KR20100074212A

KR20100074212A - Ｒｎａ 캡에 결합 가능한 인플루엔자 바이러스 ｐｂ２ 단백질의 가용성 단편

Info

Publication number: KR20100074212A
Application number: KR1020107008765A
Authority: KR
Inventors: 스테펜 쿠삭; 델파인 길리게이; 다렌 하르트; 프랑 타렌두이
Original assignee: 더 유럽피안 몰레큘러 바이올로지 래보러토리
Priority date: 2007-10-09
Filing date: 2008-10-09
Publication date: 2010-07-01
Also published as: US9045248B2; JP2011501942A; EP2574619A2; IL222997A0; JP5725861B2; EP2197901B1; IL237903A; SG185289A1; ES2454773T3; WO2009046983A1; CA2701362A1; JP2016176955A; AU2008309939B2; EP2197901A1; AU2008309939A1; EP2574619A3; KR101672554B1; JP6309563B2; IL204891A0; CN101970465B

Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스 RNA 의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2 및 그의 변이체의 가용성 단편, 및 RNA 캡 유사체를 포함하는 그의 결정화된 컴플렉스에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 컴플렉스의 구조 좌표를 사용하여 RNA 캡 결합 포켓과 상호작용하는 화합물을 스크리닝하고, 디자인하는 컴퓨터적 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 바람직하게는 고속 세팅으로, 상기 PB2 폴리펩타이드 단편을 사용함으로써 RNA 캡 결합 포켓을 포함하는 PB2 폴리펩타이드 단편에 결합하며, 바람직하게는 RNA 캡 또는 그의 유사체와의 상호작용을 억제하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 네가티브-센스 단일 스트랜드 RNA 바이러스에 의해서 야기된 바이러스 감염에 기인한 질병 상태를 치료하기 위한 화합물, 및 확인된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

ＲＮＡ 캡에 결합 가능한 인플루엔자 바이러스 ＰＢ２ 단백질의 가용성 단편{Soluble fragments of influenza virus PB2 protein capable of binding RNA-CAP}

본 발명은 인플루엔자 바이러스 RNA 의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2 또는 그의 변이체의 가용성 단편, 및 RNA 캡 유사체를 포함하는 그의 결정화된 컴플렉스에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 컴플렉스의 구조 좌표를 사용하여 RNA 캡 결합 포켓과 상호작용하는 화합물을 스크리닝하고, 디자인하는 컴퓨터적 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 바람직하게는 고속 세팅 (high-throughput setting)으로, PB2 폴리펩타이드 단편을 사용함으로써 RNA 캡 결합 포켓을 포함하는 상기의 PB2 폴리펩타이드 단편에 결합하며, 바람직하게는 RNA 캡 또는 그의 유사체와의 상호작용을 억제하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 네가티브-센스 (negative-sense) 단일 스트랜드 RNA 바이러스에 의해서 야기된 바이러스 감염에 기인한 질병 상태를 치료하기 위한 화합물, 및 확인된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자는 세계적으로 큰 이환율 및 사망률의 원인이 되며, 많은 사람에 의해서 인간에 대한 가장 중요한 바이러스성 위협에 속하는 것으로 여겨진다. 연례적인 인플루엔자 전염병은 지구를 강타하고, 때때로 새로운 악성 균주는 큰 파괴력의 범세계적 유행병을 야기한다. 현재, 인플루엔자 바이러스 전염병을 제어하는 일차적 수단은 백신 접종이다. 그러나, 백신 접종의 효과를 벗어난 돌연변이체 인플루엔자 바이러스가 빠르게 생성된다. 새로운 인플루엔자 백신을 생성시키는데 대략 6 개월이 소요된다는 사실에 비추어, 대용 치료학적 수단, 즉 항바이러스 약물이 특히, 빠르게 전파되는 범세계적 유행병에 대한 제1선의 방어책으로 필요하다.

항바이러스 약물의 개발을 위한 우수한 출발점은 필수적 바이러스 단백질의 구조적 데이터이다. 따라서, 인플루엔자 바이러스 표면 항원 뉴라미니다제의 결정 구조 결정 (von Itzstein et al., 1993)은 세포로부터 바이러스의 방출을 방지하지만, 바이러스 생산을 방지하지는 않는 항바이러스 활성을 갖는 뉴라미니다제 억제제의 개발을 직접적으로 유도하였다. 이들 및 이들의 유도체는 이어서, 현재 다수의 국가에서 우발적인 범세계적 유행병에 대한 제1선의 방어책으로서 비축되고 있는 항-인플루엔자 약물인 자나미비르 (zanamivir) (Glaxo) 및 오셀타미비르 (oseltamivir) (Roche)로 개발되었다. 그러나, 이들 약물은 단지 임상적 질병의 지속기간의 감소만을 제공한다. 대신으로, 아만타딘 및 리만타딘과 같은 다른 항-인플루엔자 화합물은 세포 내부에서 바이러스의 탈코팅 (uncoating)을 저해하는 바이러스 막 내의 이온 채널 단백질, 즉 M2 단백질을 표적으로 한다. 그러나, 이들은 이들의 부작용 및 저항성 바이러스 돌연변이체의 빠른 발생으로 인하여 광범하게 사용되지 않았다 (Magden et al., 2005). 또한, 리바비린과 같은 더욱 비특이적인 바이러스성 약물은 인플루엔자 감염의 치료를 위한 작용을 하는 것으로 나타났다 (Eriksoon et al., 1977). 그러나, 리바비린은 아마도 심각한 부작용으로 인하여 단지 몇 나라에서만 승인되었다 (Furuta et al., 2005). 분명히, 바람직하게는 다양한 표적에 대해 지시된 새로운 항바이러스성 화합물이 필요하다.

인플루엔자 바이러스뿐만 아니라 토고토바이러스 (Thogotovirus)는 한타바이러스 (Hantavirus), 오르토번야바이러스 (Orthobunyavirus) 및 플레보바이러스 (Phlebovirus)를 포함한 번야비리다에 (Bunyaviridae)의 과와 마찬가지로 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스인 오르토믹소비리다에 (Orthomyxoviridae)의 과에 속한다. 이들의 게놈은 분절화되어, (i) 단일-스트랜드화 비리온 RNA (vRNA)의 바이러스 mRNAs로의 초기 복사 (copying) 및 (ii) vRNA 복제를 수행하는 RNA 의존적 RNA 폴리머라제를 포함하는 리보핵단백질 입자로 나온다. 바이러스 mRA의 생성을 위해서, 폴리머라제는 소위 "캡-탈취 (cap-snatching)" 기전을 이용한다 (Plotch et al., 1981; Kukkonen et al., 2005; Leahy et al., 1997; Noah and Krug, 2005). 이것은 세포성 mRNA 분자의 5' RNA 캡에 결합하며, 뉴클레오타이드의 스트레치와 함께 RNA 캡을 분열시킨다. 캡핑된 RNA 단편은 바이러스 mRNA의 합성을 위한 프라이머로서 작용한다. 폴리머라제는 3 개의 서브유니트 PB1 (폴리머라제 기본 단백질), PB2 및 PA로 구성된다. PB1은 엔도뉴클레아제 및 폴리머라제 활성을 보유하는 반면에, PB2는 RNA 캡 결합 영역을 함유한다.

폴리머라제 컴플렉스는 바이러스 mRNA의 합성 및 바이러스 복제에 필수적이며, 숙주 세포 단백질에서 발견되는 것과는 상당히 상이할 것 같은 몇 개의 기능적 활성 부위를 함유하기 때문에, 이것은 적절한 항바이러스 약물 표적인 것으로 보인다 (Magden et al., 2005). 따라서, 예를 들어, PB1 내의 PA-결합 영역과 유사한 25-아미노산 펩타이드에 의해서 폴리머라제 서브유니트의 조립을 저해하기 위한 시도가 있었다 (Ghanem et al., 2007). 더구나, 폴리머라제의 엔도뉴클레아제 활성이 표적화되었으며, 일련의 4-치환된 2,4-디옥소부타노산 화합물은 인플루엔자 바이러스 내의 이 활성의 선택적 억제제로 확인되었다 (Tomassini et al., 1994). 또한, 진균 종인 델리치아 컨페르타스포라 (Delitschia confertaspora)의 추출물 내에서 확인된 치환된 2,6-디케토피페라진인 플루티마이드 (flutimide)는 인플루엔자 바이러스의 엔도뉴클레아제를 억제하는 것으로 나타났다 (Tomassini et al., 1996). 또한, 2'-데옥시-2'-플루오로구아노신과 같은 뉴클레오사이드 유사체에 의해서 바이러스 전사를 저해하기 위한 시도가 있었으며 (Tisdale et al., 1995), 치환된 피라진 화합물인 T-705는 인플루엔자 바이러스 RNA 폴리머라제의 특이적 억제제로서 작용할 수 있는 것으로 나타났다 (Furuta et al., 2005). 마지막으로, RNA 캡 구조에 대한 인간 캡 결합 단백질 eIF4E의 결합 모드 및 RNA 캡 구조와의 인플루엔자 바이러스 RNP 상호작용 사이의 비교시험에 의해서 후커 (Hooker) 등 (2003)은 인플루엔자 바이러스와 선택적으로 상호작용하지만, 인간 캡 결합 단백질과는 상호작용하지 않는 신규한 캡 유사체를 확인하였다. 그러나, PB2의 RNA 캡 결합 포켓과 상호작용하며, RNA 캡 결합 및 이에 의해서 RNA 폴리머라제 활성을 잠재적으로 저해하는 화합물을 확인하는데 있어서의 주된 장애는 지금까지, 상기 결합 포켓의 구조 및 주체성이 알려지지 않았다는 것이었다.

RNA 캡 결합 부위를 설명하기 위하여 몇 가지의 시도가 이루어졌으나, 논쟁의 소지가 있는 결과를 제공하였다. 교차-결합 실험은 두 개의 별개의 서열인 PB2의 하나의 N-말단 (242-282) 및 하나의 C-말단 (538-577) 근위 절편이 인플루엔자 바이러스 RNA 폴리머라제의 RNA 캡-결합 부위를 구성한다는 것을 시사하였다 (Honda et al., 1999). 추가의 교차-결합 실험은 RNA 캡에 대한 잠재적 상호작용 부위로서 PB2 단백질 서브유니트 내의 아미노산 533으로부터 아미노산 564까지에 걸친 서열, 특히 아미노산 잔기 Trp552를 확인하였다 (Li et al., 2001). 더구나, 돌연변이 분석은 PB2 내의 잠재적 RNA 캡 결합 아미노산 잔기 Phe363 및 Phe404를 제공하였다 (Fechter et al., 2003).

본 발명의 목적은 (i) X-선 결정학에 의한 PB2의 RNA 캡 결합 포켓의 고분해성 구조 데이터, (ii) 바람직하게는 RNA 캡 결합과 경쟁하며, 이에 의해 RNA 폴리머라제 활성을 저해하는, PB2의 RNA 결합 포켓에 결합할 수 있는 화합물을 확인하는, 바람직하게는 고속 세팅의 컴퓨터적 방법뿐만 아니라 시험관내 방법, 및 (iii) 바이러스 mRNA의 합성을 위해서 캡 탈취 기전을 사용하는 바이러스에 의해서 야기된 감염성 질병의 치료를 위해 이러한 화합물을 포함하는 약물학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 독립적으로 접혀진 영역 내의 PB2 RNA 캡-결합 부위의 정확한 정의를 최초로 가능하게 한다. 이 부위가 어디에 위치할 수 있는지는 지금까지 매우 논쟁의 소지가 많았다. 기능적 캡 결합 부위는 3 개의 폴리머라제 서브유니트 모두 및 가능하게는, 또한 바이러스 RNA를 필요로 하는 것으로 통상적으로 믿어지고 있었다 (Cianci et al., 1995; Li et al., 2001). 기능적 RNA 캡 결합 포켓을 포함한 가용성 PB2 폴리펩타이드 단편을 재조합적으로 생산하는 본 발명자들의 놀라운 성취는 정방향 발현 시스템으로부터 쉽게 수득할 수 있는 물질을 사용하여 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 상의 기능적 부위의 억제제에 대한 시험관내 고속 스크리닝을 수행할 수 있도록 한다. 캡 결합 억제제에 대한 이전의 작업은 예를 들어, 인플루엔자 비리온으로부터 정제된 완전한 리보핵단백질 입자를 사용하였다 (Hooker et al., 2003). 또한, PB2 내의 RNA 캡 결합 포켓의 상세한 구조 좌표를 제공함으로써 본 발명은 캡-결합 억제제 디자인에 대한 구조-기본 접근방법, 즉 가상 (in silico) 스크리닝 및 선도물질 최적화를 허용한다.

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첫 번째 관점에서, 본 발명은 (i) 인플루엔자 바이러스 RNA-의존적 폴리머라제 서브유니트 PB2 또는 그의 변이체로부터 유도되고, (ii)RNA 캡 또는 그의 유사체에 결합할 수 있는 가용성 폴리펩타이드 단편에 관한 것이다.

추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 가용성 폴리펩타이드 단편 및 RNA 캡 또는 그의 유사체를 포함하는 컴플렉스에 관한 것이다.

추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 가용성 폴리펩타이드 단편을 코드화한 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.

추가의 관점에서, 본 발명은 PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓의 전부 또는 일부를 회합시키는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은

(a) 도 18에 나타낸 바와 같은 본 발명의 컴플렉스의 구조 좌표에 의해서 정의된 상기 결합 포켓의 컴퓨터 모델을 구성하고;

(b) (i) 분자 단편을 상기 화합물로 조립하고, (ii) 소분자 데이터베이스로부터 화합물을 선택하고, (c) 상기 화합물의 새로운 리간드 디자인을 하는 것으로 구성된 그룹으로부터 선택된 방법에 의해서 잠재적 결합 화합물을 선택하고;

(c) 결합 포켓 내의 상기 화합물의 에너지-최소화된 배열을 제공하기 위해서 컴퓨터 수단을 사용하여 상기 화합물 및 상기 결합 포켓의 컴퓨터 모델 사이의 피팅 프로그램 (fitting program) 운전을 수행하고;

(d) 상기 피팅 운전의 결과를 평가하여 상기 화합물과 결합 포켓 모델 사이의 회합을 정량화하고, 이에 의해서 상기 결합 포켓과 회합하는 상기 화합물의 능력을 평가하는 단계를 포함한다.

추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 가상 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물에 관한 것이나, 단 화합물은 m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, m⁷GpppUm, 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온 또는 T-705는 아니며, PB2 또는 그의 변이체의 RNA 캡 결합 포켓에 결합할 수 있다.

추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 가상 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물에 관한 것이나, 단 화합물은 m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, m⁷GpppUm, 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온 또는 T-705는 아니며, PB2 폴리펩타이드, 그의 변이체 또는 그의 단편과 RNA 캡 또는 그의 유사체 사이의 결합을 억제할 수 있다.

추가의 관점에서, 본 발명은 (i) 본 발명의 폴리펩타이드 단편 또는 본 발명의 재조합 숙주 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, (ii) PB2에 결합하는 상기 시험 화합물의 능력을 분석하는 단계를 포함하여, PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓과 회합하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다.

추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 시험관내 방법에 따라 생산할 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 시험관내 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물에 관한 것이나, 단 화합물은 m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, m⁷GpppUm, 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온 또는 T-705는 아니며, PB2 폴리펩타이드, 그의 변이체 또는 그의 단편에 결합할 수 있다.

추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 시험관내 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물에 관한 것이나, 단 화합물은 m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, m⁷GpppUm, 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온 또는 T-705는 아니며, PB2 폴리펩타이드, 그의 변이체 또는 그의 단편과 RNA 캡 또는 그의 유사체 사이의 결합을 억제할 수 있다.

추가의 관점에서, 본 발명은 PB2의 RNA 캡 결합 영역에 대해서 지시된 항체에 관한 것이다.

추가의 관점에서, 본 발명은 네가티브-센스 ssRNA 바이러스에 의한 바이러스 감염에 의해서 야기된 질병 상태를 치료, 개선 또는 예방하기 위한 약물의 제조를 위한 본 발명의 화합물, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.

이하에서 본 발명을 상세히 기술하기 전에, 본 명세서에 기술된 특정한 방법, 프로토콜 및 시약은 변화될 수 있기 때문에 본 발명은 이들로 제한되지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 구체예를 기술할 목적으로 사용된 것이며, 단지 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

바람직하게는, 본 명세서에서 사용된 용어는 문헌 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 기술된 것과 같이 정의된다.

본 명세서 및 이하의 특허청구범위 전체에 걸쳐서, 문맥이 다른 식으로 요구하지 않는 한 단어 "포함한다 (comprise)" 및 "포함한다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)"과 같은 변형어는 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만, 어떤 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지는 않는다는 뜻을 내포하는 것으로 이해될 수 있다.

몇 개의 문서들이 본 명세서의 본문 전체적으로 인용되어 있다. 본 명세서에 인용된 각각의 문서 (모든 특허, 특허출원, 과학 문헌, 제조자의 설계 명세서, 설명서 등)는 상기한 것이든 이하의 것이든 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다. 이들 중의 어떤 것도 본 발명이 선행기술로서의 이러한 기술내용을 앞서는 자격이 없음을 시인하는 것으로 이해되지는 않는다.

용어 "폴리펩타이드 단편"은 단일 아미노산 쇄로 구성된 단백질의 일부분을 나타낸다. 용어 "단백질"은 이차 및 삼차 구조를 회복한 폴리펩타이드 단편을 포함하며, 추가로 몇 개의 아미노산, 즉 몇 개의 서브유니트로 이루어져서 4차 구조를 형성한 단백질을 나타낸다. 용어 "펩타이드"는 반드시 이차 또는 삼차 구조를 취하지는 않는 50 개까지의 아미노산의 짧은 아미노산 쇄를 나타낸다. "펩토이드 (peptoid)"는 N-치환된 글리신의 올리고머성 조립에 기인하는 펩타이드 유사체이다.

두 개 또는 그 이상의 폴리펩타이드 내의 잔기는, 잔기가 폴리펩타이드 구조 내의 유사한 위치를 점유한다면 서로 "상응한다"라고 말한다. 본 기술분야에서 잘 알려진 바와 같이, 두 개 또는 그 이상의 폴리펩타이드에서 유사한 위치는 아미노산 서열 또는 구조적 유사성을 기초로 하여 폴리펩타이드 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다. 이러한 정렬 도구는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 워드 와이드 웹 (World Wide Web) 상에서, 예를 들어, 바람직하게는 Align EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 위한 표준 세팅을 사용한 ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw) 또는 Align (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/ index.html)에서 얻을 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 만족스러운 정렬을 제공하기 위해서 어느 하나의 서열에 갭 (gap)을 도입시키는 것이 필요할 수 있음을 이해할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 PB2 서브유니트 내의 잔기 220 내지 510은 각각 인플루엔자 B 및 C 바이러스 PB2 서브유니트 내의 잔기 222 내지 511 및 227 내지 528에 상응한다. 3 개의 PB2 서브유니트에 대해서 이렇게 생성된 정렬은 도 10에 도시되어 있다. 두 개 또는 그 이상의 인플루엔자 바이러스 PB2 서브유니트 내의 잔기가 최상의 서열 정렬로 정렬된다면, 이들은 "상응한다"고 말한다. 두 개의 폴리펩타이드 사이의 "최상의 서열 정렬"은 최대수의 정렬된 동일한 잔기를 제공하는 정렬로 정의된다. 두 개의 정렬된 서열 사이의 서열 유사성, 바람직하게는 동일성이 10, 20 또는 30 아미노산의 길이에 걸쳐서 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 10, 20 또는 30 아미노산의 길이에 걸쳐서 30% 미만으로 떨어지면, "최상의 서열 정렬의 부분"은 유사성 스코어를 결정할 목적으로 비교 서열의 길이의 경계의 끝을 이루고, 이에 의해서 이 경계를 결정한다. 인플루엔자 A (aa 315 내지 498), B (aa 317 내지 499) 및 C (aa 327 내지 516) PB2 서브유니트의 아미노산 서열에 대한 최상의 서열 정렬의 일부분은 도 9 및 10에 나타내었다.

본 발명은 RNA 캡 또는 그의 유사체에 결합할 수 있는 가용성 인플루엔자 바이러스 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 PB2 서브유니트 단편을 포함한다. 용어 "RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2"는 바람직하게는 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 인플루엔자 C 바이러스, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 것을 나타낸다. "RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2 변이체"는 최상의 서열 정렬을 사용한 단편의 전체 길이에 걸쳐서 및/또는 최상의 서열 정렬의 부분에 걸쳐서 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 가지며, 여기에서 최상의 서열 정렬은 SEQ ID NOs: 1, 2 또는 3에 기술된 아미노산 서열과 함께 표준 세팅, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하는 본 기술분야에서 공지된 도구, 예를 들어, Align에 의해서 수득할 수 있다. 천연적으로 존재하는 PB2 변이체가 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3에 따르는 PB2 서브유니트와 맞추어서 정렬되는 경우에, 이 정렬은 두 개의 단백질의 전체 길이에 걸쳐서 이루어지고, 이 정렬 스코어는 이것을 기준으로 하여 결정되는 것이 바람직하다. 그러나, 천연 변이체는 예를 들어, N- 또는 C-말단 융합을 통해서 C-말단/N-말단 또는 내부 결실 또는 첨가를 포함할 수 있을 것이다. 이 경우에는 단지 최상으로 정렬된 부분만이 각각 유사성 및 동일성의 평가를 위해서 사용된다.

바람직하게는, 그리고 이하에 더 상세히 기술된 바와 같이 이들 변이체로부터 유도된 가용성 단편은 바람직하게는 RNA 캡 결합에 필요한 부분 내에서 각각 표시된 유사성 및 동일성을 나타낸다. 따라서, SEQ ID NOs: 1, 2 또는 3과 PB2 변이체 사이의 어떤 정렬이라도 바람직하게는 RNA 캡 결합 포켓을 포함하여야 한다. 따라서, SEQ ID NO: 1, 2 또는 3에 대한 상기 서열 유사성 및 동일성은 각각 바람직하게는 RNA 캡 결합 포켓을 포함하는, 적어도 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 165, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300 또는 그 이상의 아미노산의 길이에 걸쳐서 나타난다. 따라서, 바람직한 구체예에서 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2 변이체는 100 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 110 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 120 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 130 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 140 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 150 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 160 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 165 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 170 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 180 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 190 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 200 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 210 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 220 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 230 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 240 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 250 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 또는 300 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 갖는다.

바람직한 구체예에서, RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2 변이체는 100 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 110 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 120 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 130 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 140 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 150 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 160 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 165 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 170 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 180 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 190 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 200 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 210 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 220 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 230 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 240 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 250 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 또는 300 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 갖는다.

바람직한 구체예에서, RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2 변이체는 100 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 110 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 120 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 130 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 140 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 150 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 160 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 165 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 170 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 180 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 190 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 200 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 210 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 220 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 230 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 240 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 250 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성, 또는 300 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 갖는다.

SEQ ID NO: 1, 2 또는 3에 따르는 서열의 천연 PB2 변이체의 대다수는 공지되어 있으며, 문헌에 기술되어 있다. 이들 PB2 변이체는 모두 본 발명의 가용성 단편으로 이루어지며, 이들에 대한 기초가 될 수 있다. SEQ ID NO: 1이 기준 서열로 사용된다면, 인플루엔자 A에 대한 바람직한 예는 Val227, Arg251, Ile255, Ser271, Gln288, Ile338, Val344, Arg355, Ile373, Leu374, Asn456, Val461, 및/또는 Ser497 중의 하나 또는 그 이상에서 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 변이체는 다음의 돌연변이 중의 하나 또는 그 이상을 포함한다: Val227Met, Arg251Lys, Ile255Val, Ser271Ala, Gln288Leu, Ile338Val, Ile338Thr, Val344Leu, Arg355Lys, Ile373Thr, Leu374Ile, Asn456Ser, Val461Ile, 및/또는 Ser497Asn. 인플루엔자 A 바이러스 PB2 서브유니트의 바람직한 변이체는, 임의로 상기 언급된 돌연변이 중의 하나 또는 그 이상과 조합된, 아르기닌으로부터 리신으로의 (예를 들어, SEQ ID NO: 11) 아미노산 교환을 제공하는 위치 389에서 돌연변이를 포함한다. SEQ ID NO: 2가 기준 서열로 사용된다면, 인플루엔자 B 바이러스 PB2 서브유니트의 바람직한 변이체는 다음의 아미노산 위치 중의 하나 또는 그 이상에서 돌연변이를 포함한다: Thr254, Met261, Ile269, Thr301, Ile303, Leu319, Ile346, Lys380, Arg382, Met383, Lys385, Lys397, Asn442, Ser456, Glu467, Leu468, 및/또는 Thr494. 바람직한 구체예에서, PB2 서브유니트 변이체는 다음의 돌연변이 중의 하나 또는 그 이상을 포함한다: Thr254Ala, Met261Thr, Ile269Val, Thr301Ala, Ile303Leu, Leu319Gln, Ile346Val, Lys380Gln, Arg382Lys, Met383Leu, Lys385Arg, Lys397Arg, Asn442Ser, Ser456Pro, Glu467Gly, Leu468Ser, 및/또는 Thr494Ile. SEQ ID NO: 3이 기준 서열로 사용된다면, 인플루엔자 B 바이러스 PB2 서브유니트의 바람직한 변이체는 다음의 아미노산 위치 중의 하나 또는 그 이상에서 돌연변이를 포함한다: Leu311, Pro330, 및/또는 Ser436. 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 다음과 같다: Leu311Pro, Pro330Gln, 및/또는 Ser436Thr.

따라서, 본 발명의 가용성 단편은 상기 정의한 바와 같은 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2 또는 그의 변이체를 기초로 한다. 따라서, 이하의 명세서에서 용어 "가용성 폴리펩타이드 단편(들)" 및 "PB2 폴리펩타이드 단편"은 항상 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3에 기술된 바와 같은 PB2 단백질로부터 유도된 단편 및 상술한 바와 같은 그의 PB2 단백질 변이체로부터 유도된 단편을 포함하며, 이들은 RNA 캡 또는 그의 유사체를 결합시킬 수 있다. 그러나, 본 명세서에서는 또한, RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2 변이체로부터 유도된, RNA 캡 또는 그의 유사체에 결합할 수 있는 가용성 PB 단편을 특이적으로 나타내기 위한 용어 "PB2 폴리펩타이드 단편 변이체" 또는 "PB2 단편 변이체"를 사용한다. 따라서, 본 발명의 가용성 PB2 단편은 바람직하게는, 천연적으로 존재하는 인플루엔자 바이러스 서브유니트 PB2의 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다. 그러나, PB2 단편 변이체는 추가로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 함유하며, 최상의 서열 정렬을 사용하는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 및/또는 최상의 서열 정렬의 부분에 걸쳐서 적어도 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 갖는 것으로 생각되며, 여기에서 최상의 서열 정렬은 SEQ ID NOs: 1, 2 또는 3에 기술된 아미노산 서열과 함께 표준 세팅, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하는 본 기술분야에서 공지된 도구, 예를 들어, Align에 의해서 수득할 수 있다. 본 발명의 PB2 단편은 예를 들어, 태그 (tags), 효소 등과 같은 PB2로부터 유도되지 않은 추가의 아미노산을 포함할 수 있으며, 이러한 추가의 아미노산은 이러한 정렬에서 고려되지 않을 수 있는데, 즉 정렬 스코어의 계산으로부터 배제될 수 있는 것으로 이해된다. 바람직한 구체예에서, 상기 표시된 정렬 스코어는 단편의 서열을 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 165, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260 또는 270 아미노산의 길이에 걸쳐서 SEQ ID NOs: 1, 2 또는 3과 정렬하는 경우에 수득되며, 여기에서 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3의 각각의 서열은 바람직하게는 RNA 캡 결합 포켓을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 가용성 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 인플루엔자 A 바이러스 PB2 (SEQ ID NO: 13)의 아미노산 잔기 323 내지 404에 상응하는 아미노산 잔기로 구성되거나 적어도 이들을 포함하며, 최상의 서열 정렬을 사용하는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 및/또는 최상의 서열 정렬의 부분에 걸쳐서 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 가지며, 여기에서 최상의 서열 정렬은 SEQ ID NO: 13에 기술된 아미노산 서열과 함께 표준 세팅, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하는 본 기술분야에서 공지된 도구, 예를 들어, Align에 의해서 수득할 수 있고; 더욱 바람직하게는 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 적어도 인플루엔자 A 바이러스 PB2 (SEQ ID NO: 11)의 아미노산 잔기 318 내지 483에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, 최상의 서열 정렬을 사용하는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 및/또는 최상의 서열 정렬의 부분에 걸쳐서 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 가지며, 여기에서 최상의 서열 정렬은 SEQ ID NO: 11에 기술된 아미노산 서열과 함께 표준 세팅, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하는 본 기술분야에서 공지된 도구, 예를 들어, Align에 의해서 수득할 수 있고; 더욱 바람직하게는 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 적어도 인플루엔자 A 바이러스 PB2 (SEQ ID NO: 4)의 아미노산 잔기 235 내지 496에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, 최상의 서열 정렬을 사용하는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 및/또는 최상의 서열 정렬의 부분에 걸쳐서 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 65%, 더욱 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 가지며, 여기에서 최상의 서열 정렬은 SEQ ID NO: 4에 기술된 아미노산 서열과 함께 표준 세팅, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하는 본 기술분야에서 공지된 도구, 예를 들어, Align에 의해서 수득할 수 있고; 더욱 바람직하게는 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 적어도 인플루엔자 A 바이러스 PB2의 아미노산 잔기 220 내지 510에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, 최상의 서열 정렬을 사용하는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 및/또는 최상의 서열 정렬의 부분에 걸쳐서 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 65%, 더욱 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 가지며, 여기에서 최상의 서열 정렬은 SEQ ID NO: 1에 기술된 아미노산 서열과 함께 표준 세팅, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하는 본 기술분야에서 공지된 도구, 예를 들어, Align에 의해서 수득할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 돌연변이, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1과 비교하여 다음의 아미노산 잔기 중의 하나 또는 그 이상에서의 돌연변이와 같은 천연적으로 존재하는 돌연변이를 포함한다: Val227, Arg251, Ile255, Ser271, Gln288, Ile338, Val344, Arg355, Ile373, Leu374, Lys389, Asn456, Val461, 및/또는 Ser497. 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 다음과 같다: Val227Met, Arg251Lys, Ile255Val, Ile255Thr, Ser271Ala, Gln288Leu, Ile338Val, Ile338Thr, Val344Leu, Arg355Lys, Ile373Thr, Leu374Ile, Lys389, Asn456Ser, Val461Ile, 및/또는 Ser497Asn. 인플루엔자 A 바이러스 PB2 서브유니트 단편의 바람직한 변이체는, 임의로 상기 언급된 돌연변이 중의 하나 또는 그 이상과 조합된, 아르기닌으로부터 리신으로의 (예를 들어, SEQ ID NO: 11) 아미노산 교환을 제공하는 위치 389에서 돌연변이를 포함한다.

바람직한 구체예에서, PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 인플루엔자 B 바이러스 PB2 (SEQ ID NO: 2로부터 유도됨)의 아미노산 잔기 325 내지 406에 상응하는 아미노산 잔기로 구성되거나 적어도 이들을 포함하며, 최상의 서열 정렬을 사용하는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 및/또는 최상의 서열 정렬의 부분에 걸쳐서 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 가지며, 여기에서 최상의 서열 정렬은 SEQ ID NO: 2에 기술된 아미노산 서열과 함께 표준 세팅, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하는 본 기술분야에서 공지된 도구, 예를 들어, Align에 의해서 수득할 수 있고; 더욱 바람직하게는 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 적어도 인플루엔자 B 바이러스 PB2 (SEQ ID NO: 2로부터 유도됨)의 아미노산 잔기 320 내지 484에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, 최상의 서열 정렬을 사용하는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 및/또는 최상의 서열 정렬의 부분에 걸쳐서 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 가지며, 여기에서 최상의 서열 정렬은 SEQ ID NO: 2에 기술된 아미노산 서열과 함께 표준 세팅, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하는 본 기술분야에서 공지된 도구, 예를 들어, Align에 의해서 수득할 수 있고; 더욱 바람직하게는 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 적어도 인플루엔자 B 바이러스 PB2 (SEQ ID NO: 2로부터 유도됨)의 아미노산 잔기 237 내지 497에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, 최상의 서열 정렬을 사용하는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 및/또는 최상의 서열 정렬의 부분에 걸쳐서 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 65%, 더욱 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 가지며, 여기에서 최상의 서열 정렬은 SEQ ID NO: 2에 기술된 아미노산 서열과 함께 표준 세팅, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하는 본 기술분야에서 공지된 도구, 예를 들어, Align에 의해서 수득할 수 있고; 더욱 바람직하게는 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 적어도 인플루엔자 B 바이러스 PB2 (SEQ ID NO: 2로부터 유도됨)의 아미노산 잔기 221 내지 511에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, 최상의 서열 정렬을 사용하는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 및/또는 최상의 서열 정렬의 부분에 걸쳐서 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 65%, 더욱 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 가지며, 여기에서 최상의 서열 정렬은 SEQ ID NO: 1에 기술된 아미노산 서열과 함께 표준 세팅, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하는 본 기술분야에서 공지된 도구, 예를 들어, Align에 의해서 수득할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인플루엔자 B 바이러스 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 SEQ ID NO: 2와 비교하여 다음의 아미노산 위치 중의 하나 또는 그 이상에서의 돌연변이, 바람직하게는 천연적으로 존재하는 돌연변이를 포함한다: Thr254, Met261, Ile269, Thr301, Ile303, Leu319, Ile346, Lys380, Arg382, Met383, Lys385, Lys397, Asn442, Ser456, Glu467, Leu468, 및/또는 Thr494. 바람직한 구체예에서, 상기 단편 변이체는 다음의 돌연변이 중의 하나 또는 그 이상을 포함한다: Thr254Ala, Met261Thr, Ile269Val, Thr301Ala, Ile303Leu, Leu319Gln, Ile346Val, Lys380Gln, Arg382Lys, Met383Leu, Lys385Arg, Lys397Arg, Asn442Ser, Ser456Pro, Glu467Gly, Leu468Ser, 및/또는 Thr494Ile.

바람직한 구체예에서, PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 인플루엔자 C 바이러스 PB2 (SEQ ID NO: 3으로부터 유도됨)의 아미노산 잔기 335 내지 416에 상응하는 아미노산 잔기로 구성되거나 적어도 이들을 포함하며, SEQ ID NO: 3에 기술된 아미노산 서열을 갖는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 서열 유사성을 가지며; 더욱 바람직하게는 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 적어도 인플루엔자 C 바이러스 PB2 (SEQ ID NO: 3으로부터 유도됨)의 아미노산 잔기 330 내지 501에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, SEQ ID NO: 3에 기술된 아미노산 서열을 갖는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 가장 바람직하게는 90% 서열 유사성을 가지며; 더욱 바람직하게는 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 적어도 인플루엔자 C 바이러스 PB2 (SEQ ID NO: 3으로부터 유도됨)의 아미노산 잔기 242 내지 514에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, SEQ ID NO: 3에 기술된 아미노산 서열을 갖는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 65%, 더욱 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 가장 바람직하게는 90% 서열 유사성을 가지며; 더욱 바람직하게는 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 적어도 인플루엔자 C 바이러스 PB2 (SEQ ID NO: 3으로부터 유도됨)의 아미노산 잔기 227 내지 528에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, SEQ ID NO: 2에 기술된 아미노산 서열을 갖는 단편의 전체 길이에 걸쳐서 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 65%, 더욱 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 가장 바람직하게는 90% 서열 유사성을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인플루엔자 C 바이러스 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체는 돌연변이, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3과 비교하여 다음의 아미노산 잔기 중의 하나 또는 그 이상에서의 돌연변이와 같은 천연적으로 존재하는 돌연변이를 포함한다: Leu311, Pro330, 및/또는 Ser436. 바람직한 구체예에서, 단편 변이체는 이하의 돌연변이 중의 하나 또는 그 이상을 포함한다: Leu311Pro, Pro330Gln, 및/또는 Ser436Thr.

용어 "서열 유사성"은 최상의 서열 정렬의 동일한 위치에서의 아미노산이 동일하거나 유사한, 바람직하게는 동일한 것을 의미한다. "유사한 아미노산"은 극성, 용해도, 친수성, 소수성, 전하 또는 크기와 같은 유사한 특징을 갖는다. 유사한 아미노산은 바람직하게는 로이신, 이소로이신 및 발린; 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신; 리신, 아르기닌 및 히스티딘; 글루탐산 및 아스파르트산; 글리신, 알라닌 및 세린; 트레오닌, 글루타민 및 메티오닌이다. 숙련된 전문가는 서열 유사성 탐색 도구, 예를 들어, 워드 와이드 웹 (예를 들어, www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html) 상에서 이용할 수 있는 것을 잘 알고 있다.

본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "가용성"은 구아니딘 또는 우레아와 같은 변성제의 부재 하에서 5 ㎎/㎖ 정도로 많은 단백질 농도에서 생리적으로 등장성인 조건, 예를 들어, 0.14 M 염화나트륨 또는 슈크로즈 하에 수성 완충액 중에서 100,000× g으로 30 분 동안 원심분리시킨 후에 유효 농도로 상등액에 잔류하는 폴리펩타이드 단편을 나타낸다. 그의 용해도에 대해서 시험하는 단백질 단편은 바람직하게는 이하에 나타내는 세포성 발현 시스템 중의 하나에서 발현된다. 이러한 단백질 단편의 발현, 및 바람직하게는, 정제는 이하의 실시예 2에 더 상세히 기술한 바와 같이 수행되는 것이 특히 바람직하다.

폴리펩타이드와 관련한 용어 "정제된"은 균질한 제제와 같은 절대 순도를 필요로 하지 않으며, 오히려 이것은 폴리펩타이드가 천연 환경에서보다 비교적 더 순수하다는 표시를 나타낸다. 일반적으로, 정제된 폴리펩타이드는 기능적으로 유의적인 레벨에서 이것이 천연적으로 회합되는 다른 단백질, 지질, 탄수화물 또는 다른 물질을 실질적으로 함유하지 않으며, 예를 들어, 적어도 85% 순수하며, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 순수하고, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수하다. 표현 "결정화에 적합한 범위까지 정제된"은 85% 내지 100%, 바람직하게는 90% 내지 100%, 더욱 바람직하게는 95% 내지 100% 순수하며, 침전이 없이 3 ㎎/㎖ 이상, 바람직하게는 10 ㎎/㎖ 이상, 더욱 바람직하게는 18 ㎎/㎖ 이상까지 농축될 수 있는 단백질을 나타낸다. 숙련된 전문가는 단백질 정제를 위한 표준 기술을 사용하여 폴리펩타이드를 정제할 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩타이드는 비-환원성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 단일의 주된 밴드를 수득할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해서 화합물을 확인하는 것과 관련하여 사용된 것으로서 용어 "회합한다"는 부위 (즉, 화학적 물질 또는 화합물 또는 그의 일부분 또는 단편) 및 PB2의 결합 포켓 사이의 근접한 상태를 의미한다. 회합은 비-공유적일 수 있으며, 즉 여기에서는 병렬이 예를 들어, 수소-결합, 반 데어 발스, 정전기 또는 소수성 상호작용에 의해서 효과적으로 유리하거나, 이것은 공유적일 수 있다.

용어 "RNA 캡"은 mRNA 분자의 5' 말단 상에 존재하는 캡 구조를 나타내며, 예외적인 5' 대 5' 트리포스페이트 결합을 통해서 mRNA에 연결된 구아닌 뉴클레오타이드로 구성된다. 이 구아노신은 7 위치에서 메틸화된다. 추가의 변형에는 mRNA의 5' 말단의 처음 3 개의 리보즈 당의 2' 하이드록시-그룹의 가능한 메틸화가 포함된다. "RNA 캡 유사체"는 RNA 캡 구조와 닮은 구조를 나타낸다. RNA 캡 유사체의 예로는 7-메틸-구아노신 (m⁷G), 7-메틸-구아노신 모노포스페이트 (m⁷GMP), 7-메틸-구아노신 트리포스페이트 (m⁷GTP), 구아노신에 5' 대 5' 트리포스페이트 브릿지를 통해서 결합된 7-메틸-구아노신 (m⁷GpppG), 리보즈의 2' OH 위치에서 메틸화된 구아노신에 5' 대 5' 트리포스페이트 브릿지를 통해서 결합된 7-메틸-구아노신 (m⁷GpppGm), 아데노신에 5' 대 5' 트리포스페이트 브릿지를 통해서 결합된 7-메틸-구아노신 (m⁷GpppA), 리보즈의 2' OH 위치에서 메틸화된 아데노신에 5' 대 5' 트리포스페이트 브릿지를 통해서 결합된 7-메틸-구아노신 (m⁷GpppAm), 시티딘에 5' 대 5' 트리포스페이트 브릿지를 통해서 결합된 7-메틸-구아노신 (m⁷GpppC), 리보즈의 2' OH 위치에서 메틸화된 시티딘에 5' 대 5' 트리포스페이트 브릿지를 통해서 결합된 7-메틸-구아노신 (m⁷GpppCm), 유리딘에 5' 대 5' 트리포스페이트 브릿지를 통해서 결합된 7-메틸-구아노신 (m⁷GpppU), 리보즈의 2' OH 위치에서 메틸화된 유리딘에 5' 대 5' 트리포스페이트 브릿지를 통해서 결합된 7-메틸-구아노신 (m⁷GpppUm)이 포함된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 캡 유사체는 m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppN, m⁷GpppNm으로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 여기에서 N은 뉴클레오타이드, 바람직하게는 G, A, U 또는 C이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, RNA 캡 유사체는 추가의, 예를 들어, 1 내지 15 개의 뉴클레오타이드, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개를 포함할 수 있으며, 여기에서 뉴클레오타이드는 바람직하게는 A, C, G, U 및/또는 T로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 이들 추가의 뉴클레오타이드는 바람직하게는, 포스포에스테르, 포스포디에스테르, 또는 포스포트리에스테르 결합, 또는 그의 비-가수분해성 유사체를 통해서 m⁷GpppN 또는 m⁷GpppNm 내의 첫 번째 뉴클레오타이드 N에 결합된다.

[Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992)]에 기술된 바와 같이, 2'-데옥시 및 2'-하이드록실 형태를 포함하는, 1' 위치에서 펜토즈에 결합된 퓨린, 데아자퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오사이드 염기, 예를 들어, 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 데아자아데닌, 데아자구아노신 등으로 구성된 화합물을 나타내며, 추가로 예를 들어, 문헌 [Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, N.Y., 1980)]에 일반적으로 기술된, 변형된 염기 부위 및/또는 변형된 당 부위를 갖는 합성 뉴클레오사이드를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

용어 "결합 포켓"은 본 발명의 폴리펩타이드 단편에 의해서 형성된 삼차원적 구조, 즉 RNA 캡과 직접 접촉하는 아미노산 잔기 (제2층 아미노산 잔기), 예를 들어, Arg332 및 Ser337의 위치를 정하는 RNA 캡 또는 아미노산 잔기와 직접적으로 접촉하는 아미노산에 의해서 라이닝된 PB2의 RNA 캡 결합 영역을 나타낸다. 그의 형상으로 인하여, 결합 포켓은 RNA 캡 또는 그의 유사체를 수용한다. PB2의 RNA 캡 결합 포켓은 RNA 캡 결합 부위를 포함하는 PB2 폴리펩타이드 단편과 RNA 캡 유사체 사이의 컴플렉스의 결정 구조 데이터의 분석으로부터 제공되는 구조 좌표에 의해서 정의된다. 용어 "결합 포켓"은 또한, PB2 폴리펩타이드 단편 변이체의 결합 포켓을 포함한다.

용어 "PB2의 RNA 캡 결합 영역"은 그의 천연 삼차원적 구조 내에 RNA 결합 포켓을 포함하는 PB2의 최소 폴리펩타이드 단편을 나타낸다.

용어 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 (i) 그들의 천연 환경으로부터 분리되거나, (ii) 폴리머라제 연쇄반응에 의해서 증폭되거나, (iii) 전체적으로 또는 부분적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드를 나타내며, 센스 및 안티-센스 스트랜드 둘 다인 DNA 및 RNA 분자를 포함한다. 이 용어는 cDNA, 게놈 DNA 및 재조합 DNA를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 전체 유전자, 또는 그의 일부분으로 구성될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "재조합 벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파지와 같은 파지 벡터, 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC) 또는 P1 인공 염색체 (PAC)와 같은 인공 염색체 벡터를 포함한, 숙련된 전문가에게 공지된 모든 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 발현 벡터뿐만 아니라 클로닝 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드뿐만 아니라 바이러스 벡터를 포함하며, 일반적으로 바람직한 코드화 서열, 및 특정한 숙주 유기체 (예를 들어, 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물) 또는 시험관내 발현 시스템 내에 작동적으로 결합된 코드화 서열의 발현에 필요한 적절한 DNA 서열을 함유한다. 클로닝 벡터는 일반적으로, 특정의 바람직한 DNA 단편을 엔지니어링하고, 증폭시키기 위해서 사용되며, 바람직한 DNA 단편의 발현에 필요한 기능적 서열은 결여될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 것으로서, "재조합 숙주 세포"는 관심이 있는 폴리펩타이드 단편, 즉 본 발명에 따르는 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체를 코드화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 나타낸다. 이 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내부에서 (i) 그 자체로 자유롭게 분산되거나, (ii) 재조합 벡터 내에 혼입되거나, (iii) 숙주 세포 게놈 또는 미토콘드리아 DNA 내에 통합되어 존재할 수 있다. 재조합 세포는 관심이 있는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위해서, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터의 증폭을 위해서 사용될 수 있다. 용어 "재조합 숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터에 의해서 형질전환되거나, 형질감염되거나 감염된 원래의 세포의 자손을 포함한다. 재조합 숙주 세포는 대장균 (E. coli) 세포와 같은 박테리아 세포, 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris), 식물 세포, SF9 또는 Hi5 세포와 같은 곤충 세포, 또는 포유동물 세포일 수 있다. 포유동물 세포의 바람직한 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 녹색 아프리카 원숭이 신장 (COS) 세포, 인간 배아 신장 (HEK293) 세포, HELA 세포 등이다.

본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "결정" 또는 "결정성"은 평면의 면들이 일정한 각도로 교차하며, 구성요소 화학적 종의 규칙적 구조 (예를 들어, 내부 구조)가 있는 구조 (예를 들어, 삼차원적 고체 응집체)를 의미한다. 용어 "결정"은 다음 중의 어느 하나를 포함할 수 있다: 실험적으로 제조된 결정과 같은 고체 물리적 결정 형태, 결정으로부터 유도될 수 있는 결정 구조 (2차 및/또는 3차 및/또는 4차 구조 요소를 포함), 결정 구조를 기초로 하는 2D 및/또는 3D 모델, 그의 도식적 표시 또는 그의 도형적 표시와 같은 그의 표시, 또는 그의 컴퓨터용 데이터 세트. 한가지 관점에서, 결정은 X-선 결정학 기술에서 유용하다. 여기에서, 사용된 결정은 X-선 빔에 대한 노출을 견딜 수 있으며, X-선 결정학적 구조를 푸는데 필요한 회절 패턴 데이터를 제공하기 위해서 사용된다. 결정은 문헌 [T. L. Blundell and L. N. Johnson, "Protein Crystallography", Academic Press, New York (1976)]에 도시된 결정 형태 중의 하나에 의해서 정의된 패턴으로 X-선을 회절시킬 수 있는 것으로 특정화될 수 있다.

용어 "단위 셀 (unit cell)"은 기본적인 평행 육면체 형상의 블럭을 나타낸다. 결정의 전체 용적은 이러한 블럭의 규칙적인 조립에 의해서 구성될 수 있다. 각각의 단위 셀은 그의 반복이 결정을 구성하는 패턴의 단위의 완전한 표시를 포함한다.

용어 "공간 그룹"은 결정의 대칭 요소의 정렬을 나타낸다. 공간 그룹 명칭에서, 대문자는 격자 타입을 나타내며, 다른 기호는 그의 외관을 변화시키지 않으면서 비대칭적 단위의 내용물 상에서 수행될 수 있는 대칭 조작을 나타낸다.

용어 "구조 좌표"는 축들의 시스템에 관하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 위치를 정의하는 값들의 세트를 나타낸다. 이 용어는 분자 또는 분자들의 삼차원적 구조를 정의하는 데이터 세트 (예를 들어, 데카르트 좌표, 온도 인자 및 점유율)를 나타낸다. 구조 좌표는 약간 변형될 수 있지만, 여전히 거의 동일한 삼차원적 구조를 제공한다. 구조 좌표의 일정량의 독특한 세트는 생성된 구조의 제곱 평균 편차이다. 3 Å, 2 Å, 1.5 Å, 1.0 Å, 또는 0.5 Å 미만의 제곱 평균 편차에 의해서 서로 빗나가는 삼차원적 구조 (특히 결합 포켓의 삼차원적 구조)를 제공하는 구조 좌표는 매우 유사한 것으로 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 관측될 수 있다.

용어 "제곱 평균 편차"는 평균으로부터의 편차의 제곱의 산술적 의미의 제곱근을 의미한다. 이것은 추세 또는 목적으로부터의 편차 또는 변이를 표현하기 위한 방법이다. 본 발명의 목적에 따라, "제곱 평균 편차"는 PB2 폴리펩타이드 단편의 변이체의 골격 또는 그 안의 RNA 캡 결합 포켓에 있어서의 도 18에 따르는 PB2-m⁷GTP 컴플렉스의 구조 좌표에 의해서 정의된 바와 같은 PB2의 골격 또는 그 안의 RNA 캡 결합 포켓으로부터 변이를 정의한다.

본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "컴퓨터 모델을 구성하는"은 원자 구조 정보 및 상호작용 모델을 기초로 한 분자 구조 및/또는 기능의 정량적 및 정성적 분석을 포함한다. 용어 "모델링"은 통상적인 숫자-기본 분자 동적 및 에너지 최소화 모델, 상호작용 컴퓨터 그래프 모델, 변형된 분자 기전 모델, 간격 기하학 (distance geometry), 및 그 밖의 다른 구조-기본 속박 모델을 포함한다.

용어 "피팅 프로그램 운전"은 화학적 물질을 결합 포켓, 분자 또는 분자 컴플렉스, 또는 그의 일부분과 회합시키기 위해서 화학적 물질, 결합 포켓, 분자 또는 분자 컴플렉스 또는 그의 일부분의 구조 좌표를 이용하는 조작을 나타낸다. 이것은 결합 포켓 내의 화학적 물질의 위치를 결정하거나, 회전시키거나, 해독하여 결합 포켓의 형상 및 정전기 상보성을 매칭시킴으로써 달성될 수 있다. 공유적 상호작용, 수소 결합, 정전기, 소수성, 반 데어 발스 상호작용과 같은 비공유적 상호작용, 및 반발식 전하-전하, 쌍극자-쌍극자 및 전하-쌍극자 상호작용과 같은 비-상보적 정전기 상호작용이 최적화될 수 있다. 대신으로, 전문가는 결합 포켓에 대한 화학적 물질의 결합의 변형 에너지를 최소화시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "시험 화합물"은 관심이 있는 폴리펩타이드 단편, 즉 RNA 캡 결합 포켓을 포함하는 본 발명의 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체에 결합하는 그의 능력에 대해서 시험하는 화합물, 분자, 또는 컴플렉스를 포함하는 약제를 나타낸다. 시험 화합물은 펩타이드, 펩토이드, 폴리펩타이드, 단백질 (항체를 포함), 지질, 금속, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 핵산, 소형 유기 또는 무기 분자, 화학적 화합물, 요소, 사카라이드, 동위원소, 탄수화물, 영상화제, 지단백질, 당단백질, 효소, 분석용 프로브, 폴리아민, 및 이들의 조합 및 유도체를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 어떤 약제라도 될 수 있다. 용어 "소분자"는 50 내지 약 2,500 달톤, 바람직하게는 200-800 달톤 범위의 분자량을 갖는 분자를 의미한다. 또한, 본 발명에 따르는 시험 화합물은 임의로, 검출가능한 표지물을 포함할 수 있다. 이러한 표지물에는 효소적 표지물, 방사성 동위원소, 또는 방사성 화합물 또는 원소, 형광성 화합물 또는 금속, 화학발광성 화합물 및 생물발광성 화합물이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 시험 화합물에 검출가능한 표지물을 부착시키기 위해서는 잘 알려진 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 시험 화합물은 또한, 천연 생성물을 함유하는 추출물, 또는 혼합된 조합적 합성물과 같은 물질의 복잡한 혼합물을 포함할 수도 있다. 이들도 또한, 시험할 수 있으며, 표적 폴리펩타이드 단편에 결합하는 성분은 후속 단계에서 혼합물로부터 정제될 수 있다. 시험 화합물은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 유도되거나 선택될 수 있다. 예를 들어, 합성 화합물 라이브러리는 메이브리지 케미칼 컴패니 (Maybridge Chemical Co., Trevillet, Cornwall, UK), 켐브리지 코포레이션 (ChemBridge Corporation, San Diego, CA), 또는 앨드리히 (Aldrich, Milwaukee, WI)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 천연 화합물 라이브러리는 예를 들어, 팀테크 엘엘시 (TimTec LLC, Newark, DE)로부터 입수할 수 있다. 대신으로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 세포 및 조직 추출물의 형태인 천연 화합물의 라이브러리가 사용될 수 있다. 추가로, 시험 화합물은 조합 화학을 사용하여 개개 화합물로서 또는 혼합물로서 합성적으로 생산될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "뉴클레오타이드"는 예를 들어, 문헌 조합 화학을 사용하여 제조된 화합물의 수집은 본 발명에서 조합 라이브러리로 불린다.

용어 "고속 세팅으로"는 시험 화합물의 라이브러리를 관심이 있는 폴리펩타이드 단편에 결합하는 그들의 능력에 관해서 스크리닝하기 위해서 사용되는 다양한 유형의 고속 스크리닝 시험방법 및 기술을 나타낸다. 일반적으로, 고속 시험방법은 멀티-웰 형식으로 수행되며, 세포-부재 시험뿐만 아니라 세포-기본 시험을 포함한다.

용어 "항체"는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 둘 다, 즉 항원 또는 합텐을 인식할 수 있는 모든 면역글로불린 단백질 또는 그의 일부분, 즉 PB2의 RNA 캡 결합 영역 또는 그의 펩타이드를 나타낸다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해서, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 분열에 의해서 생산될 수 있다. 일부의 구체예에서, 항원-결합 부분에는 Fab, Fab', F(ab')₂,Fd, Fv, dAb, 및 상보성 결정부분 (CDR) 단편, 단일-쇄 항체 (scFv), 인간화된 항체와 같은 키메릭 항체, 디아바디, 및 적어도 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 항체의 일부분을 함유하는 폴리펩타이드가 포함된다.

용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물 또는 본 발명의 화합물의 염을 나타낸다. 적합한 약제학적으로 허용되는 염에는 예를 들어, 본 발명의 화합물의 용액을 염산, 황산, 푸마르산, 말레산, 석신산, 아세트산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 카본산 또는 인산과 같은 약제학적으로 허용되는 산의 용액을 혼합시킴으로써 형성될 수 있는 산부가염이 포함된다. 추가로, 화합물이 산성 부위를 보유하는 경우에, 그의 적합한 약제학적으로 허용되는 염에는 알칼리 금속염 (예를 들어, 나트륨 또는 칼륨염); 알칼리 토금속염 (예를 들어, 세슘 또는 마그네슘염); 및 적합한 유기 리간드에 의해서 형성된 염 (예를 들어, 할라이드, 하이드록사이드, 카복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트와 같은 반대음이온을 사용하여 형성된 암모늄, 4급 암모늄 및 아민 양이온)이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 염의 예시적 예로는 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 비카보네이트, 비설페이트, 비타르트레이트, 보레이트, 브로마이드, 부티레이트, 칼슘 에데테이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 캄실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 클라불라네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 디하이드로클로라이드, 도데실설페이트, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코헵토네이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리세로포스페이트, 글리콜릴아르사닐레이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 헥실레조르시네이트, 하이드라바민, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 하이드록시나프토에이트, 요오다이드, 이소티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 메탄설포네이트, 메틸설페이트, 무케이트, 2-나프탈렌설포네이트, 납실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, N-메틸글루카민 암모늄염, 올리에이트, 옥살레이트, 파모에이트 (엠보네이트), 팔미테이트, 판토테네이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트/디포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 설페이트, 서브아세테이트, 석시네이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트, 트리에티오다이드, 운데카노에이트, 발레레이트 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다 [참조: 예를 들어, S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66, pp. 1-19 (1977)].

본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "부형제"는 예를 들어, 담체, 결합제, 윤활제, 농조화제, 계면활성제, 보존제, 유화제, 완충제, 방향제, 또는 착색제와 같은, 활성성분이 아닌 약제학적 제제 내의 모든 물질을 나타내고자 하는 것이다.

용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 예를 들어, 탄산마그네슘, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당, 락토즈, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 저융점 왁스, 코코아 버터 등을 포함한다.

본 발명자들은 가용성이며, RNA 캡 또는 그의 유사체에 결합할 수 있고, 따라서 구조적 정보를 수득하기 위해서뿐만 아니라 재조합 단백질을 사용한 결합시험을 수행하기 위한 결정화에 적합한 인플루엔자 바이러스 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2 유도된 단편이 있음을 발견하였다. 본 발명의 한가지 관점은 (i) 인플루엔자 바이러스 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2로부터 유도되고, (ii) RNA 캡 또는 그의 유사체에 결합할 수 있는 가용성 폴리펩타이드 단편을 제공하는 것이다. 본 발명의 가용성 단편이 유도되는 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2는 바람직하게는 인플루엔자 A, B 또는 C 바이러스로부터 유도된다. 본 발명의 가용성 단편의 최소 길이는 RNA 캡 또는 그의 유사체를 결합시키는 그의 능력에 의해서 결정된다. 따라서, 본 발명의 PB2 폴리펩타이드 단편은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 323 내지 404 또는 320 내지 483, 또는 예를 들어, PB2 폴리펩타이드 단편 변이체 내의 그에 상응하는 아미노산으로 구성되거나, 적어도 이들을 포함하거나; SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 325 내지 406 또는 320 내지 484, 또는 예를 들어, PB2 폴리펩타이드 단편 변이체 내의 그에 상응하는 아미노산으로 구성되거나, 적어도 이들을 포함하거나; 또는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 335 내지 416 또는 330 내지 501, 또는 예를 들어, PB2 폴리펩타이드 단편 변이체 내의 그에 상응하는 아미노산으로 구성되거나, 적어도 이들을 포함하는 것이 바람직하다. 다른 한편으로, 단편의 용해도는 그들의 길이가 특정의 C- 및/또는 N-말단 경계를 넘어서 연장되는 경우에 감소하는 것으로 관찰되었다. 인플루엔자 A 타입 유도된 가용성 단편의 경우에, 이들 경계는 SEQ ID NO: 1에 관하여 바람직하게는 N-말단 아미노산 220 또는 변이체 내의 그에 상응하는 아미노산 및 C-말단 아미노산 510 또는 변이체 내의 그에 상응하는 아미노산에 대한 것이다. 인플루엔자 B 타입 유도된 가용성 단편의 경우에, 이들 경계는 SEQ ID NO: 2에 관하여 바람직하게는 N-말단 아미노산 222 또는 변이체 내의 그에 상응하는 아미노산 및 C-말단 아미노산 511 또는 변이체 내의 그에 상응하는 아미노산에 대한 것이다. 인플루엔자 C 타입 유도된 가용성 단편의 경우에, 이들 경계는 SEQ ID NO: 3에 관하여 바람직하게는 N-말단 아미노산 227 또는 변이체 내의 그에 상응하는 아미노산 및 C-말단 아미노산 528 또는 변이체 내의 그에 상응하는 아미노산에 대한 것이다. 이와 관련해서, 용어 "가용성"은 용매에 적어도 0.1 ㎎/㎖로, 더욱 바람직하게는 적어도 0.5 ㎎/㎖로, 더욱 바람직하게는 적어도 1 ㎎/㎖로, 더욱 바람직하게는 5 ㎎/㎖ 또는 그 이상의 농도로 용해할 수 있는 폴리펩타이드 단편을 나타낸다. 적합한 용매는 pH 3 내지 pH 9, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 9, 더욱 바람직하게는 pH 7 내지 pH 9에서, 0.01 M 내지 3 M, 바람직하게는 0.05 M 내지 2 M, 더욱 바람직하게는 0.1 M 내지 1 M 범위의 농도로 트리스ㆍHCl 및 임의로, 1 mM 내지 20 mM의 농도로 디티오트레이톨 (DTT) 또는 TCEP.HCl (트리스(2-카복시에틸) 포스핀 하이드록시클로라이드)과 같은 환원제를 포함하는 완충제 시스템이다.

바람직한 구체예에서, 상기 폴리펩타이드 단편은 결정화에 적합한 정도로 정제된다. 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%의 순도를 갖는다. 단백질의 순도는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 은 염색에 의한 염색 또는 HPLC 및 280 ㎚에서의 검출을 포함하는 표준 방법에 의해서 평가될 수 있다.

또 다른 바람직한 구체예에서,

(i) 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 SEQ ID NO: 1에 따르는 PB2의 아미노산 서열의 아미노산 위치 220 또는 그보다 상위, 예를 들어, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 또는 323과 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 예를 들어, 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 220과 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510, 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 225 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 230 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 235 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 240 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 245 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 250 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 255 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 260 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 265 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 270 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 275 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 280 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 280 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 285 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 290 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 295 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 300 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 305 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 310 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 315 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 320 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 또는 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 323 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위, 특히 505, 500, 495, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 484 또는 483과 동일하거나 그에 상응하고; 또는

(ii) 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 SEQ ID NO: 2에 따르는 PB2의 아미노산 서열의 아미노산 위치 222 또는 그보다 상위, 예를 들어, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 222 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 225 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 230 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 235 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 240 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 245 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 250 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 255 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 260 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 265 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 270 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 275 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 280 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 285 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 290 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 295 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 300 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 305 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 310 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 315 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 320 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 또는 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 325 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하고, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위, 예를 들어, 510, 505, 500, 499, 498, 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489, 488, 487, 486, 485, 또는 484와 동일하거나 그에 상응하고; 또는

(iii) 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 SEQ ID NO: 3에 따르는 PB2의 아미노산 서열의 아미노산 위치 227 또는 그보다 상위, 예를 들어, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 또는 335와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 227 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 230 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 235 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 240 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 245 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 250 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 255 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 260 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 265 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 270 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 275 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 280 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 285 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 290 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 295 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 300 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 305 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 310 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 315 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 320 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 325 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 330 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응하고; 또는 더욱 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 단편의 N-말단은 아미노산 위치 335 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위, 예를 들어, 525, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 또는 501과 동일하거나 그에 상응한다.

또 다른 구체예에서, 상기 폴리펩타이드 단편은 RNA 캡 또는 그의 유사체와 회합하는 능력을 보유하고, 가용성인 SEQ ID NO: 4 내지 13에 따르는 아미노산 서열 및 그의 변이체의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들에 상응한다. 바람직한 구체예에서, 상기 폴리펩타이드 단편은 아미노산 치환, 삽입 또는 결실, 바람직하게는 상술한 바와 같은 천연적으로 존재하는 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 PB2 폴리펩타이드 단편은 아미노산 잔기 235 내지 496 (SEQ ID NO: 4), 241 내지 483 (SEQ ID NO: 5), 268 내지 483 (SEQ ID NO: 6), 277 내지 480 (SEQ ID NO: 7), 281 내지 482 (SEQ ID NO: 8), 290 내지 483 (SEQ ID NO: 9), 295 내지 482 (SEQ ID NO: 10), 318 내지 483 (SEQ ID NO: 11), 320 내지 483 (SEQ ID NO: 12), 또는 323 내지 404 (SEQ ID NO: 13)를 갖거나, 이들에 상응한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상술한 바와 같은 PB2 폴리펩타이드 단편 및 RNA 캡 또는 그의 유사체를 포함하는 컴플렉스를 제공한다. 바람직하게는, 캡 유사체는 m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, 및 m⁷GpppUm으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 한가지 구체예에서, 컴플렉스 내의 폴리펩타이드 단편은 SEQ ID NO: 11에 따르는 아미노산 서열로 구성되고, 캡 유사체는 m⁷GTP이며, 여기에서 컴플렉스는 도 18에 나타낸 바와 같은 구조 좌표에 의해서 정의되는 구조를 갖는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 모든 컴플렉스는 결정성 형태, 바람직하게는 공간 그룹 C222₁ 및 a = 9.2 ㎚, b = 9.4 ㎚, c = 22.0 ㎚ ± 0.3 ㎚의 단위 셀 크기를 갖는 것을 포함한다. 바람직하게는, 상기 결정은 X-선을 3.0 Å 또는 그 이상, 바람직하게는 2.8 Å 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 2.6 Å 또는 그 이상, 가장 바람직하게는 2.4 Å 또는 그 이상의 분해능으로 회절시킨다.

한가지 구체예에서, 결정화에 적합한 단백질 용액은 수용액 중에 5 ㎎/㎖ 내지 20 ㎎/㎖, 바람직하게는 8 ㎎/㎖ 내지 18 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 11 ㎎/㎖ 내지 15 ㎎/㎖의 농도로 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체, 2 mM 내지 10 mM, 바람직하게는 3 mM 내지 8 mM, 더욱 바람직하게는 4 mM 내지 6 mM의 농도로 RNA 캡 유사체, 임의로, pH 3 내지 pH 9, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 9, 더욱 바람직하게는 pH 7 내지 pH 9에서 0.01 M 내지 3 M, 바람직하게는 0.05 M 내지 2 M, 더욱 바람직하게는 0.1 M 내지 1 M 범위의 농도로 트리스ㆍHCl과 같은 완충제 시스템, 및 임의로, 1 mM 내지 20 mM의 농도로 디티오트레이톨 (DTT) 또는 TCEP.HCl (트리스(2-카복시에틸) 포스핀 하이드록시클로라이드)과 같은 환원제를 포함할 수 있다. PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체 또는 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체와 RNA 캡 또는 그의 유사체를 포함하는 컴플렉스는 결정화 용액 내에서 바람직하게는 85% 내지 100% 순수하고, 더욱 바람직하게는 90% 내지 100% 순수하며, 더 더욱 바람직하게는 95% 내지 100% 순수하다. 결정을 생산하기 위해서는, 결정화에 적합한 단백질 용액을 등용적의 침전제 용액, 예를 들어, 나트륨 포르메이트, 황산암모늄, 다양한 크기의 폴리에틸렌 글리콜과 혼합시킨다. 바람직한 구체예에서, 결정화 매질은 1.5 내지 2 M 나트륨 포르메이트, 및 pH 4 내지 pH 5의 0.05 내지 0.15 M 시트르산을 포함하는 유사한 용적, 바람직하게는 등용적의 침전제 용액과 혼합된 0.05 내지 2 ㎕, 바람직하게는 0.8 내지 1.2 ㎕의 결정화에 적합한 단백질 용액을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 침전제 용액은 7% PEG6000, 1 M LiCl, 0.1 M 시트르산 pH 5.0, 10 mM TCEP.HCl을 포함한다.

결정은 현적 (hanging drop) 및 시팅 드롭 (sitting drop) 기술, 샌드위치-드롭 (sandwich-drop), 투석 및 마이크로배취 (microbatch) 또는 마이크로튜브 (microtube) 배취 장치를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 방법에 의해서나 성장시킬 수 있다. 본 발명의 단독으로 또는 화합물과의 컴플렉스로 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체를 결정으로 생산할 수 있는 다른 결정화 조건을 확인하기 위하여 상술한 결정화 조건을 변화시키는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 쉽게 명백할 것이다. 이러한 변화에는 pH, 단백질 농도 및/또는 결정화 온도를 조정하거나, 사용된 염 및/또는 침전제의 실체 또는 농도를 변화시키거나, 결정화를 도와주는 세제 (예를 들어, 트윈 (TWEEN) 20 (모노라우레이트), LDOA, 브리즈 (Brij) 30 (4 라우릴 에테르)), 당류 (예를 들어, 글루코즈, 말토즈), 유기 화합물 (예를 들어, 디옥산, 디메틸포름아미드), 란타니드 이온, 또는 다이온성 화합물과 같은 첨가제를 도입시키는 것이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 고속 결정화 시험을 또한 사용하여 결정화 조건을 발견하거나 최적화시키는 것을 도와줄 수 있다.

마이크로접종 (microseeding)을 사용하여 결정의 크기 및 품질을 증가시킬 수 있다. 간략하면, 마이크로-결정을 파쇄하여 저장 종자 용액을 수득한다. 저장 종자 용액을 계열 희석한다. 니들 (needle), 유리 봉 또는 헤어 (hair)의 스트랜드를 사용하여, 각각의 희석된 용액으로부터의 작은 샘플을 종자의 부재 하에서 결정을 생성시키는데 필요한 농도와 동등하거나 그 미만인 단백질 농도를 함유하는 평형화된 드롭의 세트에 첨가한다. 목표는 드롭 내에서 결정 성장의 핵으로 작용할 수 있는 단일 종자 결정으로 끝나는 것이다.

본 명세서에 기술된 바와 같이, 도 18에 나타낸 바와 같은 구조 좌표를 수득하는 방식, 좌표의 해석 및 본 명세서에 기술된 바와 가 단백질 구조를 이해하는데 있어서의 그들의 유용성은 문헌 [J. Drenth, "Principles of protein X-ray crystallography", 2^nd Ed., Springer Advanced Texts in Chemistry, New York (1999); 및 G. E. Schulz and R. H. Schirmer, "Principles of Protein Structure", Springer Verlag, New York (1985)]과 같은 표준 자료를 참고로 하여 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해된다. 예를 들어, X-선 회절 데이터는 일차로 종종, 100 K로 동결된 동결보호된 (예를 들어, 20% 내지 30% 글리세롤에 의함) 결정을 사용하여, 예를 들어, X-선 공급원으로서 싱크로트론 설비 (synchrotron facility) 또는 회전 양극에서 빔라인 (beamline)을 사용하여 획득된다. 그 후, 상 문제 (phase problem)는 일반적으로 공지된 방법, 예를 들어, 다파장 비정상 회절 (MAD), 다중 이성질체 대체법 (MIR), 단일 파장 비정상 회절 (SAD), 또는 분자 대체법 (MR)에 의해서 해결된다. 서브-구조 (sub-structure)는 SHELXD (Schneider and Sheldrick, 2002)를 사용하여 해결되고, SHARP (Vonrhein et al., 2006)에 의해서 상 계산되고, 용매 플래트닝 (flattening) 및 비-결정학적 대칭 평균화 (예를 들어, RESOLVE (Terwilliger, 2000)에 의함)에 의해서 개선될 수 있다. 모델 오토빌딩 (autobuilding)은 예를 들어, ARP/wARP (Perrakis et al., 1999)에 의해서 수행될 수 있으며, 정교화 (refinement)는 예를 들어, REFMAC (Murshudov, 1997)에 의해서 수행될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 의해서 제공된 PB2 단편의 구조 좌표 (도 18)는 다른 오르토믹소비리다에 속 (Orthomyxoviridae genera)의 PB2 폴리펩타이드, 또는 분자 대체의 방법을 사용한 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 구조 결정에 유용하다.

본 발명의 또 다른 관점은 상기 언급된 PB2 폴리펩타이드 단편 및 그의 변이체를 코드화한 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. 이러한 분리된 뉴클레오타이드 단편을 수득하기 위해서 적용된 분자 생물학 방법은 일반적으로 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있다 (표준 분자 생물학 방법에 관해서는 본 명세서에 참고로 포함된 문헌 [Sambrook et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]을 참조). 예를 들어, RNA는 인플루엔자 바이러스 감염된 세포로부터 분리될 수 있으며, cDNA는 랜덤 프라이머 (예를 들어, 데카머의 랜덤 헥사머) 또는 관심이 있는 단편의 생성에 특이적인 프라이머를 사용하여 역전사 폴리머라제 연쇄반응 (RT-PCR)을 적용함으로써 생성될 수 있다. 그 후, 관심이 있는 단편은 단편 특이적 프라이머를 사용한 표준 PCR에 의해서 증폭될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 가용성 PB2 폴리펩타이드 단편의 바람직한 구체예를 코드화한 분리된 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NOs: 23 (인플루엔자 A), 26 (인플루엔자 B), 또는 27 (인플루엔자 C)로부터 유도된다. 바람직한 구체예에서, 가용성 인플루엔자 A 바이러스 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체를 코드화한 분리된 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1과 비교하여 위치 389에서 아르기닌으로부터 리신으로의 아미노산 교환을 포함하는 SEQ ID NO: 25로부터 유도된다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 인플루엔자 A 바이러스 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체를 코드화한 분리된 폴리뉴클레오타이드는 대장균 (E. coli) 코돈 유용성을 위해서 최적화된 DNA 서열인 SEQ ID NO: 26으로부터 유도된다. 이와 관련하여, "유도된"은 SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 또는 27이 전체-길이 PB2 폴리펩타이드를 코드화하고, 바람직한 PB2 폴리펩타이드 단편을 코드화한 폴리뉴클레오타이드는 각각의 코드화된 PB2 폴리펩타이드 단편에 의해서 필요한 바에 따라 폴리뉴클레오타이드의 5' 및 3' 말단에서 결실을 포함한다는 사실을 나타낸다.

한가지 구체예에서, 본 발명은 상기의 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 벡터 내에 관심이 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 혼입시키기 위해서 사용되는 기술에 대해서 잘 알고 있다 (또한, 참고: Sambrook et al., 1989). 이러한 벡터에는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파지와 같은 파지 벡터, 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 박테리아 인공적 염색체 (BAC), 효모 인공적 염색체 (YAC), 또는 P1 인공적 염색체 (PAC)와 같은 인공적 염색체 벡터를 포함한, 숙련된 전문가에게 공지된 모든 벡터가 포함된다. 상기 벡터는 원핵성 또는 진핵성 발현에 적합한 발현 벡터일 수 있다. 상기 플라스미드는 복제의 기원 (ori), 다중 클로닝 부위, 및 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 (구성적 또는 유도성), 전사 개시 부위, 리보좀 결합 부위, 전사 종결 부위, 폴리아데닐화 시그날, 및 돌연변이 또는 결실의 상보성을 기초로 하는 항생제 저항성 또는 영양요구성 (auxotrophic) 마커와 같은 선택 마커를 포함할 수 있다. 한가지 구체예에서, 관심이 있는 폴리뉴클레오타이드 서열은 조절 서열에 작동적으로 결합된다.

또 다른 구체예에서, 상기 벡터는 관심이 있는 폴리펩타이드 단편의 정제를 용이하게 하는 에피토프-, 펩타이드-, 또는 단백질-태그를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 에피토프-, 펩타이드-, 또는 단백질-태그에는 헤마글루티닌- (HA-), FLAG-, myc-태그, 폴리-His-태그, 글루타치온-S-트랜스퍼라제- (GST-), 말토즈-결합-단백질- (MBP-), NusA-, 및 티오레독신-태그, 또는 (증진된) 녹색 형광성 단백질 ((E)GFP), (증진된) 황색 형광성 단백질 ((E)YFP), 디스코소마 (Discosoma) 종 (DsRed) 또는 모노머성 (mRFP)으로부터 유도된 적색 형광성 단백질 (RFP), 시안 형광성 단백질 (CFP) 등과 같은 형광성 단백질-태그가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 구체예에서, 에피토프-, 펩타이드-, 또는 단백질-태그는 예를 들어, 트롬빈, 인자 Xa, 프레시죤 (PreScission), TEV 프로테아제 등과 같은 프로테아제를 사용하여 관심이 있는 폴리펩타이드 단편으로부터 분열될 수 있다. 이러한 프로테아제에 대한 인식 부위는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있다. 또 다른 구체예에서, 벡터에는 재조합 숙주 세포의 배양 배지 내로, 또는 박테리아의 주변세포질 공간 내로 관심이 있는 폴리펩타이드 단편의 분비를 유도하는 기능적 서열을 포함한다. 시그날 서열 단편은 통상적으로, 세포로부터 단백질의 분비를 지시하는 소수성 아미노산으로 이루어진 시그날 펩타이드를 코드화한다. 단백질은 성장 배지 내로 (그람-양성 박테리아), 또는 세포의 내막과 외막 사이에 위치하는 주변세포질 공간 내로 (그람-음성 박테리아) 분비된다. 바람직하게는, 시그날 펩타이드 단편과 외래 유전자 사이에서 생체내 또는 시험관내 코드화된, 분열될 수 있는 가공 부위 (processing sites)가 존재한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기의 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 상기의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 재조합 숙주 세포는 아케아 (archea) 및 박테리아 세포와 같은 원핵세포 또는 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은 진핵세포일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 대장균 세포와 같은 박테리아 세포이다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 상기의 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 상기의 재조합 벡터를 상기의 숙주 세포 내로 도입시키는 방법에 대해서 잘 알고 있다. 예를 들어, 박테리아 세포는 예를 들어, 화학적 형질전환, 예를 들어, 염화칼슘 방법, 또는 전기천공법을 사용하여 쉽게 형질전환될 수 있다. 효모 세포는 예를 들어, 리튬 아세테이트 변형방법 또는 전기천공을 사용하여 형질전환될 수 있다. 다른 진핵세포는 예를 들어, 리포펙타민 (Lipofectamine™; Invitrogen)과 같은 상업적으로 입수할 수 있는 리포좀-기본 형질감염 키트, 푸젠 (Fugene; Roche Diagnostics)과 같은 상업적으로 입수할 수 있는 지질-기본 형질감염 키트, 폴리에틸렌 글리콜-기본 형질감염, 인산칼슘 침전, 유전자 총 (biolistic), 전기천공, 또는 바이러스 감염을 사용하여 형질감염될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 재조합 숙주 세포는 관심이 있는 폴리뉴클레오타이드 단편을 발현한다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 상기의 발현은 본 발명의 가용성 폴리펩타이드 단편을 유도한다. 이들 폴리펩타이드 단편은 임의로 상기-언급된 에피토프-, 펩타이드- 또는 단백질-태그를 이용하여, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 단백질 정제방법을 사용하여 정제될 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓의 전부 또는 일부를 회합시키는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (a) 도 18에 나타낸 바와 같은 컴플렉스의 구조 좌표에 의해서 정의된 상기 결합 포켓의 컴퓨터 모델을 구성하고; (b) (i) 분자 단편을 상기 화합물로 조립하고, (ii) 소분자 데이터베이스로부터 화합물을 선택하고, (c) 상기 화합물을 새로이 디자인하는 것으로 구성된 그룹으로부터 선택된 방법에 의해서 잠재적 결합 화합물을 선택하고; (c) 결합 포켓 내의 상기 화합물의 에너지-최소화된 배열을 제공하기 위해서 컴퓨터 수단을 사용하여 상기 화합물 및 상기 결합 포켓의 컴퓨터 모델 사이의 피팅 프로그램 운전을 수행하고; (d) 상기 피팅 운전의 결과를 평가하여 상기 화합물과 결합 포켓 모델 사이의 회합을 정량화하고, 이에 의해서 상기 결합 포켓과 회합하는 상기 화합물의 능력을 평가하는 단계를 포함한다.

처음으로, 본 발명은 도 18에 따르는 결합 포켓의 구조 좌표를 기초로 하여, PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 RNA 캡 결합 포켓에 대한 잠재적 결합 파트너, 바람직하게는 RNA 캡 결합의 억제제를 확인하거나, 선택하거나, 디자인하기 위한 분자 디자인 기술의 사용을 허용한다. 아마도 상기 결합 포켓에 결합할 수 있는 다수의 다양한 화합물의 제조 및 시험과 연관된 고비용을 고려하면, 이러한 예측 모델이 유용하다. RNA 캡 유사체와의 컴플렉스에서 PB2 폴리펩타이드 단편에 대해서 생성된 구조 좌표를 사용하기 위해서는, 구조 좌표를 삼차원적 형상으로 전환시키는 것이 필요하다. 이것은 구조 좌표의 세트로부터 분자 또는 그의 일부분의 삼차원적 그래프 표시를 생성시킬 수 있는 상업적으로 입수할 수 있는 소프트웨어의 사용을 통해서 달성된다. 이러한 컴퓨터 프로그램에 대한 예는 모델러 (MODELER) (A. Sali and T. L. Blundell, J. Mol. Biol., 234, pp. 779-815 (1993); 인사이트 II 상동성 소프트웨어 패키지 (Insight II Homology software package; Insight II (97.0), Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA)에서 제공됨)이다.

본 기술분야에서 숙련된 전문가는 화학적 물질 또는 단편을 PB2 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 RNA 캡 결합 포켓에 결합하는 그들의 능력에 관하여 스크리닝하기 위해서 몇 가지 방법을 사용할 수 있다. 이 방법은 예를 들어, 도 18에 따르는 구조 좌표를 기초로 한 PB2의 RNA 캡 결합 포켓의 삼차원적 컴퓨터 모델을 시각적으로 검사함으로써 시작할 수 있다. 그 후, 선택된 단편 또는 화학적 화합물은 다양한 배향으로 위치시키거나, 결합 포켓 내에 도킹시킬 수 있다. 도킨 (docking)은 세리우스 (Cerius), 콴타 (Quanta), 및 시빌 (Sybyl) (Tripos Associates, St. Louis, MO)과 같은 소프트웨어를 사용하고, 이어서 에너지 최소화, 및 OPLS-AA, 참 (CHARMM) 및 앰버 (AMBER)와 같은 표준 분자 동역학 역장 (molecular dynamics force fields)에 의한 분자 동역학을 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 화합물 또는 단편을 선택하는 방법에서 본 기술분야에서 숙련된 전문가를 도와줄 수 있는 추가의 전문적 컴퓨터 프로그램에는 예를 들어, (i) 오토도크 (AUTODOCK) (D. S. Goodsell et al., "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing", Proteins: Struct., Funct., Genet., 8, pp. 195-202 (1990); 오토도크는 더스크립스 리서치 인스티튜트 (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA)로부터 입수할 수 있다) 및 (ii) 도크 (DOCK) (I. D. Kuntz et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions", J. Mol. Biol., 161, pp. 269-288 (1982); 도크는 유니버시티 오브 캘리포니아 (University of California, San Francisco, CA)로부터 입수할 수 있다)가 포함된다.

일단 적합한 화합물 또는 단편이 선택되면, 이들은 단일 화합물 또는 컴플렉스로 디자인되거나 조립될 수 있다. 이러한 수동적 모델 구성은 콴타 또는 시빌과 같은 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 개개의 화합물 또는 단편을 연결시키는데 숙련된 전문가를 도와주는 유용한 프로그램에는 예를 들어, (i) 캐비아트 (CAVEAT) (P. A. Bartlett et al., "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules", in Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems", Special Publication, Royal Chem. Soc., 78, pp. 182-196 (1989); G. Lauri and P. A. Bartlett, "CAVEAT: A Program to Facilitate the Design of Organic Molecules", J. Comp. Aid. Mol. Des., 8, pp. 51-66 (1994); 캐비아트는 유니버시티 오브 캘리포니아 (University of California, Berkley, CA)로부터 입수할 수 있다), (ii) 이시스 (ISIS) (MDL Information Systems, San Leandro, CA; reviewed in Y. C. Martin, "3D Database Searching in Drug Design", J. Med. Chem., 35, pp. 2145-2154 (1992))와 같은 3D 데이터베이스 시스템, 및 (iii) 후크 (HOOK) (M. B. Eisen et al., "HOOK: A Program for Finding Novel Molecular Architectures that Satisfy the Chemical and Steric Requirements of a Macromolecule Binding Site", Proteins: Struct., Funct., Genet., 19, pp. 199-221 (1994); 후크는 몰레큘라 시뮬레이션즈 인코포레이티드 (Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA)로부터 입수할 수 있음)가 포함된다.

본 발명에 의해서 가능하게 된 또 다른 접근방법은 PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓에 전체적으로 또는 부분적으로 결합할 수 있는 화합물에 대한 소분자 데이터베이스의 컴퓨터 스크리닝이다. 이 스크리닝에서, 결합 포켓에 대한 이러한 화합물의 피팅의 품질은 형상 상보성 (shape complementarity)에 의해서, 또는 추정된 상호작용 에너지에 의해서 판단될 수 있다 (E. C. Meng et al., J. Comp. Chem., 13, pp. 505-524 (1992)).

대신으로, PB2의 RNA 캡 결합 포켓에 대한 잠재적 결합 파트너, 바람직하게는 RNA 캡 결합의 억제제는 도 18에 따르는 RNA 캡 유사체와의 컴플렉스에서 PB2 폴리펩타이드 단편의 3D 구조를 기초로 하여 새롭게 디자인될 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가가 이용할 수 있는 다양한 새로운 리간드 디자인 방법이 있다. 이러한 방법에는 (i) 루디 (LUDI) (H.-J. Bohm, "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. Comp. Aid. Mol. Des., 6, pp. 61-78 (1992); 루디는 몰레큘라 시뮬레이션즈 인코포레이티드 (Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA)로부터 입수할 수 있다), (ii) 레전드 (LEGEND) (Y. Nishibata and A. Itai, Tetrahedron, 47, pp. 8985-8990 (1991); 레전드는 몰레큘라 시뮬레이션즈 인코포레이티드 (Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA)로부터 입수할 수 있다), (iii) 리프프로그 (LeapFrog) (트리포스 어소시에이츠 (Tripos Associates, St. Louis, MO)로부터 입수할 수 있다), (iv) 스프라우트 (SPROUT) (V. Gillet et al., "SPROUT: A Program for Structure Generation", J. Comp. Aid. Mol. Des., 7, pp. 127-153 (1993); 스프라우트는 유니버시티 오브 리즈 (University of Leeds, UK)로부터 입수할 수 있다), (v) 그룹빌드 (GROUPBUILD) (S. H. Rotstein and M. A. Murcko "GroupBuild: A Fragment-Based Method for De Novo Drug Design", J. Med. Chem., 36, pp. 1700-1710 (1993)), 및 (vi) 그로우 (GROW) (J. B. Moon and W. J. Howe, "Computer Design of Bioactive Molecules: A Method for Receptor-Based De Novo Ligand Design", Proteins, 11, pp 314-328 (1991))가 포함된다.

또한, 잠재적 RNA 캡 결합 포켓 상호작용 화합물의 새로운 디자인 및 모델링에 있어서 본 기술분야에서 숙련된 전문가를 도와줄 수 있는 몇 가지의 분자 모델링 기술 (이에 의해서 참고로 포함됨)이 기술되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [N. C. Cohen et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem., 33, pp. 883-894 (1990); M. A. Navia and M. A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design", Curr. Opin. Struct. Biol., 2, pp. 202-210 (1992); L. M. Balbes et al., "A Perspective in Modern Methods in Computer-Aided Drug Design", Reviews in Computational Chemistry, Vol. 5, K. B. Lipkowitz and D. B. Boyd, Eds., VCH, New York, pp. 37-380 (1994); W. C. Guida, "Software for Structure-Based Drug Design", Curr. Opin. Struct. Biol., 4, pp. 777-781 (1994)]이 포함된다.

PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 변이체의 결합 포켓에 대한 결합으로 디자인되거나 선택된 분자는 그의 결합 상태에서 이것이 바람직하게는 표적 부분과의 반발식 정전기적 상호작용을 결여하도록 더 컴퓨터적으로 최적화될 수 있다. 이러한 비-상보성 (예를 들어, 정전기적) 상호작용에는 반발식 전하-전하, 쌍극자-쌍극자 및 전하-쌍극자 상호작용이 포함된다. 구체적으로, 결합된 상태에서 결합 화합물과 결합 포켓 사이의 모든 정전기적 상호작용의 합은 바람직하게는, 결합의 엔탈피에 대해 중립적이거나 우호적으로 기여한다. 화합물 변형 에너지 및 정전기적 상호작용을 평가할 수 있는 특이적 컴퓨터 프로그램은 본 기술분야에서 이용할 수 있다. 적합한 프로그램의 예로는 (i) 가우시안 (Gaussian) 92, 개정 C (M. J. Frisch, Gaussian, Incorporated, Pittsburgh, PA), (ii) 앰버 (AMBER), 버전 4.0 (P. A. Kollman, University of California, San Francisco, CA), (iii) 콴타/참 (QUANTA/CHARMM) (Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA), (iv) OPLS-AA (W. L. Jorgensen, "OPLS Force Fields", Encyclopedia of Computational Chemistry, Schleyer, Ed., Wiley, New York (1998) Vol. 3, pp. 1986-1989), 및 (v) 인사이트 II/디스커버 (Insight II/Discover) (Biosysm Technologies Incorpo-rated, San Diego, CA)가 포함된다. 이들 프로그램은 예를 들어, 실리콘 그래픽스 워크스테이션 (Silicon Graphics workstation), 이리스 (IRIS) 4D/35 또는 IBM RISC/6000 워크스테이션 모델 550을 사용하여 실행될 수 있다. 그 밖의 다른 하드웨어 시스템 및 소프트웨어 패키지도 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있다.

일단 상술한 바와 같이 관심이 있는 분자가 선택되거나 디자인되면, 그 후에는 그의 결합 특성을 개선시키거나 변형시키기 위해서 그의 원자 또는 측쇄 그룹에서 치환이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 초기 치환은 보존적인데, 즉 대체 그룹은 원래의 그룹과 동일한 크기, 형상, 소수성 및 전하에 가까울 수 있다. 물론, 입체배좌를 변화시키는 것으로 본 기술분야에서 공지된 성분은 피하여야 하는 것으로 이해된다. 그 후, 이러한 치환된 화학적 화합물은 상기에 상세하게 기술된 동일한 컴퓨터 방법에 의해서 PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 변이체의 결합 포켓에 대한 피팅의 효율에 대해서 분석할 수 있다.

본 발명의 상술한 방법의 한가지 구체예에서, PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, 및 Phe404, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, Phe404, Phe325, Phe330, 및 Phe363, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, 및 Phe363, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기의 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, 및 Lys376, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따라는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, 및 Lys376, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, Lys376, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Met431, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, 및 Met431, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, 및 Met431, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, 및 Met431, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, His432, 및 Met431, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Glu361, 및 Lys376, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe363, Glu361, 및 Lys376, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, 및 Lys376, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, 및 Ser337, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 His357, Phe404, Phe325, Glu361, Lys376, Arg332, Ser337, 및 Met431, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 His357, Phe404, Phe325, Glu361, Lys376, Arg332, Ser337, Met431, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Phe325, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Glu361, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Lys376, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, 및 Lys376, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325 및 Glu361, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325 및 Lys376, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함한다. 더구나, 다른 구체예에서 상기 정의된 결합 포켓은 임의로, SEQ ID NO: 1에 따르는 아미노산 Met431에 상응하는 아미노산, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함할 수 있다.

본 발명의 상술한 방법의 추가의 관점에서, PB2의 RNA 캡 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, 및 Phe404의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, Phe404, Phe325, Phe330, 및 Phe363의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, 및 Phe363의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, 및 Lys376의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, 및 Lys376의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, Lys376, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Met431의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, 및 Met431의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, 및 Met431의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, 및 Met431의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, His432, 및 Met431의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Glu361, 및 Lys376의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe363, Glu361, 및 Lys376의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, 및 Lys376의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, 및 Ser337의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 His357, Phe404, Phe325, Glu361, Lys376, Arg332, Ser337, 및 Met431의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 His357, Phe404, Phe325, Glu361, Lys376, Arg332, Ser337, Met431, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Phe325의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Glu361의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Lys376의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, 및 Lys376의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, 및 Glu361의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합 포켓은 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, 및 Lys376의 구조 좌표에 의해서 정의된다. 더구나, 다른 구체예에서 상기 정의된 바와 같은 결합 포켓은 임의로, 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO:1 아미노산 Met431의 구조 좌표에 의해서 추가로 정의될 수 있다.

한가지 관점에서, 본 발명은 도 18에 따르는 PB2의 RNA 캡 결합 포켓에 대한 변이체인 결합 포켓과 회합할 수 있는 화합물에 대해서 상술한 방법에 따라 컴퓨터 스크리닝하는 방법을 제공한다. 한가지 구체예에서, 상기 결합 포켓의 변이체는 아미노산 Phe323, His357, 및 Phe404의; 아미노산 Phe323, Phe404, Phe325, Phe330, 및 Phe363의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, 및 Phe363의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, 및 Lys376의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Ser 320, Arg332, Ser337, 및 Gln406의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, 및 Lys376의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, Lys376, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Met431의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, 및 Met431의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, 및 Met431의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, 및 Met431의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, Lys376, Ser320, Arg332, Ser337, Gln406, Lys339, Arg355, Asn429, His432, 및 Met431의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Glu361, 및 Lys376의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe363, Glu361, 및 Lys376의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, 및 Lys376의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, Phe330, Phe363, Glu361, 및 Ser337의; 아미노산 His357, Phe404, Phe325, Glu361, Lys376, Arg332, Ser337, 및 Met431의; 아미노산 His357, Phe404, Phe325, Glu361, Lys376, Arg332, Ser337, Met431, Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Phe325의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Glu361의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, 및 Lys376의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Glu361, 및 Lys376의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, 및 Glu361의; 아미노산 Phe323, His357, Phe404, Phe325, 및 Lys376의 골격구조 원자로부터 3 Å 이하의 제곱 평균 편차를 가지며, 여기에서 상기 아미노산 조합은 임의로, 도 18에 따르는 아미노산 Met431을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 제곱 평균 편차는 2.5 Å 이하이다. 또 다른 구체예에서, 상기 제곱 평균 편차는 2 Å 이하이다. 또 다른 구체예에서, 상기 제곱 평균 편차는 1.5 Å 이하이다. 또 다른 구체예에서, 상기 제곱 평균 편차는 1 Å 이하이다. 또 다른 구체예에서, 상기 제곱 평균 편차는 0.5 Å 이하이다.

바람직한 구체예에서, m⁷GTP는 용매 쪽의 His357와 단백질 쪽의 5 개의 페닐알라닌의 클러스터 (cluster), 주로 Phe323 및 Phe404뿐만 아니라, 또한 Phe325, Phe330, 및 Phe363 사이에 샌드위치된다. 이 바람직한 구체예에서, 구아노신 염기의 특정한 인식은 주로, m⁷GTP의 비국재화된 양성 전하를 중화시키는 것을 또한 도와주는, 구아닌의 N2 및 N1 위치에 대한 Glu361 수소 결합에 의해서 달성된다. 또한, Lys376은 O6에 대한 긴 수소 결합을 만든다. 리간드 포켓 내에는 Glu361, Lys376, 및 Gln406과 상호작용하지만, 리간드와는 직접적으로 상호작용하지 않는 두 개의 잘 정렬된 매복 물 분자가 있다. 중요한 제2 층 잔기는 바람직하게는, His357에 수소 결합하는 Arg332 및 Ser337이다. 염기의 N2의 수소 결합 간격 내에는 물 분자 또는 Ser320이 있다. N7 메틸 그룹은 Gln406 (3.4 Å)의 측쇄와 반 데어 발스 접촉하며, Phe404 (3.4 Å)의 카보닐 산소는 약간 더 떨어져서 Met431의 측쇄와 접촉한다. 이 구체예에서, 트리포스페이트는 염기 쪽으로 둥글게 구부러진다. 알파-포스페이트는 His432 및 Asn429와 상호작용하며, 감마-포스페이트는 염기성 잔기 His357, Lys339, 및 Arg355와 상호작용한다.

상술한 방법에 따른 컴퓨터 모델링이 PB2의 RNA 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓에 대한 화합물의 결합을 시사한다면, 상기 화합물을 합성할 수 있으며, 임의로 상기 결합 포켓에 결합하는 상기 화합물의 능력은 (e) 상기 화합물을 합성하고, 임의로 (f) 상기 화합물을 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체 또는 본 발명의 재조합 숙주 세포 및 RNA 캡 또는 그의 유사체와 접촉시켜 상기 PB2 폴리펩타이드 단편과 상기 RNA 캡 또는 그의 유사체 사이의 결합을 억제하는 화합물의 능력을 측정하는 추가의 단계를 포함하는 방법에 의해서 시험관내 또는 생체내에서 시험할 수 있다. 결합 포켓에 대한 이러한 화합물의 피팅의 품질은 형상 상보성에 의해서, 또는 추정된 상호작용 에너지에 의해서 판단될 수 있다 (E. C. Meng et al., J. Comp. Chem., 13, pp. 505-524 (1992)). 상기 화합물을 합성하는 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있거나, 이러한 화합물은 상업적으로 입수할 수 있다. 확인된 화합물의 상기 RNA 캡 결합 억제효과를 측정하는 방법은 이하에 기술한다.

본 발명의 또 다른 관점은 상술한 방법에 의해서 확인될 수 있는 화합물을 제공하는 것이나, 단 상기 화합물은 m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, and m⁷GpppCm, m⁷GpppU, 및 m⁷GpppUm으로 구성된 그룹으로부터 선택된 RNA 캡 유사체, 또는 RNA 캡 결합의 소분자 억제제인 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온 (RO0794238, Hooker et al., 2003) 또는 T-705 (Furuta et al., 2005)는 아니며, PB2의 RNA 캡 결합 포켓에 결합할 수 있다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 상술한 방법에 의해서 확인될 수 있는 화합물을 제공하는 것이나, 단 상기 화합물은 m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, 및 m⁷GpppCm, m⁷GpppU, 및 m⁷GpppUm으로 구성된 그룹으로부터 선택된 RNA 캡 유사체, 또는 RNA 캡 결합의 소분자 억제제인 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온 또는 T-705는 아니며, PB2 폴리펩타이드 단편과 RNA 캡 또는 그의 유사체 사이의 결합을 억제할 수 있다. 본 발명의 화합물은 펩타이드, 펩토이드, 폴리펩타이드, 단백질 (항체를 포함), 지질, 금속, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 핵산, 소형 유기 또는 무기 분자, 화학적 화합물, 요소, 사카라이드, 동위원소, 탄수화물, 영상화제, 지단백질, 당단백질, 효소, 분석용 프로브, 폴리아민, 및 이들의 조합 및 유도체를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 어떤 약제라도 될 수 있다. 용어 "소분자"는 50 내지 약 2,500 달톤, 바람직하게는 200-800 달톤 범위의 분자량을 갖는 분자를 의미한다. 또한, 본 발명에 따르는 시험 화합물은 임의로, 검출가능한 표지물을 포함할 수 있다. 이러한 표지물에는 효소적 표지물, 방사성 동위원소, 또는 방사성 화합물 또는 원소, 형광성 화합물 또는 금속, 화학발광성 화합물 및 생물발광성 화합물이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

추가의 관점에서, 본 발명은 PB2의 (i) 본 발명의 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 재조합 숙주 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, (ii) PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체에 결합하는 상기 시험 화합물의 능력을 분석하는 단계를 포함하여, RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓과 회합하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.

한가지 구체예에서, PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체와 시험 화합물 사이의 상호작용은 풀-다운 시험방법의 형태로 분석될 수 있다. 예를 들어, PB2 폴리펩타이드 단편을 정제하고, 비드 상에 고정화시킬 수 있다. 한가지 구체예에서, 비드 상에 고정된 PB2 폴리펩타이드 단편은 예를 들어, (i) 또 다른 정제된 단백질, 폴리펩타이드 단편 또는 펩타이드, (ii) 단백질, 폴리펩타이드 단편 또는 펩타이드의 혼합물, 또는 (iii) 세포 또는 조직 추출물과 접촉시킬 수 있으며, 단백질, 폴리펩타이드 단편 또는 펩타이드의 결합은 쿠마시 염색 또는 웨스턴 블러팅 (Western blotting)과 함께 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 확인할 수 있다. 미지의 결합 파트너는 질량 분광분석에 의해서 확인될 수 있다.

또 다른 구체예에서, PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체와 시험 화합물 사이의 상호작용은 효소-결합된 면역흡착시험 (ELISA)-기본 실험의 형태로 분석될 수 있다. 한가지 구체예에서, 본 발명에 따르는 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체를 ELISA 플레이트의 표면상에 고정시키고, 시험 화합물과 접촉시킬 수 있다. 시험 화합물의 결합은 예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드 및 에피토프-태깅된 화합물의 경우에 시험 화합물 또는 에피토프-태그에 대해서 특이적인 항체에 의해서 확인될 수 있다. 이들 항체는 효소에 직접 커플링될 수 있거나, 적절한 기질과 함께 화학발광성 반응 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제) 또는 비색반응 (예를 들어, 알칼리성 포스파타제)을 수행하는 상기 효소에 커플링된 이차 항체에 의해서 검출될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체에 의해서 검출될 수 없는 화합물의 결합은 시험 화합물에 직접 커플링된 표지물에 의해서 확인될 수 있다. 이러한 표지물에는 효소적 표지물, 방사성 동위원소, 또는 방사성 화합물 또는 원소, 형광성 화합물 또는 금속, 화학발광성 화합물 및 생물발광성 화합물이 포함될 수 있다. 또 다른 구체예에서는, 시험 화합물을 ELISA 플레이트 상에 고정시키고, 본 발명에 따르는 가용성 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체와 접촉시킬 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 결합은 상술한 바와 같이 PB2 폴리펩타이드 단편 특이적 항체 및 화학발광성 또는 비색 반응에 의해서 확인될 수 있다.

추가의 구체예에서는, 정제된 가용성 PB2 폴리펩타이드 단편을 펩타이드 어레이 (array)와 함께 배양하고, 특이적 펩타이드 서열에 상응하는 특이적 펩타이드 스포트에 대한 PB2 폴리펩타이드 단편의 결합은, 예를 들어, PB2 폴리펩타이드 특이적 항체, PB2 폴리펩타이드 단편에 융합된 에피토프-태그에 대해 지시된 항체, 또는 PB2 폴리펩타이드 단편에 커플링된 형광성 태그에 의해서 방출된 형광 시그날에 의해서 분석할 수 있다.

또 다른 구체예에서는, 본 발명에 따르는 재조합 숙주 세포를 시험 화합물과 접촉시킨다. 이것은 시험 단백질 또는 폴리펩타이드의 공동-발현, 및 예를 들어, 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 또는 공-면역침전에 의한 상호작용의 확인에 의해 달성될 수 있다. 또 다른 구체예에서는, 직접 표지된 시험 화합물을 재조합 숙주 세포의 배지에 첨가할 수 있다. 막을 투과하고, PB2 폴리펩타이드 단편에 결합하는 시험 화합물의 잠재력은 예를 들어, 상기 폴리펩타이드의 면역침전 및 표지물의 존재의 확인에 의해서 입증될 수 있다.

바람직한 구체예에서, PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓과 회합하는 화합물을 확인하기 위한 상술한 방법은 RNA 캡 또는 그의 유사체를 첨가하는 추가의 단계를 포함한다. 상기 방법의 또 다른 구체예에서는, 상기 RNA 캡 또는 그의 유사체의 존재 하에서 PB2에 결합하는 상기 시험 화합물의 능력 또는 PB2에 대한 상기 RNA 캡 또는 그의 유사체의 결합을 억제하는 시험 화합물의 능력을 분석한다. 결합이 RNA 캡 또는 RNA 캡 유사체와 동일한 몰 농도에서 화합물에 의해 20% 이상만큼, 30% 이상만큼, 40% 이상만큼, 50% 이상만큼, 바람직하게는 60% 이상만큼, 바람직하게는 70% 이상만큼, 바람직하게는 80% 이상만큼, 바람직하게는 90% 이상만큼 감소하면, 화합물은 RNA 캡 또는 RNA 캡 유사체 결합을 억제하는 것으로 생각된다. 바람직한 구체예에서는, 상술한 풀-다운, ELISA, 펩타이드 어레이, FRET, 및 공-면역침전 실험을 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에서 RNA 캡 구조물 또는 그의 유사체, 바람직하게는 표지된 RNA 캡 구조물 또는 그의 유사체의 존재 하에 수행될 수 있다. 한가지 구체예에서, RNA 캡 또는 그의 유사체는 상기 시험 화합물을 첨가하기 전에 첨가된다. 추가의 구체예에서, RNA 캡 또는 그의 유사체는 상기 시험 화합물의 첨가와 동시에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, RNA 캡 또는 그의 유사체는 상기 시험 화합물을 첨가한 후에 첨가된다.

바람직한 구체예에서, RNA 캡 또는 그의 유사체에 대한 본 발명의 PB2 폴리펩타이드 단편의 상호작용을 저해하는 확인할 수 있는 시험 화합물의 능력은 상기 폴리펩타이드 단편을 상기 화합물의 존재 또는 부재 하에서 7-메틸-GTP 세파로즈 4B 수지 (GE Healthcare)와 함께 배양하고, 예를 들어, 쿠마시 염색된 SDS PAGE 겔 상에서, 또는 웨스턴 블럿 분석을 사용하여, 상기 화합물의 존재 및 부재 하의 결합된 PB2 폴리펩타이드 단편의 양을 비교, 바람직하게는 정량함으로써 시험할 수 있다.

시험 화합물의 존재 또는 부재 하에서 본 발명에 따르는 PB2 단편 또는 그의 변이체와 회합하는 RNA 캡 또는 그의 유사체의 능력이 평가된다. 한가지 구체예에서, 이것은 문헌 (Natarajan et al. (2004))에 기술된 바와 같은 형광 편광시험에서 플루오레세인-표지된 RNA 캡 유사체, 플루오레세인-표지된 7-메틸-구아노신 모노포스페이트 (m⁷GMP)를 사용하여 달성될 수 있다. 대신으로, 또 다른 구체예에서, 리보즈 디올-변형된 형광성 캡 유사체, 안트라닐로일-m⁷GTP가 문헌 (Ren et al. (1996))에 기술된 바와 같은 형광 분광학적 시험방법에서 사용될 수 있다. 추가의 구체예에서는, 방사성 표지된 RNA 캡을 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에서 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체와 함께 배양하며, 여기에서 RNA 캡은 시험 화합물을 첨가하기 전에, 동시에, 또는 후에 첨가할 수 있다. 캡 결합반응을 UV-교차결합시키고, 변성시키고, 문헌 (Hooker et al. (2003))에 기술된 바와 같이 겔 전기영동에 의해서 분석한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 PB2 폴리펩타이드 단편을 미량역가 플레이트 상에 고정시키고, 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에서 표지된 RNA 캡 또는 그의 유사체와 함께 배양하고 (여기에서, RNA 캡 또는 그의 유사체는 시험 화합물을 첨가하기 전에, 동시에, 또는 후에 첨가할 수 있다), 캡 결합은 플레이트를 철저히 세척한 후에 표지물의 존재를 확인함으로써 분석한다. 시험 화합물을 갖는 웰 내의 RNA 캡 또는 RNA 캡 유사체 표지물의 시그날 강도를 시험 화합물이 없는 경우의 상기 표지물의 시그날 강도와 비교하고, 결합이 상술한 바와 같이 50% 이상만큼, 바람직하게는 60% 이상만큼, 바람직하게는 70% 이상만큼, 바람직하게는 80% 이상만큼, 바람직하게는 90% 이상만큼 감소되는 경우에, 화합물은 RNA 캡 또는 RNA 캡 유사체 결합을 억제하는 것으로 생각된다.

바람직한 구체예에서, PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓과 회합하는, 바람직하게는 RNA 캡 또는 그의 유사체의 결합을 억제하는 화합물을 확인하는 상술한 방법은 고속 세팅으로 수행된다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 본 발명에 따르는 고정화된 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체 및 표지된 RNA 캡 또는 그의 유사체를 사용하여 상술한 바와 같이 멀티-웰 미량역가 플레이트 내에서 수행된다. 바람직한 구체예에서, 시험 화합물은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 유도된다. 예를 들어, 합성 화합물 라이브러리는 메이브리지 케미칼 컴패니 (Maybridge Chemical Co., Trevillet, Cornwall, UK), 켐브리지 코포레이션 (ChemBridge Corporation, San Diego, CA), 또는 앨드리히 (Aldrich, Milwaukee, WI)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 천연 화합물 라이브러리는 예를 들어, 팀테크 엘엘시 (TimTec LLC, Newark, DE)로부터 입수할 수 있다. 대신으로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물의 형태인 천연 화합물의 라이브러리가 사용될 수 있다. 추가로, 시험 화합물은 조합 화학을 사용하여 개개 화합물로서 또는 혼합물로서 합성적으로 생산될 수 있다. RNA 캡 또는 그의 유사체는 라이브러리 화합물을 첨가하기 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 첨가될 수 있다. RNA 캡 결합을 억제하는 화합물의 능력은 상술한 바와 같이 평가될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 라이프 사이클에 대한 확인된 화합물의 억제효과는 생체내 세팅에서 시험할 수 있다. 293T 인간 배아 신장세포, 매딘-다비 (Madin-Darby) 개 신장세포, 또는 닭 배아 섬유아세포와 같은 인플루엔자 바이러스 감염에 민감한 세포주를 확인된 화합물의 존재 또는 부재 하에서 인플루엔자 바이러스에 의해서 감염시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서, 확인된 화합물은 다양한 농도로 세포의 배양 배지에 첨가될 수 있다. 바이러스 플라크 형성이 인플루엔자 바이러스의 감염능에 대한 판독 정보로 사용될 수 있으며, 확인된 화합물로 처리된 세포와 처리되지 않은 세포를 비교할 수 있다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 상술한 방법 중의 어느 것에서 적용된 시험 화합물은 소분자이다. 바람직한 구체예에서, 상기 소분자는 라이브러리, 예를 들어, 소분자 억제제 라이브러리로부터 유도된다. 또 다른 구체예에서, 상기 시험 화합물은 펩타이드 또는 단백질이다. 바람직한 구체예에서, 상기 펩타이드 또는 단백질은 펩타이드 또는 단백질 라이브러리로부터 유도된다.

본 발명에 따르는 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 변이체의 RNA 캡 결합 포켓과 회합하고/하거나 상기 결합 포켓에 대한 RNA 캡 결합을 억제하는 화합물을 컴퓨터적 확인뿐만 아니라 시험관내 확인을 위한 상술한 방법의 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 확인 가능한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(들) 및/또는 담체(들)에 의해서 제제화하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 언급된 방법에 따라 생산할 수 있는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르는 화합물은 단독으로 투여될 수 있거나, 인간 치료법에서는 일반적으로, 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 관례 (이하 참조)를 고려하여 선택된 적합한 약제학적 부형제, 희석제 또는 담체와의 혼합물로 투여될 수 있다.

PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 변이체의 결합 포켓에 대한 결합 파트너를 컴퓨터적 모델링 또는 스크리닝하는 관점에서는, 약제로 투여될 분자에 대해 유익할 수 있는 화학적 물질을 관심이 있는 분자 내로 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 표적 영역에 대한 분자의 결합에는 직접적으로 영향을 미치지 않을 수 있지만, 약제학적으로 허용되는 담체 내에서의 분자의 전반적인 용해도, 분자의 생체이용율 및/또는 분자의 독성에 기여하는 화학적 물질을 관심이 있는 분자 내로 도입시키거나, 분자로부터 제거할 수 있다. 관심이 있는 분자의 약물학을 최적화하기 위한 고려 사항 및 방법은 예를 들어, 문헌 ["Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8^th Edition, L. S. Goodman, A. Gilman, T. W. Rall, A. S. Nies, & P. Taylor, Eds., Pergamon Press (1985); W. L. Jorgensen & E. M. Duffy, Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 1155-1158 (2000)]에서 찾을 수 있다. 더구나, 관심이 있는 유기 분자의 물리적으로 중요한 설명 및 약물학적으로-적절한 특성을 제공하기 위해서 컴퓨터 프로그램 "킥 프로프 (Qik Prop)"를 사용할 수 있다. '5의 원칙 (Rule of Five)' 확률 도식 (probability scheme)을 사용하여 새로이 합성된 화합물의 경구적 흡수를 예측할 수 있다 (C. A. Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 23, pp. 3-25 (1997)). 약물 분자 구조 (pharmacophore) 선택 및 디자인에 적합한 프로그램에는 (i) 디스코 (DISCO) (Abbot Laboratories, Abbot Park, IL), (ii) 카탈리스트 (Catalyst) (Bio-CAD Corp., Mountain View, CA), 및 (iii) 켐 (Chem) DBS-3D (Chemical Design Ltd., Oxford, UK)가 포함된다.

본 발명에 의해서 의도된 약제학적 조성물은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 다양한 방식으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 정제, 환제, 캅셀제 (연질 겔 캅셀제를 포함), 카세 (cachets), 로젠지, 오뷸 (ovules), 분말, 과립 또는 좌제의 형태와 같은 고체 형태로, 또는 엘릭서, 용액, 에멀전 또는 현탁제의 형태와 같은 액체 형태로 존재할 수 있다.

고체 투여 형태는 미세결정성 셀룰로즈, 락토즈, 나트륨 시트레이트, 탄산칼슘, 이염기성 인산칼슘, 글리신 및 전분 (바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분)과 같은 부형제, 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스카멜로즈 나트륨 및 특정한 컴플렉스 실리케이트와 같은 붕해제, 및 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈 (HPMC), 하이드록시프로필셀룰로즈 (HPC), 슈크로즈, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립화 결합제를 함유할 수 있다. 추가로, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 탈크와 같은 윤활제가 포함될 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한, 젤라틴 캅셀 내의 충진제로 사용될 수도 있다. 이와 관련하여 바람직한 부형제에는 락토즈, 전분, 셀룰로즈, 밀크 슈가 (milk sugar) 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.

경구 투여에 적용한 수성 현탁액, 용액, 엘릭서 및 에멀전의 경우에, 화합물은 다양한 감미제 또는 방향제, 착색 물질 또는 염료, 유화 및/또는 현탁화제, 및 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 같은 희석제, 및 이들의 조합물과 조합될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들어, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 폴리에틸렌 옥사이드, 잔탄 고무, 카보머, 암모니오 메타크릴레이트 코폴리머, 수소화된 피마자유, 카르나우바 왁스, 파라핀 왁스, 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈 프탈레이트, 메타크릴산 코폴리머, 및 이들의 혼합물을 포함하는 방출속도 변형제를 함유할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 속분산성 또는 속용해성 투약 제제 (FDDFs)의 형태일 수 있으며, 다음의 성분을 함유할 수 있다: 아스파르탐, 아세설팜 칼륨, 시트르산, 크로스카멜로즈 나트륨, 크로스포비돈, 디아스코르빈산, 에틸 아크릴레이트, 에틸 셀룰로즈, 젤라틴, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨, 메틸 메타크릴레이트, 민트 향료, 폴리에틸렌 글리콜, 훈증 실리카, 이산화규소, 나트륨 전분 글리콜레이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 소르비톨, 자일리톨.

좌제를 제조하기 위해서는, 지방산 글리세라이드 또는 코코아 버터의 혼합물과 같은 저융점 왁스를 우선 용융시키고, 활성 성분을 교반에 의해서와 같이 그 안에 균질하게 분산시킨다. 그 후, 용융된 균질한 혼합물을 편리한 크기의 주형에 붓고, 냉각시킴으로써 고화시킨다.

비경구 투여에 적합한 본 발명의 약제학적 조성물은 다른 성분, 예를 들어, 용액을 혈액과 등장성이 되도록 만드는데 충분한 염 또는 글루코즈를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 가장 잘 사용된다. 수용액은 필요한 경우에, 적합하게 완충되어야 한다 (바람직하게는 pH 3 내지 9로).

비내 투여 및 흡입에 의한 투여에 적합한 약제학적 조성물은 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 (HFA 134A.TM.) 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판 (HFA 227EA.TM.)과 같은 하이드로플루오로알칸, 이산화탄소, 또는 또 다른 적합한 가스를 사용한 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 네불라이저 (nebulizer)로부터 에어로졸 스프레이, 또는 건조 분말 흡입기의 형태로 가장 잘 송달된다. 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 네불라이저는 예를 들어, 추가로 윤활제, 예를 들어, 소르비탄 트리올리에이트를 함유할 수 있는, 용매로서 에탄올과 추진제의 혼합물을 사용한, 활성 화합물의 용액 또는 현탁액을 함유할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 PB2 폴리펩타이드 단편 변이체 또는 본 발명의 재조합 숙주 세포를 m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, 및 m⁷GpppUm, 및 캡 결합의 소분자 억제제인 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온 (RO0794238, Hooker et al., 2003) 및 T-705 (Furuta et al., 2005)로 구성된 그룹으로부터 선택된 RNA 캡 유사체와는 상이하며, PB2에 결합할 수 있는 시험 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상술한 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물을 제공한다. 바람직한 관점에서, 본 발명은 본 발명의 PB2 폴리펩타이드 단편 또는 그의 변이체 또는 재조합 숙주 세포를 m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, 및 m⁷GpppUm, 및 캡 결합의 소분자 억제제인 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온 및 T-705로 구성된 그룹으로부터 선택된 RNA 캡 유사체와는 상이하며, PB2와 RNA 캡 또는 그의 유사체 사이의 결합을 억제할 수 있는 시험 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상술한 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 PB2의 RNA 캡 결합 영역에 대해 지시된 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 특히, SEQ ID NO: 14 내지 22에 의해서 정의된 폴리펩타이드의 그룹으로부터 선택된, 폴리펩타이드 단편 또는 상기 언급된 단편의 변이체의 RNA 캡 결합 영역을 인식한다. 특히, 상기 항체는 결합 포켓을 정의하는 상기 나타낸 아미노산 중의 하나 또는 그 이상을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이와 관련하여, 용어 에피토프는 기술분야에서 인식되는 그의 의미를 가지며, 바람직하게는 4 내지 20 아미노산, 바람직하게는 5 내지 18, 6 내지 16, 또는 7 내지 14 아미노산의 스트레치를 나타낸다. 따라서, 바람직한 에피토프는 4 내지 20, 5 내지 18, 바람직하게는 6 내지 16 또는 7 내지 14 아미노산의 길이를 가지며, SEQ ID NO: 1의 Ser320, Phe323, Phe325, Phe330, Arg332, Ser337, Lys339, Arg355, His357, Glu361, Phe363, Lys376, Phe404, Gln406, Met431 및/또는 His432 중의 하나 또는 그 이상, 또는 상응하는 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 그의 일부분일 수 있다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해서, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 분열에 의해서 생산될 수 있다. 일부의 구체예에서, 항원-결합 부분은 Fab, Fab', F(ab')₂,Fd, Fv, dAb, 및 상보적 결정부분 (CDR) 단편, 단일-쇄 항체 (scFv), 인간화된 항체와 같은 키메릭 항체, 디아바디, 및 적어도 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하는데 충분한 항체의 부분을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 항체는 표준 프로토콜에 따라 생성된다. 예를 들어, 폴리클로날 항체는 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 소 또는 말과 같은 동물을 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 표준 방법에 따라, 임의로 프로인트 (Freund's) 완전 또는 불완전 보조액, RIBI (뮤라밀 디펩타이드), 또는 ISCOM (면역자극 컴플렉스)과 같은 보조제와 함께, 관심이 있는 항원으로 면역시킴으로써 생성될 수 있다. PB2 또는 그의 단편의 RNA 캡 결합 영역에 대해 지시된 폴리클로날 항혈청은 면역된 동물을 출혈시키거나 희생시킴으로써 동물로부터 수득된다. 혈청은 (i) 동물로부터 수득된 자체로 사용될 수 있거나, (ii) 면역글로불린 분획을 혈청으로부터 수득할 수 있거나, 또는 (iii) PB2 또는 그의 단편의 RNA 캡 결합 영역에 대해서 특이적인 항체를 혈청으로부터 정제할 수 있다. 모노클로날 항체는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 방법에 의해서 생성될 수 있다. 간략하면, 동물을 면역시킨 후에 희생시키고, 림프절 및/또는 비장 B 세포를 본 기술분야에서 공지된 어떤 방법에 의해서나 불멸화시킨다. 세포를 불멸화시키는 방법에는 이들을 종양유전자로 형질감염시키는 방법, 이들을 발암성 바이러스로 감염시키고, 이들을 불멸화된 세포에 대해서 선택적인 조건 하에서 배양하는 방법, 이들을 발암성 또는 돌연변이성 화합물에 적용하는 방법, 이들을 불멸화된 세포, 예를 들어, 골수종 세포와 융합시키는 방법, 및 종양 억제 유전자를 불활성화시키는 방법이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 불멸화된 세포는 PB2 또는 그의 단편의 RNA 캡 결합 영역을 사용하여 스크리닝한다. PB2 또는 그의 단편의 RNA 캡 결합 영역에 대해 지시된 항체를 생산하는 세포, 예를 들어, 하이브리도마를 선택하고, 클로닝하고, 활발한 성장, 높은 항체 생산, 및 바람직한 항체 특징을 포함한 바람직한 특징에 대해서 더 스크리닝한다. 하이브리도마는 (i) 공통유전자형 동물의 생체내에서, (ii) 면역계가 결여된 동물, 예를 들어, 누드 마우스에게서, 또는 (iii) 시험관내의 세포 배양물에서 확장시킬 수 있다. 하이브리도마를 선택하고, 클로닝하고, 팽창시키는 방법은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있다. 숙련된 전문가는 항체의 생산에 관한 뒷받침으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌 ["Antibodies: A Laboratory Manual", E. Harlow and D. Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1990)]과 같은 표준 자료를 참고로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 네가티브-센스 단일 스트랜드 RNA 바이러스에 의한 바이러스 감염에 의해서 야기된 질병 상태를 치료, 개선, 또는 예방하기 위한 의약의 제조하기 위한, PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓에 결합할 수 있고/있거나 상기 결합 포켓에 대한 RNA 캡 또는 그의 유사체의 결합을 억제할 수 있는, 상술한 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물, 상술한 약제학적 조성물, 또는 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 질병 상태는 비-분절된 네가티브-센스 단일 스트랜드 RNA 바이러스, 즉 보나비리다에 (Bornaviridae), 필로비리다에 (Filoviridae), 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae), 및 라브도비리다에 (Rhabdoviridae) 과를 포함하는 모노네가비랄레스 (Mononegavirales) 목에 의한 바이러스 감염에 의해서 야기된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 질병 상태는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 토고토바이러스 (Thogotovirus), 및 이사바이러스 (Isavirus) 속을 포함하는 오르토믹소비리다에 (Orthomyxoviridae) 과, 한타바이러스 (Hantavirus), 나이로바이러스 (Nairovirus), 오르토분야바이러스 (Orthobunyavirus), 플레보바이러스 (Phlebovirus), 및 토스포바이러스 (Tospovirus) 속을 포함하는 아레나비리다에 (Arenaviridae) 및 분야비리다에 (Bunyaviridae) 과를 포함하는 분절된 네가티브-센스 단일 스트랜드 RNA 바이러스에 의해서 야기된다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 질병 상태는 보르나병 (Borna disease) 바이러스, 마르버그 (Marburg) 바이러스, 에볼라 (Ebola) 바이러스, 센다이 (Sendai) 바이러스, 멈프스 (Mumps) 바이러스, 홍역 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 칠면조 비기관염 바이러스, 소포성 구내염 인디아나 바이러스, 니파 (Nipah) 바이러스, 헨다 (Henda) 바이러스, 광견병 바이러스, 소유행열 바이러스, 전염성 조혈기 괴사 바이러스, 토고토 (Thogoto) 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 한탄 (Hantaan) 바이러스, 크리미안-콩고 (Crimean-congo) 출혈열 바이러스, 리프트 밸리열 (Rift Valley fever) 바이러스, 라크로스 (La Crosse) 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된 바이러스 종, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 토고토 바이러스, 또는 한탄 바이러스, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 가장 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스에 의한 감염에 의해서 야기된다.

상기 질병 상태를 치료, 개선 또는 예방하기 위해서, 본 발명의 의약은 동물 환자, 바람직하게는 포유동물 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 경구, 협측, 설하, 비내, 흡입과 같은 폐 경로, 직장 경로, 또는 비경구, 예를 들어, 공동내 (intracavernosally), 정맥내, 동맥내, 복강내, 초내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내, 또는 피하로 투여될 수 있거나, 이들은 주입 또는 무침 (needleless) 주사기술에 의해서 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 다양한 방식으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 정제, 환제, 캅셀제 (연질 겔 캅셀제를 포함), 카세, 로젠지, 오뷸, 분말, 과립 또는 좌제의 형태와 같은 고체 형태로, 또는 엘릭서, 용액, 에멀전 또는 현탁제의 형태와 같은 액체 형태로 존재할 수 있다.

고체 투여 형태는 미세결정성 셀룰로즈, 락토즈, 나트륨 시트레이트, 탄산칼슘, 이염기성 인산칼슘, 글리신 및 전분 (바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분)과 같은 부형제, 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스카멜로즈 나트륨 및 특정한 컴플렉스 실리케이트와 같은 붕해제, 및 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈 (HPMC), 하이드록시프로필셀룰로즈 (HPC), 슈크로즈, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립화 결합제를 함유할 수 있다. 추가로, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 탈크와 같은 윤활제가 포함될 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한, 젤라틴 캅셀 내의 충진제로 사용될 수도 있다. 이와 관련하여 바람직한 부형제에는 락토즈, 전분, 셀룰로즈, 밀크 슈가 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.

비내 투여 및 흡입에 의한 투여에 적합한 약제학적 조성물은 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 (HFA 134A.TM.) 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판 (HFA 227EA.TM.)과 같은 하이드로플루오로알칸, 이산화탄소, 또는 또 다른 적합한 가스를 사용한 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 네불라이저로부터 에어로졸 스프레이, 또는 건조 분말 흡입기의 형태로 가장 잘 송달된다. 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 네불라이저는 예를 들어, 추가로 윤활제, 예를 들어, 소르비탄 트리올리에이트를 함유할 수 있는, 용매로서 에탄올과 추진제의 혼합물을 사용한, 활성 화합물의 용액 또는 현탁액을 함유할 수 있다.

약제학적 제제는 바람직하게는 단위 투약형으로 존재한다. 이러한 형태에서, 제제는 활성 성분의 적절한 양을 함유하는 단위 용량으로 세분된다. 단위 투약형은 패키지화된 정제, 캅셀제, 및 바이알 또는 앰플 내의 분말과 같은 패키지화된 제제일 수 있으며, 이 패키지는 제제의 분리된 양을 함유한다. 또한, 단위 투약형은 캅셀제, 정제, 카세 또는 로젠지 그 자체일 수 있거나, 이것은 이들 중의 어떤 것의 적절한 수가 패키지화된 형태일 수 있다.

본 발명의 용도에서 투여되는 단위 용량 제제 내의 활성 성분의 양은 특정의 적용 및 활성 성분의 효력에 따라 ㎡당, 약 1 ㎎ 내지 약 1000 ㎎, 바람직하게는 약 5 ㎎ 내지 약 150 ㎎/㎡로 변화되거나 조정될 수 있다.

본 발명의 의학적 용도에서 사용되는 화합물은 매일 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏의 초기 용량으로 투여된다. 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 2 ㎎/㎏의 일일 용량 범위가 바람직하며, 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 1 ㎎/㎏의 일일 용량 범위가 가장 바람직하다. 그러나, 투약량은 환자의 필요성, 치료할 상태의 중증도, 및 사용되는 화합물에 따라서 변화될 수 있다. 특정한 상황에 적절한 투약량의 결정은 전문가의 기술의 범위이다. 일반적으로, 치료는 화합물의 최적 용량 미만인 더 작은 투약량으로 개시된다. 그 후, 투약량은 환경 하에서 최적 효과에 도달할 때까지 조금씩 증대시킴으로써 증가시킨다. 편의를 위해서, 총 일일 투약량은 필요에 따라, 하루에 걸쳐서 몇 부분으로 분할하여 투여할 수 있다.

도 1은 인플루엔자 폴리머라제의 PB1 서브유니트에 대한 잠재적 결합 부위 및 선행기술에 의해서 예견되는 바와 같은 잠재적 RNA 캡 결합 부위 (Cap-N/Cap-C (참조: Honda et al., 1999), Cap-C (Trp552) (참조: Li et al., 2001), Cap-M (참조: Fechter et al., 2003))를 갖는 전체-길이 PB2를 예시하는 것이다. 또한, 박테리아 발현을 위해서 생성된 다양한 PB2 단편을 나타낸다. 이들 구조물은 모두 높은 레벨로 발현되며, 가용성이다. 7 개의 독특한 PB2 단편을 코드화한, 13 개의 분리된 클론에 의해서 코드화된 PB2 단편의 길이의 상부부터 하부까지가 도시된다. 분리된 클론은 SEQ ID NO: 25의 다음의 뉴클레오타이드에 걸쳐있다: 클론 68: 886 내지 1449, 클론 16: 871 내지 1452, 클론 15: 871 내지 1452, 클론 57: 844 내지 1449, 클론 13: 844 내지 1449, 클론 10: 832 내지 1443, 클론 28: 805 내지 1452, 클론 23: 805 내지 1452, 클론 12: 723 내지 1425, 클론 4: 706 내지 1491, 클론 30: 706 내지 1491, 클론 07: 706 내지 1491, 및 클론 05: 706 내지 1491.
도 2A는 슈퍼덱스 (Superdex) 75 겔 여과 칼럼 상에서의 PB2 폴리펩타이드 단편 아미노산 318 내지 483의 정제를 예시하는 그래프를 나타낸다. 임의의 유니트의 280 ㎚에서의 흡수는 용출시간 및 분획 번호에 대비해서 도시된다.
도 2B는 겔 여과 후의 PB2 폴리펩타이드 단편 (아미노산 318 내지 483)의 분획 24-34의 쿠마시 염색된 SDS PAGE 겔을 나타낸다. 분자량 마커는 116 - 66.2 - 45 - 35 - 25 - 18.4 및 14.4 kD의 크기를 갖는다.
도 3A는 침전제 용액 1.6 M 나트륨 포르메이트, 0.1 M 시트르산 pH 4.6에 의해서 형성된 m⁷GTP (5 mM)와의 컴플렉스에서 PB2 폴리펩타이드 단편 (아미노산 318 내지 483)의 천연 결정을 나타낸다.
도 3B는 침전제 용액 1.6 M 나트륨 포르메이트, 0.1 M 시트르산 pH 4.6에 의해서 형성된 m⁷GTP (5 mM)와의 컴플렉스에서 부분적으로 셀레노-메티오닐화된 PB2 폴리펩타이드 단편 (아미노산 318 내지 483)의 결정을 나타낸다.
도 4는 ESRF (European Synchroton Radiation Facility)에서 빔라인 (beamline) BM14 상의 천연 결정에 대해 수득된 X-선 회절 패턴을 나타낸다. 회절 패턴은 셀 (cell) 크기 a=92.2, b=94.4, c=220.4 Å로 공간-그룹 C222₁에서 나타난다. 상부 우측 삽입도는 2.4 Å 분해능까지 연장되는 회절을 나타낸다. 하부 우측 삽입도는 대략 15×15×50 ㎛³의 크기를 갖는 것으로, 데이터 수집을 위해서 사용된 동결된 결정을 나타낸다.
도 5는 m⁷GTP와의 컴플렉스로 PB2 폴리펩타이드 단편 (아미노산 318 내지 483)의 구조의 리본 도형을 나타낸다. DSSP (Holm, L. and Sander, C., 1993)에 의해서 계산된 것으로, 이차 구조 요소는 진한 회색의 알파 나선 및 연한 회색의 베타-스트랜드로 표지된다. GTP는 Phe323, Phe404 및 His357의 측쇄와 같이 공과 막대 모델로 나타낸다. 잔기 348 및 420을 중심으로 하는 주목할 만한 루프 (loop)가 구조 내의 가시적인 N- 및 C-말단 잔기 (각각 320 및 483)와 마찬가지로 표지된다.
도 6은 420-루프가 용매 내로 돌출하는 것을 나타내는, m⁷GTP와의 컴플렉스에서 PB2 폴리펩타이드 단편 (아미노산 318 내지 483)의 구조의 대체 도면이다.
도 7은 PB2 내에서 RNA 캡 결합 포켓을 형성하는 몇 개의 아미노산에 의해서 둘러싸인 m²GTP의 입체배좌 및 비편향된 실험적 전자밀도를 도시한다. 전자밀도는 0.95 시그마에서 등고선을 나타내는 실험적 상 및 비-결정학적 대칭성 평균을 사용하여 RESOLVE에 의해서 수득된 지도에 상응한다.
도 8은 잠재적 상호작용 원자를 갖는 PB2 내의 RNA 캡 결합 포켓에 매립된 캡 유사체 m²GTP를 도시한다. 추정되는 수소 결합은 점선으로 나타낸다.
도 9는 인플루엔자 A (균주 A/Victoria/3/1975) 및 B (균주 B/Lee/40)로부터의 PB2 RNA 캡-결합 영역의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. A/Victoria/3/105의 이차 구조 (DSSP에 의해서 계산됨 (Holm and Sander, 1993))는 서열 정렬 상에 표시된다. 구조 기본 서열 정렬은 ESPRIPT (http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)에 의해서 작성된다. 짙은 흑색 배경 상의 잔기는 두 개의 서열 사이에서 동일하다. 삼각형은 캡 유사체 m⁷GTP와 상호작용하는 주요 잔기를 나타낸다.
도 10은 인플루엔자 A (균주 A/Victoria/3/1975), B (균주 B/Lee/40) 및 C (균주 Ann Arbor/1/50)로부터의 PB2 RNA 캡-결합 영역의 아미노산 정렬을 나타낸다. 주해는 도 9에 대한 것과 같다.
도 11은 PB2 내에서 RNA 캡 유사체 m⁷GTP와 RNA 캡 결합 포켓 사이의 상호작용을 개략적으로 도시한 것이다. 캡 유사체 m⁷GTP (표지된 M7G)는 진한 회색 결합으로 그리고, 단백질 잔기는 중간 회색 결합으로, 물 분자는 연한 회색 구체로 그린다. 수소 결합은 Å으로 나타낸 공여체와 수용기 사이의 간격과 함께 점선으로 나타낸다. 진한 회색으로 구체의 해칭된 (hatched) 부분은 리간드와 반 데어 발스 (van der Waals) 접촉을 하는 잔기를 나타낸다. 도형은 좌표 파일에서 쇄 명칭 B를 갖는 분자에 해당한다. 비대칭적 유니트 내의 4 개의 다른 분자 (쇄 A, B, D 및 F)는 간격과 물 위치에서의 미소한 차이를 갖는 유사한 도형을 제공한다. 도면은 LIGPLOT (Wallace et al., 1995)를 사용하여 작성되었다.
도 12는 4℃에서 m⁷GTP 세파로즈 4B 수지에 결합시킨 후에, PB2 캡-결합 영역의 지시된 야생형 및 단일 점돌연변이체의 용출의 결과의 쿠마시 염색된 SDS PAGE 겔을 나타낸다. 돌연변이체 E361A, F404A, H357A 및 K376A는 야생형 단백질이 결합하는 조건 하에서 m⁷GTP 세파로즈 4B 수지에 결합하지 못하였으며, 반면에 F323A는 약한 잔류 결합 활성을 갖고, F325A는 야생형과 거의 마찬가지로 수지에 결합하였지만, 이 결합 활성은 37℃에서 크게 저하된다 (표 3을 참조). H357W 돌연변이체는 또한, 인플루엔자 B 및 C가 이 위치에서 이 잔기를 가지기 때문에 만들어졌다. 이 돌연변이체는 용해하여 정제되었으며, 야생형에 비해서 m⁷GTP 세파로즈 4B 수지에 대하여 약간 증진된 결합을 갖는 것으로 밝혀졌다. 돌연변이체 ΔVQ는 잔기 Val421-Gln426을 3 개의 글리신 (420-루프)에 의해서 치환시킴으로써 생성되었으며, 캡-결합 활성을 나타낸다.
도 13은 야생형 및 돌연변이체 재조합 폴리머라제 컴플렉스의 캡-결합 활성을 나타낸다. HEK293T 세포의 배양물은 PB1 및 PA(Φ)를 발현하는 플라스미드에 의해서 공동-형질감염되거나, PB1, PB2-His 또는 그의 돌연변이체 및 PA를 발현하는 플라스미드에 의해서 공동-형질감염되었다. 세포 추출물은 4℃에서 m⁷GTP-세파로즈에 의해서 풀-다운 (pull-down)시킴으로써 분석되었다. m⁷GTP에 의해서 유지 및 용출된 폴리머라제 컴플렉스는 PA-특이적 항체를 사용한 웨스턴-블럿에 의해서 밝혀졌다. IN 및 E는 각각 투입된 세포 추출물 및 용출된 단백질을 나타낸다. PA-특이적 밴드의 위치는 우측에 나타내며, 분자량 마커의 이동성은 좌측에 나타낸다. 돌연변이체 ΔVQ는 잔기 Val421-Gln426을 3 개의 글리신 (420-루프)으로 치환시킴으로써 생성되었다.
도 14는 야생형 또는 돌연변이체 폴리머라제의 복제 활성을 나타내는 그래프이다. 야생형 및 돌연변이체 미니-RNPs는 생체내에서 재구성되었으며, Ni²⁺-NTA-아가로즈를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해서 정제되었다. 자손 RNPs의 축적은 안티-PA 및 안티-NP 항체를 사용한 웨스턴-블럿에 의해서 결정되었다. 데이터는 야생형 값의 퍼센트로서 제시되며, 두 개의 실험의 평균 및 범위이다. 돌연변이체 ΔVQ는 잔기 Val421-Gln426을 3 개의 글리신 (420-루프)으로 치환시킴으로써 생성되었다.
도 15는 프라이머로서 ApG를 사용한 정제된 야생형 또는 돌연변이체 RNPs의 시험관내 전사 활성을 나타내는 그래프이다. 제시된 데이터는 두 개의 실험의 평균 및 범위이다. 돌연변이체 ΔVQ는 잔기 Val421-Gln426을 3 개의 글리신 (420-루프)으로 치환시킴으로써 생성되었다.
도 16은 프라이머로서 β-글로빈 mRNA를 사용한 정제된 야생형 또는 돌연변이체 RNPs의 시험관내 전사 활성을 나타내는 그래프이다. 제시된 데이터는 두 개의 실험의 평균 및 범위이다. 돌연변이체 ΔVQ는 잔기 Val421-Gln426을 3 개의 글리신 (420-루프)으로 치환시킴으로써 생성되었다.
도 17은 정제된 야생형 또는 돌연변이체 RNPs의 ApG- 대 β-글로빈 mRNA-의존적 시험관내 전사 활성의 비를 나타내는 그래프이다. 제시된 데이터는 두 개의 실험의 평균 및 범위이다. 돌연변이체 ΔVQ는 잔기 Val421-Gln426을 3 개의 글리신 (420-루프)으로 치환시킴으로써 생성되었다.
도 18은 Lys389를 갖는 SEQ ID NO.1의 PB2 폴리펩타이드 단편 아미노산 318 내지 483에 대한 정밀한 원자 구조 좌표를 열거한다. 단편은 RNA 캡 유사체 7-메틸-구아노신 트리포스페이트 (m⁷GTP)와의 컴플렉스로 SEQ ID NO: 11에 따르는 아미노산 서열을 갖는다. 여기에서 비대칭적 유니트 내에는 쇄 A, B, D, E, F를 갖는 5 개의 분자가 있다. RNA 캡 유사체 m⁷GTP는 각각의 쇄의 잔기 번호 1이다. 여기에는 293 개의 물 분자가 있다. 파일 헤더 (file header)는 구조 정밀화에 대한 정보를 제공한다. "원자"는 그의 좌표가 측정된 원소를 나타낸다. 칼럼 내의 첫 번째 문자는 원소를 정의한다. 각각의 아미노산의 3-문자 코드가 제공되며, 아미노산 서열 위치가 제시된다. 라인 "원자"에서의 처음 3 개의 값은 측정된 원소의 원자 위치를 정의한다. 네 번째 값은 점유율 (occupancy)에 해당하고, 다섯 번째 (마지막) 값은 온도 인자 (B 인자)이다. 점유율 인자는 분자 내에서 각각의 원자가 좌표에 의해서 명시된 위치를 점유하는 분자의 비율을 나타낸다. "1"의 값은 각각의 원자가 결정의 모든 분자 내에서 동일한 좌표, 즉 동일한 위치를 갖는 것을 나타낸다. B는 그의 원자 중심 주위에서 원자의 이동을 측정하는 열 인자 (thermal factor)이다. 비등방성 온도 인자는 "ANISOU"로 표시된 라인에 제시된다. 이 명명법은 PDB 파일 형식에 상응한다.

실시예는 본 발명을 더 설명하고, 더 잘 이해되도록 하기 위해서 디자인된다. 이들은 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 이해되지는 않는다.

실시예 1: PB2 발현 구조물의 생성

인플루엔자 A/Victoria/3/1975(H3N2) PB2 (de la Luna et al., 1989)의 아미노산 서열을 기초로 한 대장균 코돈 최적화 PB2 유전자 (Geneart) SEQ ID NO: 25를, 방향성 (directional) 엑소뉴클레아제 III 절단을 위한 5' AatII/AscI 및 3' NsiI/NotI 제한부위 쌍을 도입시키고, C-말단 비오틴 수용기 펩타이드 GLNDIFEAQKIEWHE를 코드화한 3' 서열을 제공하도록 변형된 벡터 pET9a (Novagen) 내에 클로닝하였다. 첫 번째 단일방향성 절단 플라스미드 라이브러리를 3' 말단으로부터 생성시키고 (Tarendeau et al., 2007), 풀링하고 (pooled), 5' 결실 반응을 위한 기질로서 사용하였다. 150 내지 250 아미노산의 삽입물을 코드화한 선형화된 플라스미드 아가로즈 겔로부터 분리하고, 재접합시키고, 콜로니 블러트 (colony blot)에 대한 Alexa488 스트렙타비딘 (Invitrogen)의 하이브리드화를 사용하여 발현 스크리닝을 위한 RIL 플라스미드 (Stratagene)를 함유하는 대장균 BL21 AI를 형질전환시키기 위해서 사용하였다 (Tarendeau et al., 2007). 클론을 그들의 형광 시그날에 따라 등급을 매기고, 처음 36 개를 Ni²⁺ 친화성 크로마토그래피에 의해서 정제가능한 단백질의 발현에 대해 시험하였다. 13 개의 클론을 확인하고, 서열 분석하여 관심이 있는 부분 내의 7 개의 독특한 구조물을 밝혀내었다 (참조: 도 1):

nt 703-1488 (aa 235-496),

nt 721 -1449 (aa 241-483),

nt 802-1449 (aa 268-483),

nt 829-1440 (aa 277-480),

nt 841-1446 (aa 281-482),

nt 868-1449 (aa 290-483),

nt 883-1446 (aa 295-482).

이들 PB2 폴리뉴클레오타이드 단편은 주형으로 합성 유전자를 사용하는 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해서 생성되었으며, 발현 벡터 pETM11 플라스미드 (EMBL) 내의 NcoI 및 XhoI 부위 사이에 클로닝하였다. pETM11 발현 벡터는 His₆-태깅된 융합 단백질의 발현을 허용한다. His₆-태그는 TEV 프로테아제를 사용하여 융합 단백질로부터 분열될 수 있다.

실시예 2: 최소 캡-결합 단편의 확인

PB2 폴리펩타이드 단편 235-496, 241-483, 268-483, 및 290-483을 실시예 1에 기술된 플라스미드 구조물 및 실시예 3에 기술된 일반적인 발현 및 정제 프로토콜을 사용하여 대장균 내에서 발현시켰다. 정제된 PB2 단편 235-496은 단지 저농도에서 가용성인 반면에, 단편 241-483, 268-483 및 290-483은 더 가용성이고, m⁷GTP 세파로즈 칼럼에 특이적으로 결합할 수 있어서 캡-결합 활성을 시사하는 것으로 발견되었다. 이들 시험을 위해서, 0.2 ㎎의 단백질을 50 ㎕의 7-메틸-GTP 세파로즈 4B 수지 (GE Healthcare) 상에 부하시키고, 결합을 위해서 4℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 50 mM 트리스ㆍHCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 2 mM DTT를 함유하는 완충액으로 세척한 후에, 단백질을 1 mM m⁷GTP를 함유하는 동일한 완충액과 함께 원심분리시킴으로써 용출시키고, SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 이들 실험의 과정 중에, 더 작은 분해 단편도 또한 m⁷GTP를 결합시킬 수 있는 것으로 나타났으며, 이것은 N-말단 서열 분석 및 질량-분석법에 의해서 잔기 318-483인 것으로 확인되었으며, 또한 이 단편은 단백분해적으로 안정하였다. 상응하는 폴리뉴클레오타이드 단편 (nt 952-1449)을 실시예 1에 기술된 바와 같이 pETM11 내에 클로닝하였다.

실시예 3: PB2 단편 발현 및 정제

상기 플라스미드를 화학적 형질전환을 사용하여 대장균 내로 형질전환시켰다. 단백질을 LB 배지 내의 대장균 스트레인 BL21-CodonPlus-RIL (Stratagene) 내에서 발현시켰다. 0.2 mM 이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)와 함께 25℃에서 16 내지 20 시간 동안 배양한 후에, 세포를 수확하고, 용해 완충액 (50 mM 트리스ㆍHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM 2-머캅토에탄올) 내에 재현탁시키고, 초음파 처리하였다. 원심분리 후에, 청정한 용해액을 니켈 친화성 칼럼 (GE Healthcare로부터의 킬레이트화 세파로즈, Ni²⁺ 이온으로 부하됨) 상에 직접 부하시켰다. Ni-세파로즈 수지를 50 mM 트리스ㆍHCl (pH 8.0), 1 M NaCl, 15 mM 이미다졸, 5 mM 2-머캅토에탄올 완충액으로, 및 이어서 50 mM TrisㆍHCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 50 mM 이미다졸, 5 mM 2-머캅토에탄올 완충액으로 광범하게 세척하였다. 그 후, 단백질을 50 mM 트리스ㆍHCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 0.5 M 이미다졸, 5　mM 2-머캅토에탄올 완충액으로 용출시켰다. 정제된 단백질을 TEV 프로테아제 분열을 위해서 10℃에서 밤새 배양하였다. 50 mM 트리스ㆍHCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 15 mM 이미다졸, 5 mM 2-머캅토에탄올 완충액에 대해서 투석한 후에, 두 번째 니켈 친화성 단계를 수행하여 His-태그 표지된 TEV 프로테아제를 제거하였다. 비결합된 단백질을 회수하고, 순도를 개선시키기 위해서 슈퍼덱스 (Superdex) 75 칼럼 (GE Healthcare) 상에서의 겔 여과를 위해 5-8 ㎎/㎖로 농축시켰다. PB2 폴리펩타이드 단편 (아미노산 318 내지 483)에 대한 겔 여과의 결과는 도 2A에 나타내었다. 이 단편 (아미노산 318 내지 483)을 24 ㎎/㎖로 농축시킬 수 있었다. 단백질의 순도는 SDS PAGE 및 쿠마시 염색에 의해서 평가하였다 (참조: 도 2B). 전형적인 수율은 박테리아 배양물의 리터당, 120 ㎎의 순수한 단백질이다.

실시예 4: PB2 및 m²GTP의 공동-결정화

결정화 실험을 위해서는 50　mM 트리스ㆍHCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 2 mM 디티오트레이톨 (DTT), 5 mM m⁷GTP (Sigma) 중의 11-15 ㎎/㎖의 PB2 단편 318-483의 단백질 용액을 사용하였다. 로보트 (Cartesian)를 사용하여 100 ㎕의 단백질 용액을 0.1 ㎕의 다양한 침전제 용액과 혼합시킴으로써 시팅 드롭 증기확산방법 (sitting drop vapor diffusion method)을 사용한 576 결정화 조건을 스크리닝하였다. 결정은 두 개의 상이한 조건에서 확인되었다. 이들 조건은 1 ㎕의 침전제 용액과 혼합된 1 ㎕의 단백질 용액에 의한 현적 증기확산방법을 사용하여 최적화되었다. 최상의 결정은 0.1 M 시트르산 pH 4.6, 1.6-1.8 M 나트륨 포르메이트를 포함하는 침전제 용액에 의해서 수득되었다. 이들 결정은 공간 그룹 C222₁을 갖는 것이며, a = 9.2 ㎚, b = 9.4 ㎚, c = 22.0 ㎚±0.3 ㎚ Å의 단위 셀 크기를 갖는다. 일부의 더 작은 결정은 적어도 2.4 Å의 분해능을 갖는 X-선 회절을 제공하였다. 더 큰 결정은 이들이 단일 결정이 아니었다는 점에서 예외적인 것으로 발견되었다. 발견된 두 번째 결정화 조건에서, 침전제 용액은 7% PEG6000, 1 M LiCl, 0.1 M 시트르산 pH 5.0, 10 mM TCEP HCl을 포함한다. 이 조건은 적어도 3.3 Å 분해능에 대한 회절의 증거를 갖는 결정되지 않은 공간-그룹의 얇은 판상 결정을 제공하지만, 회절 품질은 훨씬 열등하며, 이들 결정은 진행되지 않았다.

실시예 5: 셀레노-메티오닌 표지된 단백질의 제조

셀레노-메티오닐화된 단백질은 기술된 바와 같은 최소 M9 배지 (Van Duyne, 1993) 내에서 생산하였다. 완전히 셀레노-메티오닐화된 단백질은 결정화하지 않았기 때문에, 부분적으로 표지된 단백질은 60　㎎/ℓ의 셀레노메티오닌 대신에 50 ㎎/ℓ의 셀레노메티오닌 및 5 ㎎/ℓ의 메티오닌을 사용하여 생산되었다. 발현, 용해 및 정제 조건은 천연 단백질에 대한 것과 같았다 (실시예 3). 전기스프레이 질량분석법은, 완전히 셀레노-메티오닐화된 단백질은 11/11 메티오닌 치환된 것에 해당하는 19654 달톤의 MW를 갖는 반면에, 부분적으로 표지된 단백질은 19578의 평균 분자량 (9.4/11, 즉, 85% 치환됨)을 가지며 각각의 피크는 7-11 셀레늄을 갖는 단백질 종에 대해서 수득된다는 것을 나타내었다.

실시예 6: 구조 결정 및 정교화

구조는 실시예 5에 기술된 바와 같은 부분적으로 셀레노-메티오닐화된 단백질을 사용하여 단일 파장 비정상 회절 (SAD) 방법에 의해서 결정되었다. 부분적으로 셀레노-메티오닐화된 단백질은 실제로 야생형보다 더 큰 단일 결정을 생성시켰다. 천연 데이타는 ESRF에서의 빔라인 BM14 상에서 공간 그룹 C222₁ 및 셀 크기 a=92.2, b=94.4, c=220.4 Å의 작은 결정 (크기 15 x 15 x 50 ㎛³)에 대해 2.4 Å 분해능에서 수집되었다 (도 4). 부분적으로 셀레노-메티오닌 표지된 단백질 결정은 구조 결정을 위해 ID29 상에서 2.9 Å 분해능으로 측정되었으며, 그 후에는 구조 정교화를 위해서 더 큰 결정에 대해 ID14-EH1 상에서 2.3 Å 분해능으로 측정되었다. 구조는 AUTOSHARP을 사용한 SAD 방법에 의해서 해명되었다 (Vonrhein et al., 2006). 50/55 셀레늄 원자 위치가 발견되었다. 상 및 지도는 셀레늄 위치로부터 결정된 4-배 비-결정학적 대칭성을 사용하는 RESOLVE (Terwilliger, 2000)에 의해서 개선되었지만, 이것은 결국 실제로는 5 개의 분자가 비대칭적 단위 (용매 함량 55%)로 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 이례적인 방식으로 정렬된다. A-D로 표시된 4 개의 잘-정돈된 분자 (평균 B-인자 약 30Å2)는 4-배 점대칭으로 정렬된다. 다섯 번째 분자는 결정학적 c-방향으로 테트라머의 패킹 (packing)을 매개하지만, 부분적으로는 무질서화된다 (평균 B-인자 약 51Å2). 상을 천연 데이타로 전이시킨 후에, ARP/wARP (Perrakis et al., 1999)는 구조의 대부분을 자동적으로 구성할 수 있었다. 명료한 잔류 전자밀도가 각각의 분자에 결합된 m⁷GTP에 대해서 관찰되었다. 정교화는 각각의 분자의 대부분에 대한 치밀한 NCS 억제 (restraints) 및 전체로서 각각의 분자에 대한 TLS 파라메터를 사용하는 REFMAC (Murshudov, 1997)에 의해 수행되었다. 최종적인 R-인자 (R-free)는 293 개의 물 분자에 의해서 0.186 (0.235)이다. MOLPROBITY (Lovell et al., 2003)에 따라, 구조의 품질은 이하의 이 서버의 출력 자료에 의해서 나타나는 바와 같이 탁월하다:

REMARK 40

REMARK 40 MOLPROBITY STRUCTURE VALIDATION

REMARK 40 MOLPROBITY OUTPUT SCORES:

REMARK 40 ALL-ATOM CLASHSCORE : 8.40

REMARK 40 BAD ROTAMERS : 3.4% 24/708 (TARGET 0-1%)

REMARK 40 RAMACHANDRAN OUTLIERS : 0.0% 0/795 (TARGET 0.2%)

REMARK 40 RAMACHANDRAN FAVORED : 97.7% 777/795 (TARGET 98.0%)

PB2의 캡-결합 영역은 α1, α2, α3 및 α4를 포함하는 나선형 번들 (helical bundle) 상에 패킹된 스트랜드 β1, β2, β5, β6 및 β7을 현저한 역평행 베타-시트를 갖는 밀집되고, 잘-정돈된 혼합된 α-β 접힘 (fold)을 가지며, 여기에서 가장 긴 나선 α1 및 α3은 대략 역평행으로 정렬된다. β2와 β5 사이의 연결은 분자의 나선형 측면 쪽으로 교차하는, 스트랜드 β3 및 β4 및 348-루프를 포함하는 긴 베타 헤어핀 내로 연장된다. α2와 α3 사이의 420-루프로 명시된 불충분하게 정돈된 루프는 용매 내로 돌출한다 (도 4 및 5). 인플루엔자 A PB2 캡-결합 영역에서, m⁷G는 주로 Phe-323 (β1으로부터, 리보즈를 향해서 더 많이 스태킹됨) 및 Phe-404 (나선 α1의 C-말단으로부터, 염기를 향해서 더 많이 스태킹됨)에 의해서 형성된 소수성 플래트폼 상에 존재하지만, 어떤 것도 염기에 대해서 정확하게 평행은 아니다. 이들 두 개의 방향족 잔기는 Phe-325, Phe-330 및 Phe-363을 또한 포함하는 5 개의 페닐알라닌의 현저한 클러스터의 일부분이다. 리간드의 용매 측면 상에서, 샌드위치는 이전에는 이 역할에서 관찰되지 않는 잔기 유형인 His-357 (β4의 C-말단으로부터)에 의해서 완결된다. 주요 산성 잔기는 구아닌의 N1 및 N2 위치 수소 결합하는 Glu-361이며, Lys-376도 또한, O6과의 상호작용을 통해서 염기 특이적 인식에 포함된다 (도 6, 7, 및 10). 캡-결합 단백질에 대해서 이례적으로, 어떤 리보즈 하이드록실과의 직접적인 상호작용도 없다. 트리포스페이트는 염기 쪽으로 둥글게 구부러진다. 알파-포스페이트는 His-432 및 Asn-429와 상호작용하며, 감마-포스페이트는 염기성 잔기 His-357, Lys-339, 및 Arg-355와 상호작용한다.

실시예 7: 캡-결합 부위의 돌연변이 분석

구조적으로 관찰된 단백질-리간드 상호작용이 시험관내 캡-결합에 중요하다는 것을 입증하기 위해서, 본 발명자들은 퀸체인지 (QuickChange) 부위 지시된 돌연변이유발 키트 (Stratagene)를 사용하여 7 개의 m⁷GTP-접촉 잔기의 알라닌 돌연변이 (F323, F325, E361, F363, F404, H357, K376)를 만들었다. 이들 단일 점돌연변이체는 4℃에서 m⁷GTP-세파로즈 수지에 결합하는 그들의 능력에 의해서 평가된, 감소된 캡-결합 활성을 나타내는 것으로 예상되었다 (표 4, 도 12). 돌연변이체를 야생형 PB2에 대해서 실시예 3에 기술한 바와 같이 정제하였다. 돌연변이체 F363A는 아마도 잘못 접힘 (misfolding)에 기인하여 대장균 내에서 불충분하며, 낮은 용해도를 가지고 발현하였으며, 더 진행되지 않았다. 돌연변이체 H357A, E361A, K376A 및 F404A는 가용성 형태로 잘 발현하였지만, 시험 조건 하에서 m⁷GTP-세파로즈에 결합하는데 실패하였으며, 반면에 F323A는 약한 결합 활성을 가졌다 (도 12). 놀랍게도, 돌연변이체 F325A는 비록 불충분하게 발현하였지만 거의 야생형과 마찬가지로 수지에 결합하였다. 본 발명자들은 이 돌연변이체의 활성이 강력하게 온도-의존적임을 보여준다 (표 3). H357W 치환도 또한 만들어졌으며, 예상된 염기와의 개선된 스태킹과 일치하였고, 이 돌연변이체 영역은 증진된 m⁷GTP 결합을 나타내었다. 결과는 도 12 및 표 4에 나타내었다.

실시예 8: 표면 플라즈몬 공명 측정을 사용한 캡-결합 친화성의 정량적 분석

다양한 돌연변이체의 결합 친화성의 더 정량적인 비교를 제공하기 위해서, 본 발명자들은 분석물로서 고정화된 캡-결합 영역 및 m⁷GTP를 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 측정을 수행하였다. SPR 분석은 CM5 센서 칩 (sensor chips)이 장치된 비아코어 (Biacore) T100 기계 (Biacore AB, Uppsala, Sweden) 상에서 수행되었다. 야생형 및 돌연변이체 PB2 캡-결합 영역을 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 6.0 중에서 50 ㎍/㎖로 희석하고, 표준 아민-커플링 화학을 사용하여 센서 표면에 고정화시켰다. 활성화/불활성화 센서 표면은 기준으로 제공되었다. 0.47-1 mM 범위의 m⁷GTP, m⁷GpppG 및 GTP의 2-배 계열 희석액을 고정화된 PB2 단백질 및 기준 표면 상에 30 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 런닝 완충액 (running buffer)은 150 mM NaCl 및 1 mM DTT를 함유하는 10 mM Hepes, pH 7.4였다. 결합에 대한 온도의 영향을 시험하기 위해서, 실험을 5, 15, 25 및 37℃에서 수행하였다. 모든 획득된 센서그램 (sensorgrams)을 이중 참조 (double referencing)를 사용하여 처리하고, 평형 해리상수는 비아코어 T100 평가 소프트웨어 (Biacore T100 Evaluation Software)에 의한 정상 상태 (steady state) 친화성 평가에 의해서 결정하였다. 이들은 고정화와 연관된 표면 화학 및 분자 배향이 값에 영향을 미칠 수 있었기 때문에 '겉보기' 해리상수라 부른다. 오차는 소프트웨어에 의해서 보고된 바와 같은 피팅과 연관된 것이다. 단백질의 상이한 고정화를 갖는 실험들 사이의 가변성은 < 25% 였다 (데이터는 나타내지 않음). 25℃에서 수득된 겉보기 평형 해리상수 K_D에 대한 결과 (표 1)는 m⁷GTP-세파로즈 결합 결과와 일치하는 경향을 나타내며, 여기에서 최고의 친화성은 H357W 돌연변이체 (K_D = 24±3 mM)에 대한 것이고, 이어서 야생형 (K_D = 177±34　mM)이며, E361A 및 K376A 돌연변이체가 최저의 친화성 (K_D>1500 mM)을 갖는다.

25℃에서 SPR에 의해서 결정된, m⁷GTP와 PB2 캡-결합 영역의 다양한 점돌연변이체 사이의 상호작용에 대한 겉보기 평형 해리상수 (K_D)

단백질	K_D (μM)
야생형	177±34
H357W	24±3
F323A	285±45
F325A	418±99
H357A	831±45
F404A	1277±120
E361A	>1500
K376A	>1500

종합해 볼 때, 상기 데이터는 시험관내에서 PB2 영역에 의한 m⁷GTP에 대한 이들 접촉 잔기의 기능적 중요성을 뒷받침한다. 야생형 캡-결합 영역에 대한 디뉴클레오타이드 캡 유사체인 m⁷GpppG 및 GTP 결합에 대한 추가의 결과는 표 2에 나타내었다.

캡 유사체에 의한 캡핑된 RNA 교차결합의 억제에 의해서 측정된 IC₅₀에 대한 값과 비교한, 25℃에서 SPR에 의해서 결정된 PB2의 야생형 캡-결합 영역과 상이한 캡 유사체 사이의 상호작용에 대한 겉보기 평형 해리상수 (K_D) (Hooker et al. 2003)

분석물	K_D (μM)	IC₅₀ (μM)
m⁷GpppG	171±19	127
m⁷GTP	177±34	113
GTP	1019±100	550

캡-결합 영역과 m⁷GTP 사이의 결합의 온도 의존성을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 37℃까지의 다양한 온도에서 야생형 및 선택된 돌연변이체 영역에 대한 K_D의 SPR 측정을 수행하였다 (표 3). 시험한 모든 단백질의 캡-결합 친화성은 온도가 상승함에 따라서 유의적으로 감소하였다. 그러나, 야생형의 겉보기 K_D는 5 내지 37℃ 사이에서 2.7의 계수로 증가하는 반면에, F325A 돌연변이체의 경우는 20 배 이상까지 증가하였다. 또한, 야생형 영역과는 달리 F325A 돌연변이체의 결합 활성은 37℃에서 배양한 후에, 아마도 열변성에 기인하여 비가역적으로 상실된다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서, 이러한 온도 민감성은 영역 및 트라이머 둘 다에서 4℃에서의 F325A 돌연변이체의 관찰된 거의 정상적인 캡-결합 친화성 및 37℃에서의 F325A 돌연변이체 폴리머라제의 기능적 손상에 대한 일관된 이론적 설명을 제공한다 (참조: 실시예 10).

m⁷GTP와 캡-결합 영역의 다양한 점돌연변이체 사이의 상호작용에 대한 해리상수 (K_D)의 온도 의존성

온도	K_D (μM)
온도	야생형	H357W	F323A	H357A	F325A
5℃	100±20	12±2	168±29	394±26	170±44
15℃	133±26	16±3	215±38	551±42	223±55
25℃	177±34	24±3	285±45	831±44	419±99
37℃	268±45	45±6	884±140	1123±130	3787±1700

실시예 9: 야생형 및 돌연변이체 폴리머라제 컴플렉스의 캡-결합 활성

인플루엔자 RNPs의 생물학적 활성에 대한 캡-결합 부위의 연관성을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 동일한 돌연변이를 인플루엔자A/Victoria/3/75의 전체-길이 PB2에 도입시키고, 생성된 트라이머성 폴리머라제 또는 재조합 RNPs의 활성을 시험하였다. 돌연변이 중의 어떤 것도 폴리머라제 컴플렉스와 관련하여 발현된 경우에 PB2의 축적을 변화시키지 않았으며, 트라이머성 폴리머라제 컴플렉스를 형성하는 PB2의 능력을 변화시키지도 않았다 (표 4).

트라이머성 폴리머라제의 캡-결합을 위해서는, HEK293T 세포를 PB1 서브유니트를 코드화한 플라스미드 pCMVPB1, PB2 야생형 서브유니트 또는 그의 돌연변이체를 코드화한 pCMVPB2His, 및 인플루엔자 바이러스 RNA 폴리머라제의 PA 서브유니트를 코드화한 pCMVPA로 공동-형질감염시키고, 형질감염시킨 지 24 시간 후에 세포 추출물을 제조하였다. 추출물은 pH 7.5에서 50 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2% NP40, 단백질 억제제 (Roche, 완전 칵테일)를 함유하는 완충액 중에서 제조하고, m⁷GTP-세파로즈 (GE Healthcare)와 함께 4℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 100 용적의 동일한 완충액으로 세척한 후에, 보존된 단백질을 1 mM m⁷GTP를 함유하는 동일한 완충액으로 용출시키고, PA-특이적 항체를 사용한 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다 (도 13). 이들 조건 하에서, 야생형 폴리머라제는 대조 세파로즈 수지 상에 보존되지 않았다. 돌연변이체 H357W는 야생형과 같이 행동하는 반면에, 여전히 결합하고 있는 F325A를 제외하고는 다른 모든 돌연변이체는 결합을 무효화시켰으며, 이 결과들은 분리된 영역에 대해서 수득된 결과를 반영한다.

실시예 10: 야생형 및 돌연변이체 재조합 미니-RNPs의 복제 및 전사 활성

야생형 또는 돌연변이체 폴리머라제의 복제 활성은 생체내 재조합 시스템에서 RNPs의 축적을 측정함으로써 시험하였다 (Ortega et al., 2000; Martin-Benito et al., 2001). RNP 재구성을 위해서는, HEK293T 세포를 칼슘-포스페이트 침전 프로토콜을 사용하여 플라스미드 pCMVPB1, pCMVPB2His, pCMVPA, pCMVNP 및 pHHclone23으로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 후 24 시간째에 추출물을 제조하고, RNPs를 기술된 바와 같이 (Area et al., 2004) Ni²⁺-NTA-아가로즈 수지 상에서 크로마토그래피함으로써 정제하였다. 웨스턴-블러팅은 PA 및 NP에 대해서 특이적인 항체를 사용하여 수행하였다. 자손 RNPs를 추출하고, 정제하고, 이들의 축적은 안티-PA 및 안티-NP 항체를 사용하여 모니터링하였다. 대부분의 돌연변이는 RNPs의 복제 활성을 실질적으로 변화시키지 않았다 (도 14 및 표 4). 단지 돌연변이 F325A 및 K376A만이 RNPs의 축적을 부분적으로 감소시켰다.

정제된 야생형 또는 돌연변이체 RNPs의 전사 활성은 프라이머로서 ApG 또는 β-글로빈 mRNA를 사용하여 시험관내에서 시험하여 각각 캡-독립적 또는 캡-의존적 전사를 나타내었다. 시험관내 RNA 합성을 위해서, 웨스턴 블럿에 의해서 결정된 것으로서 동량의 정제된 RNPs를 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 2 mM MgCl₂, 100 mM KCl, 1 mM 디티오트레이톨, 0.5 mM씩의 각각의 ATP, CTP, 및 UTP, 10 μM α-³²P-GTP (0.5 μCi/nmol), 10 ㎍/㎖ 액티노마이신 D, 1 U/㎖의 인간 태반 RNase 억제제 및 100 μM ApG 또는 10 ㎍/㎖ β-글로빈 mRNA를 함유하는 20 ㎕의 반응 혼합물 중에서 60 분 동안 30℃에서 배양하였다. 합성된 RNA를 TCA-침전시키고, 도트-블럿 (dot-blot) 장치 내에서 여과함으로써 회수하였다. 혼입은 포스포르이미저 (phosphorimager)에 의해서 정량화하였다. 대부분의 돌연변이체 RNPs는 ApG에 의해서 프라이밍되는 경우에 완전히 활성이었다 (도 15 및 표 4): 돌연변이 H357A 및 F404A는 야생형보다 전사적으로 더 효율적인 RNPs를 유도하였으며, 단지 돌연변이체 F325A만이 강력한 결핍을 나타내었다.

반대로, β-글로빈 mRNA 의존적 전사는 각각 완전히 및 부분적으로 활성인 돌연변이 H357W 및 H357A을 제외한 대부분의 돌연변이체에 대해서 심하게 영향을 미쳤다 (도 16 및 표 4). β-글로빈 대 ApG-프라이밍된 전사 활성의 비 (도 17 및 표 4)는, H357W를 제외한 모든 돌연변이체가 전사를 위한 프라이머로서 β-글로빈 mRNA를 사용하는 그들의 능력에 있어서 크게 영향을 받았음을 나타낸다.

캡-결합 활성을 감소시키도록 디자인된 돌연변이 중의 한 개를 제외한 모든 돌연변이는 단백질 영역 및 돌연변이체 폴리머라제 컴플렉스 둘 다로서 m⁷GTP-세파로즈와의 상호작용을 무효화시켰다 (표 4, 도 12 및 13). 제외된 F325A는 영역과 관련하여 불충분하게 발현되었으며, 37℃에서 폴리머라제 또는 RNP 레벨에서의 대부분의 기능적 시험에서 심하게 영향을 미쳤다 (표 4). 그러나, 이것은 4℃에서는 적당한 캡-결합 친화성을 유지하였으며 (도 12 및 13), 이것은 가능한 온도 민감성 표현형을 시사한다.

PB2 캡-결합 부위 돌연변이체의 생화학적 및 생물학적 활성의 요약

	영역의 용해도	4℃에서 영역에 대한 캡-결합	4℃에서 폴리머라제에 대한 캡-결합	RNP 축적	ApG-의존적 전사	β-글로빈-의존적 전사	β-글로빈/ApG 전자의 비
야생형	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
F323A	++	+	-	+++	+	-	-
F325A	+/-	++	++	++	-	-	-
H357A	+++	-	-	++++	++++	+	-
H357W	+++	++++	+++	++	+++	++++	+++
E361A	++	-	-	+++	+++	-	-
F363A	-	nd	nd	nd	nd	nd	nd
K376A	+++	-	-	+	+++	-	-
F404A	+++	-	-	++++	++++	-	-
ΔVQ	+++	+++	+	+++	++	-	-
nd: 측정되지 않음.

실시예 11: 캡-의존적 전사는 424-루프의 무결성 (integrity)을 필요로 한다

본 발명자들은 그의 서열이 인플루엔자 A와 B 사이에서 비교적 잘 보존된 분명하게 노출된 420-루프 (도 5 및 6)에 대해 관심이 있었다 (도 9). 이 루프의 가능한 기능을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 잔기 al421-Gln426을 3 개의 글리신으로 대체시킴으로써 이것을 단축시켰다 (돌연변이체 ΔVQ). 이 돌연변이를 보유하는 분리된 캡-결합 영역은 m⁷GTP-세파로즈 결합 활성 (도 12) 및 겉보기 K_D (데이터는 나타내지 않음)에 관해서 야생형과 같이 행동하였다. 트라이머성 폴리머라제 및 재조합 RNPs와 관련하여, 이 돌연변이체는 감소된 정도이기는 하지만 캡-유사체 수지에 결합하는 능력을 유지하였으며, 복제 및 ApG 프라이밍된 전사 활성의 야생형 레벨을 제공하였다 (도 14 및 15). 반대로, 돌연변이체는 시험관내에서 β-글로빈-의존적 전사를 수행할 수 없었다 (도 16, 17, 및 표 4). 따라서, ΔVQ 돌연변이체는 캡-의존적 전사는 부족하지만, 캡-결합은 그렇지 않다. 본 발명자들은 이 루프가 PB1 서브유니트의 활성을 조절하는데 있어서 알로스테릭 (allosteric) 역할을 나타낼 수 있는 것으로 생각한다.

SEQUENCE LISTING <110> European Molecular Biology Laboratory <120> Soluble RNA Cap Binding Pocket Fragments And Their Use <130> IPA100142 <140> <141> 2008/10/09 <160> 27 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 759 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 <222> (1)..(759) <400> 1 Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asn Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr 1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys 20 25 30 Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ser Leu Arg Met Lys 35 40 45 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Thr 50 55 60 Glu Met Val Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys 65 70 75 80 Met Ser Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val 85 90 95 Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Val Thr Ser Thr Val His Tyr Pro 100 105 110 Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Asp Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly 115 120 125 Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg 130 135 140 Val Asp Ile Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln 145 150 155 160 Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile 165 170 175 Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu 180 185 190 Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ser Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu 195 200 205 Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr 210 215 220 Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp 225 230 235 240 Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Ile Asp 245 250 255 Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Ser Val 260 265 270 Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln 275 280 285 Ile Gly Gly Thr Arg Met Val Asp Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu 290 295 300 Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser 305 310 315 320 Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser 325 330 335 Ser Ile Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu 340 345 350 Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Lys 355 360 365 Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Val Gln Leu 370 375 380 Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val 385 390 395 400 Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly 405 410 415 Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His 420 425 430 Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn 435 440 445 Trp Gly Ile Glu His Ile Asp Asn Val Met Gly Met Val Gly Val Leu 450 455 460 Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Met Arg Gly Ile Arg Val 465 470 475 480 Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val 485 490 495 Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Val Leu 500 505 510 Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr His Gly Thr Glu Arg Leu Thr 515 520 525 Ile Thr Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser 530 535 540 Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Thr Val 545 550 555 560 Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asn Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Met Glu 565 570 575 Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Lys Ala Ile Arg Gly Gln Tyr 580 585 590 Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly 595 600 605 Thr Phe Asp Thr Thr Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala 610 615 620 Pro Pro Lys Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val 625 630 635 640 Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe 645 650 655 Asn Tyr Asn Lys Thr Thr Lys Arg Leu Thr Ile Leu Gly Lys Asp Ala 660 665 670 Gly Thr Leu Ile Glu Asp Pro Asp Glu Ser Thr Ser Gly Val Glu Ser 675 680 685 Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asp Arg Arg Tyr 690 695 700 Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Asn Leu Ala Lys Gly Glu 705 710 715 720 Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys 725 730 735 Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys 740 745 750 Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn 755 <210> 2 <211> 770 <212> PRT <213> Influenza B virus <220> <221> PB2 <222> (1)..(770) <400> 2 Met Thr Leu Ala Lys Ile Glu Leu Leu Lys Gln Leu Leu Arg Asp Asn 1 5 10 15 Glu Ala Lys Thr Val Leu Lys Gln Thr Thr Val Asp Gln Tyr Asn Ile 20 25 30 Ile Arg Lys Phe Asn Thr Ser Arg Ile Glu Lys Asn Pro Ser Leu Arg 35 40 45 Met Lys Trp Ala Met Cys Ser Asn Phe Pro Leu Ala Leu Thr Lys Gly 50 55 60 Asp Met Ala Asn Arg Ile Pro Leu Glu Tyr Lys Gly Ile Gln Leu Lys 65 70 75 80 Thr Asn Ala Glu Asp Ile Gly Thr Lys Gly Gln Met Cys Ser Ile Ala 85 90 95 Ala Val Thr Trp Trp Asn Thr Tyr Gly Pro Ile Gly Asp Thr Glu Gly 100 105 110 Phe Glu Lys Val Tyr Glu Ser Phe Phe Leu Arg Lys Met Arg Leu Asp 115 120 125 Asn Ala Thr Trp Gly Arg Ile Thr Phe Gly Pro Val Glu Arg Val Arg 130 135 140 Lys Arg Val Leu Leu Asn Pro Leu Thr Lys Glu Met Pro Pro Asp Glu 145 150 155 160 Ala Ser Asn Val Ile Met Glu Ile Leu Phe Pro Lys Glu Ala Gly Ile 165 170 175 Pro Arg Glu Ser Thr Trp Ile His Arg Glu Leu Ile Lys Glu Lys Arg 180 185 190 Glu Lys Leu Lys Gly Thr Met Ile Thr Pro Ile Val Leu Ala Tyr Met 195 200 205 Leu Glu Arg Glu Leu Val Ala Arg Arg Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly 210 215 220 Ala Thr Ser Ala Glu Phe Ile Glu Met Leu His Cys Leu Gln Gly Glu 225 230 235 240 Asn Trp Arg Gln Ile Tyr His Pro Gly Gly Asn Lys Leu Thr Glu Ser 245 250 255 Arg Ser Gln Ser Met Ile Val Ala Cys Arg Lys Ile Ile Arg Arg Ser 260 265 270 Ile Val Ala Ser Asn Pro Leu Glu Leu Ala Val Glu Ile Ala Asn Lys 275 280 285 Thr Val Ile Asp Thr Glu Pro Leu Lys Ser Cys Leu Thr Ala Ile Asp 290 295 300 Gly Gly Asp Val Ala Cys Asp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Gly Leu Lys 305 310 315 320 Ile Arg Gln Arg Gln Arg Phe Gly Arg Leu Glu Leu Lys Arg Ile Ser 325 330 335 Gly Arg Gly Phe Lys Asn Asp Glu Glu Ile Leu Ile Gly Asn Gly Thr 340 345 350 Ile Gln Lys Ile Gly Ile Trp Asp Gly Glu Glu Glu Phe His Val Arg 355 360 365 Cys Gly Glu Cys Arg Gly Ile Leu Lys Lys Ser Lys Met Arg Met Glu 370 375 380 Lys Leu Leu Ile Asn Ser Ala Lys Lys Glu Asp Met Lys Asp Leu Ile 385 390 395 400 Ile Leu Cys Met Val Phe Ser Gln Asp Thr Arg Met Phe Gln Gly Val 405 410 415 Arg Gly Glu Ile Asn Phe Leu Asn Arg Ala Gly Gln Leu Leu Ser Pro 420 425 430 Met Tyr Gln Leu Gln Arg Tyr Phe Leu Asn Arg Ser Asn Asp Leu Phe 435 440 445 Asp Gln Trp Gly Tyr Glu Glu Ser Pro Lys Ala Ser Glu Leu His Gly 450 455 460 Ile Asn Glu Leu Met Asn Ala Ser Asp Tyr Thr Leu Lys Gly Val Val 465 470 475 480 Val Thr Lys Asn Val Ile Asp Asp Phe Ser Ser Thr Glu Thr Glu Lys 485 490 495 Val Ser Ile Thr Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Arg Thr Gly Glu Val 500 505 510 Ile Met Gly Ala Asn Asp Val Ser Glu Leu Glu Ser Gln Ala Gln Leu 515 520 525 Met Ile Thr Tyr Asp Thr Pro Lys Met Trp Glu Met Gly Thr Thr Lys 530 535 540 Glu Leu Val Gln Asn Thr Tyr Gln Trp Val Leu Lys Asn Leu Val Thr 545 550 555 560 Leu Lys Ala Gln Phe Leu Leu Gly Lys Glu Asp Met Phe Gln Trp Asp 565 570 575 Ala Phe Glu Ala Phe Glu Ser Ile Ile Pro Gln Lys Met Ala Gly Gln 580 585 590 Tyr Ser Gly Phe Ala Arg Ala Val Leu Lys Gln Met Arg Asp Gln Glu 595 600 605 Val Met Lys Thr Asp Gln Phe Ile Lys Leu Leu Pro Phe Cys Phe Ser 610 615 620 Pro Pro Lys Leu Arg Ser Asn Gly Glu Pro Tyr Gln Phe Leu Arg Leu 625 630 635 640 Val Leu Lys Gly Gly Gly Glu Asn Phe Ile Glu Val Arg Lys Gly Ser 645 650 655 Pro Leu Phe Ser Tyr Asn Pro Gln Thr Glu Val Leu Thr Ile Cys Gly 660 665 670 Arg Met Met Ser Leu Lys Gly Lys Ile Glu Asp Glu Glu Arg Asn Arg 675 680 685 Ser Met Gly Asn Ala Val Leu Ala Gly Phe Leu Val Ser Gly Lys Tyr 690 695 700 Asp Pro Asp Leu Gly Asp Phe Lys Thr Ile Glu Glu Leu Glu Lys Leu 705 710 715 720 Lys Pro Gly Glu Lys Ala Asn Ile Leu Leu Tyr Gln Gly Lys Pro Val 725 730 735 Lys Val Val Lys Arg Lys Arg Tyr Ser Ala Leu Ser Asn Asp Ile Ser 740 745 750 Gln Gly Ile Lys Arg Gln Arg Met Thr Val Glu Ser Met Gly Trp Ala 755 760 765 Leu Ser 770 <210> 3 <211> 774 <212> PRT <213> Influenza C virus <220> <221> PB2 <222> (1)..(774) <400> 3 Met Ser Phe Leu Leu Thr Ile Ala Lys Glu Tyr Lys Arg Leu Cys Gln 1 5 10 15 Asp Ala Lys Ala Ala Gln Met Met Thr Val Gly Thr Val Ser Asn Tyr 20 25 30 Thr Thr Phe Lys Lys Trp Thr Thr Ser Arg Lys Glu Lys Asn Pro Ser 35 40 45 Leu Arg Met Arg Trp Ala Met Ser Ser Lys Phe Pro Ile Ile Ala Asn 50 55 60 Lys Arg Met Leu Glu Glu Ala Gln Ile Pro Lys Glu His Asn Asn Val 65 70 75 80 Ala Leu Trp Glu Asp Thr Glu Asp Val Ser Lys Arg Asp His Val Leu 85 90 95 Ala Ser Ala Ser Cys Ile Asn Tyr Trp Asn Phe Cys Gly Pro Cys Val 100 105 110 Asn Asn Ser Glu Val Ile Lys Glu Val Tyr Lys Ser Arg Phe Gly Arg 115 120 125 Leu Glu Arg Arg Lys Glu Ile Met Trp Lys Glu Leu Arg Phe Thr Leu 130 135 140 Val Asp Arg Gln Arg Arg Arg Val Asp Thr Gln Pro Val Glu Gln Arg 145 150 155 160 Leu Arg Thr Gly Glu Ile Lys Asp Leu Gln Met Trp Thr Leu Phe Glu 165 170 175 Asp Glu Ala Pro Leu Ala Ser Lys Phe Ile Leu Asp Asn Tyr Gly Leu 180 185 190 Val Lys Glu Met Arg Ser Lys Phe Ala Asn Lys Pro Leu Asn Lys Glu 195 200 205 Val Val Ala His Met Leu Glu Lys Gln Phe Asn Pro Glu Ser Arg Phe 210 215 220 Leu Pro Val Phe Gly Ala Ile Arg Pro Glu Arg Met Glu Leu Ile His 225 230 235 240 Ala Leu Gly Gly Glu Thr Trp Ile Gln Glu Ala Asn Thr Ala Gly Ile 245 250 255 Ser Asn Val Asp Gln Arg Lys Asn Asp Met Arg Ala Val Cys Arg Lys 260 265 270 Val Cys Leu Ala Ala Asn Ala Ser Ile Met Asn Ala Lys Ser Lys Leu 275 280 285 Val Glu Tyr Ile Lys Ser Thr Ser Met Arg Ile Gly Glu Thr Glu Arg 290 295 300 Lys Leu Glu Glu Leu Ile Leu Glu Thr Asp Asp Val Ser Pro Glu Val 305 310 315 320 Thr Leu Cys Lys Ser Ala Leu Gly Gly Pro Leu Gly Lys Thr Leu Ser 325 330 335 Phe Gly Pro Met Leu Leu Lys Lys Ile Ser Gly Ser Gly Val Lys Val 340 345 350 Lys Asp Thr Val Tyr Ile Gln Gly Val Arg Ala Val Gln Phe Glu Tyr 355 360 365 Trp Ser Glu Gln Glu Glu Phe Tyr Gly Glu Tyr Lys Ser Ala Thr Ala 370 375 380 Leu Phe Ser Arg Lys Glu Arg Ser Leu Glu Trp Ile Thr Ile Gly Gly 385 390 395 400 Gly Ile Asn Glu Asp Arg Lys Arg Leu Leu Ala Met Cys Met Ile Phe 405 410 415 Cys Arg Asp Gly Asp Tyr Phe Lys Asp Ala Pro Ala Thr Ile Thr Met 420 425 430 Ala Asp Leu Ser Thr Lys Leu Gly Arg Glu Ile Pro Tyr Gln Tyr Val 435 440 445 Met Met Asn Trp Ile Gln Lys Ser Glu Asp Asn Leu Glu Ala Leu Leu 450 455 460 Tyr Ser Arg Gly Ile Val Glu Thr Asn Pro Gly Lys Met Gly Ser Ser 465 470 475 480 Met Gly Ile Asp Gly Ser Lys Arg Ala Ile Lys Ser Leu Arg Ala Val 485 490 495 Thr Ile Gln Ser Gly Lys Ile Asp Met Pro Glu Ser Lys Glu Lys Ile 500 505 510 His Leu Glu Leu Ser Asp Asn Leu Glu Ala Phe Asp Ser Ser Gly Arg 515 520 525 Ile Val Ala Thr Ile Leu Asp Leu Pro Ser Asp Lys Lys Val Thr Phe 530 535 540 Gln Asp Val Ser Phe Gln His Pro Asp Leu Ala Val Leu Arg Asp Glu 545 550 555 560 Lys Thr Ala Ile Thr Lys Gly Tyr Glu Ala Leu Ile Lys Arg Leu Gly 565 570 575 Thr Gly Asp Asn Asp Ile Pro Ser Leu Ile Ala Lys Lys Asp Tyr Leu 580 585 590 Ser Leu Tyr Asn Leu Pro Glu Val Lys Leu Met Ala Pro Leu Ile Arg 595 600 605 Pro Asn Arg Lys Gly Val Tyr Ser Arg Val Ala Arg Lys Leu Val Ser 610 615 620 Thr Gln Val Thr Thr Gly His Tyr Ser Leu His Glu Leu Ile Lys Val 625 630 635 640 Leu Pro Phe Thr Tyr Phe Ala Pro Lys Gln Gly Met Phe Glu Gly Arg 645 650 655 Leu Phe Phe Ser Asn Asp Ser Phe Val Glu Pro Gly Val Asn Asn Asn 660 665 670 Val Phe Ser Trp Ser Lys Ala Asp Ser Ser Lys Ile Tyr Cys His Gly 675 680 685 Ile Ala Ile Arg Val Pro Leu Val Val Gly Asp Glu His Met Asp Thr 690 695 700 Ser Leu Ala Leu Leu Glu Gly Phe Ser Val Cys Glu Asn Asp Pro Arg 705 710 715 720 Ala Pro Met Val Thr Arg Gln Asp Leu Ile Asp Val Gly Phe Gly Gln 725 730 735 Lys Val Arg Leu Phe Val Gly Gln Gly Ser Val Arg Thr Phe Lys Arg 740 745 750 Thr Ala Ser Gln Arg Ala Ala Ser Ser Asp Val Asn Lys Asn Val Lys 755 760 765 Lys Ile Lys Met Ser Asn 770 <210> 4 <211> 262 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 235 to 496 <222> (1)..(262) <400> 4 Thr Gln Gly Thr Cys Trp Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val 1 5 10 15 Arg Asn Asp Asp Ile Asp Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile 20 25 30 Val Arg Arg Ala Ser Val Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu 35 40 45 Met Cys His Ser Thr Gln Ile Gly Gly Thr Arg Met Val Asp Ile Leu 50 55 60 Arg Gln Asn Pro Thr Glu Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala 65 70 75 80 Met Gly Leu Arg Ile Ser Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe 85 90 95 Lys Arg Thr Ser Gly Ser Ser Ile Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr 100 105 110 Gly Asn Leu Gln Thr Leu Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu 115 120 125 Phe Thr Met Val Gly Lys Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr 130 135 140 Arg Arg Leu Val Gln Leu Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile 145 150 155 160 Ala Glu Ala Ile Ile Val Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met 165 170 175 Ile Lys Ala Val Arg Gly Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln 180 185 190 Arg Leu Asn Pro Met His Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala 195 200 205 Lys Val Leu Phe Gln Asn Trp Gly Ile Glu His Ile Asp Asn Val Met 210 215 220 Gly Met Val Gly Val Leu Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser 225 230 235 240 Met Arg Gly Ile Arg Val Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser 245 250 255 Thr Glu Arg Val Val Val 260 <210> 5 <211> 243 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 241 to 483 <222> (1)..(243) <400> 5 Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Ile Asp 1 5 10 15 Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Ser Val 20 25 30 Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln 35 40 45 Ile Gly Gly Thr Arg Met Val Asp Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu 50 55 60 Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser 65 70 75 80 Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser 85 90 95 Ser Ile Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu 100 105 110 Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Lys 115 120 125 Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Val Gln Leu 130 135 140 Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val 145 150 155 160 Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly 165 170 175 Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His 180 185 190 Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn 195 200 205 Trp Gly Ile Glu His Ile Asp Asn Val Met Gly Met Val Gly Val Leu 210 215 220 Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Met Arg Gly Ile Arg Val 225 230 235 240 Ser Lys Met <210> 6 <211> 216 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 268 to 483 <222> (1)..(216) <400> 6 Arg Arg Ala Ser Val Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met 1 5 10 15 Cys His Ser Thr Gln Ile Gly Gly Thr Arg Met Val Asp Ile Leu Arg 20 25 30 Gln Asn Pro Thr Glu Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met 35 40 45 Gly Leu Arg Ile Ser Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys 50 55 60 Arg Thr Ser Gly Ser Ser Ile Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly 65 70 75 80 Asn Leu Gln Thr Leu Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe 85 90 95 Thr Met Val Gly Lys Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg 100 105 110 Arg Leu Val Gln Leu Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala 115 120 125 Glu Ala Ile Ile Val Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile 130 135 140 Lys Ala Val Arg Gly Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg 145 150 155 160 Leu Asn Pro Met His Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys 165 170 175 Val Leu Phe Gln Asn Trp Gly Ile Glu His Ile Asp Asn Val Met Gly 180 185 190 Met Val Gly Val Leu Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Met 195 200 205 Arg Gly Ile Arg Val Ser Lys Met 210 215 <210> 7 <211> 204 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 277 to 480 <222> (1)..(204) <400> 7 Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln Ile Gly Gly Thr 1 5 10 15 Arg Met Val Asp Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu Glu Gln Ala Val 20 25 30 Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser Ser Ser Phe Ser 35 40 45 Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser Ser Ile Lys Arg 50 55 60 Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu Lys Ile Arg Val 65 70 75 80 His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Lys Arg Ala Thr Ala 85 90 95 Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Val Gln Leu Ile Val Ser Gly 100 105 110 Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val Ala Met Val Phe 115 120 125 Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly Asp Leu Asn Phe 130 135 140 Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His Gln Leu Leu Arg 145 150 155 160 His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn Trp Gly Ile Glu 165 170 175 His Ile Asp Asn Val Met Gly Met Val Gly Val Leu Pro Asp Met Thr 180 185 190 Pro Ser Thr Glu Met Ser Met Arg Gly Ile Arg Val 195 200 <210> 8 <211> 202 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 281 to 482 <222> (1)..(202) <400> 8 Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln Ile Gly Gly Thr Arg Met Val Asp 1 5 10 15 Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys 20 25 30 Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser Ser Ile Lys Arg Glu Glu Glu Val 50 55 60 Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr 65 70 75 80 Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Lys Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys 85 90 95 Ala Thr Arg Arg Leu Val Gln Leu Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln 100 105 110 Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp 115 120 125 Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala 130 135 140 Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys 145 150 155 160 Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn Trp Gly Ile Glu His Ile Asp Asn 165 170 175 Val Met Gly Met Val Gly Val Leu Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu 180 185 190 Met Ser Met Arg Gly Ile Arg Val Ser Lys 195 200 <210> 9 <211> 194 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 290 to 483 <222> (1)..(194) <400> 9 Gly Gly Thr Arg Met Val Asp Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser Ser 20 25 30 Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser Ser 35 40 45 Ile Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu Lys 50 55 60 Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Lys Arg 65 70 75 80 Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Val Gln Leu Ile 85 90 95 Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val Ala 100 105 110 Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly Asp 115 120 125 Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His Gln 130 135 140 Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn Trp 145 150 155 160 Gly Ile Glu His Ile Asp Asn Val Met Gly Met Val Gly Val Leu Pro 165 170 175 Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Met Arg Gly Ile Arg Val Ser 180 185 190 Lys Met <210> 10 <211> 188 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 295 to 482 <222> (1)..(188) <400> 10 Val Asp Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu Glu Gln Ala Val Asp Ile 1 5 10 15 Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser Ser Ser Phe Ser Phe Gly 20 25 30 Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser Ser Ile Lys Arg Glu Glu 35 40 45 Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu Lys Ile Arg Val His Glu 50 55 60 Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Lys Arg Ala Thr Ala Ile Leu 65 70 75 80 Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Val Gln Leu Ile Val Ser Gly Arg Asp 85 90 95 Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val Ala Met Val Phe Ser Gln 100 105 110 Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly Asp Leu Asn Phe Val Asn 115 120 125 Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His Gln Leu Leu Arg His Phe 130 135 140 Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn Trp Gly Ile Glu His Ile 145 150 155 160 Asp Asn Val Met Gly Met Val Gly Val Leu Pro Asp Met Thr Pro Ser 165 170 175 Thr Glu Met Ser Met Arg Gly Ile Arg Val Ser Lys 180 185 <210> 11 <211> 166 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 318 to 483 R389K <222> (1)..(166) <400> 11 Arg Ile Ser Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr 1 5 10 15 Ser Gly Ser Ser Ile Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu 20 25 30 Gln Thr Leu Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met 35 40 45 Val Gly Lys Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu 50 55 60 Val Gln Leu Ile Val Ser Gly Lys Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala 65 70 75 80 Ile Ile Val Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala 85 90 95 Val Arg Gly Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn 100 105 110 Pro Met His Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu 115 120 125 Phe Gln Asn Trp Gly Ile Glu His Ile Asp Asn Val Met Gly Met Val 130 135 140 Gly Val Leu Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Met Arg Gly 145 150 155 160 Ile Arg Val Ser Lys Met 165 <210> 12 <211> 164 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 320 to 483 <222> (1)..(164) <400> 12 Ser Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ile Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr 20 25 30 Leu Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly 35 40 45 Lys Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Val Gln 50 55 60 Leu Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile 65 70 75 80 Val Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg 85 90 95 Gly Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met 100 105 110 His Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln 115 120 125 Asn Trp Gly Ile Glu His Ile Asp Asn Val Met Gly Met Val Gly Val 130 135 140 Leu Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Met Arg Gly Ile Arg 145 150 155 160 Val Ser Lys Met <210> 13 <211> 82 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 323 to 404 <222> (1)..(82) <400> 13 Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser Ser Ile 1 5 10 15 Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu Lys Ile 20 25 30 Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Lys Arg Ala 35 40 45 Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Val Gln Leu Ile Val 50 55 60 Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val Ala Met 65 70 75 80 Val Phe <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 320 to 330 <222> (1)..(11) <400> 14 Ser Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 330 to 340 <222> (1)..(11) <400> 15 Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser Ser Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 340 to 350 <222> (1)..(11) <400> 16 Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 350 to 360 <222> (1)..(11) <400> 17 Gln Thr Leu Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 360 to 370 <222> (1)..(11) <400> 18 Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Lys Arg Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 370 to 380 <222> (1)..(11) <400> 19 Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 380 to 390 <222> (1)..(11) <400> 20 Arg Leu Val Gln Leu Ile Val Ser Gly Arg Asp 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 390 to 400 <222> (1)..(11) <400> 21 Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 400 to 410 <222> (1)..(11) <400> 22 Val Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met 1 5 10 <210> 23 <211> 2277 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 WT <222> (1)..(2277) <400> 23 atggaaagaa taaaagaact acggaacctg atgtcacagt ctcgcactcg cgagatacta 60 acaaaaacca cagtggacca catggccata attaagaaat acacatcagg gagacaggaa 120 aagaacccgt cacttaggat gaaatggatg atggcaatga aatatccaat tacagctgac 180 aagaggataa cagaaatggt tcctgagaga aatgagcaag gacaaaccct atggagtaaa 240 atgagtgatg ccgggtcaga tcgagtgatg gtatcacctt tggcagtgac atggtggaat 300 agaaatggac cagtgacaag tacggttcat tatccaaaag tctacaagac ttattttgat 360 aaagtcgaaa ggttaaaaca tggaaccttt ggccctgtcc attttagaaa ccaagtcaaa 420 atacgccgaa gagttgacat aaaccctggt catgcagacc tcagtgccaa ggaggcacaa 480 gatgtaatca tggaagttgt tttccccaat gaagtggggg ccaggatact aacgtcggaa 540 tcacaattga caataaccaa agagaaaaaa gaagaactcc aagattgcaa aatttctcct 600 ttgatggttg catacatgtt agagagagaa cttgtccgaa aaacgagatt tctcccagtt 660 gctggtggaa caagcagtgt gtacattgaa gtgttacact tgactcaagg aacgtgttgg 720 gaacagatgt acactccagg tggagaagtg aggaatgacg atattgacca aagcctaatt 780 attgcagcca ggaacatagt gagaagagca tcagtatcag cagatccact agcatcttta 840 ttggagatgt gccacagcac acaaattggc gggacaagga tggtggacat tcttagacag 900 aacccgacgg aagaacaagc tgtggatata tgcaaggctg caatgggact gagaatcagc 960 tcatccttca gttttggtgg gttcacattt aagagaacaa gcgggtcatc aatcaaaaga 1020 gaggaagaag tgcttacggg caatctccaa acattgaaaa taagggtgca tgaagggtac 1080 gaggagttca caatggtggg gaaaagggca acagctatac tcagaaaagc aaccaggaga 1140 ttggttcagc ttatagtgag tggaagggac gagcagtcaa tagccgaagc gataattgta 1200 gccatggtgt tttcacaaga ggattgcatg ataaaagcag ttagaggtga cctgaatttc 1260 gttaacaggg caaatcagcg gttgaatccc atgcaccaac ttttaaggca ttttcagaaa 1320 gatgcgaaag tgctttttca gaattgggga attgaacata ttgacaatgt gatgggaatg 1380 gttggagtat taccagacat gactccaagc acagagatgt caatgagagg aataagagtc 1440 agcaaaatgg gcgtggatga atactccagc acagagaggg tagtggttag cattgatcgg 1500 tttttgagag ttcgagacca acgtgggaat gtattactat ctcctgagga ggtcagtgaa 1560 acacatggga cagagagact gacaataact tactcatcgt caatgatgtg ggagattaat 1620 ggccctgagt cagtgttggt caatacctat caatggatca tcagaaattg ggaaactgtt 1680 aaaattcaat ggtctcagaa tcctacaatg ttgtacaaca aaatggaatt tgagccattt 1740 cagtctttag ttcctaaggc cattagaggc caatacagtg gatttgtcag aactctattc 1800 caacaaatga gggatgtact tgggacattt gataccaccc agataataaa gcttctcccc 1860 tttgcagccg ccccaccaaa gcaaagtaga atgcagttct cttcattgac tgtgaatgtg 1920 aggggatcag ggatgagaat acttgtaagg ggcaattctc ctgtattcaa ctacaacaag 1980 accactaaaa gactaacaat tctcggaaaa gatgctggca ctttaattga agacccagat 2040 gaaagcacat ccggagtgga gtccgctgtt ttgagaggat ttctcattct aggtaaggaa 2100 gatagaagat acggaccagc attaagcatc aatgaactga gcaaccttgc aaaaggagaa 2160 aaggctaatg tgctaattgg gcaaggagac gtggtgttgg taatgaaacg aaaacgggac 2220 tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcggatggc catcaat 2277 <210> 24 <211> 2277 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 Arg389Lys <222> (1)..(2277) <400> 24 atggaaagaa taaaagaact acggaacctg atgtcacagt ctcgcactcg cgagatacta 60 acaaaaacca cagtggacca catggccata attaagaaat acacatcagg gagacaggaa 120 aagaacccgt cacttaggat gaaatggatg atggcaatga aatatccaat tacagctgac 180 aagaggataa cagaaatggt tcctgagaga aatgagcaag gacaaaccct atggagtaaa 240 atgagtgatg ccgggtcaga tcgagtgatg gtatcacctt tggcagtgac atggtggaat 300 agaaatggac cagtgacaag tacggttcat tatccaaaag tctacaagac ttattttgat 360 aaagtcgaaa ggttaaaaca tggaaccttt ggccctgtcc attttagaaa ccaagtcaaa 420 atacgccgaa gagttgacat aaaccctggt catgcagacc tcagtgccaa ggaggcacaa 480 gatgtaatca tggaagttgt tttccccaat gaagtggggg ccaggatact aacgtcggaa 540 tcacaattga caataaccaa agagaaaaaa gaagaactcc aagattgcaa aatttctcct 600 ttgatggttg catacatgtt agagagagaa cttgtccgaa aaacgagatt tctcccagtt 660 gctggtggaa caagcagtgt gtacattgaa gtgttacact tgactcaagg aacgtgttgg 720 gaacagatgt acactccagg tggagaagtg aggaatgacg atattgacca aagcctaatt 780 attgcagcca ggaacatagt gagaagagca tcagtatcag cagatccact agcatcttta 840 ttggagatgt gccacagcac acaaattggc gggacaagga tggtggacat tcttagacag 900 aacccgacgg aagaacaagc tgtggatata tgcaaggctg caatgggact gagaatcagc 960 tcatccttca gttttggtgg gttcacattt aagagaacaa gcgggtcatc aatcaaaaga 1020 gaggaagaag tgcttacggg caatctccaa acattgaaaa taagggtgca tgaagggtac 1080 gaggagttca caatggtggg gaaaagggca acagctatac tcagaaaagc aaccaggaga 1140 ttggttcagc ttatagtgag tggaaaggac gagcagtcaa tagccgaagc gataattgta 1200 gccatggtgt tttcacaaga ggattgcatg ataaaagcag ttagaggtga cctgaatttc 1260 gttaacaggg caaatcagcg gttgaatccc atgcaccaac ttttaaggca ttttcagaaa 1320 gatgcgaaag tgctttttca gaattgggga attgaacata ttgacaatgt gatgggaatg 1380 gttggagtat taccagacat gactccaagc acagagatgt caatgagagg aataagagtc 1440 agcaaaatgg gcgtggatga atactccagc acagagaggg tagtggttag cattgatcgg 1500 tttttgagag ttcgagacca acgtgggaat gtattactat ctcctgagga ggtcagtgaa 1560 acacatggga cagagagact gacaataact tactcatcgt caatgatgtg ggagattaat 1620 ggccctgagt cagtgttggt caatacctat caatggatca tcagaaattg ggaaactgtt 1680 aaaattcaat ggtctcagaa tcctacaatg ttgtacaaca aaatggaatt tgagccattt 1740 cagtctttag ttcctaaggc cattagaggc caatacagtg gatttgtcag aactctattc 1800 caacaaatga gggatgtact tgggacattt gataccaccc agataataaa gcttctcccc 1860 tttgcagccg ccccaccaaa gcaaagtaga atgcagttct cttcattgac tgtgaatgtg 1920 aggggatcag ggatgagaat acttgtaagg ggcaattctc ctgtattcaa ctacaacaag 1980 accactaaaa gactaacaat tctcggaaaa gatgctggca ctttaattga agacccagat 2040 gaaagcacat ccggagtgga gtccgctgtt ttgagaggat ttctcattct aggtaaggaa 2100 gatagaagat acggaccagc attaagcatc aatgaactga gcaaccttgc aaaaggagaa 2160 aaggctaatg tgctaattgg gcaaggagac gtggtgttgg taatgaaacg aaaacgggac 2220 tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcggatggc catcaat 2277 <210> 25 <211> 2277 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> PB2 synthetic gene, optimized for E.coli codon usage <222> (1)..(2274) <400> 25 atggaacgca ttaaagaact gcgcaacctg atgagccaga gccgtacccg tgaaattctg 60 accaaaacca ccgtggatca catggcgatc atcaaaaaat ataccagcgg ccgtcaggaa 120 aaaaatccga gcctgcgcat gaaatggatg atggcgatga aatatccgat caccgcggat 180 aaacgcatta ccgaaatggt gccggaacgt aatgaacagg gccagaccct gtggagcaaa 240 atgagcgatg cgggtagcga tcgtgttatg gttagcccgc tggcggttac ctggtggaat 300 cgtaatggtc cggttaccag caccgtgcat tatccgaaag tgtacaaaac ctatttcgat 360 aaagtggaac gcctgaaaca tggcaccttt ggcccggtgc attttcgtaa ccaggtgaaa 420 attcgtcgtc gcgtggatat taatccgggt catgcggatc tgagcgcgaa agaagcgcaa 480 gacgttatca tggaagttgt tttcccgaac gaagttggtg cgcgtattct gaccagcgaa 540 agccagctga ccatcaccaa agaaaaaaaa gaagaactgc aggattgcaa aattagcccg 600 ctgatggtgg cgtatatgct ggaacgtgaa ctggttcgta aaacccgttt tctgccggtt 660 gcgggtggca ccagcagcgt gtatattgaa gtgctgcatc tgacccaggg cacctgttgg 720 gaacagatgt ataccccggg tggtgaagtg cgtaacgatg atatcgatca gagcctgatt 780 attgcggcgc gtaacattgt tcgtcgtgcg agcgttagcg cggatccgct ggcgagcctg 840 ctggaaatgt gtcatagcac ccagattggt ggcacccgta tggttgatat tctgcgtcag 900 aacccgaccg aagaacaggc ggtggatatt tgtaaagcgg cgatgggtct gcgtattagc 960 agcagcttta gctttggcgg ctttaccttt aaacgtacca gcggcagcag cattaaacgt 1020 gaagaagaag tgctgaccgg taatctgcag accctgaaaa ttcgtgtgca cgaaggctat 1080 gaagaattca cgatggttgg caaacgtgcg accgcgattc tgcgtaaagc gacccgtcgt 1140 ctggttcagc tgattgtgag cggcaaagat gaacagagca ttgcggaagc gattatcgtt 1200 gcgatggttt tcagccagga agattgcatg attaaagcgg ttcgtggcga tctgaacttt 1260 gtgaaccgtg cgaaccagcg tctgaatccg atgcaccagc tgctgcgcca ttttcagaaa 1320 gatgcgaaag tgctgtttca gaactggggc atcgaacata tcgataacgt gatgggcatg 1380 gttggtgttc tgccggatat gaccccgagc accgaaatga gcatgcgtgg tattcgtgtg 1440 agcaaaatgg gcgtggatga atacagcagc accgaacgtg tggttgtgag cattgatcgt 1500 tttctgcgtg tgcgtgatca gcgtggtaat gttctgctga gcccggagga ggttagcgaa 1560 acgcacggca ccgaacgtct gaccattacc tatagcagca gcatgatgtg ggagattaac 1620 ggtccggaaa gcgtgctggt gaacacctat cagtggatca ttcgcaactg ggaaaccgtg 1680 aaaattcagt ggagccagaa tccgaccatg ctgtacaaca aaatggaatt cgaaccgttt 1740 cagagcctgg ttccgaaagc gattcgtggt cagtatagcg gttttgtgcg taccctgttt 1800 cagcagatgc gtgatgttct gggcaccttt gataccaccc agatcattaa actgctgccg 1860 tttgcggcgg caccgccgaa acagagccgt atgcagttta gcagcctgac cgtgaatgtt 1920 cgtggtagcg gcatgcgtat tctggttcgt ggtaacagcc cggtgttcaa ctataacaaa 1980 accaccaaac gcctgaccat tctgggtaaa gatgcgggca ccctgattga agatccggat 2040 gaaagcacca gcggcgttga aagcgcggtt ctgcgcggtt ttctgattct gggcaaggag 2100 gatcgtcgtt acggtccggc gctgagcatt aacgaactga gcaatctggc gaaaggcgaa 2160 aaagcgaacg ttctgattgg tcagggtgat gtggtgctgg tgatgaaacg taaacgcgat 2220 agcagcattc tgaccgatag ccagaccgcg accaaacgta ttcgtatggc gattaat 2277 <210> 26 <211> 2313 <212> DNA <213> Influenza B virus <220> <221> PB2 <222> (1)..(2313) <400> 26 atgacattgg ctaaaattga attgttaaaa caactgttaa gggacaatga agccaaaaca 60 gtattgaaac aaacaacggt agaccaatat aacataataa gaaaattcaa tacatcaaga 120 attgaaaaga acccttcatt aaggatgaag tgggcaatgt gttctaattt tcccttggct 180 ttgaccaagg gtgacatggc aaacagaatc cccttggaat acaagggaat acaacttaaa 240 acaaatgctg aagacatagg aaccaaaggc caaatgtgct caatagcagc agttacctgg 300 tggaatacat atggaccaat aggagatact gaaggtttcg aaaaagtcta cgaaagcttt 360 tttctcagaa agatgagact tgacaatgcc acttggggcc gaataacttt tggcccagtt 420 gaaagagtaa gaaaaagggt actgctaaac cctctcacta aggaaatgcc tccagatgaa 480 gcaagtaatg tgataatgga aatattgttc cctaaggaag caggaatacc aagagaatct 540 acttggatac atagggaact gataaaagaa aaaagagaaa aattgaaagg aacgatgata 600 actcccattg tactggcata catgcttgag agggaattgg ttgccaggag aaggttcctg 660 ccggtggcag gagcaacatc agctgagttc atagaaatgc tacactgctt acaaggtgaa 720 aattggagac aaatatacca cccgggaggg aataaactaa ctgaatctag gtctcaatcg 780 atgattgtgg cttgtagaaa gataatcaga agatcaatag tcgcatcaaa cccattggag 840 ctggctgtag aaattgcaaa caagactgtg atagatactg aacctttaaa atcatgtctg 900 acagccatag acggaggtga tgtcgcctgt gacataataa gagctgcatt aggactaaag 960 atcagacaaa gacaaagatt tggacgactt gaactaaaaa ggatatcagg aagaggattc 1020 aaaaatgatg aagaaatatt aatcgggaac ggaacaatac agaagattgg aatatgggac 1080 ggagaagagg agttccatgt aagatgtggt gaatgcaggg gaatattaaa aaagagcaaa 1140 atgagaatgg aaaaactact aataaattca gctaaaaagg aagacatgaa agatttaata 1200 atcttgtgca tggtattttc tcaagacact aggatgttcc aaggagtaag gggagaaata 1260 aattttctta atagagcagg ccaactttta tctccaatgt accaactcca aagatatttt 1320 ttgaatagaa gtaacgatct ctttgatcaa tgggggtatg aggaatcacc caaagcaagt 1380 gagctacatg ggataaatga attaatgaat gcatctgact acactttgaa aggggttgta 1440 gtaacaaaaa atgtgattga tgattttagt tctactgaaa cagaaaaagt atctataaca 1500 aaaaatctta gtttaataaa aagaactggg gaagtcataa tgggggccaa tgacgtaagt 1560 gaattagaat cacaagctca gctaatgata acatatgata cacctaagat gtgggagatg 1620 ggaacaacca aggaactggt gcaaaacacc tatcaatggg tgctaaaaaa tttggtaaca 1680 ctgaaggctc agtttcttct aggaaaagaa gacatgttcc aatgggatgc atttgaagca 1740 tttgaaagca taatccccca gaagatggct ggccaataca gtggatttgc aagagcagtg 1800 ctcaaacaaa tgagagacca agaggtcatg aaaactgacc agttcataaa gttgttgccc 1860 ttttgtttct caccaccaaa gttaaggagc aatggggagc cttatcagtt cttgaggctt 1920 gtattgaagg gaggaggaga aaatttcatc gaagtaagga aagggtctcc tctattctct 1980 tacaatccac aaacagaagt cctaactata tgcggcagaa tgatgtcatt aaaagggaaa 2040 attgaagatg aagaaaggaa tagatcaatg gggaatgcag tgttggcggg ttttcttgtt 2100 agtggcaagt atgacccaga tcttggagat ttcaaaacta ttgaagaact tgaaaagcta 2160 aaaccggggg agaaagcaaa catcttactt tatcaaggaa agcccgttaa agtagttaaa 2220 aggaaaagat atagtgcttt atccaatgac atttcacaag gaattaagag acaaagaatg 2280 acagttgagt ccatggggtg ggccttgagc taa 2313 <210> 27 <211> 2325 <212> DNA <213> Influenza C virus <220> <221> PB2 <222> (1)..(2325) <400> 27 atgtcttttc tattgacaat agcaaaggaa tacaaaagac tatgccaaga tgctaaggca 60 gctcaaatga tgacagtagg aactgtatca aactacacta cgttcaagaa atggactaca 120 tcaaggaagg aaaagaatcc ttcactaaga atgagatggg caatgagcag caaattccca 180 ataatagcta acaagagaat gctggaagaa gctcaaattc ctaaagaaca caacaatgta 240 gccctttggg aagacacaga agatgtttca aaaagggatc atgttcttgc aagcgcctct 300 tgtataaatt attggaattt ttgtggacct tgtgtcaaca attcagaagt gatcaaagaa 360 gtttataaat ctagatttgg aagattagaa agaaggaaag aaataatgtg gaaagaactt 420 agatttacat tagttgatag acaacgaaga agagttgaca ctcagcctgt agaacaaaga 480 ttgagaactg gagaaattaa agacttgcaa atgtggactt tgttcgaaga tgaagctcct 540 cttgctagca aatttatttt agacaattat ggtctagtca aagaaatgag atcaaagttt 600 gcaaacaaac ctctgaataa agaagtagtt gcacacatgt tagaaaaaca attcaatccg 660 gaaagtagat tcttgcctgt tttcggagct ataaggccag aaagaatgga attgatccat 720 gcattaggag gagaaacttg gatacaagaa gctaacactg cagggatttc caatgttgat 780 caaaggaaaa atgatatgag agcagtatgt aggaaagttt gtcttgcagc aaatgcaagt 840 ataatgaacg ccaaaagcaa actggttgag tatataaaaa gtacaagtat gagaattgga 900 gaaacagaaa gaaagcttga agaacttata cttgaaaccg atgatgtctc acctgaagta 960 acattatgta aatctgcttt aggaggacca ttaggaaaaa ctctatcttt tgggcccatg 1020 ctactcaaga aaatttctgg ttccggagta aaagttaaag atacagtata tatccaaggt 1080 gtcagagcag tacaatttga atactggagt gagcaagaag aattctatgg agaatataag 1140 tcagccaccg ctttattcag cagaaaggaa agatcactag aatggattac aataggagga 1200 ggaataaatg aagacagaaa gagacttcta gctatgtgca tgatattttg cagagatgga 1260 gattatttta aagacgcccc tgcaacaata acaatggcag atttaagtac gaagttagga 1320 agagaaattc catatcaata tgtgatgatg aattggatac aaaaatcaga agataatctc 1380 gaagccttat tatacagtag gggaattgta gaaaccaatc caggaaaaat ggggagctca 1440 atgggaattg atggttccaa aagagcaatt aaatctttaa gggctgtcac aatacaatca 1500 ggaaagattg acatgccaga atcaaaagaa aaaattcacc ttgagctctc tgataatctt 1560 gaagcatttg attcatcagg aagaattgtt gcaacaattt tagaccttcc tagtgacaaa 1620 aaggtaacat ttcaggatgt aagctttcaa catcctgatc tggcagtatt gagagatgag 1680 aaaacggcca taacaaaagg gtatgaagcg ctaatcaaaa ggctaggaac aggggacaat 1740 gatattcctt ccttaattgc aaagaaggat tatttgtctc tttataattt accagaagta 1800 aaattaatgg ctcccttaat cagacccaat agaaaaggag tttattccag agttgctaga 1860 aaattagtgt ctacacaagt tactactgga cattattcat tacatgaatt gataaaggtc 1920 ttacccttta cttatttcgc cccaaaacag ggaatgtttg aaggaaggct tttctttagc 1980 aacgatagct ttgttgagcc tggagtaaat aacaatgtat tttcttggag taaggctgac 2040 agttctaaaa tatattgtca tggaatagcg ataagggtac ctttagttgt tggagatgaa 2100 cacatggaca cttcgttagc actattagaa gggtttagtg tttgtgaaaa cgaccccaga 2160 gcaccaatgg taacaagaca agatttaatt gatgtgggat ttgggcaaaa agttagactc 2220 ttcgtaggcc aagggagcgt tagaaccttc aagcgaactg cctcacaaag ggctgcatca 2280 agcgatgtaa ataagaatgt gaaaaagata aagatgtcta actaa 2325 1/30

Claims

(i) 인플루엔자 바이러스 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2 또는 그의 변이체로부터 유도되고, (ii) RNA 캡 또는 그의 유사체에 결합할 수 있는 가용성 폴리펩타이드 단편.
제1항에 있어서, 결정화에 적합한 정도까지 정제된 폴리펩타이드 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 서브유니트 PB2가 인플루엔자 A, B 또는 C 바이러스 또는 그의 변이체로부터 유래하는 폴리펩타이드 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) N-말단은 SEQ ID NO: 1에 따르는 PB2의 아미노산 서열 및 그의 변이체의 아미노산 위치 220 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 510 또는 그보다 하위와 동일하거나 그에 상응하거나,
(ii) N-말단은 SEQ ID NO: 2에 따르는 PB2의 아미노산 서열 및 그의 변이체의 아미노산 위치 222 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 511 또는 그보다 하위와 동일하거나 그에 상응하거나,
(iii) N-말단은 SEQ ID NO: 3에 따르는 PB2의 아미노산 서열 및 그의 변이체의 아미노산 위치 227 또는 그보다 상위와 동일하거나 그에 상응하며, C-말단은 아미노산 위치 528 또는 그보다 하위와 동일하거나 그에 상응하고, RNA 캡 또는 그의 유사체와 회합하는 능력을 보유하는 폴리펩타이드 단편.
제4항에 있어서, RNA 캡 또는 그의 유사체와 회합하는 능력을 보유하고, SEQ ID NO: 4 내지 13에 따르는 아미노산 서열 및 그의 변이체의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나, 그에 상응하는 폴리펩타이드 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 단편 및 RNA 캡 또는 그의 유사체를 포함하는 컴플렉스.
제6항에 있어서, 캡 유사체가 m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, 및 m⁷GpppUm로 구성된 그룹으로부터 선택되는 컴플렉스.
제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 단편이 SEQ ID NO: 11에 따르는 아미노산 서열로 구성되고, 상기 캡 유사체가 m⁷GTP이며, 도 18에 나타낸 바와 같은 구조 좌표에 의해서 정의되는 구조를 갖는 컴플렉스.
제8항에 있어서, 상기 컴플렉스가 공간 그룹 C222₁, 및 a = 9.2 ㎚; b = 9.4 ㎚; c = 22.0 ㎚ (±0.3 ㎚)의 단위 셀 크기를 갖는 결정성 형태를 갖는 컴플렉스.
제8항 및 제9항에 있어서, 결정이 3.0 Å 또는 그 이상, 바람직하게는 2.4 Å 또는 그 이상의 분해능으로 X-선을 회절시키는 컴플렉스.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 분리된 폴리펩타이드에 대해 코드화한 분리된 폴리뉴클레오타이드.
제11항의 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제11항의 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 제12항의 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
(a) 도 18에 나타낸 바와 같은 제8항의 컴플렉스의 구조 좌표에 의해서 정의된 결합 포켓의 컴퓨터 모델을 구성하고;
(b) (i) 분자 단편을 화합물로 조립하고, (ii) 소분자 데이터베이스로부터 화합물을 선택하고, (c) 화합물의 새로운 리간드 디자인을 하는 것으로 구성된 그룹으로부터 선택된 방법에 의해서 잠재적 결합 화합물을 선택하고;
(c) 결합 포켓 내의 화합물의 에너지-최소화된 배열을 제공하기 위해서 컴퓨터 수단을 사용하여 화합물 및 결합 포켓의 컴퓨터 모델 사이의 피팅 프로그램 운전을 수행하고; 또한
(d) 피팅 운전의 결과를 평가하여 화합물과 결합 포켓 모델 사이의 회합을 정량화하고, 이에 의해서 결합 포켓과 회합하는 화합물의 능력을 평가하는 단계를 포함하여,
PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓의 전부 또는 일부와 회합하는 화합물을 확인하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 결합 포켓이 SEQ ID NO: 1에 따르는 PB2의 아미노산 Phe323, His357, 및 Phe404, 또는 그에 상응하는 아미노산을 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 결합 포켓이 SEQ ID NO: 1에 따르는 PB2의 아미노산 Phe325, Phe330, 및 Phe363, 또는 그에 상응하는 아미노산을 더 포함하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 결합 포켓이 SEQ ID NO: 1에 따르는 PB2의 아미노산 Glu361, 및 Lys376, 또는 그에 상응하는 아미노산을 더 포함하는 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 포켓이 아미노산 Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406을 더 포함하는 방법.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 포켓이 SEQ ID NO: 1에 따르는 PB2의 아미노산 Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432, 또는 그에 상응하는 아미노산을 더 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 결합 포켓이 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe323, His357, 및 Phe404의 구조 좌표에 의해서 정의되는 방법.
제20항에 있어서, 상기 결합 포켓이 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Phe325, Phe330, 및 Phe363의 구조 좌표에 의해서 더 정의되는 방법.
제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 결합 포켓이 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Glu361, 및 Lys376의 구조 좌표에 의해서 더 정의되는 방법.
제20항 또는 제22항에 있어서, 상기 결합 포켓이 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Ser320, Arg332, Ser337, 및 Gln406의 구조 좌표에 의해서 더 정의되는 방법.
제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 포켓이 도 18에 따르는 PB2 SEQ ID NO: 1 아미노산 Lys339, Arg355, Asn429, 및 His432의 구조 좌표에 의해서 더 정의되는 방법.
제20항에 있어서, PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓이 상기 결합 포켓의 아미노산 Phe323, His357, 및 Phe404의 골격구조 원자로부터 2.5 Å 이하의 제곱 평균 편차를 갖는 방법.
제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, (e) 상기 화합물을 합성하고, 임의로 상기 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(들) 및/또는 담체(들)에 의해서 제제화하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
제26항에 있어서, (f) 상기 화합물, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 상기 폴리펩타이드 단편, 또는 제12항에 따르는 상기 재조합 숙주 세포, 및 RNA 캡 또는 그의 유사체를 접촉시켜 상기 PB2 폴리펩타이드 단편과 상기 RNA 캡 또는 그의 유사체 사이의 결합을 억제하는 상기 화합물의 능력을 결정하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, m⁷GpppUm, 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온, T-705 또는 m⁷Gppp(N)_1-15 (여기에서, N은 A, Am, G, Gm, C, Cm, U 또는 Um이다)가 아니며, PB2 또는 그의 변이체의 RNA 캡 결합 포켓에 결합할 수 있는, 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물.
m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, m⁷GpppUm, 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온, T-705 또는 m⁷Gppp(N)_1-15 (여기에서, N은 A, Am, G, Gm, C, Cm, U 또는 Um이다)가 아니며, PB2 폴리펩타이드, 그의 변이체 또는 그의 단편과 RNA 캡 또는 그의 유사체 사이의 결합을 억제할 수 있는, 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물.
(i) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 상기 폴리펩타이드 단편 또는 제13항에 따르는 상기 재조합 숙주 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, (ii) PB2에 결합하는 상기 시험 화합물의 능력을 분석하는 단계를 포함하여, PB2의 RNA 캡 결합 포켓 또는 PB2 폴리펩타이드 변이체의 결합 포켓과 회합하는 화합물을 확인하는 방법.
제30항에 있어서, RNA 캡 또는 그의 유사체를 첨가하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 RNA 캡 또는 그의 유사체의 존재 하에서 PB2 또는 그의 변이체에 결합하는 상기 시험 화합물의 능력, 또는 PB2 또는 그의 변이체에 대한 상기 RNA 캡 또는 그의 유사체의 결합을 억제하는 상기 시험 화합물의 능력을 분석하는 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 RNA 캡 또는 그의 유사체를 상기 시험 화합물을 첨가하기 전에, 동시에 또는 후에 첨가하는 방법.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 고속 세팅으로 수행되는 방법.
제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 화합물이 소분자인 방법.
제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 화합물이 펩타이드 또는 단백질인 방법.
제26항, 제27항, 또는 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(들) 및/또는 담체(들)에 의해서 제제화하는 단계를 더 포함하는 방법.
제27항 또는 제37항의 방법에 따라서 생산할 수 있는 약제학적 조성물.
m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, m⁷GpppUm, 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온, T-705 또는 m⁷Gppp(N)_1-15 (여기에서, N은 A, Am, G, Gm, C, Cm, U 또는 Um이다)가 아니며, PB2 폴리펩타이드, 그의 변이체 또는 그의 단편에 결합할 수 있는, 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물.
m⁷G, m⁷GMP, m⁷GTP, m⁷GpppG, m⁷GpppGm, m⁷GpppA, m⁷GpppAm, m⁷GpppC, m⁷GpppCm, m⁷GpppU, m⁷GpppUm, 2-아미노-7-벤질-9-(4-하이드록시-부틸)-1,9-디하이드로-퓨린-6-온, T-705 또는 m⁷Gppp(N)_1-15 (여기에서, N은 A, Am, G, Gm, C, Cm, U 또는 Um이다)가 아니며, PB2 폴리펩타이드, 그의 변이체 또는 그의 단편과 RNA 캡 또는 그의 유사체 사이의 결합을 억제할 수 있는, 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 확인할 수 있는 화합물.
PB2의 RNA 캡 결합 영역에 대해서 지시된 항체.
제41항에 있어서, SEQ ID NO: 14 내지 22에 의해서 정의된 폴리펩타이드의 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 단편을 인식하는 항체.
네가티브-센스 ssRNA 바이러스에 의한 바이러스 감염에 의해서 야기된 질병 상태를 치료, 개선 또는 예방하는 의약의 제조를 위한 제28항, 제29항, 제39항 또는 제40항에 따르는 화합물, 제36항에 따르는 약제학적 조성물, 또는 제41항 또는 제42항에 따르는 항체의 용도.
제43항에 있어서, 상기 질병 상태가 보나비리다에 (Bornaviridae), 필로비리다에 (Filoviridae), 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae), 및 라브도비리다에 (Rhabdoviridae) 과를 포함하는 모노네가비랄레스 (Mononegavirales) 목의 바이러스 감염에 의해서 야기되는 용도.
제43항에 있어서, 상기 질병 상태가 오르토믹소비리다에 (Orthomyxo-viridae), 아레나비리다에 (Arenaviridae) 또는 분야비리다에 (Bunyaviridae) 과에 의해서 야기되는 용도.
제43항에 있어서, 상기 질병 상태가 보르나병 바이러스, 마르버그 바이러스, 에볼라 바이러스, 센다이 바이러스, 멈프스 바이러스, 홍역 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 칠면조 비기관염 바이러스, 소포성 구내염 인디아나 바이러스, 니파 바이러스, 헨다 바이러스, 광견병 바이러스, 소유행열 바이러스, 전염성 조혈기 괴사 바이러스, 토고토 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 한탄 바이러스, 크리미안-콩고 출혈열 바이러스, 리프트 밸리열 바이러스 및 라크로스 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된 바이러스에 의해서 야기되는 용도.
제43항에 있어서, 상기 질병 상태가 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 토고토 바이러스 및 한탄 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택된 바이러스에 의해서 야기되는 용도.