KR20110011658A - 최적화된 세포 제제에 의한 수초 질환의 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포, 및 그와 같은 세포의 제조 방법, 분리 방법 및 이용 방법에 관한 것이다.

Description

최적화된 세포 제제에 의한 수초 질환의 치료{TREATING MYELIN DISEASES WITH OPTIMIZED CELL PREPARATIONS}
본 발명은 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포, 및 그와 같은 세포의 제조, 분리, 및 이용 방법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 참조
본원은 2008년 5월 8일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/051,557호의 이익을 주장하며, 이는 본원의 부분으로서 참고로 인용된다.
연방 지원된 조사에 대한 설명
본 발명은 국립 신경질환 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)가 부여한 승인번호 R01NS039559 하의 정부 지원으로 이루어졌다.
수초 부전 또는 손실은 후천성 및 선천성 수초 질환을 특징짓는다. 이들 저수초성 질병 및 탈수초성 질병은 현저한 임상 효과를 가지며, 다수의 경우, 상기 질병이 있는 환자에서 심각한 장애를 야기하거나 수명을 단축시킨다. 이들 환자에 대해 소수의 치료 선택사항이 현재 이용가능하다.
본 발명은 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포, 및 그와 같은 세포를 제조, 분리, 및 이용 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서, 신경세포 또는 신경전구세포의 집단을 제공하는 단계 및 신경세포 또는 신경전구세포 상의 PDGFαR 마커 및/또는 CD9 마커의 존재를 선별하여 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 분리하는 단계를 포함하는, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단의 분리 방법을 제공한다.
또한, 신경세포 또는 신경전구세포의 집단을 제공하는 단계, 신경세포 또는 신경전구세포 상의 A2B5의 존재를 선별하는 단계, 신경세포 또는 신경전구세포 상의 PSA-NCAM, 또는 신경세포 계통의 다른 마커의 부재를 선별하는 단계, 및 신경세포 또는 신경전구세포의 CD11, 또는 (미세아교세포 계통의 세포와 같은) 염증 세포의 다른 마커의 부재를 선별하여 A2B5 포지티브, PSA-NCAM 네가티브, CD11 네가티브 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 분리하는 단계를 포함하는, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단의 분리 방법을 제공한다.
희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 실질적으로 순수한 집단이 제공된다. 세포는 PDGFαR 마커 및/또는 CD9 마커에 대해 포지티브이고, 임의로 불사화된다. 그 예로, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단의 세포는 인간 텔로머(telomer) 확장 역전사효소를 인코딩하는 외인성 핵산을 발현시킨다.
또한 적어도 약 80%의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 포함하는 세포의 집단이 제공된다. 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포는 CD9 마커, PDGFαR 마커, 또는 CD9 마커와 PDGFαR 마커 모두에 대해 임의로 포지티브이다. 집단의 예에서, 아교전구세포는 CD9 마커에 대해 포지티브이고, CD9 포지티브 세포는 PDGFαR 마커에 대해 임의로 네가티브이다. 집단의 예에서, 아교전구세포는 PDGFαR 마커에 대해 포지티브이고, CD9 마커에 대해 포지티브이다. 집단의 예에서, 아교전구세포는 PDGFαR 마커에 대해 포지티브이고, CD9 마커에 대해 네가티브이다. 또한, 아교전구세포의 집단이 제공되고, 여기서, 아교전구세포의 적어도 약 80%는 PDGFαR 마커, CD9 마커, 또는 이들 마커 모두에 대해 포지티브이다.
또한, 수초 관련 장애(예, 저수초화 장애, 이는 백색질형성장애, 리소좀저장질환, 뇌성마비, 또는 뇌실주위 백질연화증, 또는 탈수초화 장애, 예컨대 염증성 또는 유전된 탈수초성 장애를 갖는다)를 앓고 있는 대상의 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은 대상에, 본 명세서에서 교시하거나 그 방법으로 제조된 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 이식하는 것을 포함한다.
희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포주의 제조 방법을 또한 제공한다. 상기 방법은 신경세포 또는 신경전구세포의 집단을 분리하는 단계, 신경세포 또는 신경전구세포 상의 PDGFαR 및/또는 CD9의 존재를 선별하는 단계, 및 상기 세포를 불사화하여 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포주를 제조하는 단계를 포함한다.
세포, 및 본 명세서에서 교시된 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 제조 또는 분리 방법은 아교전구세포 운명을 조절하는 제제를 스크리닝하는 방법에 유용하다. 따라서, 본 명세서에는 아교전구세포 운명을 조절하는 제제를 스크리닝하는 방법이 제공되고, 이 방법은 본 명세서에서 교시된 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단 또는 본 명세서에서 교시된 방법으로 제조된 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 배양하는 것을 포함한다. 배양된 세포는 스크리닝될 제제와 접촉되고, 상기 제제와 접촉된 세포의 운명이 검출된다. 희소돌기아교세포 운명의 증가 또는 감소, 또는 성상세포 운명의 증가 또는 감소는 아교세포 운명을 조절하는 제제를 표시한다.
하나 이상의 방법 또는 조성물의 세부 사항은 첨부되는 도면 및 하기의 설명에 기재되어 있다. 상기 방법 및 조성물의 다른 특징, 목적, 및 이점은 상세한 설명 및 도면, 및 특허청구범위로부터 명확해질 것이다.
도 1은 분리된 태아 인간(임신령: 21주) 피질 조직을 사용한 CD140a/PDGFαR에 대한 유세포분석(Flow Cytometry)이다. 마우스 항-인간(anti-human) CD140a 항체는 태아 인간 피질에서 분리된 세포 집단을 인식했다.
도 2는 태아 인간 피질에서 다양한 임신령에서 PDGFαR+ 세포의 발생률을 보여주는 그래프이다. 실선은 임신령에 따른 PDGFαR 발생률의 선형 회귀를 나타내고(r2=0.57), 점선은 95% 신뢰한계를 보여주며, 이는 대부분의 샘플이 상기 한계 내에 속함을 나타낸다. 통계 검정은 또한 2개의 파라미터가 유의하게 상관됨을 나타내었다(n=15, p=0.0012).
도 3a 및 도 3b는 태아의 발아대, 그 위의 중간대 및 피질에서 PDGFαR 세포가 상대적으로 풍부함을 보여주는 그래프이다. CD140a+ 세포는 초기 제2 3개월기 피질/IZ에서는 드물었으나, 임신령이 증가함에 따라 점차로 증가하였다(n=29)(도 3a). 대조적으로, CD140a 세포의 상대적인 발생률은 제2 3개월기 동안 해부된 발아대(VZ/SVZ)에서 비교적 일정하게 유지되었다(n=10)(도 3b).
도 4a 및 도 4b는 태아 분리물로부터 얻은 CD140a/A2B5/PSA-NCAM 세포분석 데이터를 보여주는 그래프이다. 도 4a는 조합된 MACS 및 FACS 과정으로부터 계산된 6개의 서브분획의 상대적인 분율을 보여준다(n=4, 임신령: 19 내지 22주). 이어서, 각각의 분류물을 T3/0.5% pd-FBS 함유 배지에서 7일 동안 평판배양한 후, 염색하고, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 항체 O4를 계수하였다(도 4b). A2B5 또는 PSA-NCAM 상태에 관계없이 각각의 CD140a+ 분획은 보다 높은 비율의 O4+ 희소돌기아교세포를 나타내었다(n=3 샘플).
도 5a 및 도 5b는 CD140a 분류된 세포가 주로 희소돌기아교세포로 성장하고 PDGF-AA/FGF2에서 전구체로서 유지될 수 있음을 보여주는 그래프이다. 도 5a는 O4-발현 미성숙 희소돌기아교세포의 비율을 시험관내에서 4일째에 계수하였음을 보여준다. CD140a 고갈된 배양물에서 희소돌기아교세포는 거의 발견되지 않았지만, 모든 CD140a+ 세포 중의 약 40%가 희소돌기아교세포로서 발달하였다. 도 5b에 도시된 바와 같이, CD140a 분류된 세포는 PDGF-AA 및 FGF-2(각각 20ng/ml)의 존재하에 7일 동안 배양하였고, 신경세포 직계의 표현형 마커(phenotypic marker)로 염색하였다. 이러한 조건에서, CD140a+ 세포는 A2B5-발현 전구세포로서 유지되고, 자발적인 희소돌기아교세포 분화가 억제되어, O4+ 희소돌기아교세포의 비율은 10% 미만으로 감소되었다. 이에 반해, CD140a- 세포는 주로 βⅢ 튜불린+ 뉴런으로 구성되었다.
도 6은 신생아 쉬버러(shiverer) 마우스의 저수초화된 전뇌로 이식후 8 내지 12주째 인간 CD140a+/ PDGFαR+ 세포 치사의 정량화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 CD140a/PDGFαR 분류된 세포가 콘드로이틴 설페이트 B 및 D 잔기(moiety)를 활발히 생성함을 보여주는 개요도이다.
성인과 태아 공급원 모두로부터의 신경세포 및 신경전구세포는 신경 계통 및 아교세포 계통의 세포를 포함하는 세포의 다양한 집단을 포함한다. 세포의 혼합 집단으로부터 특이적 세포 타입의 비교적 순수한 집단을 분리하기 위한 도전을 입증했다. 이는, 고수율의 특정 세포 타입이 세포 이식물에 대해 바람직할 때, 더 어렵다는 것을 입증했다.
예를 들어, A2B5는 아교전구세포의 초기 마커, 및 그 세포의 분리 수단으로서 이용되었다. A2B5는 GD3 신타아제에 의해 합성된 몇 개의 강글리오사이드 상의 에피토프를 인식한다. 그러나, GD3 신타아제 효소는 양성능력(bipotential) 희소돌기아교세포-성상세포 전구체(progenitor), 미성숙 신경모세포 및 성숙 섬유 성상세포에서 활성이다. 따라서, 제2 단계는 신경세포를 확인 및 제거하기 위해 이용된다. PSA-NCAM+(폴리시알화된 신경세포 접착 분자-포지티브) 신경모세포의 A2B5 분류된 세포를 격감시키기 위한 이중 분류로, 신경세포의 집단에는 아교세포 전구체가 풍부하다. 그러나, 이들 단계는, 희소돌기아교세포 전구체의 비교적 순수한 집단이 필요할 때 풍부한 오염물을 남기는 섬유 성상세포를 제거하지 않는다. 희소돌기아교세포는 중추신경계의 수초화 세포이기 때문에, 희소돌기아교세포 전구체의 비교적 순수한 집단은 수초 질환을 앓고 있는 대상에서의 이식에 유용하다.
세포 집단, 조성물, 및 키트
본 명세서에는 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단이 제공된다. 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포는 희소돌기아교세포 및 성상세포 모두를 임의로 생기게 할 수 있다. 따라서, 상기 기재된 세포 집단은 양성능력 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 포함한다.
집단의 예는 예를 들어, 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 포함하는 적어도 약 80%의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 포함한다. 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포는 임의로 CD9 마커, PDGFαR 마커, 또는 CD9 마커와 PDGFαR 마커 모두에 대해 포지티브이다. 집단의 예에서, 아교전구세포는 CD9 마커에 대해 포지티브이고, CD9 포지티브 세포는 임의로 PDGFαR 마커에 대해 네가티브이다. 집단의 예에서, 아교전구세포는 PDGFαR 마커에 대해 포지티브이고, CD9 마커에 대해 포지티브이다. 집단의 예에서, 아교전구세포는 PDGFαR 마커에 대해 포지티브이고, CD9 마커에 대해 네가티브이다. 또한 아교전구세포의 집단이 제공되고, 여기서, 아교전구세포의 적어도 약 80%는 PDGFαR 마커, CD9 마커, 또는 이들 마커 모두에 대해 포지티브이다.
세포 집단은 비교적으로 다른 세포 타입, 예컨대 신경 계통의 뉴런 또는 세포, 섬유 성상세포, 및 섬유 성상세포 계통의 세포, 및 다능(pluripotential) 줄기세포(예컨대, ES 세포)가 비교적 없을 수 있다(예, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 % 미만 함유). 임의로, 세포 집단의 예는 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 실질적으로 순수한 집단이다.
상기 기재된 집단의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포는 PDGFαR 마커에 대해 포지티브일 수 있다. PDGF 마커는 임의로 PDGFαR 엑토도메인(ectodomain)이다. 하나 이상의 PDGFαR 포지티브 세포를 표시 및/또는 선별하기 위해 이용될 수 있는 PDGFαR 엑토도메인 에피토프의 하나의 예는 CD140a이다. 따라서, PDGFαR 포지티브 세포는 CD140a에 의해 확인될 수 있고, PDGFαR 포지티브 세포의 집단은 CD140a를 이용하여 풍부하게 될 수 있다. 그와 같은 세포를 PDGFαR +/CD140a+로 부를 수 있다.
PDGFαR 마커에 대해 포지티브라는 것은, PDGFαR 특이적 항체, 또는 PDGFαR과 같은 다른 특이적 결합 참여자가 마커에 선택적으로 결합하며, 이로써, PDGFαR 항체 또는 다른 결합 참여자는 세포 분리 및 풍부화 절차, 예컨대 이뮤노패닝(immunopanning)에 이용될 수 있다. PDGFαR은 아교전구세포 및 더 제한된 희소돌기아교세포 전구체에 의해 발현되지만, 성숙 성상세포에서 급격히 하류조절된다. 인간 및 설치류 유전자 발현 분석에 따라, PDGFαR은 A2B5 정의된 전구세포에서 선택적으로 과발현된다.
희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포 집단은 CD9 마커에 대해 포지티브일 수 있다. CD9 마커는 임의로 CD9 엑토도메인이다. CD9 마커에 대해 포지티브라는 것은, CD9 특이적 항체가 CD9 마커에 선택적으로 결합한다는 것을 의미하고, 이로써, CD9 항체 또는 다른 결합 참여자는 세포 분리 또는 풍부화 절차, 예컨대 이뮤노패닝에 이용될 수 있다. CD9에 대해 포지티브인 세포는 또한 PDGFαR에 대해 포지티브일 수 있다. 임의로, PDGFαR에 대해 포지티브인 세포는 CD9에 대해 네가티브이다. 임의로, CD9에 대해 포지티브인 세포는 PDGFαR에 대해 네가티브이다.
임의로, 상기 기재된 집단의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포는 PSA-NCAM 마커, 및/또는 신경 계통의 세포의 다른 마커에 대해 네가티브이고, 하나 이상의 염증성 세포 마커에 대해 네가티브(예, CD11 마커에 대해 네가티브, CD32 마커에 대해 네가티브, 및/또는 CD36 마커에 대해 네가티브, 이들은 미세아교세포의 마커이다)이다. 임의로, 집단의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포는 임의 조합 또는 이들 추가 마커의 서브셋에 대해 네가티브이다. 따라서, 예를 들어, 집단의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포는 이들 추가 마커 중 어느 1개, 2개, 3개 또는 4개에 대해 네가티브일 수 있다.
집단의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포는 A2B5 마커에 대해 포지티브 또는 네가티브일 수 있다. 따라서, 집단은 A2B5 마커의 존재 또는 부재를 기반으로 추가 선택될 수 있다. 따라서, 집단의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포는 A2B5 포지티브, A2B5 네가티브 또는 A2B5 포지티브 및 네가티브 세포의 조합일 수 있다. 집단 중 A2B5 네가티브 세포는 또한 PSA-NCAM 마커, CD11 마커, CD32 마커, CD36 마커, 또는 임의 조합에 대해 네가티브일 수 있다. 유사하게는, A2B5 포지티브 세포는 또한 PSA-NCAM 마커, CD11 마커, CD32 마커, CD36 마커, 또는 임의 조합에 대해 네가티브일 수 있다.
임의로, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 상기 기재된 집단은 신경 조직, 또는 다능 또는 다기능(multipotent) 줄기세포 또는 세포주로부터 유도될 수 있다. 다능의 줄기세포는 다능 줄기세포(IPS 세포)로부터 유도될 수 있다. IPS 세포는 예를 들어 섬유아세포와 같은 분화된 세포로부터 유도된다. (참조, Yu, 2007, Science 21;318(5858):1917-20 및 Takahashi, 2006, Cell, 126;4, 663-676, 이들 모두는 상기에 기재된 방법 및 조성물에 대해 그 전체가 참고로 통합된다). 임의로, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포는 태아 세포로부터 유도된다. 그러나, 세포는 비(non)-태아 조직으로부터 유도될 수 있고, 이 조직은 예를 들어, 성인 신경 조직 또는 비(non)-신경 조직(예, PS 세포의 경우)을 포함한다. 신경 조직은 임의로 뇌, 뇌간 또는 척수(뇌실밑부분, 후각망울, 피질하 백질 부위, 및 태아와 성인 뇌 모두의 대뇌, 및 태아 뇌의 신경절 융기 포함)으로부터 유도된다.
희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 선택된 집단은 희소돌기아교세포의 분화를 야기하는 조건 하에서 임의로 배양될 수 있다. 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단은 성상세포의 분화를 야기하는 조건 하에서 임의 배양될 수 있다. 따라서 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포 집단 중 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 운명은 희소돌기아교세포 또는 성상세포를 형성하도록 정해질 수 있다. 예를 들어, 실험실내 희소돌기아교세포 분화는 무혈청 배지에서의 미토겐(mitogen) 제거 및 T3에 의해 PDGFαR 마커 포지티브 세포로부터 촉진될 수 있다. 실험실내 성상세포 분화는 혈청 및/또는 BMP 노출에 의해 PDGFαR 마커 포지티브 세포로부터 촉진될 수 있다.
희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 상기 기재된 집단은 세포의 총수를 증가시키기 위해 배양시 임의로 확대될 수 있다. 세포는 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 확대를 지지하는 미토겐으로서 PDGF-AA 또는 AB에의 연속 또는 박동성 노출에 의해 확대될 수 있고; 상기 세포는 FGF2, FGF4 , FGF8 및 FGF9를 포함하는 섬유아세포 성장 인자들에 노출될 수 있고, 이 인자들은 아교전구세포의 유사분열 확대를 지지할 수 있지만, 세포의 분화를 성상세포의 혼합 집단 및 희소돌기아교세포로 편향시킬 수 있다. 세포들은 또한 혈소판 격감된 또는 전체 혈청으로 임의 보충될 수 있는 FGF2, PDGF, 및 NT3의 조합으로 보출된 배지에서 확대될 수 있다(참조, Nunes et al. (2003), Identification and isolation of multipotent neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature Medicine 9:239-247; Windrem et al. (2004), Fetal and adult human oligodendrocyte progenitor cell isolates myelinate the congenitally dysmyelinated brain. Nature Medicine 10:93-97, 이들은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 대해 참고로 통합됨).
더욱이, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단은 임의로 불사화될 수 있다. 불사화 세포는 배양시 되풀이하여 나누어지는 세포주를 포함한다. 불사화 세포는 모(parent) 세포의 유전자 조작에 의해 임의로 개발된다. 예로써, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 포함하는 세포의 집단은 인간 텔로머 확장 역전사효소를 인코딩하는 외인성 핵산(hTERT)을 발현시키기 위해 형질도입될 수 있다(참조, Roy et al. (2004), Roy et al. (2004), Telomerase-immortalization of the human fetal spinal cord ventricular zone generates stable lines of lineage-restricted spinal progenitor cells, Nature Biotechnol. 22:297-305; 또한 미국 특허 No. 7,150,989, 표제 "Telomerase-immortalized human neural stem cells and phenotypically-restricted progenitor cells," to Goldman" to Goldman, 이들은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 대해 참고로 통합됨). 인간 텔로머 확장 역전사효소는 세포에서 hTERT의 발현을 이끄는 프로모터에 임의로 작동가능하게 링크된다. 프로모터는 구성요소적으로 발현될 수 있고, 이는 형질도입된 전구세포와 자손 모두, 또는 세포 특이적 패션(fashion)에서의 의미이고, 초기에 형질도입된 세포 집단의 유도체의 서브셋에서의 의미이다.
희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단은 관심있는 다른 단백질을 발현시키기 위해 임의로 유전적으로 변형된다. 예를 들어, 세포는 외인성 표적화 부분(moiety), (예를 들어, 영상화를 위한) 외인성 마커 등을 발현시키기 위해 변형될 수 있다. 집단의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포는 내인성 표적 부분, 마커, 또는 수초 기초 단백질 등을 과발현시키기 위해 임의로 변형될 수 있다.
세포 집단은 임의로 저온보존된다. 생존 세포의 다양한 저온보존 방법은 공지되어 있고 이용될 수 있다(참조, 예, Mazur, 1977, Cyrobiology 14:251-272; Livesey 및 Linner, 1987, Nature 327:255; Linner, et al., 1986, J. Histochem. Cytochem. 34(9):1123-1135; U.S. Pat. No. 4,199,022 to Senkan et al.; U.S. Pat. No. 3,753,357 to Schwartz; U.S. Pat. No. 4,559,298 to Fahy, 이들은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 대해 적어도 참고로 통합됨).
본 명세서에는, 유효량의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포 집단 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 이하에 기재되어 있다.
또한, 본 명세서에는, 본 명세서의 방법의 실행시에 이용될 수 있고, 시약을 포함하는 키트 및 본 명세서에서 가르친 세포 집단을 포함하는 키트가 제공된다. 상기 키트는 개시된 방법의 실시에 필요하거나 유익한 것으로 이해되는 임의의 시약 또는 시약의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 세포 집단, 및 키트를 이용하는데 필요한 완충용액 또는 조성물을 포함할 수 있다. 키트의 다른 예는 키트를 이용하는데 필요한 임의의 완충용액 또는 조성물과 함께 세포 분류 및/또는 검출용 시약을 포함한다. 키트는 또한 희소돌기아교세포 편향된 전구세포, 및 본 명세서에 기재된 방법에 상기 세포를 이용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 교시된 방법으로 제조 또는 분리된 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 제공한다.
희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단의 제조 또는 분리 방법
희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 분리하기 위해 본 명세서에 개시된 방법은 PSA-NCAM 및 CD11의 부재와 함께 PDGFαR 마커의 존재 또는 A2B5의 존재를 선별하는 것에 관한 것이다. 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 분리하기 위해 본 명세서에 개시된 방법은 또한 CD9 마커의 마커를 선별하는 것에 관한 것일 수 있다. 임의로, 상기 방법은 CD9 마커의 마커 및/또는 PDGFαR 마커를 선별하는 것을 포함한다. 상기 방법은 특정 세포 타입(즉, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포)의 고 수율 및/또는 추가 풍부를 제공하기 위해 고안된다. 상기 방법은 임의로 다른 마커에 대한 또는 그 마커에 대항하는 선별을 포함한다.
따라서, 본 명세서에는 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단의 분리 방법이 제공되고, 이 방법은 신경세포 또는 신경전구세포의 집단을 제공하는 단계 및 신경세포 또는 신경전구세포 상의 PDGFαR 마커의 존재를 선별하여 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 분리하는 단계를 포함한다.
또한, 본 명세서에는 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단의 분리 방법이 제공되고, 이 방법은 신경세포 또는 신경전구세포의 집단을 제공하는 단계 및 신경세포 또는 신경전구세포 상의 CD9 마커의 마커를 선별하여 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 분리하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 추가 마커의 존재 또는 부재를 선별하는 것을 임의로 추가로 포함한다. 따라서, 상기 방법은 신경세포 또는 신경전구세포 상의 A2B5의 존재 또는 부재를 선별하는 것을 임의로 포함한다. 상기 방법은 PSA-NCAM의 부재, CD11의 부재, CD32의 부재, 또는 CD36의 부재를 선별하는 것을 임의로 추가로 포함한다.
또 다른 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단의 분리 방법은 신경세포 또는 신경전구세포의 집단을 제공하는 단계, 신경세포 또는 신경전구세포 상의 A2B5의 존재를 선별하는 단계, 신경세포 또는 신경전구세포 상의 PSA-NCAM의 부재를 선별하는 단계, 및 신경세포 또는 신경전구세포 상의 CD11의 부재를 선별하는 단계를 포함하는 몇 개의 선별 단계를 수행하여 A2B5 포지티브, PSA-NCAM 네가티브, 및 CD11 네가티브 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 분리하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 CD32, CD36, 또는 CD32와 CD36 모두의 부재를 선별하는 것을 임의로 추가로 포함한다. 이 방법으로, PDGFαR 마커를 이용하는 단일 단계 방법과 비교하여 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단이 상이하게 되는데, 그 이유는 PDGFαR+ 세포 중 어떤 것은 A2B5-이고, 일부는 포지티브이기 때문이다. 이러한 다중 단계 방법으로 A2B5+ 아집단(subpopulation)이 생긴다.
상기에서 기재된 바와 같이, 본 방법에 이용된 신경세포 또는 신경전구세포는 임의로 신경 조직, 분화된 줄기세포, 줄기세포, 또는 세포주로부터 유도된다. 신경세포 또는 조직 및/또는 신경전구세포 및 조직을 획득하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 예로써, 신경 조직은 생검(biopsy)에 의해 획득될 수 있다. 조직 또는 세포의 공급원은 인간; 사육 동물, 예컨대 고양이 및 개; 가축(예, 소, 말, 돼지, 양, 및 염소); 실험실 동물(예, 마우스, 래빗, 랫트, 및 기니피그(guinea pig)); 비영장류를 포함하는 임의의 포유동물 공급원일 수 있다.
본 명세서에서 교시된 선별 단계는 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 특정 마커, 예컨대 PDGFαR 마커 및/또는 CD9 마커에 대한 선별은 종래의 방법, 예컨대 이뮤노패닝을 이용하여 수행될 수 있다. 선별 방법은 임의로 형광 활성화 세포 분류(FACS), 자기 활성 세포 분류(MACS), 또는 신속하고 효율적인 세포 분류를 허용하는 임의의 다른 방법의 이용을 포함한다. 세포 분류 방법의 예는 예를 들어 미국 특허 No. 6,692,957에 개시되어 있고, 이는 세포 선별 및 분류를 위한 적어도 조성물 및 방법에 대해 적어도 그 전체가 참고로 본 명세서에 통합되어 있다.
일반적으로, 세포 분류 방법은 검출가능 부분을 이용할 수 있다. 검출가능 부분은 임의의 적합한 직접 또는 간접 라벨을 포함하고, 이 라벨은 비제한적으로, 효소, 형광색소, 바이오틴, 발색단, 방사선동위원소, 착색 비드(colored bead), 전기화학, 화학 변형 또는 화학발광 부분을 포함한다. 일반적인 형광 부분은 플루오레세인(fluorescein), 시아닌 염료, 쿠마린(coumarin), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코빌리단백질(phycobiliprotein), 단실(dansyl) 글로라이드, 텍사스 레드(Texas Red), 및 란타나이드 착물 또는 그의 유도체를 포함한다. 자기 세포 분류가 이용될 수 있다.
세포 분류가 수행될 때, 마커는 엑토도메인일 수 있고, 세포 투과 또는 막 파열은 이용되지 않는다. 예로써, PDGFαR 마커 선별 단계는 PDGFαR(예, CD140a)의 엑토도메인을 결합하는 항체 또는 다른 결합 부분을 사용하여 임의로 수행된다. 적합한 항체는 비제한적으로, 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 선택된 마커를 결합할 수 있는 항체 단편(예, F(ab')2, Fab', Fab 단편), 및 단쇄 항체를 포함한다. 다른 결합 참여자는 마커 리간드, 공동인자 등을 포함하고, 이는 마커에 특이적으로 결합한다. 따라서, 수용체인 마커의 경우에, 수용체 리간드 또는 그의 결합부는 검출가능 부분으로서 이용될 수 있다. 항체 및 다른 결합 참여자는 상업적으로 이용가능하거나 당업자에게 이용가능한 기술을 사용하여 만들어 질 수 있다.
당업자는 특이적 마커에 대해 또는 그 마커에 대항하여 어떻게 선별하는지를 이해할 것이다. 따라서, 예로써, 특정 마커에 대해 분류된 세포의 집단은 특정 마커에 대해 포지티브인 세포를 확인하고, 추가 이용 또는 추가 선별 단계을 위해 세포를 보유하는 것을 포함한다. 특이적 마커에 대항하여 분류된 세포의 집단은 특정 마커에 대해 포지티브인 세포를 확인하고 추가 이용 또는 추가 선별 단계를 위해 세포를 배제하는 것을 포함한다.
임의로, 분리 방법은 세포를 불사화하는 것을 추가로 포함한다. 불사화 세포는 반복된 계대(passaging)에 따라 배양시에 나누어질 수 있는 세포주를 포함한다. 불사화 세포는 모(parent) 세포의 유전자 조작에 의해 임의로 개발된다. 예로써, 분리 방법은 신경세포, 신경전구세포, 또는 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 포함하는 그의 임의의 아집단을 변형시키는 것을 추가로 포함하고, 이로써, 세포는 인간 텔로머 확장 역전사효소를 인코딩하는 외인성 핵산을 발현시킨다. 텔로머 확장 역전사효소를 사용하여 전구세포를 불사화하는 물질 및 방법은 미국 특허 No. 7,150,989에 개시되어 있고, 이는 텔로머라제(telomerase) 불사화와 관련된 교시에 대해 적어도 그의 전체가 참고로 본 명세서에 통합된다. 불사화는 방법의 하나 이상의 선별 단계 전 또는 후에 수행될 수 있다.
따라서, 본 명세서에는, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포주의 제조 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 명세서의 방법으로 제조된 신경세포 또는 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 제공하는 단계 및 세포를 불사화하여 세포주를 생산하는 단계를 포함한다. 상기 불사화 단계는 세포에, 프로모터에 작동가능하게 링크된 인간 텔로머 확장 역전사효소를 인코딩하는 핵산 서열을 도입하는 것을 임의로 포함한다. 외인성 핵산의 도입은 바이러스 매개성 형질도입, 전기천공, 바이오리스틱(biolistic) 형질도입, 또는 리포좀 매개성 형질도입을 포함하는 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 바이러스 매개성 형질도입 수단은 레트로바이러스 매개성 형질도입, 아데노(adeno) 연관 바이러스 매개성 형질도입, 렌티바이러스 매개성 형질도입, 아데노바이러스 매개성 형질도입, 및 헤르페스바이러스 매개성 형질도입으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
치료 방법
본 명세서에는, 대상의 수초 관련 장애의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 명세서에서 교시된 방법으로 제조된 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 대상에 이식하거나, 본 명세서에서 교시된 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 이용하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 희소돌기아교세포의 분화를 야기하는 조건 하에서 선택된 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 배양하는 것을 포함할 수 있다. 그 다음, 수득한 분화된 희소돌기아교세포, 또는 그의 서브셋은 수초 관련 장애를 앓고 있는 대상에 이식될 수 있다.
수초 관련 장애는 저수초화 장애 및 탈수초성 장애를 포함한다. 저수초화 장애는 백색질형성장애, 리소좀저장질환, 뇌성마비, 및 뇌실주위 백질연화증을 포함한다. 탈수초성 장애는 염증성 탈수초성 장애, 예컨대 다발성 경화증, 횡단성 척수염, 및 시신경염 및 유전된탈수초성 장애를 포함한다.
자기조직, 동종이계(同種異系) 또는 이종(xenogeneic) 세포는 이식 단계에서 사용될 수 있다. 신경세포 또는 신경전구세포, 및/또는 이로부터 유도된 아교전구세포는 상기에 기재된 바와 같이 다양한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 자기조직 신경세포 또는 신경전구세포는 예를 들어 이식물 수령자의 뇌실밑부분으로부터 채취될 수 있다. 동종이계 세포는 유산된 태아, 미사용 임신 유도된 태아, 또는 장기 제공자로부터 채취될 수 있다. 이종 세포는 돼지, 원숭이, 또는 임의의 다른 적합한 포유동물로부터 채취될 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 이식된 세포는 임의로 불사화된다. 줄기세포 및 분화된 세포의 세포주는 태아 조직 및/또는 신경 조직의 사용을 피하도록 아교전구세포를 유도하기 위해 사용될 수 있다.
CNS는 면역적으로 반응이 일어나지 않는 부위이기 때문에, 이종을 포함하는 이식된 세포는 생존할 수 있고, 임의로, 면역억제성 약물, 또는 면역억제제의 전형적인 처방계획은 치료 방법에 사용되지 않는다. 그러나, 치료 방법은 임의로 면역억제제를 대상에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 면역억제제 및 이의 투여 계획은 당업자에 공지되어 있고, 아자티오프린(Azathioprine), 아자티오프린 나트륨, 시클로스포린(Cyclosporine), 달트로반(Daltroban), 구스페리무스 트리히드로클로라이드(Gusperimus Trihydrochloride), 시롤리무스(Sirolimus), 및 타크롤리무스(Tacrolimus)와 같은 제제를 포함한다. 투약 범위 및 처방계획의 기간은 하기에 따라 변할 수 있다: 치료될 장애; 거부반응의 정도; 사용된 특정 면역억제제의 활성; 대상의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식습관; 투여 시간; 투여 경로; 사용된 특정 면역억제제의 배설 속도; 치료 기간 및 빈도; 및 병용된 약물. 당업자는 면역억제의 허용가능한 투약 및 기간을 결정할 수 있다. 투약 계획은 대상의 상태의 어떤 사용금지사유 또는 변화의 경우에 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.
이식된 희소돌기아교세포 편향된 전구세포 또는 희소돌기아교세포의 수는 수령자의 크기 및 종, 및 수초 생산 또는 교체를 필요로 하는 조직의 부피에 따라 각 이식(예, 주입 부위)에서 약 102 내지 108의 범위일 수 있다. 단일 이식(예, 주입)은 103 내지 105, 104 내지 107, 및 105 내지 108 개의 세포, 또는 이식물 수령 환자에 대해 어떤 전체량의 범위에 이를 수 있다.
세포의 대상에의 전달은 신경계에 직접적인 단일 단계 또는 다중 단계 주입을 포함할 수 있다. 국소 장애, 예컨대 시신경의 탈수초화에 대해, 단일 주입이 사용될 수 있다. 성인 및 태아 희소돌기아교세포 전구체가 광범위한 탈수초성 또는 저수초화 장애에 대해 이식물 수령자의 뇌(Windrem et al., Nature Medicine 10: 93-97) 내에 널리 분산할지라도, 다중 주입 부위는 치료를 최적화하기 위해 수행될 수 있다. 주입은 중추신경계, 예컨대 백색질 트랙(tract), 예컨대 뇌량(예, 전반 및 후반 원기(anlagen) 내로), 척수, 소뇌각(cerebellar peduncle), 대뇌각(cerebral peduncle)의 면적에 임의로 인도된다. 그와 같은 주입은, 임의로 영상화 방법(예,고해상도 MRI 영상화)를 수반하면서 정밀한 국소화 방법, 예컨대 정위기능 수술를 사용하여 일방 또는 쌍방으로 행해질 수 있다. 당업자는, 뇌 영역이 종(species)에 걸쳐 변한다는 것을 인식하지만; 그러나, 당업자는 또한 포유동물 종에 걸친 유사한 뇌 영역을 인식한다.
세포 이식물은 해리된 세포로서 임의로 주입되지만, 또한 비(non)해리된 세포의 국소 배치에 의해 제공될 수 있다. 어느 한 경우에, 세포 이식물은 허용가능한 용액을 임의로 포함한다. 그와 같은 허용가능한 용액은 바람직하지 못한 생물학적 활성 및 오염을 피하는 용액을 포함한다. 적합한 용액은 제형에 등장성을 부여하기 위해 적절한 양의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 용액의 예는 비제한적으로 염수, 링거액, 덱스트로오스 용액, 및 배양 배지를 포함한다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다.
해리된 세포 이식물의 주입은 주입 장치(예, 캐뉼라(cannula), 니들(needle), 또는 튜브)의 유입 경로, 유출 경로 및 이들 모두에 걸쳐 만들어진 유동(streaming) 주입일 수 있다. 자동화는 균일한 유입 및 및 유출 속도 및 주입 속도 및 체적을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
임의로 다초점 전달 전략은 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 그와 같은 다초점 전달 전략은 수령자 중추신경계에 걸쳐 광범위한 및 조밀한 공여 세포 이식(engraftment)을 달성하기 위해 고안된다. 주입 부위는, 회색질 구조를 개재시키는 것으로부터 방해 없이(또한 제한된 방해로) 공여 세포가 주요 뇌 면적, 뇌간, 및 척수 백색질 트랙(tract)으로 이동하는 인접 침윤을 허용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 주입 부위는 전뇌 피질하에 있는, 명확하게는 뇌량의 전반 및 후반 원기(anlagen)에 양방으로 있는, 및 등 부분으로 소뇌각에 있는 다섯 번째 위치에 있는 4개의 위치를 임의로 포함한다.
임의로, 본 명세서에 제공된 치료 방법은 수초재생을 직접 또는 간접으로 평가하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 영상화 기술, 전도 속도, 또는 증상 개선은 이식 후에 임의로 테스트된다.
스크리닝( screening ) 방법
또한, 본 명세서에 교시된 세포 집단 또는 본 명세서에서 교시된 방법으로 제조된 세포를 사용하여 아교전구세포 운명을 조절하는 제제를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 배양하는 단계; 배양된 세포를 스크리닝될 제제와 접촉시키는 단계; 및 제제와 접촉된 세포의 운명을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 희소돌기아교세포 운명의 증가 또는 감소, 또는 성상세포 운명의 증가 또는 감소는 아교세포 운명을 조절하는 제제를 표시한다. 그와 같은 방법으로 확인된 제제는, 예를 들어, 생체내 또는 생체외에서 희소돌기아교세포의 수를 증가시키는 제제를 선별하는데 유용하다. 이들 제제는 대상의 수초 장애를 치료하기 위해 사용되고 이식 전에 이식 조직을 풍부하게 하기 위해 사용된다. 반대로, 성상세포 운명을 감소시키는 제제는, 예를 들어 대상의 신경계의 손상에 따르는 신경교성반흔(glial scarring) 또는 염증성 반응을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
스크리닝 방법은 조절된 아교세포 운명을 갖는 세포의 생존 능력을 평가하는 것을 임의로 포함한다. 본 명세서에서 교시된 생존 능력 및 검출 단계는 하나 이상의 희소돌기아교세포 또는 성상세포 특이적 마커를 검출하는 것을 포함한다. 그와 같은 검출 방법은 당업자에 공지되어 있고, 다양한 절차, 예컨대 FACS 및 면역조직화학을 포함한다.
추가 정의
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 특이적 결합 또는 선택적 결합이란, 단백질, 프로테오글라이칸(proteoglycan), 및 다른 생물제제의 이질적인 집단에서 PDGFαR과 같은 마커의 존재에 결정적인 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지정된 조건 하에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은, 대상에 존재하는 다른 단백질, 프로테오글라이칸, 또는 다른 생물제제에 유의미한 양으로 결합하지 않으면서 특정 마커 또는 마커 단편 또는 그의 변이체에 결합한다.
항체에 대한 선택적 결합은 특정 단백질, 프로테오글라이칸, 또는 그의 변이체, 단편, 또는 단백질 코아(core)에 대한 특이성을 위해 선택된 항체를 사용할 수 있다. 다양한 면역분석 포맷(format)은 특정 단백질, 프로테오글라이칸, 또는 그의 변이체, 단편, 또는 단백질 코아와 선택적으로 결합하는 항체를 선별하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 고상(solid-phase) ELISA 면역분석은 단백질, 프로테오글라이칸, 또는 그의 변이체, 단편, 또는 단백질 코아와 선택적 면역반응인 항체를 선별하기 위해 일상적으로 사용된다. 참조, 선택적 결합을 측정하기 위해 사용된 면역 분석 포맷 및 조건의 기술에 대한 Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988). 모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들어 하기에 의해 측정될 수 있다: Scatchard analysis of Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980).
신경세포 및 신경전구세포는 신경계에서 발견된 세포들 또는 신경 조직을 개발하거나 개발할 수 있는 세포들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 신경세포 또는 신경전구세포는 태아 또는 비(non)-태아 뇌 또는 척수로부터 유도된 세포를 포함한다. 그와 같은 신경세포 또는 신경전구세포는 뉴런, 줄기세포, 아교세포, 또는 신경 또는 아교세포 계통의 세포를 포함하는 세포의 해리된 집단일 수 있다. 신경세포는 당분야의 기술을 사용하여, 분화된, 비(non)-신경세포, 예, 섬유아세포로부터 임의로 유도된다.
실질적으로 순수한 세포의 집단이란, 세포가 세포 집단의 적어도 약 95%를 구성하는 선택된 표현형(예, 아교전구세포)을 갖는 것을 의미한다. 적어도 약 95%란, 세포 집단의 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%를 포함하는 것을 의미한다.
값이 근사치로서 표현될 때, 선행사 약의 사용에 의해, 특정 값이 또한 개시된다. 각 범위의 종말점(endpoint)은 다른 종말점과 관련하여 그리고 다른 종말점에 독립적으로 유의적이다. 더욱이, 특정 값이 본 명세서에 명백하게 개시된 경우, 그 값, 및 약 그 값은, 명백하게 언급되지 않을지라도 개시된다. 예를 들어, 값 10이 명백하게 개시된다면, 그때, 약 10이 또한 개시된다. 값이 명백하게 개시될 때, 그 값 이하, 그 값 이상 및 값들 사이의 가능한 범위가 또한 개시된다. 예를 들어, 값 10이 개시되면, 10 이하 및 10 이상이 또한 개시된다. 명세서 전체를 통해, 데이터는 수많은 상이한 포맷으로 제공되고 이들 데이터는 종말점 및 개시점, 및 데이터 점들의 임의 조합의 범위를 나타내는 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 점 10 및 특정 데이터 점 15가 개시되면, 10 및 15 초과, 이상, 미만 및 이하는 10 내지 15의 어떤 범위로서 개시되는 것으로 생각된다.
명세서에 전체에 사용된 임의의 또는 임의로란, 나중에 기재된 사건 또는 상황이 일어날 수 있지만 그렇지 않을 수 있고, 그 기재는 상기 사건 또는 상황이 일어나는 예 및 일어나지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 검출가능 부분은 마커와 그의 결합 부분 사이의 상호작용을 검출하여 마커의 존재를 확인하기 위한 임의의 수단이다. 상기 검출가능 부분은 다양한 검출 수단을 사용하여 검출될 수 있다. 검출가능 부분의 검출은 직접적일 수 있고, 단, 검출가능 부분은 예를 들어, 형광색소의 경우에서와 같이 자체 검출가능하다. 대안적으로, 검출가능 부분의 검출은 간접적일 수 있다. 후자의 경우에, 제2 또는 제3 부분은 검출가능 부분과 반응 또는 결합한다. 예를 들어, 마커를 결합하는 항체는, 직접 검출가능 부분을 갖는 제2 항체가 특이적으로 결합하는 간접 검출가능 부분으로서 도움이 될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 치료하는 또는 치료는 반드시 완전한 치유를 의미하는 것은 아니다. 근원적인 질환의 하나 이상의 증상이 감소되거/되거나 증상을 야기하는 하나 이상의 근원적인 세포, 생리적인 또는 생화학적 원인 또는 메가니즘이 감소된다는 것을 또한 의미할 수 있다. 본 문맥에서 사용된 감소된이란 질환의 분자적 상태 또는 질환의 생리적 상태를 포함하는 질환의 상태에 대한 것을 의미하는 것으로 이해된다.
개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있고, 그와 함께 사용될 수 있으며 그의 제조에 사용될 수 있고 또는 그의 생성물인 물질, 조성물, 및 성분이 개시된다. 이들 및 다른 물질이 본 명세서에 개시되어 있고, 이들 물질의 조합, 서브셋, 상호작용, 그룹 등이 개시될 때, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별 및 집합적 조합 및 변경의 특정 관련이 명백하게 개시될 수 없지만, 각각은 명확하게 숙고되고 본 명세서에 기재되어 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 세포 집단 또는 치료 계획의 특정 변경이 개시되고 논의되며, 세포 집단 또는 처방계획에 대해 만들어질 수 있는 수많은 변경이 논의된다면, 세포 집단 및 처방계획의 조합 및 교환 각각 및 모든 것은, 명확히 반대로 표시되지 않으면, 명확히 고려된다. 유사하게는, 이들의 어떤 서브셋 또는 조합은 또한 명확히 고려되고 개시된다.
실시예
실시예 1: 희소돌기아교세포 편향된 전구세포에 대한 마커로서 PDGF αR의 확인
희소돌기아교세포 편향된 전구세포를 분리하기 위해 먼저 필요한 다단계 분리 공정을 피하기 위해, 단일 마커를 확인하였다. 먼저, 임신령 18 내지 21주의 유산된 태아로부터 유도된, 인간 태아 피질 하부/피질 분리물을 항-CD140a인 PDGFαR 단백질의 에피토프(epitope)로 표지하였다. 이들 분리물의 FACS는 분류된 세포의 평균 3.5%를 CD140a로서 회수하였다(도 1). GeneCard® 미세유동 어레이(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하는 멀티플렉스 정량 PCR로, 이들 세포가 양성능력 교세포 및 희소돌기아교세포 전구세포 둘 다의 고도로 과발현된 마커이고 신경세포, 성상세포 및 줄기세포 유전자에서 고갈됨을 확인하였다.
배양하는 경우, 이들 세포는 이들이 노출되는 배양 조건 및 성장 인자 보충물에 따라 희소돌기아교세포 또는 성상세포를 발생시켰다. 놀랍게도, 이들 분리물로부터 생성된 거의 모든 희소돌기아교세포는 PDGFαR 분류된 풀(pool)로부터 유도되었다. PDGFαR+ 세포가 고갈된, 매치된 제제는 어떤 조건하에서도 인식가능한 수의 O4 정의된 희소돌기아교세포를 생성하지 못했다. 선행 PDGFαR 기반 MACS에 의해 부여된 O4+ 희소돌기아교세포는 15배 이상 절대적으로 풍부하고, PDGFαR 고갈된 배양물에서 확인된 소수의 희소돌기아교세포는, 명목상 MACS 고갈된 분획에서 벗어날 것으로 예상될 수 있었던, 잘못된 네가티브 PDGFαR+ 세포 발생률에 속했다. 그 다음, 2색 FACS는 A2B5+PDGFαR- 세포가 A2B5+PDGFαR+ 세포보다 거의 6배 풍부하지만, 거의 모든 O4-생성 세포는 A2B5+PDGFαR+ 분획으로 분리됨을 알려주었다. 따라서, A2B5는 아교전구세포의 분획을 풍부하게 하는 것으로 검토될 수 있지만, 이의 유용성은 PDGFαR+ 세포의 유의한 소집단화를 보호하는 기능인 것으로 보이고, PDGFαR+ 세포 자체가 사실상 보다 큰 집단의 희소돌기아교세포 적격인 아교전구세포의 전체 풀을 차지한다.
이에 근거하여, 태아 인간 전뇌 조직으로부터 유도된 PDGFαR+ 세포의 단일 항원 분류된 분리물은 신경 표현형을 오염시키지 않는 희소돌기아교세포 적격 아교전구세포의 분리된 집단을 포함하는 것으로 결론지어진다. 이들 세포는 이미 기재된 어떠한 인간 세포 벡터보다도 더 예측가능하고 높은 효율의 희소돌기아교세포 분화를 제공한다. 예를 들면, 임신령 18 내지 21주의 피질 하부/피질 조직으로부터 다수의 PDGFαR 분류된 아교전구세포가 분리되었다(도 2). 이는 PDGFαR 정의된 전구체의 실질적인 확대 집단을 포함하는 연령 범위이다.
방법
PDGF αR 분리용으로 사용된 항체: 항-CD140a 마우스 모노클로날(monoclonal), IgG2a, 클론 알파R1(LaRochelle et al. (1993) Cell Growth Differ. 4:547-53)을 사용하였다. 이러한 항체는 전장 발현 플라스미드(Matsui et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 86:8314-18)를 사용하여 세포를 형질전환시켜 제조하고, 이어서 하이브리도마(hybridoma)를 제조하는 마우스를 면역시키는 데 사용하였다. 유세포분석 및 FACS를 위해서, 홍조소(phycoerythrin)(PE)-콘쥬게이팅된 항-CD140a(BD Cat No. 556002; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 0.25㎍ 정제된 Ab/20㎕/백만 세포로 사용하였다. 자기 세포 분류(MACS)를 위해서, 콘쥬게이팅되지 않은 항-CD140a를 0.21㎍ 정제된 Ab/0.84㎕/백만 세포(BD Cat No. 556001; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)로 사용하였다.
분석 방법: 태아 세포를 전방 및 측방 산란기 영역 측정에 따라 게이팅(gating)한 후, 이중선 사건을 배제하기 위해서 펄스 높이 및 폭에 대해 게이팅하였다. CD140a-PE 포지티브 사건을 488nm에서의 여기에 따라서 및 530/30 및 575/26 밴드패스 필터의 방출 측정을 사용하여 측정하였다. 530/30 자가형광 신호에 비해 증가된 575/26 신호를 측정함으로써 특정 PE 형광을 측정하였다. IgG2a-PE 항체를 사용하는, 매치된 대조군을 사용하여 포지티브 및 네가티브 게이트를 설정하였다.
FACS 예: 도 1은 CD140a/PDGFαR 세포분석을 위한 대표적인 유세포분석을 보여준다. 임신령 21주의 태아 피질 조직을 분리하고, 분리한 지 24시간 후에 CD140a 항체를 사용하여 염색하였다. 게이팅된 세포의 3.8%가 CD140a/PDGFαR에 대해 양성이었다. 분류를 위해 도시된 이러한 게이팅 방식을 사용하여, 생성된 세포 집단은 IgG2a 대조 염색에 의해 측정된 바와 같이 약 99%를 초과한다.
PDGF αR 세포는 임신령 15주부터 태아 피질에 존재하고 발달에 따라 보다 풍부해진다 : PDGFαR/CD140a 세포의 발생률을, 15주 내지 22주된 15개의 태아 뇌로부터의 피질 분리물에서 유세포분석기에 의해 측정하였다. 도 1B를 참조한다. 임신령에 따른 PDGFαR 발생률의 선형 회귀를 측정하였다(r2=0.57). 통계학적 검정은 2개의 파라미터가 유의하게 상관됨을 추가로 보여준다(n=15, p=0.0012). 이러한 값을 위해 사용된 게이팅 방식은 모든 PDGFαR 포지티브 사건을 포함하고, 위에서 보여준 분류 게이트와 다를 수 있다. 함께 취할 경우, 이들 데이터는 PDGFαR의 발생률이 태아 인간 피질에서 임신령에 따라 증가함을 나타낸다.
PDGF αR 세포는 또한 태아 뇌실, 척수, 시상 및 뇌간으로부터도 분리할 수 있다: 인간 PDGFαR 발현 세포는 제2 3개월기 태아 뇌의 신경축 전체에 걸쳐 발견되었다. 태아 피질 이외에, PDGFαR+ 세포는 뇌실(1.1%, n=3, 17 내지 18주), 중뇌(3.8%, n=l, 16.2주), 후뇌(1.2%, n=1, 16.2주) 및 척수(4.3%, n=1, 17주)의 분리물에서 발견되었다.
A2B5 또는 PSA - NCAM 의 발현은 PDGF αR 발현과 서로 관련되지 않는다: 인간뇌실은 A2B5+/PSA-NCAM 표현형에 의해 정의된 아교 전구체 집단을 포함한다. 이들 세포는 저수초화 쉬버러 마우스로 이식시 매우 광범위한 양의 수초화를 일으킨다(Windrem et al., 2004, Nat Med 10(1):93-7). PDGFαR 정의된 추정 OPC를 A2B5+/PSA-NCAM 세포 집단으로 제한할지를 평가하기 위해서, PSA-NCAM에 대해 먼저 자기적인 분류를 실시하고, PSA-NCAM 포지티브 분획 및 네가티브 분획 둘 모두를 수집하고, 24시간 동안 회수하도록 하였다. PSA-NCAM-분획에서, A2B5 및 PDGFαR에 대해 이중 유세포분석 및 FACS를 실시하였다. PSA-NCAM 및 A2B5 둘 모두 마우스 IgM 항체에 의해 인식되기 때문에, PSA-NCAM+ 분획은 PDGFαR 발현에만 근거하여 수행하였다. 동형 및 형광 마이너스 원(Fluorescence minus one; FMO) 대조군 둘 모두를 사용하여, PDGFαR-발현 세포는 어떠한 특이성 A2B5 또는 PSA-NCAM 정의된 표현형으로도 제한되지 않는 것으로 밝혀졌다(표 1).
[표 1]
Figure pct00001
A2B5 및 PSA-NCAM 분류된 집단 중 PDGFαR+ 세포의 붕괴. 전체 세포 집단을 각각의 풀의 상대적인 빈도의 상대적인 곱으로부터 계산하였다(n=4, 임신령 19 내지 22주).
분류 후 대부분의 세포를 PSA-NCAM+/PDGFαR-(54.9±8.1%)로 정의하고; 이들은 전체 세포 중 절발 이상을 차지하였다. 그 다음으로 가장 풍부한 집단은 3개의 마커(PSA-NCAM/A2B5/PDGFαR; 26.0±5.1%) 중 어느 하나로도 표지되지 않은 세포였다. 이들 풍부한 풀과 대조적으로, PDGFαR+ 세포는 채점된 총 세포의 6.2%만을 차지했다.
분류된 집단의 표현형을 결정하기 위해서, 세포를 분류 후 평판배양하여, 0.5% 혈소판 고갈된 혈청(pdFBS) 및 갑상선 호르몬(T3)이 보충된 기본 배지에서 저밀도로 희소돌기아교세포 분화를 촉진시켰다. 평판배양한지 7일 후, 배양물을 염색하고, 주요 신경 표현형, 뉴런, 희소돌기아교세포 및 성상세포를 계수하였다(표 2).
[표 2]
Figure pct00002
3중 분류된(±PDGFαR/A2B5/PSA-NCAM) 세포, 7 DIV의 표현형 특성 확인. FACS 직후, 세포를 기질에 평판배양하고, 기본 배지(DMEM/F12/N2 + T3 및 0.5% pd-FBS)에서 7일 동안 배향하였다. 그 다음, 세포를 분화된 성상세포(GFAP), 희소돌기아교세포(O4) 및 뉴런(TuJ1)의 마커로 염색하였다.
이미 기재한 바와 같이(Windrem et al. (2004) Nature Medicine 10: 93-97), TuJ1/bⅢ-튜불린-포지티브 미성숙 뉴런의 비율은 PSA-NCAM+PDGFαR-분획(41%, n=1)에서 가장 높았다. GFAP+성상세포는 모든 집단에서 비교적 풍부하지만, PSA-NCAM-PDGFαR-A2B5+ 및 PSA-NCAM-PDGFαR-A2B5-의 거의 대부분은 성상세포이며 75%(n=1)보다 크다. A2B5+/PSA-NCAM-/PDGFαR+ 세포보다 A2B5+/PSA-NCAM-/PDGFαR- 세포에 2배 많은 성상세포가 존재하였다.
분류된 세포의 O4+ 희소돌기아교세포 생성 능력은 A2B5 또는 PSA-NCAM 표현형에 상관없이 3개의 PDGFαR+ 분획으로 거의 전적으로 제한되었다. PDGFαR-네가티브 분획보다 PDGFαR-포지티브 분획에 O4+ 세포가 10배 초과 비율(%)로 존재하였다(O4%, PDGFαR+ 대 PDGFαR- 양측 t-검정, df=4, p=0.0098). A2B5 및 PSA-NCAM 둘 모두는 FACS 후 상대적인 O4 생성도를 유의하게 증가시키거나 격감시키지 못했다.
PDGF αR 분류된 세포는 시험관내에서 희소돌기아교세포 및 성상세포를 생성시킨다: 분류된 PDGFαR 세포를 유사분열 촉진 조건, PDGF-AA/FGF-2에서 저밀도(5×l05/ml)로 배양하여, 확대시키고, 희소돌기아교세포 또는 성상세포로서의 자발적인 아교세포 분화도를 측정하였다. 5 내지 7일까지, 정교하고 미세한 공정을 갖는 소 세포 및 편평한 성상세포 유사 세포가 출현하였다. 이들 세포를 7일째에 아교 전구체(A2B5), 미성숙 희소돌기아교세포(O4) 및 성상세포(GFAP)에 대한 표현형 마커로 염색하였다. 대부분의 세포는 전구체로서 잔류하였고, 47.4±11.0% 세포는 전구체 항원 A2B5를 발현했다(n=5 태아 샘플, SE). 이러한 조건에서의 자발적인 희소돌기아교세포 분화율은 7일째에 4.8±1.5% O4+ 세포로 비교적 낮았다(n=7). 또한, 소수의 GFAP+ 성상세포(4%, n=1)만이 생성되었다.
FGF 회수 및 T3의 부가로 인해 상당한 O4+ 희소돌기아교세포 분화를 유도하였고, 17.4±3.6% 세포가 7일째에 O4+였다(p=0.023, Welch 보정된 비대응 t-검정(unpaired t-test), df=5). A2B5-발현 전구체로서 잔류하는 세포의 수는 FGF/PDGF에 대해 58.7±15.4%(n=3)로부터 40.0±14.0%(n=4)로 18% 감소하였다. 분류 후 혈청을 첨가함으로써 GFAP+ 성상세포 분화를 유도하였다. 0.5%의 낮은 혈청에 노출된 배양물에서, 성상세포 표현형이 4%로부터 28%(n=1)로 7배 증가하였다.
인간 태아 피질로부터의 희소돌기아교세포 생성은 PDGF αR+ 전구체로 제한되었다: PDGFαR 분류된 전구체를 T3를 함유하는 성장 인자 비함유 배지에서 배양하는 경우, 시험관내에서 희소돌기아교세포 분화가 얻어지고; 37.63±6.5%의 세포가 시험관내에서 4일째에 조기 희소돌기아교세포 마커 O4+(n=8)를 발현하였다. FACS 및 MACS 분리된 세포 사이에 유의적인 차는 없었다(FACS -40.8% 대 MACS - 32.3%, df=6, p=0.57).
소수의 PDGFαR 네가티브 세포는 사용되는 배양 조건에 상관없이 분류 후 희소돌기아교세포를 생성시켰다. PDGF/FGF의 유사분열 조건에서, 0.4±0.2% 세포는 시험관내에서 7일째에 O4를 발현하였다(n=7). 대부분의 PDGFαR- 세포는 TuJl+ 뉴런(84%, n=1) 또는 A2B5+ 전구체(20%, n=1)였다. 10% 이하의 다양한 양의 혈청 또는 IGF를 부가하여도 O4 발현 세포의 비율(%)은 유의하게 증가하지 않았다. 또한, PDGFαR- 세포를 PDGFαR+ 세포로부터 희소돌기아교세포 유도에 최적인 성장 인자 비함유 조건에서 배양하는 경우, 매우 소수의 세포가 4일째에 O4를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 총 비율(%)은, 7개의 분류된 태아 샘플로부터 계수된 1805개 중에서 발견된 3개의 O4 포지티브 세포의 경우에만, 1% 훨씬 미만이었다.
실시예 2: A2B5/ PSA - NCAM / CD11 세포 분류 전략
이중 면역자기(immunomagnetic) 분류법을 사용하여 분리된 조직으로부터 아교전구세포를 분리하였다. 분리 당일, 세포를 마우스 항-PSA-NCAM(Chemicon, Bellerica, MA)와 함께 1:100로 배양하고, 마우스 항-CD11와 배양한 후, 세척하고, 마이크로비드 표지된 래트 항-마우스 IgM(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)으로 표지하고, MACS 고갈에 의해 제거하였다. 잔여 PSA-NCAM-/CD11-세포를 MAb A2B5 상청액(클론 105; ATCC, Manassas, VA)과 함께 1:1로 20분 동안 배양한 후, 세척하고, 마이크로비드 표지된 래트 항-마우스 IgM(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)로 표지하였다. 모든 배양은 얼음 위에서 실시된다(참조: Keyoung et al. (2001), Specific identification, selection and extraction of neural stem cells from the fetal human brain, Nature Biotechnology 19: 843-850; Roy et al. (2000), In vitro neurogenesis by progenitor cells isolated from the adult human hippocampus, Nature Med. 6: 271-277).
이어서, 문헌(참조: Nunes et al. (2003), Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain, Nature Medicine 9: 439-447)에 기재된 바와 같이, A2B5+ 세포(MACS; Miltenyi, Auburn, CA)의 자기적인 분리를 실시하였다. 결합된 세포를 용출시켜, 매우 풍부한 A2B5+/PSA-NCAM-/CD11- 세포 집단을 수득하였다. 분류 후, 세포를 시험관내에서 1 내지 2일 동안 20ng/ml bFGF를 갖는 DMEM/F12/N1에서 유지시킨 후, 냉동시키고, 액체 질소 속에서 7% DMSO/93% FBS 중의 2×106 세포/ml로 저장하였다.
실시예 3: 선천성 백색질이영양증의 세포 치료 구제
방법
세포: 문헌(참조: Windrem et al., 2004 Nature Medicine 10: 93-97)에 기재된 바와 같이, 유산시 수득된 제2 3개월기 인간 태아(임신령: 19 내지 22주)로부터 태아 OPC를 추출하였다. 전뇌 뇌실/뇌실하구역(subventricular zone)을 잔여 뇌 실질조직으로부터 절개하고, 샘플을 얼음 상에서 냉각시키고, 잘게 썬 샘플을 문헌(참조: Keyoung et al., 2001)에 기재된 바와 같이 파파인/DNAse를 사용하여 추출 3시간 이내에 분리하였다. 분리물을 20ng/ml FGF를 갖는 DMEM/F12/N1의 최소 배지에서 밤새 유지시켰다. 총 5개의 조직 샘플(1: 임신령 19주, 1: 임신령 20주, 3: 임신령 22주)을 본 조사에 사용하였고, 모두는 염색체 정상 태아 공여체로부터 수득하였다.
분류: 분리된 조직으로부터 이중 면역 자기 분류법을 사용하여 아교전구세포를 분리하였다. 분리 당일, 세포를 마우스 항-PSA-NCAM(Chemicon, Bellerica, MA)와 함께 1:100으로 배양한 후, 세척하고, 마이크로비드 표지된 래트 항-마우스 IgM(Miltenyi, Auburn, CA)로 표지하고, MACS 고갈에 의해 제거하였다. 그 다음, 잔여 PSA-NCAM- 세포를 MAb A2B5 상청액(클론 105; ATCC, Manassas, VA)과 함께 1:1로 20분 동안 배양하고, 세척한 후, 마이크로비드 표지된 래트 항-마우스 IgM(Miltenyi, Auburn, CA)로 표지하였다. 모든 배양은 얼음 위에서 실시되었다. 이어서, 문헌(참조: Nunes et al., 2003, Nat Med. 9(4): 439-47)에 기재된 바와 같이, A2B5+ 세포(MACS; Miltenyi, Auburn, CA)의 자기적 분리를 실시하였다. 결합된 세포를 용출시켜, 매우 풍부한 A2B5+/PSA-NCAM- 세포 집단을 수득하였다. 분류 후, 세포를 시험관내에서 1 내지 2일 동안 20ng/ml bFGF를 갖는 DMEM/F12/N1 속에서 유지시키고, 냉동시킨 후, 7% DMSO/93% FBS 중의 2×106 세포/ml로 액체 질소 속에 저장하였다.
이식 및 관리: 동종 쉬버러를 동종 rag2 비함유 면역결핍 마우스(Shinkai et al., 1992)에 교배시켜, shi/shi×rag2-/- 수초 결핍, 면역결핍 마우스의 계통(line)을 생성하였다. 상기 계통의 신생 마우스를 5개의 주사 부위에 걸쳐 분산된 총 300,000개 공여 세포를 사용하여 출생한 지 하루 이내에 이식하였다. 상기 신생 마우스를 먼저 세포 전달을 위해 저온 마취시켰다. 0.5㎕ HBSS 중의 5×104개의 공여 세포를 전뇌 피질하부, 구체적으로 뇌량 양측의 전방 및 후방 안라젠(anlagen)으로 4부위 각각에서 주입하였다. 이러한 주입에 의해 신생 마우스의 중량/크기(1 내지 1.5g으로 다양함)에 따라 1.0 내지 1.2mm 깊이로 복부로 전달되었다. 1㎕ 중의 105개의 세포의 15회째 주입은 소뇌각으로 척추로 전달하여 주요 소뇌 및 척추 뇌간 관(tract)으로 접근시켰다. 모든 세포를, 두개골을 통해 추정되는 표적 부위로 직접 삽입된, 빨아올린 유리 피펫을 통해 주입하였다. 21일에 젖을 뗄 때까지 신생 마우스를 이들의 어미에게 되돌려주고, 이때, 각각의 새끼를 풍부해진 개별 우리로 이동시켰다.
생존률 분석 및 통계: 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석법을 사용하여, 문헌(참조: Hosmer and Lemeshow, 1999, Applied Survival Analysis (New York, John Wiley and Sons))에 기재된 바와 같이, 이식된 마우스 및 대조군 마우스의 상이한 생존률을 평가하였다. 염수 주입된 마우스와 비처리 마우스 사이에는 생존률 차이가 발견되지 않았고, 따라서 두 집단을 GPC 이식된 마우스와의 카플란-마이어 비교용 단일 대조군으로서 합하였다.
GraphPad Prism®(v4.0c for Macintosh® GraphPad Software, San Diego, CA)을 사용하여 분산 분석(Analyses of variance; ANOVA)을 실시하였다.
면역표지: 마우스 항-인간 핵, 클론 235-1을 1:100으로 사용하여 인간 세포를 확인하였다(MAB1281, Millipore, Billerica, MA). 수초 염기성 단백질(Myelin basic protein)을 래트 항-MBP로 1:25로 표지하고(Ab7349, Abcam, Cambridge MA), 축삭(axon)은 마우스 항-신경섬유 칵테일로 1:1000으로 표지하였다(SMI-311 및 SMI-312, Covance, Princeton, NJ). Caspr, Nav1.6 및 Kv1.2에 대한 모노클로날 항체를 각각 1:600, 1:200 및 1:200으로 사용하고, NeuroMab(Davis, CA)으로부터 입수하였다. 래빗 항-Caspr 및 항-βIV 스펙트린을, 문헌(참조: Rasband and Trimmer, 2001, Developmental clustering of ion channels at and near the node of Ranvier. Dev Biol 236: 5-16; Yang et al., 2007, βIV spectrin is recruited to axon initial segments and nodes of Ranvier by ankyrinG, J Cell Biol 176: 509-519)에 기재된 바와 같이 생성시키는 한편, 래빗 항-Caspr2는 Millipore로부터 입수하였다. 래빗 항-olig2는 Abcam(Cambridge, MA)(Ab33427)으로부터 입수하였고, 1:1,500으로 사용하였다. Alexa Fluor® 2차 항체, 고트(goat) 항-마우스, 래트 및 래빗 488, 568, 594 및 647을 1:400으로 사용하였다(Invitrogen, Carlsbad, CA).
수초화된 축삭 계수: 척수 경부의 균일한 랜덤 시상 단편 및 뇌량의 관상 단편을 둘 모두 신경섬유 및 MBP 염색용으로 선택하고; 척수 샘플에서, 가장 중간 단편을 수초화된 숙주 축삭의 비율(%)에 대해 분석하였다. 0.1㎛ 간격으로 취한 10개의 중첩된 광학 슬라이스의 1㎛ 적층물(Olympus FluoView® 300; Olympus Optical, Melville, NY)을, 입구에서 시작하여 말단으로 진행하면서, 척주(dorsal column)에서 3개 시야 각각을 위해 제조하였다. 3개의 평행한 등거리 라인을 축삭에 대해 수직으로 이미지 상에 놓았다. 축삭을 라인들과의 교차점에서 수초화되거나(양측에서 수초 염기성 단백질(MBP)에 밀접되거나) 수초화되지 않은 것으로 채점했다. 이어서, 상기 과정을 뇌량의 관상 절단된 샘플에 대해 반복하였다.
공여 세포의 균형잡힌 표시. 수용체 백색질 중의 인간 세포의 비율(%)을 이식 후 시간의 함수로서 평가하였다. 랜덤하게 개시되고 균일하게 샘플링된 뇌의 시상 단편을 인간 핵 및 DAPI(Vector Labs, Burlingame, CA)에 대해 표지하였다. 뇌량, 술(fimbria) 및 소뇌 백색질의 4 내지 6개 단편(선택된 범위의 단편에서 구조의 지속성에 좌우)을 계수하고, 데이터를 입력하고 BioQuant 이미지 분석(Nashville, TN)을 사용하여 재구성하였다. 이들 14㎛ 단편의 백색질 영역에서 모든 인간 핵 및 DAPI-표지된 세포를 계수하였다.
전자 현미경: 1년에 걸쳐 생존한 4마리의 마우스를 HBSS로 경심 관류시킨 후, 인산염 완충액(수크로스-PB) 중의 0.25% 글루타르알데히드 및 6% 수크로스를 갖는 4% 파라포름알데히드로 관류시켰다. 각각의 뇌의 한쪽 반구 및 각각의 척수의 종방향 반쪽을 전자 현미경용 수크로스-PB 중의 2% 파라포름알데히드, 2.5% 글루타르알데히드에 후고정시키고; 각각의 뇌 및 척수의 나머지 반쪽을 면역조직화학용 수크로스-PB 중의 4% 파라포름알데히드에 후고정시켰다. 전자 현미경용으로 사용된 조직 샘플을 오스뮴산으로 염색하고, 에탄올에서 탈수시킨 후, 에폰(Epon)에 포매하였다. PowerTome® X Ultramicrotome(RMC, 제조원: Boeckeler, Tucson, AZ)을 사용하여 초박편으로 절단하였다. 초박편을 폼바(formvar) 피복된 구리 1홀 그리드 상에 수집하고, 리드 시트레이트 및 우라닐 아세테이트로 뚜렷하게 한 후, JEOL(Tokyo, Japan) 100CX 투과 전자 현미경으로 시험하였다.
발작 계수: 카메라가 천장에 매봉된 멸균 플렉시글래스 우리에 마우스를 넣고(Pheno Typer, Noldus, Wageningen, the Netherlands), 밤새 자유롭게 내버려두고, 그 동안 이들의 움직임을 적외선으로 기록하였다. 8시간 비디오테이프 각각으로부터 6개의 중복되지 않는 반시간 비디오 단편을 램덤하게 선택하는데, 초기 3시간 단편을 배제하여 새로운 환경의 영향을 감소시켰다. 채점된 각각의 마우스당 2개의 단편을 마우스 연령 및 처리에 대해 모르는 3명의 관찰자 각각에게 양도하였다. 관찰자는 각각의 마우스의 발작을 기록하고 시간을 재었고, 발작은 마우스가 측면으로 넘어지고 굳은, 통상적으로 강직 자세를 나타내는, 전형적으로 몸통 및 팔다리의 간헐적 경련성 굽힘-신장에 의해 악화되는 경우로 정의된다. 마우스가 처음으로 똑바로 움직이는 때에 종결되는 것으로 발작 시간을 잰다. 시간당 발작 횟수 및 시간당 총 발작 시간을 채점하였다.
경뇌량 전달: 마우스를 케타민(60mg/kg, i.p.) 및 크실라진(10mg/kg, i.p.)으로 마취시키고, 기관절개를 통해 관을 삽입한 후, 인공호흡기(SAR-830, CWE, Inc., Ardmore, PA)로 인공호흡시켰다. 평균 동맥 혈압 및 혈액 가스를 모니터링하기 위해 대퇴부 동맥에 카테터를 꽂고, 워밍 블랭킷(warming blanket)(Harvard Apparatus, Holliston, MA)에 의해 체온을 37℃에서 유지시켰다. 아크릴성 시멘트로 두개골에 부착시킨 맞춤형 금속 프레임으로 마우스를 고정시켰다. 직경이 각각 3mm인 2개의 드릴 구멍을, 중심이 브레그마(bregma) 뒤로 1 내지 2mm 및 중간선으로부터 2 내지 3mm에 있도록 좌우 양측에 만든다. 경뇌막을 제거하고, 아가로스(염수 중 0.75%)를 개두술 부위로 부어 넣은 후, 0.17mm 두께의 유리 오버슬립(coverslip)으로 밀폐시킨다. 이어서, 헤드 프레임을 현미경 단계에 연결된 제2 프레임에 부착시켰다. 경뇌량 전기 자극에 의해 발생된 국소 장 전위(local field potentials; LFP)를 기록하기 위해서, 2M NaCl 용액으로 충전된 유리 마이크로피펫을, 브레그마 뒤로 1.5mm 및 중간선으로부터 2.5mm에 깊이 200㎛로 우측 피질에 삽입시켰다. 전기 자극(10 내지 1000㎂에서 100μs, Master-8 프로그래머에 의해 제어되는 ISO-Flex 아이솔레이터 사용; AMPI, Israel)을, 반대측(우측) 반구의 동일 좌표에 삽입된 이극성 전극을 사용하여 가하였다. 발생한 LFP를 multiClamp 700A 증폭기에 의해 기록하고, 1kHz의 차단 주파수로 여과하고, pCLAMP 9.2 프로그램 및 DigiData 1332A 인터페이스(Axon Instruments Inc., Foster City, CA)에 의해 200μs 간격으로 샘플링하였다. 동일한 전극을 사용하여 뇌파도(ECoG)를 연속적으로 모니터링하였다. multiClamp 700A 증폭기(Axon, Foster City, CA)에 의해 1Hz의 저주파수 필터 및 100Hz의 고주파수 필터(51, 52), 및 pCLAMP 9.2 프로그램 및 DigiData 1332A 인터페이스(Axon, Foster City, CA)를 사용하여 200μs 간격으로 ECoG를 계속해서 기록하였다. 자극 발생된 경뇌량 반응의 진폭을 피크와 기준선(baseline)의 차이로서 계산하고, 이때 기준선은 자극이 전달되기 전 20ms 동안 측정된 평균 전위로 정의된다. 경뇌량 반응의 속도를 반응 잠복기 및 자극과 기록 전극 사이의 거리와 함께 계산하였다. 반응 잠복기는 자극 개시와 피크 간의 차이로서 정의된다. 전극 자극(0.10ms, 0.01 내지 0.10mA)에 대한 경뇌량 반응의 2개의 기록을 각각의 동물로부터 수득하였다.
결과
생착된 쉬버러 마우스는 실질적으로 연장된 생존률을 나타내었다: 신생 이중-동형접합 쉬버러(shi/shi)×rag2-/- 면역결핍 마우스에 300,000개의 인간 아교전구세포(GPC)(n=26) 또는 PBS 비히클 대조군(n=29)을 이식시키거나, 아무것도 이식시키지 않았다(n=59). 뇌량 양측 앞뒤 및 추정 소뇌각을 포함하여 5개의 부위에 단일 중간선 주입으로서 세포를 전달하고; PBS 대조군을 각각의 부위에 동일한 용량으로 주입하는 한편, 비주입 대조군은 주입하지 않았다. 이어서, 마우스를 어미에게 돌려주고, 정상적으로 발달시킨 후, 21일째 이유시키고, 소그룹으로 수용한다. 모든 마우스는 점진적인 신경학적 악화를 겪는 것으로 관찰되는데, 전형적으로 먼저 보행시 점진적인 몸통 불안정성 악화로 나타나고, 이어서 14 내지 16주령까지 현저한 뒷다리 약화를 나타내고, 4 내지 6주에 발작이 시작되지만 18 내지 19주까지 급속하게 증가한다. 따라서, 18주까지, 모든 마우스는 현저히 손상된 전방 보행 및 빈번한 지속적인 발작 에피소드를 나타내었다. 출생 후 130일 내지 150일에 걸쳐, 29마리의 PBS 처리된 대조군 쉬버러 마우스 및 53마리의 처리되지 않은 대조군 쉬버러 마우스는 죽었고, 중간 및 평균(±SE) 생존률은 각각 135.0±1.4일 및 132.4±2.1일이었다.
이에 반해, 이식된 26마리의 마우스 중 20마리가 상기 기간 동안 죽었지만, 6마리(23.1%)는 생존하였다. 처리되지 않은 대조군의 평균 생존률이 130일에 가깝고 총 82마리의 대조군 마우스 중 아무것도 150일까지 생존하지 못한 반면, 이들 6마리의 이식된 마우스는 160일 이상 생존하였고, 4마리는 구제된 것으로 보였으며, 분석을 위해 희생되기 전 1년 이상 생존하였다. 이들 마우스는 명백히 향상된 신경학적 기능을 나타내었는데, 발작 발생률이 감소하였고, 이동성 및 자기보호성이 향상되었다. 사실상, 190일을 초과하여 생존하는 이식된 마우스는 분명한 처리 의존성 치료를 나타내었는데, 정상적인 신경학적 표현형의 실질적으로 완전한 회복과 함께 1년에 걸쳐 지속적인 생존을 나타내었다. 그 결과, 상당히 연장된 생존률을 나타내는 그룹으로서 생착된 마우스는, 카플란-마이어 분석(Hosmer and Lemeshow, 1999)에 의해, 생존률의 처리 관련 향상은 통계학적으로 유의하고, 매우 그러한 것으로 확인되었다(p=0.0003; 위험비(hazard ratio) = 0.4718 (95% CI=0.30-0.70)).
이식은 신경학적 개선과 발작 감소와 관련되었다: 구제된 마우스는 신경성 결손의 실질적인 해결을 나타냈다. 쉬버러 마우스는 전형적으로 출생한지 수 주 이내에 명백한 몸통 불안정성 및 현저한 긴장성 떨림을 나타내고, 점진적인 뒷다리 약화 및 실명을 포함하여 다양한 감각 및 지각 결손으로 악화되어 18 내지 19주령까지 심각하게 손상된다. 또한, 이들은 점진적으로 악화되는 발작 장애를 나타내고, 종종 간질 지속상태로 죽는다. 출생 후 130일 내지 150일 동안 생존한 마우스는 신경 시험에서 뚜렷한 개선을 나타내었고, 7 내지 8월령까지 발작 빈도 감소 및 보행 개선을 나타내고, 전방 이동이 증가하고 후방 돌진 또는 경직이 감소되었다. 이후 수 개월에 걸쳐, 이식된 마우스는 점진적으로 향상되는데, 보행시 정상적인 유동성, 정상적인 자발적 탐색 거동 및 감소된 몸통 의도 떨림을 유지한다. 35주령 이상 생존하는 5마리 마우스 모두는 전방 보행시 비틀거림으로 나타나는 조 축성 의도 떨림(coarse axial intention tremor)을 제외하고는 평가가능한 종합 신경학적 기능면에서 상기 기간까지 및 그 이후에도 실질적으로 정상이었다.
자발적 발작의 빈도 및 기간을 처리되지 않은 shi/shi×rag2 비함유 마우스와 이식된 shi/shi×rag2 비함유 마우스 둘 다에서 연령의 함수로서 평가하고; 이식에 의해 구제된 이식된 마우스의 발작 빈도를, 처리되었음에도 불구하고 죽은, 처리된 대응물과 비교하는 데 특히 주의한다. 전형적으로 강직성 무운동의 부재형 에피소드 후, 짧은 강직성-간헐적 경련성 사건으로의 급속한 전개를 특징으로 하는 쉬버러 마우스의 제1 발작은 35 내지 42일령까지 나타났다. 약 120일에, 발작 빈도는 처리된 동물과 처리되지 않은 동물 둘 다에서 유사하게 실질적으로 증가한 것으로 나타났다. 120일 내지 140일에 걸쳐, 각 그룹의 발작 빈도는 증가하였고, 시간당 빈번한 발작을 야기하였고; 이러한 발작 사건은 간질 지속 상태의 지속 기간으로 발전하여 종종 죽음에 이른다. 그러나, 상기 기간에 생존하여 장기간 생존을 향유한 동물에서, 발작 빈도는 극적으로 감소하여 12월에는 어떠한 발작 활성도 관찰되지 않았다(p<0.0001, 일원 분산분석(1 way ANOVA), 12개월 이식된 동물 발작 발생률을 4개월 이식된 쉬버러 및 대조군 쉬버러의 발작 발생률과 따로 비교). 따라서, 주산기 아교전구세포(GPC) 이식은 주산기 이식에 의해 구제된 shi/shi×rag2 비함유 마우스에서 현저히 감소된 발작 활성과 관련되고, 1년까지 어떤 것도 잔류 자발적 발작 활성을 나타내지 않으면서 실직적으로 완전한 신경 회복을 나타내었다.
자발적인 발작 이외에, 쉬버러는 자극 유도된 발작 활성을 나타내었고, 연령의 함수로서 빈도 및 기간 둘 모두 증가하였다. 이러한 취급에 대한 병리학적 반응을 정량화하기 위해서, 간단히 갑작스럽게 마우스를 꼬리로 매다는 간단한 스크리닝 시험을 정립하고, 이들의 거동 반응을 관찰하였다. 이러한 꼬리 매달기는 처리되든 안되든 간에 3개월령까지 큰 비율의 발작을 쉬버러 마우스에서 유도하기에 충분하다. 30초 이내에 꼬리 매달기의 발작 활성 유도를, 발작 빈도 및 기간에 대한 세포 이식물의 효과를 평가하기 위한 척도로서 선택하였다. 5개월 이상 생존한 이식된 마우스 중에서, 꼬리 매달기 도전 중 47±2.8%가 발작을 일으켰다. 이에 반해, 8개월까지, 4마리의 생존 마우스는 꼬리 매달기로 발작을 유도할 수 없었다. 연령(일수)로 플로팅된, 발작이 유도된 마우스의 비율(%)의 선형 회귀에 의하면, y=-0.324x + 116.7의 베스트-핏(best-fit)이 확인되었다. 회귀 분석에 의해, 발작 빈도 및 연령간의 네가티브 상관관계(r=0.826; r2=0.68)는 유의한 것으로 확인되었다(p<0.0001; F=53.68 [1, 25 d.f.]).
인간 아교 전구체의 주산기 이식편은 광범위한 고밀도 숙주 수초 화를 야기한다: 이식된 동물에서 공여 세포의 말단 분포 및 수초화의 확고함을 평가하기 위해서 그리고 단기 및 장기 생존자 사이의 공여 세포 분산 및 수초화의 정도를 비교하기 위해서, 단기 및 장기 생존자를 경뇌량 전도 속도 및 발작 빈도의 평가 후 13개월령에 결국 희생시켰다. 이들 마우스의 뇌 및 척수를 공여 세포 분포 및 밀도, 수초 생성 및 수초화된 축색의 비율, 결절 구조 및 재구성, 수초화된 축삭을 포함하는 초미세구조 척도 및 수초 G-비 면에서 분석하였다. 이들 척도 각각을, 조기 사망한, 이식된 마우스로부터 수득한 값들 뿐만 아니라 이식되지 않은 쉬버러 대조군, 야생형 정상 수초화된 rag2 비함유 마우스와도 비교하였다.
이러한 조직학적 데이터는 생존률 데이터의 주목하지 않을 수 없는 특성을 지지한다. 인간 공여 세포 생착은 매우 광범위하였고, 인간 공여 OPC에 의해 거의 전체 신경축 투과 및 군체 형성이 이루어졌다. 높은 공여 세포 밀도가 전뇌, 소뇌, 뇌간 및 척수 경부 전반에 걸쳐 관찰되는데, 등허리대(thoracolumbar cord)의 수준에서만 감소하고, 엉치뼈대(sacral cord) 및 척수원추에서는 다시 증가하였다. MBP 발현이 나타내는 바와 같이, 수초화 패턴은 광범위한 생착을 반영하며, 모든 주요 중추 백색질관 뿐만 아니라 뇌신경절, 시교차 및 척수원추와 같이 원거리 및 다양한 구조물을 포함하여 동일하게 광범위한 고밀도 수초화를 나타낸다. 9개월령까지 신경학적 시험이 매우 정상화되었던 장기 생존자는 뇌, 뇌간 및 소뇌의 거의 완전한 수초화를 나타내었고, 시신경, 척수 및 척수 신경근 뿐만 아니라 연수근 및 신경절의 실질적인 수초화를 나타내었다. 연수근 및 신경절의 실질적인 수초화와 관련하여, CNS 및 PNS의 가장자리에서의 공여 GPC 이동의 중단이 현저하여, 공여체 유도된 수초화가 말초 신경으로부터 중추 신경절 및 신경근을 분리하는 전이점까지 일어나지만, 이를 초과하지는 않는다. 공여 세포 분산의 얻어진 밀도 및 패턴은 마우스 숙주의 중추신경계의 실질적으로 완전한 키메라화(chimerization)를 야기하여, 매우 인간화된 백색질을 수득하였다. 3차원 재구성 기술에 의해, 이식된 쉬버러의 뇌에서 공여체 유도된 수초화의 패턴 및 밀도 둘 모두는 야생형 정상 마우스의 패턴 및 밀도와 유사한 것으로 확인되었다.
이종이식된 쉬버러 뇌는 회복된 랑비에 결절을 나타낸다: 쉬버러 축삭의 공여 세포 유도된 수초화는 정상적인 랑비에 결절 및 파라결절(paranodal) 구조의 수득과 동반되었다. 35 또는 52주령에 죽은, 이식된 쉬버러의 몸통 뇌량, 척수경부 및 시신경의 고해상도 공초점 영상을 사용하여, 분포 패턴을 파라결절 및 근접파라결절 단백질 Caspr 및 KV1.2 전압-게이팅된 칼륨 채널 각각에 대해 평가하고, 이의 인접 상호작용은 정상 랑비에 결절을 특징짓는다(Rasband and Trimmer (2001) Dev Biol 236: 5-16.; Schafer and Rasband (2006) Curr Opinion in Neurobiology 16: 508-514). 이들 칼륨 채널은 수초화된 축삭의 근접파라결절에서 조립되고 기능적으로 정의하지만, 수초화되지 않은 섬유에서 광범위하고 비특이적으로 발현된다(Rasband and Trimmer, 2001). 또한, 전형적으로 온전한 수초화 축삭의 랑비에 결절에 격리되지만 비수초화 및 탈수초화 섬유를 따라 광범위하게 분산된 NaV1.6 신속 나트륨 채널의 축삭 발현 및 구획화가 측정되었다. 유사하게, 안키린(ankyrin)에 커플링하여 랑비에 결절에서 신속 나트륨 채널을 유기화하고, 이에 따라 결절 NaV1.6 발현과 동시에 발생하는 βIV-스펙트린(spectrin)에 대한 면역염색을 수행하였다(Schafer and Rasband, 2006; Sherman and Brophy (2005) Nature Rev Neurosci 6, 683-690; Yang et al. (2007) J Cell Biol 176: 509-519).
이들 상보적 결절 마커를 사용하여, 랑비에 결절의 본질적인 정상 유기화가, 이식된 마우스에서 관찰되었고, 야생형 마우스와 구별할 수 없다. Caspr 및 KV1.2는 유기화된 파라결절 및 근접파라결절 부착시 발현되고, 발현 패턴은 이식되지 않은 대조군에서 분명한 분산된 Caspr 및 KV1.2 면역표지의 전체적으로 비배위된 패턴과 명확히 대비된다. 유사하게, NaV1.6 및 βIV-스펙트린 둘 모두는 이식된 shi/shi 마우스에서 랑비에 결절을 확인하고, 파라결절을 정의하는 Caspr의 측면에 위치하는 반면, 이들의 이식되지 않은 대조군은 NaV1.6 또는 βIV-스펙트린 발현의 제거를 보여주지 않는다. 따라서, 종간 키메라화에도 불구하고, 인간 GPC 유도된 희소돌기아교세포와 숙주 마우스 축삭의 아교-축삭 상호작용은 기능적으로 적합하였다. 보다 광범위하게, GPC 유도된 희소돌기아교세포는 숙주 축삭과 효과적으로 소통하여 랑비에 결절을 구조적으로 적합하게 유기화하는 한편, 결절 내에서 급속 나트륨 채널을 격리시켜, 이들의 축삭 기질을 효과적으로 및 적합하게 수초화할 수 있다.
경뇌량 전도 속도가 이종이식된 쉬버러 뇌에서 회복된다: 정상 수초의 명확한 조직학적 재구성으로 인해, 공여 OPC 유도된 수초를 정도 및 기능적 적격성 면에서 평가하여, 이것이 새로 수초화된 중추 축삭의 구성 속도를 회복시키는지를 결정하였다. 이러한 목적으로, 신생아 이종이식 후 12 내지 13개월 사이에 4마리의 장기 생존 이식 쉬버러 마우스로 구성된 샘플에서 뇌량을 교차하는 전도 속도를 평가하였다. 경뇌량 신경 전도 속도는 개두술 동안 대칭 부위에서의 대측성 자극 후에 이들 마우스 각각의 뇌량의 수 개의 부위에 놓인 깊이 전극으로부터의 반응 진폭 및 횟수에 의해 결정하였다. 동일한 수의 연령 일치 야생형(코제닉(cogenic) C3h) 마우스 및 rag2 비함유 대조군을, 이식되지 않은 쉬버러×rag2 비함유 마우스로 이루어진 필수적으로 보다 어린(4개월령) 샘플과 동일하게 평가하였다. 이는 마지막 과정이기 때문에, 지속적인 생존을 보여준 동물들 뿐만 아니라 정상 신경 기능의 실질적인 회복을 보여준 동물들 모두를 이들의 경뇌량 전도 속도 측정 후 희생시키고, 이들을 대상으로 한 생존율 조사를 종결하였다.
대조군 Fvb 야생형(n=3) 및 rag2 비함유 C3h 마우스(n=4) 모두 각각 0.324±0.01 및 0.328±0.03m/sec의 전도 속도를 나타내는 반면, 쉬버러×rag2 마우스(n=4)는 C3h 배경 상에서도 0.260±0.02m/sec의 실질적으로 보다 느린 전도도를 나타내었다. 대조적으로, 이식 후 12 내지 13개월에 희생되기 직전에 시험된, 이식된 쉬버러×rag2 마우스(n=3)는 0.330±0.01m/sec의 평균 전도 속도를 가졌다. post hoc Boneferroni t-검정을 사용한 반복 측정 ANOVA는, 유의한 처리 효과(F=35.15 [3, 9 df])를 보여 주어, 이식된 마우스에 의한 뇌량 전도가 이식되지 않은 쉬버러×rag2-/- 마우스(p<0.001)보다 상당히 빠르고, 정상적으로 수초화된 Fvb 야생형 및 rag2 비함유 마우스의 뇌량 전도와 구별할 수 없었다. 이식된 마우스가 나타내는 보다 신속한 경뇌량 전도는 자극 강도 전체에 걸쳐 지속적이고, 이에 따라 광범위한 섬유 직경 전체에 걸쳐 개선된 전도를 나타내는 것으로 여겨진다. 따라서, 인간 OPC의 신생아 이식은 밀도 및 생리학적 적격성 면에서 충분한 수초를 제공하여 주요 중심관인 뇌량에 대한 정상적인 반구간 전도 속도를 회복하였다.
수초화 및 축삭 피포는 시간이 지남에 따라 점진적이었다: 18 내지 20주(n=10), 27주(n=1), 35주(n=1) 및 52 내지 56주(n=4)령에 이식된 쉬버러의 뇌를, 이들 수용체 뇌에서의 인간 공여 세포의 분포 패턴 및 밀도 뿐만 아니라 공여체 유도된 수초에 대해 평가하였다. (20주령 마우스는 광범위한 공여 세포 생착에도 불구하고 자연사한 한편, 52 내지 56주령 마우스는 장기 생존하였고, 조직학 분석을 위해 희생되었다. 27주 및 35주령 마우스의 치사(자연사 및 사고사)는, 단수인 경우, 중간 시점(intermediate time points)의 정보를 제공하였다.)
BMP 발현이 뒤따르는 대뇌 및 소뇌 수초화는 20주에 실질적이고 광범위한 영역에 분포하는 반면, 뇌간 및 척수 경부에서의 MBP 발현의 밀도 및 분포는 20주보다 35주에 더 광범위하고 52주 내지 56주에 훨씬 더 크다. 특히, 52주 내지 56주령 이식된 마우스는 본질적으로 완전한 뇌간의 수초화를 나타내는 반면, 20주령 마우스는 여전히 야생형 대조군에 비해 다수의 상대적인 저수초화 영역을 나타내었다. 비교적 지연된 수초화 영역은 뇌간의 복측 장관(ventral long tract) 뿐만 아니라, 뇌간 피개 및 고유 핵간관(intrinsic internuclear tract)을 포함하고, 이들 모두는 52주령에 이른 시점보다 광범위하게 수초화되었다. MBP 및 신경섬유에 대해 면역염색된 공초점 광학 단면에서 피포된 숙주 축삭의 비율을 조사함으로써, 52주까지, 피질척수로 경부의 골수 접합부 경부에서 축삭의 78.0±4.8%가 수초화되고, 이는 야생형에서 관찰된 값(93.9±0.9%)보다 단지 약간 작은 비율임을 확인하였다. 동일 시점에, 이식된 동물의 뇌량 및 피질척수로 둘 다에서 수초화된 축삭의 비율이 야생형 대조군의 비율과 구별할 수 없고; 각각 60%를 초과하였다. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하고 척수 경부의 종방향으로 길고 매우 평행한 섬유에 집중하여, 공초점 분석에서 수초-피포된 축삭을 정의하는 기준을 확인하였다. 12 내지 13월령 이식된 쉬버러의 피질척수로 경부의 TEM은 대부분의 축삭이 주요 고밀도 라인과 다층 적층을 갖는, 초미세구조적으로 정상인 수초를 나타냄을 보여주고, 이는 공초점 광학 단면에서 피포된 것으로 보이는 축삭이 사실상 그렇게 되었음을 확인해 준다. 또한, 관찰된 수초의 주요 고밀도 라인은 이의 필수적인 공여 세포 기원을 나타내는데, 왜냐하면 쉬버러 희소돌기아교세포는 주요 고밀도 라인을 만들지 않고, 고밀도 라인의 형성은 수초 염기성 단백질을 필요로 하고, 쉬버러는 유전적으로 결핍되어 있기 때문이다(Readhead et al. (1990) Cell 48: 703-712.). 또한, 총 수초-피포된 섬유 직경에 대한 축삭 직경의 비로 정의된, 계산된 G-비는 이식된 쉬버러 또는 야생형 rag2 비함유 마우스보다 처리되지 않은 쉬버러에서 상당히 더 높지만, 이식된 쉬버러 또는 야생형 rag2 비함유 마우스는 서로 상이하지 않았다. 이는, 처리되지 않은 쉬버러가 약간의 수초 피포를 이루거나 전혀 이루지 않는 한편, 이식된 동종은 정상적으로 수초화된 야생형×rag2 비함유 대조군과 평균적으로 동일한 두께의 수초를 갖는다.
이식된 쉬버러의 점진적인 수초화는 공여 세포 분산의 속도 또는 역학 함수인 것으로 보여지지 않는데, 왜냐하면 35주에 공여 세포의 해부도가 52주에 관찰된 해부도와 실질적으로 상이하지 않았기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 공여체 유도된 세포의 국소 밀도는 시간의 경과에 따라 증가하는 것으로 보여지고; 이러한 증가는 점근성이고, 제1 반년 또는 이식후 반년에 초기 확대 후 공여 세포 풀의 유사분열 적격성에 속하는 것을 반영하는 것으로 보인다. 따라서, 인간 공여 세포를 이의 목적지에 제공한 지 오랜 후, 수초 발생 및 축삭 피포가 서서히 계속해서 진행되고, 결국에는, 장기간의 출생 후 성숙 기간 후 수용체 신경축의 수초화를 달성하고; 이는 단일 희소돌기아교세포에 의한 국소 축삭의 증분 진입(incremental engagement)을 반영할 수 있고, 단일 희소돌기아교세포는 수초 피포의 개별 도메인에서 성숙하고 확대되어, 수 개월에 걸쳐 한꺼번에 축삭을 이의 피포된 그룹에 부가한다.
장기 생존은 수용체 백색질의 인간화와 관련되었다: 쉬버러 마우스 백색질에서의 인간 아교세포 집단의 선택적인 확대는, 적어도 부분적으로는 이식된 인간 GPC의 보다 지속적인 증식 산물인 것으로 보이고, 확대 가능성의 세포-자발적인 규제를 고려하여, 후기 임신 제2 3개월기 태아 뇌실하구역으로부터 유도된 GPC는 적어도 추가의 또다른 9 내지 12개월 동안 활성적으로 분화를 계속할 것으로 예상된다. 따라서, 수용체 마우스 뇌에서 모든 인간 세포의 수를 시간의 함수로 플로팅하는 경우, 300,000 세포/수용체의 초기 용량은 장기 생존자에서 12 내지 14개월까지 평균 12백만 인간 공여 아교세포로 확대되었다. Ki67+ 세포의 발생률을 3개의 샘플 영역, 즉, 뇌량, 술 및 소뇌 백색질에서 평가하는 경우, 유사분열 인간 공여 세포의 분율은, 주산기 및 이후 수 개월 동안, 국소 숙주 세포의 분율보다 훨씬 높은 것으로 밝혀졌고; 단지 생착 후 1년에 인간 공여 세포의 Ki67+ 분획이 2% 미만으로 떨어지는 것으로 관찰되었다. 그 이후에도, Ki67+ 인간 아교세포의 분율은, 이식된 숙주 둘 모두 및 rag2 야생형 또는 shi/shi×rag2-/- 마우스 대조군에서, Ki67+ 마우스 세포의 상응하는 비율보다 높게 유지되었다(F=12.42 [3, 2 df], 세포 유형 및 구역을 변경하는 2원 ANOVA; p<0.05 각각 비교, Boneferroni post hoc t test). 결국, 인간 공여 세포 풀의 우세한 확대에도 불구하고, 이의 상대적인 유사분열 정지는, 정상적인 인간 GPC가 동일반응계내에서 확대를 감소하는 대략적인 시간 경과에 따라서, 이식 후 1년까지 이루어진다. 이와 관련하여 중요하게는, 이소성 병소, 역형성 또는 신생물 전환(neoplastic transformation)의 증거는 연속 시험된 100개 이상의 이식된 마우스에서는 확인되지 않았다.
이들 데이터는 공여 인간 GPC가, 이식 후, 이들의 숙주인 마우스 대응물보다 강력하고 지속적인 유사분열 확대를 나타내고, 시간이 경과함에 따라, 이는 수용체 백색질의 상대적인 인간화를 야기함을 의미한다. 사실상, 인간 공여 세포 보충물의 정량화에 의해, 12 내지 14개월에 희생시킨, 4마리의 장기 생존 이식된 마우스는 뇌량, 술 및 소뇌 백색질에서 모든 세포의 1/3 이상이 인간 기원 세포임을 나타냈다(각각 35.3±11.8%, 42.9±10.9%, 및 40.8±6.9%). 4마리 중 3마리에서, 백색질 구역 각각에서 모든 세포의 40% 초과가 인간이었고, 이들 중 가장 고밀도 생착 부분에서, 13개월에 희생된 마우스에서, 이의 뇌량의 모든 세포의 54.6%가 인간이었다. 쉬버러 백색질에서 모든 세포의 1/3 이하가 비아교세포이고, 비아교세포는 미세아교세포, 내피 세포 및 혈관주위세포를 포함하므로, "최상 경우" 마우스의 모든 뇌량 아교세포의 80% 이상이 생착 후 1년까지 인간 기원 세포인 것으로 추정되고; 보다 광범위하게는, 각각의 평가된 장기 생존 수용체에서 모든 뇌량 아교세포의 반 이상이 인간이었다.
실시예 4: CD140a 기반 FACS 는 인간 태아 전뇌로부터의 아교전구세포의 전사적으로 명백한 수초발생 분획을 분리한다
방법
세포 및 조직 샘플: 태아 뇌 조직을 38개의 경우로부터 수득하였다(임신령: 15 내지 22주). 피질 조직을 뇌실 및 뇌실하대 및 그 위의 피질 외막으로 절개하고, 얼음 위에서 냉각시켰다. 간략하게, 파파인 및 DNase를 사용하여, 추출한지 2시간 이내에, 잘게 썬 샘플을 분리하고(참조: Windrem et al. 2004, Nat. Med. 10(1): 93-7, 이는 적어도 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다), 20ng/ml FGF-2을 갖는 DMEM/F12/N1(Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 속에서 밤새 유지시켰다.
분류: 분류 당일에, 자기적인 분리 또는 FACS를 위한 세포를 제조하였다. 자기적인 분리에 의해 세포의 PSA-NCAM 정의된 고갈을 수행하였다(참조: Windrem et al. 2008, Cell Stem Cells(6): 553-65, 이는 적어도 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다). PDGFαR 또는 CD9 FACS를 위해, 세포를, 2mM EDTA 및 0.5% BSA를 갖는 PBS에 재현탁시키고, 1차 항체와 함께 배양하였다. 동형 및 형광 마이너스 원 대조군을 사용하여 적합한 게이트를 설정하였다. 펄스 폭 및 높이 측정치를 사용하여 단일 세포들을 구별하였다. 분류 후, 세포를 14일 이하 동안 DMEM/F12/N1 속에 유지시켰다. 이식 세포의 경우, 1 내지 3일 동안 FGF-2 속에서 유지시켰다.
면역세포화학: 시험관내 배양물을 조기 전구체 및 희소돌기아교세포 마커, 각각 A2B5 및 O4에 대해 염색하였다(참조: Roy et al. 1999, J. Neurosci 19(22) 9986-95 and Sim et al. 2006, Ann. Neurol. 59(5): 763-79, 이는 적어도 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다). O4 및 A2B5 둘 다는 살아있는 세포에 편재되고, 이후에 4% 파라포름알데히드로 고정되었다. O4 상청액을 1:100으로 희석하여 사용하고, 모노클로날 항체 A2B5 상청액(clone 105, American Type Culture Collection)은 DMEM/F12/N1로 1:1로 희석하고, 각각을 4℃에서 40분 동안 적용하였다. 고정 후, 배양물을 성상세포 마커용으로 GFAP(1:1000, Chemicon, Bellerica, MA) 및 AQP4(1:200, Chemicon, Bellerica, MA)로 염색하고, 신경세포 마커용으로 Ⅲ-튜불린(clone TuJ1, 1:1000, Covance, Princeton, NJ) 및 HuD(clone 16A11, 10ng/ml, Invitrogen, La Jolla, CA)로 염색하였다. 희소돌기아교세포 직계 세포를, Olig2(1:200, AbCam, Cambridge, MA)를 사용하여 표지하였다. 신경전구세포를, 항-SOX2 항체(1:500, R & D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 표지하였다. 2차 항체, Alexa488, 594 및 647 콘주게이팅된 고트 항-마우스 IgM, 래빗 및 래트 항체 각각을 1:400의 희석도로 사용하였다(Invitrogen, La Jolla, CA). 고정된 배양물을 DAPI(10ng/ml; Invitrogen, La Jolla, CA)로 대조염색하였다.
채점: 표현형으로 표지된 세포의 수를 개별 복제 샘플(각 용량 수준에서 n=3)로부터 랜덤하게 선택된 10개 필드에서 계수하였다. 반복 측정 일원 분산 분석 (ANOVA) 후, 두네트(Dunnett) 다중 비교 검정(GraphPad Prism® 5 (Graph Pad Software, Inc., La Jolla, CA)(p<0.05)에 의해 통계학적 유의성을 평가하였다.
단면에서의 면역조직화학: 인간 핵에 대한 항체 1281(1:400, Chemicon, Bellerica, MA), 인간 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 Ng2에 대한 모노클로날 항체 2029(clone 9.2.27)(1:200, Chemicon, Bellerica, MA), 인간 Olig2에 대한 고트 항체(1:200, R&D Systems, Minneapolis, MN), GFAP에 대한 래빗 항체 5804(1:1000, Chemicon, Bellerica, MA), Ki67에 대한 래빗 항체(1:200, LabVision, Fremont, CA), 및 MBP에 대한 래트 항체 7349(1:25, Abcam, Cambridge, MA)를 사용하여, 이식된 세포를 동정하였다(참조: Nunes et al. 2003, Nat. Med. 9(4):439-47; Windrem et al. 2004, Nat. Med. 10(1):937; Windrem et al. 2002, J. Neurosci. Res. 69(6):966-75; and Windrem et al. 2008, Cell Stem Cell 2(6): 553-65, 이들은 적어도 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다). 공초점 영상화를, IX70 도립형 현미경에 결합된 Olympus Fluoview®(Center Valley, PA)를 사용하여 실시하였다. 아르곤 레이저(Argon laser lines)를 사용하여, Alexa488-, 568- 및 647-표지된 고트 또는 덩키(donkey) 2차 항체(각각 1:400, Invitrogen, La Jolla, CA)의 3채널 면역형광 검출을 달성했다. 비오티닐화(biotinylation)된 2차 항체(1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), 및 avidinAlexa488(1:500, Invitrogen, La Jolla, CA)와 배양 후, Ng2 면역형광을 수득하였다. 각각의 동물에 대해 피브리아(fibria) 및 뇌량 백색질 생착의 입구, 중간 및 말단 구역을 나타내는, 350m 이상 떨어진 3개의 단면을 계수하였다(Stereo Investigator, MicroBright Field, Williston,VT).
이식 및 표지: 동종 쉬버러 마우스를 번식시켰다. 출생 1 내지 2일 이내에, 새끼를 세포 전달을 위해 저온마취시켰다. HBSS 1㎕ 중의 공여 세포(0.5×105)를, 빨아올린 유리 피펫으로 주입하고, 두개골을 통해 추정 뇌량으로 삽입시켰다. 이식물을, 1.0 내지 1.5g으로 달라지는 새끼의 중량에 따라, 1.0 내지 1.2mm 깊이의 뇌량으로 보낸다. 그 다음, 8 내지 12주에 새끼를 죽인다. 이종이식의 거부를 방지하기 위해서, 2주령에 도달 후, 새끼에게 매일 면역억제제 FK506(5mg/kg, Tecoland Inc, Edison, NJ)를 주사하였다.
실시간 RT - PCR 저밀도 어레이 분석: 6개의 태아 샘플을, 분자 분석을 위해 수집된 CD140a/PDGFαR(임신령: 21 내지 22주) 및 포지티브 및 네가티브 분획용으로 분류하였다. 총 RNA를, RNeasy®(Qiagen, Chatsworth, CZ)를 사용하여 추출하고, ribo-SPIA계 전체 전사체계 증폭기술(NuGen, San Carlos, CA)을 사용하여 증폭시켰다. 48 유전자 저밀도 Taqman®계 어레이(TLDA, Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 47개의 세포 유형 특이성 마커 유전자의 발현을 평가하였다. 전사 발현의 상대적인 존재도를 △△Ct 분석에 의해 계산하고, 발현 데이터를 GAPDH로 표준화하였다. 1/2 초과의 RNA 샘플에서 발현이 검출되지 않은 유전자는 제외하였다. log2-변형 데이터에 대해 통계학적 분석을 수행하고, 오류 발견율을 사용하여 다중 시험을 위해 p-값을 보정하였다(참조: Hochberg and Benjamini 1990, Stat. Med. 9(7):811, 이는 적어도 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다).
마이크로어레이 : 3'-편향 ribo-SPIA(NuGen Ovation®, San Carlos, CA)를 사용하여 추출된 전체 RNA를 증폭시키고, Affymetrix(Santa Clara, CA) U133+2 어레이에서 제조자 지시사항에 따라서 혼성화하였다. 미처리 세포 강도 데이터(CEL)를, RMA 방법을 사용하여 처리하고(참조: Irizarry et al. 2003, Biostatistics 4(2): 249-64, 이는 적어도 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다), 바이오컨덕터(Bioconductor) 및 R을 사용하여 하류 분석을 수행하였다(참조: Gentleman et al. 2004, Genome Biol. 5(10): R80, 이는 적어도 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다). 초기 품질 제어를 수행하고, 이는 RNA 분해 및 신호 분포의 측정을 포함한다. 하나의 샘플을, 근원 성분 및 계층적 클러스터링 분석에 따라서 이상치(outlier)로서 확인한 후, 추가의 분석으로부터 제거하였다. 특이하게 PDGFαR+ 세포에 의해 발현되는 것으로 정의된 유전자는 3배 초과로 발현되었고, 5% 오류 발견율 범위를 갖는 완화된 t-검정 통계를 사용하여 유의하였다(q<0.05, n=5; linear modeling empirical Bayes test statistic)(참조: Smyth 2004, Stat. Appl. Gener. Mol. Bio. 3: Article 3, 이는 적어도 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다). 다르게 발현하는 유전자들을 추가로 여과하여, 성체 A2B5 분류된 WMPC에 대해 인간 미세아교세포(CD11b-정의, n=3)에 의해 고도로 발현되는 유전자를 제거하였다. 유전자 온톨로지(Gene ontology) 및 인제누이티 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis)(Ingenuity Systems, Redwood City, CA)을 일련의 PDGFαR 특이 유전자에 대해 수행하였다. 유전자 온톨로지 과잉 표시성 분석을, NIH DAVID를 사용하여 수행하였다(참조: Dennis et al. 2003, Genome Biol 4(5): P3, 이는 적어도 본원에 기재된 방법을 위해서 참고로 인용된다). 인제누이티(Ingenuity Systems, Redwood City, CA)에서 계산된 유의성 p-값은, 과잉 표시된 기능/경로 아노테이션(annotation)을 확인하기 위한 피셔 이그젝트 우측 검정(right-tailed Fisher's Exact test)에 근거하고, 상기 아노베이션은 우연히 예상된 것보다 많이 다르게 발현된 유전자를 갖는 아노테이션이다. 유전자 구성원의 관련 점수 및 조성에 따라서 유전자의 개별 네트워크를 선택하였다. PGSEA 패키지를 사용하여 GSEA(Gene set enrichment analysis)를 수행하고, 개별 경로의 상대적인 부화(enrichment)를 선형 모델로 핏팅하고 보완된 t-검정 통계를 사용하여 유의성을 평가하여 제공한다. 얻어진 p-값을, 오류 발견율을 사용하여 다수 검정 보정을 위해 보정하였다.
결과
CD140a 는 olig2 + 아교전구세포의 집단을 정의한다: 인간 전뇌에서, 아교전구세포(GPC)는 임신 제2 3개월기의 후반기 동안에 가장 활발히 생성된다. 후기 임신 제2 3개월기 인간 전뇌에서의 CD140a/PDGFαR+ 세포의 지형 분포를 평가하기 위해서, 임신 22주의 전뇌 단면을, PDGFαR 엑토도메인 내에서 에피토프를 인지하는 모노클로날 항-CD140a IgG로 면역표지하였다(참조: LaRochelle et al. 1993, Cell Growth Differ. 4(7): 547-53, 이는 적어도 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다). 면역염색에 의해, CD140a+ 세포가 발달중인 인간 전뇌에 침투하여 중간 구역을 통해 발달중인 피질 외막으로 확대되고, NG2 정의된 성인 OPC의 형태와 유사한 형태를 가짐을 확인하였다.
현미경사진은 CD140a/PDGFαR 발현 세포가 임신령 22주의 태아 뇌의 발달중인 피질 외막에서 발견됨을 보여주었다. 확인가능한 모든 CD140a-포지티브 세포 몸체는 희소돌기아교세포 직계 전사 인자 Olig2를 공발현하였다. 신경 전구체 표현형과 일관되게, 중간 구역 내의 CD140a+/PDGFαR+ 세포는 전구체-발현된 전사 인자 Sox2를 공발현하였다. 공초점 현미경을 이용하여, 활성 세포 주기에 있는 세포의 마커인 항-Ki67 항체로 표지된 PDGFαR+/CD140a+ 세포의 비율을 결정하였다.
실질적으로 모든 CD140a+ 세포를 희소돌기아교세포 직계 전사 인자 olig2로 공표지하는 한편, sox2는 이들의 분획에 의해 공발현되었다. 유의한 비율의 CD140a+ 세포가 활발히 사이클링하는 세포의 마커인 Ki67를 발현했다. 대조적으로, 성상세포의 마커인 GFAP 또는 구속된 뉴런의 마커인 HuD에 의해, 동일위치에서의 국소화는 인지되지 않았다. 또한, 이들 데이터는 CD140a+ 세포가 구속되지 않은 아교전구세포를 포함함을 입증한다.
CD140a + GPC 는 임신 제2 3개월기 피질 확대 동안 나타나고 축적된다: 유세포분석에 의해, 혼합된 중간 구역과 피질 외막을 포함하는 피질 분리물 내에서 세포의 4.8±0.7%를 나타내는, 임신령 20 내지 22주에 풍부한 CD140a+/PDGFαR+ GPC 집단은 CD140a+로서 분류되는 것으로 밝혀졌다(n=13, 표준오차 [SE]). 유세포분석을 사용하여 20 내지 22주된 태아 피질/IZ 분리물의 태아 발아 구역 및 그 위의 중간 구역 및 피질에서 PDGFαR 세포의 상대적 부화를 측정하였다. CD140a+ 세포는 이른 임신 제2 3개월기 피질/IZ에서는 드물고, 임신령에 따라 점차로 증가하였다(n=29). 대조적으로, 상대적인 CD140a 세포 발생률은 임신 제2 3개월기 동안에 절개된 발아 구역(VZ/SVZ)에서 비교적 일정하게 유지되었다(n=10). 보다 이른 임신령에서는, 비교적 소수의 CD140a+ 세포가 확인되고; 인지 가능한 수의 세포는 임신령 16주에 처음으로 나타나기 시작했다. 임신 제2 3개월기 발달의 후반기를 포함하여 16 내지 23주를 초과하면, 피질 CD140a+ 세포 발생률과 임신령 사이의 유의한 상관관계가 인지된다(p<0.0001, r2=0.43, df = 26). 대조적으로, 절개된 뇌실 및 뇌실하구역 내에서의 CD140a+ 세포의 상대적인 발생률은 임신령 증가에 따라 증가하지 않았다(p=0.57, r2 = 0.04, df = 10)(도 3a). 추정 백색질 및 피질에서 CD140a+ 세포의 비율이 급속하게 증가하는 데 반해 VZ/SVZ에서 CD140a+ 세포의 비율이 비교적 일정한 것(3.1±0.4% 대 1.2±0.1%; 비대응 t-검정, p = 0.012, df = 37)은, 새롭게 생성된 VZ/SVZ 유도된 GPC에 의해 발달중인 뇌의 단조 군체형성을 입증한다(도 3b).
CD140a + / PDGF αR + 세포는 A2B5 + 아교전구세포의 소집단을 포함한다: 인간 태아 뇌로부터 유도된 A2B5+/PSA-NCAM- 세포는 표현형이 불균일한 세포 집단을 포함한다. 이들은 양성 GPC의 수초발생 분획을 포함하지만, 이들은 또한 성상세포 표현형, 전형적으로 공발현 GFAP 및 A2B5 면역반응성으로 제한되는 것으로 보이는 아교세포를 포함한다. 분리된 태아 세포로부터 면역자기적 분류에 의해 PSA-NCAM+ 세포를 제거하고, A2B5 및 CD140a에 대한 2색 유세포분석을 실시하였다.
태아 분리물을, PSA-NCAM 항원성을 근거로 면역자기적으로 선택하였다. 이어서, PSA-NCAM 세포를, PE 및 APC 콘쥬게이팅된 항체를 각각 사용하여 CD140a 및 A2B5에 대한 2색 FACS/세포분석을 실시하였다. A2B5 또는 CD140a 항체를 매치된 동형 대조군 컨쥬게이팅된 항체로 치환함으로써 형광-마이너스 원(EMO)을 사용하여 포지티브 선택 게이트를 정의하였다. A2B5 및 C140a-특이성 항체를 또한 합하였다. 큰 비율의 CD140a-표지된 세포는 A2B5를 공발현하였다. PSA-NCAM+ 세포에 대해 단색 CD140a 세포분석/FACS를 수행하였다. 도 4a는, 조합된 MACS 및 FACS 방법으로부터 계산된 모두 6개의 아분획의 상대적인 분율을 보여준다(n=4, 임신령: 19 내지 22주). 각각의 분류물을, T3/0.5% pd-FBS 함유 배지에서 7일 동안 평판배양한 후, 염색하고, 희소돌기아교세포 항원 O4을 계수하였다(도 4b). A2B5 또는 PSA-NCAM 상태에 상관없이 각각의 CD140a+ 분획은 고비율의 O4+ 희소돌기아교세포를 생성시켰다(n=3 샘플).
CD140a+/PDGFαR+ 세포는, 둘 다 유도되는 전체 집단에서보다 A2B5+/PSA-NCAM- 풀에서 훨씬 더, 2.6배 풍부하였다(A2B5+/PSA-NCAM-에서 23.2±3% 대 10.9±3%; t-검정 p=0.0324, n=4)(도 4a). CD140a+/PDGFαR+ GPC 중에서, 70±10%는 조직 분리 후 48시간 내에 분석하는 경우(n=4), A2B5+를 공발현하였다. 희소돌기아교세포 전위의 분류후 분석을 1% 혈소판 고갈된 혈청(PD-FBS) 및 트리요오도티로닌(T3) 보충된 배지에서 평가하였다. 7일 후, 매치된 인간에서 미성숙 유사분열후 희소돌기아교세포를 인지하는 mAb O4를 사용하여, 매치된 배양물을 면역염색하였다(참조: Armstrong et al. 1992, J. Neurosci 12(4): 1538-47; Kirschenbaum et al. 1994, Cerebral Cortex 4(6): 576-89 and Roy et al. 1999, J. Neurosci. 19(22): 9986-95, 이는 적어도 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다). 희소돌기아교세포 분화가 1% PD-FBS의 존재에 의해 제한되지만, O4+ 희소돌기아교세포의 비율은 매치된 CD140a- 대응물에서보다 모든 CD140a+ 세포 분획에서 상당히 더 컸다(n=3 분류물)(도 4a).
선행 PSA-NCAM 고갈 없이 수행된 2색 FACS에 의해, 뉴런 및 미성숙 성상세포를 포함함으로써, 분리된 모든 전뇌 세포(임신령: 18 내지 23주, n=11)의 38.1±4.9%를 포함하는 A2B5+ 세포 중에서, 전체 분리물(n=3, 2색 분류) 내의 4.0±1.4% PDGFαR+에 비해, 5.3±1.5%가 PDGFαR 발현하는 것이 밝혀졌다. 따라서, CD140a+ 세포는 A2B5+ 아교전구세포의 비교적 작은 별개의 소집단을 포함한다.
희소돌기아교세포 생성은 CD140a + 세포로 제한되었다: 형광-활성화 세포 분류법(FACS)을 사용하여 CD140a+ 세포와 CD140- 세포를 따로 분리하였다. 분류 직후, CD140a+ 세포는 크기가 균일하고, 비교적 작으며, 밝은 상인 것으로 밝혀졌다. 24시간 이내에, 대부분은 처음으로 양극성 세포로서 미세한 공정을 정교하게 하는 것으로 관찰되었다.
현미경사진은 CD140a 분류된 세포가 GPC의 마커를 발현하는 것을 보여준다. 분류 후 24시간째에 면역세포화학을 사용하여 CD140a 분류된 세포의 표현형을 평가하였다. 이 단계에, CD140a+/PDGFαR+ 분류된 세포는 CD140a/PDGFαR 면역반응성을 균일하게 발현하였다. 고배율에서, CD140a+ 발현 세포는 희소돌기아교세포 직계, Olig2 및 신경 전구체의 전사 인자 마커, Sox2를 공발현하였다. CD140a- 고갈된 세포는 CD140a 면역반응성을 발현하지 않았다. 대부분의 CD140a/PDGFαR 고갈된 세포는 신경세포 직계 발현 βⅢ-튜불린 및 HuD였다. 고갈된 세포의 보다 작은 아집단은 GFAP/AQP 이중 표지된 성상세포로 이루어졌다.
CD140a+ 세포는 CD140a/PDGFαR을 균일하게 발현하고, 전사 인자 olig2 및 sox2를 공발현하며, 상기 전사 인자 둘 모두는 비구속 아교 전구체에 의해 발현된다. 이에 반해, CD140a- 분획은 olig2+ 세포 뿐만 아니라 CD140a+/PDGFαR+ 세포도 매우 결여되었다.
희소돌기아교세포 분화를 촉진하기 위해서, 2개의 집단을 성장 인자의 부재하에 T3와 함께 성장시켰다. 1 내지 2일 이내에, 대부분의 CD140a+ 세포는, 전형적으로 소형의 치밀한 세포체를 갖는 이극성인 전구체 유사 형태를 나타내고, 핵-편재 Olig2 단백질을 발현하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 4일 후, CD140a 분류된 세포의 36.6±5%가 희소돌기아교세포 마커 O4를 발현(n=13)하는 반면, CD140a- 세포의 0.1%만이 상기 시점에서 O4를 발현하였다(n=7, 하나의 샘플은 약 1% O4+ 세포를 갖지만, 나머지 6개 샘플에서는 전혀 확인할 수 없었다). 도 5b에 도시한 바와 같이, 7일에, 대부분의 CD140a- 세포가 TuJ1+ 뉴런(63±8%, n=4 태아 샘플) 또는 GFAP+ 성상세포(6±2%, n=4)로서 확인될 수 있었다. 지속성 A2B5+ 세포의 아그룹(21±1%, n=3)(이의 일부는 GFAP를 공발현한다)은 CD140a- 배양물에서도 발견되었다. 더구나, 20ng/ml IGF1을 보충하거나 보충하지 않은, 10% 이하의 혈청 농축물에 노출하여도 CD140a- 배양물에서 O4+ 희소돌기아교세포의 출현을 유발하지 못했다. 종합적으로, CD140a+ 분획 중의 O4+ 세포의 비율이, 이의 CD140a- 나머지에 대해 200배 초과로 증가된 것이 확인되었다(37% CD140a+ 대 0.14% CD140a-, p<0.0001, 양측 t-검정; df=18). 따라서, 이들 임신 제2 3개월기 태아 인간 전뇌 분리물에서, O4+ 희소돌기아교세포는 CD140a+ 전구세포에 의해서만 생성되었다.
CD140a + 세포는 희소돌기아교세포 및 성상세포 둘 다를 생성시키도록 지시될 수 있다: FACS 분류된 CD140a+ 세포를 성장 인자의 부재하에 배양하였다. 7일까지, 일부 희소돌기아교세포의 사멸이 발견되지만, 생존하는 희소돌기아교세포는 성숙한 희소돌기아교세포 마커 O1을 발현하고 성숙하는 희소돌기아교세포의 복잡한 분지화 형태를 발달시키는 것으로 확인되었다.
그러나, CD140a+ 세포로부터 이러한 희소돌기아교세포의 분화는, 혈청 비함유 배지에서의 T3 및 미토겐 제거에 의해 촉진될 수 있지만, 혈청 및/또는 BMP 노출을 사용하여 성상세포 분화 또한 쉽게 유발될 수 있다. 분류 직후, 혈청 또는 BMP-4의 부가에 의해 신속한 GFAP+ 성상세포 분화가 유발되는 것으로 밝혀졌다. 0.5% 혈장 유도된 (PD)-FBS에 노출된 배양물에서, 분류 후 7일까지, 8.8%에서 30.7%로, 3.5배의 성상세포 표현형이 유도되었다(p=0.0023, 비대응 t-검정, df=5). 유사하게, BMP-4 부가에 의해, GFAP+ 성상세포가 50ng/ml BMP-4에 4일 동안 노출 후, 8%에서 40% 초과의 급속한 용량 의존성 증가를 나타내었다(p<0.01; F = 12.4; 일원 ANOVA + Dunnett's post hoc analysis). 이에 반해, 희소돌기아교세포 직계 분화는 BMP-4 처리에 의해 극적으로 억제되어, O4+ 세포의 발생률이 시험관내에서 4일에 30% 초과에서 5% 미만으로 떨어졌다(p<0.01; F = 12.7; ANOVA + Dunnett's post hoc). 결과적으로, 이들 배양물에서 GFAP/O4 비는 BMP-4에 반응시 0.5 미만에서 15 초과로 증가하였다. post hoc 분석은 5ng/ml BMP-4가 GFAP+ 및 O4+ 세포의 비율을 유의하게 변화시킴을 보여주었다(p<0.05).
CD140a+ 세포는 시험관내에서 양성 전구체로서 유지될 수 있었다. 미토겐 PDGF-AA 및 FGF-2를 20ng/ml씩 첨가함으로써 4일째에 O4+ 희소돌기아교세포의 출현이 거의 완전히 차단되었다. 매치된 배양물에서, CD140a+ 세포의 2.4±1.2%만이 미토겐의 존재하에 4일까지 희소돌기아교세포로서 발달하였다(n=5). 이들 세포 중 대부분이 A2B5+ 전구체로서 남았고(75±7%, n=3), 시험관내에서 1주일 이상 동안 그대로 유지될 수 있었으며; 4.8±1.2%만이 7일째에 O4+인 한편, 70% 초과가 1주일째A2B5+로 남았다(n=6). 또한, 편평한 외관의 GFAP+ 성상세포(8.8±1.9%, n=4)의 점진적인 출현이 발견되었다. FGF의 회수 및 T3의 PDGF-보충 배지로의 부가에 의해 부분적인 희소돌기아교세포 분화가 유발되었고, O4+ 세포의 발생률이 거의 3배 내지 13.7± 2.9%까지 증가하지만(p=0.0123, t-검정, n=3); 그럼에도 불구하고, 대부분의 세포는 여전히 A2B5+ 전구체로 남아있었다(59.3±13.7%, p<0.05, 대응 t-검정, n=4).
태아 CD140a+ 세포에 대한 긴장성 BMP 신호전달(signaling)의 효과를 조사하기 위해서, 성상세포 직계 구속을 광범위 BMP 길항제인 노긴으로 차단하고자 시도했고, 상기 길항제의 처리는 성체 GPC를 A2B5+ 전구체로서 유지시킨다. 성장 인자의 부재하에 4일 동안 CD140a+ 배양물에 첨가되는 경우, 100ng/ml 노긴은 BMP-4 유발된 성상세포 분화를 강력하게 억제하였다(p<0.05, Tukey's post hoc test). 노긴 부가는 희소돌기아교세포 구속에 대한 BMP-4의 억제 효과를 역전시켜, O4+ 세포의 비율을 비함유 대조군 수준으로 반환시켰다(BMP-4 + 노긴 중의 21.0±3% O4+ 세포 대 BMP-4 단독 중의 4.3±1% O4+ 세포; p<0.05). 성상세포 및 희소돌기아교세포 분화의 기준선 수준은 외인성 BMP 리간드 부재하에 노긴 처리에 의해 영향을 받지 않았다(노긴처리되지 않은 그룹 및 100ng/ml 노긴 처리된 그룹 각각에서 8.1±3% 및 8.1±4% GFAP+; 노긴처리되지 않은 그룹 및 100ng/ml 노긴 처리된 그룹에서 22.6±4% 및 21.0±3% O4+ 세포).
CD140a + GPC 는 이종이식시에 저수초화된 쉬버러 마우스를 수초 화하였다 : 7마리의 수초-결핍 쉬버러 shi / shi 마우스 그룹에 CD140a 분류된 GPC를 각각 5x104 세포씩 이식하였다. 이종이식물을, 위에서 기재한 바와 같이, 뇌량간 주입으로서 신생아에게 전달하였다(참조: Windrem et al. 2004, Nat. Med. 10(1):93-97, 이는 적어도 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다). 이들 조건하에서, A2B5+/PSA-NCAM- 분류된 태아 인간 GPC는 전형적으로 신생아 이식 후 8주까지 수초를 생성시키기 시작하고, 12주까지 비교적 대용량의 다르게 저수초화된 백색질을 수초화하였다. 수초 생성 및 축삭 피포를 수행하는 CD140a 분류된 세포의 상대적인 적격성을 평가하기 위해서, CD140a-생착된 쉬버러를 8 내지 12주령에 희생시키고, 이들의 뇌를 저온절개하고, 수초 염기성 단백질(MBP)에 대해 면역염색하며, 상기 단백질은 쉬버러에서 달리 발현되지 않는다. CD140a-생착된 마우스는 사실상, A2B5 분류된 GPC를 사용하여 미리 관찰된 지리적 패턴과 유사한 지리적 패턴으로, 뇌량, 피막 및 술의 상당하고 광범위한 수초화를 나타냈다.
인간 태아 CD140a+/PDGFαR+ GPC를 신생아 쉬버러 마우스의 저수초화된 전뇌에 이식하였다. 주입 후 8 내지 12주에, 항-인간 핵 항원(hNA)에 의해 인지되는 인간 세포 분획은, 수초 단백질 유전자 MBP를 발현하는 수초화 희소돌기아교세포로 분화하였다. 인간 수초화 과정과 일관되게, 큰 비율의 이식된 세포가 이식 후 8 내지 12주에 NG2-발현 GPC로서 남았다. 그러나, 인간 세포의 소분획만 GFAP로 표지된 성상세포로 분화하였다. 도 6은 이식 후 8 내지 12주에 인간 세포 치사의 정량화를 보여준다(n=3).
술(fimbria) 내에서의 정량화는, 대부분의 인간 세포가 희소돌기아교세포 직계이고, 인간 핵 항원(hNA) 정의된 인간 세포의 68±14%는 조기 아교세포 및 희소돌기아교세포 전사 인자 Olig2를 공발현하였다(n=3 채점된 뇌). 주입 후 8주까지, 이식된 A2B5-정의 태아 GPC로부터 수초 발생이 막 시작되는 시점에, 인간 CD140 분류된 세포의 8±3%는 MBP+ 희소돌기아교세포로 이미 분화되었다(n=3, 도 6). 비교적 조기 시점에, 1/3은 NG2+ GPC로 존속되고(31±14%, n=3; 도 6); 이들의 한 분획은, Ki67 발현에 의해 정의되는 바와 같이, 유사분열 능력을 가졌다(8±4%, n=3; 도 6). 인상적으로, 이식된 인간 CD140a+ 세포의 5% 미만이 GFAP 정의된 성상세포로 분화하였다(도 6). 이러한 발견은 CD140a+ 태아 인간 GPC가, A2B5+/PSA-NCAM- GPC의 보다 큰 풀(CD140a+ 태아 인간 GPC는 A2B5+/PSA-NCAM- GPC의 일부분이다)과 같이, 생체내에서 급속한 희소돌기아교세포 성숙 및 수초 발생을 일으킬 수 있음을 나타낸다.
CD140a + 세포는 비구속 아교전구세포의 전사 프로파일을 발현한다: CD140a 분류된 인간 GPC의 분화 상태를 보다 잘 평가하기 위해서, 이들의 발현 프로파일을 CD140a- 태아 피질 세포에 대해 평가하였다. Taqman®(Roche, Alameda, CA) 저밀도 미세유체 어레이를 사용하여, 아교전구세포 운명의 강력한 예언으로서 확인된 48개의 마커 유전자 패널의 고처리량 정량 RT-PCR(qPCR)를 달성하였다(표 3).
[표 3]
CD140a+/PDGFaR+ 태아 인간 희소돌기아교세포 전구세포의 마커 유전자 발현 프로파일
Figure pct00003
Figure pct00004
태아 피질 분석물을 CD140a/PDGFaR 면역활성을 위해 FACS 분류한 후, 즉시 RNA 분석을 위해 냉동시켰다(n=6 태아 샘플). 세포 유형 특이성 마커의 발현을 정량 Taqman® RT-PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 측정하고, 매치된 CD140a-/PDGFaR- 풀과 비교하였다. 발현 데이터를 GAPDH로 표준화하여 계산하고, 대응 t-검정 통계를 통해 유의성을 평가하였다. 오류 발견율(q-값)을 사용하여 다수 시험 효과에 대한 p-값을 조정하였다. 평균 발현비 및 표준 오차 범위를 보여준다. 5% FDR에서 현저히 발현된 유전자를 진하게 표기하고, 현저하게 고갈된 유전자를 이탤릭체로 표기하였다. OPC-발현된 유전자는 태아 CD140a/PDGFaR 분류된 세포에서 매우 풍부하게 되었다.
임신령 20 내지 22주의 6개의 태아 전뇌 샘플을 사용하여, FACS를 사용해서CD140a 발현에 근거한 피질 분리물을 분류하고, CD140a+ 및 CD140a- 분획의 마커 유전자 발현 패턴을 비교하였다(표 3). PDGFRA mRNA는 CD140a- 세포보다 CD140a+ 세포에서 500배 초과로 높았고(대응 t-검정, p=0.013), 이는 엄격한 분류 조건과 CD140a+/PDGFαR+ 집단 분류 수단으로서 항-CD140a의 사용을 입증한다. 다수의 OPC 및 희소돌기아교세포-직계 마커의 상당히 높은 발현이 또한 확인되었다. 예를 들어, CSPG4 프로테오글리칸 NG2는 CD140a+ 세포에서 거의 50배 과발현되고, 희소돌기아교세포 직계 전사 인자들 Olig1, Olig2, Nkx2.2 및 Sox10은 모두 CD140a+ 세포에서 유사하게 풍부했다(표 3). 사실상, 발현 비는 Olig2 및 Sox10의 경우에 극단적이고, 각각은 CD140- 세포에서보다 CD140a+ 세포에서 150배 초과로 과발현되며, 이는 CD140a- 집단으로부터 olig2/sox10의 거의 완전히 고갈을 암시한다. 또한, CD140a+/PDGFαR+ 세포의 전구체 프로파일을, Sox2, 신경 줄기/전구체 발현된 전사 인자의 유의한 발현에 의해 확인하였다.
전구세포 표현형과 일관되게, mRNA 인코딩 분화된 세포 마커는 CD140a+ OPC에서 풍부하지 않았다. 희소돌기아교세포-발현된 수초 단백질 유전자들, MBP, PLP, MOBP, MOG는 발현 범위가 CD140a+ 세포에서 0.1 내지 1.3배였다. 희소돌기아교세포 경막 단백질(OTP)이 유일하게 제외되었고, 이는 CD140a-/PDGFαR- 세포에서보다 CD140a+/PDGFαR+ 세포에서 6.3배 높게 발견되었다(p=0.033). 항원적 표현형과 일치하게, 성상세포 마커 AQP4 및 GFAP는 태아 CD140a 정의된 OPC에서 풍부하지 않았다(표 4).
[표 4]
GPC-특이성 및 세포-세포 신호전달 유전자는 태아 CD140a 정의된 세포에 의해 고도로 발현된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
CD140a 분류된 세포의 마이크로어레이 프로파일을 이들이 제거된 대조군과 직접 비교하였다. CD140a 풍부한 유전자는, 분류된 세포에서 3배 초과로 발현되는 유전자로서 정의되고, 보완된 t-검정 통계와 5% 오류 발견율 범위를 사용하는 대응 t-검정에 따라서 유의했다. 이들 기준 을 사용하여, 408 유전자는 CD140a+ GPC에 의해 발현된 것으로 확인되었다. 세포 유형 발현 또는 신호전달 경로 지위를 기준으로 선택된 유전자를 나타낸다.
대조적으로, 프로-교세포(pro-glial) 칼슘 버퍼 S100β는 CD140a- 세포에서보다 CD140a+ 세포에서 17.2배 높게 상향조절되었다(p=0.003). 마지막으로, 뉴런에 의해 발현된 전사물은 CD140a+/PDGFαR+ 세포에서 유의하게 고갈되고, 튜불린 α1 및 βⅢ-튜불린은 CD140a+ 세포에서보다 CD140a- 세포에서 3.3 내지 4.0배 높았다.
미세아교세포 선택된 전사체 CD68 및 CD86의 비교적 높은 발현이 관찰되었다. 그러나, 태아 신경절 융기 NG2+ 세포가 CD68을 발현할 수 있고, 토마토-렉틴+ 세포가 유사하게 PDGFR를 발현할 수 있으므로, 항원적으로 정의된 인간 OPC는 미세아교세포와 함께 표면 항원을 공유할 수 있고, 이는 CD140a+/PDGFR+ 아교세포 전구체를 이동시킴으로써 미세아교세포 마커의 네가티브 발현을 나타낸다.
Affymetrix(Santa Clara, California) HG-U133+2 어레이를 사용하여, 태아 CD140a 풍부한 세포 및 고갈된 세포의 전사 프로파일을 분석하였다. 개별 CD140a 분류된 샘플을 매치된 고갈 잔여물과 비교하고, 분화 유전자 발현 분석을 수행하였다. 풍부한 유전자는 고갈된 풀에 비해 CD140a+ mRNAs에서 3배 초과로 과발현되는 것으로 정의된다. 보완된 t-검정 통계를 5% 오류 발견율 범위와 함께 사용하여, 실험 Bayes 검정 통계를 사용하는 선형 모델링을 통해, 유전자는 상당히 풍부한 것으로 정의되었다(참조: Smyth 2004, Stat. Appl. Genet. Mol. Bio. 3: Article 3, 이는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 참고로 인용된다). 아노테이션 후, 408개의 유전자는 CD140a+/PDGFαR+ 세포에 의해 유의하게 조절되고 3배 이상까지 선택적으로 과발현되는 것으로 확인되었다. qPCR 마커 데이터와 일치되게, CD140a 분류된 세포는 유의하게 높은 수준의 원형 GPC 마커 OLIG1(PDGFR+에서 56 높음), OLIG2(24배), NKX2.2(20배), PDGFRA(31배), SOX10(31배), CSPG4/NG2(11배) 및 ST8SIA1, A2B5 항원에 대한 합성 효소(3.3배)를 발현하였다. PDGFRA, NG2 및 ST8SIA1/SIAT8A의 높은 발현은 성인 GPC의 표현형과 유사하였다. 유사하게, S100β, OTP 및 CNP 또한 CD140a 분류된 세포에서 유의하게 상향 조절되었다(표 4). 희소돌기아교세포, 성상세포, 뉴런 및 신경 줄기 세포를 포함하는 기타 신경 표현형 마커는 CD140a+ 세포에 의해 고도로 발현되지 않았다. 따라서, CD140a+ 세포에 의해 유의하게 과발현되는 것으로 확인된 모두 10개의 마커 유전자가 실시간 qPCR에 의해 추가로 확인되었고, 이는 마이크로어레이 데이터가 인간 CD140a+/PDGFαR+ GPC의 게놈 프로파일을 충실하게 반영함을 암시한다.
CD140a + GPC 의 유전자 발현 패턴은 현저한 글리칸 조절된 신호전달을 나타낸다: 인간 CD140a+ 세포의 명세 및 분화를 조절하는 신호절단 경로를 확인하기 위해서, 문헌 기반 데이터 수집 및 경로 분석을 수행하되, 먼저 유전자 온톨로지(GO) 아노테이션의 기능적 분류 및 과표시에 집중한다. 신경계 발달에 관련된 유전자가 특히 우세한 것이 주목되었다(Benjamini 보정된 p-값 = 8.6×10-5; GO Biological process GO:0007399). 또한, 온톨로지 클러스터가 세포 소통, 신호 변환 및 세포 표면 연결된 신호 변환과 관련된 것으로 확인되었다(Enrichment Score: 4.36, GO biological process annotations). 다수의 당단백질(Swiss-Prot; Benjamini 보정된 p-값 = 1.8×10-14) 및 통합 형질막 단백질(p=1.4×10-5, GO:0005887)을 동정하였다. 인제누이티 경로 분석(IPA)을 수행하고, 이는 신경발생(p=1.6×10-8) 및, 흥미롭게도, 정신분열증(p=5.0×10-12)에 관여된 유전자의 차별적인 표시를 나타내었다.
KEGG 기반 유전자 세트 부화 분석(Gene Set Enrichment Analysis; GSEA)으로, CD140a- 세포에서와 CD140a+ 세포에서의 조절이 유의하게 상이한 37개 경로를 확인하였다(q<0.05). 이들 중에서, '콘드로이틴 설페이트 생합성'(q = 4.65×10-11) 및 '글리칸 생합성 1'(q = 1.00×10-8)이 가장 유의했다. 유사하게, 인제누이티(Ingenuity Systems, Redwood, CA)에 의해, 가장 유의한 경로로서 콘드로이틴 설페이트 글리코사미노글리칸(GAG)의 활발한 활성을 확인하였다(p=1.32×10-5). 이들 생합성 경로는 크게 CSPG 및 글리칸 생합성에 관여된 효소를 포함한다(표 4). 그 중에서, CD140a-선택적 전사체는 콘드로이틴 설포트랜스퍼라제, CHST3, CHST11 및 우로닐-2-설포트랜스퍼라제(UST)였다. 또한, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(CSPG) 코어 단백질 자체가 또한 고도로 발현되었다. CSPG4(NG2) 및 CSPG5(뉴로글리칸)은 둘 모두, 고갈된 세포에서 관찰되는 것보다 5배 높은 수준으로 발현되었다.
설포트랜스퍼아제의 우세는, CD140a+ 세포에 의해 생성된 콘드로이틴이 마찬가지로 콘드로이틴 설페이트 B 및 D 잔기(CS-B 및 CS-D)를 생성하기 위해 황산화를 수행함을 나타낸다(도 7). CS-GAG 쇄는 많은 성장 인자들을 결합시킬 수 있고, 이들을 세포 표면 수용체에 제공하는 작용을 할 수 있고; CS-B는 FGF2와 플레이오트로핀(PTN)을 결합시키고 유사분열 배양물의 신경 전구체에 대한 FGF2의 유사분열 효과를 증진시킨다. 이와 관련하여, PTN mRNA가 PDGFαR 세포에 의해 고도로 유의하게 발현됨이 주목된다(3.7배, FDR 보정된 q-값=1.65×10-4). 놀랍게도, 성인 GPC는 PTN-수용체, RTPβ/ξ(PTPRZ1)를 고도로 발현한다. 태아 CD140a+ 세포 또한 PTPRZ1을 과발현하는 것으로 밝혀졌으며, PTPRZ1은 어레이에 의해 유의하게 풍부해졌다(보완된 t-검정, p=0.0085). qPCR을 통해, PTPRZ1이 CD140- 세포에 비해 CD140a+ GPC에서 3.74배까지 차별적으로 상향조절되었음을 확인하였다(q=0.034). 이는 태아 OPC에서 뿐만 아니라 성인 OPC에서도 PTN/PTPRZ1 오토크린 경로가 존재함을 의미하고, 또한, PTN에 의한 우세한 CSPG-B-의존성 오토크린 신호절달을 의미한다.
CD140a + GPC 의 전사 프로파일은 활발한 wnt , 노치(notch) 및 EGF 경로를 예측한다: 유전자 온톨로지 기반 GSEA를 통해, wnt, 노치 및 EGF 신호절달 경로가 CD140a 분류된 세포에서 유의하게 과발현되는 것으로 확인되었다(각각 q = 1.67×10-3, 5.06×10-5 및 9.26×10-5). 2개의 TCF 전사 인자 이형(isoform), TCF7L1 및 TCF7L2가 높은 수준으로 존재함은 활발한 wnt 신호전달을 의미한다(표 4). 또한, wnt 표적 유전자의 GSEA는 CD140a+ 세포에 의한 다수의 WNT 표적 유전자의 유의한 과발현을 나타내었다(p=0.011).
히트맵(heatmap)을 사용하여 WNT 표적 유전자를 보여주었다. CD140a 분류된 세포에서 wnt 신호전달 경로 상대적 부화의 기능적 유의성을 조사하기 위해서, 유전자 세트 부화 분석을, 아노테이션된 표적 유전자를 사용하여 수행하였다. 파라미터-GSEA는 CD140a+ 세포에서 wnt 표적 유전자가 상당히 풍부해짐을 나타내었다(p=0.011). 이들 중에서, 15개의 유전자는 CD140a+ 및 CD140a- 세포에 의해 유의하게 다르게 발현되었다(>3배 변화, 5% FDR). 이들 유전자의 생성된 히트맵을 각각의 태아 샘플에 대해 플로팅하였다(n=5). 15개 중 대부분인 12개가 CD140a 분류된 세포에서 유의하게 높게 발현되었다.
Wnt 표적 유전자는 표적 유전자 사이클린 D1(CCND1)을 포함하고, CCND1은 CD140a 분류된 세포에서 13배 초과로 높았다(표 4). 또한, 이들 유전자의 발현은 PDGFαR+/CD140a+ 세포에서의 활발한 wnt 신호전달을 암시한다. PTPZ1이 β-카테닌의 티로신 포스포릴화를 조절할 수 있기 때문에, 콘드로이틴 조절된 신호전달과 wnt 경로 구성원의 공조절은 PTPRZ1에 의한 일반적인 조정을 암시한다.
4개의 노치 조절제가 CD140a+ 선택적 유전자 중에서 발견되었다(p=6.9×10-3). 이들은 노치 리간드 콘탁틴/F3(CNTN1) 및 재그드(jagged) 1(JAG1)을 포함하고, 상기 리간드는 설치류에서 OPC 분화에 대한 상반된 효과를 가질 수 있다. 콘탁틴은 PDGFαR+ 세포에 의해 30배 초과로 풍부해지는 반면(q=4.01×10-15), 재그드 1은 단지 3.3배 높다. 노치 경로의 공활성제(coactivator)인 마스터마인드형(mastermind-like) 2(MAML2)의 발현은 또한, CD140a 분류된 세포에서 8.4배 높은 것으로 밝혀졌다(q=1.86×10-8). 노치 경로 활성화와 일관되게, 전사가 노치 신호전달에 의해 활성화될 수 있는 HES-관련 전사 인자 HEY2는 CD140a+ 세포에서 유의하게 4.5배 높았다(q=1.35×10-3).
다수의 티로신 키나제 성장 인자 수용체와 이들의 조절제는 태아 CD140a+ GPC에 의해 유사하게 과발현되고; 이들은 PDGFRA 자체 뿐만 아니라 상피 성장 인자(EGF) 계열 수용체 EGFR 및 erbB3도 포함하며, EGFR 및 erbB3의 발현은 각각 CD140a- 세포에서보다 CD140a+ 세포에서 3.3배 및 9.7배 높았다. EGFR 및 PDGFRA 수용체 둘 다의 세포간 도메인과 상호작용하는 SH3-연결기 단백질 GRB14 또한 유의하게 과발현되었다. 또한, 5.5배의 높은 EGF-리간드 TGFα 발현(q=4.35×10-6)은 EGFR을 통한 오토크린 신호전달을 나타낸다. 흥미롭게도, 막 결합된 TGF-α는 테트라스파닌 단백질 CD9를 통해 EGFR을 활성화하도록 준비될 수 있고, 이는 CD140a+ 세포에서 7.4배 풍부하다(q=1.1×10-3). CD9는 경막 TGF-α의 결합을 통한 EGFR 활성화를 강하게 증진시킬 수 있고, 이는 EGFR을 통해 CD9-강화된 신호전달에 대한 GPC-선택적 메카니즘을 암시한다.
테트라스파닌 CD9 및 Pdgf αR은 태아 인간 전구체에서 과발현된다: 막 단백질 중에서, 유전자 인코딩 CD9는 태아 인간 CD140a+ 세포에 의해 현저히 과발현되는 것으로 확인되었다. 이에 근거하여, 태아 인간 GPC가 CD9 엑토도메인-유도(ectodomain-directed) FACS를 사용하여 독립적으로 분리가능할 수 있는지를 결정하였다. 유세포분석에 의하면, CD9+ 세포는 태아 중간 구역 및 피질판(n=5)에 모든 세포의 2.75±0.7%를 포함하고, 세포의 1% 미만을 포함하는 태아 VZ(0.51± 0.1%)에서는 덜 흔한 것으로 밝혀졌다. 이어서, 2색 세포분석을 수행하여 CD140a+ GPC 중 CD9+ 세포의 분포를 조사하였다. CD9+ 세포 집단은 CD140a와 부분적으로 중복되어, CD140a+ GPC의 절반이 CD9를 발현하고(49.6± 5%, n=6); 이와 같이, 분리된 전체 풀의 2.6±1.5%가 CD140a 및 CD9를 공발현하였다.
태아 분리물을, 이중 CD140a/CD9 세포분석을 위해, CD140a 및 CD9와 함께 배양하였다. 동형 대조군 항체를 이용한 형광-마이너스 대조군을 사용하여 각각의 항원에 대한 포지티브 분류 게이트를 설정하였다. 6개의 독립 태아 샘플(임신령: 18 내지 20주)에 대해 CD140a/CD9 세포분석을 수행하였다. CD9+ 세포의 약 절반이 CD140a를 공발현하는 한편, CD140a+ 세포의 약 1/3이 CD9를 발현하였다. 이는 매우 유의한 중복을 나타내고, CD140a 분류 후 CD9 포지티브 세포가 14.4±2.3배 풍부해진 것으로 해석된다(p=0.0002). 이러한 결과는 고갈된 집단에 비해 CD140a 세포에서의 CD9 mRNA의 7.4배 높은 발현과 일관된다.
단독으로 사용된, CD9 기반 분류는 분류되지 않은 분리물에 비해 CD140a+/PDGFR+ 세포에서 매우 유의하게 14배 부화를 제공하였다(하나의 샘플 t-검정, p=0.00002). 이들 데이터는 태아 인간 뇌에서 아교 전구체의 항원적으로 뚜렷한 소집단에 대한 마커로서 CD9의 용도를 나타내고, 추가로, 인간 아교전구세포의 희소돌기아교세포 적격인 집단의 분리를 위한 동시 CD9 및 CD140a 유도된 FACS의 유용성을 나타낸다.

Claims (58)

  1. (a) 신경세포 또는 신경전구세포의 집단을 제공하는 단계, 및
    (b) 신경세포 또는 신경전구세포 상의 PDGFαR의 존재를 선별하여 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 분리하는 단계
    를 포함하는, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단의 분리 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    신경세포 또는 신경전구세포 상의 A2B5의 존재를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    신경세포 또는 신경전구세포 상의 A2B5의 부재를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    신경세포 또는 신경전구세포 상의 CD9의 존재를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    신경세포 또는 신경전구세포 상의 PSA-NCAM의 부재를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    신경세포 또는 신경전구세포 상의 CD11의 부재를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    신경세포 또는 신경전구세포 상의 CD32의 부재를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    신경세포 또는 신경전구세포 상의 CD36의 부재를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선별 단계 중 하나 이상을 FACS에 의해 수행하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선별 단계를 자기 분류에 의해 수행하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PDGFαR의 엑토도메인(ectodomain)을 결합하는 항체를 이용하여 PDGFαR 선별 단계를 수행하는 방법.
  12. 제 11 항의 방법으로 제조된 세포의 집단.
  13. (a) 신경세포 또는 신경전구세포의 집단을 제공하는 단계, 및
    (b) 신경세포 또는 신경전구세포 상의 CD9의 존재를 선별하여 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 분리하는 단계
    를 포함하는, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단의 분리 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    신경세포 또는 신경전구세포 상의 PDGFαR의 존재를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항의 방법으로 제조된 세포의 집단.
  16. (a) 신경세포 또는 신경전구세포의 집단을 제공하는 단계,
    (b) 신경세포 또는 신경전구세포 상의 A2B5의 존재를 선별하는 단계,
    (c) 신경세포 또는 신경전구세포 상의 PSA-NCAM의 부재를 선별하는 단계,
    (d) 신경세포 또는 신경전구세포 상의 CD11의 부재를 선별하여 A2B5 포지티브, PSA-NCAM 네가티브, 및 CD11 네가티브 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 분리하는 단계
    를 포함하는, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단의 분리 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    선별 단계 중 하나 이상을 FACS에 의해 수행하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    선별 단계를 자기 분류에 의해 수행하는 방법.
  19. 약 80% 이상의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 포함하는 세포의 집단.
  20. 제 19 항에 있어서,
    아교전구세포가 CD9 마커에 대해 포지티브인 세포의 집단.
  21. 제 19 항에 있어서,
    아교전구세포가 PDGFαR 마커에 대해 포지티브인 세포의 집단.
  22. 제 20 항에 있어서,
    CD9 마커에 대해 포지티브인 하나 이상의 아교전구세포가 PDGFαR 마커에 대해 네가티브인 세포의 집단.
  23. 제 21 항에 있어서,
    PDGFαR 마커에 대해 포지티브인 하나 이상의 아교전구세포가 CD9 마커에 대해 포지티브인 세포의 집단.
  24. 제 21 항에 있어서,
    PDGFαR 마커에 대해 포지티브인 하나 이상의 아교전구세포가 CD9 마커에 대해 네가티브인 세포의 집단.
  25. 아교전구세포의 약 80% 이상이 PDGFαR 마커, CD9 마커, 또는 이들 마커 모두에 대해 포지티브인 아교전구세포의 집단.
  26. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 실질적으로 순수한 집단을 포함하는 세포의 집단.
  27. 제 21 항에 있어서,
    PDGFαR 마커가 PDGFαR 엑토도메인인 세포의 집단.
  28. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 PSA-NCAM 마커에 대해 네가티브인 세포의 집단.
  29. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 CD11 마커에 대해 네가티브인 세포의 집단.
  30. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 CD32 마커에 대해 네가티브인 세포의 집단.
  31. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 CD36 마커에 대해 네가티브인 세포의 집단.
  32. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 A2B5 마커에 대해 포지티브인 세포의 집단.
  33. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 A2B5 마커에 대해 네가티브인 세포의 집단.
  34. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    희소돌기아교세포 편향된 세포가 인간 텔로머(telomer) 확장 역전사효소를 인코딩하는 외인성 핵산을 발현시키는 세포의 집단.
  35. 제 1 항 내지 제 8 항, 제 13 항, 제 14 항 및 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포의 집단을 대상에 이식하는 것을 포함하는 대상의 수초 관련 장애의 치료 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    수초 관련 장애가 저수초화 장애인 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    저수초화 장애가 백색질형성장애인 방법.
  38. 제 36 항에 있어서,
    저수초화 장애가 리소좀저장질환인 방법.
  39. 제 36 항에 있어서,
    저수초화 장애가 뇌성마비인 방법.
  40. 제 36 항에 있어서,
    저수초화 장애가 뇌실주위 백질연화증인 방법.
  41. 제 35 항에 있어서,
    수초 관련 장애가 탈수초성 장애인 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    탈수초성 장애가 염증성 탈수초성 장애인 방법.
  43. 제 42 항에 있어서,
    염증성 탈수초성 장애가 다발성 경화증, 횡단성 척수염, 및 시신경염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  44. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 세포의 집단을 대상에 이식하는 것을 포함하는 대상의 수초 관련 장애의 치료 방법.
  45. 희소돌기아교세포의 분화를 야기하는 조건 하에서 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 세포의 집단을 배양하고, 하나 이상의 분화된 희소돌기아교세포를 대상에 이식하는 것을 포함하는 대상의 수초 관련 장애의 치료 방법.
  46. (a) 신경세포 또는 신경전구세포의 집단을 분리하는 단계;
    (b) 신경세포 또는 신경전구세포 상의 PDGFαR, CD9, 또는 이들 모두의 존재를 선별하는 단계; 및
    (c) 하나 이상의 PDGFαR 및/또는 CD9 포지티브 세포를 불사화하여 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포주를 제조하는 단계
    를 포함하는, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포주의 제조 방법.
  47. 제 46 항에 있어서,
    불사화 단계가 프로모터에 작동가능하게 링크된 인간 텔로머 확장 역전사효소를 인코딩하는 핵산 서열을 세포에 도입하는 것을 포함하는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서,
    도입이 바이러스 매개성 형질도입, 전기천공, 바이오리스틱(biolistic) 형질도입, 또는 리포좀 매개성 형질도입인 방법.
  49. 제 48 항에 있어서,
    바이러스 매개성 형질도입이 레트로바이러스 매개성 형질도입, 아데노(adeno) 연관 바이러스 매개성 형질도입, 렌티바이러스 매개성 형질도입, 아데노바이러스 매개성 형질도입, 및 헤르페스바이러스 매개성 형질도입으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  50. (a) 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 세포의 집단을 제공하는 단계; 및
    (b) 하나 이상의 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포를 불사화하여 세포주를 생산하는 단계
    를 포함하는, 희소돌기아교세포 편향된 아교전구세포주의 제조 방법.
  51. 제 50 항에 있어서,
    불사화 단계가 프로모터에 작동가능하게 링크된 인간 텔로머 확장 역전사효소를 인코딩하는 핵산 서열을 세포에 도입하는 것을 포함하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서,
    도입이 바이러스 매개성 형질도입, 전기천공, 바이오리스틱 형질도입, 또는 리포좀 매개성 형질도입인 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    바이러스 매개성 형질도입이 레트로바이러스 매개성 형질도입, 아데노 연관 바이러스 매개성 형질도입, 렌티바이러스 매개성 형질도입, 아데노바이러스 매개성 형질도입, 및 헤르페스바이러스 매개성 형질도입로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  54. (a) 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 세포의 집단을 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양된 세포를 스크리닝될 제제와 접촉시키는 단계;
    (c) 제제와 접촉된 세포의 운명, 즉 희소돌기아교세포 운명의 증가 또는 감소, 또는 성상세포 운명의 증가 또는 감소를 검출하여, 아교세포 운명을 조절하는 제제를 표시하는 단계
    를 포함하는, 아교전구세포 운명을 조절하는 제제의 스크리닝 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    조절된 아교세포 운명을 갖는 세포의 생존 능력을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  56. 제 54 항에 있어서,
    검출 단계가 하나 이상의 희소돌기아교세포 또는 성상세포 특이적 마커를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서,
    마커의 검출이 FACS를 포함하는 방법.
  58. 제 56 항에 있어서,
    마커의 검출이 면역조직화학을 포함하는 방법.
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