KR20100126375A

KR20100126375A - 비타민 ｄ와 25-하이드록시비타민 ｄ3의 조합물

Info

Publication number: KR20100126375A
Application number: KR1020107020252A
Authority: KR
Inventors: 네일 로버트 벅; 브루노 에이치 레우엔베르거; 스벤 볼프람; 바우터 클레어하우트; 엘리자베쓰 스토에클린; 카이 우르반
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2008-02-13
Filing date: 2009-02-12
Publication date: 2010-12-01
Also published as: BRPI0907952B1; JP2011512342A; AU2009214049B2; EP2240183A1; MX2010008894A; IL207589A; IL207589A0; JP5509503B2; AU2009214049A1; KR20150139629A; WO2009101132A1; CN101951920A; CN106214683A; EA201001283A1; BRPI0907952A2; US20120196057A1; US20160324877A1

Abstract

본 발명은 비타민 D(콜레칼시페롤 및/또는 에르고칼시페롤) 및 25-OH D3(칼시페다이올)을 포함하는 조성물, 및 적어도 인간 중의 비타민 D의 농도, 생체이용률, 대사작용 또는 효능에 영향을 주는 상기 조성물의 용도에 관한 것이다. 또한, 상기 조성물의 형태 및 투여용량뿐만 아니라 분무-건조된 제형을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

비타민 Ｄ와 25-하이드록시비타민 Ｄ3의 조합물{COMBINATION OF VITAMIN D AND 25-HYDROXYVITAMIN D3}

본 발명은 비타민 D(콜레칼시페롤 및/또는 에르고칼시페롤) 및 25-하이드록시비타민 D3(칼시페다이올)을 포함하는 조성물, 및 적어도 비타민 D3의 농도, 생체이용률, 대사작용 또는 효능에 미치는 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.

비타민 D(예를 들어, 에르고칼시페롤 및 콜레칼시페롤)는 이들의 생물학적 활성에 의해 정의되는 지용성 화합물 그룹이다. 비타민 D의 결핍은 어린이에서 구루병을 성인에서 골연화증을 일으킨다. 그러나, 수 개월 동안 권장 하루치 용량(즉, 5 내지 15 ㎍ 또는 200 내지 600 IU 비타민 D)의 100배 이상을 만성적으로 섭취한 후에 독성이 생길 수 있다. 비타민 D의 경우, "독성에 대한 역치는 500 내지 600 mcg/kg 체중/day이다. 일반적으로, 성인은 장기간 동안 RDA의 3배 이상을 소비해서는 안 된다"(문헌[Garrison & Somer, The Nutrition Desk Reference , Third Ed ., McGraw-Hill, pg. 82, 1997]). 375 nmol/L를 초과하는 25-하이드록시비타민 D의 혈액 농도에서는 고칼슘혈증(hypercalcemia)이 생길 수 있다. 보다 최근에, 비타민 D의 안전한 상한치는 적어도 250 ㎍/day(10,000 IU)인 것으로 확인되었다(문헌[Hathcock et al. Am .J. Clin . Nutr. 85:6-18, 2007]). 예를 들어 식이 보충제의 섭취는 약 200 nmol/L의 25-하이드록시비타민 D의 혈액 농도를 유발하는 것으로 나타났다.

비타민 D는, 간에서 하이드록시화되어 25-하이드록시비타민 D(칼시페다이올; 25-OH 비타민 D; 25-OH D)를 생성한 후 신장 및 다른 조직에서 또 다른 하이드록시화를 거쳐 1,25-다이하이드록시비타민 D(비타민 D의 활성 호르몬 형태)를 생성시키는 전구호르몬(prohormone)이다. 1,25-다이하이드록시비타민 D는 혈액으로 방출되고 비타민 D 결합 단백질(DBP)과 결합하여 표적 조직으로 전달된다. 1,25-다이하이드록시비타민 D와 비타민 D 수용체 간의 결합은 상기 복합체가 세포 핵의 전사 인자로서 작용하도록 한다.

비타민 D 결핍은 뼈의 재흡수를 촉진할 수 있다. 이는 또한 심혈관계, 면역계 및 근육계의 기능을 조절할 수 있다. 역학 조사에 따르면, 비타민 D 섭취와 이것이 혈압 및 글루코오스 대사에 미치는 영향 간의 연관성이 확인되었다. 비타민 D의 활성은 부갑상선 호르몬에 의해 네거티브 피드백을 받는다.

비타민 D와 25-OH D3 둘 다 과거에 약제로서 투여되었다. 비타민 D는 물론 널리 입수가능하고, 25-OH D3는 예전에 "칼데롤(CALDEROL)"이라는 명칭 하에 미국 오르가논(Organon)에 의해 미국에서 판매되었지만, 현재는 FDA에 중단(discontinued) 의약품으로 등재되어 있다. 이것은 옥수수 오일 및 25-OH D3를 함유하는 젤라틴 캡슐이었다.

25-OH D3의 액체 형태가 오일 용액으로 "하이드로페롤(HIDROFEROL)"이라는 명칭 하에 파에스 파르마(FAES Farma)에 의해 스페인에서 현재 판매되고 있다.

비타민 D와 25-OH D3의 조합물은 동물 사료에 사용되고 있다. 사료에 사용하기 위한 25-OH D3는 "로비믹스 하이-D(ROVIMIX HY-D)"라는 명칭 하에 디에스엠(DSM)으로부터 상업적으로 입수가능하다.

트리취(Tritsch) 등(US 2003/0170324)은 적어도 오일에 용해된 5 내지 50%(wt/wt) 양의 25-OH D3 및 항산화제, 25-OH D3과 오일의 액적을 캡슐화하는 제제, 및 영양 보충제(예를 들어, 비타민 D3)를 포함하는 사료 프리믹스(feed premix) 조성물을 개시하고 있다. 이 같은 프리믹스는 가금류, 돼지, 개과 또는 고양이과 식품에 첨가될 수 있다. 이러한 조성물은 25-OH D3를 산화에 대해 안정화시킨다.

시모스-누네스(Simoes-Nunes) 등(US 2005/0064018)은 동물 사료에 25-OH 비타민 D3와 비타민 D3의 조합물을 첨가하는 것을 개시하고 있다. 구체적으로, 약 10 내지 약 100 ㎍/kg의 25-OH 비타민 D3 및 약 200 내지 약 4,000 IU/kg의 비타민 D3를 돼지 사료에 첨가한다. 이러한 첨가는 돼지의 뼈 강도를 향상시킨다.

스타크(Stark) 등(US 5,695,794)은 25-OH 비타민 D3와 비타민 D3의 조합물을 가금류 사료에 첨가하여 경골연골발육부전증(tibial dyschondroplasia)의 영향을 개선시키는 것을 개시하고 있다.

보렌스타인(Borenstein) 등(US 5,043,170)은 산란 닭 및 늙은 닭의 알 강도 및 다리 강도를 개선하기 위한, 비타민 D3와, 1-알파-하이드록시콜레칼시페롤 또는 1-알파,25-다이하이드록시콜레칼시페롤의 조합물을 개시하고 있다.

청(Chung) 등(WO 2007/059960)은 비타민 D3 및 25-하이드록시비타민 D3 둘 다를 함유하는 규정식을 먹인 암퇘지(sow)에서 일반적인 건강 상태, 몸체, 한배 새끼의 수(liter size) 및 건강, 및 다른 생산 변수들이 개선되었음을 개시하고 있다. 또한, 25-OH D3 인간 식품 보충제를 개시하고 있지만, 이의 투여량 범위(5 내지 15 ㎍/kg 체중)는 하루 최대 투여량(1인당 300 내지 900 ㎍)과 같이 매우 높다.

상술된 문헌들은 비타민 D3와 25-OH D3의 조합물을 인간을 위한 약제, 식품 또는 영양제로서 사용하거나, 또는 그의 인간 건강에 미치는 영향을 교시하거나 암시하고 있지 않다. 이러한 조성물의 형태 및 투여용량은 인간에 의한 비타민 D의 사용에 바람직한 영향을 미친다(예컨대, 약동학(pharmacokinetics)). 인간에게 비타민 D 및 25-OH D3 모두를 투여하는 것의 역학에 대해, 우리가 아는 바로는 이전에는 연구된 적이 없다. 다른 장점 및 개선점은 후술되거나 또는 본원의 개시내용으로부터 명백해질 것이다.

놀랍게도, 비타민 D와 25-OH D3의 조합물을 인간에게 투여한 경우 혈장 25-OH D가 서로 상승효과적으로 증가함을 발견하였다. 이러한 영향은 즉시 관찰되며 대략 초기 6시간 후에 가장 뚜렷하다. 또한, 혈장 수준의 증가가 대략 206시간에 걸쳐 유지된다. 그러므로, 본 발명은 인간의 약제로서 사용하기 위한, 비타민 D(콜레칼시페롤 및/또는 에르고칼시페롤)와 25-OH D3(칼시페다이올)의 조합물을 포함한다. 이 같은 조성물의 한 가지 가능한 용도는 골다공증 치료제이지만, 본 발명의 조합물은 비타민 D 또는 25-OH D 결핍을 드러내는 모든 징후에 적합하다.

또한, 본 발명에 따르면, 25-OH D3와 비타민 D의 조합물은 서로 상승효과적으로, 비타민 D 또는 25-OH D3 중 어느 하나와는 반응하지 않는 많은 유전자를 비롯한, 많은 수의 비타민 D 응답 유전자를 조절(과잉발현 또는 과소발현)하는 것을 발견하였다. 이는, 실제로 모든 비타민 D가 먼저 25-OH D로 대사된다고 하는 비타민 D 대사작용의 현재 모델로는 설명되지 않는 놀라운 결과이다.

본 발명에 따르면, 상기 조합물은 하기 두 가지 중요한 장점을 제공한다:

1) 25-OH D의 신속하고 상승적인 혈장 응답을 초래하는 점;

2) 의외로 뚜렷하고 긴 플래토(plateau) 상태의 혈장 25-OH D 수준을 유발하는 점.

이들은 특히 비타민 D 결핍 치료의 중요한 목표(즉, 적정량 미만의 비타민 D 상태 및 장기간 안정한 혈장 농도를 신속히 보정하여 모든 비타민 D 의존성 조직에 충분한 공급을 보장하는 것)이다.

본 발명의 또 다른 양태는, 25-OH D3, 바람직하게는 비타민 D와 25-OH D3의 조합물을 함유하는, 인간 소비에 적합한 식품, 기능성 식품, 식품 보충제 또는 영양제이다.

도 1은 하지(hindlimb) 무부하 그룹("HU 그룹") 및 처리 그룹(비타민 D3, 25-OH D3 또는 이들의 조합물)에 대한 쥐과 유전자에 대해 차등 발현된 프로브 세트(probe set)의 벤 다이어그램(Venn Diagram)을 나타낸 것이다.
도 2는 25-OH D3 처리 그룹과 25-OH D3 + 비타민 D의 조합물 처리 그룹 간에 차등 발현된 프로브 세트의 벤 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 3은 비타민 D3 처리 그룹과 25-OH D3 + 비타민 D3의 조합물 처리 그룹 간에 차등 발현된 프로브 세트의 벤 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 4는 HU 그룹과 25-OH D3 + 비타민 D3의 조합물 처리 그룹 간에 차등 발현된 유전자에 대한 1745개의 프로브 세트의 인리치먼트 분석(enrichment analysis)(진고 메타코어(GeneGo MetaCore)로 수행됨)이다.
도 5는 25-OH D3 + 비타민 D3 처리 그룹에서 차등 발현된 프로브 세트 및 선택된 골격근 유전자에 대한 프로브 세트의 벤 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 6은 25-하이드록시비타민 D3 처리 그룹에서 차등 발현된 프로브 세트 및 선택된 골격근 유전자에 대한 프로브 세트의 벤 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 7은 비타민 D3 처리 그룹에서 차등 발현된 프로브 세트 및 선택된 골격근 유전자에 대한 프로브 세트의 벤 다이어그램을 나타낸 것이다.

명세서 및 특허청구범위에 사용된 "비타민 D"란 용어는 비타민 D3(콜레칼시페롤) 및/또는 비타민 D2(에르고칼시페롤)을 의미한다. 인간은 비타민 D2(에르고칼시페롤)를 만들 수는 없지만 비타민 D의 공급원으로 사용할 수는 있다. 비타민 D2는 다양한 식물에 의해 합성될 수 있고 종종 비타민 D3에 대한 등가물로서 보충제 중의 비타민 D로 사용된다.

"비타민 D 대사산물"이란 25-하이드록시비타민 D3를 제외한 비타민 D의 임의의 대사산물을 의미한다.

"25-OH D3"란 구체적으로 25-하이드록시비타민 D3를 지칭한다.

"25-OH D"란, 혈장에서 발견되는 주요 순환 형태인 비타민 D2 또는 비타민 D3의 25-하이드록실화된 대사산물을 지칭한다.

한 실시양태에서, 비타민 D, 25-OH D3 및 약학적으로 허용가능한 항산화제, 및 정제, 캡슐 또는 투여가능한 형태의 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 인간 용도에 적합한 약학 조성물이 제공된다.

본 발명은 또한 활성 성분이 본질적으로 비타민 D와 25-OH D3의 조합물, 더욱 바람직하게는 비타민 D3와 25-OH D3의 조합물로 이루어진 인간 약학 조성물에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서는, 25-OH D3 용량과 함께 비타민 D 또는 비타민 D3의 다수의 개별 용량으로 구성된 키트(kit)가 제공된다. 이들은 병, 블리스터 팩(blister pack) 또는 바이알 랙(vial rack) 등과 같은 용기에 보관될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 조성물을 인간에게 소정 용량으로서 투여하라는 설명서가 상기 키트 내에 제공된다.

또 다른 실시양태에서는, 25-OH D3 및 약학적으로 허용가능한 항산화제의 분무-건조된 제형 하나 이상으로 이루어진 인간 용도에 적합한 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 또한 비타민 D 또는 비타민 D3의 분무-건조된 제형으로 이루어질 수 있다. 다르게는, 상기 조성물은 비타민 D 또는 비타민 D3 및 25-OH D3, 및 약학적으로 허용가능한 항산화제의 혼합물일 수 있으며, 이로부터 분무-건조된 제형이 제조된다. 또는, 비타민 D 또는 비타민 D3 및 약학적으로 허용가능한 항산화제의 분무-건조된 제형 하나 이상의 제 1 조성물, 및 25-OH D3의 분무-건조된 제형 하나 이상의 제 2 조성물로 별도로 구성된 키트가 제공된다.

또 다른 양태에서는, 분무-건조된 제형을 제조하는 방법이 제공된다. 적어도 비타민 D, 25-OH D3 또는 둘 다를 중간 쇄 트라이글리세라이드, 코코넛 오일 또는 팜 오일과 같은 적합한 오일에 용해시켜 비수성 상을 제공한다. 비수성 상과 수성 상을 에멀젼화시킨다. 이 에멀젼을 분무하고 건조하여 분말로 만든다. 다르게는, 비타민 D 또는 비타민 D3 및 25-OH D3를 별도로 분무 건조하여 분말로 만든 후 서로 혼합한다.

또 다른 양태에서는, 인간에게 비타민 D 및 25-OH D3를 투여하는 방법이 제공된다. 이에 의해, 25-OH D의 농도가 혈액, 혈장 또는 혈청에서 증가 또는 유지될 수 있고; 25-OH D의 정상 상태 농도가 혈액, 혈장 또는 혈청에서 달성될 수 있으며; 25-OH D의 혈장 또는 혈청 농도의 예측가능성이 증가될 수 있다.

이 같은 투여에 의해 달성되는 25-OH D의 피크 농도는 30 내지 375 nmol/L, 바람직하게는 약 120 내지 300 nmol/L일 수 있다. 이 같은 투여에 의해 달성되는 25-OH D의 정상 상태 농도는 바람직하게는 60 nmol/L를 초과한다.

또 다른 실시양태에서, 25-OH D3 단독 또는 비타민 D와의 조합물은 인간 소비에 적합한 식품, 기능성 식품, 식품 보충제 또는 영양제에서 활성 성분이다. 25-OH 및/또는 D3의 투여용량은 약학 제품에 존재하는 것들과 같을 수 있으나, 바람직하게는 더 낮은 범위로 되는 경향이 있다. 식품 보충제 및 영양제는 정제, 캡슐 또는 기타 편리한 투여 형태일 수 있다. 식품은 음료 또는 식품일 수 있고, 바람직한 경우, 기타의 비타민, 미네랄 등과 같은 다른 영양학적으로 효과적인 화합물을 함유할 수도 있다.

비타민 D 결핍은 고령 인구 및 연령과 상관없이 만성 부동증(chronic immobility)으로 고생하는 사람들에게 특히 만연되고 있는 증상이다. 이는 햇빛에의 노출이 일반적으로 부족하거나, 비타민 D를 제조 또는 이를 효과적으로 대사시킬 수 있는 몸의 능력이 떨어지거나, 또는 기타 많은 요인들 때문일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 한 양태는 고령 인구에서 비타민 D와 25-OH D3의 조합물의 사용이다. 본원에 사용된 "고령"이란 용어는 65세 초과, 바람직하게는 70세 초과, 더욱 바람직하게는 80세를 초과하는 개체를 포함하는 것을 의미한다.

또 다른 실시양태에서, 25-OH D3와 비타민 D의 조합물은 비타민 D 결핍 또는 부족을 특징으로 하는 증상을 발달시킬 위험에 있는 사람에 적합하다. 이는 구체적으로 폐경후 여성(즉, 약 45세 이상) 및 약 45세 이상의 남성을 비롯한 성인을 포함할 것이다. 이는 특히 다량의 자연광에 노출되지 못한 사람들, 예를 들어 관습적으로 긴 옷을 입는 사람, 규칙적으로 외출하지 않는 사람, 햇빛에 노출시 선스크린제를 사용하는 사람, 또는 햇빛이 비교적 강렬하지 않은, 적도의 북쪽 또는 남쪽 지역에 사는 사람에게 특히 적합하다.

비타민 D와 25-OH D3의 조합물은 하루 1회, 주 1회 또는 월 1회 투여될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명에 따르면, 비타민 D와 25-OH D3의 조합물을 전달함으로써, 25-OH D의 혈장 수준이 서로 상승효과적으로 증가함을 발견하였다. 이러한 영향은 즉시 관찰되며 초기 약 6시간 후에 가장 뚜렷하다. 또한, 혈장 수준의 증가는 약 206시간 이상 동안 (비교적 낮은 수준이지만 여전히 임상적으로는 효과적인 수준으로) 지속된다. 그러므로, 본 발명은 단일 비타민 D 형태의 종래 치료에 비해 분명한 두 가지 장점을 제공한다. 즉, 이 같은 빠른 효과는 급성 생체이용률을 제공하지만, 지속적인 상승된 혈장 수준은 연장된 생체이용률을 보장한다.

또 다른 양태에서는, 적어도 25-OH D3의 분무-건조된 제형을 인간에게 투여함에 의한 사용 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태는 비타민 D와 25-OH D3의 조합물을 투여함으로써 흡수장애 증후군(예를 들어, 셀리악 병, 스프루 또는 단장 증후군에 의해 발병됨)을 가진 인간에게 비타민 D 또는 이의 대사산물을 제공하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 양태는 인간에게 비타민 D와 25-하이드록시비타민 D3의 조합물을 제공함으로써 비타민 D를 25-하이드록시비타민 D로 효과적으로 처리할 수 없는, 간 기능이 손상된 인간에게 비타민 D 대사산물을 제공하는 방법이다.

비타민 D 및 25-OH D3는 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있고, 이의 조성물은 편리한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 비타민 D, 25-OH D3 또는 둘 다(별개로 또는 함께)의 결정을 오일에 용해시키고 가열 및 진탕한다. 바람직하게는, 상기 오일은 용기로 옮겨져 가열된다. 그 후, 비타민 D, 25-OH D3 또는 둘 다를 용기에 첨가하고, 그동안 오일의 온도를 유지하거나 시간에 따라 증가시킨다. 상기 조성물을 진탕하여 비타민 D, 25-OH D3 또는 둘 다의 결정을 용해시킨다. 오일에 첨가하기 전에, 상기 결정의 크기를 밀링 및/또는 체질에 의해 감소시켜 용해를 촉진할 수 있다. 상기 조성물을, 교반, 용기 회전, 혼합, 균질화, 재순환 또는 초음파처리에 의해 진탕시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 오일을 용기에서 약 80 내지 약 85℃의 온도로 가열하고 사이징된 결정을 용기에 도입하고 내용물을 교반하여 상기 결정들을 상기 오일에 용해시킨다.

상기 "오일"은 임의의 적합한 식용 오일, 지질 또는 지방: 예를 들어 바바수 오일, 코코넛 오일, 코훈 오일, 머루미루 탈로우, 팜핵 오일, 또는 투쿰 오일일 수 있다. 상기 오일은 천연, 합성, 반합성 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다. 천연 오일은 임의의 공급원(예를 들어, 동물, 식물, 균류, 해양생물)으로부터 유도될 수 있고; 합성 또는 반합성 오일은 편리한 기술에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상기 오일은 식물 중간 쇄 트라이글라세라이드의 혼합물, 주로 카프릴산 및 카프르산, 팜유 또는 코코넛 유 또는 이들의 혼합물이다. 상기 조성물은 임의적으로 하나 이상의 다른 적합한 성분들, 예를 들어 약학적으로 허용가능한 항산화제, 보존제, 용해제, 계면활성제, pH 조정제 또는 완충제, 습윤제 및 이들의 임의의 조합물을 함유할 수 있다. 이들은 약학적으로 허용가능한 담체의 예이다.

적합한 항산화제는 토코페롤, 혼합된 토코페롤, 천연 또는 합성 공급원으로부터의 토코페롤, 부틸화된 하이드록시 톨루엔(BHT), 부틸화된 하이드록시 아니졸(BHA), 천연 항산화제 예를 들어 로즈마리 추출물, 프로필 갈레이트, 및 인간을 위한 약제 제조에 사용되는 임의의 다른 것들을 포함한다. 바람직하게는, 항산화제는 토코페롤이다. 적합한 보존제는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 칼륨 소르베이트, 나트륨 벤조에이트, 벤조산 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 적합한 용해제는 무기 또는 유기 용매: 예를 들어 알코올, 염화된 탄화수소 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 적합한 계면활성제는 음이온성, 양이온성 또는 비이온성, 예를 들어 아스코빌 팔미테이트, 폴리소르베이트, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 임의의 조합물일 수 있다. 적합한 pH 조정제 또는 완충제는 시트르산-나트륨 시트레이트, 인산-나트륨 포스페이트, 아세트산-나트륨 아세테이트 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 적합한 습윤제는 글리세롤, 솔비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다.

일단 형성되면, 상기 오일 조성물은 다양한 다른 유용한 조성물에 혼입될 수 있으며, 이들 중 일부를 이하에서 논의한다. 예를 들어, 에멀젼을 형성하고, 이를 임의적으로 캡슐화하거나 분무 건조시킬 수 있다. 상술된 비수성 조성물을 수성 조성물과 조합함으로써 다양한 에멀젼을 제조할 수 있다. 상기 에멀젼은 임의의 유형일 수 있다. 적합한 에멀젼은 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 무수물 에멀젼, 고체 에멀젼 및 마이크로에멀젼을 포함한다.

상기 에멀젼은 임의의 편리한 기술에 의해 제조될 수 있다. 상기 에멀젼은 수성 조성물 및 비수성(예를 들어, 오일) 조성물을 함유하며, 이때 후자는 오일 조성물의 총 중량을 기준으로 약 3 내지 약 50 중량%의 양으로 오일 중에 용해된 비타민 D, 25-OH D3, 또는 둘 다(별개로 또는 함께)를 포함한다. 본원에 사용된 "수성 조성물" 및 "수성 상"은 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 상기 에멀젼은 약 20 내지 약 95%의 수성 조성물, 및 약 5 내지 약 80%의 비수성 조성물을 함유할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 상기 에멀젼은 약 85 내지 약 95%(vol/vol)의 수성 조성물, 및 약 5 내지 약 15%(vol/vol)의 비수성 조성물을 함유한다. 편리하게는, 상기 비수성 조성물은 상기 수성 조성물 중에 액적으로서 분산될 수 있다. 예를 들어, 상기 액적은 수성 조성물에서 약 500 nm 미만의 평균 직경을 가질 수 있다. 편리하게는, 상기 액적은 약 150 내지 약 300 nm의 평균 직경을 갖는다.

특히 유리한 실시양태에서, 상기 에멀젼은 캡슐화제를 함유하며, 이는 상기 에멀젼의 추가 처리시(예를 들어, 분무 건조에 의해) 상기 오일 조성물의 캡슐화를 촉진한다. 캡슐화제는 상기 오일 조성물을 캡슐화할 수 있는 임의의 식용 물질일 수 있다. 바람직하게는, 캡슐화제는 콜로이성 물질이 우세하다. 이 같은 물질은 전분, 동물 자원으로부터의 단백질(젤라틴 포함), 식물 자원으로부터의 단백질, 카제인, 펙틴, 알지네이트, 아가, 말토덱스트린, 리그닌 설포네이트, 셀룰로오스 유도체, 당, 사카라이드, 솔비톨, 검 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다.

적합한 전분은 식물 전분(예를 들어, 미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 내셔널 스타치 앤드 케미칼 코포레이션(National Starch & Chemical Corp.)으로부터의 캡슐(CAPSUL^®) 또는 하이-캡(HI-CAP^®)), 기타 변성된 식품 전분 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 전분은 CAPSUL^® 변성된 식물 전분이다. 동물 자원으로부터 적합한 단백질은 젤라틴(예를 들어, 소 젤라틴, 블룸 가(Bloom number)가 상이한 돼지 젤라틴(유형 A 또는 B), 생선 젤라틴), 탈지유 단백질, 카제이네이트 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 바람직하게는, 동물 단백질은 젤라틴이다. 식물 자원으로부터 적합한 단백질은 감자 단백질(예를 들어, 프랑스 레스트렘 소재의 로케 프레레 소시에테 아노니메(Roquette Preres Societe Anonyme)로부터의 알부렉스(ALBUREX^®)), 완두콩 단백질, 대두 단백질 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 식물 단백질은 알부렉스 감자 단백질이다. 상이한 텍스트로스 등가물을 갖는 적합한 말토덱스트린은 말토덱스트린 5, 말토덱스트린 10, 말토덱스트린 15, 말토덱스트린 20, 말토덱스트린 25 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 말토덱스트린은 말토덱스트린 15이다. 적합한 셀룰로오스 유도체는 에틸 셀룰로오스, 메틸에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 적합한 사카라이드는 락토오스, 수크로오스 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 사카라이드는 수크로오스이다. 적합한 검은 아카시아, 로쿠스트 빈, 카라긴 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 검은 아카시아 검이다.

상기 에멀젼이 캡슐화제를 함유하는 경우, 상기 캡슐화제는 임의의 편리한 기술에 의해 물에 분산되어 수성 상을 형성할 수 있다. 상기 수성 상은 용액, 또는 선택된 성분들의 특성에 따른 혼합물일 수 있다. 선택된 성분들은 균질화, 혼합, 에멀젼화, 재순환, 정적 혼합, 초음파처리, 교반, 가열 또는 이들의 임의의 조합을 비롯한 임의의 편리한 기술에 의해 분산될 수 있다. 이어서, 생성되는 수성 상의 점도를 물의 첨가에 의해 원하는 대로 조정한다. 상기 에멀젼의 수성 조성물은 임의적으로 비수성 조성물에 관한 상술된 것들을 포함하나, 이들에 국한되지 않는 임의의 다른 적합한 물질을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상기 수성 조성물은 캡슐제, 막-형성제, 가소제, 보존제, 항산화제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 나트륨 벤조에이트 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 적합한 항산화제는 나트륨 아스코르베이트, 아스코르베이트, 아스코르브산, 시트르산 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다.

바람직하게는, 수성 상은 변성된 식품 전분 예를 들어 옥텐일 석신일 전분(CAPSUL^®), 말토덱스트린 및 나트륨 아스코르베이트를 함유한다. 또 다른 바람직한 수성 상은 감자 단백질(ALBUREX^®), 말토덱스트린 20 및 나트륨 아스코르베이트를 함유한다. 상기 선택된 성분은 임의의 편리한 기술, 바람직하게는 교반에 의해 물에 용해될 수 있다. 상기 혼합물은 바람직하게는 균일해지고 덩어리가 없어질 때까지 균질화된다. 바람직하게는, 상기 균질화는 약 50 내지 약 80℃ 사이의 온도에서 수행된다. 이어서, 생성되는 수성 상의 최종 점도를 원하는 점도, 바람직하게는 약 250 내지 약 450 mPa·s, 더욱 바람직하게는 약 300 내지 약 400 mPa·s, 더욱더 바람직하게는 약 385 mPa·s(비드렛(beadlet) 제조용), 또는 60 내지 300 mPa·s(제형 분무 건조용)로 조정할 수 있다.

상기 에멀젼은, 균질화, 회전자-고정자 전단, 고압 전단 및 공동(cavitation), 고속 "코울(cowles)" 또는 전단 진탕 및 이들의 임의의 조합을 비롯한 임의의 수단에 의해 비수성 조성물 및 수성 상을 에멀젼화시킴으로써 형성될 수 있다. 상기 에멀젼의 부피 및 점도는 바람직하게는 에멀젼화 이후 물의 첨가에 의해 조정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 비수성 및 수성 조성물은 균질화에 의해 에멀젼화될 수 있다. 바람직하게는, 상기 에멀젼은 임의의 미네랄, 전이 금속 또는 퍼옥사이드를 함유해서는 안 된다.

상술된 바와 같이, 상기 에멀젼은 다른 유용한 조성물, 특히 캡슐화된 오일, 예를 들어 분무-건조된 분말을 제조하는 데 사용되거나 이에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 상기 캡슐화된 오일은 오일 조성물 및 상기 오일 조성물을 캡슐화시키는 캡슐화제를 포함하며, 이때 상기 오일 조성물은 오일 조성물의 총 중량을 기준으로 약 5 내지 약 50 중량%의 양으로 상기 오일에 용해된 비타민 D, 25-OH D3 또는 둘 다를 함유한다. 상기 캡슐화된 오일은 임의의 편리한 기술, 예를 들어 분무 건조, 냉동 건조, 유동층 건조, 트레이 건조, 흡착 및 이들의 임의의 조합을 비롯한 임의의 편리한 기술에 의해 상술된 에멀젼을 건조함으로써 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상기 캡슐화된 오일은 캡슐화제를 함유하는 상기 수성 상을 갖는 에멀젼을 분무 건조함으로써 제조되며, 분무 건조 변수들은 최종 캡슐화된 오일에 바람직한 물리적 특성에 따른다. 이 같은 물리적 변수들은 입자 크기, 분말 형태 및 흐름, 및 수분 함량을 포함한다. 바람직하게는 상기 오일은 상기 캡슐화된 오일의 총 중량을 기준으로 약 30 중량% 미만, 약 20 중량% 미만, 약 10 중량% 미만, 또는 약 5 중량% 미만의 양으로 존재한다. 상기 캡슐화된 오일은 양호한 유동성을 가져야 하고 비타민 D 및/또는 25-OH D3는 상기 조성물에 걸쳐 균질하게 분포되어야 한다. 편리하게는, 상기 캡슐화된 오일은 분말이다. 임의의 다른 적합한 첨가제가 상기 캡슐화된 오일에 첨가될 수 있다. 이 같은 첨가제 중 하나는 상기 캡슐화된 오일의 유동성을 증가시키는 이산화규소와 같은 유동제일 수 있다.

상기 조성물은 정제, 캡슐(예를 들어, 경질 또는 연질), 또는 주사액(예를 들어, 오일 또는 에멀젼)의 형태로 제공될 수 있다. 이들은 하루 1회 용량으로 포장될 수 있다.

투여용량

매일. 두 개의 활성 성분들이 별개로 투여되는 본 발명에 따른 조성물은 비타민 D 또는 25-OH D3를 약 1 내지 약 50 ㎍, 바람직하게는 약 5 내지 25 ㎍의 양으로 함유한다. 다르게는, 비타민 D 및 25-OH D3 둘 다를 갖는 하루 1회 투여용량은 각각의 활성 성분을 약 1 내지 약 50 ㎍, 바람직하게는 약 5 내지 25 ㎍의 양으로 함유한다.

비타민 D 대 25-OH D3의 투여용량 비율은 약 50:1 내지 약 1:50, 더욱 바람직하게는 약 25:1 내지 약 1:25, 더욱더 바람직하게는 약 6:1 내지 약 1:6일 수 있다.

다수의 개별 투여용량은 단일 키트(또는 용기)로 포장될 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 별도로(즉, 60개의 분리 용량) 또는 조합된(즉, 두 활성 성분을 함유하는 30개의 용량) 두 활성물질을 30개 별도의 하루 용량으로 구성할 수 있다. 인간에게 상기 투여용량을 투여하기 위한 설명서가 상기 키트에 포함될 수 있다.

매주. 주 1회 투여용량은 비타민 D 또는 25-OH D3를 약 7 내지 약 350 ㎍, 바람직하게는 약 35 내지 175 ㎍의 양으로 함유한다. 다르게는, 주 1회 투여용량은 비타민 D 및 25-OH D3 각각을 약 7 내지 약 350 ㎍, 바람직하게는 약 35 내지 175 ㎍의 양으로 함유할 수 있다. 비타민 D 대 25-OH D3의 투여용량 비율은 약 50:1 내지 약 1:50, 더욱 바람직하게는 약 25:1 내지 약 1:25, 더욱더 바람직하게는 약 6:1 내지 약 1:6일 수 있다.

매달. 월 1회 투여용량은 비타민 D 또는 25-OH D3를 약 30 내지 약 1500 ㎍, 바람직하게는 약 75 내지 500 ㎍의 양으로 함유한다. 다르게는, 월 1회 투여용량은 비타민 D 및 25-OH D3 각각을 약 30 내지 약 1500 ㎍, 바람직하게는 약 75 내지 500 ㎍의 양으로 함유할 수 있다. 하나의 키트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 주 또는 월별 용량으로 구성될 수 있다.

1:6의 25-OH D3 대 D3의 투여 비율이 혈장 25-OH D 수준을 신속하게(즉, 수 시간 안에) 증가시키고 증가된 플래토 수준을 유지하는 데 특히 유리한 것으로 확인되었다.

그러므로, 본 발명의 또 다른 양태는 비타민 D와 25-OH D3의 조합물을 투여함으로써 60 nmol/L 이상의 25-OH D의 장기 혈장 수준을 기저선보다 높게 유지하는 방법이다. 바람직하게는, 상기 비타민 D는 비타민 D3이다.

본원 명세서 및 특허청구범위에 걸쳐 사용된 "장기(prolonged)"란 비타민 D와 25-OH D3의 섭취 후 4시간에서 출발하여 적어도 12시간까지 지속되는 시간을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태는 25-OH D3와 비타민 D의 조합물을 투여함으로써 적어도 1주일 동안 25-OH D의 증가된 혈장 수준을 기저선보다 적어도 30 nmol/L 높게 유지하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 양태는 25-OH D3와 비타민 D의 조합물을 투여함으로써 적어도 1주일 동안 25-OH D의 혈장 수준을 기저선보다 적어도 30 nmol/L 높게 상승시키는 방법이다. 바람직하게는, 상기 비타민 D는 비타민 D3이다.

본 발명의 또 다른 양태는 25-OH D3와 비타민 D의 조합물을 투여한 후 단기간에, 즉 2시간 내에 25-OH D의 혈장 수준을 기저선보다 적어도 30 nmol/L 높게 증가시키고, 적어도 1주일 동안 기저선보다 적어도 30 nmol/L 높게 혈장 수준을 유지하는 방법이다. 바람직하게는, 상기 비타민 D는 비타민 D3이다.

알 수 있는 바와 같이, 25-OH D3 및 비타민 D 모두, 바람직하게는 비타민 D3를 투여하는 장점 중 하나는 25-OH D의 순환 양이 급속하게 증가하고 이러한 증가가 유지된다는 점이다. 보다 적은 투여용량, 예를 들어 하루 처방전으로 권장되는 양을 투여하는 경우, 혈장의 절대값 증가는 물론 실시예의 보다 많은 용량에서 나타나는 것보다 더 낮을 것이다. 즉, 상기 증가는 30 nmol/L 미만일 것이다. 그러나, 총 응답 패턴은 동일하다. 즉, 기저선보다 높게 증가가 유지되는 가파른 증가 및 긴 플래토가 존재한다. 비록 응답 크기가 보다 작아도, 혈장 수준은 여전히 하루 종일 안정하다는 장점이 있다. 그러므로, 모든 조직은 25-OH D를 최적으로 공급받는다.

본 발명의 또 다른 장점은 비타민 D 및 25-OH D3 둘 다, 바람직하게는 비타민 D3의 투여에 의해, 순환하는 25-OH D의 수준이 소정의 수준에 더욱 쉽게 도달할 수 있고 상기 소정의 수준이 예견가능한 시간 동안 지속될 수 있다는 점이다. 그러므로, 비타민 D 치료에 반응이 없는 개체의 수는 최소화될 수 있다. 예를 들어, 간 기능이 손상되거나 또는 유사한 증상을 가진 개체는 이제 더욱 정상화된 25-OH D 수준을 가질 수 있다.

유전자 분석

상기 조합물의 증가된 생체활성을 증명하기 위해, 비타민 D, 25-OH D3 및 이들의 조합물에 노출된 근 조직의 유전자 칩 분석을 수행하였다. 상세한 내용은 쥐 하지 현수 모델을 사용하여 실시예 2에 제공된다. 알 수 있는 바와 같이, 개별 투여보다는 상기 두 물질의 조합물을 전달한 경우, 활성 또는 조절된(과잉발현 또는 과소발현된) 유전자의 개수에 엄청난 증가가 있었다. 이것은, 대부분의 비타민 D는 간에서 소화 및 처리되는 경우 25-OH D로 전환하는 것으로 현재 알려져 있기 때문에, 놀라운 결과이다.

그러므로, 본 발명의 또 다른 양태는 비타민 D와 25-OH D3의 조합물을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 비타민 D 및 25-OH D 반응성 인간 유전자를 활성화 또는 조절하는 방법이다.

하기 비-제한적 실시예는 본 발명을 더욱 잘 예시하기 위해 제공된다.

실시예

실시예 1

제형 & 임상 시험

제형

재료 및 방법

25-OH D3의 분무-건조된 제형을 분말로 제공하였다. 요약하면, 25-OH D3 및 DL-α-토코페롤을 중간 쇄 트라이글리세라이드의 오일에 용해시킨 다음 변성된 전분, 수크로오스 및 나트륨 아스코르베이트의 수용액에 에멀젼화시켰다. 이 에멀젼을 이산화규소의 존재 하에 분무 건조기에서 분말화하였다. 물 함량(LOD)이 4% 미만이 될 때 생성된 분말을 수집하고 400 ㎛를 통해 체질하였다(sieved). 이를 알루미늄 백에 패킹하고 실링한 다음 15℃ 미만의 건조한 곳에 저장하고 제조한 후 12 개월 안에 사용하였다.

각각 3개의 로트(lot)를 제조하였다. 구체적으로, 진공 하에 70℃에서 앵커 교반기가 장착된 프라이믹스(FRYMIX) 가공 유닛에서 120분 동안 혼합하여 하기 성분들로 이루어진 매트릭스를 제조하였다:

- 17.300 kg 물(WBI)

- 13.460 kg 변성된 식품 전분(CAPSUL HS)

- 3.270 kg 수크로오스

- 0.730 kg 나트륨 아스코르베이트

82℃에서 프로펠러 교반기가 장착된 이중-벽 용기에서 35분 동안 혼합하여 하기 성분들로 이루어진 오일 상을 제조하였다:

- 0.550 kg 베르가베스트 엠씨티(BERGABEST MCT) 오일 60/40

- 0.049 kg 칼시페다이올(HY-D USP)

- 0.183 kg DL-α-토코페롤

상기 오일 상을 프라이믹스 가공 유닛의 매트릭스에 옮기고 그의 내부 콜로이드 밀(mill)로 예비-에멀젼화시켰다(60분, 70℃). 이 예비-에멀젼을 고압 균질화기를 통해 순환시켰다(20분). 70℃에서 점도가 60 내지 90 mPa·s인 에멀젼을 고압 펌프를 통해 분무 노즐로 옮겼다. 유동화제로서, 이산화규소(SIPERNAT 320 DS)를 탑에 공급하였다(그러나, 다른 이산화규소 형태도 적합할 것으로 생각된다). 상기 분무 및 건조 변수들을 아래에 기재하였다.

25-OH D3 3개 로트 각각에 대해, 평균 8.4 kg의 분무-건조된 분말 및 약 0.25% 함량의 25-OH D3를 수득하였다. 상기 제형의 다른 성분들은 변성된 식품 전분 73.2%, 수크로오스 17.6%, 나트륨 아스코르베이트 4.0%, 중간 쇄 트라이글리세라이드 3.0%, 이산화규소 1.0% 및 DL-α-토코페롤 1.0%였다.

비타민 D3의 분무-건조된 제형을 분말로 제공하였다. 요약하면, 비타민 D3 및 DL-α-토코페롤을 중간 쇄 트라이글리세라이드의 오일에 용해시킨 다음 변성된 전분, 수크로오스 및 나트륨 아스코르베이트의 수용액에 에멀젼화시켰다. 이 에멀젼을 이산화규소의 존재 하에 분무 건조기에서 분말화하였다. 물 함량(LOD)이 4% 미만이 될 때 생성된 분말을 수집하고 체질하여 큰 덩어리들을 제거하였다. 이를 15℃ 미만의 건조한 곳에 저장하였다. 안정성이 우수하였고 저장 수명이 12개월로 연장될 수 있었다.

임상 시험

개체

건강한 폐경후 여성(50 내지 70세)을 사전 동의를 얻어 모집하고 다음 기준에 따라 선발하였다: 혈청 25-OH D 20 내지 50 nmol/L, 체질량지수 18 내지 27 kg/㎡, 혈압 146/95 mmHg 미만, 혈청 칼슘 2.6 nmol/L 미만, 공복시 글루코오스 100 mg/dl 미만, 주 3회 이상 고-강도 운동이 없을 것, 고혈압 치료가 없을 것, 고-용량 비타민 D 또는 칼슘 보충제, 또는 골 대사작용에 영향을 주는 약물(예를 들어, 바이포스포네이트, 칼시토닌, 에스트로겐 수용체 조절제, 호르몬 대체 요법, 부갑상선 호르몬) 사용이 없을 것, 시험 동안 "양지" 지역 방문이 없을 것.

개체는 7개 처리 그룹(즉, 매일, 매주, 단일물 투여 볼루스(bolus), 및 조합물 투여 볼루스) 중 하나로 무작위로 할당하였다. 각각의 그룹은 5개 개체를 포함하였다. 이들은 겨울 동안 스위스 쮜리히에서 4 개월 동안 시험에 따랐다.

임상 연구

인간에게 투여된 비타민 D 및 25-OH D3의 약동학적 특성을 비교하고 연구하는 것이 목적이었다. 같은 양의 두 물질을 조사하였다. 섭생은 20 ㎍/일(또는 이의 매주 기준 등가량)의 25-OH D3을 기준으로 하였다. 25-OH D의 최대 기존 기저선 농도가 50 nmol/L이므로, 개체가 Ca² ⁺ 항상성 교란이 관찰되는 범위로 접근할 것으로 예상되지 않는다. 비교 목적을 위해, 같은 몰량의 비타민 D 또는 25-OH D3를 투여할 필요가 있었다. 비타민 D의 투여와 관련하여, 상기 투여용량은 배경 가변성(background variability)을 극복하기에 충분하고 효과적인 투여용량을 참가자들에게 제공하는 것으로 간주된다.

매일: 120 투여

1. 25-OH D3 20 ㎍

2. 비타민 D3 20 ㎍(800 IU)

매주: 16 투여

3. 25-OH D3 140 ㎍

4. 비타민 D3 140 ㎍(5600 IU)

볼루스: 단일물 투여

5. 25-OH D3 140 ㎍

6. 비타민 D3 140 ㎍(5600 IU)

볼루스: 조합물 투여

7. D3 및 25(OH)D3 140 ㎍(5600 IU)+140 ㎍

병에 포장된 경질 겔 캡슐은 캡슐당 20 또는 140 ㎍의 분무-건조된 비타민 D 또는 25-OH D3를 함유하였다. 각각의 투여용량은 아침 식사시에 경구로 소비되었다. 이 연구 기간은 "일" 및 "주" 그룹에 대해 4개월이었다. "볼루스"로 등록된 개체는 제 2 연구에서 단일물 투여를 경구로 소비하고 4개월 동안 추가로 추적하였다.

상기 투여용량을 섭취시킨 후 개체로부터 샘플을 여러 번 획득함으로써 25-OH D의 혈장 농도(예를 들어, 피크 및 정상 상태)를 결정하였다. 선별 목적으로 및 기저선 값을 설정하기 위해, 연구 시작 전에 혈액 샘플을 얻어 임상 실험하여 혈청 내 비타민 D, 25-OH D3, 칼슘, 크레아티닌, 알부민 및 공복시의 글루코오스를 측정하였다. 연구 1주차 월요일에 혈청 비타민 D, 25-OH D 및 1,25-다이하이드록시 비타민 D; 혈청 표지자(즉, 비타민 D, 25-OH D, 칼슘, 크레아티닌, 알부민, PTH, GOT, GPT, ALP, 트라이글리세라이드, HDL, LDL, 전체 콜레스테롤, bALP 및 공복시의 글루코오스); 우린(urine) 표지자(즉, 칼슘, 크레아티닌 및 DPD)의 약동학을 24시간에 걸쳐 분석하였다. 1주차 나머지 요일 및 2주차 월요일에 대한 일차별 샘플들을 취해 혈청 비타민 D 및 25-OH D, 혈청 표지자(즉, 칼슘, 크레아티닌, 알부민) 및 우린 표지자(즉, 칼슘, 크레아티닌)를 분석하였다. 이 같은 분석은 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15주차의 월요일에 계속하였다. 16주차 월요일에, 샘플을 취해 혈청 비타민 D, 25-OH D 및 1,25-다이하이드록시 비타민 D; 혈청 표지자(즉, 비타민 D, 25-OH D, 칼슘, 크레아티닌, 알부민, PTH, GOT, ALP, 트라이글리세라이드, HDL, LDL, 전체 콜레스테롤, bALP 및 공복시의 글루코오스); 및 우린 표지자(즉, 칼슘, 크레아티닌 및 DPD)를 분석하였다.

결과

표 1은 140 ㎍ 25-OH D3의 투여, 140 ㎍ 25-OH D3의 투여, 140 ㎍ 비타민 D의 투여, 또는 140 ㎍ 25-OH D3 + 140 ㎍ 비타민 D의 조합물 투여 후 혈장 25-OH D 수준의 증가를 나타낸다. 기재된 시간 스케줄에 따라 혈액 샘플을 수득하였다.

시간(hr)	혈장 25-OH D (기저선(nmol/L)에 대한 변화)
시간(hr)	140 ㎍ 25-OH D3	140 ㎍ 비타민 D3	140 ㎍ 25-OH D3 + 140 ㎍ 비타민 D3
0	0.0	0.0	0.0
2	28.5	1.5	41.2
4	47.7	2.2	61.6
6	58.2	3.2	64.6
8	60.2	5.2	62.4
10	57.7	6.2	63.1
12	58.9	6.7	63.9
25	42.2	8.0	46.2
49	34.4	11.7	43.2
73	29.7	13.0	39.7
97	22.2	12.7	33.9
206	17.5	14.0	31.9
374	12.7	13.0	20.7
708	7.5	13.7	14.2

위에 나타낸 바와 같이, 140 ㎍ 25-OH D3 + 140 ㎍ 비타민 D의 조합물 투여 후 혈장 25-OH D 응답이 서로 상승효과적으로 증가하였다. 이러한 효과는 특히 초기 6시간 동안 뚜렷하였다. 또한, 조합물 투여는 2 내지 206 시간(즉, 8.5일까지, 또는 1주일에 걸쳐) 동안 적어도 30 nmol/L로 혈장 25-OH D 수준의 지속적인 증가를 나타내었다. 140 ㎍ 25-OH D3의 투여 후, 25-OH D 수준의 적어도 30 nmol/L 증가는 4 내지 49시간에서만 관찰되었고, 140 ㎍ 비타민 D만의 투여 후에는 어떠한 크기 증가도 관찰되지 않았다.

따라서, 140 ㎍ 25-OH D + 140 ㎍ 비타민 D3의 조합물 투여는 두 가지 중요한 이점을 제공한다. 즉, 이는 25-OH D의 신속하고 서로 상승적인 혈장 응답을 초래하고 의외로 혈장 25-OH D 수준의 뚜렷하고 긴 플래토 상태를 유발한다. 이들이 특히 비타민 D 결핍의 중요한 치료 목적이다. 즉, 적정량 미만의 비타민 D 상태 및 장기간 안정한 혈장 농도를 신속히 보정하여 모든 비타민 D 의존성 조직에 충분한 공급을 보장한다.

실시예 2

유전자 칩 데이터

이 연구의 목적은 BalbC 생쥐를 사용하여 골격근 위축증 모델에서 비타민 D3, 25-OH D3, 및 비타민 D3와 25-OH D3의 조합물의 영향을 시험하는 것이고, 여기서 꼬리 현수법은 상기 동물의 하지 무부하의 골격근 위축증을 유발하였다. 초기에 상기 모델은 인간의 우주비행을 모사하기 위한 쥐에서 수립되었고 골격근 질량 또는 뼈의 손실을 연구하기 위해 다른 과학 분야에서도 통상적으로 사용되었다. 결과는 근육감소증(고령화 과정에서의 골격근 질량 및 강도의 퇴행적 손실) 또는 (예를 들어, 골절, 외과수술 또는 외상에 의한 장기 침대 요양 후) 골격근의 부동성과 같은 인간 증상을 나타내는 것으로 간주되었다.

방법

연구용으로, 9개월 연령의 BaldC 암컷 생쥐를 연구 초기에 1개 그룹당 10마리 4개 그룹으로 무작위 추출하였다:

1. 대조군: 하지 무부하(HU)

2. 비타민 D3 그룹: HU + 비타민 D3 처리

3. 25-OH D3 그룹: HU + 25-OH D3 처리

4. 비타민 D + 25-OH D3 그룹: HU + 비타민 D3와 25-OH D3(조합물) 처리

동물들을 7일 동안 특수 우리 안에 가두고 모든 생쥐들을 별도로 수용하고 먹이 및 물에 자유로이 접근할 수 있도록 하였다. 모든 동물들은 실험 시작시 그리고 절개 3시간 전에 위관영양을 통해 2회 처리받았다.

1. 대조군: 비히클(젤라틴) 처리

2. D3 그룹: 비타민 D3(50 ㎍/kg/bw) 처리

3. 25-OH D3 그룹: 25-OH D3(50 ㎍/kg/bw) 처리

4. 조합물 그룹: 비타민 D3 + 25-OH D3(50+50 ㎍/kg/bw) 처리

연구 말기에서, 비복근을 꺼내어 액체 질소에 직접 냉동시켜 추가로 분석하였다. 비복근에서의 유전자 발현 변화를 확인하고 mRNA 수준의 변동을 분석하기 위해, 본 발명자들은 어피메트릭스 마우스(Affymetrix Mouse) 430-2 마이크로어레이 및 이 어레이유형에 대한 어피메트릭스로부터의 버전 27(2008년 12월) 주석 파일을 사용하였다. 상기 어레이는 "34,000개의 잘-특성화된 생쥐 유전자 및 유니진(UniGene) 클러스터로부터 39,000개 이상의 전사체 및 변이체의 발현 수준을 분석하기 위한 45,000 프로브 세트"를 함유하였다(어피메트릭스, 2009).

통상적으로 사용되는 트라이졸(Trizol) 프로토콜을 사용하여 전체 RNA를 단리하였다. 분광광도계 분석을 통해 상기 RNA를 정량하였다. 또한, 애질런트(Agilent) 2100 바이오애널라이저(Bioanalyzer)로 전체 RNA 샘플을 정량적으로 분석하였다. 이어서, RNA를 1 사이클 cDNA 합성을 위해 제조하였다. 이 단계에서 전체 진핵생물 표적 표지 과정을 모니터링하기 위한 외인성 양성 대조군을 제공하기 위해 폴리-A RNA 대조군을 사용하였다. 제 1 cDNA을 합성하고 제 2 가닥의 cDNA를 합성한 후, 상기 cDNA를 이중 가닥의 cDNA로 정제하였다. 이어서, 바이오틴(biotin) 표지된 cRNA를 합성하고 260/280 nm에서 분광광도계를 사용하여 정제 및 정량하였다. 진칩(GeneChip) 프로브 어레이 상으로 혼성하기 전에 cRNA 표적을 단편화하여 최적의 분석 감도를 수득하는 것이 중요하다. 단편화 이후, 상기 프로브를 상기 칩(어피메트릭스 마우스 430-2 칩)에서 혼성화시켰다. 상기 칩을 어피메트릭스의 유동 스테이션에서 세척 및 염색하고 유전자 칩 스캐너에서 스캔하였다. 이어서, 이 데이터를 스캐너로부터 옮겨와 진데이터(Genedata)의 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석하였다(익스프레셔니스트(Expressionist) 5.0: 리파이너 어레이 앤드 애널리스트(Refiner Array and Analyst)). 진고 메타코어(GeneGo Metacore) 패키지(V5.2 빌드 17389)의 온라인 버전을 사용하여 데이터 해석 및 경로 분석을 하였다.

리파이너 어레이는 품질 문제 및 플래그 문제 측정을 위해 마이크로어레이 데이터를 구한다. 이는 일련의 정규 알고리즘 및 검증된 압축 방법을 제공하여 후속적인 통계 분석을 위한 미가공 마이크로어레이 데이터를 자동으로 선-처리 작업하고 요약한다.

마이크로어레이 데이터 분석은 HU 그룹과 HU + (비타민 D, 25-OH D3 또는 이들의 조합물) 처리 그룹 간에 차등 발현되는 유전자(mRNA)를 밝혀내었다.

하나의 주요 발견은 다음과 같다:

1. 25-OH D3와 비타민 D3의 조합물은 25-OH D3보다 유전자에 대한 더 많은 프로브 세트를 변화시키고, 이에 따라 비타민 D3보다 유전자에 대한 더 많은 프로브 세트를 변화시킨다(표 1).

a. HU 대조군에 비해, 조합물 처리(D3 + 25-하이드록시비타민 D3)를 받은 그룹은 25-OH D3로만 처리 받은 그룹(1263)보다 상당히 더 많이 변화된 유전자에 대한 프로브 세트(1745)를 가진다

HU 대조군에 비해, 25-OH D3 처리 받은 그룹은 비타민 D3(385) 처리 받은 그룹(385)보다 상당히 더 많이 변화된 유전자에 대한 프로브 세트(1263)를 가진다.

2. 25-OH D3 + 비타민 D3의 조합물 처리는 비타민 D3 처리 받은 것보다 25-OH D3 처리 받은 유전자에서 더욱 차등 발현된 프로브 세트를 가진다.

a. 25-OH D3 그룹에서 차등 발현된 유전자에 대한 프로브 세트의 약 61%가 또한 25-OH D3 + 비타민 D3 그룹에서 차등 발현된다(1263 중 769, 도 2).

b. 비타민 D3 그룹에서 차등 발현된 유전자에 대한 프로브 세트의 약 46%가 또한 25-OH D3 + 비타민 D3 그룹에서 차등 발현된다(385 중 177, 도 3).

c. 25-OH D3와 비타민 D3의 조합물 처리가, 도 4, 6 및 7에 도시된 바와 같이, 근 발단 과정의 유전자에 가장 중요한 영향을 미친다.

d. 관련 유전자는 골격근에서 하기 주요 범주들 중 일부이다: 근 수축, 근 발달 및 근 유지(표 2).

3. 상기 선택된 골격근의 유전자의 프로브 세트의 경우, 25-OH D3와 비타민 D3의 조합물 처리는 비타민 D3 또는 25-OH D3만의 처리보다 더 높은 발현을 나타낸다(표 3).

표 1: HU 및 HU + (비타민 D3, 25-OH D3 또는 조합물) 처리 그룹 간의 유전자에 대한 차등 발현된 프로브 세트

표 2: HU 및 처리 그룹 간의 선택된 골격근 유전자에 대해 차등 발현된 프로브 세트

표 3: 골결근의 선택된 유전자에 대한 발현 패턴

본원에 개시된 실시양태는 본 발명의 다수의 양태를 예시하기 위한 것이므로, 본원에 기술되고 청구된 발명은 상기 특정 실시양태에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 임의의 균등한 실시양태도 본 발명의 범위 내에 속한다. 실제로, 본원에 개시되고 기술된 것들 외의 본 발명의 다양한 변형이 상기 개시내용으로부터 당해 분야 숙련자들에게 명백할 것이다. 이러한 변형 역시 첨부된 특허청구범위에 속하는 것으로 의도된다. 상충되는 경우, 정의를 비롯한 본 발명의 개시내용이 우선한다.

Claims

비타민 D 및 25-OH D3를 포함하는, 인간 용도에 적합한 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
약학적으로 허용가능한 항산화제, 및 정제, 캡슐 또는 주사가능한 형태의 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 분무 건조되거나 캡슐화된 비드렛(beadlet) 조성물.
25-OH D 결핍과 관련된 증후군을 완화시키는 데 사용하기 위한 인간 약제를 제조하기 위한 25-OH D3 및 비타민 D의 용도.
25-OH 비타민 D3을 포함하는, 인간 용도에 적합한 영양제, 식품 보충제 또는 식품.
제 5 항에 있어서,
비타민 D를 추가로 포함하는 영양제, 식품 보충제 또는 식품.
a) 비타민 D 및
b) 25-OH D3
의 다수의 개별 투여용량을 포함하는 키트(kit).
제 7 항에 있어서,
용기(container), 및 상기 조성물 소정 투여용량을 인간에게 투여하기 위한 설명서로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 부재(member)를 추가로 포함하는, 키트.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
7개 이상의 다수의 개별 투여용량이 존재하는, 키트.
제 9 항에 있어서,
30개 이상의 개별 투여용량이 존재하는, 키트.
비타민 D 및 25-OH D3를 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 혈액, 혈청 또는 혈장의 25-OH D 농도를 증가 또는 유지시키거나, 인간 혈액, 혈청 또는 혈장의 25-OH D 농도를 바람직한 정상-상태 농도에 도달시키거나, 또는 인간 혈액, 혈청 또는 혈장의 25-OH D 농도의 예측가능성을 증가시키는 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 비타민 D 및 25-OH D3가 개별 투여용량 형태로서 투여되는, 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 비타민 D 및 25-OH D3가 동일한 투여용량 형태로 투여되는, 방법.
비타민 D와 25-OH D3의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 인간의 장기(prolonged) 25-OH D 혈장 수준을 기저선(baseline)보다 적어도 60 nmol/L 높게 유지시키는 방법.
적어도 1주일 동안 비타민 D와 25-OH D3의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 인간의 25-OH D 혈장 수준을 기저선보다 적어도 30 nmol/L 높게 증가시키는 방법.
비타민 D와 25-OH D3의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 인간의 25-OH D 혈장 수준을 2시간 안에 급속히 증가시키는 방법.
제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간이 노인인, 방법.
제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간이 흡수장애 증후군(예를 들어, 셀리악(celiac)병, 스프루(sprue) 또는 단장 증후군에 의해 발병됨)을 가진, 방법.
제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간이 간 기능이 손상된, 방법.
비타민 D와 25-OH D3의 조합물을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 비타민 D 및 25-OH D 반응성 인간 유전자를 활성화 또는 조절하는 방법.