KR20100116558A - 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법 - Google Patents

체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체는, 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드를 알파-1 안티트립신 또는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체에 결합시켜 체내 지속성을 유지함으로 혈중반감기(T1/2)가 고유의 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드보다 현저히 증가하여 체내 안정성이 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체는 단백질 또는 펩티드 약물의 지속성 제제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법{Fusion protein or fusion peptide with increased half life by keeping long-acting activity, and method for increasing half life using the same}
본 발명은 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
기존의 단백질 및 펩티드 의약품들은 일반 화학 합성 의약이 제공하지 못하는 치료 효과를 나타내고 뛰어난 효능을 발휘하여서 의약 치료제 분야에서 중요한 영역을 차지하고 있다. 예를 들어, 유전자 재조합 인간성장호르몬(hGH, recombinant human growth hormone)은 성장 호르몬 결핍증의 효과적인 치료제로서 유일하게 사용되고 있으며, 유전자 재조합 적혈구 촉진인자(EPO, recombinant human erythropoietin)는 신장 이상에 의한 빈혈 환자의 적혈구 농도를 상승시키는 약으로 사용되고 있고, 유전자 재조합 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF, recombinant granulocyte colony stimulating hormone)는 화학적 치료를 받는 암 환자의 백혈구를 증가시키는 유일한 약으로 사용되고 있다. 이 외에도 인체에 존재하는 다양한 종류의 사이토카인(cytokine), 호르몬, 펩티드 등이 대체 치료제가 없는 경우 유일한 치료제로서 광범위하게 사용되고 있다.
그러나, 이들 단백질 또는 펩티드 치료제들은 체내에서 뛰어난 치료 효과를 발휘하지만 일반적으로 혈액 내의 가수분해효소에 의하여 분해되어 주사 후 치료 효과가 바로 소실되거나, 신장이나 간을 통하여 쉽게 체내에서 제거되기 때문에 짧은 반감기를 가지고 있다. 따라서, 이들 단백질 또는 펩티드 치료제들은 체내에서 일정한 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 자주 주사를 해야 하는 취약점을 가지고 있다. 단백질 치료제 또는 펩티드 치료제의 잦은 주사는 주사의 공포심, 주사 시의 통증 등 환자의 약물 순응도를 감소시켜서 장기간 치료를 요하는 경우 제한적으로 사용되며, 이에 따라 치료 효과도 떨어지는 단점이 있다.
따라서, 단백질/펩티드 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오래 유지하기 위한 연구가 꾸준히 진행되어 왔다.
이러한 연구의 일 예로, 단백질 또는 펩티드를 체내에서 자연분해시키는 폴리머를 이용하여 봉합한 후 피하 또는 근육 주사하여 체내에서 서서히 방출시키는 서방형(sustained release) 치료제가 개발되었다(M. Chasin & R. Langer, et al., Biodegradable polymer as drug delivery system, Marcel Dekker (1990); J. Heller, et al., Adv. Drug Del Rev., 10, 163 (1993)). 생체 내 분해되는 폴리머로는 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))가 가장 많이 사용되며, 상기 서방형 치료제의 대표적인 예로는 LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone) 작용제 (agonist) 펩티드를 서방출성 펩티드로 제조한 제품이 있으며, 이 제품은 1개월 또는 3개월 이상 체내에서 펩티드를 방출하기도 한다. 또한, 이러한 연구는 분자량이 큰 단백질에도 적용되었으며, 이의 일 예로, 미국등록특허 제 6,500,448호에는 생분해성 고분자와 금속 이온을 통해 인간성장호르몬의 서방성 미세입자를 제조하는 기술에 대해 기재되어 있다. 대한민국등록특허 제 10-0236771호 및 제 10-0329336호에는 재조합 인간성장호르몬을 체내에서 분해시키는 히아루론산을 이용한 단백질 약물의 서방성 미세 입자 제형에 관하여 기재되어 있다.
그러나, 생체분해성 폴리머를 이용한 서방형 치료제는 아미노산의 숫자가 적은 분자량을 가진 펩티드에서는 어느 정도 성공을 거두었으나, 분자량이 큰 단백질 치료제의 경우는 성공이 제한적이었다. 그 이유는 서방출성 봉합체를 만드는 과정에서 단백질의 변성이 쉽게 일어나서 아미노산의 변형이 단백질의 역가를 저하시키고 아울러 인체에서 원하지 않는 면역 반응을 야기하기 때문이다. 또한, 일반적으로 단백질 또는 펩티드 서방출성 봉합체의 미세입자의 경우 입자의 크기가 커서 인체에 주사할 때 주사 바늘이 굵은 주사기를 사용하여야 하는 단점이 있고, 제조 과정에서의 낮은 생산수율이 경제성에서 문제가 되기도 한다.
상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여, 단백질 또는 펩티드의 신장 투과를 지연시키기 위한 방법이 연구되었다. 일반적으로, 분자량이 60,000 달톤 이하의 단백질들은 체내에서 신장의 여과체에서 걸러지지 않고 그대로 통과하게 된다. 따라서, 이보다 적은 분자량을 가진 펩티드 또는 단백질 치료제의 크기를 증가시켜서 체내 잔류 시간을 증가시킴으로써 주사 횟수를 줄이고자 하는 방법이 연구되었다. 이러한 방법에 의하면, 생리활성이 있는 단백질/펩티드는 체내에서 서서히 방출 (sustained release)되는 형태가 아니라 지속성(long-acting)의 작용을 할 수 있을 것으로 생각된다.
주사 횟수를 줄이는 방법 중 가장 보편적으로 사용되는 방법으로는, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; 이하 'PEG'라 약칭함)과 같이 용해도가 높은 고분자 물질을 단백질 또는 약리 활성을 가진 펩티드의 표면에 부착시키는 방법이 있다. PEG는 단백질 또는 펩티드의 아민기를 가진 아미노산에 비특이적으로 부착되며, PEG가 부착된 단백질은 용해도가 증가하고 수용액 상태에서 유체역학적 부피 (hydrodynamic volume)가 증가하여 인체에 주사 시 체내에 오래 머무르는 효과가 있다(Sada et al., J. Ferment Bioeng 71, 137-139, 1991).
최근에는 인터페론 알파에 PEG를 부착시켜서 주사 횟수를 줄이고자 하는 방법이 상용화되었다. 또한, 킨스틀러 등은 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)에 PEG를 부착시켜서 일주일에 한번 주사해도 주 3회 주사하는 과립구 콜로니 자극인자와 약효가 동일함을 입증하였으며(Kinstler et al., Pharm Res 12, 1883~1888, 1995), 상기 PEG-GCSF는 "Neulast"라는 상품명으로 허가를 받아 사용되고 있다.
그러나, 단백질에 PEG가 부착되면 PEG의 단백질 표면에 PEG가 비특이적으로 화학결합을 이루기 때문에 PEG가 부착된 단백질의 부분이 수용체와 결합을 방해하여 단백질의 생체 내 역가가 현저히 저하되는 문제가 있다. 또한, 생리활성을 일으키는 부위에 비특이적으로 부착된 PEG-단백질들을 정제 과정에서 분리해서 생체 내 활성저하를 최소화하게 결합된 PEG-단백질을 얻어내야 하는 번거로움이 있다. 이 과정에서 원하는 PEG-단백질 결합체를 얻기 위해서는 생산수율이 현저히 저하되어서 경제성이 낮고, 특정 단백질들의 경우 수용액 상태에서의 안정성이 낮은 경우에는 PEG를 부착시키고자 하는 시도가 실패하기도 하였다.
또한, 당쇄공학(glycoengineering)을 이용하여 주사 횟수를 줄이고자 하는 방법이 개발되어 상용화 되었다. Elliot 등은 적혈구 촉진인자(EPO)의 아미노산을 치환하는 방법을 이용하여 당쇄를 추가하는 방법에 대해 보고하였다(Nat Biotechnol 21, 414~421, 2003; 미국등록특허 제 7,217,689호). 당쇄공학적 방법이 적용된 적혈구 촉진인자는 "Aranesp"라는 상품명으로 허가를 받아 시판되고 있으며, 당쇄, 시알산(sialic acid) 및 분자량 증가로 인해 혈류로의 흡수 및 대사와 배설이 지연되는 효과를 가지게 되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이 기술은 생리활성 물질의 당쇄 부착 또는 추가로 인해 활성 저하가 유발될 수 있고, 체내 안정성의 지속 여부가 여러 단백질에 대해 검증되지 않았으며, 생리활성 단백질에 추가로 부착되는 당쇄의 위치가 매우 제한적이고, 저분자 펩티드에는 적용시키기 쉽지 않은 등 그 사용이 매우 제한적일 수 밖에 없다.
유전 공학적인 방법이 발달한 이후 생리활성을 가진 단백질을 큰 분자량을 갖는 다른 단백질과 융합시켜 단백질의 크기를 증가시키는 방법이 연구되었다(Curr Opin Drug Discov Devel 12, 284~95, 2009). 예를 들어, 생리활성을 가진 단백질의 유전자와 인간 알부민(human albumin) 유전자를 융합한 후 효모세포에서 발현시킨 융합 단백질이 알려져 있다(국제출원공개 WO 93/15199호 및 WO 93/15200호). 상기의 알부민과 생리활성 단백질의 융합에 관한 예로는, 과립구 자극인자(Halpern et al., Pharm Res 19, 1720~1729, 2002), 인간성장호르몬(Osborn et al., Eur J Pharmacol 456, 149~158, 2002), 글루카곤 유사 펩티드-1(Baggio et al., Diabetes 53, 2492~2500, 2004), 인터페론 알파(Osborn et al., J Pharmacol Exp Ther 303, 540~548, 2002) 등이 알려져 있다.
유전자 재조합 방법을 이용한 융합 단백질의 다른 예로는, 트랜스페린 (transferrin) 융합 단백질이 알려져 있다. 예를 들어, 미국등록특허 제 7,176,278호에서는 천연형 트랜스페린 및 당화가 되지 않는 트랜스페린 변이체와 글루카곤 유사 펩티드-1 등의 융합체(fusion molecule)를 만들어 체내 반감기를 증가시키고자 하였다.
한편, 면역글로불린(Immunoglobulin, Ig)의 Fc 부분을 특정 단백질과 융합시켜서 체내 반감기를 증가시키는 방법이 개발되었다(미국등록특허 제 5,116,964호 및 제 5,605,690호). TNF-α 수용체(TNF-α receptor) 절편을 IgG1의 Fc 부분과 결합시킨 유전자를 동물세포(chinese hamster ovary, CHO)에서 발현시킨 물질(상품명: Enbrel)은 류마티스 관절염 치료제로 미국 FDA 허가를 받아서 현재 치료제로 사용되고 있다. 또한, 왕(Qinghua Wang; WO 2007/012188)은 체내 반감기가 짧은 생리활성 펩티드인 GLP-1(t1/2 < 2분) 또는 엑센딘-4를 Ig의 Fc 부분과 융합체(fusion molecule)를 만들어서 체내 반감기를 증가시키고자 하였다.
이와 같이, 면역글로불린 Fc는 융합 단백질의 운반체(carrier)로서 많이 이용되고 있으나, IgG Fc가 가지는 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cell cytotoxicity; ADCC) 또는 보체-의존성 세포 독성(complement dependent cytotoxicity; CDC) 효과는 그대로 유지하게 된다. 따라서, 생리활성 물질과 Fc를 융합한 물질을 인체에 투여할 경우 단순한 체내 반감기를 유지시키고자 하는 목적 외에도 복잡한 면역 반응에 노출이 될 뿐만 아니라 장기 반복 투여 시 원하지 않는 항체를 생성시키기도 한다. 따라서, Fc가 융합된 상기 방법은 사용이 제한적이 될 수 밖에 없다.
또한, 대한민국등록특허 제 10-0725315호에는 면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의 제조방법, 즉 생리활성을 가진 단백질과 Fc 부분을 PEG로 연결시켜서 체내 반감기를 증가시키는 방법에 관하여 기재되어 있다. 상기 방법의 경우, 생리활성 단백질-PEG-Fc의 구조를 가진 "단백질 결합체"는 약물 동력학 조사에서 구조가 변형되지 않은 생리활성 단백질 보다 더 긴 체내 반감기를 가지는 것을 보여주었다. 그러나, 상기 "단백질 결합체"도 두 생리활성 단백질과 Fc를 PEG로 화학 반응을 통하여 연결시킨다는 점에서 PEG 융합 단백질 제조에서 발생할 수 있는 문제가 상존한다.
면역글로불린을 이용한 다른 예로, IgG 항체 전체 분자와 저분자 화합물을 화학적으로 연결시켜 펩티드 약물의 체내 안정성을 증가시키고자 하였다(Rader et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5396~5400, 2003, Doppalapudi et al., Bioorg & Med Chem 17, 501~506, 2007). 그러나, "CovX-Body"라고 명명된 이 기술은 생리활성 단백질과 같은 분자량이 큰 단백질에는 사용할 수 없고, 또한 상기 Fc 융합 단백질과 PEG 단백질 제조에서 발생하는 문제점들로 인해 사용이 제한적일 수 밖에 없다.
상기한 바와 같이, 생리활성 단백질 치료제 또는 펩티드 치료제에 고분자를 융합시키는 다양한 방법이 시도되어 왔지만, 이러한 방법들은 특정 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드와 결합시킬 경우 체내 지속 시간이 의약용으로 개발하기에 적합하지 못하고, 제조 과정에서 수율이 현저히 낮아서 경제성이 결여되며, 장기간 사용시 체내에서 불필요한 면역 반응을 야기하고, 단백질 또는 펩티드 결합 과정에서 사용되는 화학 물질 잔기가 체내 주입 시 독성을 야기하는 등 다양한 이유에 의하여 모든 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드에 적용하지 못한다는 단점이 있다. 따라서, 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드의 체내 활성 감소를 최소화하면서 혈중 반감기를 연장시킬 수 있는 새로운 단백질 또는 펩티드 융합체에 대한 개발의 필요성이 요구되고 있다.
본 발명자들은 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드의 체내 활성 감소를 최소화하면서 혈중 반감기를 연장시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드 융합체에 대하여 연구하던 중, 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드를 알파-1 안티트립신 또는 알파-1 안티트립신 변이체와 결합시켜 새로운 단백질 또는 펩티드 융합체를 제조하였으며, 상기 단백질 또는 펩티드 융합체가 체내 지속성을 유지함으로 혈중반감기 (T1/2)가 고유의 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드보다 현저히 증가하여 체내 안정성이 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명에 따른 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 약물동태 그래프를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체 [T502: α1AT(P357N)/IFN-α]의 약물동태 그래프를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 약물동태 그래프를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]의 약물동태 그래프를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]의 생체 내 활성(뇌하수체가 제거된 랫트의 무게 증가) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 생체 내 활성(백혈구 수 증가) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]의 복강내 당부하 검사 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]가 당뇨모델 마우스에서 혈당 감소에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 세포내 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 세포내 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]의 트립신 활성 억제를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]의 인간 호중구 엘라스타제 활성 억제를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH] 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 수행 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드를 알파-1 안티트립신과 결합시켜, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드를, 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체와 결합시켜, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드를, 알파-1 안티트립신 또는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체와 결합시켜, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체는, 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드를 알파-1 안티트립신 또는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체와 결합시켜, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기를 증가시킨 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 "단백질 융합체(fusion protein/fusion polypeptide)"는 하나 이상의 생리활성을 가진 단백질을 알파-1 안티트립신 또는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합시킨 새로운 분자 구성을 가진 단백질 융합체를 의미한다. 또한 "펩티드 융합체 (fusion peptide)"는 하나 이상의 생리활성을 가진 저분자량의 펩티드를 알파-1 안티트립신 또는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합시킨 새로운 분자 구성을 가진 펩티드 융합체를 의미한다.
상기 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드는 직접 또는 아미노산으로 구성된 링커를 이용하여 알파-1 안티트립신 또는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체에 결합될 수 있다.
상기 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드와 알파-1 안티트립신 또는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체는 유전자 재조합 기술을 이용하여 결합시키는 것이 바람직하나, 당업계에 알려져 있는 가교제를 사용하여 알파-1 안티트립신 또는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체의 N-말단, C-말단 또는 유리 기에 결합시킬 수 있다.
상기 생리활성 단백질은 호르몬류 및 이의 수용체, 생물학적반응 조절물질 (biological response modifier) 및 이의 수용체, 사이토카인류 및 이의 수용체, 효소류, 항체류, 항체 단편류 등을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 상기 생리활성 단백질은 인간성장호르몬(hGH), 인슐린, 난포자극호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin), 부갑상선호르몬(parathyroid hormone, PTH), 적혈구 촉진인자(EPO), 혈소판생성 촉진인자(TPO), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨, 대식세포 (marophage) 활성화 인자, 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 조직플라스미노겐 활성체(tissue plasminogen activator), 혈액응고인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, hBMP2 (human bone morphogenic protein 2), KGF(keratinocyte growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 알파-갈락토시다제 A(α-galactosidase A), 알파 이두로니다제(α-L-iduronidase), 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 락타제(lactase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파제(lipase), 유리카제(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 유로키나제, 스트렙토키나제, 마이엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase), 수퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase), 보톨리늄 독소, 콜라게나제, 히알루로니다제 (hyaluronidase), L-아스파라기나제(L-asparaginase), 단일클론항체, 다클론항체, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 생리활성 펩티드는 글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1) 및 이의 유사체, 엑센딘 및 이의 유사체, 소마토스타틴(somatostatin) 및 이의 유사체, LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone) 작용제 및 길항제, 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1 (thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신 유사체(vasopressin analogues), 및 생리활성 단백질의 단편 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 알파-1 안티트립신은 분자량이 약 50,000 달톤의 포유류의 혈액 내에 존재하는 단백질 중의 하나로서, 혈액 내 농도는 약 2㎎/㎖에 달하는 주 혈액 단백질 중의 하나이며(Robin W.C. et al., Nature 298, 329-334, 1982), 알파-1 프로테아제 억제제(alpha-1 protease inhibitor)라고도 불리운다. 이 단백질은 단백질 분해 효소와의 시험시 여러 종류의 단백질 분해 효소를 억제한다. 그러나, 현재 알려진 질환과 관련된 생체 내 주된 기능은 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase)의 억제제로 알려져 있다(Beatty et al., J Biol Chem 255, 3931~3934, 1980). 알파-1 안티트립신이 결핍되면 폐의 기능이 저하되고 심각한 유전적 질환을 일으키기도 한다. 따라서, 혈액 내에서 추출한 알파-1 안티트립신은 FDA의 허가를 거쳐서 프로라스틴(Prolastin)이라는 상품명으로 폐기종(emphysema) 치료제로 판매되고 있다. 프로라스틴은 통상적으로 60㎎/㎏의 용량으로 1주 간격으로 정맥 주사로 인체에 투여되며, 인체에서의 안전성 및 유해성이 입증이 된 단백질이다. 또한, 알파-1 안티트립신의 체내 반감기는 약 5~6일 정도로 알려져 있다(Weweres, MD, et al., N. Engl J med 316, 1055-1062, 1987). 따라서, 인체에 과량 투여해도 안정성 등이 이미 입증된 알파-1 안티트립신을 생리활성을 가진 단백질 또는 펩티드와 융합하여 체내 반감기가 증가된 지속성 물질로 만들고자 하는 논리적인 근거가 제공된다. 알파-1 안티 트립신의 프로테아제 억제제로의 역할 및 구조 등은 이미 잘 알려져 있다 (Elliott, P. et al., JMB 275, 419-425, 1998). 알파-1 안티트립신의 P1(N-말단에서부터 358번 위치) 아미노산은 메티오닌 기이지만, 이 단백질은 트립신, 키모트립신(chymotrpsin), 트롬빈 및 엘라스타제 등의 다양한 프로테아제 등의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다. 또한, 알파-1 안티트립신은 자연계에 100여 종 이상의 대립유전자(allele)가 존재하고, 표현형(phenotype)은 IEF(isoelectric focusing) 유형에 따라 A에서 Z로 구분한다(Stoller et al., The Lancet, 365, 2225 - 2236, 2005). 이중 가장 많은 M 대립 유전자는 정상형으로 아미노산 서열 변이에 의해 다시 M1(Val213), M1(Ala213), M2, M3와 같이 여러 가지 아형(subtype)으로 구분된다. 따라서, 본 발명에 사용된 알파-1 안티트립신은 자연계에 존재하는 특정 아형이며, 다른 아형에 대하여도 동일한 효과를 얻을 수 있다.
상기 알파-1 안티트립신 변이체는 하나 이상의 아미노산을 변이시켜 특정부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 제조된다. 예를 들어, 알파-1 안티트립신 변이체에서 하나 이상의 아미노산의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이된 것을 특징으로 한다. 또한, 알파-1 안티트립신 변이체에서 하나 이상의 아미노산의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이된 것을 포함하고 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 것을 포함한다. 상기 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산의 변이는 359번째 아미노산인 세린이 트레오닌으로 변이되거나 또는 232번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 변이된 것을 포함한다. 또는 상기 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산의 변이는 359번째 아미노산인 세린이 트레오닌으로 변이되고 232번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 변이된 것을 포함한다. 즉, 알파-1 안티트립신 변이체는 알파-1 안티트립신 변이체[α1AT(P357N)], 알파-1 안티트립신 이중 변이체[α1AT(P357N, S359T)], 알파-1 안티트립신 이중 변이체 2[α1AT(P357N, C232S)], 알파-1 안티트립신 삼중 변이체[α1AT(P357N, C232S, S359T)]를 포함한다.
상기 알파-1 안티트립신 변이체[α1AT(P357N)]는 N-말단으로부터 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린(proline)을 아스파라진(Asn)으로 변이시킨 것을 특징으로 한다. 이러한 알파-1 안티트립신 변이체는 Asn-X-Ser의 새로운 N-당화 부위가 생성되어 알파-1 안티트립신의 프로테아제 억제제의 활성을 중화시키는 동시에 체내 주입 시에 아미노산 치환에 의한 면역원성 가능성을 최소화할 수 있다.
상기 알파-1 안티트립신 이중 변이체[α1AT(P357N, S359T)]는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린을 아스파라진으로 변이시키고 359번째 아미노산인 세린을 트레오닌으로 변이시킨 것을 특징으로 한다. 이러한 알파-1 안티트립신 변이체는 Asn-X-Thr의 새로운 N-당화 부위가 생성되어 알파-1 안티트립신의 프로테아제 억제제의 활성을 중화시키는 동시에 체내 주입 시에 아미노산 치환에 의한 면역원성 가능성을 최소화할 수 있다.
상기 알파-1 안티트립신 이중 변이체 2[α1AT(P357N, C232S)]는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린을 아스파라진으로 변이시키고 232번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 변이시킨 것을 특징으로 한다. 이러한 알파-1 안티트립신 이중 변이체 2는 Asn-X-Ser의 새로운 N-당화 부위가 생성되어 알파-1 안티트립신의 프로테아제 억제제의 활성을 중화시키는 동시에 체내 주입시에 아미노산 치환에 의한 면역원성 가능성을 최소화할 수 있으며, 유리 시스테인에 의한 이중체 형성 등을 제거할 수 있다.
상기 알파-1 안티트립신 삼중 변이체[α1AT(P357N, C232S, S359T)]는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린을 아스파라진으로 변이시키고, 232번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 변이시키며, 359번째 아미노산인 세린을 트레오닌으로 변이시킨 것을 특징으로 한다. 이러한 알파-1 안티트립신 변이체는 Asn-X-Thr의 새로운 N-당화 부위가 생성되어 알파-1 안티트립신의 프로테아제 억제제의 활성을 중화시키는 동시에 체내 주입시에 아미노산 치환에 의한 면역원성 가능성을 최소화할 수 있으며, 유리 시스테인기에 의한 이중체 형성 등을 제거할 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 펩티드 융합체는 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH](서열번호 1), 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH](서열번호 2), 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH](서열번호 3), 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체[T502: α1AT(P357N)/IFN-α](서열번호 4), 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF](서열번호 5), 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF](서열번호 6), 및 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)](서열번호 7)를 포함한다.
본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH], 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체[T502: α1AT(P357N)/IFN-α], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF], 및 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]의 혈중반감기(t 1/2 )는 고유의 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드보다 현저히 증가하여 체내 안정성이 우수하다.
또한, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]를 주사한 뇌하수체가 제거된 랫트의 경우 체중 증가를 나타내고, 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] 및 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]를 주사한 랫트의 경우 백혈구 수가 증가된다. 또한, 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]를 투여한 군은 엑센딘-4를 투여한 군보다 혈당 감소효과가 우수하고, 24시간 후에도 혈당이 낮게 유지되어 혈당 감소 효과가 오랜 시간 동안 지속된다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체는 효과적으로 생체 내 활성을 오래도록 유지함을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] 및 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 세포 내 활성(EC50)은 알파-1 안티트립신 및 알파-1 안티트립신 변이체의 종류에 상관없이 큰 차이가 없이 유사하게 나타난다.
또한, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH]는 트립신 억제 활성 및 인간 호중구 엘라스타제에 대한 억제 활성이 우수하게 나타나고, 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]는 트립신 억제 활성 및 인간 호중구 엘라스타제에 대한 억제 활성이 낮게 나타난다. 따라서, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체 [T109wt: α1AT/hGH] 및 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]가 체내에서 활성을 지속적으로 유지함으로 체내 반감기가 증가하는 것이 알파-1 안티트립신의 고유 성질에 의한 것이 아님을 알 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체는 체내 지속성을 유지함으로 혈중반감기(T1/2)가 고유의 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드보다 현저히 증가하여 체내 안정성이 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체는 단백질 또는 펩티드 약물의 지속성 제제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체의 제조 [T109wt: α1AT/hGH]
1. 발현 벡터 pSNAT의 제조
인간성장호르몬을 알파-1 안티트립신의 C-말단에 융합시켜 발현하기 위하여, 알파-1 안티트립신만을 발현하는 벡터인 pSNAT를 제조하였다. 구체적으로는, C-말단에 인간성장호르몬을 삽입하기 위해 알파-1 안티트립신을 코딩하는 벡터인 hMU001448(KRIBB)를 두개의 프라이머인 ALT21(서열번호 8)과 ALT30(서열번호 9)을 이용하여 PCR로 증폭하였다. 이때 사용된 프라이머 중 ALT30은 융합된 단백질의 활성을 유지하기 위하여 유연성을 극대화하기 위한 링커를 포함하고 있다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두개의 제한 효소인 XhoI과 BamHI으로 절단하여 모벡터인 pSGHV0(GenBank Accession No. AF285183)에 결합하여 클로닝하였으며, 이를 pSNAT로 명명하였다.
2. 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 벡터의 제조 [T109wt, α1AT/hGH]
인간성장호르몬(hGH)을 엔코딩하는 IOH45734(invitrogen) 벡터를 모체로 하여 두개의 프라이머인 DH22(서열번호 10)와 ALT12(서열번호 11)를 사용하여 PCR로 인간성장호르몬을 증폭하였다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두개의 제한효소인 BamHI과 NotI으로 절단하고, BamHI/NotI 절단부를 가지고 있는 pSNAT에 결합하여 발현 벡터인 T109wt(서열번호 1)를 제조하였다.
3. 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체(T109wt)의 발현
차이니즈 햄스터 난소세포(CHO-K1)를 이용하여 상기 2에서 제조한 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체(T109wt)의 발현을 확인하였다. CHO-K1은 10% FBS (Fetal Bovine Serum)와 항생제를 포함한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)에 5% CO2와 37℃ 조건으로 배양하여 유지하였다. 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체(T109wt)를 도입하기 하루 전, 100㎜ 배양접시에 세포를 1×106 농도로 접종하여 배양한 후, FBS와 항생제가 없는 800㎕의 DMEM과 5㎍의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체(T109wt)를 혼합하여 상온에서 1분 동안 유지한 후, 20㎍의 PEI(Polyethylenimine, linear, Polysciences Inc (Cat. no: 23966, MW~25,000))와 혼합하여 10~15분 정도 상온에서 방치하였다. 이때 하루 전 배양하였던 세포를 PBS로 씻어내고 새로운 배양액 6㎖의 DMEM을 첨가하였다. 10~15분 후, 상온에 방치한 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체(T109wt)를 이 배양접시에 첨가하였다. 다음 날 PBS로 씻어내고 FBS가 없는 IMDM(Cat. No 12200-028, Gibco, Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지를 첨가하여 단백질 발현을 확인하였다.
4. 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체(T109wt)의 정제
상기 3에 의하여 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO-K1)에서 발현한 T109wt 단백질을 하기와 같이 정제하였다. 구체적으로는, 세포 배양액으로 분비된 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체(T109wt)를 정제하기 위하여, 배양액을 원심 분리하여 세포를 제거한 후 상등액만을 취하였다. 세포 상등액을 평형 완충용액(20mM sodium phosphate, pH 8.0)으로 희석하여 평형 완충용액으로 평형화된 Q-Sepharose (GE Healthcare, 미국) 컬럼에 주입한 후 평형 완충용액으로 충분히 세척한 후 염의 농도를 증가(0~400mM NaCl, 20mM sodium phosphate, pH8.0)시켜 용출하였다. 용출된 상기 단백질 용액에 염을 가하여 평형화되어 있는 Phenyl-Sepharose(GE Healthcare, 미국) 컬럼에 주입한 후 평형 완충용액으로 충분히 세척하고 염의 농도를 감소(2~0M NaCl, 20mM sodium phosphate, pH6.8)시켜 용출하였다. 상기 용액을 Vivaspin20(GE Healthcare, 미국)을 사용하여 농축하고 고순도로 정제된 T109wt 단백질을 얻었다.
실시예 2 : 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체의 제조 [T109: α1AT(P357N)/hGH]
1. 알파-1 안티트립신 변이체의 제조 (pDHT3N 클로닝 벡터)
단백질 치료제 또는 펩티드 치료제의 융합체의 제조에 사용되는 알파-1 안티트립신의 활성을 감소시키기 위하여, 알파-1 안티트립신 변이체를 제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신을 코딩하는 벡터 hMU001448(KRIBB)를 PCR로 증폭하고 yT&A 벡터에 클로닝하여 pDHT3 벡터를 제조하였다. 그 다음 두개의 프라이머 ALT1(서열번호 12) 및 ALT2(서열번호 13)와 변이체 생성키트(Stratagene, QuikChange Ⅱ Cat No. 200523-5)를 사용하여 알파-1 안티트립신 활성에 영향을 주는 P2 위치인 357번째 아미노산 프롤린을 아스파라진으로 변이시켜 활성을 감소시키고 N-당화를 유도한 pDHT3N 클로닝 벡터를 제조하였다.
2. 발현 벡터 pSNATN의 제조
인간성장호르몬을, 활성이 감소된 알파-1 안티트립신 변이체의 C-말단에 융합시켜 발현하기 위하여, pSNATN 벡터를 제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신 변이체의 C-말단에 인간성장호르몬을 삽입하기 위해, 활성이 감소된 알파-1 안티트립신 변이체를 코딩하는 벡터인 pDHT3N을 두개의 프라이머인 ALT14(서열번호 14)와 ALT30(서열번호 9)을 이용하여 PCR로 증폭하고 pSNAT와 두개의 제한 효소인 EcoRV와 BamHI을 이용하여 클로닝하였으며, 이를 pSNATN으로 명명하였다.
3. 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이체 벡터의 제조 [T109, α1AT(P357N)/hGH]
상기 실시예 1의 2와 동일한 방법으로 증폭된 인간성장호르몬 뉴클레오티드를 BamHI/NotI 절단부를 가지고 있는 pSNATN에 결합하여 발현 벡터인 T109(서열번호 2)를 제조하였다.
4. 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체 (T109)의 발현
상기 실시예 1의 3과 동일한 방법으로 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO-K1)를 이용하여 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체(T109)의 발현을 확인하였다.
5. 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체 (T109)의 정제
상기 실시예 1의 4와 동일한 방법으로 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체(T109)를 정제하였다.
실시예 3 : 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체의 제조 [T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]
1. 알파-1 안티트립신 이중 변이체의 제조 (pDHT3NT 클로닝 벡터)
단백질 치료제 또는 펩티드 치료제의 융합체의 제조에 사용되는 알파-1 안티트립신 변이체의 당화의 균질성을 위하여, 알파-1 안티트립신 이중 변이체를 제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신 활성에 영향을 주는 P2 위치인 357번째 아미노산 프롤린을 아스파라진으로 변이시켜 활성을 감소시키고, N-당화를 유도한 pDHT3N 클로닝 벡터를 모체로 하여, 2개의 프라이머 ALT82(서열번호 15) 및 ALT83 (서열번호 16)과 변이체 생성키트(엔지노믹스, EZchange Cat No. EM020)를 사용하여 359번째 아미노산 세린을 트레오닌으로 변이시켜 pDHT3NT 클로닝 벡터를 제조하였다.
2. 발현 벡터 pSNATNT의 제조
인간성장호르몬을, 당화의 균질성을 가지면서 활성이 감소된 알파-1 안티트립신 이중 변이체의 C-말단에 융합시켜 발현하기 위하여, pSNATNT 벡터를 제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신 이중 변이체의 C-말단에 인간성장호르몬을 삽입하기 위해, 알파-1 안티트립신 이중 변이체를 코딩하는 벡터인 pDHT3NT를 두개의 프라이머인 ALT14(서열번호 14)와 ALT30(서열번호 9)을 이용하여 PCR로 증폭하고 pSNAT와 두개의 제한 효소인 EcoRV와 BamHI을 이용하여 클로닝하였으며, 이를 pSNATNT로 명명하였다.
3. 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중 변이체 벡터의 제조 [T109T, α1AT(P357N, S359T)/hGH]
상기 실시예 1의 2와 동일한 방법으로 증폭된 인간성장호르몬 뉴클레오티드를 BamHI/NotI 절단부를 가지고 있는 pSNATNT에 결합하여 발현 벡터인 T109T(서열번호 3)를 제조하였다.
4. 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 (T109T)의 발현
상기 실시예 1의 3과 동일한 방법으로 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO-K1)를 이용하여 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체(T109T)의 발현을 확인하였다.
5. 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 (T109T)의 정제
상기 실시예 1의 4와 동일한 방법으로 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체(T109T)를 정제하였다.
실시예 4 : 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체의 제조 [T502: α1AT(P357N)/IFN-α]
1. 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이체 벡터의 제조 [T502, α1AT(P357N)/IFN-α]
인간 인터페론 알파(IFN-α)를 엔코딩하는 MHS1010-98051913(Open biosystems) 벡터를 모체로 하고, 두개의 프라이머인 ALT45(서열번호 17)와 ALT49 (서열번호 18)를 사용하여 PCR로 인간 인터페론 알파(IFN-α)를 증폭하였다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두개의 제한효소인 BamHI과 NotI으로 절단하여 BamHI/NotI 절단부를 가지고 있는 pSNATN에 결합하여 발현 벡터인 T502(서열번호 4)를 제조하였다.
2. 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체 (T502)의 발현
상기 실시예 1의 3과 동일한 방법으로 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO-K1)를 이용하여 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체(T502)의 발현을 확인하였다.
3. 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체 (T502)의 정제
상기 실시예 1의 4와 동일한 방법으로 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체(T502)를 정제하였다.
실시예 5 : 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체의 제조 [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF]
1. 알파-1 안티트립신 이중 변이체 2의 제조 (pDHT3NS 클로닝 벡터)
단백질 치료제 또는 펩티드 치료제의 융합체의 제조에 사용되는 알파-1 안티트립신의 고유한 활성을 감소시키면서 알파-1 안티트립신의 시스테인으로 인한 이중체 형성 등의 단백질 변성의 가능성을 제거하기 위하여, 알파-1 안티트립신 이중 변이체 2를 제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신 활성에 영향을 주는 P2 위치인 357번째 아미노산 프롤린을 아스파라진으로 변이시켜 활성을 감소시키고, N-당화를 유도한 pDHT3N 클로닝 벡터를 모체로 하여 2개의 프라이머 ALT52(서열번호 19) 및 ALT53(서열번호 20)과 변이체 생성키트(Stratagene, QuikChange II Cat No. 200523-5)를 사용하여 알파-1 안티트립신에 존재하는 232번째 아미노산 시스테인을 세린으로 변이시켜 pDHT3NS 클로닝 벡터를 제조하였다.
2. 발현 벡터 pSNATNS의 제조
과립구 자극인자를, 활성이 감소된 알파-1 안티트립신 이중 변이체 2의 C-말단에 융합시켜 발현하기 위하여, pSNATNS 벡터를 제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신 이중 변이체 2의 C-말단에 과립구 자극인자를 삽입하기 위해, 알파-1 안티트립신 이중 변이체 2를 코딩하는 벡터인 pDHT3NS를 두개의 프라이머인 ALT14(서열번호 14)와 ALT30(서열번호 9)을 이용하여 PCR로 증폭하고 pSNAT와 두개의 제한 효소인 BstEII와 BamHI을 이용하여 클로닝하였으며, 이를 pSNATNS로 명명하였다.
3. 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중 변이체 2 벡터의 제조 [T602S, α1AT(P357N, C232S)/G-CSF]
과립구 자극인자(G-CSF)를 엔코딩하는 IHS1380-97652343(Open biosystems) 벡터를 모체로 하고, 두개의 프라이머인 ALT56(서열번호 21)와 ALT57(서열번호 22)을 사용하여 PCR로 과립구 자극인자(G-CSF)를 증폭하였다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두개의 제한효소인 BamHI과 NotI으로 절단하여 BamHI/NotI 절단부를 가지고 있는 pSNATNS에 결합하여 발현 벡터인 T602S(서열번호 5)를 제조하였다.
4. 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 (T602S)의 발현
상기 실시예 1의 3과 동일한 방법으로 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO-K1)를 이용하여 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체(T602S)의 발현을 확인하였다.
5. 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 (T602S)의 정제
상기 실시예 1의 4와 동일한 방법으로 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체(T602S)를 정제하였다.
실시예 6 : 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체의 제조 [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]
1. 알파-1 안티트립신 삼중 변이체의 제조 (pDHT3NST 클로닝 벡터)
단백질 치료제 또는 펩티드 치료제의 융합체의 제조에 사용되는 알파-1 안티트립신 이중 변이체의 당화의 균질성을 위하여, 알파-1 안티트립신 삼중 변이체를 제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신 활성에 영향을 주는 P2 위치인 357번째 아미노산 프롤린을 아스파라진으로 변이시켜 활성을 감소시키고, N-당화를 유도하고 알파-1 안티트립신의 시스테인으로 인한 이중체 형성 등의 단백질 변성의 가능성을 제거하기 위하여 232번째 아미노산 시스테인을 세린으로 변이시킨 알파-1 안티트립신 이중 변이체 2 pDHT3NS 클로닝 벡터를 모체로 하여, 2개의 프라이머 ALT82(서열번호 15) 및 ALT83(서열번호 16)과 변이체 생성키트(엔지노믹스, EZchange Cat No. EM020)를 사용하여 359번째 아미노산 세린을 트레오닌으로 변이시켜 pDHT3NST 클로닝 벡터를 제조하였다.
2. 발현 벡터 pSNATNST의 제조
과립구 자극인자를, 활성이 감소된 알파-1 안티트립신 삼중 변이체의 C-말단에 융합시켜 발현하기 위하여, pSNATNST 벡터를 제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신 삼중 변이체의 C-말단에 과립구 자극인자를 삽입하기 위해, 알파-1 안티트립신 삼중 변이체를 코딩하는 벡터인 pDHT3NST를 두개의 프라이머인 ALT14(서열번호 14)와 ALT30(서열번호 9)을 이용하여 PCR로 증폭하고 pSNAT와 두개의 제한 효소인 BstEII와 BamHI을 이용하여 클로닝하였으며, 이를 pSNATNST로 명명하였다.
3. 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중 변이체 벡터의 제조 [T602ST, α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]
과립구 자극인자(G-CSF)를 엔코딩하는 IHS1380-97652343(Open biosystems) 벡터를 모체로 하고, 두개의 프라이머인 ALT56(서열번호 21)와 ALT57(서열번호 22)을 사용하여 PCR로 과립구 자극인자(G-CSF)를 증폭하였다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두개의 제한효소인 BamHI과 NotI으로 절단하여 BamHI/NotI 절단부를 가지고 있는 pSNATNST에 결합하여 발현 벡터인 T602ST (서열번호 6)를 제조하였다.
4. 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체 (T602ST)의 발현
상기 실시예 1의 3과 동일한 방법으로 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO-K1)를 이용하여 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체(T602ST)의 발현을 확인하였다.
5. 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체 (T602ST)의 정제
상기 실시예 1의 4와 동일한 방법으로 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체(T602ST)를 정제하였다.
실시예 7 : 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체의 제조 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]
1. 발현 벡터 pSCAT의 제조
엑센딘-4를 알파-1 안티트립신의 N-말단에 융합시켜 발현하기 위하여, pSCAT 벡터를 제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신의 N-말단에 엑센딘-4를 삽입하기 위해, 알파-1 안티트립신을 코딩하는 벡터인 hMU001448(KRIBB)를 두개의 프라이머인 ALT21(서열번호 8)과 ALT5(서열번호 23)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두개의 제한 효소인 XhoI과 NotI으로 절단하여 모벡터인 pSGHV0(GenBank Accession No. AF285183)에 결합하여 클로닝하였으며, 이를 pSCAT로 명명하였다.
2. 발현 벡터 pSCATN의 제조
엑센딘-4를, 활성이 감소된 알파-1 안티트립신 변이체의 N-말단에 융합시켜 발현하기 위하여, pSCATN 벡터를 제조하였다. 구체적으로는, 알파-1 안티트립신 변이체의 N-말단에 엑센딘-4를 삽입하기 위해, 활성이 감소된 알파-1 안티트립신 변이체를 코딩하는 벡터인 pDHT3N을 두개의 제한 효소인 EcoRV와 NotI을 이용하여 pSCAT와 클로닝하였으며, 이를 pSCATN으로 명명하였다.
3. 엑센딘-4의 제조
엑센딘-4를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위하여, DH15(sense codon, 서열번호 24)와 DH16(antisensecodon, 서열번호 25)을 이용하여 PCR로 증폭하였다.
4. 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이체 벡터의 제조 [T304, Exendin-4/α1AT(P357N)]
엑센딘-4를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 3에서 제조된 것을 주형으로 하여 두개의 프라이머인 ALT44(서열번호 26)와 ALT41(서열번호 27)을 사용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 증폭된 뉴클레오티드를 말단에 존재하는 두개의 제한효소인 XhoI과 BamHI으로 절단하여 XhoI/BamHI 절단부를 가지고 있는 pSCATN에 결합하여 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이체 벡터(T304, 서열번호 7)를 제조하였다.
5. 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체 (T304)의 발현
상기 실시예 1의 3과 동일한 방법으로 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO-K1)를 이용하여 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체(T304)의 발현을 확인하였다.
6. 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체 (T304)의 정제
상기 실시예 1의 4와 동일한 방법으로 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체(T304)를 정제하였다.
실험예 1 : 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체의 효소면역분석법
본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체의 분석을 위해 하기와 같은 효소면역분석법을 수행하였다.
1. 인간성장호르몬(hGH), 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체 [T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 효소면역분석법
인간성장호르몬에 대한 단클론항체(Medix Biochemica, 핀란드)를 인산염 완충용액에 1~5㎍/㎖의 농도로 희석하여 100㎕를 96웰 플레이트(Nunc, 덴마크)에 분주한 후 상온에서 15~18시간 동안 방치하였다. 웰 플레이트에 부착되지 않고 남아있는 항체를 제거한 후 1% 소혈청알부민이 용해된 인산염완충용액 250㎕를 분주하여 상온에서 2시간 방치시키고 세척용액(0.05% 트윈 20, 인산염완충용액)으로 3회 세척한 후 용액을 제거하였다. 시료는 1% 소혈청알부민이 용해된 인산염완충용액으로 희석하였으며, 96웰 플레이트에 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 96웰 플레이트를 세척용액으로 5회 세척한 후 sulfo-NHS-biotin(Pierce biotechnology, 미국)을 이용하여 접합시킨 인간성장호르몬 단클론항체-biotin 접합체를 희석용액에 희석하여 96웰 플레이트에 100㎕씩 분주하였다. 이어서 플레이트를 상온에서 2시간 반응시킨 다음 세척용액으로 5회 세척한 후 스트렙타비딘-HRP 용액을 가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 세척용액으로 5회 세척하고 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)와 과산화수소수 발색용액 100㎕를 각 웰에 첨가한 후 암소에서 30분간 반응시켰다. 1M 황산 100㎕를 각 웰에 첨가하여 반응을 종료시키고, VersaMax microplate reader(Molecular Device, 미국)로 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 정량값은 표준물질에 대한 표준곡선을 작성한 후 회귀분석을 통해 구하였다.
2. 인간 인터페론 알파(IFN-α), 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체[T502: α1AT(P357N)/IFN-α]의 효소면역분석법
인간 인터페론 알파(IFN-α) 및 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체의 효소면역분석법은 Bender Medsystems(오스트리아) 사의 Human IFN-α Matched Antibody Pairs for ELISA의 항체를 사용하였다. 10㎍/㎖의 IFN-α 항체를 상기 1의 방법에 따라 코팅 및 차단(blocking)하고, 시료는 희석 후 상온에서 2시간 동안 쉐이킹(shaking)하여 반응시켰으며, Anti-IFN-α-HRP 접합체는 50㎕를 사용하여 상온에서 2시간 동안 쉐이킹하여 반응시켰다. 이후 과정은 상기 1의 방법에 따라 수행하였다.
3. 과립구 자극인자(G-CSF), 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 효소면역분석법
상기 1에서 인간성장호르몬 항체 대신 과립구 자극인자(G-CSF)에 대한 단클론항체(RND systems, 미국)를 인산염완충용액에 1~5㎍/㎖의 농도로 희석하여 사용하고, 인간성장호르몬 단클론항체-biotin 접합체 대신 과립구 자극인자 다클론항체-biotin 접합체(RND systems, 미국)를 사용한 것을 제외하고는 상기 1의 방법에 따라 수행하였다.
4. 엑센딘-4, 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]의 효소면역분석법
엑센딘-4의 경우, 상기 1에서 인간성장호르몬 대신 엑센딘-4에 대한 다클론항체(펩트론, 한국)를 인산염완충용액에 5~10㎍/㎖의 농도로 희석하여 사용하고, 인간성장호르몬 단클론항체-biotin 접합체 대신 엑센딘-4 단클론항체-biotin 접합체를 사용한 것을 제외하고는 상기 1과 동일한 과정을 수행하였다.
엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체(T304)의 경우, 상기 실시예 7에서 제조한 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체(T304)를 Freund adjuvant(Sigma, 미국)와 섞어서 랫트에 주사하여 항혈청을 생성시켰으며, Protein G-Sepharose(GE Healthcare, 미국)를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 항체를 인산염완충용액에 10~20㎕/㎖의 농도로 희석하여 96웰 플레이트에 코팅하였고, sulfo-NHS-biotin (Pierce biotechnology, 미국)을 이용하여 접합시킨 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체(T304) 다클론 항체-biotin 접합체를 사용하여 상기 1의 방법에 따라 수행하였으며, 시료 반응과 접합체 반응은 플레이트를 쉐이킹하여 수행하였다.
실험예 2 : 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체의 약물동태 실험
본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체의 약물동태를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 인간성장호르몬(hGH), 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체 [T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 약물동태
실험동물로 Sprague-Dawley 랫트를 사용하였으며, 인간성장호르몬 투여군에는 3마리를 할당하였고, 나머지 융합체 투여군에는 각각 5마리씩 할당하였다. 각 군의 Sprague-Dawley 랫트에 상기 실시예 1~3에서 제조한 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 [T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]를 각각 랫트 ㎏당 720㎍의 투여량으로 피하 주사하였고, 희석액은 인산염완충용액을 사용하였으며, 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 30, 48시간 후 채혈하여 원심분리 후 혈청을 얻었다. 대조군으로는 인간성장호르몬인 Scitropin(SciGen, 싱가포르)을 랫트 ㎏당 200㎍의 투여량으로 피하 주사하였고, 희석액은 인산염완충용액을 사용하였으며, 0, 0.33, 1, 2, 5, 8, 12, 18, 24, 30, 48시간 후 채혈하여 원심분리 후 혈청을 얻었다. 각 시료에 대해서는 상기 실험예 1의 효소면역분석 방법을 이용하여 분석하였다.
본 발명에 따른 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 약물동태 그래프는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH]의 혈중반감기(t 1/2 )는 5.3시간이고 혈중최고농도 도달시간 (Tmax)은 8시간이었으며, 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]의 혈중반감기(t 1/2 )는 5.4시간이고 혈중최고농도 도달시간(Tmax)은 12시간이었으며, 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 혈중반감기(t 1/2 )는 4.9시간이고 혈중최고농도 도달시간 (Tmax)은 12.8시간이었다. 반면, 인간성장호르몬(hGH)의 혈중반감기(t 1/2 )는 0.8시간이고 혈중최고농도 도달시간(Tmax)은 1시간이었다. 따라서, 본 발명에 따른 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 및 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]는 인간성장호르몬에 비해 현저히 증가된 체내 안정성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
2. 인간 인터페론 알파(IFN-α), 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체[T502: α1AT(P357N)/IFN-α]의 약물동태
실험동물로 Sprague-Dawley 랫트를 사용하였으며, 각 군당 5마리씩 할당하였다. 하나의 실험군의 Sprague-Dawley 랫트에 상기 실시예 4에서 제조한 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체[T502: α1AT(P357N)/IFN-α]를 랫트 ㎏당 200㎍의 투여량으로 피하 주사하였고, 0, 0.33, 1, 2, 5, 8, 12, 18, 24, 30, 48, 72, 96시간 후 채혈하여 원심분리 후 혈청을 얻었다. 대조군으로는 인간 인터페론 알파(IFN-α, 인터맥스 알파, LG 생명과학)를 사용하여 랫트 ㎏당 60㎍의 투여량으로 피하 주사하였고, 0, 0.33, 1, 2, 5, 8, 12, 18, 24시간 후 채혈하여 원심분리 후 혈청을 얻었다. 각 시료에 대해서는 상기 실험예 1의 효소면역분석 방법을 이용하여 분석하였다.
본 발명에 따른 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체[T502: α1AT(P357N)/IFN-α]의 약물동태 그래프는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체[T502: α1AT(P357N)/IFN-α]의 혈중반감기(t 1/2 )는 18.5시간이고 혈중최고농도 도달시간(Tmax)은 12시간이었으며, 인간 인터페론 알파의 혈중반감기(t 1/2 )는 3.4시간이고 혈중최고농도 도달시간(Tmax)은 1.4시간이었다. 따라서, 본 발명에 따른 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체[T502: α1AT(P357N)/IFN-α]는 인간 인터페론 알파에 비해 현저히 증가된 체내 안정성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
3. 과립구 자극인자(G-CSF), 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 약물동태
실험동물로 Sprague-Dawley 랫트를 사용하였으며, 과립구 자극인자 투여군에는 3마리를 할당하였고, 나머지 융합체 투여군에는 각각 5마리씩 할당하였다. 각 군의 Sprague-Dawley 랫트에 상기 실시예 5~6에서 제조한 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]를 각각 랫트 ㎏당 340㎍의 투여량으로 피하 주사하였고, 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 30, 48시간 후 채혈하여 원심분리 후 혈청을 얻었다. 대조군으로는 과립구 자극인자인 Filgrastim(Gracin, 제일약품㈜)을 사용하여 랫트 ㎏당 100㎍의 투여량으로 피하 주사하였고, 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 30, 48시간 후 채혈하여 원심분리 후 혈청을 얻었다. 각 시료에 대해서는 상기 실험예 1의 효소면역분석 방법을 이용하여 분석하였다.
본 발명에 따른 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체 [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 약물동태 그래프는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF]의 혈중반감기(t 1/2 )는 5.1시간이고 혈중최고농도 도달시간(Tmax)은 13.6시간이었으며, 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 혈중반감기 (t 1/2 )는 4.5시간이고 혈중최고농도 도달시간(Tmax)은 16시간이었다. 반면, 과립구 자극인자의 혈중반감기(t 1/2 )는 1.8시간이고 혈중최고농도 도달시간(Tmax)은 1.8시간이었다. 따라서, 본 발명에 따른 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 및 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]는 과립구 자극인자에 비해 현저히 증가된 체내 안정성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
4. 엑센딘-4, 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]의 약물동태
실험동물로 Sprague-Dawley 랫트를 사용하였으며, 각 군당 5마리씩 할당하였다. 하나의 실험군의 Sprague-Dawley 랫트에 상기 실시예 7에서 제조한 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]를 랫트 ㎏당 520㎍의 투여량으로 피하 주사하였고, 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 30, 48, 72시간 후 채혈하여 원심분리 후 혈청을 얻었다. 대조군으로는 엑센딘-4를 사용하여 랫트 ㎏당 40㎍의 투여량으로 피하 주사하였고, 0, 10, 20, 30, 40, 60, 120, 180, 240, 300, 360분 후 헤파린이 처리된 튜브에 채혈하여 원심분리 후 혈청을 얻었다. 각 시료에 대해서는 상기 실험예 1의 효소면역분석 방법을 이용하여 분석하였다.
본 발명에 따른 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]의 약물동태 그래프는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]의 혈중반감기(t 1/2 )는 19.1시간이고 혈중최고농도 도달시간(Tmax)은 10.4시간인 반면, 엑센딘-4의 혈중반감기(t 1/2 )는 0.8시간이고 혈중최고농도 도달시간(Tmax)은 0.4시간이었다. 따라서, 본 발명에 따른 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]는 엑센딘-4에 비해 현저히 증가된 체내 안정성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3 : 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체의 생체 내 활성 실험
본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체의 생체 내 활성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 인간성장호르몬(hGH), 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]의 생체 내 활성
실험동물로 뇌하수체가 제거된 Sprague-Dawley 랫트를 사용하였으며, 실험군을 3개군으로 나누어 각 군당 7마리씩 할당하였다. 각 군의 뇌하수체가 제거된 Sprague-Dawley 랫트에 상기 실시예 2에서 제조한 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]를 랫트 당 18㎍, 인간성장호르몬 (Eutropin, LG 생명과학)을 랫트 당 5㎍, 대조군으로 인산염완충용액을 사용하여 매일 피하 주사하였고, 주사 후 랫트의 무게를 매일 측정하였다.
본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]의 생체 내 활성(뇌하수체가 제거된 랫트의 무게 증가) 분석 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 인산염완충용액을 주사한 뇌하수체가 제거된 랫트의 경우 체중 증가가 거의 일어나지 않았으나, 인간성장호르몬과 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]를 주사한 뇌하수체가 제거된 랫트의 경우 7일째에 각각 약 10.2%와 9.4%의 체중 증가를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]는 인간성장호르몬과 마찬가지로 뇌하수체가 제거된 랫트에서 효과적으로 생체 내 활성을 나타냄을 알 수 있다.
2. 과립구 자극인자(G-CSF), 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 생체 내 활성
실험동물로 Sprague-Dawley 랫트를 사용하였으며, 실험군을 5개군으로 나누어 각 군당 5마리씩 할당하였다. 각 군의 Sprague-Dawley 랫트에 상기 실시예 5에서 제조한 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF]를 랫트 ㎏당 340㎍과 1,700㎍, 상기 실시예 6에서 제조한 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]를 랫트 ㎏당 1,700㎍, 및 과립구 자극인자인 Filgrastim (Gracin, 제일약품㈜)을 랫트 ㎏당 100㎍의 투여량으로 피하 주사하였고, 실험 3일전, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일째에 미정맥 채혈하여 Hematology Analyzer(Pentra 120)를 이용하여 백혈구 수를 측정하였다.
본 발명의 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체 [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 생체 내 활성(백혈구 수 증가) 분석 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 과립구 자극인자인 Filgrastim의 투여군에서는 백혈구 수의 증가가 주사 후 1일차에 최고치에 도달한 다음 2일차부터는 기저 상태에 그쳤으나, 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF]의 랫트 ㎏당 340㎍ 투여군에서는 백혈구 수의 증가가 주사 후 2일차에 최고치에 도달한 다음 3일차부터 감소하였고, 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] 및 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체 [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]를 각각 랫트 ㎏당 1,700㎍ 투여군에서는 백혈구 수의 증가가 주사 후 3일차까지 유지되다가 4일차부터 감소되었다. 따라서, 본 발명의 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] 및 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]는 과립구 자극인자에 비해 생체 내 활성을 더 오래도록 유지한다는 것을 확인할 수 있었다.
3. 엑센딘-4, 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]의 생체 내 활성
본 발명에 따른 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]의 생체 내 활성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 복강내 당부하 검사 및 당뇨모델 마우스에서의 혈당 감소 실험을 수행하였다.
3-1. 복강내 당부하 검사
8주령의 C57BL/6 마우스에 4주간 고지방 사료를 먹여서 비만을 유도하였으며, 실험 개시 15시간 전에 절식시킨 상태에서 복강내 당부하검사를 실시하였다. 구체적으로는, 상기 실시예 7에서 제조한 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]와 엑센딘-4를 각각 10nmol/㎏의 투여량으로 마우스의 복강 내에 단회투여하였다. 시험물질 투여 후 각각 30분, 12시간, 24시간이 경과 한 다음 포도당을 1.5g/5㎖/㎏ 복강투여하였고, 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120분에 혈당계(올메디쿠스, 대한민국)를 이용하여 혈당을 측정하였다.
본 발명의 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]의 복강내 당부하 검사 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]의 투여군은 엑센딘-4의 투여군보다 혈당 감소효과가 오래 지속되어 혈당 감소효과가 우수함을 확인하였다.
3-2. 당뇨모델 마우스에서의 혈당 감소 실험
실험동물로 9주령의 db/db 마우스를 사용하였으며, 실험군을 3개군으로 나누어 각 군당 6마리씩 할당하였다. 9주령의 db/db 마우스에 사료 제한을 가하지 않은 상태에서 상기 실시예 7에서 제조한 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체 [T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]와 엑센딘-4를 각각 100nmol/㎏의 투여량으로 각 실험군의 마우스에 피하주사하였고, 시험물질 투여 후 0, 1, 3, 6, 24, 43, 48, 52시간 경과 후 혈당계(올메디쿠스, 대한민국)를 이용하여 혈당을 측정하였다.
본 발명의 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)]가 당뇨모델 마우스에서 혈당 감소에 미치는 영향을 나타낸 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 엑센딘-4 투여군은 24시간 이후 혈당이 대조군과 유사하게 나타났으나, 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)] 투여군은 24시간 후에도 혈당이 낮게 유지되어 혈당 감소 효과가 오랜 시간 동안 지속되었다.
실험예 4 : 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체의 세포 내 활성 실험
본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체의 세포 내 활성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 인간성장호르몬(hGH), 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체 [T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 세포 내 활성
마우스 림프종 세포(NB2 cell)는 RPMI1640에 10% HS(Horse serum), 10% FBS, 2-머캅토에탄올과 항생제를 포함한 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건으로 배양하였다. 실험에 사용하는 NB2 세포를 사용하기 24시간 전에 RPMI1640에 10% HS가 들어있는 배지에 넣어 배양하였다. 배양 24시간 후 NB2 세포를 1×DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 한번 세척하였다. 그 다음 5% HS 조성의 RPMI 1640 배지에 세포수가 2×104/100㎕/well 상태가 되도록 준비하여 96웰 플레이트 (Corning, 미국)에 각각 100㎕씩 분주하고, 농도별로 희석한 시료를 웰에 20㎕씩 접종시켜, 5% CO2, 37℃ 조건으로 48시간 동안 배양시켰다. 이어서 MTS 용액 (Promega, 미국)을 96웰 플레이트에 웰당 20㎕씩 넣어주고 5% CO2, 37℃ 배양기에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 10% SDS(sodium dodecyl sulfate)를 20㎕씩 가하여 반응을 종료하였다. 흡광도는 VersaMax microplate reader(Molecular Device, 미국)를 이용하여 490㎚에서 측정하였고, MTS 검색법으로 얻어진 흡광도 값으로 50%의 세포가 살아남도록 한 약물의 농도를 EC50(50% effective concentration)로 결정하였다.
본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 세포내 활성 분석 결과는 표 1 및 도 9에 나타내었다.
시료 EC50(pM)
T109wt 211.8
T109 181.1
T109T 217.1
표 1 및 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체 [T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체 [T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 EC50 값은 큰 차이없이 서로 유사하게 나타났다. 따라서, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 세포 내 활성(EC50)은 알파-1 안티트립신의 아미노산 변이에 상관없이 서로 유사하다는 것을 확인할 수 있었다.
2. 과립구 자극인자(G-CSF), 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 세포 내 활성
쥐 골수아세포(Murine myeloblastic NFS-60 세포)는 RPMI 1640에 10% FBS, mouse IL-3과 항생제를 포함한 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건으로 배양하였다. 그 다음, 쥐 골수아세포를 사용하여 상기 1의 방법과 동일하게 수행하여 흡광도를 490nm에서 측정하였고, MTS 검색법으로 얻어진 흡광도 값으로 50%의 세포를 살아남도록 한 약물의 농도를 EC50(50% effective concentration)로 결정하였다.
본 발명의 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 세포내 활성 분석 결과는 표 2 및 도 10에 나타내었다.
시료 EC50(pM)
T602S 78.1
T602ST 97.6
표 2 및 도 10에 나타난 바와 같이, 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] 및 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 EC50 값은 큰 차이없이 서로 유사하게 나타났다. 따라서, 본 발명의 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]의 세포 내 활성(EC50)은 알파-1 안티트립신의 아미노산 변이에 상관없이 서로 유사하다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5 : 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체의 트립신 활성 억제 비교 실험
본 발명에 따른 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]의 트립신 활성 억제 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체 [T109wt: α1AT/hGH]와 상기 실시예 2에서 제조한 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]를 각각 트립신과 섞어주었다. 이때 트립신과 융합체의 농도는 10nM이었고, 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 기질인 N-Benzoyl-Val-Gly-Arg p-nitroanilide hydrochloride(Sigma, 미국)를 0.2mM이 되도록 가하여 405㎚에서 흡광도 변화를 측정하였다. 트립신의 효소 unit은 1분당 흡광도 0.001을 변화시키는 기질 농도로 설정하였고, 효소 활성은 units/㎎ 트립신으로 계산하였다. 대조군으로는 트립신을 사용하였다.
결과는 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 트립신과 알파-1 안티트립신의 Ka(association constant) 값을 계산한 결과, 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH]의 Ka 값은 약 7.5×108 M-1이었고, 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]의 Ka 값은 약 8.0×106 M-1 이었다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH]는 트립신 억제 활성이 우수하게 나타나고, 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]는 트립신 억제 활성이 낮게 나타남으로써, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH] 및 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]가 체내에서 활성을 지속적으로 유지함으로 체내 반감기가 증가하는 것이 알파-1 안티트립신의 고유 성질에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.
실험예 6 : 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체의 인간 호중구 엘라스타제 활성 억제 비교 실험
본 발명에 따른 천연형 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH]와 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]의 인간 호중구 엘라스타제 활성 억제 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체 [T109wt: α1AT/hGH]와 상기 실시예 2에서 제조한 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]를 각각 인간 호중구 엘라스타제와 섞어주었다. 이때 엘라스타제와 융합체의 농도는 40nM이었고, 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 기질인 MeOSuc-AAPV-pNA(Santa Cruz Biotechnology, Inc., 미국)를 1mM이 되도록 가하여 405㎚에서 흡광도 변화를 측정하였다. 인간 호중구 엘라스타제의 효소 unit은 1분당 흡광도 0.001을 변화시키는 기질 농도로 설정하였고, 효소 활성은 units/㎎ 엘라스타제로 계산하였다.
결과는 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH]는 인간 호중구 엘라스타제를 거의 100% 억제시켰고, 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]의 Ka 값은 약 1.4×107 M-1이었다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH]는 인간 호중구 엘라스타제에 대한 억제 활성이 우수하게 나타나고, 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]는 인간 호중구 엘라스타제에 대한 억제 활성이 낮게 나타남으로써, 본 발명의 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH] 및 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]가 체내에서 활성을 지속적으로 유지함으로 체내 반감기가 증가하는 것이 알파-1 안티트립신의 고유 성질에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.
실험예 7 : 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체의 전기영동 실험
본 발명에 따른 천연형 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH], 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 당화 부위 추가에 따른 분자량 변화를 알아보기 위하여, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 실험을 수행하였다.
결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 당화 부위 추가가 없는 천연형 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH]에 비해 당화 부위(Asn-X-Ser)가 추가된 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]는 단백질 염색 띠가 분자량이 높은 쪽으로 더 퍼져서 나타났으며, 추가 당화 부위가 Asn-X-Thr의 아미노산 서열을 갖는 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]의 경우 분자량 증가를 더욱 명확하게 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH]와 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH]에서 당화 부위 추가에 따른 분자량 변화를 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체는, 체내 지속성을 유지함으로 혈중반감기(T1/2)가 고유의 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드보다 현저히 증가하여 체내 안정성이 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 융합체는 단백질 또는 펩티드 약물의 지속성 제제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Alteogen, Inc <120> Fusion protein or fusion peptide having enhanced half life in blood, and method for enhancing half life in blood <130> P10-08083 <150> KR10-2009-0035190 <151> 2009-04-22 <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 590 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T109wt(alpha-1AT/hGH) <400> 1 Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His 1 5 10 15 Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu 20 25 30 Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr 35 40 45 Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe 85 90 95 Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu 100 105 110 Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp 115 120 125 Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr 130 135 140 Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr 145 150 155 160 Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu 165 170 175 Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe 195 200 205 His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu 210 215 220 Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu 225 230 235 240 Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp 245 250 255 Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile 260 265 270 Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu 275 280 285 Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly 290 295 300 Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly 305 310 315 320 Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala 325 330 335 Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe 340 345 350 Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys 355 360 365 Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe 370 375 380 Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Gly Gly Gly Gly Ser Phe 385 390 395 400 Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala 405 410 415 His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu 420 425 430 Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln 435 440 445 Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu 450 455 460 Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu 465 470 475 480 Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe 485 490 495 Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu 500 505 510 Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu 515 520 525 Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys 530 535 540 Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly 545 550 555 560 Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu 565 570 575 Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 580 585 590 <210> 2 <211> 590 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T109 [alpha-1AT(P357N)/hGH] <400> 2 Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His 1 5 10 15 Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu 20 25 30 Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr 35 40 45 Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe 85 90 95 Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu 100 105 110 Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp 115 120 125 Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr 130 135 140 Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr 145 150 155 160 Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu 165 170 175 Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe 195 200 205 His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu 210 215 220 Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu 225 230 235 240 Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp 245 250 255 Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile 260 265 270 Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu 275 280 285 Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly 290 295 300 Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly 305 310 315 320 Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala 325 330 335 Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe 340 345 350 Leu Glu Ala Ile Asn Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys 355 360 365 Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe 370 375 380 Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Gly Gly Gly Gly Ser Phe 385 390 395 400 Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala 405 410 415 His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu 420 425 430 Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln 435 440 445 Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu 450 455 460 Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu 465 470 475 480 Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe 485 490 495 Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu 500 505 510 Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu 515 520 525 Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys 530 535 540 Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly 545 550 555 560 Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu 565 570 575 Arg Ile Val Gln 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Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe 195 200 205 His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu 210 215 220 Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu 225 230 235 240 Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp 245 250 255 Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile 260 265 270 Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu 275 280 285 Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly 290 295 300 Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly 305 310 315 320 Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala 325 330 335 Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe 340 345 350 Leu Glu Ala Ile Asn Met Thr Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys 355 360 365 Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe 370 375 380 Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Gly Gly Gly Gly Ser Phe 385 390 395 400 Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala 405 410 415 His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu 420 425 430 Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln 435 440 445 Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu 450 455 460 Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu 465 470 475 480 Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe 485 490 495 Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu 500 505 510 Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu 515 520 525 Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys 530 535 540 Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly 545 550 555 560 Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu 565 570 575 Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 580 585 590 <210> 4 <211> 564 <212> 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Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu 405 410 415 Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg 420 425 430 His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys 435 440 445 Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn 450 455 460 Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu 465 470 475 480 Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala 485 490 495 Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu 500 505 510 Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr 515 520 525 Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala 530 535 540 Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu 545 550 555 560 Arg Ser Lys Glu <210> 5 <211> 573 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T602S [alpha-1AT(P357N, C232S)/G-CSF] <400> 5 Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His 1 5 10 15 Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile 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Ala Phe Ala Met Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe 85 90 95 Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu 100 105 110 Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp 115 120 125 Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr 130 135 140 Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr 145 150 155 160 Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu 165 170 175 Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe 195 200 205 His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu 210 215 220 Gly Met Phe Asn Ile Gln His Ser Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu 225 230 235 240 Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp 245 250 255 Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile 260 265 270 Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu 275 280 285 Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly 290 295 300 Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly 305 310 315 320 Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala 325 330 335 Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe 340 345 350 Leu Glu Ala Ile Asn Met Thr Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys 355 360 365 Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe 370 375 380 Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Gly Gly Gly Gly Ser Thr 385 390 395 400 Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys 405 410 415 Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu 420 425 430 Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu 435 440 445 Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro 450 455 460 Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly 465 470 475 480 Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro 485 490 495 Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe 500 505 510 Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala 515 520 525 Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln 530 535 540 Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu 545 550 555 560 Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 565 570 <210> 7 <211> 433 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T304 [Exendin-4/alpha-1AT(P357N)] <400> 7 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln 35 40 45 Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys 50 55 60 Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu 65 70 75 80 Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile 85 90 95 Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His 100 105 110 Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu 115 120 125 Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu His Thr Leu Asn Gln 130 135 140 Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser 145 150 155 160 Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu 165 170 175 Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala 180 185 190 Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile 195 200 205 Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val 210 215 220 Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys 225 230 235 240 Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys 245 250 255 Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys 260 265 270 Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr 275 280 285 Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn 290 295 300 Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg 305 310 315 320 Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr 325 330 335 Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser 340 345 350 Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu 355 360 365 Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr 370 375 380 Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Asn Met Ser Ile Pro 385 390 395 400 Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln 405 410 415 Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln 420 425 430 Lys <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (ALT21) <400> 8 ccctcctcga gaatgccgtc ttctgtctcg 30 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (ALT30) <400> 9 gggcccggat cctcctcctc ctttttgggt gggatt 36 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (DH22) <400> 10 ggatccttcc caaccattcc 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18 gcgggcggcc gctcattcct tacttcttaa 30 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (ALT52) <400> 19 gcatgtttaa catccagcac tctaagaagc tgtccagc 38 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (ALT53) <400> 20 gctggacagc ttcttagagt gctggatgtt aaacatgc 38 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (ALT56) <400> 21 gggcccggat ccacccccct gggccctgcc 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (ALT57) <400> 22 gcgggcggcc gctcagggct gggcaaggtg 30 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (ALT5) <400> 23 gggcccgcgg ccgcagttat ttttgggtgg g 31 <210> 24 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (DH15) <400> 24 ggatccgacg atgacgataa gcatggcgaa ggaacattca ccagcgactt gtcaaaacag 60 atggaagagg aggcagtgcg gttatttatt gagtggctta agaacggcgg accaagtagc 120 ggggcacctc cgccatctgc tagca 145 <210> 25 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (DH16) <400> 25 gctagcagat ggcggaggtg ccccgctact tggtccgccg ttcttaagcc actcaataaa 60 taaccgcact gcctcctctt ccatctgttt tgacaagtcg ctggtgaatg ttccttcgcc 120 atgcttatcg tcatcgtcgg atcca 145 <210> 26 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (ALT44) <400> 26 gggcccctcg agatggctac aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc 60 tgcctgccct ggcttcaaga gggcagtgcc catggcgaag gaacattc 108 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (ALT41) <400> 27 ggggggatcc tcagatggcg gaggtgcccc 30

Claims (21)

  1. 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드를 알파-1 안티트립신과 결합시켜, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 융합체는 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드가 직접 또는 아미노산으로 구성된 링커를 이용하여 알파-1 안티트립신에 결합된 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 생리활성 단백질은 호르몬류 및 이의 수용체, 생물학적반응 조절물질(biological response modifier) 및 이의 수용체, 사이토카인류 및 이의 수용체, 효소류, 항체류 및 항체 단편류로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 생리활성 단백질은 인간성장호르몬(hGH), 인슐린, 난포자극호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 인간 융모성 성선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin), 부갑상선호르몬(parathyroid hormone, PTH), 적혈구 촉진인자(EPO), 혈소판생성 촉진인자(TPO), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨, 대식세포(marophage) 활성화 인자, 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 조직플라스미노겐 활성체(tissue plasminogen activator), 혈액응고인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, hBMP2(human bone morphogenic protein 2), KGF (keratinocyte growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 알파-갈락토시다제 A(α-galactosidase A), 알파 이두로니다제(α-L-iduronidase), 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 락타제(lactase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파제 (lipase), 유리카제(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 유로키나제, 스트렙토키나제, 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 수퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase), 보톨리늄 독소, 콜라게나제, 히알루로니다제 (hyaluronidase), L-아스파라기나제(L-asparaginase), 단일클론항체, 다클론항체, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 생리활성 펩티드는 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1) 및 이의 유사체, 엑센딘 및 이의 유사체, 소마토스타틴(somatostatin) 및 이의 유사체, LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone) 작용제 및 길항제, 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신 (oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자 (corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘 (bivalirudin), 바소프레신 유사체(vasopressin analogues), 및 생리활성 단백질의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 융합체는 서열번호 1로 표시되는 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체[T109wt: α1AT/hGH]인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  7. 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드를, 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체와 결합시켜, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 융합체는 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드가 직접 또는 아미노산으로 구성된 링커를 이용하여 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체에 결합된 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 생리활성 단백질은 호르몬류 및 이의 수용체, 생물학적반응 조절물질 및 이의 수용체, 사이토카인류 및 이의 수용체, 효소류, 항체류 및 항체 단편류로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 생리활성 단백질은 인간성장호르몬(hGH), 인슐린, 난포자극호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 인간 융모성 성선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin), 부갑상선호르몬(parathyroid hormone, PTH), 적혈구 촉진인자(EPO), 혈소판생성 촉진인자(TPO), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨, 대식세포(marophage) 활성화 인자, 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 조직플라스미노겐 활성체(tissue plasminogen activator), 혈액응고인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, hBMP2(human bone morphogenic protein 2), KGF (keratinocyte growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 알파-갈락토시다제 A(α-galactosidase A), 알파 이두로니다제(α-L-iduronidase), 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 락타제(lactase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파제 (lipase), 유리카제(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 유로키나제, 스트렙토키나제, 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 수퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase), 보톨리늄 독소, 콜라게나제, 히알루로니다제 (hyaluronidase), L-아스파라기나제(L-asparaginase), 단일클론항체, 다클론항체, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 생리활성 펩티드는 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1) 및 이의 유사체, 엑센딘 및 이의 유사체, 소마토스타틴(somatostatin) 및 이의 유사체, LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone) 작용제 및 길항제, 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신 (oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자 (corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘 (bivalirudin), 바소프레신 유사체(vasopressin analogues), 및 생리활성 단백질의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  12. 제 7항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이된 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  13. 제 7항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이된 것을 포함하고, 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 것을 포함하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산의 변이는 359번째 아미노산인 세린이 트레오닌으로 변이되거나 또는 232번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 변이된 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산의 변이는 359번째 아미노산인 세린이 트레오닌으로 변이되고 232번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 변이된 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  16. 제 7항에 있어서, 상기 융합체는 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체[T109: α1AT(P357N)/hGH](서열번호 2), 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T109T: α1AT(P357N, S359T)/hGH](서열번호 3), 인간 인터페론 알파/알파-1 안티트립신 변이융합체[T502: α1AT(P357N)/IFN-α](서열번호 4), 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 이중변이융합체[T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] (서열번호 5), 과립구 자극인자/알파-1 안티트립신 삼중변이융합체[T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF](서열번호 6), 및 엑센딘-4/알파-1 안티트립신 변이융합체[T304: Exendin-4/α1AT(P357N)](서열번호 7)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩티드 융합체.
  17. 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드를, 알파-1 안티트립신 또는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 알파-1 안티트립신 변이체와 결합시켜, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기를 증가시키는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이된 것을 특징으로 하는, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기를 증가시키는 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이된 것을 포함하고, 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 것을 포함하는, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기를 증가시키는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산의 변이는 359번째 아미노산인 세린이 트레오닌으로 변이되거나 또는 232번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 변이된 것을 특징으로 하는, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기를 증가시키는 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 상기 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산의 변이는 359번째 아미노산인 세린이 트레오닌으로 변이되고 232번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 변이된 것을 특징으로 하는, 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기를 증가시키는 방법.
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