KR20100120430A - 캠퍼를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 유인용 조성물 및 이를 이용한 소나무재선충병 검정용 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소나무재선충 유인용 조성물 및 이를 이용한 소나무재선충병 검정용 키트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 캠퍼를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 유인용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 소나무재선충병 검정용 키트 및 상기 키트를 이용하여 소나무재선충에 의한 고사 원인 및 감염 여부를 검정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 캠퍼를 포함하는 소나무재선충 유인용 조성물 및 검정용 키트는 소나무재선충을 유인하는 효과가 우수하고, 캠퍼가 낮은 농도로 존재할 경우에도 유인효과가 우수한 특징이 있으며, 또한, 본 발명의 키트를 소나무에 꽂아두기만 하면 유인된 소나무재선충를 단지 확인하는 과정을 통해 소나무재선충에 의한 감염 여부 및 고사 원인을 신속하고 간편하게 검정할 수 있는 효과가 있다.
나무재선충, 캠퍼, 유인, 검정, 키트

Description

퍼를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 유인용 조성물 및 이를 이용한 소나무재선충병 검정용 키트{Composition of attractant to pine wood nematode comprising camphor as an active ingredient and diagnosis kit for the detection of pine wilt disease using the composition}
본 발명은 소나무재선충 유인용 조성물 및 이를 이용한 소나무재선충병 검정용 키트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 특정성분을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 유인용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 소나무재선충병 검정용 키트 및 상기 키트를 이용하여 소나무재선충에 의한 고사 원인 및 감염 여부를 검정하는 방법에 관한 것이다.
토양과 식물체 내에는 많은 종류의 병원균과 해충이 서식하고 있으며, 이중에는 식물의 생장저해와 발병에 직간접적인 영향을 주는 것으로 알려진 식물기생선충이 존재한다. 이러한 식물기생선충 중, 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 분류학적으로 참선충목의 잎선충과 소나무재선충 속에 속하고, 전 세계적으로 49종이 보고되어 있다(알기쉬운 소나무 재선충, 국립산림과학원, 2005년). 또한, 소나무재선충은 크기 1mm 내외의 실 같은 선충으로서 나무 조직 내에 수분 및 양분의 이동통로를 막아 나무를 죽게 하는 유해선충으로서, 스스로는 다른 소나무로 이동할 수 있는 능력이 없기 때문에 솔수염하늘소를 매개충으로 하여 이동하여 다른 건전한 소나무를 감염시킨다. 솔수염하늘소의 유충과 번데기는 소나무 내에서 자라는데, 이 하늘소가 우화하여 소나무를 탈출할 때 소나무재선충을 체내에 보유하게 되고, 우화한 하늘소 성충이 건전한 소나무의 1-2년생 신초를 갉아먹을 때(후식할 때) 소나무가 소나무재선충에 감염된다. 감염된 소나무는 일반적으로 6일째부터 잎이 쳐지게 되고 20일째에부터 잎이 시들기 시작하여 30일 후에는 잎이 급속하게 붉은색으로 변색하여 반드시 1년 이내에 고사하게 된다.
한편, 소나무재선충에 의해 발생되는 소나무재선충병은 일본을 비롯한 아시아, 미국, 아메리카, 유럽 등 세계 곳곳에서 발생되고 있는데, 일본의 경우 1941년 이후 연간 240만m3의 소나무와 해송이 고사되어 거의 전멸상태에 이르고 있고, 중국은 1982년 난징시에서 처음 발생된 이후 현재 약 700만 ha의 마미송과 해송림에 극심한 피해를 주고 있으며, 대만에서는 1985년에 발생하여 특산종인 유구송이 전명 위기에 처해있다. 또한, 우리나라의 경우에도 1988년부터 소나무들이 재선충에 감염되기 시작하여 현재에 이르기까지 무려 53개의 도시에서 소나무재선충병이 발생되고 있으며, 계속적으로 전국으로 확산됨에 따라 환경적인 문제뿐만 아니라 그로 인한 막대한 경제적 손실까지 발생하고 있는 실정이다.
따라서 우리나라에서는 일찍이 소나무재선충을 식물방역법상 금지해충으로 지정하여 침입방지에 노력하고 있으며, 지금까지 소나무재선충병을 방제하기 위해 다양한 방법들이 개발되었는데, 이러한 방법들로는 벌채훈증법, 벌채소각법, 벌채파쇄법, 살충제살포법, 천적이용법 등의 방법이 있다.
벌채훈증법은 소나무재선충에 감염되어 죽은 나무를 베어서 훈증제로 매개곤충을 사멸시키는 방법으로 훈증제가 사람과 가축 등에 해가 있을 수 있기 때문에 사용시 안전에 유의해야 하고 특히 눈, 코, 입, 피부 등과의 접촉을 피해야 한다는 문제점이 있고, 벌채소각법은 소나무재선충에 감염되어 죽은 나무를 베어서 넓은 공터에 쌓은 다음 태우거나 이동식 간이 소각로를 이용하여 태우는 방법으로 해충을 제거하는 데는 확실한 효과가 있으나 산불 때문에 방제시기가 극히 제한적이라는 문제점이 있다. 벌채 파쇄법은 소나무재선충에 감염되어 죽은 나무를 베어서 톱밥 또는 칩 제조기를 이용하여 1.5cm이하의 크기로 분쇄함으로서 목질부 내의 매개충 유충을 죽이는 방법으로 이 방법은 환경오염이 없으며 죽은 나무가 임지에 쌓여 있지도 않기 때문에 산불의 위험도 낮다. 그러나 감염목을 분쇄하기 위하여 운반하는 중에 매개충이 들어있는 나무를 빠뜨리기 쉽고 인력과 방제비가 많이 든다는 문제점이 있다. 살충제살포법은 매개충이 소나무를 후식하기 전에 방제함으로써 소나무재선충병을 예방할 수 있어 피해확산을 저지할 수 있으며 넓은 면적의 산림에 적용할 수 있다는 장점이 있으나 익충을 죽여 생태계를 파괴할 수 있으며 해충의 저항성을 증대하여 추가적인 살충제의 개발이 필요하며 그 효과 면에서 근원적인 방제방법이 아니라는 문제점이 있다. 또한, 천적을 이용하는 방법은 생태계를 복원하여 먹이사슬을 유지 할 수 있는 친환경 방제수단으로 도입천적 이용법, 증식천적 이용법, 천적보호법 등이 있는데, 방제 효과가 미비한 단점이 있다.
따라서 인간 및 동물에 대한 부작용을 일으키지 않으며, 비교적 저렴한 비용으로 소나무재선충을 방제할 수 있는 방법 및 소나무재선충에 의한 소나무의 감염을 효과적으로 방지할 수 있는 새로운 방법의 개발이 시급한 실정이다.
또한, 소나무의 고사원인은 가뭄, 대기 오염, 도로공사 등에 의한 뿌리 절단 등의 물리적 원인과 각종 선충 및 솔껍질깍지벌레, 솔잎혹파리 등의 각종 해충과 병원균 등의 생물학적 원인이 있다. 이들 고사원인에 의한 막대한 산림 피해를 예방하기 위해서는 나무의 고사 원인을 신속하게 검정하여 적절한 대책을 강구해야 한다. 그러나 아직까지 고사된 소나무가 소나무재선충에 의한 것임을 규명하는 방법으로는 죽은 소나무로부터 선충을 분리한 후 현미경으로 관찰하는 방법뿐이다. 또한, 죽은 소나무로부터 선충을 분리하기 위해서는 도끼로 죽은 소나무의 일부를 떼어낸 다음, 1㎝ 이내의 작은 칩(chip)으로 만든 다음 24시간 동안 버만(Bermann) 깔대기 방법으로 선충을 분리해 내고, 분리한 선충을 현미경 하에서 검경하여 분리된 선충이 소나무재선충인지 아닌지를 조사해야 한다. 이러한 방법은 많은 시간과 노력이 들고 현미경이나 버만 깔대기 시설과 같은 특수 시설이 필요할 뿐만 아니라, 선충을 분류 동정할 수 있는 고도로 훈련된 전문가에 의해서만 검정할 수 있는 문제점이 있다.
따라서 소나무재선충에 의한 소나무의 고사 여부를 신속하고 정확하게 비전문가라도 이용할 수 있는 새로운 검정 방법의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 소나무재선충에 의한 소나무의 감염 여부 및 고사된 소나무의 고사 원인을 검정할 수 있는 새로운 방법을 연구하던 중, 소나무에서 발견 되는 휘발성 물질로 알려진 캠퍼(camphor)가 소나무재선충을 효과적으로 유인할 수 있음을 확인하였고, 이를 이용하여 소나무재선충에 의한 소나무의 고사 원인 및 감염 여부를 비전문가라 할지라도 쉽고 간편하고 빠르게 검정할 수 있는 키트 및 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 캠퍼(camphor)를 유효성분으로 포함하는 소나무재선충 유인용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 소나무재선충 검정용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 소나무재선충 검정용 키트를 이용하여 소나무재선충에 의한 소나무의 고사 원인 또는 감염 여부를 검정하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 캠퍼(camphor)를 유효성분으로 포함하는 소나무재선충 유인용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일시예에 있어서, 본 발명의 소나무재선충 유인용 조성물에 포함된 캠퍼는 10-3~10-5M의 농도가 되도록 헥산으로 희석할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 소나무재선충 유인용 조성물은 살충제를 추가로 포함하여 소나무재선충을 유인 및 살충하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 캠퍼(camphor)를 유효성분으로 포함하는 소나무재선충 유인용 조성물을 포함하는 소나무재선충 검정용 키트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 소나무재선충 검정용 키트는 튜브, 상기 튜브 내부의 하부에 배치되는 겔(gel), 상기 겔의 상부에 배치되고 캠퍼를 함유하는 캠퍼 흡수제 및 상기 튜브를 밀폐할 수 있는 마개를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 소나무재선충 검정용 키트를 검정을 목적으로 하는 소나무에 꽂아두는 단계를 포함하는 소나무재선충에 의한 소나무의 고사 원인 또는 감염 여부를 검정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 소나무재선충에 의한 소나무의 고사 원인 또는 감염 여부를 검정하는 방법은 상기 소나무재선충 검정용 키트를 검정을 목적으로 하는 소나무에 구멍을 뚫고 상기 구멍에 8시간 이상 꽂아두는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 캠퍼를 포함하는 소나무재선충 유인용 조성물 및 검정용 키트는 소나무재선충을 유인하는 효과가 우수하고, 캠퍼가 낮은 농도로 존재할 경우에도 유인효과가 우수한 특징이 있으며, 또한, 본 발명의 키트를 소나무에 꽂아두기만 하면 유인된 소나무재선충를 단지 확인하는 과정을 통해 소나무재선충에 의한 감염 여부 및 고사 원인을 신속하고 간편하게 검정할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 캠퍼(camphor)를 유효성분으로 포함하는 소나무재선충 유인용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
일반적으로 장뇌라고도 불리는 캠퍼(camphor)는 강한 방향성 냄새가 나는 물 질로서 밀랍과 같이 흰색을 띄거나 또는 투명한 고체인 지방고리모양의 케톤으로 C10H16O의 분자식을 가진다. 또한, 캠퍼는 나이트로셀루로스와 고용체를 만드는 성질이 있어서 셀룰로이드 필름의 제조에 이용되고 있고, 흥분 및 강심제와 자극, 진통 및 방부제로서의 의약 관련 제품의 용도로도 사용되고 있으며, 나아가 곰팡이의 살충제로도 사용되고 있음이 밝혀진 바 있다. 그러나 상기 캠퍼가 소나무재선충을 유인하는 효과가 있다는 내용에 대해서는 본 발명에서 최초로 규명하였다.
본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 상기 캠퍼는 천연으로부터 분리되거나 또는 화학적 합성법으로 합성된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연식물로부터 분리된 것을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 소나무 또는 녹나무로부터 분리된 것을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 소나무재선충 유인용 조성물에 포함되는 상기 캠퍼는 적절한 용매로 희석될 수 있는데, 바람직하게 상기 용매는 헥산일 수 있다. 또한, 상기 희석은 캠퍼의 농도가 10-3~10-5M의 농도가 되도록 희석할 수 있다.
한편, 소나무재선충은 소나무 또는 잣나무 등에 기생하면서 나무를 갉아먹는 선충으로서 암컷은 0.7~1.0mm, 수컷은 0.6~0.8mm 길이의 소형 선충이며, 이러한 소나무재선충은 솔수염하늘소와 공생관계에 있으며 소나무재선충을 지니고 있는 솔수염하늘소에 의해 나무의 조직내부로 침입하여 초기에는 목질부와 피층의 수지관에서 서식하면서 소나무의 유조직 세포를 먹으면서 생존한다. 또한, 소나무재선충은 상온에서 대략 35일 생존하며, 4령충(1기~4기)의 유충기를 거쳐 성충이 되는 것으 로 알려져 있고, 1세대의 소요시간은 25℃의 경우 6일정도 걸리며, 1쌍이 20일 후에는 20만 마리로 증식될 정도로 증식력이 왕성한 것으로 알려져 있다.
그러나 소나무재선충에 감염된 소나무는 수지관 주변 유조직 세포의 괴사가 일어나고 수분 및 양분의 이동통로가 막혀서 나무가 고사하며, 소나무재선충에 한번 감염된 나무는 거의 100% 고사하기 때문에 일명 “소나무 에이즈 병”이라고 불리기도 한다. 소나무재선충의 매개충인 솔수염하늘소를 자연적으로 방제할 수 있는 천적이 아직까지 실용화되지 않았기 때문에 소나무재선충에 의한 소나무의 감염은 곧 대대적인 소나무림의 멸종으로 이어질 위험성이 대단히 크다.
한편, 현재까지 소나무 재선충병의 방제를 위하여 개발된 방법들은 거의 대부분이 매개충인 솔수염하늘소를 주 타겟으로 연구되어 왔을 뿐, 생물학적 접근을 이용한 소나무재선충에 대한 직접적인 저해제 또는 유인제는 개발된 바가 없다.
따라서 소나무재선충을 효과적으로 방제하기 위해서는 소나무의 고사원인을 신속하게 진단함으로써 소나무재선충으로부터 소나무의 고사를 예방할 수 있거나 또는 소나무재선충병에 대한 방제효율을 증가시켜 근본적으로 소나무재선충병을 방제할 수 있을 것이다.
반면, 본 발명의 캠퍼(camphor)를 유효성분으로 포함하는 소나무재선충 유인용 조성물은 소나무재선충을 유인하는 효과가 우수한 특징이 있다.
또한, 본 발명의 소나무재선충 유인용 조성물은 분산형 소나무재선충 및 증식형 소나무재선충을 모두 유인하는 효과가 있다.
상기에서 “분산형 소나무재선충”이란 소나무재선충이 소나무의 목질부 속 에서 번식을 계속하다가 2~5월에 분산형 제3기 유충으로 변태하여 소나무재선충병을 매개하는 솔수염하늘소의 유충이 번데기로 될 때, 번데기방 주변으로 모여들게 되며, 이후 소나무재선충의 분산형 제4기 유충이 번데기에서 성충으로 되는 매개충의 몸속에 침입한 후, 매개충이 건전한 소나무를 갉아 먹을 때 생기는 상처부위를 통해 건전한 소나무의 조직 내로 들어가서 전파 및 감염시키는 것을 분산형 소나무재선충이라고 한다.
상기에서 “증식형 소나무재선충”이란 매개충에 의해 소나무재선충의 분산형 제4기 유충이 건전한 소나무 속으로 들어오면 성충이 다시 알을 낳고, 상기 알이 제2기 유충, 제3기 유충, 제4기 유충 및 성충으로 변태함으로써 분산형이 되지 않고 일생동안 감염된 소나무 내에서 지속적으로 증식하는 형태를 말하며, 실제로 소나무가 죽게 되는 것은 이들 증식형 소나무재선충 때문이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 캠퍼에 대한 소나무재선충의 유인 효과를 확인한 결과, 본 발명의 캠퍼는 알파-피넨(α-pinene) 및 베타-피넨(β-pinene)과 같이 소나무재선충을 유인하는 효과가 있는 것으로 나타났으며, 증식형 소나무재선충 뿐만 아니라 분산형 소나무재선충에 대해서도 유인효과가 있는 것으로 나타났다(도 2 내지 도 4 참조).
따라서 본 발명은 캠퍼를 유효성분으로 포함하는 소나무재선충 유인용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 소나무재선충 유인용 조성물은 소나무재선충을 유인할 수 있는 장소에 투여된 후 활성 성분의 신속 또는 지속적인 효과를 통해 소나무재 선충을 유인할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 상기 제형은 수화제, 입제, 분제, 유제, 스프레이상, 연막제, 캡슐형 및 젤상 등의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 소나무재선충 유인용 조성물이 에멀젼, 유동성, 수화제, 마이크로캡슐 등의 제형일 경우에는 본 발명의 조성물의 유효성분인 캠퍼의 농도가 그 적용예에 적당하도록 물 또는 적절한 용매로 희석하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 소나무재선충 유인용 조성물이 에어로졸, 발연제 및 독성 유인물 등의 제형일 경우에는 통상 그대로 적용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 소나무재선충 유인용 조성물은 상기 조성물에 의해 유인되는 소나무재선충에 대한 다른 살충제, 살선충제, 살비제 또는 살균제 등을 추가로 함께 사용될 수 있다. 이들 성분은 개별적으로 또는 혼합물로서 적절한 담체 중에서 배합할 수 있고, 또는 적절한 유기 용매와 함께 배합하여 제형화 할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물에 추가로 포함될 수 있는 살충제, 살비제 및 선충 박멸제로는, 예를 들어, 유기 인산 화합물, 카바메이트 화합물, 피레스로이드 (pyrethroid) 화합물, 네오니코티노이드 (neonicotinoid) 화합물, 벤조일페닐우레아 화합물, 벤조일히드라지드 화합물, 티아디아진 (thiadiazine) 유도체, 넬리세톡신 (nelicetoxin) 유도체, 염소화 탄화수소 화합물, 포름아미딘 유도체, 티오우레아 유도체, 페닐피라졸 화합물 등일 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 소나무재선충 유인용 조성물에 상기 기술한 살충제, 살비제 및 선충 박멸제를 추가로 포함할 경우에는 소나무재선충을 유인하는 효과뿐만 아니라 동시에 살충할 수 있는 효과가 있다.
한편, 소나무가 고사되는 여러 가지 원인 중에서 특히, 소나무재선충에 의해 소나무가 고사된 경우, 고사 원인을 밝히기 위해 죽은 소나무를 잘게 잘라서 24시간 동안 물에 담근 뒤, 소나무로부터 분리되어 나오는 선충을 현미경으로 검경하는 방법이 사용되어 왔다. 그러나 이러한 방법은 많은 노력과 시간이 소비되고 현미경을 통해 선충을 규명할 수 있는 전문가만이 검정할 수 있는 단점이 있다.
따라서 본 발명은 소나무재선충에 의한 감염 여부 및 소나무재선충에 의해 고사한 소나무의 고사 원인을 빠르고 간편하게 검정할 수 있는 소나무재선충 검정용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 소나무재선충 검정용 키트는 캠퍼를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 유인용 조성물을 포함하며, 본 발명의 분야에서 당업자들에게 공지된 방법들을 이용하여 제조할 수 있다. 바람직하게 본 발명에 따른 소나무재선충 검정용 키트는, (a) 튜브, (b) 상기 튜브 내부의 하부에 배치되는 겔(gel), (c) 상기 겔의 상부에 배치되고 캠퍼를 함유하는 캠퍼 흡수제 및 (d) 상기 튜브를 밀폐할 수 있는 마개를 포함할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 원심분리용 튜브에 아가(agar)를 첨가하여 굳힌 후, 캠퍼가 처리된 필터 페이퍼(filter paper) 또는 코튼 볼(cotton ball)을 상기 아가 위에 넣음으로써 소나무재선충을 유인할 수 있는 검정용 키트를 제작하였으며, 상기 방법으로 제조한 본 발명의 소나무재선충 검정용 키트의 모식 도를 도 7에 나타내었다.
또한, 본 발명자들은 상기 방법으로 제조된 본 발명의 소나무재선충 검정용 키트가 실제적으로 소나무재선충을 유인할 수 있는 효과가 있는지를 확인하기 위하여 캠퍼를 함유하는 본 발명의 조성물을 포함하는 소나무재선충 검정용 키트를 검정을 목적으로 하는 나무에 꽂아둔 결과, 소나무재선충을 유인하는 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
특히, 본 발명의 일실시예에 의하면, 본 발명의 키트에 대한 소나무재선충 유인효과를 확인하기 위해 인공 용실에서 소나무재선충의 먹이가 되는 잿빛곰팡이병균을 소나무 조각에 접종 후, 병원성이 있는 소나무재선충을 접종한 다음, 상기 소나무 조각에 검정용 키트를 꽂아둔 결과, 캠퍼를 포함하고 있는 본 발명의 키트가 알파-피넨(α-pinene) 및 베타-피넨(β-pinene)을 포함하는 키트의 유인효과보다 더 많이 소나무재선충을 유인하였으며(통계적 차이는 없었음), 유인성 물질을 처리한 시간이 경과될수록 소나무재선충의 유인효과는 더 증가하는 것으로 나타났다(도 6a 및 6b 참조).
또한, 본 발명의 일실시예에 의하면, 본 발명의 키트에 대하여 소나무재선충 유인효과를 실제적으로 소나무재선충에 감염된 감염목을 대상으로 조사한 결과, 캠퍼를 포함하는 본 발명의 키트를 소나무에 꽂아둔 다음, 8시간 후부터 소나무재선충이 유인되는 것을 확인할 수 있었으며, 알파-피넨(α-pinene) 및 베타-피넨(β-pinene) 보다 유인효과가 더 우수한 것으로 나타났다(도 8 참조).
따라서 본 발명은 소나무재선충 검정용 키트를 이용하여 소나무재선충에 의 한 소나무의 고사 여부 또는 감염 여부를 신속하고 정확하게 검정할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 검정 방법은 소나무재선충에 의한 감염이 의심되는 소나무 또는 고사된 소나무에 상기 본 발명의 소나무재선충 검정용 키트를 꽂아두는 단계를 통해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 소나무에 구멍을 뚫고 상기 구멍에 본 발명에 따른 키트를 꽂아두는 단계를 통해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 검정은 본 발명의 키트를 검정을 목적으로 하는 소나무에 꽂아둔 다음, 일정 시간이 지난 후, 키트에 유인된 소나무재선충의 유무를 확인함으로써 판단할 수 있다. 즉, 고사된 소나무의 경우, 본 발명의 키트에 유인된 소나무재선충이 존재한다면 고사의 원인이 소나무재선충에 의한 것으로 판단할 수 있으며, 소나무가 완전히 고사하지 않고 고사가 진행 중인 소나무의 경우에도 본 발명의 키트에 유인된 소나무재선충이 존재한다면 검정 대상의 소나무가 소나무재선충에 감염되었고 따라서 고사될 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
증식형 소나무재선충에 대한 캠퍼의 유인력 테스트
본 발명자들은 캠퍼(camphor) 성분이 소나무재선충을 유인하는 효과가 있는지를 확인하기 위하여 증식형 소나무재선충, 즉, 소나무 속으로 들어온 분산형 제4기 유충은 성충으로 분산형이 되어야 하는데 성충으로 되지 못하고 일생동안 소나무 속에서 지내는 소나무재선충에 대한 유인력 실험을 수행하였다. 상기 실험을 위해, 먼저 선충으로는 Botrytis cinerea균에 증식시킨 소나무재선충을 버만 깔대기 방법을 이용하여 분리하였으며, 분리한 소나무재선충들을 1 ㎖당 1,000마리로 희석하여 사용하였다. 또한, 상기 분리한 선충들에 대한 캠퍼의 유인효과를 확인하기 위해 워터 아가(water agar) 배지위에 7개의 필터 페이퍼(8 mm)를 올려놓았고, 워터 아가 배지의 가운데에는 코튼 볼(cotton ball)(1.5 cm)을 올려놓았으며, 상기 7개의 필터 페이퍼 중 6개는 각 물질(유인력이 있는 물질)에 대한 실험군으로 휘발성 물질들을 10-4M의 농도로 헥산에 희석한 다음 이를 처리하였고, 나머지 하나는 대조군으로 헥산만을 처리하였다. 이후, 상기 코튼 볼에 앞서 준비한 1000마리의 소나무재선충을 절식시키기 않은 소나무재선충과 하루 동안 절식시킨 소나무재선충을 각각 처리한 후, 24℃의 암 조건에 24시간 및 48시간 이후의 소나무재선충수를 조사하였다. 상기 소나무재선충수의 조사를 위해 필터 페이퍼 주위의 1.2 cm 배지를 떼어낸 후, 증류수로 페트리 디쉬(60 mm)의 반을 채우고, 그 속에 떼어낸 배지를 넣고 유인된 선소나무재선충의 수를 조사하였다. 보다 정확한 조사를 위해 상기 방법을 3번씩 1차 및 2차로 반복 수행하였으며 그 평균값을 계산하여 결과를 얻었다. 상기와 같은 방법의 유인력 실험의 모식도는 도 1에 나타내었으며, 실험군으로 사용된 18개의 휘발성 물질들은 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich Co.)에서 구입하였으며 그 종류는 하기 표 1에 나타내었고, 증식형 소나무재선충에 대한 시간별 유인력 결과는 도 2a 내지 도 3b에 나타내었다.
유인력 실험에 사용된 휘발성 물질들

번호

휘발성 물질
휘발성 물질을 수득할 수 있는 소나무 종류
분자량
P. massoniana
( 대만적송 )
P. densiflora
(적송)
P. tunbergii
(해송)
1 α- pinene o o o 136.24
2 β- pinene o o o 136.24
3 Camphene o o o 136.24
4 Limonene o o o 136.24
5 Myrcene o 136.24
6 3- Carene o o 136.24
7 Terpinolene o 136.24
8 α- Phellandrene o 136.24
9 α- Terpinene 136.24
10 γ- Terpinene 136.24
11 Decane o 142.29
12 Bornyl acetate o 196.29
13 Terpineol anhylrous o 154.25
14 Borneol o 154.25
15 Camphor o 152.24
16 Thujone o 152.24
17 P- cymene o 134.22
18 α- Humulene o 204.36
그 결과, 3번 반복실험에 따른 1차 실험에 의하면 절식하지 않은 소나무재선충은 유인효과가 통계적으로 유의한 차이가 없었지만, 1일 절식한 소나무재선충의 경우 24시간 후에 알파-피넨(α-pinene)이 유인력이 있는 것으로 나타났고, 48시간 후에는 알파-피넨(α-pinene), 베타-피넨(β-pinene) 및 본 발명의 캠퍼(camphor)가 유인력이 있는 것으로 나타났다. 2차 실험에 따르면 절식여부에 관계없이 알파-피넨(α-pinene), 베타-피넨(β-pinene) 및 캠퍼(camphor)가 다른 휘발성 물질들에 비해 유인력 효과가 월등한 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 캠퍼(camphor) 성분은 알파-피넨(α-pinene) 및 베타-피넨(β-pinene)과 같이 소나무재선충을 유인하는 효과가 우수한 것을 알 수 있었고, 또한 상기 캠퍼가 10-4M의 낮은 농도에서도 소나무재선충을 유인하는 효과가 우수한 것을 알 수 있었다.
< 실시예 2>
분산형 소나무재선충에 대한 캠퍼의 유인력 테스트
본 발명자들은 캠퍼 성분이 분산형 소나무재선충에 대해서도 유인력 효과가 있는지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 여기서 상기 분산형 소나무재선충이란 솔수염하늘소의 유충이 번데기로 될 때 소나무재선충의 유충이 번데기 주변이 모여들어 우화되는 매개충의 몸속으로 침입한 후, 매개충에 의해 소나무의 조직내에 들어가서 소나무를 감염시키는 것을 분산형 소나무재선충이라고 한다. 상기 분산형 소나무재선충에 대한 유인력 실험은 감염된 소나무에서 갓 부화한 솔수염하늘소를 해부하여 수득한 분산형 소나무재선충 유충을 버만 깔대기 방법을 이용하여 분리한 다음 이를 실험에 사용하였으며, 분리한 분산형 소나무재선충 유충들은 1 ㎖당 200마리로 희석하여 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였고 결과는 도 4에 나타내었다.
그 결과, 상기 실시예 1의 결과와 동일하게 알파-피넨(α-pinene), 베타-피넨(β-pinene) 및 본 발명의 캠퍼(camphor)가 분산형 소나무재선충 유충에 대해서도 우수한 유인 효과가 있는 것으로 나타났다.
< 실시예 3>
인공 용실에서 증식형 소나무재선충에 대한 캠퍼의 유인력 테스트
<3-1> 인공 용실 제작
상기 실시예 1 및 2를 통해 캠퍼 성분이 소나무재선충을 유인하는 효과가 우수함을 알 수 있었다. 이에 본 발명자들은 캠퍼 성분을 이용하여 소나무재선충을 유인하고 검정할 수 있는 키트를 제작하였고 상기 키트가 소나무재선충을 유인하는 효과가 있는지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 상기 실험을 수행할 수 있도록 인공 용실을 제작하였는데, 이를 위해 건전한 소나무의 조각을 길이 5 cm, 평균 직경 2.5 cm로 절단한 다음, 절단면 중앙에 구멍을 뚫고(깊이 3-4 cm, 직경 1 cm), 멸균기로 121℃에 15분간 상기 절단된 소나무 조각을 멸균 시킨 후, 소나무재선충의 먹이가 되는 잿빛곰팡이 병균을 접종하였다. 그런 뒤, 2주 후에 병원성이 있는 소나무재선충을 1 ㎖당 1,000마리를 인공 용실에 접종한 후 25℃ 암 조건에서 보관하였다. 상기 병원성이 있는 소나무재선충은 국립산림과학원 남부산림연구소에서 분양 받은 것을 사용하였다. 상기 방법에 따른 인공 용실의 제작 과정은 도 5에 나타내었다.
<3-2> 캠퍼를 포함하는 소나무재선충 검정용 키트 제작
소나무재선충을 유인하여 검정할 수 있는 검정용 키트를 제작하기 위해, 2 ㎖의 원심분리용 튜브에 0.5%의 아가로 채운 뒤 아가가 굳으면 휘발성 물질인 캠퍼를 필터 페이퍼(가로 0.5 cm x 세로 2.5 cm) 방법 및 코튼 볼(직경 0.5 cm)의 두 가지 방법을 이용하여 10 ㎕씩 처리한 후, 상기 튜브를 인공 용실에 꽂았다. 각 처리는 3번 반복으로 실시하였고, 이후 24℃의 암 조건에 24 및 48시간 후 선충의 유인수를 조사하였다. 이때 양성대조군으로는 휘발성 물질인 알파-피넨(α-pinene) 및 베타-피넨(β-pinene)을 각각 사용하였고, 음성대조군으로는 헥산을 사용하였다. 상기 방법에 따른 결과는 도 6a 및 6b에 나타내었다.
그 결과, 필터 페이퍼 방법에 따른 휘발성 물질들의 유인력 효과는 24시간 후에는 유의적인 효과가 거의 없었지만 48시간 후에는 알파-피넨(α-pinene) 및 캠퍼가 1,089 및 1,088 마리의 선충을 유인하는 것으로 나타났고, 베타-피넨(β-pinene)이 693마리의 선충을 유인하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 반면, 헥산은 160 마리 미만의 선충만을 유인하는 효과가 있었다. 또한, 코튼 볼 방법에 따른 유인력의 효과는 필터 페이퍼 방법 보다 유인효과가 더 좋은 것으로 나타났는데, 휘발성 물질 처리 24시간 후의 알파-피넨(α-pinene)의 경우 1,129마리가 유인되었고, 베타-피넨(β-pinene)의 경우 905마리가 유인되었으며, 캠퍼의 경우 이보다 더 많은 1,651마리가 유인되는 것으로 나타났다. 나아가 48시간 후에는 캠퍼의 경우 3,050마리에 가까운 재선충이 유인되는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해, 본 발명의 캠퍼를 포함하는 소나무재선충 검정용 키트가 소나무재선충에 대한 유인 효과가 우수한 것을 알 수 있었으며, 특히 코튼 볼의 경우, 소나무재선충을 유인하는 효과가 알파-피넨(α-pinene) 및 베타-피넨(β-pinene) 보다 월등히 우수한 것을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
소나무재선충 감염목에서 본 발명에 따른 키트의 유인력 테스트
상기 실시예 <3-2>에서 제조한 본 발명의 소나무재선충 검정용 키트에 대하여 실제적으로 소나무재선충에 감염된 나무로부터 소나무재선충을 유인할 수 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 국립산림과학원 남부산림연구소에서 분양 받은 소나무재선충 감염목을 길이 8 cm 및 평균 직경 10 cm로 절단한 소나무 조각의 옆 부분에 4개의 구멍을 뚫고(간격 10 cm, 깊이 3-4 cm, 직경 1 cm) 여기에 캠퍼를 포함하는 본 발명의 검정용 키트를 삽입하였는데, 상기 키트는 원심분리용 튜브(2 ㎖)에 0.5%의 워터 아가를 부어서 굳히고 직경 0.5 cm의 코튼 볼을 상기 튜브 중앙에 삽입하여 제조한 것을 사용하였으며, 이때 상기 코튼 볼에는 유인물질로 캠퍼, α-pinene, β-pinene을 주입하였고, 대조군으로는 헥산을 주입한 것을 사용하였다. 이후 소나무 조각에 상기 키트를 꽂아둔 다음, 0.1, 1, 4, 8, 24 및 48 시간 간격으로 유인된 소나무재선충의 수를 확인 및 동정하였다. 상기 본 발명에서 사용된 소나무재선충 검정용 키트의 모형은 도 7에 나타내었고, 상기 방법에 따른 결과는 하기 표 2 및 도 8에 나타내었다.
휘발성 유인물질에 유인된 선충의 종류 및 수


유인물질
처리 24시간 후 처리 48시간 후
소나무재선충
( Bursaphelenchus . xylophilus )
어리소나무
재선충
(Bursaphele nchus mucronatus )
부식성선충
( Saprophago us nematodes )
소나무재선충
( Bursaphelenchus . xylophilus )
어리소나무
재선충
( Bursaphele nchus mucronatus )
부식성선충
( Saprophago us nematodes )
알파-피넨 743(마리) 6 0 238 1 0
베타-피넨 681 0 0 518 0 0
캠퍼 9190 0 0 22450 0 0
헥산 19 0 0 11 0 0
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 소나무재선충 검정용 키트를 감염된 소나무에 꽂은 다음 8시간 후부터 소나무재선충이 유인되었으며, 특히 휘발성 물질 처리 24시간 후의 알파-피넨(α-pinene)의 경우, 743 마리가 유인되었고, 베타-피넨(β-pinene)의 경우, 681 마리가 유인되었으며, 캠퍼의 경우에는 9,190 마리가 유인되는 것으로 나타났다. 나아가 48시간 후에는 캠퍼의 경우 22,450마리에 가까운 재선충이 유인되는 것으로 나타났다.
또한, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 키트에 의해 유인된 선충의 종류들을 확인한 결과, 캠퍼에는 소나무재선충만이 선택적으로 유인되는 것으로 나타났다. 특히, 소나무재선충 검정용 키트를 처리한지 24시간 후의 경우 소나무재선충이 9,190 마리가 유인되었고, 48 시간후에는 22,450 마리가 유인되었으나 유사재선충이나 부식성선충은 전혀 유인되지 않는 것으로 나타났다.
그러므로 상기 결과를 통해, 본 발명자들은 캠퍼를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 키트가 소나무재선충에 대한 선택적인 유인 효과가 매우 뛰어남으로 고사된 소나무 또는 소나무재선충에 의해 감염이 의심되는 나무에 적용할 경우, 소나무재선충에 의한 고사 원인 및 감염 여부를 신속하고 정확하게 검정할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
도 1은 필터 페이퍼(filter paper) 및 코튼 볼(cotton ball)의 방법으로 소나무재선충을 유인하는 실험을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 절식하지 않은 증식형 소나무재선충을 대상으로 휘발성 물질들을 처리한지 24시간 및 48시간 후의 유인된 재선충의 수를 비교하여 나타낸 그래프이며(1차 실험결과), 여기서 X축의 일련의 번호는 본 발명의 표 1에 기재된 각각의 휘발성 물질의 종류를 나타낸 것이고, ⓒ는 헥산만을 처리한 대조구를 나타낸 것이다.
도 2b는 1일 절식한 증식형 소나무재선충을 대상으로 휘발성 물질들을 처리한지 24시간 및 48시간 후의 유인된 재선충의 수를 비교하여 나타낸 그래프이며(2차 실험결과), 여기서 X축의 일련의 번호는 본 발명의 표 1에 기재된 각각의 휘발성 물질의 종류를 나타낸 것이고, ⓒ는 헥산만을 처리한 대조구를 나타낸 것이다.
도 3a는 절식하지 않은 증식형 소나무재선충을 대상으로 휘발성 물질들을 처리한지 24시간 및 48시간 후의 유인된 재선충의 수를 비교하여 나타낸 그래프이며(2차 실험결과), 여기서 X축의 일련의 번호는 본 발명의 표 1에 기재된 각각의 휘발성 물질의 종류를 나타낸 것이고, ⓒ는 헥산만을 처리한 대조구를 나타낸 것이다.
도 3b는 1일 절식한 증식형 소나무재선충을 대상으로 휘발성 물질들을 처리한지 24시간 및 48시간 후의 유인된 재선충의 수를 비교하여 나타낸 그래프이며(2차 실험결과), 여기서 X축의 일련의 번호는 본 발명의 표 1에 기재된 각각의 휘발 성 물질의 종류를 나타낸 것이고, ⓒ는 헥산만을 처리한 대조구를 나타낸 것이다.
도 4는 분산형 소나무재선충에 대하여 휘발성 물질들을 처리한지 24시간 후에 유인된 소나무재선충 분산형 유충의 수를 비교하여 나타낸 그래프이며, 여기서 X축의 일련의 번호는 본 발명의 표 1에 기재된 각각의 휘발성 물질의 종류를 나타낸 것이고, ⓒ는 헥산만을 처리한 대조구를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 캠퍼를 포함하는 소나무재선충 유인용 키트에 대한 유인효과를 실험하기 위해 인공 용실의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 6a는 휘발성 물질로 알파-피넨(α-pinene)(A), 베타-피넨(β-pinene)(B), 캠퍼(C) 및 헥산이 각각 처리된 필터 페이터를 포함하는 소나무재선충 검정용 키트를 이용하여 상기 휘발성 물질 처리 후 24시간 및 48시간 후에 유인된 소나무재선충의 유인수를 각각 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6b는 휘발성 물질로 알파-피넨(α-pinene)(A), 베타-피넨(β-pinene)(B), 캠퍼(C) 및 헥산이 각각 처리된 코튼 볼을 포함하는 소나무재선충 검정용 키트를 이용하여 상기 휘발성 물질 처리 후 24시간 및 48시간 후에 유인된 소나무재선충의 유인수를 각각 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 소나무재선충 검정용 키트의 일 모형을 나타낸 그림이다.
도 8은 코튼 볼에 알파-피넨(α-pinene), 베타-피넨(β-pinene), 캠퍼 및 헥산을 각각 처리한 코튼볼을 포함하는 소나무재선충 검정용 키트를 이용하여 상기 코튼 볼이 휘발성 물질을 처리한 후 0, 1, 1, 4, 8, 24 및 48시간 후에 유인된 소 나무재선충의 수를 비교하여 나타낸 그래프이다.

Claims (5)

  1. 캠퍼(camphor)를 유효성분으로 포함하는 소나무재선충 유인용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 캠퍼는 10-3~10-5M의 농도가 되도록 헥산으로 희석하는 것을 특징으로 하는 소나무재선충 유인용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 살충제를 추가로 포함하여 소나무재선충을 유인 및 살충하는 것을 특징으로 하는 소나무재선충 유인용 조성물.
  4. 캠퍼(camphor)를 유효성분으로 포함하는 소나무재선충 유인용 조성물을 포함하는 소나무재선충 검정용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 키트는,
    튜브;
    상기 튜브 내부의 하부에 배치되는 겔(gel);
    상기 겔의 상부에 배치되고 캠퍼를 함유하는 캠퍼 흡수제; 및
    상기 튜브를 밀폐할 수 있는 마개를 포함하는 것을 특징으로 하는 소나무재선충 검정용 키트.
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