KR20100110434A

KR20100110434A - 호중구를 이용한 병원균의 약독화 방법

Info

Publication number: KR20100110434A
Application number: KR1020090028760A
Authority: KR
Inventors: 이희수; 김애란; 임숙경; 조윤상; 임춘태; 윤민; 정석찬
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원)
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2010-10-13
Also published as: KR101149872B1

Abstract

본 발명은 병원균의 약독화 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 병원균과 호중구를 공동 배양함으로써 상기 병원균을 약독화시키는 방법, 이렇게 약독화된 병원균 변이주 및 상기 변이주를 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다.

병원균, 살모넬라, 호중구, 약독화

Description

호중구를 이용한 병원균의 약독화 방법{Method for Attenuation of Pathogen Using Neutrophils}

사람이나 가축에서 주요 질병으로 알려져 있는 살모넬라나 리스테리아, 부루셀라 및 결핵 병원균 등은 숙주에 침입하면 대식구나 호중구 및 임파구 등의 세포내에 생존하며 치료약이나 항체에 저항하여 치료가 어려운 것으로 보고되어 있다. 상기 질병의 치료에는 세포성 면역을 활성화시키는 것이 효과적인 것으로 알려져 있다. 세포성 면역의 활성화에는 균체를 불활화시킨 사균 백신 보다는 병원체를 약독화시킨 생균 백신이 효과적인 것으로 알려져 있다.

이러한 이유로 당업계에서는 유전자 재조합 기술을 이용하여 병원성 유전자를 결실시키거나, 약품을 처리하여 플라스미드 등의 병원성 인자를 제거하거나, 영양 결핍 조건에서 병원균을 배양하여 약독화 변이주를 작제하는 방법 등을 개발하 여 왔다.

일례로, 한국등록특허 97-010759호는 aro 유전자가 결실된 약독화된 살모넬라 변이균주를, 한국공개특허 2008-0082156호는 lon 유전자 및/또는 cpxR 유전자가 결실된 약독화된 살모넬라 변이균주를, 국제공개특허 WO2007/106956호는 guaB 유전가 결실된 약독화된 살모넬라 변이균주를 각각 개시하고 있다.

그러나, 이와 같은 많은 노력에도 불구하고 성공 사례는 드문 실정이다. 이는 인위적인 조작에 의한 약독화 방법의 경우 고도의 기술이 요구될 뿐만 아니라 병원체가 원래 상태로 복귀하려는 특성을 갖고 있어 병원성이 회복될 가능성이 높기 때문이다.

이에 본 발명자는 병원균의 비복귀성 약독화 방법을 개발하기 위해 노력하던 중 호중구와 병원균을 여러 계대에 걸쳐 공동 배양함으로써 병원균의 병원성이 현저하게 감소되고, 이러한 병원성 감소가 비복귀성 돌연변이에 의한 것임을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 병원균과 호중구를 공동 배양함으로써 상기 병원균을 약독화시키는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 이렇게 약독화된 병원균 변이주를 제공하고자 한다.

아울러, 본 발명은 상기 변이주를 함유하는 백신 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 면역 탐식세포인 호중구내에 병원균의 반복적응 배양을 통하여 약독 변이주를 작제하는 방법으로서, 병원균이 호중구의 탐식기능에 저항하여 살아남고 적응하기 위한 생체 친화적인 변화과정을 이용한 것이다.

'호중구'는 체내의 첨병으로서, 병원체 침입시 가장 먼저 이를 탐식하여 파괴시키거나, 면역기관에 항원정보를 제공하는 항원인식세포(antigen presenting cell)로서 작용하다. 일반적으로 호중구는 수명이 짧아 혈류내에서 6-8시간, 조직내에서 7시간-4일 정도인 것으로 알려져 있다. 따라서, 약독화된 병원체가 호중구에 적응하여 살아남는 경우 면역기관에 효과적으로 항원 정보를 전달하여 숙주로 하여금 면역능을 획득하게 한다. 또한, 호중구의 수명이 4일 이내이므로 호중구의 밖으로 다시 쉽게 노출되어 다른 식균세포인 대식구나 T-임파구 등에 탐식되어 체내에서 소멸되는 효과를 기대할 수 있다.

호중구는 대상동물의 혈액으로부터 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 본 발명에서는 한 양태로서, 대상동물의 전혈로부터 밀도 구배 원심분리법(density gradient centrifugation)을 이용하여 분리할 수 있다(실시예 1-1 참조). 상기 대상동물은 닭, 오리, 칠면조와 같은 가금류, 돼지, 소, 염소, 양, 말, 산양, 젖소, 고양이, 개 또는 사람 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 '병원균'은 사람이나 동물 등의 질병을 유발하는 미생물을 의미한다. 상기 병원균은 이에 제한되는 것은 아니지만, 병인성 대장균, 살모넬라균, 리스테리아균, 브루셀라균 및 결핵균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 살모넬라균은 살모넬라 엔테리티디스(Samonella Enteritidis) 또는 티피무리움(S. Typhimurium)일 수 있다. 상기 리스테리아균은 리스테리아 모노사이토지네스(Listeria monocytogenes)이다. 상기 브루셀라균은 브루셀라 아보투스(Brucella abortus), 수이스(B. suis) 또는 멜리텐시스(B. melitensis)일 수 있다. 상기 결핵균은 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium Tuberculosis)이다.

본 발명은 병원균과 호중구를 공동 배양하여 병원균을 약독화시키는 방법에 관한 것이다. 여기서, 계대 회수는 2 내지 50회, 바람직하게는 5 내지 30회, 보다 바람직하게는 15 내지 20회로 한다.

한 양태로서, 병원균과 호중구의 공동 배양은 (1) 호중구와 병원균을 10분 내지 2시간, 바람직하게는 30분 내지 1시간 공동 배양하는 단계; (2) 호중구 밖의 병원균을 살상하는 단계; (3) 호중구를 회수한 후 용해시켜 병원균을 수득하는 단계를 포함하도록 실시할 수도 있다(실시예 1-2 참조). 그리고, 단계 (3)에서 수득한 병원균을 후속 계대 배양에 도입한다.

즉, 단계 (1)에서 호중구와 병원균을 공동 배양하면, 호중구의 탐식작용에 의해 병원균이 호중구에 들어가게 된다. 단계 (2)에서는 호중구에 탐식되지 못한, 즉, 호중구 밖의 병원균을 예를 들면, 항생제 등을 처리하여 살상한다. 단계 (3)에서는 호중구를 회수한 후 용해(lysis)하여 호중구내의 병원균을 수득한다.

본 발명의 약독화 방법은 병원균의 약독화 여부를 확인하기 위하여 약독화된 병원균의 생화학적 성상(예, 당 분해능 변화), 유전자 PFGE(Pulsed-field Gel Electrophoresis) 패턴, 플라스미드 프로필(plasmid profile) 또는 마우스에서의 안전성을 분석하고, 원균주(parent)와 비교하는 단계를 추가로 실시할 수 있다. 각 분석 방법을 보다 상세하게 설명하면 아래와 같다.

당 분해능 변화 분석에서는 약독화된 병원균의 당(예, 락토오스, 수크로스, 자일리톨, 트레할로스, 듀시톨, 소르비톨) 분해능을 분석한다. 플라스미드 프로필 분석에서는 일반적으로 병원성과 관련이 있는 플라스미드는 비교적 사이즈가 큰(50-200kb) 것으로 알려져 있으므로 약독화된 병원균로부터 사이즈가 큰 플라스미드의 소실 여부를 확인하는 것이 바람직하다. 유전자 PFGE 패턴 분석에서는 약독화된 병원균을 제한 효소로 처리한 후 PFGE 패턴을 분석한다. 마우스에서 병원성 분석에서는 통상적으로 마우스 복강내 접종시 병원성이 없는 것으로 판정하는 기준은 LD₅₀(50% of Lethal Dose)(mouse ip)이 5x10⁵CFU 이상인 것으로 보고되고 있으므로 약독화된 병원균의을 마우스 복강내 접종한 후 상기 기준에 부합되는지 여부를 확인한다.

본 발명은, 본 발명에 의해 약독화된 병원균 변이주에 관한 것이다. 본 발 명의 변이주는 원균주와는 상이한 당 분해능을, 또는 상이한 유전자 PFGE 패턴을 나타낼 수 있다. 또한, 원균주와는 상이한 플라스미드 프로필을 보일 수 있다. 바람직하게는 사이즈가 큰(50-200kb) 플라스미드가 소실된 것일 수 있다. 또한, 마우스에 복강내 접종시 LD₅₀이 5x10⁵CFU 이상일 수 있다. 본 발명의 약독화 방법에 의해 상기 특징 중 적어도 하나를 보유하게 되는 변이주는 본 발명에 속한다고 할 것이다.

한 양태로서, 본 발명의 병원균이 살모넬라 티피무리움인 경우에, 변이주는 원균주(parent)에 비해 자일리톨의 이용능이 저하되고 배양 후기(48시간 후) 트레할로스의 이용능이 증가되었다. 변이주를 제한효소 XbaI과 AvrⅡ로 처리하고 유전자 유형을 PFGE 분석으로 확인한 결과 변이주는 원균주에 비해 일부 유전자(약 90Kb)가 소실되는 등 XbaI 처리시 10%, AvrⅡ 처리시 50%의 상이한 패턴으로 나타내어 유전적 돌연변이를 확인할 수 있었다. 또한, 변이주의 플라스미드 프로필 조사에서, 5회 계대주는 105kb 플라스미드의 소실을, 10회 계대주는 105kb 및 90kb 플라스미드의 소실을 나타내었으며, 반면에 5회 이상의 계대주의 경우는 3-5kb의 플라스미드가 강하게 발현되어 변동 없이 비복귀성을 유지하는 특성을 보였다. 이들 변이균주의 마우스에 대한 병원성 시험에서 5회 및 10회 계대주는 복강내 접종시 LD₅₀이 4.5x10⁵CFU 및 6.0x10⁵CFU로서 원균주의 1.0x10⁵CFU 보다 5-6배 병원성이 감소되었다. 추가로, 호중구에 적응된 변이균주(ST31-N10th, 10회 계대주)의 안정성 또는 병원성 회복여부를 알아보기 위해, blood agar에서 추가로 10회 계대배양한 균주(ST31-N10th-B10th)와 다시 호중구에서 10회 및 blood agar에서 10회 계대배양(ST31-N20th-B10th)의 생화학 성상, 유전자 PFGE 패턴 및 플라스미드 프로필을 비교한 실험에서 모두 동일한 유형을 나타내어 비복귀성의 안정성이 확인되었다. 또한 마우스내 병원성 회복여부 시험에서 LD₅₀이 변이균주(ST31-N10th)의 6.0x10⁵CFU에서 각각 7.5x10⁵CFU (ST31-N10th-B10th) 및 4.6-6.0x10⁶CFU (ST31-N20th-B10th)로서 원균주의 1.0x10⁵CFU 보다 15배 이상 병원성이 더 약독화된 것으로 나타났다.

본 발명은, 본 발명에 의해 약독화된 병원균 변이주를 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여할 수 있다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에틸 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 성장을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페 놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적 유효량으로 투여한다. 용어 "약제학적 유효량"이란 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 항원에 따라 달라지며, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여 가능하다.

본 발명의 약독화 방법은 유전자 재조합 기술을 이용한 약독화 방법과 비교하였을 때 고도의 기술을 요구하지 않으면서도, 상기 약독화는 비복귀성 돌연변이에 의해 달성된 것이므로 병원성의 회복 가능성이 없어 생체에 적용함에 있어 안전하다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1-1: 돼지 호중구의 분리

살모넬라 항체 음성 돼지를 선정하여 Roof 등(1992)의 방법을 변형하여 호중구를 분리하였다. ① 6-10ml의 혈액을 채혈하여 항응고제가 코팅된 용기에 넣고 잘 흔들어 혈액이 응고되지 않도록 하였다. ② 15ml의 conical centrifuge tube에 3ml의 Histopaque 1119(Sigma) 용액을 가하고, 그 위에 3ml의 Histopaque 1077(Sigma) 용액을 가한 후 그 위에 주의 깊게 6ml의 혈액을 가하고 원심분리하였다(700x g, 30분, 실온 18-26℃)(도 1). ③ 원심분리한 튜브에 2층의 흰 밴드를 확인한 후 상층(mononuclear cell/platelet)을 제거하고 하층(granulocytes)을 취하였다. 맨 아래에 적혈구층이 있고, 그 위에 3ml의 H-1119 층이 있으며, 그 위에 흰 밴드를 취하였다. ④ 10ml의 HBSS(Hanks's balanced saltnsolution, Sigma)로 2회 세척하였다(200x g, 10분). ⑤ 호중구의 침전물을 3-5ml의 HBSS로 풀어주었다. 이 때 혈액 등의 이물질이 함유되어 있는 경우 위의 ②의 방법에 따라 재원심분리하여 순수한 호중구층을 얻을 수 있다(도 1). ⑥ 5% FBS(Fetal bovine serum)가 함유된 RPMI 1640(Gibco)으로 풀어 5x10⁷세포/ml가 되게 하여 하기 실시예에 이용하였다.

실시예 1-2: 살모넬라 원균주(ST31)의 입수 방법

살모넬라 원균주 ST31은 돼지의 설사 분변에서 분리한 살모넬라 티피무리움 균주 중에서 항생제 내성이 없는 균주를 아래 표 1과 같이 선발한 것으로, 본 발명 의 실시예에서 이용하였다.

공시시험균주의 약제내성 조사

균주명

Am

Amc

CF

CZ

Cfx

Ctx

Sm

Gm

An

N

K

Na

Cl

C

T

Tmp

Sxt

STD173-1

S

R

S

R

S

STD311-1

S

R

S

R

S

STD327

S

R

S

R

S

STD45-1

R

S

R

S

R

S

R

STD373-1

S

R

S

R

S

STD339-1

S

R

S

R

S

ST31

S

ST55

R

S

I

S

R

S

R

S

Am: ampicillin, Amc: amoxicillin/clavulanic acid, CF: cephalothin, Cz: Cefazolin, Cfx:Cefoxitin, Ctx: Cefotaxime, Sm: streptomycin, Gm: gentamicin, An: amikacin, N: neomycin, K: kanamycin, Na: Nalidixic acid, Cl: colistin, C: chloramphenicol, T: tetracycline, Tmp: trimethoprim, SXT: trimethoprim/sulfamethoxazole.

살모넬라 원균주 ST31은 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2009년 2월 18일자로 기탁하고, 수탁번호 KACC 91446P를 부여받았다.

실시예 1-3: 호중구내 살모넬라균 계대 배양법

본 발명에 따른 호중구내 살모넬라균의 계대 배양법을 상세히 기술하면 다음과 같다. ① 살모넬라균을 BHI(Brain Heart Infusion) broth(difco)에 4-5시간 배양하였다. ② 15ml의 conical tube에 돼지의 호중구가 함유된 RPMI 배지를 2ml 분주하였다. ③ 살모넬라 균액 100㎕ 접종하고 30분간 배양하였다. ④ 젠타마이신(100㎍/ml) 및 가나마이신(100㎍/ml)을 가하여 1시간 동안 방치하여 세포밖의 살모넬라를 시멸시켰다. ⑤ 원심분리하여 중성구를 침전시키고 상층액을 제거하였다. ⑥ 중성구를 PBS로 3회 세척하고 처음 양으로 재부유시켰다. ⑦ 부유액 100㎕를 취하여 증류수를 가하여 중성구를 용해시켜 살모넬라균을 방출시켰다. ⑧ 시료를 PBS로 희석하여 MacConkey(difco)에 도말 배양하여 균집락을 선발하였다. 균집락이 많은 경우는 5-10개 내외를, 5개 이하인 경우에는 모든 균집락을 보관하고, 1번 집락의 균주를 계대배양하였다. 이상의 방법을 10회 이상 반복하여 호중구에 저항 및 적응하는 살모넬라균을 만들고 여러 가지 생화학적, 유전학적 변이주를 확인하였다.

상기 과정에서 호중구에 살모넬라균을 접종하고 1시간 후 Giemsa stainning하여 현미경으로 탐식과정을 관찰할 수 있다(도 2).

실시예 2-1: 호중구내 계대배양된 병원균의 생화학적 성상변화

2-10회 계대시마다 살모넬라균을 분리하여 생화학적 성상을 분석하였다. 그 결과, 계대 균주들은 원균주에 비해 자일로스의 이용능이 감소하였고, 배양 후기(48시간 후)에 트레할로스의 이용능이 증가하였다(도 3, 표 2).

실시예 2-2: 호중구내 계대배양된 병원균의 유전학적 특성 변화

살모넬라균을 제한효소인 XbaI과 AvrII로 처리하여 유전자 유형을 PFGE(Pulsed-field Gel Electrophoresis) 분석에 의해서 확인하였다. 그 결과, parent(ST31) 균주에 비해 일부 유전자(약 90kb)가 소실되는 등 XbaI 처리시 10%, AvrII 처리시 50%의 상이한 패턴을 나타내어 유전적인 변이가 유발되었음을 확인할 수 있었다(도 4).

실시예 2-3: 호중구내 계대배양된 병원균의 플라스미드 양상 변화

살모넬라균의 플라스미드 프로필을 조사한 결과, 5회 계대주는 105kb 플라스미드의 소실을, 10회 계대주는 105kb 및 90kb의 플라스미드가 소실되었으며, 반면에 5회 이상의 계대주의 경우는 3-5kb의 플라스미드가 강하게 발현되어 변동없이 유지되는 특성을 보였다(도 5). 일반적으로 병원성과 관련이 있는 것으로 밝혀진 플라스미드는 50-200kb의 비교적 큰 사이즈인 것으로 알려져 있다.

실시예 2-4: 병원성의 약독화 분석

본 발명의 변이균주의 마우스에 대한 병원성 시험에서 5회 및 10회 계대균주는 복강내 접종시 반수치사량(50% of Lethal Dose: LD₅₀)이 4.5x10⁵CFU 및 6.0x10⁵CFU로서 원균주(ST31, parent)의 1.0x10⁵CFU 보다 5-6배 병원성이 감소되었다. 통상적으로 마우스에서 복강내 접종시 병원성이 없는 것으로 판정하는 기준은 LD₅₀(mouse ip)이 5x10⁵CFU 이상인 것으로 보고되고 있어 10회 계대균주의 6.0x10⁵CFU의 경우는 여기에 부합되는 농도이다.

한편, 호중구에 적응된 변이균주(10회 계대주, ST31-N10th)의 안정성 또는 병원성 회복여부를 알아보기 위해, blood agar에서 추가로 10회 계대배양한 균주(ST31-N10th-B10th)와 다시 호중구에서 10회 및 blood agar에서 10회 계대배양(ST31-N20th-B10th)한 균주의 생화학적 특성, 유전자 PFGE 패턴 및 유전자 프로필을 분석한 결과, 모두 동일한 유형을 나타내어 안정성이 인정되었다. 또한, 마우스내 병원성 회복여부 시험에서 LD₅₀이 변이균주(ST31-N10th)의 6.0x10⁵CFU에서 각각 7.5x10⁵CFU (ST31-N10th-B10th) 및 4.6-6.0x10⁶CFU (ST31-N20th-B10th)으로 parent(ST31)의 1.0x10⁵CFU보다 15배 이상 병원성이 더 약독화된 것으로 나타났다.

호중구내 계대배양된 균주의 마우스에서의 병원성 변화

균주	OD 값 (405nm)	배양액 균농도(cfu/ml)	LD50(CFU) (i.p.)
ST31(원균주)	1.037	4.5x10⁸	1.0x10⁵
ST31-N5th-1	0.933	3.3x10⁸	4.5x10⁵
ST31-N10th-3	0.905	2.7x10⁸	6.0x10⁵
ST31-N10th-B10th-1	0.929	2.9x10⁸	7.5x10⁵
ST31-N15th-B10th-1	0.924	1.8x10⁸	3.6x10⁶
ST31-N20th-B10th-3	0.911	2.8x10⁸	7.0x10⁵
ST31-N20th-B10th-11	0.911	2.3x10⁸	4.6x10⁶
ST31-N20th-B10th-12	0.951	2.0x10⁸	6.0x10⁶

* BHI broth에 24시간 배양 및 원심분리 후 단계별 희석하여 0.2ml 마우스 복강내 접종함.

* 상기 균주명에서 마지막 숫자는 균 집락의 번호를 의미함.

상기 약독화된 균주 중에서 ST31-N5th-1과 ST31-N20th-B10th-12를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2009년 2월 18일자로 기탁하고, 수탁번호 KACC 91447P와 KACC 91448P를 각각 부여받았다.

도 1은 돼지의 혈액으로부터 호중구를 분리하는 과정을 순차적으로 나타낸 것이다.

도 2는 호중구의 살모넬라균 탐식작용을 나타낸 것이다.

도 3은 호중구내 계대배양된 살모넬라균의 당분해능 변화를 나타낸 것이다.

도 4는 호중구내 계대배양된 살모넬라균의 PFGE 패턴의 변화를 나타낸 것이다(A: 제한효소 Xba I 처리, B: 제한효소 Avr II 처리).

도 5는 호중구내 계대배양된 살모넬라균의 플라스미드 프로필 변화를 나타낸 것이다(레인 1: high range 마커, 2:ST41(원균주), ST31-N5th-1, 4: ST31-N10th-3, 5:ST31-N10th-B10th-1, 6:ST31-N20th-B10th-3, 7: large size 마커).

Claims

병원균과 호중구를 공동 배양함으로써 병원균을 약독화시키는 방법.
제 1항에 있어서,

상기 호중구는 가금류, 돼지, 소, 염소, 양, 말, 산양, 젖소, 고양이, 개 또는 사람으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

상기 병원균은 병인성 대장균, 살모넬라균, 리스테리아균, 브루셀라균 또는 결핵균인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

계대 회수는 2 내지 50회로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

병원균과 호중구의 공동 배양은 (1) 호중구와 병원균을 10분 내지 2시간 공동 배양하는 단계; (2) 호중구 밖의 병원균을 살상하는 단계; (3) 호중구를 회수한 후 용해시켜 병원균을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

병원균의 약독화 여부를 확인하기 위하여 약독화된 병원균의 생화학적 성상, 유전자 PFGE(Pulsed-field Gel Electrophoresis) 패턴, 플라스미드 프로필(plasmid profile) 또는 마우스에서의 안정성을 분석하고 원균주(parent)와 비교하는 단계를 추가로 실시하여 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,

플라스미드 프로필 분석은 50-200kb의 플라스미드의 소실 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,

마우스에서의 안정성 시험은 약독화된 병원균을 마우스 복강내 접종하고 반수치사량이 5x10⁵ CFU 이상인지 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
수탁번호 KACC 91446인 살모넬라 티피무리움 균주.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 약독화된 병원균 변이주.
제 10항에 있어서,

ST31-N5th-1(KACC 91447P) 또는 ST31-N20th-B10th-12(KACC 91448P)인 것을 특징으로 하는 변이주.
제 10항에 따른 약독화된 병원균 변이주를 함유하는 백신 조성물.