KR20100111305A - 황화제 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 A:

의 황화제 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 혼합물의 황화에 사용되는 용도에 관한 것으로, 상기 식에서 모든 R기는 각각 독립적으로 H 또는 유기 기를 나타낸다. 상기 황화제는 바람직하게 포름아미딘 디설피드이다. 이는 쉽게 이용가능하며, 저렴한 출발물질로부터 합성하는 것이 용이하기 때문에, 기존의 황화제에 대해 특히 적절한 대체물인 것으로 발견되었다.

Description

황화제 및 이의 용도{SULFURIZATION AGENT AND ITS USE}

본 발명은 황화제로서 사용하는 화합물에 관한 것으로, 즉, 이중결합된 황원자를 화합물내로 편입시킴으로써 화합물을, 특히 인-함유 화합물을 산화시키는 화합물에 관한 것이다. 이러한 황화제는 예를 들어, 인터뉴클레오타이드 결합을 안정화시키고 내연제를 생성하는데 특히 유용하다.

올리고뉴클레오타이드 및 이의 합성 유도체는 연구 도구 및 약제 모두로서 중요한 가치를 갖는다. 이의 효과는 엑손-스키핑 중재 치료, 및 siRNAs(small interfering RNAs) 도구와 치료를 위한 생물학적 관련 시작 코돈 타겟의 안티센스 차단을 통해, RNase H를 구성하는 것에서부터 표적 mRNA를 분해하는 것에 이르기까지 다재다능하다.

예를 들어, DNA 및 RNA에서 일반적인 포스페이트 결합은 가수분해되므로, 핵산의 안정성은 이러한 도구 및 약제의 효과에 중요한 인자이다. 원치않는 프로세스를 회피하기 위해, 천연 핵산의 보다 안정한 유사체가 합성되었으며, 이는 PNA, ENA/BNA, LNA 및 PMO를 포함한다. 게다가, 안정화는 RNA에서 2'-OH 기의 알킬화에 의해 획득될 수 있으며, 이는 일련의 유도체, 특히 2'-O 메틸화 및 알킬화 유도체를 형성한다. 부가적인 안정화 인자는 포스페이트(P=O) 인터뉴클레오타이드 결합을 포스포로티오에이트(P=S)로 치환시킴으로써 도입될 수 있다.

펩타이드의 인 유도체는 화학 및 생물학적 연구에서 점점 중요성이 증가하고 있다. 인산화 단백질은 이에 의해 세린, 트레오닌 또는 티로신의 측쇄 히드록실기와 함께 포스페이트 모노에스테르가 형성되도록 하며, 단백질 키나아제 및 포스파타아제에 의한 단백질 조절 및 신호 전달에 중요한 중간물로서 확인되었다. 인산화 펩타이드(phosphopeptides, Curr. Org. Chem. 2007, 11, 409)는 질병에서 인산화의 작용 및 역할의 메카니즘을 이해하는데 사용되고 있다.

본 발명에서 예상되는 이러한 인-함유부의 황화(P=S 함유) 유사체는 이러한 분야의 발달에 중요할 것이다.

P=S 결합의 도입은 새로운 뉴클레오타이드의 커플링에 의해 형성되는 중간 3가 인 원자를 5가 원자로 산화시키는 황화제의 적용에 의해 달성될 수 있다.

천연 황, S₈은 단지 3가 인과 느리게 반응하기 때문에, 지난 수십년간 다수의 황화제가 제조되고 시험되었다. 이러한 것중 하나는 일반적인 뷰케이지 리전트(Beaucage reagent)(J. Org. Chem. 1990, 55, 4693)이다. 뷰케이지 리전트외에도, 다른 제제들이 이들의 실험실에서, 특히 올리고뉴클레오타이드 합성 분야에서 발견되었다. 특히, 페닐아세틸 디설피드(PADS, Nucleos, Nucleot. 1999, 18, 485), 테트라에틸티우람 디설피드(TETD, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 3005), 비스(O,O-디이소프로폭시포스피노티오일) 디설피드(S-tetra, Tetrahedron Lett. 1993, 33, 5317) 및 3-에톡시-1,2,4-디티아졸린-5-온(EDITH, Nucleos. Nucleot. 1997, 16, 1585)이 발견되었다.

WO-2005/097817은 올리고뉴클레오타이드 합성 및 정제용 시약들의 광범위한 리스트를 제공한다. 바람직한 시약은 3-아미노 1,2,4-디티아졸리딘-5-온이다.

불행하게도, 당 기술분야에서 황화제의 제조는 종종 상당히 정교하다. 미국 특허 제 5,852,168호에는 광범위하게 퍼져있는 뷰케이지 리전트의 합성 접근성, 용해도 특성 및 안정성이 최적이 아니며, 이는 대규모 올리고뉴클레오타이드 제조용의 동일한 시약의 적합성에 문제가 있음을 보고하고 있다. 쉽게 이용가능하며 저렴한 출발물질로부터 합성하는 것이 용이한 황화 화합물은 상기 시약들에 대한 좋은 대체물이 될 수 있다.

지웨이 왕(Zhiwei Wang) 등("Dimethylthiuram Disulfide. New Sulfur Transfer Reagent in Phosphorothioate Oligonucleotide Synthesis" Methods in Molecular Biology, Vol. 288(2005), p. 51-63)은 황화제로서 디메틸티우람 디설피드(DTD)를 상기 언급된 PADS와 비교하였다. 상기 저자는 DTD가 용매 소모를 총 20% 감소시키며, 총 합성 시간을 25% 줄일 수 있는 것으로 결론지었다. 미국 특허 제 6,809,195호에는 이와 유사한 설명이 기재되어 있다. 이의 내용이 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.

불행하게도, 상기 왕(Wang) 등의 문헌 58페이지에 기술된 바와 같이, DTD는 염기의 첨가시 급속히 분해된다. 이는 불리하게도 이의 적용가능성을 제한한다. 또한, 그 합성은 인화성 및 자극성 성분을 포함하며, DTD는 아주 불쾌하며 오래 지속되는 냄새를 수반한다.

따라서, 산 및 염기 안정성 시약을 쉽게 제조하는 방안이 계속 요구되는 실정이다.

본 발명의 목적은 상기 언급된 결점에 의해 저해되지 않으며, 산 및 염기에 안정한 황화제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 이제 특정 그룹의 화합물, 특히 포름아미딘 디설피드(FMDS),

및 이의 염이 이러한 요건을 충족시켜주는 것을 발견하였다. R₁-R₄는 아래에 정의될 것이다. 알칼리 조건에서 FMDS의 안정성은 수반된 실시예 1 및 2로 입증된다.

이러한 화합물은 당 기술분야에서 쉽게 이용가능하다. 무수 조건하에서 저렴한 티오우레아와 원소 할로겐(예, Cl₂)의 반응은 정량적 FMDS 디할로게나이드 형성을 이끌며(Tetrahedron 2005, 61, 4233), 이는 편리하고 간단하게 상기 언급된 어느 시약들을 대체할 수 있다. 그러나, 현재까지는, 이러한 화합물과 황화에서 이의잠재적 사용간에 어떠한 관련성이 이루어지지 않았다.

FMDS는 왕(Wang) 등에 의한 상기 인용된 논문에서 연구 대상인 DTD 화합물과 상당히 다르다. 왕(Wang) 등에 개시된 DTD 합성은 NMR 특성화에 의해 나타나는 바와 같은 어느 검출가능한 양으로 SH부를 갖는 토토머형을 생성하지 않는다. 이는 왕(Wang) 등에 주어진 정보 자체에 기초하여 사전에 예기치 않은 것이었다. 왜냐하면, 상기 합성은 종결 산 단계를 포함하며, 이는 DTD가 다른 토토머 형태를 취하는 것을 저해하기 때문이다. 게다가, 왕(Wang) 등은 토토머 불순물이 없음을 나타내는 용융 범위 보다는 용융점을 언급하였다.

DTD와 비교하여, FMDS는 보다 적은 합성 단계를 포함하며, 불리한 냄새를 전혀 갖지 않는다.

일반적으로, 본 발명의 범위는 인-함유 부(moieties)를 황화하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 유기 분자가 이중결합된 황원자의 부착에 의해 보다 높은 산화 상태로 될 수 있다면, 무인(non-phosphorus) 유기물(예, 윤활용 황화 올레핀, Chem. Technol. Fuels Oils 1986, 22, 570) 및 금속-함유 화합물(예, 촉매(Fuel Process. Technol. 2004, 86, 169), 감마찰층(Chem. Petrol. Engin. 1966, 2, 37), 윤활제(Surf. Coat. Technol. 2000, 132, 1) 및 태양 전지(Thin Solid Films 2001, 387, 80)의 분야를 포함한다.

본 발명은 화학식 A:

를 갖는 황 함유 화합물, 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 혼합물의 황화에 사용되는 용도에 관한 것으로, 상기 식에서 모든 R기는 각각 독립적으로 H 또는 (유기)기를 나타낸다. 바람직하게, 모든 R기는 각각 독립적으로 (치환된) 아민, (치환된) 히드록실, (치환된) 설피딜, (치환된) 히드록실아민, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 시아네이트, 이소시아네이트, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬로 구성되는 그룹으로부터 선택된 부를 나타내며, 모두 하나 이상의 헤테로원자를 포함하거나 포함하지 않는다.

택일적으로 또는 부가적으로, 화학식 A에서 모든 R기는 각각 독립적으로 황화시 H, -OH, -NO₂, -CN, -SO₂R_a, -SR_a, -NHR_a, -N(R_a)₂, -C(O)R_a, -CO₂R_a, -OR_a, 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 알콕실의 의미를 갖는다. Ra는 독립적으로 각 경우에 H, 할로겐, 알킬, 아릴 또는 아랄킬을 나타내며, 임의로 하나 이상의 헤테로원자를 함유하며, 바람직하게 O, N, P, Se, B 및 S로 부터 선택된 기로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유한다.

화학식 A의 화합물은 본 명세서에서 황-전달제 또는 황화제로서 칭하여진다. 필수적으로, 이러한 황화제의 기초는 C=N 결합에 의해 어느 한 측면상에 플랭킹되는 반응성 디설피드부에 의해 형성된다. 하지만, 택일적으로 바람직하게 두 모든 C=N기가 이종 치환된 알킬, 즉, H가 아니며, 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 R₃ 및/또는 R₄기를 갖는 이종 치환된 알킬일 수 있다.

용어 "알킬", "알케닐", "알키닐", "아릴" 및 "아랄킬"은 치환된 및 치환되지 않은 탄화수소 라디칼, 바람직하게는 1-20, 보다 바람직하게는 2-10 탄소원자를 갖는 탄화수소 라디칼을 포함하며, 그리고 시클로알킬 및 시클로알케닐과 같은 고리형을 포함한다.

"아릴"은 바람직하게 6-14 탄소원자를 함유하는 방향족 탄화수소로부터 유도된 유기 라디칼을 의미하며, 모노시클릭 또는 축합 카보시클릭 방향족 고리(예, 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐 등)를 포함하며, 임의로 1 내지 2 치환체로 더욱 치환된다.

상기 기는 하나, 둘 또는 그 이상의 치환을 함유할 수 있으며, 바람직하게 O, N, P, Se, B 및 S 원자로부터 선택된 하나, 둘 또는 그 이상의 치환을 함유할 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, 존재하는 C 및 이종 원자는 각 원자의 원자가를 적절히 만족시키기위해 수소원자를 더 포함하는 것으로 이해된다.

"(치환된) 아민"은 질소원자를 통해 결합된 NR₅R₆ 기를 의미하며, 여기서 R₅ 및 R₆는 독립적으로 H이거나 상기 언급된 바와 같은 유기기일 수 있다.

"(치환된) 히드록실"은 산소 원자를 통해 결합된 OR₇ 기를 의미하며, 여기서 R₇은 H이거나 상기 언급된 바와 같은 유기기일 수 있다.

"(치환된) 설피드릴"은 황원자를 통해 결합된 SR₈ 기를 의미하며, 여기서 R₈은 H이거나 상기 언급된 것들과 같은 유기기일 수 있다.

바람직한 구현으로, R₁ 및 R₂는 질소 함유부이다.

R₁ 및 R₂ 기는 다중 헤테로원자를 포함하는 유기기일 수 있다. 예를 들어, R₁ 및 R₂는, 서로 독립적으로 그리고 나머지 R기들에 독립적으로, 황 함유 라디칼(-SZ, -SOZ, -SO₂Z), 인 함유 라디칼(-PZ₂, -POZ₃, -PSZ₃), 질소 함유 라디칼(-NZ, -NZ₂, -NZ₃ ⁺), 산소 함유 라디칼(-OZ)을 포함하며, 여기서 Z는 아민, 이민, 산소, 히드록실, 황, 설피드릴, 아릴, 알킬, 알케닐 또는 알키닐이다. 기본적으로, Z는 하나 이상의 이종 원자를 포함할 수 있다.

R₁ 및 R₂, 및 R₃ 및 R₄는 동일하거나 다를 수 있다. 동종 화합물(즉, R₁=R₂ 및 R₃=R₄)외에도, 이종 디설피드가 또한 황화에 적용될 수 있다(여기서 R₁≠R₂ 및/또는 R₃≠R₄). 바람직한 구현으로, 기 R₃=R₄이며, R₁=R₂이다. 보다 바람직한 구현으로, R₃=R₄=H, 그리고 보다 바람직한 구현으로, R₁=R₂=NH₂이며, 이는 포름아미딘 디설피드로 알려진 화합물을 생성한다.

일 구현으로, R₁ 및 R₂는 SH가 아니다. 보다 바람직하게, R₁ 및 R₂는 SH가 아니다. 다른 구현으로, 화합물 구조는 바람직하게 화학식 A1으로 나타내어진다:

상기 식에서, R₃ 및 R₄는 상기한 바와 같은 의미를 가지며, 그리고 R_1a 및 R_2a는 각각 독립적으로 상기 R_a에 주어진 바와 같은 의미를 가질 수 있다. 보다 바람직한 구현으로, R₃=R₄=H이며, 보다 바람직한 구현으로, R₁=R₂=NH₂이며, 이는 포름아미딘 디설피드로 알려진 화합물을 생성한다.

구조식 A(또는 A1)의 화합물은 이의 중성 형태(그려진 바와 같은) 또는 이의 염, 하이드레이트 또는 솔베이트로 적용될 수 있다. 바람직한 염은 HX염이며, 여기서 X는 어느 할로겐이며, n은 1-4이다. 보다 바람직하게, 상기 화합물은 이의 디하이드로클로라이드 형태이다.

합성

구조식 A의 화합물, 특히 포름아미딘 디설피드의 합성은 매우 간단하고, 고수율적이며, 고효율적이며 쉽다. M. Soroka 및 W. Goldeman "Reinvestigation of the conversion of expoxides into halohydrins with elemental halogen catalysed by thiourea"(Tetrahedron 2005, 61, 4233)에 기술된 바와 같이, 포름아미딘 디설피드는 X₂(여기서, X=할로겐, 예, F, Cl, Br)와의 반응을 통해 쉽게 이용가능한 티오우레아로부터 제조될 수 있으며, 이는 이에 상응하는 포름아미딘 디설피드 2HX 염을 정량적으로 형성한다. 따라서, 구조식 A의 황화제는 염 형태로, 일반적으로 이의 n HX 염(여기서, n=1~4(1,2,3,4))으로 존재할 수 있다. 바람직한 구현으로, n은 2이며, 그리고 X=Cl이다.

포름아미딘 디설피드의 합성 경로는 예를 들어, 유기인산 화합물을 황화시키기에 적절한 다른 화학식 A의 화합물에 대해 어느 과도한 실험없이 간단하게 추론될 수 있으며, 이는 본 발명의 대상이다.

적용

상기 정의된 화합물 A는 황화에 유용하다. "황화" 반응은 특정 원자의 보다 높은 산화 상태로의 산화를 포함한다.

상기 황화의 중요한 예는 대상이 되는 원자에 이중 결합된 황원자의 결합에 의한 3가 인 P^III의 5가 인 P^V으로의 산화이다.

특히, 본 발명은 다양한 분자내로 포스포로티오에이트 결합(P=S)을 편입시키는 방법을 제공한다. 이론적으로, 황화되는 화합물은 3가 인 P^III, 즉, 오르가노포스파이트를 함유하는 어느 유기 화합물일 수 있다. 따라서, 포스페이트 또는 포스포노스 에스테르는 각각, 이의 상응하는 포스포로티오에이트 또는 포스포노티오네이트로 황화될 수 있다. 화합물 A는 형성된 PIII 센터(포스포라미디트 합성법을 적용하는 경우에, 이는 포스포트리에스테르일 것이다)를 5가 P=S를 함유하는 중간물을 산화시킨다.

오르가노포스페이트 화합물의 중요 부류는 예를 들어, DNA, RNA 및 포스포펩타이드와 같이 생물학적으로 중요한 분자로부터 형성된다. 다른 관심있는 인-함유 물질은 포스포리피드, 인 함유 폴리머, 및 포스포네이트-변형 표면을 포함한다. 인에 가장 안정한 산화 상태인 P^V로 산화되면, 오르가노포스페이트 화합물은 더욱 산화될 수 없으며, 이에 따라 내화성을 갖는다. 황화된 오르가노포스페이트는 나무, 페이퍼 및 텍스틸과 같은 다른 가연성 물질에 내화성을 부여하는 중요한 첨가제이다. 티오포스포 작용성(즉, S=P(R)₃, 여기서 R은 알킬기이거나 헤테로원자 함유 알킬기임)을 함유하는 특정 인 폴리머가 내연제로서 유용한 것으로 특히 보고되었다(참조 예, 미국 특허 5,852,168호, 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). 따라서, 일 구현으로, 인 P^III은 P^V를 갖는 내연 오르가노포스페이트 화합물로 전환된다. 포스포네이트로 변형된 표면은 랑미르-블로젯(Langmuir-Blodget) 필름과 유사한 금속 유기 다층의 제조를 가능케 하였다. 이러한 금속 유기 다층은 화학-선택적 및 타입-선택적 크리스탈 성장 및 화학선택적 센서를 포함하는 다수 적용처를 갖는다.

따라서, 일 견지로, 본 발명은 용액상 또는 고체상으로 제조되는 DNA, RNA, 포스포로펩타이드, 포스포노펩타이드, 포스포릴레이티드 뉴클로레오사이드 당 또는 올리고사카라이드 또는 어느 다른 티오레이티드 인(V) 유도체의 합성의 일부로서 포스파이트, 포스포나이트, 포스폰아미디트, 포스포라미디트, 포스핀 또는 어느 다른 인(III) 유도체의 황화에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 의해 생성되는 출발 인 함유 화합물, 및 이의 상응하는 포스포로티오에이트는 각각 화학식 B 및 C를 갖는다:

상기 화학식에서, R₉, R₁₀, 및 R₁₁은 동일하거나 다를 수 있으며, 바람직하게 임의로 치환된 알킬, 알콕시, 페닐, 페녹시 및 3차 아미노, 및 이들의 유사체와 같은 유기부로부터 선택된다.

바람직하게, R₉ 및 R₁₀은 R₁₂, -OR₁₃, -C(R₁₄)(R₁₅)(R₁₆), -NH(R₁₇), -N(R₁₈)(R₁₉) 또는 -S-R₂₀으로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, R₁₁은 -R₁₂, -OR₁₃, -C(R₁₄)(R₁₅)(R₁₆), -NH(R₁₇), -N(R₁₈)(R₁₉) 또는 -S-R₂₀, 할로겐 또는 보호기로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 각 R₉, R₁₀, 및 R₁₁은 동일하거나 다를 수 있다. 또한, 각 R기(즉, R₁₂-R₂₀)는 동일하거나 다를 수 있으며, 바람직하게 아릴기, 알킬기, 알리시클릭기, 카보하이드레이트기, 글리세라이드기, 펩타이드기, 플루오로포어, 뉴클레오사이드기, 아미노산기, 스테로이달기, 테르펜기, 올리고뉴클레오타이드기, 포스포노펩타이드기, 포스포리피드기, 인 함유 중합기, 및 포스페이트-변형 표면으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게, 화학식 (B) 및 (C)에서 R기는 알킬기(바람직하게, (C₁-C₈)알킬기), 펩타이드기, 및/또는 올리고뉴클레오타이드기이다. 보다 바람직하게, 화학식 (B)의 R기는 펩타이드 및 올리고뉴클레오타이드기이다.

화학식 (B)와 관련하여, 용어 "카보하이드레이트기"는 이노시톨, 폴리히드록시 알데히드기, 폴리히드록시 케톤기 및 이로 가수분해될 수 있는 다른 기들을 의미한다. 특정 히드록시 보호기를 운반하거나 운반하지 않는 모노사카라이딕, 디사카라이딕 및 폴리사카라이딕 기가 이러한 용어의 범위내에 포함된다. 용어 "글리세라이드기"는 특정 히드록시 보호기를 운반하거나 운반하지 않는 글리세롤기를 의미한다. 용어 "펩타이드기"는 아미노산의 아미노기와 카르복실기간의 상호작용에 의해 형성된 아미드 함유 기를 의미한다. 이러한 용어는 특정 히드록시 보호기를 운반하거나 운반하지 않는 최고 10,000의 분자량을 갖는 디펩타이드, 트리펩타이드, 및 폴리펩타이드를 포함한다.

용어 "뉴클레오사이드기"는 N-글리코실 결합에 의해 퓨린 또는 피리미딘 염기를 갖는 당(특히, 리보스 또는 데옥시리보스)으로부터 형성된 것이다. 이는 이에 한정하는 것은 아니나, 특정 히드록시 보호기를 운반하거나 운반하지 않는 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘, 티미딘, 이노신, 이의 2'-데옥시 및 2'-치환 유사체, 합성 유도체 등을 포함한다. 용어 "아미노산기"는 특정 히드록시 보호기를 운반하거나 운반하지 않는 알라닌, 발린, 글루타민, 리신, 히스티딘, 이소루신, 프롤린기 등과 같은 아미노산기를 의미한다. 용어 "스테로이달 기"는 특정 히드록시 보호기를 운반하거나 운반하지 않는, 알도스테론, 안드로스테론, 콜레칼시페롤, 콜레스테롤, 콜레익산, 코르티코스테론, 코르티솔, 코르티솔 아세테이트, 코르티손, 코르티손 아세테이트, 데옥시코르티코스테론, 덱사메타손, 에르고칼시페롤, 에르고스테롤, 에스트라디올-17.알파., 에스트라디올-17.베타., 에스트리올, 에스트론, 라노스테롤, 리토콜릭산, 프로게스테론, 테스토스테론 등과 같은 테트라시클릴 시클로펜타[a]페난트린 스켈레톤을 함유하는 기를 의미한다. 용어 "테르펜 기"는 하나 이상의 벤제노이드기를 갖는 비고리형이거나 고리형일 수 있는 이소프렌 유니트 C₅H₈에 기초한, 화학식 C₁₀H₁₆을 갖는 (불포화) 탄화수소의 기를 의미한다. 이는 특정 히드록시 보호기를 운반하거나 운반하지 않는 디펜텐, 피넨, 미센, 메탄기 등을 포함한다.

용어 "올리고뉴클레오타이드 기"는 전형적으로 2-10000 뉴클레오타이드를 함유하는 기, 심지어 이보다 더 큰 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 기를 의미한다. 용어 "뉴클레오타이드"는 N-글리코실 결합에 의해 포스포릴레이티드 당에 결합된 헤테로시클릭 화합물을 함유하는 어느 화합물을 의미한다. 이러한 화합물의 예는 아데노신 포스페이트, 플라빈 모노뉴클레오타이드 등이지만, 보다 특정적으로, 상기 용어는 또한 핵산 퓨린 또는 피리미딘, 하나의 당(보통 (화학적으로 변형된) 리보스 또는 데옥시리보스), 및 포스페이트기의 조합인 분자를 포함하며, 이러한 뉴클레오타이드의 예는 특정 보호기를 운반하거나 운반하지 않는 아데닐릭산, 구아닐릭산, 우리딜릭산, 시티딜릭산 등일 수 있다. 용어 "뉴클레오타이드"는 또한 6-멤버로 이루어진 모폴린 고리가 리보스 또는 데옥시리보스 고리를 대체하며, 뉴클레오타이드가 P^v 중심부를 통해 연결된 모폴리노-올리고뉴클레오타이드를 포함한다.

용어 "포스포노펩타이드"는 두 아미노산간의 카르복스아미드 결합이 포스포노기로 치환된 인 함유 펩타이드를 의미한다.

용어 "포스포리피드"는 하나의 작용기에 결합된 포스포러스기 및 다른 작용기에 하나 이상의 긴사슬 유기(>C6) 기를 가지며, 보호기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 2작용성, 3작용성 또는 다작용성 유니트를 의미한다. 용어 "인 함유 폴리머"는 백본내에 또는 백본의 주변에 인을 함유하는 5 이상의 유니트로 이루어진 올리고머를 의미한다. 용어 "포스포네이트-변형 표면"은 층 또는 층들내에 금속 또는 다른 기질을 함유하거나 함유하지 않는 포스포네이트층 또는 다층을 갖는 유리, 금속 실리콘, 무기 기질, 또는 다른 지지체를 의미한다. 일 구현으로, 상기 유기인산 화합물은 내연 포스포노펩타이드 또는 포스포러스 함유 폴리머이다.

인 함유 화합물의 3가 인 작용기는 선택적으로 황화될 수 있다. 택일적으로, 3가 인 작용기 모두가 황화될 수 있다. 또한, 하나 이상의 인 작용기가 동시에 황화될 수 있으며, 또는 이들은 연속적으로(즉, 순차적으로 한번에 하나씩) 황화될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 황화시, 한번에 하나의 뉴클레오타이드가 황화되는 것이 바람직하다. 이는 히드록시 보호기가 산가수분해에 의해 제거되는 경우 올리고뉴클레오타이드의 분할을 방지한다.

올리고뉴클레오타이드, 또는 다른 유사한 분자에 대해, 화학식 (A)의 황-전달제는 뉴클레오사이드 잔기를 변형시키지 않아, 이에 따라 마크로분자의 화학적 정체성이 보존된다. 따라서, 화학식 (A)의 제제 및 본 발명의 방법은 원하는 화합물의 자동화 합성에 신뢰성있게 사용될 수 있다.

일 구현으로, R₉ 및 R₁₀은 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보뉴클레오사이드, 및 이의 합성 유사체일 수 있다. 본 발명의 제제는 R₉ 및 R₁₀이 뉴클레오사이드, 특히 적절하게 보호된 뉴클레오사이드인 포스파이트 또는 포스포노스 에스테르로부터 올리고뉴클레오타이드의 포스포로티오에이트 유사체의 합성에 특히 유용하다. 이는 뉴클레오타이드 다합체에서 인터뉴클레오타이드 포스포로티오에이트 또는 포스포노티오에이트 결합을 생성하기 위해, (고체상) 올리고뉴클레오타이드 합성시 특정 적용을 갖는다. 배경기술에서 언급한 바와 같이, 황화는 하나 이상의 P=S 결합을 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 합성에서 일반적인 단계이다.

본 발명에 의해 획득되는 포스포로티오에이트부가 (효소적) 가수분해에 덜 민감하기 때문에, 안정성을 향상시키기 위해 본 발명의 황화제를 올리고뉴클레오타이드내로 편입시키는 것이 바람직하다.

"올리고뉴클레오타이드"는 이에 한정하는 것은 아니나, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포디티오에이트, 포스포로티오디아미데이트 및 H-포스포네이트 유도체를 포함한다. 천연 발생 및 합성 올리고뉴클레오타이드 유도체가 모두 포함된다.

일반적으로, 합성 완료후, 5가 P=S 함유 유니트(들)는 인 함유 원자상에 하나 이상의 보호기를 제거하여, 이에 따라 일반 화학식 R₉-O-P(=S)(-O-)-O-R₁₀의 포스포로티오에이트 디에스테르를 생성한다. 이러한 경우에, R₁₁은 바람직하게 올리고뉴클레오타이드의 합성 완료후 선택적으로 제거(분할)될 수 있다. 이러한 기의 예는 β-시아노에틸이다. 그러나, 만일 뉴클레오타이드 다합체의 포스포노티오에이트 유사체(즉, 적어도 하나의 포스포노스 연결기가 P=S로 치환된 P=O를 갖는 유사체)를 제조하는 것이 원하여질 경우, R₁₁은 황화후 선택적으로 제거될 수 있는 기일 필요는 없다. 상기한 바와 같이, 포스포로디에스테르 결합 대신에, 포스포로티오디아미데이트 인터서브유니트 결합을 사용하는 것이 유익할 수 있으며, 이는 R₉ 및 R₁₀에 대한 리보실 또는 데옥시리보실 모노머 대신에 모폴리노 뉴클레오타이드 모노머의 사용을 가능케 한다.

당 기술분야의 숙련자는 올리고뉴클레오타이드의 다수 합성 유도체가 있으며, 이에 따라 올리고뉴클레오타이드의 어느 합성 유도체내로 황 원자를 도입하기 위한 화합물 (A)의 황화제로서의 사용이 포함되는 것을 인식할 수 있을 것이다.

황화 반응은 하나 이상의 용매에서 일어난다. 따라서, 구조식 (A)의 황화제는 이에 한정하는 것은 아니나, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 아세톤, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 아세토니트릴, 디메틸설폭시드, 피리딘, 피콜린, 루티딘, 콜리딘, 톨루엔, 자일렌, 벤젠, 디에틸 에테르, 헥산, 헵탄, 펜탄, 페트롤럼 에테르, 메틸 테르트-부틸에테르, N-메틸피롤리돈, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 아세틱 안하이드리드, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 클로로아세트산, 1,2-디클로로에탄, 1,1-디클로로에탄, 1,1,1-트리클로로에탄, 테트라히드로퓨란, 퓨란, 테트라히드로피란, 1-부탄올, 2-부탄올, s-부탄올, 테르트-부탄올, 트리플루오로에탄올, 헥사플루오로이소프로판올, 포름아미드, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 시클로헥산, 디옥산, 피퍼리딘, 및 이의 어느 조합을 포함하는 다양한 용매와 함께 적용될 수 있다. 바람직하게, 용매(들)는 황화에 적용되는 제제 및 화합물 모두가 충분히 가용성인 것이며, 고체-지지 합성의 경우에는 또한 가용성 화합물 (A)가 온-레진 포스포러스 작용성에 접근가능하도록 수지와 호환가능하여, 이에 따라 반응은 적정한 양의 시간내에 일어난다. 바람직한 구현으로, 반응은 디메틸설폭시드와 피리딘의 결합시 발생한다. 보다 바람직한 구현으로, 상기 피리딘은 3-피콜린이다.

용액 또는 고체상의 황화 반응에서, 반응 혼합물은 황화제(들) 및 하나 이상의 용매 외에 보조제로서 염기를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 염기는 (하나 이상의) 용매일 수 있다. 상기 염기는 바람직하게 유기 질소 염기이다. 황화제와 염기의 체적비는 바람직하게 3:1 내지 1:3, 보다 바람직하게 2:1 내지 1:2의 범위이다. 상기 염기는 이에 한정하는 것은 아니나, (치환된) 피리딘(예, 피콜린, 루티딘, 콜리딘), NH₃, 암모늄 히드록시드, 히드록실아민, (치환된) 알킬아민(즉, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 벤질아민) 또는 (치환된) 헤테로시클릭 아민(예, 피퍼리딘, 모폴린, 트리아졸, 테트라졸)을 포함한다. 바람직한 구현으로, 상기 염기는 피리딘이다. 보다 바람직한 구현으로, 상기 피리딘은 3-피콜린이다.

용액 또는 고체상의 황화 반응에서, 반응 혼합물은 황화제(들), 용매(들) 및 임의의 염기 외에 음이온 황염(즉, S^2- 또는 RS^-)을 함유할 수 있다. 이러한 설피드염은 이에 한정하는 것은 아니나, 소디움, 포타슘, 리튬, 마그네슘 및/또는 칼슘의 설피드, 디설피드, 트리설피드, 테트라설피드 염을 포함한다. 이들은 일반적으로 반응을 촉진하기 위해 그리고/또는 시약 당량의 양을 감소시키기 위해 포함된다.

바람직하게, 반응은 약 1시간미만내에 일어나며, 보다 바람직하게 약 30분미만내에, 가장 바람직하게 약 15분미만내에 일어난다. 일부 적용에서, 반응은 30초 정도로 짧은 시간내에 완료될 수 있다. 실온(즉, 약 25-30℃)에서 반응을 수행하는 것이 바람직하나, 약 0-50℃, 그리고 바람직하게 약 10-50℃의 범위내 온도에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 화학식 (B)의 화합물을 화학식 (C)의 티오에이티드 유도체로 전환되는 전환율은 약 90%이상, 그리고 종종 약 99%이상이다.

상기에서 황화는 P^III의 5가 P^V로의 산화에 대해 기술되었다. 유추컨대, 황화는 또한 윤활유에 대한 (황화 형태로) 첨가제로서 사용될 수 있는 올레핀의 산화에 적용될 수 있다. 참고문헌은 미국 특허 5,403,960 및 본 명세서에 인용된 참고문헌들로 이루어진다. 본 발명에 사용하기에 특히 적절한 출발 올레핀은 3 내지 약 6 탄소원자를 함유하는 지방족 모노올레핀으로 칭하여지는 모노에틸렌계 불포화 지방족 탄화수소이다. 이들은 1-부텐, 2-부텐, 이소부텐, 1-펜텐, 2-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부텐, 2-메틸-2-부텐, 1-헥센, 2-헥센, 3-헥센, 2-메틸-1-펜텐, 2-메틸-2-펜텐, 2-에틸-2-부텐 등 및 이의 혼합물을 포함한다.

바람직하게, 상기 올레핀은 이소부텐, 2-메틸-1-부텐, 1-메틸-2-부텐, 2-메틸-2-펜텐 등과 같은 분지형 사슬 올레핀이다. 보다 바람직하게, 상기 에틸렌계 이중결합은 가장 바람직한 올레핀인 이소부틸렌과 같은 3차 탄소원자에 인접한다.

가스 또는 액체로서 이러한 올레핀의 본 발명의 황화제와의 반응을 수행하는 방법은 숙련자라면 바로 알 수 있을 것이다.

실시예

실시예 1. 트리페닐 포스피트의 예비 황화

MeCN에 용해된 1M 트리페닐 포스피트의 용액 25㎕에, DMSO/3-피콜린(1/1, v/v)에 용해된 FMDS의 0.15M 용액 500㎕를 첨가하고, 그 용액을 16시간동안 (교반없이) 방치하였다. 3-피콜린은 염기이므로, 염기성 조건을 형성하는 것이 주목된다. 혼합물은 다량의 물 및 디클로로메탄으로 추출되었다. 소디움 설페이트상에서 유기층을 건조한 후, 용매를 진공하에 제거하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분석후, 모든 수집된 분획은 ³¹P 함량에 대해 분석되었다. 발견된 ³¹P NMR(MeCN-d₃)상에서의 하나의 신호는 δ에서 54.2ppm이었으며, 이는 (PhO)₃P=S의 참조값에 해당하는 것이었다(Nucleous. Nucleot. Nucl. Acids 2005, 24, 1293). 이와 대조적으로, 산화 산물(PhO)₃P=O(δ invullen, δ ~ 0ppm) 또는 출발물질(PhO)₃P (δ 128.3ppm)은 어느 분획에서도 발견되지 않았다. 따라서, FMDS는 염기 조건에서 성공적인 것으로 발견되었다. 더욱이, 상기 언급된 바와 같이 상업적으로 이용가능한 FMDS는 이의 안정한 디하이드로클로라이드(산성화) 형태로 존재하여야 함이 주목되어야 한다. 그렇지 않으면 상기 FMDS는 pH 독립적인 안정성을 보였다.

비교예 1. PADS와 FMDS의 비교

FMDS의 효능을 평가하기 위해, 반응 패널은 동일한 조건하에서 황화제 PADS와 비교되었다. 이에 따라, PADS 반응(200eq. PADS를 함유하는 MeCN/3-피콜린 1/1(v/v)에 용해된 다소 시간이 지난(3일됨) 0.2M의 PADS 용액에 첨가된 MeCN에 용해된 1M 용액의 (PhO)₃P 25㎕)은 (흔들림이나 교반없이) 밤새 방치한 후 (³¹P NMR에 의한 판단으로 - 참조 실시예 1) 적어도 35% 미반응 출발물질을 함유하는 혼합물을형성하였다. 이와 대조적으로, 모든 FMDS 조합과의 반응(DMSO/3-피콜린 1/1(v/v)에 용해된 100/50/10eq.의 0.15M FMDS를 밤새 방치하거나 50eq. FMDS를 4시간 방치한 후 NMR 분석함)은 출발물질의 완전한 전환을 나타내었다.

실시예 2. 3'-포스피트트리에스테르 결합 뉴클레오타이드의 포스포로티오에이트로의 황화

뉴클레오타이드 3'-포스피트트리에스테르의 황화에 미치는 FMDS의 영향을 하기 반응으로 검출하였다. MeCN에 용해된 0.1M 용액으로서 상업적으로 이용가능한 2'-O-메틸 아데노신 뉴클레오타이드 N,N-디이소프로필-2-O-시아노에틸 포스포라미디트(5'-O-DMT, Bz로 보호된 염기) 50μmol을 활성 분자 시브(4Å)를 함유하는 건조 1,2-디클로로에탄(2mL)에 용해된 6-클로로헥사놀(8eq.)과 1H-테트라졸(3eq., MeCN내에 용해된 0.45M 용액으로서)의 혼합물에 아르곤 분위기하에 첨가하였다. 반응 2시간 후, ³¹P NMR(DMSO-d₆)은 출발물질(δ 150.2 & 149.9ppm, 부분입체이성질체)의 포스피트트리에스테르(δ 139.9 & 139.4ppm, 부분입체이성질체)로의 전환을 나타내었다. FMDS(DMSO/3-피콜린 1/1(v/v), 12.5eq.에 용해된 0.15M)를 첨가하고, 그 혼합물을 1시간 후에 ³¹P NMR에 의해 분석하였다. (δ 68.0 & 67.6ppm 부분입체이성질체 P^V와 비교된) P^III의 존재는 <4.5%이었으며, 반면 P=O는 관찰되지 않았다.

이러한 조건은 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성에 일반적으로 사용되는 것보다 적은 양의 황화제를 사용하는 것을 주목해야 한다(본 발명에서 12.5eq와 비교하여 종래 기술에서는 >100eq.).

Claims (13)

1. 화학식 A:
   

   

   
   의 황화제 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 혼합물의 황화에 사용되는 용도:
   상기 식에서 모든 R기는 각각 독립적으로 H 또는 유기 기를 나타낸다.
   
2. 제 1항에 있어서, 모든 R기는 각각, 독립적으로 H이거나, 또는 (치환된) 아민, (치환된) 히드록실, (치환된) 설피딜, (치환된) 히드록실아민, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 시아네이트, 이소시아네이트, 아릴, 선형 또는 분지형 알킬, 헤테로-아릴 및/또는 선형 또는 분지형 헤테로알킬로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유기 기를 나타내며, 여기서 상기 (헤테로)알킬은 포화되거나 포화되지 않을 수 있는 것을 특징으로 하는 용도.
   
3. 화학식 A의 황화제, 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 혼합물의 황화에 사용되는 용도:
   상기 식에서 모든 R기는 각각 독립적으로 H, -OH, -NO₂, -CN, -SO₂Ra, -SRa, -NHRa, -N(Ra)₂, -C(O)Ra, -CO₂Ra, -ORa, 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 알콕실의 의미를 가지며, 여기서 Ra는 독립적으로 각 경우에 H, 할로겐, 알킬, 아릴 또는 아랄킬을 나타내며, 임의로 하나 이상의 헤테로원자를 함유하며, 바람직하게 O, N, P, Se, B 및 S로 부터 선택된 기로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유한다.
   
4. 제 3항에 있어서, 상기 황화제는 화학식 A1:
   

   

   
   으로 나타내어지며, 상기 식에서 R₃ 및 R₄는 제 3항에 주어진 의미를 가지며, 그리고 R_1a 및 R_2a는 각각 독립적으로 제 3항에서 R_a에 대해 주어진 의미를 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
   
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, R₁ 및 R₂ 기는 질소 함유 부(moieties), 바람직하게는 NH₂인 것을 특징으로 하는 용도.
   
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 황화제는 포름아미딘 디설피드인 것을 특징으로 하는 용도.
   
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 황화제는 3가 인 P^III을 함유하는 화합물을 황화하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
   
8. 제 7항에 있어서, 상기 3가 인 P^III을 함유하는 화합물은 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는 용도.
   
9. 제 7항에 있어서, 상기 3가 인 P^III을 함유하는 화합물은 P^V를 갖는 내연 유기인산 화합물로 전환되는 것을 특징으로 하는 용도.
   
10. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 황화제는 올레핀 화합물을 황화하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
    
11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 황화는 염기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
    
12. 제 11항에 있어서, 상기 염기는 (치환된) 피리딘, 바람직하게 피리딘 또는 3-피콜린인 것을 특징으로 하는 용도.
    
13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 황화는 적어도 하나의 설피드 염, 바람직하게 소디움 설피드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.