소듐 포스페이트 버퍼의 기질액에 효소액을 넣고 안정화 시킨후 잔틴 옥시데이즈 50 μl를 넣고 흡광도를 사용하여 550nm에서 2분간의 흡광도를 측정하였다. 잔틴/잔틴 옥시데이즈 반응으로 생성된 슈퍼옥사이드 라디칼에 의해 시토크롬 c가 환원되는 것을 측정하는데, SOD에 의해 슈퍼옥사이드 음이온의 양이 감소하여 시토크롬 c의 변화 속도를 현상을 이용하여 SOD의 활성을 측정하였다. 시토크롬 C의 환원을 50% 억제하는 양을 SOD의 1 unit로 정의하였다.

2-2-2. 카탈라아제 활성의 측정

Aebi의 방법에 준하여 50mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.0)중에 기질인 10mM 과산화수소의 환원되는 정도를 파장 240㎚에서 흡광도의 변화를 읽고 분자흡광계수 0.041 mM^-1cm^-1을 이용하여 활성도를 산정하였다. 효소활성의 단위는 1분당 1㎎ protein이 분해하는 과산화수소의 양을 μmole로 표시하였다.

2-2-3. 글루타치온 퍼옥시데이즈 ( GSH Px ) 활성의 측정

Pagila와 Valentine의 방법에 준해 과산화수소, 글루타치온 및 NADPH가 함유된 0.1mM Tris 버퍼(pH 7.2)중에서 효소액을 가하여 파장 340㎚에서 흡광도를 측정하고 표준검량선에 준하여 활성도를 산정하였다. 효소 활성의 단위는 1분간 1 μM NADPH를 산화시키는 효소의 양으로 정의하였다. 당 1㎎ protein이 생성하는 NADP의 양을 nmole로 표시하였다.

와송 분획물의 고지방식이를 섭취한 래트의 간 조직 내 항산화효소 활성도에 미치는 효과

처리	Dose (㎎/㎏)	SOD	GSH-Px	Catalase
처리	Dose (㎎/㎏)	U/mg protein	Activity
정상군		2.21±0.23^a	14.7±0.87^a	111.6±8.93^a
대조군		1.18±0.151^e	6.05±0.98^e	60.3±5.47^c
에틸아세테이트	100	1.75±0.20^b	10.2±0.74^b	90.5±9.60^b
부탄올	100	1.64±0.19^bc	9.35±0.85^bc	83.6±6.56^b
메탄올	100	1.50±0.12^bcd	8.27±0.81^cd	71.6±4.49^c
클로로포름	100	1.32±0.14^de	7.39±0.63^de	62.7±3.67^c
물	100	1.38±0.18^cde	6.92±0.71^de	65.4±5.11^c

분석 절차는 실험 방법에 기재되어 있다. 값은 6번의 실험을 통한 평균±S.D.이다. 같은 활자가 뒤이어 오는 값은 유의적으로 차이가 없다(p<0.05).

SOD: 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈: SOD의 1 unit는 알카라인 DMSO-매개된 시토크롬 C의 환원을 50%RK지 저해하는 양으로 정의

GSH Px: 글루타치온 퍼옥시데이즈: 산화된 NADPH nmole/mg protein/min

Catalase: 환원된 과산화수소 μmole/mg protein

실험예 3. 항혈전 효과 측정

본 발명에 따른 와송 추출물이 항혈전 효과에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

* 단백질 정량 및 통계처리

1. 출혈시간( Bleeding time ) 및 응고시간( Plasma clotting time )의 측정

Han 등의 방법에 의하여 마취된 실험동물을 꼬리 끝에서 0.3㎝ 자른 후 곧 37.5℃ saline 용액에 꼬리를 5㎝ 담그고 지혈될 때까지의 시간(Bleeding time)을 측정하였다.

또한, 플라스틱 시험관을 37℃의 수욕상에 담그고 혈장 100㎕, saline(0.15M NaCl) 100㎕, 25mM 염화칼슘 100㎕를 가하고 섞은 후 가만히 흔들어 주면서 염화칼슘을 가한 후부터 혈장이 응고하기까지의 시간(Plasma clotting tim)을 측정하였다.

와송 분획물이 고지방식이를 섭취한 래트의 출혈시간 및 응고시간에 미치는 효과

처리	Dose (㎎/㎏)	출혈시간	응고시간
처리	Dose (㎎/㎏)	Sec	Sec
정상군		267.5±30.4^a	234.6±29.8^a
대조군		115.4±25.6^d	90.4±15.9^d
에틸 아세테이트 분획물	100	210.3±29.8^b	178.8±25.5^b
부탄올 분획물	100	189.5±23.7^b	135.2±21.7^c
메탄올 분획물	100	179.3±21.0^bc	123.7±19.3^cd
클로로포름 분획물	100	128.2±28.1^d	114.3±20.1^cd
물 분획물	100	133.75±30.2^cd	105.9±19.4^cd

2. 조직인자(Tissue factor)의 측정

Quick와 Surprenant 등의 방법에 준하여 플라스틱 시험관을 37^oC 수욕상에 담그고 혈장 100㎕, 조직인자 용액을 생리식염수로 희석한 것 100㎕(blank는 생리식염수 100㎕)를 가하고 25mM 염화칼슘 100㎕를 넣고 섞은 후 시험관을 수욕상에서 꺼내어 가만히 기울여 보고 다시 담그고 하면서 염화칼슘을 첨가한 후부터 응고할 때까지의 시간을 측정하였으며 2회 반복하였다. 생리식염수를 넣지 않고 조직인자 용액만 넣었을 때의 응고시간을 100% 조직인자로 정하고, 조직인자 용액을 넣지 않고 생리식염수만을 넣은 혈장의 응고시간을 0%로 하여 농도를 로그스케일(log scale)로 x축, 활성의 %를 y축에 표시하여 표준곡선을 그렸으며 이 그래프에서 50% 조직인자 활성도가 있는 조직인자의 양을 1unit로 정하여 조직인자 활성을 표시하였다.

와송 분획물이 고지방식이를 섭취한 래트의 조직인자 활성도에 미치는 효과

처리	Dose (㎎/㎏)	뇌	폐
처리	Dose (㎎/㎏)	Unit/mg protein
정상군		3.17±0.56^e	8.63±0.62^d
대조군		7.43±0.49^a	23.6±2.56^a
에틸아세테이트 분획물	100	6.13±0.40^d	18.6±0.87^c
부탄올 분획물	100	6.48±0.29^cd	19.2±1.27^c
메탄올분획물	100	6.69±0.21^bcd	20.3±0.91^bc
클로로포름 분획물	100	7.16±0.22^ab	22.6±1.01^ab
물 분획물	100	7.02±0.19^abc	24.1±0.96^a

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

와송 추출물 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

와송 추출물 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

*스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

와송 추출물 100㎎

옥수수전분 100㎎

*유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 2 : 식품의 제조

1. 조리용 양념의 제조

와송 추출물 20~95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

와송 추출물 0.2~1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

와송 추출물 0.5~5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

와송 추출물 0.1~5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

와송 추출물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

와송 추출물 5~10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 3 : 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82%를 주입하여 본 발명의 와송 추출물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 와송 추출물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채쥬스의 제조

와송 추출물 5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4. 과일쥬스의 제조

와송 추출물 1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

도 1은 조직인자 준비 과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 미토콘드리아, 시토졸 및 마이크로좀 분획의 준비 과정을 나타낸 모식도이다.

Claims

와송 추출물을 유효성분으로 포함하는 항혈전 조성물.
제1항에 있어서, 상기 와송 추출물은 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는 항혈전 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항혈전 조성물.
제3항에 있어서, 상기 약학 조성물은 혈전 및 혈소판 응집으로 인한 고혈압, 심장병, 뇌졸중 및 심근경색이 포함된 군에서 어느 하나 이상의 혈전증으로 인한 질병의 예방 및 치료용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 항혈전 조성물.
제3항에 있어서, 상기 식품 조성물은 혈전 및 혈소판 응집으로 인한 고혈압, 심장병, 뇌졸중 또는 심근경색의 예방 및 치료용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 항혈전 조성물.