KR20100075568A

KR20100075568A - 글리코겐 포스포릴라아제 억제제 화합물 및 이의 약제 조성물

Info

Publication number: KR20100075568A
Application number: KR1020107009325A
Authority: KR
Inventors: 피에르트 반커; 스코트 하워드 딕커슨; 둘스 마리아 가리도; 스티븐 미거 스파크스; 프란시스 엑스 타바레스; 스테판 앤드류 톰슨
Original assignee: 글락소스미스클라인 엘엘씨
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2008-09-25
Publication date: 2010-07-02
Also published as: AU2008309004A1; CO6321157A2; MX2010003442A; DOP2010000088A; JP2010540553A; EA201000392A1; MA31775B1; BRPI0817445A2; CN101861303A; CR11397A; ZA201002182B; EP2197845A1; US20100234433A1; WO2009045831A1; CA2701020A1

Abstract

본 발명은 글리코겐 포스포릴라아제 억제제인 신규 화합물, 및 당뇨 및 그와 관련된 다른 질환에서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 화합물을 함유하는 약제 조성물, 및 상기 화합물 및 상기 약제 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

글리코겐 포스포릴라아제 억제제 화합물 및 이의 약제 조성물{GLYCOGEN PHOSPHORYLASE INHIBITOR COMPOUND AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF}

본 발명은 글리코겐 포스포릴라아제 억제제 화합물, 상기 화합물의 약제 조성물, 당뇨병 및 당뇨병과 관련된 질환 및/또는 조직 허혈, 예를 들어, 심근 허혈의 치료에서의 상기 화합물 또는 상기 화합물을 함유하는 약제 조성물의 용도, 및 상기 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

당뇨병의 치료는 많은 국가에서 보건 관심사로 남아있다. 인슐린의 자가 주사에 비해 최소의 바람직하지 않은 부작용을 갖는 경구 섭취 약물이 요망된다. 부작용이 적거나, 오래 작용하거나, 다양한 메커니즘을 통해 작용하는, 보다 나은 약물이 지속적으로 요구되고 있다.

당뇨병의 치료를 위해 다수의 약물이 이용가능하다. 이들은 주사되는 인슐린 및 약물, 예를 들어, 술포닐우레아, 글리피지드(glipizide), 토부타미드(tobutamide), 아세토헥사미드(acetohexamide), 톨라지미드(tolazimide), 비구아니드(biguanide), 및 경구 섭취되는 메트포르민(metformin)(글루코파아지(glucophage))을 포함한다. 경구 섭취되는 약물이 효과적이지 않은 당뇨병 환자에서는 인슐린 자가 주사가 요구된다. 타입 1 당뇨병(인슐린 의존성 당뇨병으로도 언급됨)을 가진 환자는 보통 인슐린을 자가 주사함으로써 치료된다. 타입 2 당뇨병(비-인슐린 의존성 당뇨병으로도 언급됨)을 가진 환자는 보통 식이, 운동 및 경구 제제의 조합으로 치료된다. 경구 제제가 실패하는 경우, 인슐린이 처방될 수 있다. 당뇨병 약물이 경구 섭취되는 경우, 보통 다수의 매일의 용량을 필요로 한다.

인슐린의 적절한 투여량의 결정은 환자의 뇨 및/또는 혈액에서의 당 수준의 빈번한 시험을 필요로 한다. 인슐린의 과도한 용량의 투여는 일반적으로 혈중 글루코오스에서의 가벼운 이상으로부터 혼수, 심지어 사망까지 다양한 증상을 갖는 저혈당증을 초래한다. 경구 섭취되는 약물도 마찬가지로 바람직하지 않은 부작용이 존재한다. 예를 들어, 상기 약물은 몇몇 환자에서 효과적이지 않고, 위장 장애를 초래할 수 있거나, 다른 개체에서 적절한 간 기능을 손상시킬 수 있다. 보다 적은 부작용을 갖는 개선된 약물 및/또는 실패한 다른 약물에 비해 성공적인 약물을 항상 필요로 한다.

타입 2 또는 비-인슐린 의존성 당뇨병에서, 간 글루코오스 생성이 중요한 표적이다. 간은 공복 상태에서 혈장 글루코오스 수준의 주요 조절자이다. 타입 2 환자에서의 간 글루코오스 생성 속도는 비-당뇨병 개체에 비해 통상적으로 유의하게 증가된다. 타입 2 당뇨병에 대해, 급식 또는 식후 상태에서, 간은 전체 혈장 글루코오스 공급에서 비례적으로 작아진 역할을 갖고, 간 글루코오스 생성은 비정상적으로 높다.

간은 글리코겐 분해(글루코오스 중합체 글리코겐의 분해) 및 글루코오스 신합성(2- 및 3-탄소 전구물질로부터의 글루코오스의 합성)에 의해 글루코오스를 생성한다. 따라서, 글리코겐 분해는 간 글루코오스 생성 방해에 중요한 표적이다. 글리코겐 분해가 타입 2 당뇨병 환자에서 부적절한 간 글루코오스 생산에 기여할 수 있음을 제안하는 몇몇의 증거가 존재한다. 에르스 질환(Hers' disease) 또는 글리코겐 포스포릴라아제 결핍과 같은 간 글리코겐 저장 질환을 갖는 개체는 종종 발작적 저혈당증을 나타낸다. 추가로, 정상적인 흡수후 인간에서, 약 75% 이하의 간 글루코오스 생성이 글리코겐 분해로부터의 결과로 추정된다.

글리코겐 분해는 효소 글리코겐 포스포릴라아제의 조직 특이적 이소형(isoform)에 의해 간, 근육 및 뇌에서 일어난다. 이러한 효소는 글리코겐 거대분자를 분해하여 글루코오스-1-포스페이트 및 짧아진 글리코겐 거대분자를 방출시킨다.

글리코겐 포스포릴라아제 억제제는 글루코오스 및 이의 유사체, 카페인 및 기타 퓨린 유사체, 다양한 치환기를 갖는 고리형 아민, 아실 우레아, 및 인돌 유사 화합물을 포함한다. 이러한 화합물 및 글리코겐 포스포릴라아제 억제제는 일반적으로 간 글루코오스 생성을 감소시키고, 혈당증을 낮춤으로써 타입 2 당뇨병의 치료에 잠재적으로 유용한 것으로 가정되었다. 또한, 글리코겐 포스포릴라아제 억제제가 혈액 중의 글루코오스 농도에 민감한 것이 바람직한 것으로 생각된다.

따라서, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련된 질환의 치료를 위한 신규 화합물 및 이를 함유하는 약제 조성물이 요망된다.

발명의 개요

본 발명은 하기 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체를 제공한다:

화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체를 포함하는 약제 조성물이 또한 제공된다.

또한, Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.

화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 약제 조성물을 포유동물, 특히 인간에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 추가로 제공되며, 여기서 상기 치료는 당뇨병, 당뇨병과 관련된 질환, 및 심근 허혈을 포함하는 조직 허혈로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 질환에 대한 것이다.

추가로, 활성 치료 물질로 사용(요법에서 사용)하기 위한 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체가 제공된다. 또한, 포유동물, 특히 인간에서 당뇨병, 당뇨병과 관련된 질환, 및/또는 심근 허혈을 포함하는 조직 허혈의 치료에 사용하기 위한 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체가 제공된다.

화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체의 제조 방법이 또한 제공된다.

발명의 상세한 설명

근육 조직에서의 글리코겐 포스포릴라아제의 활성은 글루코오스의 생성 및 이후의 에너지 수요에서 중요하다. 운동 시에 근육 글리코겐 포스포릴라아제의 억제는 근 약화 및 근 조직 손상을 초래할 수 있다. 따라서, 포유동물에 경구 제공되는 경우 근육에 비해 간에서 글리코겐 포스포릴라아제에 대해 보다 큰 효과를 나타내는 본 발명의 화합물을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 화합물은 경구 투여 후에 근육 글리코겐 함량 및 기능에 대해 거의 영향을 미치지 않고, 간 글리코겐 함량에 강한 영향을 나타낸다. 결과적으로, 본 발명의 화합물은 생체내 활성에서 효력을 나타낼 수 있고, 허용가능한 가용성 및 생체이용율 특성을 가질 수 있고, 간 조직에 대한 이의 선택성의 견지에서 개선된 안전성/독성 프로파일을 가질 수 있다.

화학식 Ⅰ의 화합물에 대한 화학명은 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({2-{[({2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]페닐}아미노)카르보닐]아미노}-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)트레오닌이다.

화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체는 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다(예를 들어, 이는 하나 이상의 비대칭 탄소 원자를 함유한다). 개별적 입체이성질체(거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체) 및 이의 혼합물이 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명은 또한 하나 이상의 키랄 중심이 반전된 화학식 Ⅰ의 화합물의 이성질체와의 혼합물로서 화학식 Ⅰ의 화합물(또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체)의 개별적 이성질체를 포함한다. 마찬가지로, 화학식 Ⅰ의 화합물(또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체)이 화학식에 나타낸 것 이외의 토토머 형태로 존재할 수 있고, 이러한 토토머 형태 또한 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본 발명은 상기에 정의된 특정 기의 모든 조합 및 서브셋(subset)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 입체이성질체의 혼합물 뿐만 아니라 정제된 거울상 이성질체 또는 거울상 이성질체/부분입체 이성질체 풍부 혼합물을 포함한다. 또한, 화학식 Ⅰ의 화합물의 개별적 이성질체 뿐만 아니라 이러한 개별적 이성질체의 임의의 전적으로 또는 부분적으로 평형화된 혼합물이 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명은 또한 상기 화학식의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 유도체의 개별적 이성질체 뿐만 아니라, 하나 이상의 키랄 중심이 반전된 상기 화학식의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 유도체의 이성질체와의 혼합물을 포함한다. 본 발명은 상기 정의된 특정 기의 모든 조합 및 서브셋을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 화합물의 바람직한 입체화학성은 하기 화학식 ⅠA로 표시된다:

본 발명의 화합물이 또한 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체의 형태로 이용될 수 있음이 당업자에 의해 인지될 것이다.

전형적으로 그러나 절대적인 것은 아니지만, 본 발명의 염은 약제학적으로 허용되는 염이다. 용어 "약제학적으로 허용되는 염" 내에 포함된 염은 본 발명의 화합물의 비-독성 염을 의미한다. 본 발명의 화합물의 염은 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기 산 또는 염기로부터 형성된 통상적인 염, 및 4차 암모늄 염을 포함할 수 있다. 이들 염은 산 부가 염을 포함할 수 있다. 일반적으로, 염은 약제학적으로 허용되는 무기 및 유기 산으로부터 형성된다. 적합한 산 염의 더욱 구체적인 예에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 포름산, 락트산, 알레산(aleic acid), 타르타르산, 시트르산, 팔모산(palmoic acid), 말론산, 히드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 황부산(fumic acid), 톨루엔술폰산, 메탄술폰산(메실레이트), 나프탈렌-2-술폰산, 벤젠술폰산, 히드록시나프토산, 히드로요오드산, 말산, 테로산(teroic acid), 탄닌산, 스테로산 등이 포함된다.

자체적으로는 약제학적으로 허용되는 것이 아닌 옥살산 및 트리플루오로아세테이트와 같은 다른 산도 본 발명의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 얻는데 있어서 중간체로서 유용한 염의 제조에 유용할 수 있다. 적합한 염기성 염의 더욱 구체적인 예에는 나트륨, 리튬, 칼륨, 마그네슘, 알루미늄, 칼슘, 아연, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 및 프로카인 염이 포함된다.

다른 대표적인 염에는 아세테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 비타르트레이트, 보레이트, 칼슘 에데테이트, 캄실레이트, 카보네이트, 클라불라네이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜리라사닐레이트(glycollylarsanilate), 헥실레조르시네이트, 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 히드록시나프토에이트, 요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우레이트, 말레이트(malate), 말레에이트(maleate), 만델레이트, 메실레이트, 메틸술페이트, 모노포타슘 말레에이트, 뮤케이트, 납실레이트, 니트레이트, 옥살레이트, 파모에이트(엠보네이트), 팔미테이트, 판토테네이트, 포스페이트/디포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 서브아세테이트, 숙시네이트, 술페이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트, 트리에티오다이드, 및 발레레이트가 포함된다.

본원에서 사용되는 용어 "용매화물"은 용질(본 발명에서는, 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염 또는 생리학적 기능성 유도체) 및 용매에 의해 형성된 화학량론적 복합체를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 용매는 용질의 생물학적 활성을 방해하지 않을 수 있다. 적합한 용매의 비제한적인 예는 물, 메탄올, 에탄올 및 아세트산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 사용된 용매는 약제학적으로 허용되는 용매이다. 가장 바람직하게는 사용된 용매는 물이고, 용매화물은 수화물이다.

본원에서 사용되는 용어 "생리학적 기능성 유도체"는 포유동물에 투여된 후, 본 발명의 화합물 또는 이의 활성 대사산물을 (직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 본 발명의 화합물의 임의의 약제학적으로 허용되는 유도체를 의미한다. 이러한 유도체, 예를 들어, 에스테르 및 아미드는 과도한 실험 없이도 당업자에게 명백할 것이다. 생리학적 기능성 유도체를 교시하는 범위가 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5^th Edition, Volume 1: Principles and Practice]의 교시내용이 참조될 수 있다.

화학식 Ⅰ의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 및 생리학적 기능성 유도체의 제조 방법은 일반적으로 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5^th Edition, Volume 1: Principles and Practice]을 참조하라.

화학식 Ⅰ의 화합물(또는 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체)은 편리하게는 하기 기재되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 전술한 단계의 순서는 본 발명의 실시에서 중요하지 않고, 방법은 당업자의 지식을 기초로 하여 임의의 적합한 순서로 단계를 수행함으로써 실시될 수 있다. 또한, 기재된 단계 중 일부는 모든 중간 화합물의 분리 없이 조합될 수 있다.

화학식 I의 화합물을 합성하기 위한 하나의 일반적인 방법이 하기 반응도식 1에 요약되어 있다. 상업적으로 입수가능한 출발 물질 메틸 4-클로로-2-니트로벤조에이트(2) 및 [(6-(메틸옥시)-3-피리디닐]보론산(3)은, 중간체 4를 얻기 위해 표준 조건 하에서, 이로 제한되는 것은 아니나 디클로로비스(트리시클로헥실포스핀)팔라듐(II) 또는 디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 또는 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐과 같은 촉매를 이용하여, 세슘 플루오라이드 또는 탄산나트륨과 같은 염기의 존재하 아세토니트릴 또는 DME 및 물과 같은 용매 중에서 커플링될 수 있다. 수산화리튬 또는 수산화나트륨과 같은 염기성 조건 하, 테트라히드로푸란(THF) 및/또는 메탄올(MeOH) 및/또는 물 및/또는 1,4-디옥산을 포함하는 용매 중에서 중간체 4의 에스테르를 가수분해시키면 상응하는 카르복실산(5)이 얻어진다.

중간체 7은 표준 커플링 조건 하에서 카르복실산(5)을 메틸 O-(1,1-디메틸에틸)-L-트레오니네이트(6) 또는 이의 히드로클로라이드 염과 혼합시킴에 의해 형성된다. 이러한 조건에는 이로 제한되는 것은 아니나, 실온에서의 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드), PyBop (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyBrOP (브로모-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트), HOBT (N-히드록시벤조트리아졸), HOAT (N-히드록시-9-아자벤조트리아졸), 또는 DIC (N,N'-디이소프로필카르보디이미드) 또는 HATU (2-(1H-9-아자벤조트리아즉솔-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 및 DIEA (N,N-디이소프로필에틸아민) 또는 트리에틸아민의 사용이 포함된다. 사용될 수 있는 용매에는 DMSO, NMP, 또는 바람직하게는 DMP가 포함된다. 바람직한 하나의 방법에서, 중간체 5 및 6은 1-프로판포스폰산 시클릭 무수물 및 DIEA 또는 트리에틸아민과 같은 유기 염기의 존재하 에틸 아세테이트 중에서 조합되어 중간체 7이 생성된다.

이들로 제한되는 것은 아니나, 수소 분위기 하에 에틸 아세테이트 또는 메탄올과 같은 용매 중에서 탄소상 팔라듐을 이용하여 처리하는 것과 같은 표준 조건 하에서 중간체 7의 니트로 기를 환원시키면 중간체 8이 생성된다.

중간체 10은 DMF와 같은 용매 중에서 중간체 8을 이소시아네이트, 중간체 9(하기 반응 도식 2에 요약된 합성 방법)와, 그리고 디이소프로필에틸아민(DIEA) 또는 트리에틸아민과 혼합시킴에 의해 형성된다. 바람직하게는 중간체 8 및 9는 피리딘 중에서 배합되어 중간체 10을 생성한다.

최종 생성물은 테트라히드로푸란(THF) 및/또는 메탄올(MeOH) 및/또는 물 및/또는 1,4-디옥산을 포함하는 용매 중에서 수산화리튬 또는 수산화나트륨과 같은 염기성 조건 하에서 중간체 10의 에스테르를 절단시킴으로써 형성된다.

반응 도식 1: 화학식 I의 화합물의 합성

화학식 I의 다른 이성질체의 합성은 화학식 6의 라세미체를 포함하는 상응하는 이성질체를 이용함으로써 수행될 수 있다.

중간체 9의 합성을 위한 하나의 일반적인 방법은 하기 반응 도식 2에 요약되어 있다. 11을 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트의 존재하에 나트륨 보로히드라이드로 환원시키면 중간체 12가 생성될 것이다. 중간체 12의 메틸화는 중간체 13을 생성하도록, 수소화나트륨과 같은 염기를 이용하여 처리한 후에, DMF 또는 NMP와 같은 용매 중에서 요오도메탄 또는 디메틸 술페이트와 같은 메틸화제를 이용하여 처리함으로써 수행될 수 있다. 마찬가지로 12는 중간체 13을 생성하도록, 톨루엔(양쪽성 상 시스템) 중에서 벤질 트리에틸암모늄 클로라이드 또는 수성 수소화나트륨의 존재 하에 디메틸 술페이트와 반응할 수 있다. 다른 방법에서, 중간체 12는 디클로로메탄 중에서의 포스포러스 트리브로마이드를 이용한 처리와 같은 표준 조건을 이용하여 상응하는 브로마이드로 전환될 수 있다. 생성되는 브로마이드는 메탄올 중에서의 메톡시화나트륨를 이용하여 처리함으로써 중간체 13으로 전환될 수 있다. 중간체 13의 환원은, 중간체 14를 생성하도록, 에탄올 및/또는 물과 같은 용매 중에서 수산화나트륨과 같은 염기 및 아연을 이용한 처리에 의해 수행될 수 있다. 대안적인 방법에서, 중간체 13의 환원은 에탄올과 같은 용매 중에서 수소 및 PtO₂를 이용한 처리에 의해 수행될 수 있다. 그 후 중간체 9는 디클로로메탄과 같은 용매 중에서 DIEA와 같은 염기 및 포스겐 또는 트리포스겐으로 중간체 14를 처리함으로써 얻어진다.

반응 도식 2: 중간체 9의 합성

본 발명은 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체 및 하나 이상의 부형제(약제학 분야에서는 담체 및/또는 희석제로도 언급됨)를 포함하는 약제 조성물(약제 제형으로도 언급됨)을 추가로 제공한다. 부형제는 제형의 다른 성분과 상용성이 있고 이의 수용체(즉, 환자)에게 유해하지 않는 의미에서 허용된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체와 하나 이상의 부형제를 혼합(뒤섞는)시키는 것을 포함하는, 약제 조성물의 제조 방법이 제공된다.

약제 조성물은 단위 용량당 소정량의 활성 성분을 함유하는 단위 용량 형태일 수 있다. 이러한 단위는 치료적 유효량의 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체 또는 치료적 유효량의 분획을 함유하여, 다수의 단위 투여 형태가 요망되는 치료적으로 효과적인 용량을 달성하기 위해 제공된 시간에 투여될 수 있다. 바람직한 단위 투여 제형은 본원의 상기 언급된 바와 같은 매일의 용량 또는 서브용량(sub-dose), 또는 이의 적절한 분획의 활성 성분을 함유하는 것들이다. 또한, 이러한 약제 조성물은 약제학 분야에서 널리 공지된 방법 중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

약제 조성물은 임의의 적절한 경로, 예를 들어, 경구(협측 또는 설하를 포함함), 직장, 비내, 국소(협측, 설하 또는 경피를 포함함), 질내 또는 비경구(피하, 근내, 정맥내 또는 경피를 포함함) 경로에 의한 투여에 적합될 수 있다. 이러한 조성물은 약학 분야에서 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 활성 성분과 부형제(들)을 회합시킴으로써 제조될 수 있다.

경구 투여를 위해 적합화되는 경우, 약제 조성물은 별개의 단위, 예를 들어, 정제 또는 캡슐; 분말 또는 과립; 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액; 음용성 포말 또는 휘프(whip); 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물(또는 이의 염, 용매화물 또는 유도체) 또는 본 발명의 약제 조성물은 "신속 용해(quick-dissolve)" 의약으로 투여하기 위해 캔디, 웨이퍼(wafer), 및/또는 텅 테이프(tongue tape) 제형으로 혼입될 수 있다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐 형태의 구강 투여를 위해, 활성 약물 성분은 경구용의 비독성의 약제학적으로 허용되는 비활성 담체, 예를 들어, 에탄올, 글리세롤, 물 등과 조합될 수 있다. 분말 또는 과립은 화합물을 적합한 미세 크기로 분쇄시키고, 유사하게 분쇄된 약제학적 담체, 예를 들어, 음용성 탄수화물, 예를 들어, 전분 또는 만니톨과 혼합시킴으로써 제조된다. 착향제, 보존제, 분산제 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.

캡슐은 상기 기재된 바와 같이 분말 혼합물을 제조하고, 형성된 젤라틴 또는 비-젤라틴성 껍질에 충전시킴으로써 제조된다. 활택제 및 윤활제, 예를 들어, 콜로이드성 실리카, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 고형 폴리에틸렌 글리콜이 충전 작업 전에 분말 혼합물에 첨가될 수 있다. 붕해제 또는 가용화제, 예를 들어, 아가-아가, 탄산칼슘 또는 탄산나트륨이 또한, 캡슐이 섭취되는 경우 의약의 생체이용율을 개선시키기 위해 첨가될 수 있다.

또한, 요망되거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제, 및 착색제가 또한 혼합물에 혼입될 수 있다. 적합한 결합제는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예를 들어, 글루코오스 또는 베타-락토오스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검, 예를 들어, 아카시아, 트래거캔쓰(tragacanth), 알긴산 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한다. 상기 투여 형태에 사용되는 윤활제는 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 아세트산나트륨, 염화나트륨 등을 포함한다. 붕해제는 전분, 메틸셀룰로오스, 아가, 벤토나이트, 잔탄 검(xanthan gum) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

정제는, 예를 들어, 분말 혼합물을 제조하고, 과립화 또는 슬러그화시키고, 윤활제 및 붕해제를 첨가하고, 정제로 압착함으로써 제형화된다. 분말 혼합물은 적합하게 분쇄된 화합물과 상기 기재된 바와 같은 희석제 또는 베이스(base), 및 임의로 결합제, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스, 및 알기네이트, 젤라틴, 또는 폴리비닐 피롤리돈, 용액 지연제, 예를 들어, 파라핀, 재흡수 촉진제, 예를 들어, 4차염, 및/또는 흡수제, 예를 들어, 벤토나이트, 카올린 또는 제2인산칼슘(dicalcium phosphate)을 혼합시킴으로써 제조된다. 분말 혼합물은 결합제, 예를 들어, 시럽, 전분 페이스트, 아카디아 뮤실라게(acadia mucilage) 또는 셀룰로오스 또는 중합 물질의 용액을 습윤화시키고, 스크린을 통과시킴으로써 과립화될 수 있다. 과립화의 대안으로서, 분말 혼합물은 정제 기계를 통해 이동될 수 있고, 상기 결과는 과립으로 분쇄되는 불완전하게 형성된 슬러그이다. 과립은 스테아르산, 스테아레이트 염, 활석 또는 광유의 첨가에 의해 정제 형성 다이(die)로의 접착을 방지하도록 윤활처리될 수 있다. 이후, 윤활된 혼합물은 정제로 압착된다. 본 발명의 화합물(또는 이의 염, 용매화물 또는 유도체)는 또한 자유롭게 유동하는 비활성 담체와 조합될 수 있고, 과립화 또는 슬러그화 단계를 통과하지 않고 직접 정제로 압착될 수 있다. 셸락(shellac)의 밀봉 코트(coat), 당 또는 중합 물질의 코팅, 및 왁스의 광택 코팅으로 구성되는 투명/불투명 보호 코팅이 제공될 수 있다. 다양한 용량을 구별하기 위해 상기 코팅에 색소가 첨가될 수 있다.

경구용 액체, 예를 들어, 용액, 시럽 및 엘릭시르(elixir)가 제공된 양이 소정량의 활성 성분을 함유하도록 하기 위해 투여 단위 형태로 제조될 수 있다. 시럽은 본 발명의 화합물(또는 이의 염, 용매화물 또는 유도체)를 적절하게 착향된 수용액에 용해시킴으로써 제조될 수 있고, 엘릭시르는 비독성 알코올성 비히클의 사용을 통해 제조된다. 현탁액은 본 발명의 화합물(또는 이의 염, 용매화물 또는 유도체)을 비독성 비히클에 분산시킴으로써 제형화될 수 있다. 가용화제 및 유화제, 예를 들어, 에톡실화된 이소스테아릴 알코올 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에테르, 보존제, 착향 첨가제, 예를 들어, 페퍼민트 오일, 천연 감미제, 사카린 또는 다른 인공 감미제 등이 또한 첨가될 수 있다.

적절한 경우, 경구 투여를 위한 투여 단위 제형은 미세캡슐화될 수 있다. 제형은 또한, 예를 들어, 코팅 또는 중합체, 왁스 등의 내에 미립자 물질을 매립(embedding)시킴에 의해 방출을 연장시키거나 지속시키도록 제조될 수 있다.

본 발명에서, 정제 및 캡슐이 약제 조성물의 전달에 바람직하다.

본원에서 사용되는 용어 "치료"는 예방을 포함하고, 특정 질환의 경감, 질환의 하나 이상의 증상의 제거 또는 감소, 질환 진행의 지연 또는 제거, 및 이전에 병에 걸리거나 진단된 환자 또는 피검체에서의 질환 재발의 방지 또는 지연을 의미한다. 예방(또는 질병 발병의 방지 또는 지연)은 통상적으로 발달된 질병 또는 질환을 갖는 환자에게 투여되는 것과 동일하거나 유사한 방식으로 약물을 투여함으로써 달성된다.

본 발명은 당뇨병 또는 관련 질환, 예를 들어, 비만, X 증후군, 인슐린 내성, 당뇨병성 신병증(diabetic nephropathy), 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 고혈당증(hyperglycemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 고지질혈증(hyperlipidemia), 심장혈관병, 뇌졸중, 죽상경화증(atherosclerosis), 지질단백 질환, 고혈압, 조직 허혈, 심근허혈, 및 우울증에 걸린 포유동물, 특히 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 치료는 치료적 유효량의 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체를 상기 포유동물, 특히 인간에 투여하는 단계를 포함한다. 치료는 또한 치료적 유효량의 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체를 함유하는 약제 조성물을 상기 포유동물, 특히 인간에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "유효량"은, 예를 들어, 연구자 또는 임상의에 의해 연구되는 조직, 시스템, 동물, 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 약물 또는 약제학적 작용제의 양을 의미한다.

용어 "치료적 유효량"은 상기 용량이 투여되지 않은 상응하는 피검체와 비교시 질병, 질환 또는 부작용의 향상된 치료, 치유, 예방 또는 개선, 또는 질병 또는 질환의 진행 속도에서의 감소를 발생시키는 임의의 양을 의미한다. 상기 용어는 또한 이의 범위 내에 정상적인 생리학적 기능을 향상시키는데 효과적인 양을 포함한다. 요법에 사용하기 위해, 치료적 유효량의 화학식 Ⅰ의 화합물 뿐만 아니라 이의 염, 용매화물 및 생리학적 기능성 유도체는 원료(raw) 화합물로 투여될 수 있다. 추가로, 활성 성분은 약제 조성물로 제공될 수 있다.

요법에 사용하기 위해, 치료적 유효량의 화학식 Ⅰ의 화합물(또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체)이 원료 화합물로 투여될 수 있으나, 이는 통상적으로 약제 조성물 또는 제형의 활성 성분으로 제공된다.

본 발명의 화합물(또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체)의 정확한 치료적 유효량은 치료되는 피검체(환자)의 연령 및 체중, 치료를 필요로 하는 정확한 질환 및 이의 중증도, 약제학적 제형/조성물의 특성, 및 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 요인에 좌우될 것이며, 이는 궁극적으로 주치의 또는 수의사의 재량에 따를 것이다. 통상적으로, 화학식 Ⅰ의 화합물(또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체)은 하루당 수용체(환자, 포유동물)의 체중 kg 당 약 0.1 내지 100 mg의 범위, 더욱 일반적으로 하루당 체중 kg당 0.1 내지 10 mg의 범위로 치료를 위해 제공될 것이다. 허용가능한 일일 투여량은 약 1 내지 약 1000 mg/일, 바람직하게는 약 1 내지 약 100 mg/일일 수 있다. 이러한 양은 전체 일일 용량이 동일하게, 하루당 단일 용량 또는 하루당 다수의 서브-용량(예를 들어, 2, 3, 4, 5회 이상)으로 제공될 수 있다. 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체의 유효량은 화학식 Ⅰ의 화합물 자체의 유효량의 비율에 따라 결정될 수 있다. 유사한 투여량이 치료를 위한 본원에 언급된 다른 질병의 치료(예방 포함)를 위해서도 적절해야 한다. 일반적으로, 적절한 용량의 결정은 의약 또는 약학 분야의 당업자에 의해 용이하게 도출될 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체, 또는 하나 이상의 다른 항당뇨 약물을 갖는 상기 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체의 약제 조성물을 포함한다. 이러한 항당뇨 약물은, 예를 들어, 주사되는 인슐린 및 약물, 예를 들어, 경구 섭취되는 술포닐우레아, 티아졸리딘디온, 글리피지드, 글리메피라이드(glimepiride), 토부타미드, 아세토헥사미드, 톨라지미드, 비구아니드, 로시글리타존(rosiglitazone), 메트포르민(글루코파아지), 시타글립틴(sitagliptin)(자누비아(Januvia)) 염 또는 이의 조합물 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물이 또 다른 항당뇨 약물과 조합되어 사용되는 경우, 조합물의 각각의 화합물 또는 약물의 용량이, 상기 약물 또는 화합물이 단독으로 사용되는 경우의 용량과 상이할 수 있음을 당업자는 인지할 것이다. 적절한 용량은 당업자에 의해 용이하게 인지되고 결정될 것이다. 화학식 Ⅰ의 화합물(또는 이의 염, 용매화물, 생리학적 기능성 유도체) 및 다른 치료학적 활성제(들)의 적절한 용량, 및 투여의 상대적인 시간조절(timing)이 요망되는 조합된 치료 효과를 달성하기 위해 선택될 것이고, 이는 주치의 또는 임상의의 의견 및 재량에 따른다.

실험예

하기 실시예는 단지 예시를 위한 것으로 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하려는 것이 아니며, 본 발명은 하기 첨부된 특허청구범위에 의해 규정된다. 다르게 언급되지 않는 한, 시약은 상업적으로 입수되거나 문헌에 기재된 과정에 따라 제조된다.

실시예 1: 화학식 IA의 화합물: O-(1,1-디메틸에틸)-N-({2-{[({2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]페닐}아미노)카르보닐]아미노}-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-L-트레오닌의 제조

단계 1. 메틸 4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로벤조에이트

2개의 마이크로웨이브 바이알 각각에 메틸 4-클로로-2-니트로벤조에이트(0.5g, 2.32mmol), [6-(메틸옥시)-3-피리디닐]보론산(0.51g, 3.48mmol) 디클로로비스(트리시클로헥실포스핀)팔라듐(II)(0.137g, 0.186mmol) 및 세슘 플루오라이드(1.76g, 11.6mmol)을 충전시켰다. 각각의 바이알에, 아세토니트릴(9mL) 및 물(1.5mL)을 첨가하였다. 각각의 바이알을 150℃에서 6분 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, 바이알의 내용물을 합하고, 에틸 아세테이트(100mL)로 희석시키고, 50% 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축하였다. 이 물질을 다른 0.5g 규모 (4-클로로-2-니트로벤조에이트) 반응물과 합하고, 헥산/에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 2.0g의 생성물을 황색 오일로 수득하였다:

단계 2. 4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로벤조산

물(15mL) 중의 수산화리튬 일수화물(1.748g, 41.6mmol)을, THF(50mL) 및 메탄올(20mL) 중의 메틸 4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로벤조에이트(2.0g, 6.94mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 약 4.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1N 수성 HCl(100mL)로 산성화시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켜 1.9g(100% 수율)의 회백색 고형물을 수득하였다.

단계 3. 메틸 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로페닐}카르보닐)-L-트레오니네이트

HATU(3.95g, 10.4mmol)를, DMF(100mL) 중의 4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로벤조산(1.90g, 6.93mmol), 메틸 O-(1,1-디메틸에틸)-L-트레오니네이트 히드로클로라이드(1.72g, 7.6mmol) 및 디이소프로필에틸아민(1.79g, 13.86mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 약 24시간 동안 교반하였다. 감압하에서 DMF의 대부분을 제거시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(100mL) 중에 용해하고 1N HCl(50mL), 포화된 중탄산나트륨(50mL) 및 염수(50mL)로 세척하였다. 에틸 아세테이트 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 헥산/에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 2.9g(94% 수율)의 생성물을 황갈색 오일로 수득하였다:

단계 4. 메틸 N-({2-아미노-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-O-(1,1-디메틸에틸)-L-트레오니네이트

팔라듐(탄소상 10%, 2.0g)을 질소 분위기 하에 메탄올(125mL) 중의 메틸 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로페닐}카르보닐)-L-트레오니네이트(2.90g, 6.51mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 배출시키고 수소로 플러싱시켰다. 그 후 혼합물을 수소 분위기 하에서 약 18시간 동안 교반하였다. 질소로 플러싱시킨 후에, 혼합물을 여과하고, 용매를 감압 하에서 증발시켜 2.45g(91% 수율)의 생성물을 포말로 수득하였다.

단계 5. (3,5-디메틸-4-니트로페닐)메탄올

THF(100mL) 중의 나트륨 보로히드라이드(2.91g, 76.7mmol)의 현탁액에 3,5-디메틸-4-니트로벤조산(8.5g, 43.55mmol)을 첨가하고, 약 5분 동안 교반한 후에, 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트(14.53g, 102.4mmol)를 적가하였다. 반응물을 실온에서 약 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 물(150mL)에 천천히 붓고, 에틸 아세테이트(2 × 300mL)로 추출하고, 유기 상을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜, 8.05g(102% 수율)의 생성물을 회백색 고형물로 수득하였다.

단계 6. 1,3-디메틸-5-[(메틸옥시)메틸]-2-니트로벤젠

DMF(150mL) 중의 (3,5-디메틸-4-니트로페닐)메탄올(7.0g, 38.68mmol)에 수소화나트륨(60% 오일 분산액 1.85g, 46.36mmol)을 첨가하였다. 약 40분 동안 교반시킨 후에, 메틸 요오다이드를 첨가하고 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 물(500mL)을 서서히 첨가하여 반응을 켄칭시키고 에틸 아세테이트(2 ×500mL)로 추출하였다. 유기 상을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔(에틸 아세테이트/헥산) 상에서 크로마토그래피 하여, 5.3g(70%)의 생성물을 수득하였다.

단계 7. 2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]아닐린

1,3-디메틸-5-[(메틸옥시)메틸]-2-니트로벤젠(5.0g, 25.6mmol)을 EtOH(120mL)에 용해하고 80℃로 가온시켰다. 물(10mL) 중의 NaOH(5.9g, 128mmol)의 용액을 첨가하고, 이어서 아연(15g, 230mmol)을 5g씩 첨가하였다. 첨가가 종료되면, 용액을 약 4시간 동안 환류시킨 후에 냉각시키고, 실온에서 3일 동안 교반하였다. 그 후 혼합물을 여과하고, 여액을 농축시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 염수 사이에 분배하였다. 염수 층을 에틸 아세테이트로 추출하고, 합친 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔(에틸 아세테이트/헥산) 상에서 크로마토그래피 하여 4.5g(106%)의 생성물을 오일로 수득하였다:

단계 8. 2-이소시아네이토-1,3-디메틸-5-[(메틸옥시)메틸]벤젠

디클로로메탄(200mL) 중의 2,6-디메틸-4[(메틸옥시)메틸]아닐린(3.45g, 20.88mmol)과 N,N-(디이소프로필)아미노메틸폴리스티렌 (PS-DIEA, 아르고노트, 17.6g, 3.56mmol/g 적재)의 혼합물에 약 2 내지 3분에 걸쳐 포스겐(25% 톨루엔 용액 5.17g, 52.2mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 약 24시간 동안 교반한 다음 여과하여 PS-DIEA를 제거하였다. 감압 하에서 농축시켜 4.0g(100%)의 생성물을 진갈색 오일로 수득하였다.

단계 9. 메틸 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({2-{[({2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]페닐}아미노)카르보닐]아미노}-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-L-트레오니네이트

메틸 N-({2-아미노-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-O-(1,1-디메틸에틸)-L-트레오니네이트(2.45g, 5.89mmol) 및 2-이소시아네이토-1,3-디메틸-5-[(메틸옥시)메틸]벤젠(2.25g, 11.79mmol)을 피리딘(80mL) 중에 용해시키고 약 24시간 동안 교반하였다. 반응물을 감압 하에서 농축시키고 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시키고 여과하였다. 에틸 아세테이트 상을 중탄산나트륨 및 염수로 세척하였다. 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에서 농축시킨 다음, 잔류물을 실리카 겔(에틸 아세테이트/헥산) 상에서 크로마토그래피하여 3.2g(89%)의 생성물을 수득하였다.

단계 10. O-(1,1-디메틸에틸)-N-({2-{[({2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]페닐}아미노)카르보닐]아미노}-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-L-트레오닌

메틸 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({2-{[({2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]페닐}아미노)카르보닐]아미노}-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-L-트레오니네이트(3.2g, 5.27mmol)를 THF(150mL) 및 메탄올(50mL)에 용해시켰다. 여기에 물(50mL) 중의 수산화리튬 일수화물(1.328g, 31.6mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 약 24시간 동안 교반하였다. 이 혼합물에 1N HCl(200mL)을 첨가하고, 이것을 에틸 아세테이트(2 ×300mL)로 추출하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켜 3.16g(100%)의 생성물을 백색 포말로 수득하였다.

실시예 2: 화학식 IA의 화합물의 칼륨 염: 칼륨 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({2-{[({2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]페닐}아미노)카르보닐]아미노}-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-L-트레오니네이트의 제조

아세토니트릴(100mL) 중의 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({2-{[({2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]페닐}아미노)카르보닐]아미노}-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-L-트레오닌(1.0g, 1.69mmol)에 칼륨 t-부톡사이드(THF 중의 1.0M, 1.69mL)를 첨가하였다. 혼합물을 약 15분 동안 교반하고, 용매를 감압하에서 제거하여 생성물을 수득하였다.

생물학적 프로토콜

동물, 특히 포유동물(예를 들어, 인간)의 질병(예를 들어, 본원에 상술된 것)의 치료 또는 예방에서 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체의 유용성은, 하기 기술되는 시험관내 및 생체내 검정을 포함하는, 관련 분야의 당업자에게 공지된 통상적인 검정에서의 활성에 의해 입증될 수 있다.

인간 간 글리코겐 포스포릴라아제 a(HLGPa)로 언급되는, 글리코겐 포스포릴라아제가 활성화된 "a" 상태에 있는 정제된 글리코겐 포스포릴라아제(GP) 효소는 하기 절차에 따라 수득될 수 있다.

인간 간 글리코겐 포스포릴라아제의 적절한 클로닝 및 발현:

인간 간 글리코겐 포스포릴라아제 cDNA를 시판되는 인간 간 cDNA 라이브러리(BD Biosciences)로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. cDNA를 프라이머 5'GGCGAAGCCCCTGACAGACCAGGAGAAG3'와 5'CGATGTCTGAGTGGATTTTAGCCACGCC3' 및 5'GGATATAGAAGAGTTAGAAGAAATTG3'와 5'GGAAGCTTATCAATTTCCATTGACTTTGTTAGATTCATTGG3'를 이용하여 2개의 중첩하는 단편으로 증폭시켰다. PCR 조건은 중합효소 제조업체에 의해 권고된, 효소 Pfu Turbo(Stratagene), 0.5% DMSO, 250uM의 각각의 누클레오티드 트리포스페이트, 및 0.4uM의 각각의 프라이머 + 완충액을 이용한 40주기의 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분이었다. 각각의 PCR 단편을 분자적으로 클로닝시키고, 각각의 삽입물의 DNA 서열을 결정하였다. 이후, 글리코겐 포스포릴라아제 cDNA의 2 DNA 단편을 박테리아 발현 플라스미드 pTXK1007LTev(GlaxoSmithKline)에서 함께 연결시켜, 메티오닌-글리신-알라닌-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-글리신-글리신-글루타메이트-아스파라긴-루신-티로신-페닐알라닌-글루타민-글리신-글리신-에 대한 코돈에 대해 5' 말단에 융합된 전장 cDNA를 생성시켰다. 단백질 생성물은 6X히스티딘 태그(tag) 뒤에 Tev 프로테아제 절단 부위를 가질 것이다. pTXK1007LTev 내의 cDNA의 두 가닥의 DNA 서열을 결정하였다.

인간 간 글리코겐 포스포릴라아제의 정제:

동결된 세포 페이스트(100g)를 해동시키고, 1200mL의 50mM Tris, 100mM NaCl, 15mM 이미다졸, pH 8.0에 현탁시켰다. 세포를 폴리트론(Polytron)(Brinkman, PT10-35)으로 가볍게 파열시키고, AVP 균질화기를 통해 2회 통과시켰다. 대장균 세포 용해질을 45분 동안 27,500 x g에서의 원심분리로 정화시키고, 0.8 마이크론 필터를 통해 여과시켰다. 용액을 50mM Tris, 100mM NaCl 및 15mM 이미다졸, pH 8.0로 미리 평형화된 21mL의 Ni-NTA 수퍼플로우(Superflow)(Qiagen) 컬럼(ID 26mm X H 4.0 cm)에 적용시켰다. 컬럼을, A280이 기준선으로 복귀될때까지 평형화 완충액으로 세척하였다. 약하게 결합된 단백질을 동일한 완충액 중의 10 베드(bed) 컬럼 부피의 50mM 이미다졸을 이용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 글리코겐 포스포릴라아제를 100mM 및 250mM 이미다졸의 단계로 용리시켰다. 100mM 및 250mM 둘 모두의 분획을 풀링(pooling)시킨 후, 50mM Tris, pH 8.0 완충액을 이용하여 5배로 희석시켰다. 이러한 용액을 50mM Tris, pH 8.0로 미리 평형화된 21 mL의 Q 고속 유동 컬럼(fast flow column)(Amersham Pharmacia Biotech AB, ID 2.6cm X H 4.0 cm) 상에 로딩시켰다. 글리코겐 포스포릴라아제를 50mM Tris, pH 8.0(완충액 B) 중의 0-30%의 1M NaCl로부터의 연속 구배로 용리시켰다. 정제된 글리코겐 포스포릴라아제의 15% 내지 20% 완충액 B의 분획을 풀링시키고, 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브로 분취시키고, -80℃에서 보관하였다. 정제된 분획은 SDS-PAGE 겔 상에서 단일의 ~100kd 밴드를 형성하였다.

인간 간 글리코겐 포스포릴라아제의 활성화:

인간 간 글리코겐 포스포릴라아제의 활성화(즉, 비활성 HLGPb 형태의 활성화 HLGPa 형태로의 전환)를 고정된 포스포릴라아제 키나아제를 이용한 HLGPb의 인산화에 의해 달성하였다.

10mg의 포스포릴라아제 키나아제(Sigma, P-2014)를 2.5 mL의 100mM HEPES, 80mM CaCl₂(pH 7.4)에 용해시키고, 동일한 완충액 중에서 미리 평형화된 1mL의 아피-겔(Affi-Gel)(Active Ester Agarose, BioRad # 153-6099) 비드와 가볍게 혼합하였다. 혼합물을 4℃에서 4시간 동안 로킹(rocking)시켰다. 비드를 동일한 완충액으로 1회 세척하고, 50mM HEPES, 1M 글리신 메틸 에스테르, pH 8.0의 용액으로 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 이후, 비드를 50mM HEPES, 1mM β-머캅토에탄올, pH 7.4로 세척하고, 4℃에서 보관하였다.

동결된 정제된 글리코겐 포스포릴라아제(HLGPb)를 4℃에서 해동시킨 후, 50mM HEPES, 100mM NaCl, pH 7.4로 밤새 투석시켰다. 15 mg의 투석된 HLGPb, 3mM ATP 및 5mM MgCl₂를 50mM HEPES, 100mM NaCl, pH 7.4로 평형화된 500ul의 제조된 아피-겔 고정 포스포릴라아제 키나아제 비드와 함께 인큐베이션하였다. 하기 요약된 검정 시스템을 이용하여 10분 간격으로 활성의 증가를 추적함으로써 인산화 정도를 모니터하였다. 간단히, 상기 검정은 0.1 uM 인간 간 글리코겐 포스포릴라아제, 50mM HEPES, 100mM KCl, 2.5mM EGTA, MgCl₂, 3.5mM KH₂PO₄, 0.5mM DTT, 0.4mg/mL 글리코겐, 7.5mM 글루코오스, 0.50mM β-니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드(β-NAD), 3 U/mL 포스포글루코뮤타아제, 및 5 U/mL 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제를 함유하였다. 340 nm에서 NAD⁺의 환원을 추적함으로써 활성을 모니터하였다. 활성의 추가 증가가 관찰되지 않는 경우(30-60분), 혼합물로부터 비드를 제거하여 반응을 중지시켰다. 질량 분광분석법에 의한 샘플의 분석에 의해 인산화를 추가로 확인하였다. 활성화된 샘플을 함유하는 상층액을 50mM HEPES, 100mM NaCl, pH 7.4에서 밤새 투석시켰다. 최종 샘플을 동등한 부피의 글리세롤과 혼합시키고, 마이크로퓨즈 튜브로 분취시키고, -20℃에서 보관하였다.

인간 간 글리코겐 포스포릴라아제 a 효소 활성 검정:

소분자(<1000 Da.) 화합물에 대한 글리코겐 포스포릴라아제의 활성화된 형태(HLGPa)의 반응을 측정하기 위한 효소적 검정을 개발하였다. 상기 검정은 형광 생성물 레조루핀(resorufin)을 생성시키는 포스포글루코뮤타아제, 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제, NADH 옥시다아제 및 호스라디쉬 퍼옥시다아제에 글리코겐 및 무기 포스페이트로부터의 글루코오스-1-포스페이트의 생성을 커플링시킴으로써 약리학적으로 관련된 글리코겐 분해 반응을 모니터하도록 구성되었다. 시약 성분의 농도는 다음과 같았다: 15nM 인간 간 글리코겐 포스포릴라아제 a, 1mg/mL 글리코겐, 5mM K₂HPO₄, 40 U/mL 포스포글루코뮤타아제(Sigma), 20 U/mL 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제(Sigma), 200nM 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) NADH 옥시다아제(Park, H.J.; Kreutzer, R.; Reiser, C.O.A.; Sprinzl, M. Eur . J. Biochem. 1992, 205, 875-879.)에 기재된 바와 같이 제조됨), 2 U/mL 호스라디쉬 퍼옥시다아제(Sigma), 30 uM FAD, 250 uM NAD⁺, 50 uM 암플렉스 레드(amplex red), +/- 10mM 글루코오스. 사용된 염기 검정 완충액은 50mM HEPES, 100mM NaCl, pH 7.6이었다. 글리코겐 포스포릴라아제의 글루코오스-민감성 억제제의 확인을 돕기 위해, 10mM 글루코오스의 존재 또는 부재하에서 검정을 수행하였다. 비-HLGPa 특이적 레조루핀 생성에 기여할 수 있는 성분을 오염시키는 검정을 제거하기 위해, 시약을 2개의 2x 농축된 칵테일(cocktail)로 제조하였다. 카탈라아제 코팅된 아가로오스 비드의 용액을 염기 검정 완충액 중에 제조하였다. 첫번째 칵테일(칵테일 #1)은 테르무스 테르모필루스 NADH 옥시다아제, NAD⁺, 글리코겐, 포스포글루코뮤타아제, 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제, K₂HPO₄, FAD 및 50U/mL 카탈라아제 코팅된 아가로오스 비드 +/- 10mM 글루코오스로 구성되었다. 30분 동안 25℃에서 인큐베이션 후, 이 용액에 암플렉스 레드를 첨가하고, 원심분리 및 상층액 보존에 의해 카탈라아제 코팅된 아가로오스 비드를 제거하였다. 두번째 칵테일(칵테일 #2)은 인간 간 글리코겐 포스포릴라아제-a 및 호스라디쉬 퍼옥시다아제 +/- 10mM 글루코오스를 함유하였다. 본 발명의 화합물과 칵테일 #2의 15분 동안의 예비인큐베이션 후, 반응을 개시하기 위한 칵테일 #1의 첨가로 상기 검정을 수행하였다. 96(black ½ volume Costar #3694) 또는 384-웰 미세역가 플레이트(small volume black Greiner)에서 상기 검정을 수행하였다. 생성물 형성으로 인한 형광의 변화를, 560 nm에서의 여기 및 590 nm에서의 방출과 함께 형광 플레이트 판독기(Molecular Devices SpectraMax M2)에서 측정하였다. 실시예 화합물 1의 활성이 하기 표 1에 도시되어 있다.

표 1: 인간 간 글리코겐 포스포릴라아제 a 효소 검정에서 화합물의 활성.

생체내 글루카곤 공격 모델:

목정맥 삽관한 수컷 CD 래트(220-260g)(Charles Rivers, Raleigh, NC)를 삽관 1-2일 후에 수령하고, 먹이(Lab Diet 5001, PMI Nutrition International, Brentwood, MO) 및 물에 자유롭게 접근가능하게 하여 알파-드리(Alpha-dri™) 베딩(bedding)(Shepherd Specialty Papers, Inc., Kalamazoo, MI)에서 개별적으로 사육하고, 글루카곤 공격 연구 3-4일 전의 기간 동안 21℃ 및 50% 상대 습도에서 12시간의 명/암 주기로 유지시켰다. 연구일에, 래트를 체중에 의해 치료군(N=4-5)으로 분류하고, 깨끗한 알파-드리 베딩을 갖춘 슈 박스(shoe box) 우리에서 개별적으로 사육하였다. 0.2 mL의 혈액을 제거하고 0.2 mL 멸균 염수를 플러싱하여 삽관선을 개봉하였다. 1시간의 순응 후, 혈액 샘플을 수거하여 기준 글루코오스를 측정하고, 래트에 비히클(5% DMSO: 30% 솔루톨(Solutol) HS15: 20% PEG400: 45% 25mM N-메틸글루카민) 또는 약물(5 mL/kg)을 경구 투여하였다. 약물 투여 2시간 후, 시간 0의 혈액 샘플(0.4 mL)을 글루코오스 측정을 위해 수거하고, 래트에게 산도스타틴(Sandostatin), 0.5 mg/kg(Novartis Pharmaceuticals Corp., East Hanover, NJ) 및 글루카곤, 10 ug/kg(Bedford Laboratories, Bedford, OH)을 목정맥을 통해 투여하였다. 글루코오스 측정을 위해 10 및 20분 후에 혈액 샘플을 수거하였다. 전혈을 테루모 카피젝트(Terumo Capiject) 혈액 수거 튜브(Terumo Medical Corp., Elkton, MD)에 두고, 20-30분 동안 실온에서 그대로 둔 후, 원심분리(3,000 X G)하여 혈청을 수득하였다. 글루코오스의 혈청 수준을 올림푸스(Olympus) AU640™ 임상 화학 면역분석기(immuno-analyzer)(Olympus America Inc., Melville, NY)를 이용하여 측정하였다. 비히클 글루코오스 AUC의 감소%(%R)를, 식 감소% = 100 * 1-(AUC 약물/AUC 비히클)을 이용하여 각각의 약물 치료에 대해 계산하였는데, 여기서 AUC는 식 AUC = (T0+T10)/2*10 + (T10+T20)/2*10 - (T0*20)을 이용하여 혈청 글루코오스로 값으로부터 계산되었다. 실시예 화합물 1의 활성은 하기 표 2에 표시되어 있다.

표 2: 생체내 글루카곤 공격 모델에서의 화합물의 활성.

SEQUENCE LISTING <110> BANKER, Pierette DICKERSON, Scott Howard GARRIDO, Dulce Maria SPARKS, Steven Meagher TAVARES, Francis X. THOMSON, Stephen Andrew <120> GLYCOGEN PHOSPHORYLASE INHIBITOR COMPOUND AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF <130> PR62629WO <150> 60/975,865 <151> 2007-09-28 <160> 4 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Homo Sapien <400> 1 ggcgaagccc ctgacagacc aggagaag 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Homo Sapien <400> 2 cgatgtctga gtggatttta gccacgcc 28 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Homo Sapien <400> 3 ggatatagaa gagttagaag aaattg 26 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Homo Sapien <400> 4 ggaagcttat caatttccat tgactttgtt agattcattg g 41

Claims

하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체:
제 1항에 있어서, 하기 화학식 IA에 표시된 입체화학성(stereochemistry)을 갖는 화합물:
제 1항 또는 제 2항의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체를 포함하는 약제 조성물.
제 1항 또는 제 2항의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체, 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 약제 조성물.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 정제 또는 캡슐인 약제 조성물.
제 1항 또는 제 2항의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체, 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 약제 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법으로서, 상기 치료가 당뇨 및 당뇨와 관련된 질병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 질병에 대한 것인 방법.
제 6항에 있어서, 당뇨와 관련된 질병이 비만, 증후군 X, 인슐린 내성, 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 고콜레스테롤혈증, 고인슐린혈증, 고지질혈증, 심장혈관 병, 뇌졸중, 죽상경화증, 지질단백 질환, 고혈압, 조직 허혈, 심근 허혈, 및 우울증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제 6항에 있어서, 치료가 당뇨에 대한 것인 방법.
제 6항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
활성 치료 물질로 사용하기 위한 제 1항 또는 제 2항의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체.
치료에 사용하기 위한 제 1항 또는 제 2항의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체.
포유동물에서 당뇨, 비만, 증후군 X, 인슐린 내성, 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 고콜레스테롤혈증, 고인슐린혈증, 고지질혈증, 심장혈관 병, 뇌졸중, 죽상경화증, 지질단백 질환, 고혈압, 조직 허혈, 심근 허혈, 및 우울증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환 또는 질병을 치료하는데 사용하기 위한 제 1항 또는 제 2항의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체.
제 12항에 있어서, 당뇨의 치료에 사용하기 위한 화합물.
제 12항에 있어서, 포유동물이 인간인 화합물.
제 1항 또는 제 2항의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 기능성 유도체의 제조 방법으로서,
a. 4-클로로-2-니트로벤조에이트 및 [6-(메틸옥시)-3-피리디닐]보론산을 메틸 4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로벤조에이트로 전환하는 단계;
b. 메틸 4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로벤조에이트를 4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로벤조산으로 전환하는 단계;
c. 4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로벤조산을 메틸 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로페닐}카르보닐)-L-트레오니네이트로 전환하는 단계;
d. 메틸 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]-2-니트로페닐}카르보닐)-L-트레오니네이트를 메틸 N-({2-아미노-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-O-(1,1-디메틸에틸)-L-트레오니네이트로 전환하는 단계;
e. 3,5-디메틸-4-니트로벤조산을 (3,5-디메틸-4-니트로페닐)메탄올로 전환하는 단계;
f. (3,5-디메틸-4-니트로페닐)메탄올을 1,3-디메틸-5-[(메틸옥시)메틸]-2-니트로벤젠으로 전환하는 단계;
g. 1,3-디메틸-5-[(메틸옥시)메틸]-2-니트로벤젠을 2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]아닐린으로 전환하는 단계;
h. 2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]아닐린을 2-이소시아네이토-1,3-디메틸-5-[(메틸옥시)메틸]벤젠으로 전환하는 단계;
i. 메틸 N-({2-아미노-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-O-(1,1-디메틸에틸)-L-트레오니네이트 및 2-이소시아네이토-1,3-디메틸-5-[(메틸옥시)메틸]벤젠을 메틸 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({2-{[({2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]페닐}아미노)카르보닐]아미노}-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-L-트레오니네이트로 전환하는 단계; 및
j. 메틸 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({2-{[({2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]페닐}아미노)카르보닐]아미노}-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-L-트레오니네이트를 O-(1,1-디메틸에틸)-N-({2-{[({2,6-디메틸-4-[(메틸옥시)메틸]페닐}아미노)카르보닐]아미노}-4-[6-(메틸옥시)-3-피리디닐]페닐}카르보닐)-L-트레오닌으로 전환하는 단계를 포함하는 방법.