KR20100098405A

KR20100098405A - 생체분자의 선택적 방사선표지

Info

Publication number: KR20100098405A
Application number: KR1020107013550A
Authority: KR
Inventors: 오메이라 리쯔 파딜라 드 지저스; 어니스트 윌리엄 코박스; 매티아스 에버하드 글래서; 에릭 애스태드; 파이잘 아메드 시우드
Original assignee: 제너럴 일렉트릭 캄파니; 해머스미쓰 이마네트 리미티드
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2010-09-06
Also published as: CN101903047A; EP2231201A1; CN101903047B; CA2705134C; NZ584900A; CA2705134A1; JP2011508194A; AU2008340449A1; WO2009080561A1; ES2662495T3; KR101563758B1; AU2008340449B2; EP2591808A2; BRPI0821300A2; MX2010006910A; IL205392A0; JP5566905B2; RU2491958C2; RU2010123475A; EP2231201B1

Abstract

본 명세서에 (i) 티올-반응성 말단 및 아지도/알킨-반응성 말단을 포함하는 연결기를 제공하고; (ii) 연결기의 티올-반응성 말단을 하나 이상의 티올기 또는 그들의 반응성 유도체를 포함하는 생체분자와 반응시키고; (iii) 차후에 연결기의 아지도/알킨-반응성 말단을 각각 불소-치환된 아지드 또는 알킨과 반응시키는 것을 포함하는, 생체분자 위로의 불소 원자 도입 방법을 제공한다. 또한, 이관능성 연결기 및 생체공액체의 조성물 및 합성 방법 및 불소-표지된 생체분자를 포함하는 방사성-진단 시약을 제공한다

Description

생체분자의 선택적 방사선표지 {SELECTIVE RADIOLABELING OF BIOMOLECULES}

아미노산 잔기를 포함하는 생체분자 위로 불소 원자, 특히 방사성 불소 원자를 도입하는 방법은 상당한 관심사이다. 그러나, ¹⁸F와 같은, 방사성 불소 원자가 약 110 분의 비교적 짧은 수명을 가지므로, 생체분자에 방사성 불소를 도입하려면 시간-효율적 방법이 요구된다.

방사성 불소 원자(들)을 포함하는 불소 원자(들)을 생체분자 위로 도입하기 위한 효과적이고 위치-특이적인 방법에 대한 계속적인 요구가 있다.

일측면에서, 불소 원자를 폴리펩티드와 같은 생체분자 위로 도입하는 방법을 개시한다. 이 방법은: (i) 티올-반응성 말단 및 아지도 또는 알킨-반응성 말단을 포함하는 연결기를 제공하고; (ii) 연결기의 티올-반응성 말단을 하나 이상의 티올기 또는 그들의 반응성 유도체를 포함하는 생체분자와 반응시키고; (iii) 차후에 연결기의 아지도 또는 알킨-반응성 말단을 불소-치환된 아지드 또는 알킨과 각각 반응시키는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 생체분자 위로 하나 이상의 불소 원자를 도입하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 (i) N-(부트-3-인일)-3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)프로판아미드 연결기 (1)과 같은 말(Mal)-알킨 이관능성 연결기의 티올-반응성 기를 하나 이상의 티올기를 포함하는 생체분자와 반응시키고; (ii) 차후에 연결기의 알킨기를 불소-치환된 아지드와 반응시키는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, (i) 하나 이상의 티올기를 포함하는 생체분자; 및 (ii) 연결기로부터 유도된 구조 단위를 포함하는 생체공액체(bioconjugate)를 제공한다. 연결기는 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하는 아민 화합물을 티올-반응성 관능기를 포함하는 카르복실산 또는 활성화된 에스테르와 반응시키는 것을 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. 또 다른 측면에서, 연결기는 티올-반응성 관능기를 포함하는 아민 화합물을 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하는 카르복실산 또는 활성화된 에스테르 화합물과 반응시켜 제조될 수 있다.

이에 또 다른 측면에서, 본 명세서에서는 본 방법, 연결기, 및 생체분자를 사용하여 만들어진 생체공액체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 연결기의 조성물을 제공한다.

본 발명의 이러한 측면들, 및 이점들은 전체 도면들에 걸쳐 유사한 부호가 유사한 부분들을 나타내는 수반된 도면들을 참고하여 다음의 구체적인 내용을 읽으면 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 ¹⁸F 클릭 표지된 안티-Her2 애피바디(affibody) (27) (a, 방사성 채널; b, 280 nm UV 채널)을 나타내는 비-최적화 시스템의 반응 혼합물의 HPLC 분석을 나타낸다.
도 2는 구배 I, 216 nm UV (a, 방사성 채널, 3:51 분에서의 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11); b, UV 채널)을 사용한 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11) 함유 반응 혼합물의 HPLC 분석을 나타낸다. 증류물은 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11)의 존재 하에서만 나타난다 (c, 방사성 채널; d, UV 채널).
도 3은 모델 화합물 (16) 및 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11)를 사용하여 다른 알킨 (16) 농도 및 온도에서 형성된 트리아졸 생성물 (17)의 방사화학적 수율의 HPLC 도표를 나타낸다.
도 4는 알키닐화 애피바디 (22)의 말디-토프(MALDI-TOF) MS 데이터를 나타낸다.
도 5는 알키닐화 애피바디 (22) 및 Cy5 표지된 아지도 PEG (25a) 간의 클릭 공액체의 SDS-PAGE 단백질 겔을 나타낸다. Cu^I 공급원 및 환원제가 존재할 때 공액체 생성물 (26)의 예상 분자량에서 Cy5 염료의 형광 방출이 관찰된다. 대조 실험에서는 이들 중 임의의 것이 없으면 공액 생성물의 존재가 관찰되지 않는다.

다음의 구체적인 내용은 예로써 제시된 것이고 본 출원의 발명 및 본 발명의 용도를 제한하려는 의도는 없다. 게다가, 본 발명의 선행 배경기술 또는 다음의 구체적인 내용에서 제시된 임의의 이론에 의해 제한하려는 의도가 없다.

청구된 발명의 주제를 더욱 분명히 그리고 간결하게 기술하고 알려주기 위하여, 다음의 설명 및 본 명세서에 첨부된 청구항에서 사용되는 특정 용어에 대한 다음의 정의를 제공한다. 단수형 "a", "an", 및 "the"는 문맥에서 달리 명백히 지시하지 않으면 복수형 지시대상들을 포함한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "활성화기"는, 예를 들어, N-히드록시숙신이미드, 술포-N-히드록시숙신이미드, 산 염화물, 및 우레아 중간체와 같이, 카르보닐기를 친핵체 쪽으로 더욱 반응성을 좋게 하는 임의의 기를 의미한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "아지도-반응성 말단" 및/또는 "아지도-반응성 관능기"는 아지드 관능기와 반응할 수 있는 임의의 관능기를 의미한다. 아지도-반응성 관능기의 일부 예들은 알킨, 알렌 및 포스핀을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에 사용된, 용어 "알킨-반응성 말단" 및/또는 "알킨-반응성 관능기"는 알킨 관능기와 반응할 수 있는 임의의 관능기를 의미한다. 알킨-반응성 관능기의 예는 Cu⁰, Cu^I, Cu^II를 포함하나 이에 제한되지 않는, Cu^I 공급원의 존재 하에서 반응할 수 있는 아지드, 및 아스코르브산나트륨과 같은 환원제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에 사용된, 용어 "지방족 라디칼" 또는 "지방족기"는 일반적으로 시클릭이 아니고 sp³ 탄소 원자인 부착점을 가진 탄소 원자의 배열을 의미한다. 탄소 원자의 배열은 추가로 sp³, sp² 또는 sp 혼성 탄소 원자의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 추가로, 탄소 원자의 배열은 1가, 2가, 또는 3가가 될 수 있다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸, 이소옥틸, 벤질, 시클로헥실메틸, 및 페네틸, 1',1'-디메틸벤질을 포함한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "방향족 라디칼" 또는/및 "방향족기"는 sp² 혼성 탄소 원자 및 공액 탄소-탄소 이중결합의 시클릭 배열을 의미하고, 탄소 원자의 시클릭 배열의 일부를 형성하는 방향족 sp² 혼성 탄소 원자에서 부착점을 갖는다. 방향족기 또는 라디칼은 하나 내지 최대 허용 수의 치환기를 가질 수 있다. 아릴기의 예는 페닐, 치환된 페닐, 톨릴, 치환된 톨릴, 자일릴, 메시틸, 클로로페닐, 나프틸, 퓨릴, 티에닐 및 피롤릴을 포함한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "시클로알킬 라디칼" 또는 "시클로알킬기"는 sp³ 혼성 탄소 원자의 시클릭 배열을 의미하고, 탄소 원자의 시클릭 배열의 일부를 형성하는 sp³ 혼성 탄소 원자에 부착점을 갖는다. 탄소 원자의 배열은 추가로 sp³, sp², 또는 sp 혼성 탄소 원자의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 게다가, 탄소 원자의 시클릭 배열은 하나 내지 최대 허용 수의 치환기로 치환될 수 있다. 게다가, 시클릭 원자의 배열은 O, N, 또는 S와 같은 이종원자를 포함할 수 있다. 시클로알킬기의 예는 시클로헥실, 메틸시클로헥실, 트리메틸시클로헥실, 페닐시클로헥실, 테트라히드로피라닐, 4-티아시클로헥실, 및 시클로옥틸을 포함한다.

용어 "티올기와 티올 교환 반응을 할 수 있는 이황화물기"는 생체분자의 티올기와 반응할 수 있는 기를 의미한다. 따라서, 이황화물은 티올-반응성기로 간주될 수 있다. 이황화 피리딜은 그러한 이황화물의 예이다.

본 명세서에 사용된, 용어 "불소-치환된 아지드"는 하나 이상의 불소 치환기를 가진 아지드-함유 화합물을 의미한다. 게다가, 불소 치환기는 예를 들어, ¹⁸F 및 ¹⁹F와 같은 임의의 동위 원소일 수 있다. 일 실시예에서, 불소 치환기는 ¹⁸F이다. 아지드는 지방족 아지드, 지환족 아지드, 또는 방향족 아지드일 수 있다. 게다가, 지환족 아지드 및 방향족 아지드는 모노시클릭, 비시클릭, 또는 폴리시클릭 구조를 가질 수 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "불소-치환된 알킨"은 하나 이상의 불소 치환기를 갖는 알킨-함유 화합물을 의미한다. 게다가, 불소 치환기는 예를 들어, ¹⁸F 및 ¹⁹F와 같은 임의의 동위 원소일 수 있다. 일 실시예에서, 불소 치환기는 ¹⁸F이다. 알킨은 지방족 알킨, 지환족 알킨, 또는 방향족 알킨일 수 있다. 게다가, 지환족 알킨 및 방향족 알킨은 모노시클릭, 비시클릭, 또는 폴리시클릭 구조를 가질 수 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 길이 또는 글리코실화 또는 인산화와 같은 후-번역성 변형과 상관없이, 본 명세서에서 아미노산의 임의의 사슬을 기술하는데 사용된다. 따라서, 이 용어들은 본 명세서에서 아미노산 잔기의 중합체를 일컫는데 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이 용어들은 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생적 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용될 수 있다. 따라서, 용어 "폴리펩티드"는 전장, 자연 발생적 단백질 및 전장 자연 발생적 단백질 또는 자연 발생적 단백질의 특정 도메인 또는 일부에 상응하는 재조합으로 또는 합성으로 생성된 폴리펩티드를 포함한다.

용어 "알킬", "지방족", "지환족", 및 "방향족"에 적용되는, 용어 "라디칼" 및 "기"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "티올-반응성 말단" 및/또는 "티올-반응성 관능기"는 티올기 또는 메르캅탄기 (즉, -SH기)와 반응할 수 있는 관능기를 의미한다. 티올-반응성 관능기의 예는 티올기와 티올 교환 반응을 할 수 있는 말레이미도기, 할로지방족기, 할로방향족기, 할로지환족기, (할로아세틸)알킬기, (할로아세틸)시클로알킬기, (할로아세틸)아릴기, α,β-불포화 술폰기, 비닐술폰기, α,β-불포화카르보닐기, 에폭시기, 아지리딘기, 및 이황화물기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

적절한 말레이미도기는 모(비치환)기 및 치환기로써 지방족, 지환족 또는 방향족기를 포함하는 유도체를 포함한다. 적절한 α,β-불포화 카르보닐기는 아크릴로일기를 포함하는 것들을 포함한다. 적절한 α,β-불포화 카르보닐기는 α,β-불포화 에스테르 및 α,β-불포화 술폰을 포함한다. 비닐술폰기는 α,β-불포화 술폰기의 특정한 예이다.

달리 명시하지 않으면, 앞으로 구체적인 내용 및 청구항에서 사용되는 성분의 양, 분자량과 같은 특성, 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 모든 경우에서 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 명시하지 않으면, 다음의 구체적인 내용 및 첨부된 청구항에서 설명된 수치적 파라미터들은 본 발명으로 구하려고 하는 바람직한 특성들에 따라 바뀔 수 있는 근사치이다. 적어도, 그리고 청구항의 범위에 균등론(doctrine of equivalents)의 적용을 제한하려는 의도가 없으므로, 각 수치적 파라미터는 적어도 보고된 특정 숫자의 수에 비추어, 그리고 보통의 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.

본 발명의 일측면은 불소 원자를 생체분자 위로 도입하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은

(i) 티올-반응성 말단 및 아지도 또는 알킨-반응성 말단을 포함하는 연결기를 제공하고;

(ii) 연결기의 티올-반응성 말단을 하나 이상의 티올기 또는 그들의 반응성 유도체를 포함하는 생체분자와 반응시키고;

(iii) 차후에 연결기의 아지도 또는 알킨-반응성 말단을 불소-치환된 아지드 또는 알킨기와 각각 반응시키는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 하나 이상의 티올기 및 연결기를 포함하는 생체분자로부터 유도된 구조 단위를 포함하는 생체공액체 조성물을 제공하는 것이다. 연결기는 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하는 아민 화합물을 티올-반응성 관능기를 포함하는 카르복실산 또는 활성화된 에스테르와 반응시키는 것을 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. 또 다른 측면에서 연결기는 티올-반응성 관능기를 포함하는 아민 화합물을 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하는 카르복실산 또는 활성화된 에스테르 화합물과 반응시켜 제조될 수 있다.

생체분자

본 명세서에 사용된, 용어 "생체분자"는 연결기와의 반응을 위해 하나 이상의 티올기 (또는 가끔은 "메르캅토"기를 의미함) 또는 그들의 반응성 유도체를 포함하는 자연 발생적 또는 조작된 분자를 의미한다. 티올기는 생체분자에서 자연적으로 발생할 수 있거나 표준 생물학적 방법 또는 적절한 기술 인정된 방법을 사용하여 화학적으로 도입될 수 있거나 조작될 수 있다. 일부 실시예에서, 생체분자는 특별히 50 미만의 아미노산 잔기를 갖는 것을 제외한다.

그러한 생체분자는 자연 상태에서 하나 이상의 SH 기를 가질 수 있거나, 예를 들어, 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 조작될 수 있다. 자연적으로 SH 기를 갖는 생체분자의 예는 하나 이상의 시스테인 아미노산과 연결되는 것들을 포함한다. 용어 "그들의 반응성 유도체"는 연결기 화합물과의 반응을 위한 자유 티올기를 생성하기 위하여 활성화되는 SH 기의 유도체를 의미한다.

하나 이상의 자연적 티올기 또는 화학적 조작된 티올기를 포함하는 생체분자의 예는 펩티드, 폴리펩티드, 벡터, 지질, 다당류, 당아미노글리칸 및 그들의 변형된 형태, 당지질, 당단백질, 합성 중합체, 세포 응답 변형체, (예를 들어, 성장 인자, 화학주성 인자, 또는 사이토킨), 효소, 수용체, 신경전달물질, 호르몬, 사이토킨, 백신, 합텐, 독소, 인터페론 및 리보자임을 포함한다. 개시된 방법은 또한 티올기를 함유하지 않으나, 티올기를 함유하는 분자에 공액되는 분자에 적용될 수 있다. 생체분자의 추가의 예는 단백질, 단백질 단편, 단백질 변이체, 골격계 단백질, 조작 단백질, 뉴클레오티드 및 관련된 분자, 핵산, 올리고-DNA 또는 올리고-RNA 펩티드 공액체, 폴리클로날 및 모노클로날 항체와 같은 항체, 및 항체계 단편을 포함한다. 따라서, 개시된 방법은 티올기를 가진 폴리펩티드와 같은 티올-함유 분자와 관련된 데옥시리보핵산 (예를 들어, 올리고데옥시뉴클레오티드, 핵산 탐식자, 플라스미드), 리보핵산 (예를 들어, siRNA)을 포함하는 핵산의 불소화에 사용될 수 있다.

생체분자는 하나 이상의 티올기를 갖는 임의의 자연 발생적 또는 조작된 생체분자일 수 있다. 모든 실시예에서, 생체분자는 자연 발생적 및/또는 비자연적 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 티올기를 포함하는 생체분자는 시스테인 잔기 또는 비자연적 기를 포함한다. 용어 "시스테인 잔기"가 시스테인이 생체분자 사슬의 일부로 포함된 후 생기는 티올기가 아닌 구조적 단편을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 연결기와 반응하기 위한 생체분자는 조작된 시스테인 잔기를 갖는 것이며, 적절한 전구 생체분자가 화학적으로 변형되어 티올기 및 시스테인 잔기를 갖는 바람직한 생체분자를 생성함을 의미한다.

일부 경우에서, 생체분자는 반응성 티올기를 생성하기 위해 환원제로 처리될 수 있다. 예를 들어, 이황화물 연결을 갖는 생체분자는 적절한 환원제로 환원되어 티올기를 갖는 생체분자 2 당량을 생성할 수 있다. 유용한 환원제의 예는 2-메르캅토에탄올, 2-메르캅토에탄올아민, 디티오트레이톨 (DTT), 및 트리스-(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)을 포함한다.

연결기

본 명세서에 사용된, 용어 "연결기"는 티올-반응성 말단 또는 그들의 보호된 유도체, 및 아지도 또는 알킨-반응성 말단 또는 그들의 보호된 유도체를 포함하는 이관능성 화합물을 의미한다. 연결기는 티올-함유 화합물을 티올-반응성 말단을 통해 한쪽 끝에 부착하기 위하여, 그리고 아지드 또는 알킨, 특히 불소-치환된 아지드 또는 알킨을 각각 아지도 또는 알킨-반응성 말단을 통해 다른쪽 끝에 부착하기 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된, 용어 "말-알킨 이관능성 연결기"는 첫 번째 말단에 말레이미도기를, 그리고 두 번째 말단에 알킨기를 갖는, N-(부트-3-인일)-3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판아미드 연결기 (1)과 같은 연결기를 의미하고, "말-아지드 이관능성 연결기"는 첫 번째 말단에 말레이미도기를, 그리고 두 번째 말단에 아지드기를 갖는, 화합물 (2)와 같은 연결기를 의미한다. 연결기의 일부 제한 없는 예들은 구조식 (1) 내지 (6)에 나타나 있다.

일부 실시예에서, 티올-반응성 말단, 아지도 또는 알킨-반응성 말단, 또는 티올-반응성 말단 및 아지도 또는 알킨-반응성 말단 양쪽 모두는 전구 유도체로 대체될 수 있다. 연결기는 티올-함유 화합물을 티올-반응성 말단을 통해 한쪽 끝에 부착하고/하거나 아지드 또는 알킨 (예를 들어, 불소-치환된 아지드 또는 알킨)을 각각 아지도 또는 알킨-반응성 말단을 통해 다른쪽 끝에 부착하는데 사용될 수 있다.

연결기 제조

연결기는 티올-반응성 관능기 및 아지도 또는 알킨-반응성 관능기 양쪽 모두를 각각 (i) 하나 이상의 티올기를 갖는 생체분자, 및 (ii) 불소-치환된 아지드 또는 알킨과 반응할 수 있게 하는 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 일 실시예에서, 연결기는 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하는 아민 화합물을 티올-반응성 관능기를 포함하는 카르복실산 또는 활성화된 에스테르와 반응시켜 제조된다. 아지도 또는 알킨 반응성 관능기를 갖는 임의의 아민 화합물이 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 아민 화합물은 구조식 (7)을 포함하며,

이때 G는 아지도 또는 알킨-반응성 관능기이고, J는 연결 단위이고, R¹은 H, 지방족 라디칼, 방향족 라디칼, 또는 지환족 라디칼이다. 2가 연결 단위 J의 성질은 티올-반응성 및 아지도 또는 알킨-반응성 관능기의 반응성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 입체 장애를 최소화하도록 설계될 수 있다. 본 방법의 이점 중 하나는 연결 단위가 생체공액체의 최종 특성을 바꾸기 위해 조정될 수 있다는 것이다. 따라서, 연결기는 용해도 및 약력학/약동학 (PK/PD) 특성과 같은 최종 공액체의 특성을 변형시키기 위하여 크기, 극성, 전하, 및 화학적 조성이 바뀔 수 있다. 게다가, 연결기는 표적화 및/또는 용해도를 향상시키는 기의 부착을 위해 추가의 조작을 포함할 수 있다.

다른 실시예에서, 연결기는 티올-반응성 관능기를 포함하는 아민 화합물을 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하는 카르복실산 또는 활성화된 에스테르와 반응시켜 제조될 수 있다.

카르복실산 또는 활성화된 에스테르는 구조식 (8)을 포함하며,

이때 L은 티올-반응성 관능기, 또는 그들의 보호된 유도체를 포함하고; M은 2가 연결 단위이고, R²는 OH 또는 활성화기이다. 활성화기 R²는 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 갖는 아민 화합물과 구조식 (8)의 카르보닐 탄소 원자와의 반응을 용이하게 한다.

또 다른 실시예에서, 연결기의 조성물은 다음의 화학식을 포함하며:

이때 L은 티올-반응성 관능기이고;

M 및 J는 이관능성 단위/연결 단위이고;

R¹은 H, 지방족 라디칼, 방향족 라디칼, 또는 지환족 라디칼이고;

G는 아지도 또는 알킨-반응성 관능기이다.

구조식 (1) 및 (2)를 갖는 연결기의 제조를 위한 합성 방법의 예는 반응식 1 및 2에 나타나 있다.

반응식 1

반응식 2

반응식 1 및 2에서, DMF는 디메틸 포름아미드를 의미하고 DIEA는 디-이소프로필 에틸 아민을 의미한다. 이러한 방법을 사용하여 제조될 수 있는 연결기의 일부 예는 상기 구조식 (1) 내지 (6)에 나타나 있다.

생체공액체

연결기와 하나 이상의 티올기를 갖는 생체분자의 반응의 결과로 생성된 생성물을 생체공액체로 지칭한다. 따라서 일 실시예에서, 생체공액체는 (i) 하나 이상의 티올기를 포함하는 생체분자; 및 (ii) 연결기로부터 유도된 구조 단위를 포함하며, 이때 연결기는 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하는 아민 화합물을 티올-반응성 관능기를 포함하는 카르복실산 또는 활성화된 에스테르와 반응시키는 것을 포함하는 방법으로 제조된다. 또 다른 실시예에서, 생체공액체는 (i) 하나 이상의 티올기를 포함하는 생체분자; 및 (ii) 연결기로부터 유도된 구조 단위를 포함하며, 이때 연결기는 티올-반응성 관능기를 포함하는 아민 화합물을 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하는 카르복실산 또는 활성화된 에스테르와 반응시키는 것을 포함하는 방법으로 제조된다. 또 다른 측면에서, 연결기는 티올-반응성 관능기를 포함하는 아민 화합물을 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하는 카르복실산 또는 활성화된 에스테르와 반응시켜 제조될 수 있다.

생체공액체의 불소화 방법

본 명세서에 기술된 방법은 불소-표지된 생체공액체, 더욱 구체적으로는 방사성 불소 (예를 들어, ¹⁸F) 표지된 생체공액체의 제조를 가능하게 한다. 이러한 방법의 이점 중 하나는 연결기가 생체분자의 티올기가 연결기의 티올-반응성 관능기와 선택적으로 반응할 수 있고, 결과로 생긴 생체공액체가 ¹⁸F 또는 정상 불소-치환된 아지드 또는 알킨과 반응하기 전 정제될 수 있는 비-방사성 조건 하에서 생체분자와 같은 생체분자에 선택적으로 부착할 수 있다는 것이다. 또 다른 이점은 방사성 불소 표지가 특히 추적자 수준으로 최종 단계에서 선택적으로 부가될 수 있어서, 최종 생체공액체의 제조 전 시간 소비적인 추가의 정제 단계에 대한 필요성을 제거한다.

생체공액체 위로 불소를 도입하기 위한 본 명세서에 기술된 방법은 임의의 길이의 불소화 생체공액체를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서 생체공액체의 생체분자는 50 이상의 아미노산 잔기 또는 100 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.

일 측면에서, 하나 이상의 불소 원자(들)을 생체분자 위로 도입하는 방법을 개시한다. 본 방법은: (i) 티올-반응성 말단 및 아지도 또는 알킨-반응성 말단을 포함하는 연결기를 제공하고; (ii) 연결기의 티올-반응성 말단을 하나 이상의 티올기 또는 그들의 반응성 유도체를 포함하는 생체분자와 반응시키고; (iii) 차후에 연결기의 아지도 또는 알킨-반응성 말단을 각각 불소-치환된 아지드 또는 알킨과 반응시키는 것을 포함할 수 있다.

폴리펩티드와 같은 생체분자 위로 불소 원자를 도입하는 방법의 일부 실시예에서, 연결기의 티올-반응성 말단은 티올기와 티올 교환 반응을 할 수 있는 말레이미도기, 할로지방족기, 할로방향족기, 할로지환족기, (할로아세틸)알킬기, (할로아세틸)시클로알킬기, (할로아세틸)아릴기, 비닐술폰기, 아크릴로일기, 에폭시기, 아지리딘기, 및 이황화물기로부터 선택된다.

더욱 구체적으로, 본 명세서에 기술된 방법은 연결기로써 N-(부트-3-인일)-3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판아미드 (1)과 같은 말-알킨 이관능성 연결기를 사용하여 생체분자 위로 하나 이상의 불소 원자를 도입하는데 사용될 수 있다. 그러한 방법은: (i) N-(부트-3-인일)-3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판아미드 (1)의 티올-반응성기를 하나 이상의 티올기를 포함하는 생체분자와 반응시키고; (ii) 차후에 (i) 단계의 결과로 생긴 중간 생성물의 알킨기를 불소-치환된 아지드와 반응시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 연결기로써 화합물 (2)와 같은 말-아지드 이관능성 연결기를 사용하여 생체분자 위로 하나 이상의 불소 원자를 도입하는데 사용될 수 있다. 그러한 방법은: (i) 화합물의 티올-반응성 관능기 (2)를 하나 이상의 티올기를 포함하는 생체분자와 반응시키고; (ii) 차후에 (i) 단계의 결과로 생긴 중간 생성물의 아지드기를 불소-치환된 알킨과 반응시키는 것을 포함한다.

연결기의 아지도 또는 알킨-반응성 말단과 불소-치환된 아지드 또는 알킨의 반응이 중간 정도의 산성 내지 중간 정도의 염기성 조건 범위일 수 있는 임의의 매질에서 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 반응은 약 6 내지 약 9 범위의 pH를 갖는 매질에서 수행될 수 있고; 또 다른 실시예에서, 약 7 내지 약 8 범위의 pH에서 수행될 수 있다. 반응 온도는 대기 온도 내지 약 70 ℃로 바뀔 수 있다. 반응 시간은 바뀔 수 있으나, 일반적으로 약 10 분 내지 약 60 분일 수 있다. 일부 실시예에서, 반응 시간은 약 10 분 내지 약 30 분으로 바뀐다. 그러나, 더 긴 반응 시간 또한 사용될 수 있다. 반응은 아스코르브산나트륨과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 환원제의 존재 하에서, Cu⁰, Cu^I, 또는 Cu^II 염을 포함하나 이에 제한되지 않는, Cu^I, 또는 그들의 전구체의 존재 하에서 수행될 수 있다. 반응식 3 및 4가 불소 표지된 생체공액체 (9) 및 (10)을 제조하기 위한 가능한 방법을 보여준다.

반응식 3 반응식 4

하나의 방법에서, 알킨 또는 아지드 함유 연결기에 대한 전구체를 티올기를 포함하는 폴리펩티드와 첫 번째로 반응시킬 수 있고, 그 결과로 생긴 중간체를 변형시켜 바람직한 생체공액체를 제공한다. 이와 달리, 알킨 또는 아지드 함유 연결기에 대한 전구체를 첫 번째로 변형시켜 연결기를 제공할 수 있고, 그 뒤 티올기를 포함하는 폴리펩티드와 반응시켜 생성물을 제공할 수 있다.

상기 기술을 사용하여, 생체분자 위로 불소 또는 ¹⁸F와 같은 방사성 불소 원자(들)을 도입할 수 있다. 불소-치환된 아지드 또는 알킨을 생체공액체와 반응시킬 때, 불소-치환된 생체공액체가 생긴다. 방사성 불소-치환된 아지드 또는 알킨을 생체공액체와 반응시킬 때, 방사성 불소-표지된 생체공액체가 생긴다. 적절한 불소-치환된 아지드/알킨의 제한 없는 예가 구조식 (11) 내지 (14)에 나타나 있다.

폴리펩티드와 같은, 하나 이상의 티올기를 갖는 앞서 기술된 임의의 생체분자가 생체공액체의 제조에 사용될 수 있다. 하나 이상의 티올기를 갖는 폴리펩티드, 백터, 골격계 단백질 및 조작된 결합 단백질과 같은 생체분자가, 그러한 물질이 잠재적으로 값진 진단상 및 치료상 가치가 있으므로 특히 가치있다. 따라서 일 실시예에서, 애피바디와 같은 골격계 단백질을 N-(부트-3-인일)-3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판아미드 연결기 (1)과 같은 말-알킨 이관능성 연결기와 반응시켜 생체공액체를 제조할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 애피바디와 같은 골격계 단백질을 화합물 (2)와 같은 말-아지드 이관능성 연결기와 반응시켜 생체공액체를 제조할 수 있다. 추가로, 생체공액체를 불소-치환된 아지드 또는 알킨과 반응시켜 가치있는 불소-표지된 생체공액체를 제조할 수 있다.

불소-표지된 생체공액체는 진단 응용에 가치있는 물질이다. ¹⁸F 표지된 생체공액체가 예를 들어 PET (양전자 방출 단층촬영술) 기술과 같은 선행 기술에서 알려진 영상화 기술을 사용하여 가시화될 수 있다.

본 발명의 단지 특정 특징들이 본 명세서에서 예시되고 기술되었지만, 많은 변형 및 변화들이 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구항이 본 발명의 실제 핵심 이내에서 모든 그러한 변형 및 변화들을 포함하려는 의도로 이해되어야 한다.

실시예

본 발명의 실시는 단지 실례로써 본 명세서에 나타난 다음의 실시예들로부터 훨씬 더 충분히 이해될 것이나, 어떠한 방법으로도 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예 부문에서 사용된 축약형은 상세하게는 다음과 같다: "mg": 밀리그램; "mL": 밀리리터; "mg/mL": 밀리리터당 밀리그램; "mmol": 밀리몰; "μL": 마이크로리터; "KDa": 킬로달톤; "말디-MS": 매트릭스 보조된 레이저 탈착 이온화 질량 분광법; "HPLC": 고압 액체 크로마토그래피; "LC-MS" 액체 크로마토그래피 질량 분광법, "ESI-MS" 전기분무 이온화 질량 분광법, "말디-토프 MS" 매트릭스 보조된 레이저 탈착 이온화 비행시간 질량 분광법, "TFA": 삼불화아세트산; "DMSO": 디메틸술폭시드; "DTT": 디티오트리에톨; "MeCN" 아세토니트릴, "PBS": 인산염 완충 염수, "Mal": 말레이미도; "ppm" 밀리언당 부, "MWCO: 분획 분자량; "냉 조건": 방사성 동위원소가 없음 및 "방사화학적 수율": 원래 존재하는 활성도의 비율. 달리 언급이 없으면, 모든 시약-등급 화학물질들이 받은 채로 사용되었고, 모든 수용액의 제조에 밀리포어(Millipore) 물이 사용되었다.

실시예 1: 2-[ ¹⁸ F] 플루오로에틸아지드 (11)의 제조

반응식 5

풍부 [¹⁸O]H₂O 표적의 19 MeV 양성자 조사와 ¹⁸O(p,n)¹⁸F 핵반응을 이용하여 시클로트론으로 [¹⁸F]-플루오라이드를 제조하였다. 조사 후, 크립토픽스®(Kryptofix®) (5 mg, 13.3 μmol), 탄산칼륨 (1 mg, 7.2 μmol), 및 MeCN (1 mL)의 혼합물을 ¹⁸F-물 (1 mL)에 첨가하였다. 질소 스트림 하에서 (100 mL/분) 80 ℃로 가열하여 용매를 제거하였다. 그 뒤, MeCN (0.5 mL)을 첨가하였고 가열 및 질소 스트림 하에서 증발시켰다. 이 과정을 두 번 반복하였다. 실온으로 냉각 후, 무수의 MeCN (0.2 mL) 내 톨루엔술폰산-2-아지도에틸에스테르 (15) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80 ℃에서 15 분간 교반하였다. MeCN (0.3 mL)의 첨가 후, 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11)를 130 ℃에서 질소 흐름 (15 mL/분) 하에서 MeCN (0.1 mL)를 담고 있는 포집 바이알로 증류시켰다. 이 화합물 (11)을 54 %의 붕괴-수정된 방사화학적 수율 (¹⁸F-플루오라이드에 대하여) 및 63 %의 증류 효율로 수집하였다.

도 2는 등급 I, 216 nm의 UV (a, 방사성 채널, 3:51 분에서 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11); b, UV 채널) 및 증류된 생성물 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11) (c, 방사성 채널; d, UV 채널)을 사용한 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11)을 함유하는 반응 혼합물의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.

실시예 2: 작은 기질의 다른 농도에서 트리아졸 형성을 나타내는 농도 연구

반응식 6

농도 연구에서, 알킨 모델 (16) (1.2-0.01 mg, 7.5-0.25 μmol)을 DMF (50 μL)에 용해시키고 질소 하에서 황산구리(II) (25 μl, 2.8 mg, 11.25 μmol), 및 아스코르브산나트륨 (25 μL, 7.5 mg, 37.5 μmol)의 수용액과 혼합하였다. MeCN (100 μl) 내 [¹⁸F]2-플루오로에틸아지드 (11)를 첨가하고 실온에서 15 분간 정치시킨 뒤, 혼합물을 HPLC로 분석하였다. 그 뒤 바이알을 가열하고 (15 분, 80 ℃) 다시 분석하였다.

그 결과로 생긴 트리아졸 생성물 (17)이 3.14 mM (100 μg)의 최소의 알킨 모델 (16) 농도로 실온에서 정량적 수율로 획득된다. 반응 혼합물을 80 ℃에서 가열할 때, 최소의 알킨 모델 (16) 농도는 그 결과로 생긴 트리아졸 (17)의 정량적 수율에 대해 1.57 mM (50 μg)이었다.

도 3은 모델 화합물 (16) 및 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11)을 사용하여 다른 알킨 (16) 농도 및 온도에서 형성된 트리아졸 생성물 (17)의 방사화학적 수율의 HPLC 플롯을 나타낸다.

실시예 3: 펩티드 위 트리아졸 형성

[¹⁸F](S)-6-아미노-2-(2-{(S)-2-[2-((S)-6-아미노-2-{[4-(2-플루오로-에틸)-[l,2,3]트리아졸-1-카르보닐]-아미노}-헥사노일아미노)-아세틸아미노]-3-페닐-프로피오닐아미노}-아세틸아미노)-헥산산 (19)의 제조.

반응식 7

물 (50 μL) 내 황산구리(II) 오수화물 (4.3 mg, 17 μmol)의 용액에, 질소 하에서 물 (50 μL) 내 아스코르브산나트륨 (3.4 mg, 17 μmol)을 첨가하였다. 실온에서 대략 일 분 뒤, 알킨 펩티드 전구체 (18) 용액을 첨가한 후 (2 mg, 3.4 μmol, 인산나트륨 완충용액 내, pH 6.0, 0.5 M, 50 μL), MeCN (50 μL) 내 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11) (24-32 MBq) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분간 유지시키고 HPLC 이동상 A (물, 0.1 % TFA) (0.3 mL)으로 희석하였다. 표지된 펩티드 (19)를 반-정제용 HPLC (216 nm UV, Rt = 6:24)를 사용하여 단리하였다.

실시예 4: 말- 알킨 이관능성 연결기 (1)의 합성

반응식 8

N-[β-말레이미도프로필옥시]숙신이미드 에스테르 (50 mg, 1.25 당량)을 1.0 mL의 건조 DMF에 용해시켰다. 3-부틴-1-아민 염산염 (16 mg, 1.0 당량)을 0.5 mL의 건조 디메틸포름아미드 (DMF) 및 26 μL의 디이소프로필에틸아민 (DIEA)에 용해시켰다. 이 아민 용액을 숙신이미드 에스테르에 에스테르 용액을 얼음 수조에 넣어둔 채로 한 방울씩 첨가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 10 분간 교반하였다. 용액을 실온까지 가온하고 18 시간 동안 교반하였다. 용매를 진공에서 증발시키고 잔여물을 5 mL CH₂Cl₂에 용해시켰다. 유기 용액을 염수 (3 x 5 mL)로 추출하였고 MgSO₄로 건조하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였고 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, MeOH/CH₂Cl₂)를 사용하여 정제하였다. 샘플을 최소량의 CH₂Cl₂ (ca. 2 mL)에 용해시키고, 그 뒤 헥산으로 세 번 세척하여 생성물 (1)을 그리스(grease)로부터 정제하였다. 생성물 (1)이 부푼 흰 고체로 침강되었다. ¹H-NMR을 사용하여 생성물을 특성화하였다. 수율: 8.2 mg (25 %). ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) : δ 2.02 (s, 1), 2.41 (t, J = 5 Hz, 2), 2.57 (t, J = 5 Hz, 2), 3.42 (td, J = 5 Hz, 2), 3.88 (t, J = 5 Hz), 5.90 (bs, 1), 6.73 (s, 2).

실시예 5: 2-플루오로 에틸트리아졸 - 말레이미드의 제조 (대조 화합물) (21)

반응식 9

인산나트륨 완충액 (20 μl, 250 mM, pH 6.0), DMF (50 μl) 및 구리 분말 (100 mg, -40 메쉬, 알드리치 카탈로그 번호 26,608-6)의 혼합물을 5 분간 질소 기체 (10 ml/분)로 퍼징하였다. DMF (9.2 μl, 2007년 글래서(Glaser) 및 아스타드(Årstad)에 의해 기술된 방법으로 제조) 내 2-플루오로에틸아지드 (20) (10 μmol), 및 DMF (20 μl) 내 3-(N-말레이미딜)-N-(3-프로파르길) 프로피온아미드 (1) (2.1 mg, 9.5 μmol)의 첨가 후, 용기를 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 (1 mbar, 8O ℃) 하에서 제거하였다. 정제용 HPLC로 정제하여 플루오로에틸트리아졸 (21) 화합물 (1.2 mg, 41 %)을 얻었다. HR ESI-MS: C₁₃H₁₆N₅O₃F에 대하여 (계산치, m/z = 310.1310, 실측치 m/z = 310.1314).

정제용 HPLC로 정제 (구배: 15 분에 걸쳐 5 내지 80 % 용매 B이며, A = H₂O/0.1 % TFA 및 B = MeCN/0.1 % TFA, 흐름 속도: 15 mL/분; 컬럼: 루나(Luna) 5 μm C18(2) (페노메넥스(Phenomenex)), 75 x 30 mm, 검출: UV 216 nm.

실시예 6: 애피바디 알키닐화 및 말- 알킨 이관능성 연결기와의 반응

반응식 10

안티-Her2 애피바디, 14 kDa (동결건조된 분말로 1 mg)을 460 μL의 인산염 완충 염수 (PBS)에 용해시켰다. 용액의 pH를 7.4로 유지시켰다. 이 용액에 PBS에 용해된 디티오트레이톨 (DTT) 0.5 M 용액 40 μL를 첨가하였으며; pH를 7.4로 유지시켰다. 그 결과로 생긴 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 환원된 애피바디를 겔 여과를 통해 정제하였다. 이 환원된 애피바디의 순수한 분획에 말-알킨 이관능성 연결기 (1) (DMSO 내 0.15 M) 용액의 12 μL 분취액을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 적당히 교반하며 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물을 겔 여과 후 원심분리 한외여과 (아미콘(Amicon)), MWCO 5 kDa (밀리포어)를 사용하여 정제하여 정제된 알키닐화 애피바디 (22)를 획득하였다.

(말디-토프-MS) 및 HPLC 이후 LC(ESI)-MS를 사용하여 그 결과로 생긴 정제된 알키닐화 애피바디 (22)를 특성화하였다. 수율 (%): 78; MS: (MH⁺ 계산치: 14260, 실측치: 14260). 도 4는 알키닐화 애피바디 (22)의 말디-토프 MS 데이터를 나타낸다.

알키닐화 애피바디 (22)의 HPLC 분석에 대한 표준 조건: HPLC 분석에 그레이스 바이닥(Grace Vydac) 단백질 C4 컬럼을 사용하였다. 용매 A: 100 % H₂O, 0.1 % TFA, 용매 B: 100 % MeCN, 0.1 % TFA; 검출: UV 216 및 280 nm; 흐름 속도: 1 mL/분. 하기 표 1에서 나타나듯이 용매 농도를 시간에 따라 바꾸었다.

[표 1]

알키닐화 애피바디 (22)에 대한 전형적인 용리 시간은 대략 11 분이었다.

실시예 7: 냉조건 하에서 생체공액체 위 트리아졸의 형성

반응식 11

아지도-PEG (23)을 사용한 알키닐화-애피바디 (22)의 표지. 인산나트륨 (100 mM, pH 8) 수용액 36 μL에 알키닐화 애피바디 (22) 용액 (인산 완충 염수 내 0.6 mM, ~8 mg/mL, pH 7.4) 모액의 분취액 3 μL을 첨가하였다. 이 용액에 방금 제조된 11-아지도-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (아지도-PEG) (23) 18 mM 용액 (100 mM 인산나트륨에 희석, pH 8)의 분취액 1 μL를 첨가하였다. 그 뒤 이 용액에 방금 제조된 아스코르브산나트륨 10 mM (2 mg/mL) 용액 (100 mM 인산나트륨 내, pH 8)의 분취액 5 μL를 첨가하였다. 마지막으로, 방금 제조된 황산구리(II)의 10 mM (1.6 mg/mL) 현탁액 (100 mM 인산나트륨 내, pH 8)의 분취액 5 μL를 반응 혼합물에 첨가하였다. 따라서 이러한 첨가들은 시약 및 기재에 대한 다음의 최종 농도를 산출한다―알키닐화 애피바디 (22) (36 μM), 아지도 PEG (23) (360 μM), 아스코르브산나트륨 (1 mM), 및 CuSO₄ (1 mM).

그 결과로 생긴 용액을 65 ℃에서 0.75 시간 동안 적당히 교반하여 혼합하였다. 그 뒤 반응 혼합물을 즉시 4 mL 순수한 물 (밀리Q)로 희석시키고 아미콘 원심분리 한외여과 장치, MWCO 5 kDa (밀리포어)을 사용하여 <100 μL로 농축하였다. 이러한 물 희석-농축 순서를 추가로 두 번 반복하여 과량의 시약을 제거하였다. 말디-토프-MS 및 고 성능 액체 크로마토그래피 이후 LC(ESI)-MS를 사용하여 그 결과로 생긴 정제된 공액체 (24)을 특성화하였다. 수율 (%): 42. MS: (MH⁺ 계산치: 14478, 실측치: 14492).

실시예 8: Cy5 - 표지된 아지도 PEG (25a)를 이용한 알키닐화 - 애피바디 (22)의 표지

반응식 12

인산나트륨 수용액 (100 mM, pH 8) 36 μL에 알키닐화 애피바디 (22) 용액 (0.6 mM, 인산 완충 염수 내 ~8 mg/mL, pH 7.4) 모액의 분취액 3 μL를 첨가하였다. 그 뒤 방금 제조된 Cy5-표지된 아지도-PEG (25a)의 18 mM 용액 (100 mM 인산나트륨에 희석, pH 8)의 분취액 1 μL를 첨가하였다. 그 뒤 이 용액에, 방금 제조된 아스코르브산나트륨 10 mM (2 mg/mL) 용액 (100 mM 인산나트륨 내, pH 8)의 분취액 5 μL를 첨가하였다. 마지막으로, 방금 제조된 황산구리(II) 10 mM (1.6 mg/mL) 현탁액 (100 mM 인산나트륨 내, pH 8)의 분취액 5 μL를 반응 혼합물에 첨가하였다. 이러한 첨가들는 시약 및 기재에 대한 다음의 최종 농도를 산출한다: 알키닐화 애피바디 (22) (36 μM), Cy5-표지된 아지도-PEG (25a) (360 μM), 아스코르브산나트륨 (1 mM), 및 CuSO₄ (1 mM).

그 결과로 생긴 용액을 65 ℃에서 0.75 시간 동안 적당히 교반하여 혼합하였다. 그 뒤 반응 혼합물을 즉시 4 mL 순수한 물 (밀리Q)에 희석시키고 아미콘 원심분리 한외여과 장치, MWCO 5 kDa (밀리포어)를 사용하여 100 μL 미만으로 농축하였다. 이러한 물 희석-농축 순서를 추가로 두 번 반복하여 과량의 시약을 제거하였다. HPLC 및 염료의 형광 방출량을 모니터링하는 SDS-PAGE 단백질 겔로 그 결과로 생긴 정제된 공액체 (26)를 특성화하였다 (도 5).

실시예 9: 열조건 하에서 알키닐화 애피바디 (22) 위 트리아졸 형성

반응식 13

¹⁸ F로 안티 - Her2 애피바디 (22)의 표지. 황산구리(II) 수용액 (5 μL, 0.0249 mg, 0.1 μmol)을 인산나트륨 완충액 (5 μL, 100 mM, pH 8.0) 내 아스코르브산나트륨 (0.198 mg, 1 μmol) 및 PBS (5 μL) 내 알키닐화 애피바디 (22) (50 μg, 3.57 nmol)와 함께 혼합하였다. MeCN (20 μl) 내 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11) (264 μCi, 9.8 MBq, 2007년 글래서, M., 및 아스타드, E.에 의해 기술된 문헌 ["Click labeling" with 2-[¹⁸F]fluoroethylazide for Positron Emission Tomography. Bioconj. Chem. 18, 989-993]에 의해 제조, 본 명세서에 참조로 포함됨)의 첨가 후, 혼합물을 60 ℃에서 30 분간 가열하였다. 반응 혼합물의 2-[¹⁸F]플루오로에틸아지드 (11)로의 표지 HPLC 분석은 애피바디 (27) UV 신호로 방사성 피크 공동-용리를 나타낸다.

정제용 HPLC (구배: 15 분에 걸쳐 5 내지 80 % 용매 B이며, A = H₂O/0.1 % TFA 및 B = MeCN/0.1 % TFA, 흐름 속도: 1 mL/분; 컬럼: 루나 3 μm C18(2) (페노메넥스), 50 x 4.6 mm, 검출: UV 280 nm)에 의한 정제. 도 1은 ¹⁸F 클릭 표지된 안티-Her2 애피바디 (27)을 나타내는 비-최적화 시스템의 반응 혼합물의 HPLC 분석을 나타낸다 (a, 방사성 채널; b, 280 nm UV 채널).

본 발명은 그들의 사상 또는 기본적 특성으로부터 벗어남 없이 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 따라서 앞서 기술한 실시예들은 모든 점에서 본 명세서에 기술된 발명에 대한 제한이 아닌 예시로써 고려되어야 한다. 따라서 본 발명의 범위는 앞서 기술한 구체적인 내용이 아닌 첨부된 청구항에 명시되고, 따라서 청구항과 동등한 의미 및 범위 이내의 모든 변화들이 거기에 포괄되는 것을 의도하였다.

Claims

(i) 티올-반응성 말단 및 아지도 또는 알킨-반응성 말단을 포함하는 연결기를 제공하고;
(ii) 연결기의 티올-반응성 말단을 하나 이상의 티올기 또는 그들의 반응성 유도체를 포함하는 생체분자와 반응시키고;
(iii) 차후에 연결기의 아지도 또는 알킨-반응성 말단을 불소-치환된 아지드 또는 알킨기와 반응시키는 것을 포함하는,
생체분자 위로의 불소 원자 도입 방법.
제1항에 있어서, 상기 생체분자가 50 초과의 아미노산 잔기를 가지는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체분자가 애피바디인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티올-반응성 말단이 티올기와 티올 교환 반응을 할 수 있는 말레이미도기, 할로지방족기, 할로방향족기, 할로지환족기, (할로아세틸)알킬기, (할로아세틸)시클로알킬기, (할로아세틸)아릴기, 비닐술폰기, 아크릴로일기, 에폭시기, 아지리딘기, 및 이황화물기로부터 선택되는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 티올기가 시스테인 잔기 또는 티올-함유 비자연적 아미노산을 포함하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결기의 티올-반응성 말단이 말레이미도기인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체분자의 반응성 유도체가 생체분자를 환원제로 처리하여 제조되는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결기가:

로부터 선택되는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결기가 아민 화합물과 카르복실산 또는 활성화된 에스테르 화합물이 반응하여 연결기를 형성하는 것을 포함하는 방법으로 제조되고; 상기 아민 화합물이 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하고 카르복실산 또는 활성화된 에스테르 화합물이 티올-반응성 관능기를 포함하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불소-치환된 아지드 또는 알킨이 ¹⁸F 치환된 아지드 또는 알킨 또는 ¹⁹F 치환된 아지드 또는 알킨, 바람직하게는 ¹⁸F 치환된 아지드 또는 알킨을 포함하는 방법.
(i) 말-알킨 이관능성 연결기의 티올-반응성 말단을 하나 이상의 티올기를 포함하는 생체분자와 반응시키고;
(ii) 차후에 알킨기를 불소-치환된 아지드기와 반응시키는 것을 포함하는,
생체분자 위로의 불소 원자 도입 방법.
(i) 말-아지드 이관능성 연결기의 티올-반응성 말단을 하나 이상의 티올기를 포함하는 생체분자와 반응시키고;
(ii) 차후에 아지드기를 불소-치환된 알킨기와 반응시키는 것을 포함하는,
생체분자 위로의 불소 원자 도입 방법.
제11항에 있어서, 상기 불소-치환된 아지드기가 ¹⁸F 치환된 아지드 또는 ¹⁹F 치환된 아지드기, 바람직하게는 ¹⁸F 치환된 아지드기를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 불소-치환된 알킨기가 ¹⁸F 치환된 알킨 또는 ¹⁹F 치환된 알킨기, 바람직하게는 ¹⁸F 치환된 알킨을 포함하는 방법.
(i) 하나 이상의 티올기를 포함하는 생체분자; 및
(ii) 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하는 아민 화합물을 티올-반응성 관능기를 포함하는 카르복실산 또는 활성화된 에스테르와 반응시키는 것을 포함하는 방법으로 제조되는 연결기
로부터 유도된 구조 단위를 포함하는 생체공액체.
제15항에 있어서, 상기 활성화된 에스테르가 구조식:
L-M-COR²
을 포함하며, 이때 L은 티올-반응성 관능기, 또는 그들의 보호된 유도체를 포함하고; M은 2가 연결 단위이고; R²는 OH 또는 활성화기인 생체공액체.
제15항에 있어서, 상기 아민 화합물이 구조식:
G-J-R¹
을 포함하며, 이때 G는 아민이고, J는 2가 연결 단위이고, R¹은 아지도 또는 알킨-반응성 관능기인 생체공액체.
제15항에 있어서, 상기 생체분자가 애피바디인 생체공액체.
제17항에 있어서, 상기 연결 단위가 아지도 또는 알킨-반응성 관능기를 포함하는 아민 화합물을 티올-반응성 관능기를 포함하는 카르복실산 또는 활성화된 에스테르 화합물과 반응시키는 것을 포함하는 방법으로 제조되는 생체공액체.
화학식
L-M-CO-NH(R¹)-J-G
을 포함하며, 이때 L은 티올-반응성 관능기이고; M 및 J는 2가 연결 단위이고; R¹은 H, 지방족 라디칼, 방향족 라디칼, 또는 지환족 라디칼이고; G는 아지도 또는 알킨-반응성 관능기인 연결기의 조성물.
제21항에 있어서, 상기 연결기가:

로부터 선택되는 연결기의 조성물.