KR20100070265A - 과수 병해 방제용 미생물 살균제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 길항균 미생물을 이용한 과수 병해 방제용 살균제에 관한 것으로, 본 발명의 미생물 살균제는 과수 병해에 대한 길항균으로서 본 발명자에 의해 분리된 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P)를 이용하고, 살균성 식물 추출물로서 차나무 또는 울금 추출물을, 살균성 식물 정유로서 피마자오일(Castor oil), 클로브 버드(Clove bud), 타임(Thyme) 등을 포함하므로써, 종래 화학적 살균제와 효과면에서 비슷하면서도 내성유발이 없고 인체에 무해하며 살균력이 종래 화학농약에 대등한 환경친화적 살균제를 제공한다.
검은점무늬병(Melanose), 감귤 검은점무늬병원균(Diaporthe citri), 바실러스 서브틸리스, 차나무(Melaleuca alternifolia), 피마자유(Castor oil)

Description

과수 병해 방제용 미생물 살균제{BIOLOGICAL GERMICIDE FOR PREVENTING FRUIT TREE DISEASE}
본 발명은 길항균 미생물을 이용한 과수 병해 방제용 살균제에 관한 것으로, 보다 상세히는 감귤 검은점무늬병 등의 과수 병해에 길항균 미생물과 살균·항균성 식물추출물, 살균·항균성 식물정유를 이용하여 환경오염없이 자연친화적인 생물학적 살균제에 관한 것이다.
검은점무늬병(Melanose)은 제주도 감귤 재배농가에 가장 큰 피해를 주는 병으로서 심한 지역에서는 전체 농약살포 횟수의 절반 이상이 검은점무늬병 방제를 위해서 행해지고 있다. 특히 서귀포를 포함한 제주도의 남동부지역은 타 지역에 비하여 검은점무늬병에 대한 피해가 심한 지역이다. 또한 검은점무늬병균은 줄기나 나무전체가 갑자기 죽어버리는 수지병이나 주요 저장병인 꼭지썩음병의 원인이 되기도 한다.
기주범위는 감귤속 식물이며, 감귤류 전체에 발병되나 종류에 따라 발병의 차이는 약간 있다. 감귤지대에 널리 분포하지만 감귤의 생육기간에 강우가 적은 지역에서는 비교적 발병이 적은 편이고, 강우가 많은 제주도 남동쪽 지역에서 발병이 많은 편이다.
검은점무늬병원균은 자낭균에 속하는 곰팡이로 자낭포자 세대는 Diaporthe citri F. A. Wolf이고 분생포자 세대는 Phomopsis citri Fawcett이다. 분생포자인 병포자를 형성하는 병자각은 주로 죽은 가지, 특히 최근에 죽은 가지에 주로 생기며 검은색의 타원형, 또는 원형이고 그 크기는 200~450㎛이다. 병포자는 두 가지 형태, 즉 알파(α)포자, 베타(β)포자를 형성하는데 알파포자는 무색, 단포이며 크기는 5~9×2~4㎛로써 기주식물을 직접 침입하지만 베타포자는 무색, 단포의 실 모양으로 크기는 20~30×0.7~1.5㎛로서 발아가 되지 않아 기주식물을 직접 침입하지는 못한다.
병포자들은 습기가 많은 조건에서는 끈끈한 노란색의 점액질 덩어리 형태로 병자각으로 부터 분출되며 상대적으로 건조한 조건하에서는 덩굴손(tendril) 모양으로 분출되고 여기에서 나온 포자들은 건조에 상당히 강한 것으로 알려져 있다. 자낭악은 병자각 형성이 거의 끝난 가지에 생기며 검은색으로 새의 긴 부리모양으로 끝이 가늘어지며 길이는 200~800㎛이다. 자낭은 긴 곤봉형으로 그 안에 8개의 자낭포자가 들어 있으며 각각의 자낭포자들은 무색, 2포이며 두 개의 유구(guttulae)를 가지고 그 크기는 11~15.5×3~5㎛이다. 균사의 발육 최적온도는 24℃이며 20~28℃에서 4시간이면 발아가 되기 시작하지만 15℃에서는 10시간을 요구한다.
검은점무늬병균의 발생생태를 보면 병원균은 병자각이나 자낭각 형태로 월동하며 전염원은 이들에서 생성된 병포자와 자낭포자이다. 자낭포자는 공기 중에 비산되어 바람에 의해 먼 거리까지 병원균을 전파시킬 수 있지만 상대적으로 병포자에 비해서 전염원으로서의 비중은 훨씬 가벼운 편이다. 병포자는 나무위의 마른 가지나 과원에 방치하여 둔 죽은 가지에서 생겨난 병자각에서 생성되며 빗방울과 함께 비산된다. 과실의 경우 통상 낙화기 부터 낙화 후 5개월까지 병이 발생할 수 있으며 병 발생 정도는 수상에 남아 있는 죽은 가지의 양, 과실의 크기(생육단계), 강우나 이슬에 의한 습윤기간에 따라 다양하다.
죽은 가지나 전정하여 버려진 가지에 병원균이 정착하고 2~3개월 후면 포자를 형성하여 전염원이 되며 약 1년 정도 포자 생성이 지속된다. 녹지를 침입한 병원균은 죽지 않고 살아있는 경우가 많으며 녹지가 고사한 후(병원균에 의해 고사하는지는 확실치 않음) 병자각이 형성되어 전염원이 된다. 포자가 열매나 잎을 침입하면 기주식물은 병원균에 대한 방어작용으로서 항균물질을 분비하여 침입한 병원균을 죽이고 그 반응으로써 검은 점이 형성되게 되는 것으로 알려져 있다.
포자가 식물조직을 침입하기 위해서는 24~28℃에서 8시간 이상, 20℃에서는 12시간이상의 습윤조건이 필요하며 잠복기간은 25℃에서 1~2일, 10℃에서는 7일간이다. 따라서 상우가 많지 않더라도 오후에 비가 오고 마르지 않은 상태에서 야간온도가 어느 정도 높을 경우 병 발생에 충분한 조건이 된다. 병 발생 조건이 충족되면 10월초까지도 병이 발생하지만 특별한 경우를 제외하고는 과실의 비대기 이후는 저항성을 지니기 때문에 병 발생은 흔치 않다.
검은점무늬병의 병징은 병원균 침입 후 약 1주일 만에 나타나는데 잎, 가지, 과실에 발병되며 감염 시기나 과실의 상태, 감염 시 기후 조건 등에 따라 매우 다양하게 나타나고 특히 과실에서의 병반 모양은 흑점형, 니괴형, 누반형 3가지가 있다. 병원균이 침입한 식물의 표피세포는 그 침입 부위로부터 6개의 세포층까지 괴사하며 그 속에 딱딱하고 검붉은 고무질과 같은 물질이 박혀있는데 이것이 대표적인 흑점형 반점이 된다. 낙화기 이전에 감염된 부위는 약간 함몰되며 경우에 따라서는 이 함몰이 수확기까지 유지되고 그 부위는 착색이 되어도 푸른색으로 남아 있다가 서서히 착색이 진행된다. 흑점의 크기는 매우 다양하여 낙화기 때 감염된 병반은 상대적으로 그 크기가 크며, 과실이 좀더 자란 상태에서는 상대적으로 작은 병반을 형성하여 흑점의 모양도 뚜렷한 작은 돌기모양이 되고 과실의 비대기가 거의 끝날 단계에 감염된 조직은 병반이 붉은 색을 띠며 상대적으로 흑점모양이 뚜렷하지 않다. 또한 병원균 농도가 높을 경우 검붉은 딱지, 또는 부스럼같은 모양이 되는데 이것이 니괴형 병반이며 물이 흐르는 방향으로 형성된 병반을 누반형이라고 한다.
잎의 경우 5월 초·중순경 잎이 굳어지기 전에 감염되기 시작하여 전형적인 검은 점이 박혀있지만 심할 경우 잎이 황화되고 심하게 뒤틀리며 낙엽이 된다. 줄기의 경우 신초나 녹지에 5월 초·중순경 이후로 감염되기 시작하며 다른 부위와는 다르게 침입 부위에서 균이 살아 있는 경우가 많다.
이러한 검은점무늬병의 방제 방법으로는 우선 죽은 가지 및 전정가지를 제거하는 것이다. 검은점무늬병은 죽은 가지에서 형성된 포자에 의해서 전염되기 때문 에 전염원, 즉 죽은 가지들이 많이 남아 있으면 아무리 농약을 많이 살포하여도 방제가 되지 않는 경우가 많다. 수확이나 전정 시 나무에 남아있는 죽은 가지를 철저히 제거하며, 전정가지들은 과원 주위에 쌓아두지 말고 불태우거나 파쇄하여 전염원을 제거함으로써 병 발생을 줄일 수 있다.
약제 방제는 지역에 따라 차이는 있지만 5월 중순·말경부터 8월 하순 사이에 약 15~20일 간격, 또는 200~250㎜의 누적 강우 시마다 4~5회 약제를 살포한다. 고시된 약제로는 만코지(다이센엠-45)와 디치(델란 수화제), 메치람(썬업 입상수화제), 프로피(안트라콜 수화제)등이 있다(신과수병해충도감, 농촌진흥청 원예연구소, pp 297~301). 하지만 무농약 감귤농가에서 사용할 수 있는 친환경 약제는 현재 전무한 실정이다.
최근에는 미생물 및 각종 추출물 등을 이용한 생물학적 방제방법이 많이 연구되고 있는데, 이러한 방법은 환경오염, 내성유발, 잔류독성 등의 문제를 야기하지 않기 때문에 무농약 감귤 재배농가에서도 사용할 수 있어 매우 바람직한 방제방법으로 여겨지고 있다.
식물병원균을 방제할 수 있는 생물자재로 길항미생물, 식물추출물, 항균성오일 등이 있다. 길항미생물로는 Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus Licheniformis, Paenibacillus polymyxa, Ampelomyces quisqualis, Streptomyce속 등이 있으며, 국내외적으로 많은 연구가 진행되고 있으며, 또한 다양한 종류의 미생물농약이 등록되어 있으나 감귤 검은점무늬병으로 고시되어 있는 미생물농약은 없는 실정이다. 식물추출물로는 소리쟁이, 쇠비름, 홀아비꽃대, 울금 등이 식물병 원균에 살균효과가 있는 것으로 알려져 있으나 아직 효과적인 제품으로 상용화되지는 못하고 있다. 또한 항균성오일은 thyme oil, clove bud oil, rose geranium oil, sassafras oil, castor oil 등이 있으며 살균효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 이 역시 단용으로는 만족스러운 방제가를 나타내지 못하고 있다.
이러한 식물의 성분을 이용하여 개발되어지는 생물농약은 살충제는 많이 상업화되어 있으나, 살균제는 상대적으로 미약하며 종류 또한 다양하지 못한 실정이다. 또한 식물추출물과 그 외의 다른 혼합되는 성분들과의 제제화에 있어 효과를 제대로 발휘할 수 있는 제제화 기술이 부족하여, 화학농약이나 합성 살균제에 비해 그 효과가 미약한 편이다. 뿐만 아니라 농가의 소득을 향상시키고 안정적인 수익성을 확보하기 위해서는 농작물을 친환경적으로 생산할 수 있는 기술을 개발하여야 한다.
감귤에는 검은점무늬병, 창가병, 궤양병 등의 병해와 응애, 진딧물, 깍지벌레, 총채벌레 등의 해충이 큰 피해를 주고 있다. 이 중 해충방제를 위한 친환경방제제는 국내 7~8개사에서 이미 개발되어 판매되고 있으며 그 효과가 매우 우수한 것으로 알려져 있다. 감귤병해의 피해정도는 검은점무늬병이 약 80%, 창가병이 약 5%, 궤양병이 약 10%, 기타병해가 약 5%로 알려져 있으므로 무농약 감귤 생산을 위해서는 검은점무늬병 방제용 생물농약의 개발이 절실히 필요하다. 따라서 본 발명에서는 과수의 병해 중 특히 무농약 감귤 재배에 있어서 가장 피해가 심한 검은점무늬병을 방제할 수 있는 환경친화적 살균제를 개발하여 무농약 감귤을 재배하고자 하는 농가의 고층을 덜어주고자 하였다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 과수 병해 특히 감귤 검은점무늬병에 방제효과가 있는 강력한 길항균을 제공함으로써, 종래 화학 농약으로 야기되는 문제점을 해소하여 내성유발이 없고, 인체에 무해하며, 환경친화적인 미생물 살균제를 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 과수 병해 길항균으로서 본 발명자에 의해 분리된 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P)을 살균 유효성분으로 하는 과수 병해 방제용 미생물 살균제를 제공한다. 본 발명에서 ‘길항균’은 바실러스 서브틸리스가 이용될 수 있으나, 특히 본 발명자들에 의하여 분리되어 기탁된 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P)일 경우 가장 효과적인 방제 능력을 보인다.
본 발명의 목적은 과수에 발생하는 병해에 대한 환경친화적 살균제를 제공하는 것인 만큼, 과수의 종류에 특정하게 한정되는 것은 아니나, 실험을 통해 바람직하게는 감귤 검은점무늬병(Diaporthe citri), 배 검은무늬병(Alternaria kikuchiana), 배 검은별무늬병(Venturia nashicola), 사과 검은별무늬병(Venturia inaequalis), 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 잎곰팡이병(Cladosporium fulvum), 고추 탄저병(Colletotrichum coccodes), 토마토 시들음병(Fusarium oxysporum), 감자 시들음병(Fusarium solani), 고추 역병(Phytophthora capsici), 참외 역병(Phytophthora melonis), 토마토 균핵병(Sclerotinia minor), 벼 키다리병(Fusarium moniliforme), 잔디 탄저병(Colletotrichum caudatum), 잔디 피시움 잎마름병(Pythium sp.), 잔디 갈색퍼짐병(Rhizoctonia solani) 등에 다양하게 적용될 수 있으나, 가장 바람직하게는 감귤 검은점무늬병(Diaporthe citri)에 적용된다.
또한, 본 발명의 과수 병해 방제용 미생물 살균제는 병해에 대한 길항균으로서 상기 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P) 외에도 살균성 식물 추출물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 차나무 또는 울금, 마늘, 소리쟁이, 쇠비름, 참소리쟁이, 측백나무, 할미꽃으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 식물 추출물을 살균 유효성분으로 더 포함하는 것이 바람직하고, 이 중에서 차나무 또는 울금 추출물인 경우 그 살균력 증강에 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 과수 병해 방제용 미생물 살균제는 병해에 대한 길항균으로서 상기 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P) 외에도 살균성이 있는 식물성 오일로서 피마자오일(Castor oil), 클로브 버드(Clove bud), 타임(Thyme) 중에서 선택된 하나 이상으로부터 추출된 식물성 정유를 살균 유효성분으로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 과수 병해 방제용 미생물 살균제는 길항균인 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P)과, 살균성 식물추출물로 차나무 추출물, 살균성 식물정유로서 피마자오일을 모두 포함할 때 가중 우수한 과수 병해 방제효과를 제공할 수 있다.
상기 본 발명의 미생물 살균제는 미생물의 표면 점착력을 증기시키기 위한 부착성증진제, 미생물의 자외선 파괴를 감소시키기 위한 자외선차단제 또는 미생물의 습도 유지를 위한 보습제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어‘다당류’는 식물체에서 추출된 물질로, 액체상, 농축액, 혼합액 또는 고형상, 분말상일 수 있으며, 조추출물(crude extract)을 포함하는 개념으로 사용될 수 있으며, 조추출물을 더욱 정제한 것으로 포함하는 개념이다. 또한 ‘다당류’는 바람직하게는 본 발명자들에 의하여 분리된 ‘차나무(Tea tree; Melaleuca alternifolia)’에서 추출된 추출물을 지칭하는 것으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 식물성 정유는 식물성 오일을 포함하며, 오일은 식물체에서 추출된 정유로 액체상, 농축액 또는 혼합액을 포함하는 개념으로 사용되며, 특히 본 발명에 있어서 바람직하게는 '피마자유'를 포함한다.
본 발명에서 ‘효력증진제’는 유효성분의 부착을 증진시키기 위한 ‘부착성증진제’, 자외선으로부터 길항균 포자를 보호하기 위한 ‘자외선차단제’, 길항균 포자를 보습유지 및 발아촉진을 위한 ‘보습제’를 포함하는 개념이다.
본 발명에서 배합비의 ‘%’는 다른 언급이 없는 한 ‘부피%’를 의미한다.
본 발명에서 유효성분은 ‘길항균’, '살균성 식물 추출물(항균성 다당류)’, ‘식물성 오일(항균성 오일)’로서 3가지 유효성분이 혼합되는 형태의 개념으로 실내효과평가는 검은점무늬병원균(Diaporthe citri)을 대상으로 실시하였고, 포 장에서의 효과평가는 감귤 재배농가에서 방제효과를 측정하였다.
본 발명은 감귤 검은점무늬병에 대한 길항균을 배양하여 길항균배양액과 C1~C4의 저급 알콜 또는 메탄올을 이용하여 차나무추출물(다당류), 피마자추출물(피마자유)을 서로 일정한 비율로 혼합되어 사용될 수 있으며, 각각의 유효성분은 그 혼합비율이 제한되지는 않으나 최적의 살균효과를 위해서는 각각 대등한 비율로 혼합되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 식물의 추출은 C1~C4의 저급 알콜에서 추출하는 것이 바람직하고, 메탄올에서 추출되는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 제한되지 않으나 약 50℃이고, 추출시간은 제한되지 않으나 약 24시간 이상이 바람직하다.
상기 살균제의 적용대상은 감귤 검은점무늬병에 적용하는 것이 바람직하나 과수의 병해에 대한 살균제를 제공하는 만큼, 이에 한정되는 것은 아니며 다른 과수의 곰팡이병해에도 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 3가지 유효성분의 살균효율을 증가시키기 위하여 효력증진제가 더 포함된 살비제를 제공한다.
상기 첨가제는 특별히 제한되지는 않으나, 부착성증진제로 카르복시 메틸 셀룰로즈(Carboxy Methyl Cellulose, CMC), 젤라틴(Gelatin)인 것이 바람직하고, 이 중 젤라틴(Gelatin)이 더욱 바람직하다. 자외선차단제로 2-하이드록시-4-옥틸옥시벤조페논(2-Hydroxy-4-octyloxybenzophenone)와 2-2-하이드록시-5-메틸페닐벤조트리아졸(2-(2-Hydroxy-5-methylphenyl) benzotriazole)인 것이 바람직하고, 이 중 2-하이드록시-4-옥틸옥시벤조페논(2-Hydroxy-4-octyloxybenzophenone)인 것이 더욱 바람직하다. 보습제로 소듐 히아루로네이트(Sodium hyaluronate), 소듐 2-피롤리돈-5-카르복시레이트(Sodium 2-pyrrolidone-5-carboxylate)인 것이 바람직하고, 이 중 소듐 2-피롤리돈-5-카르복시레이트(Sodium 2-pyrrolidone-5-carboxylate)인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 3가지 유효성분을 안정시키기 위하여 물성조정제 및 안정제가 더 포함된 살균제를 제공한다.
상기 물성조정제는 특별히 제한되지는 않으나, 폴리옥시에틸렌 모노올레이트(Polyoxyethylene monooleate), 폴리옥시에틸렌 도데실 모노 에테르(Polyoxyethylene dodecyl mono ether), 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol)-400, 에톡시레이트된 캐스터오일(Castor oil, ethoxylated)에서 선택되는 것이 바람직하다.
상기 안정제는 소듐 벤조에이트(Sodium benzoate), 포타슘 소르베이트(Potassium sorbate), 소듐 프로피오네이트(Sodium propionate)인 것이 바람직하고, 이 중 포타슘 소르베이트(Potassium sorbate)가 더욱 바람직하다.
상기 살균제는 3가지 유효성분과 효력증진제, 물성조정제 및 안정제와 혼합되어 사용되며 전체 살균제에 대하여 유효성분 중 바실러스 서브틸리스 KB-401은 1×109 cfu/㎖ 이상 포함하는 것이 바람직하며, 항균성다당류와 항균성오일은 약 80~86%인 것이 바람직하고, 효력증진제는 0.5 내지 3.5%인 것이 바람직하고, 물정조정제는 2 내지 10%인 것이 바람직하고, 안정제는 소량이라도 상관없다.
본 발명의 유효성분의 함량은 살균제의 제형, 살포방법에 따라 다르게 적용 되는 것이 바람직하다. 본 발명에서의 검은점무늬병에 대한 살균제의 제형은 액상으로 하며 살포방법은 물에 충분히 희석하여 경엽처리할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P), 차나무추출물, 피마자오일을 이용한 살균제는 감귤 검은점무늬병에 대하여 가장 우수한 방제효과를 지니며, 기존 고시된 화학농약과 비교하여 화학농약 대비 90% 이상의 방제효과를 지니고 있어, 감귤 검은점무늬병 방제용 친환경농자재로서 실용성이 충분히 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명의 과수 병해 방제용 미생물 살균제를 더욱 상세히 설명한다. 본 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예를 설명할 뿐, 본 발명의 기술적 사상이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 감귤 검은점무늬병 길항균의 선발
본 발명에서 사용되는 감귤 검은점무늬병의 길항균으로는 바실러스 서브틸리스 KB-401을 사용하였다.
본 발명자들은 국내 토양으로부터 총 254개의 미생물을 분리하여 실내와 포트에서 검은점무늬병균(Diaporthe citri)에 대한 항균력 평가, 감귤나무에 대한 안 전성 평가, 인공배양성 평가, 내구체 형성능 평가 등을 실시한 결과, 최종적으로 효과가 가장 우수한 세균 1종을 선발하여, 바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P)이라 명명하고, 2007년 4월 24일자로 사단법인 한국종균협회(Korean Federation of Culture Collections)에 KFCC 11388P의 수탁번호로 기탁하였다.
바실러스 서브틸리스 KB-401의 주요 균학적인 특성은 다음과 같다.
[NA 배지에서의 특성]
색깔 연한 담황색
균총형태 원형
균총표면 볼록형
균총크기 1.0~3.0㎜
[생리적 특성]
그람반응 양성
내성포자 형성유무 유
세포형태 간형
세포의 활동성유무 유
산소요구성 호기성
혐기적 생장 불가
카탈라아제 생성유무 유
VP 테스트 양성
산화작용 포도당 유
자일로오스 유
만니톨 유
아라비노오스 유
포도당으로터 가스 생성유무 유
가수분해능 카제인 양성
젤라틴 양성
녹말 양성
시트레이트 이용성 유
프로피오네이트 이용성 무
타이로신 분해능 무
질산 환원능 유
인돌 형성능 무
염분요구성 무
7% 염분농도에서의 생장 유
요소 가수분해 무
온도별 생장 최저 15℃
최적 30℃
최고 40℃
[항균 스펙트럼]
병명(병원균) 항균력
배 검은무늬병(Alternaria kikuchiana) +
감귤 검은점무늬병(Diaporthe citri) +++
배 검은별무늬병(Venturia nashicola) +
사과 검은별무늬병(Venturia inaequalis) +
잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea) ++
토마토 잎곰팡이병(Cladosporium fulvum) +
고추 탄저병(Colletotrichum coccodes) ++
토마토 시들음병(Fusarium oxysporum) ++
감자 시들음병(Fusarium solani) ++
고추 역병(Phytophthora capsici) ++
참외 역병(Phytophthora melonis) +
토마토 균핵병(Sclerotinia minor) +
벼 키다리병(Fusarium moniliforme) ++
잔디 탄저병(Colletotrichum caudatum) ++
잔디 피시움 잎마름병(Pythium sp.) +
잔디 갈색퍼짐병(Rhizoctonia solani) +++
※ 항균력 정도(㎜) 0~10 : + , 10~20 : ++ , 20 이상 : +++
본 발명의 길항균인 바실러스 서브틸리스 KB-401은 감귤 검은점무늬병원균의 균사생장 및 포자발아를 현저히 억제시키는 활성을 갖고 있어, 농작물이나 환경에 악영향을 미치지 않고 감귤의 검은점무늬병을 방제할 수 있다.
실시예 2: 길항균 바실러스 서브틸리스 KB-401의 길항균배양액 제조
상기 길항균 바실러스 서브틸리스 KB-401은 M-2배지(표 1)를 이용하여 배양하며 포장생성을 확인하였다. 배양은 30℃, 250ℓ 발효기(Fermenter)에서 150rpm, 1.0~1.5 vol/vol/min, pH6.0~7.0에서 48시간 배양하였으며, 모든 세포가 포자로 변하였는지는 현미경(×400)으로 확인하였다.
M-2 배지 조성
배지 조성 함량(/ℓ)
Glucose 20g
Soybean flour 25g
KH2PO4 1g
K2HPO4 1g
CaCO3 1g
MgSO4·7H2O 0.3g
CuSO4·5H2O 0.01g
MnSO4 0.02g
FeSO4·7H2O 0.02g
ZnSO4·7H2O 0.02g
실험예 1: 바실러스 서브틸리스 KB-401의 항진균 활성 평가
상기에서 배양된 바실러스 서브틸리스 KB-401의 항진균 활성평가를 위하여 다른 종류의 길항균과 함께 감귤 검은점무늬병원균(Diaporthe citri)에 대한 항진균 활성을 평가하였다. 즉, 길항균배양액을 0.45㎛ 여과막에 통과시켜 여과액을 준비하고 페이퍼 디스크(paper disc)방법에 준하여 40㎕/disc를 점적하고 항진균 활성을 평가결과를 하기 표 2에 나타내었다.
길항균배양액의 항진균 활성 평가결과
대상병원균 길항균의 병원균 생육저지활성(생육저지환 직경; ㎜)
KB-401 KB-291 KB-423 KB-525
감귤 검은점무늬병원균
(Diaporthe citri)		 21.8 11.4 7.6 10.3
실시예 3: 48종의 식물체로부터 조추출물 제조
여러 문헌을 통하여 각종 식물병원균에 대해 살균효과가 예상되는 하기 표 3의 식물체 48종을 선별한 후, 이를 각각 200g씩 믹서기에서 곱게 마쇄하여 유리병에 넣은 다음 메탄올 1000㎖를 혼합하여 약 50℃에서 24시간 방치하였다. 24시간 후 여과하고 추출용액을 회전진공감압농축기(EYELA N-1000, 일본)로 농축하였다. 상기 농축물을 다시 메탄올에 혼합하는 과정을 거쳐 메탄올 조추출물을 제조하였다.
식물명 학명 식물명 학명
가락풀나물 Caulophyllum thalictroicdes 오이풀 Sanguisorba officinalis
감국 Chrysanthemum morifolium 용담 Gentiana scabra
개미취 Aster tataricus 울금 Curcuma longa
개암풀 Psoralea corylifolia 인동덩굴 Lonicera japonica
깽깽이풀 Plagiorhegma dubium 은행나무 Ginkgo biloba
꽈리 Physalis franchetii 음나무 Kalopanax pictus
끈끈이주걱 Drosera rotundifolia 이질풀 Geranium nepalense
달래 Allium grayi 장구채 Melandrium firmum
닭의 장풀 Commelina communis 조릿대 Sasamorpha purpurascens
대황 Rheum undulatum 조뱅이 Cephalonopsis segetus
도꼬마리 Xanthium strumarium 제비꽃 Viola mandshurica
마늘 Allium sativum 쥐방울덩굴 Aristolochia contorta
마디풀 Polygonum aviculare 지모 Anemarrhena asphodeloides
매운냉이 Wasabia japonica 질경이 Plantago asiatica
맥문동 Liriope platyphylla 차나무 Melaleuca alternifolia
목향 Inula helenium 참소리쟁이 Rumex crispus
방풍 Saposhnikovia divaricata 측백나무 Thuja orientalis
백선 Dictamnus dasycarpus 한련초 Eclipta prostata
비파나무 Eryobotrya japonica 할미꽃 Pulsatilla koreana
사철쑥 Artemisia capillaris 현삼 Scrophularia oldhami
산초나무 Zanthoxylum piperitum 협죽도 Nerium oleander
소리쟁이 Rumex crispus 형개 Schizonepeta tenuifolia
소태나무 Picrasma ailanthoides 홀아비꽃대 Chloranthus japonicus
쇠비름 Portulaca oleracea 환삼덩굴 Humulus japonicus
실험예 2: 조추출물에 대한 항진균 활성 평가
상기에서 준비한 48종 조추출물의 항진균 활성평가를 위하여 감귤 검은점무늬병원균(Diaporthe citri)에 대한 항진균 활성을 평가하였다. 평가방법은 페이퍼 디스크(paper disc)방법에 준하여 각각의 조추출물을 1000ppm/disc, 500ppm/disc, 100ppm/disc 농도로 점적하여 항진균 활성을 평가하고 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
조추출물의 항진균 활성 평가결과 (생육저지환 직경; ㎜)
조추출물 처리농도(ppm) 조추출물 처리농도(ppm)
1000 500 100 1000 500 100
가락풀나물 10.3 9.5 9.0 오이풀 9.7 9.2 9.0
감국 9.5 9.3 - 용담 9.5 9.1 9.0
개미취 10.0 9.0 울금 19.2 16.5 11.3
개암풀 9.7 9.3 9.0 인동덩굴 10.2 9.5 9.3
깽깽이풀 11.0 10.2 9.4 은행나무 12.4 10.8 10.0
꽈리 10.6 9.7 9.1 음나무 10.2 9.5 9.0
끈끈이주걱 10.9 10.2 9.0 이질풀 9.8 9.3 9.1
달래 9.5 9.1 - 장구채 9.3 - -
닭의 장풀 9.3 9.0 - 조릿대 10.0 9.2 9.0
대황 9.8 9.4 9.0 조뱅이 9.5 9.0 -
도꼬마리 10.8 9.7 9.0 제비꽃 9.6 9.0 -
마늘 13.6 11.3 10.8 쥐방울덩굴 9.3 9.0 -
마디풀 9.0 - - 지모 9.5 9.1 -
매운냉이 9.5 9.0 - 질경이 9.5 9.0 -
맥문동 9.7 9.2 차나무 21.7 17.4 12.8
목향 9.3 - - 참소리쟁이 15.2 13.0 11.2
방풍 9.7 9.1 9.0 측백나무 15.9 13.7 10.6
백선 9.4 9.0 9.0 한련초 11.8 10.5 9.8
비파나무 10.1 9.6 9.1 할미꽃 13.6 10.7 9.4
사철쑥 12.2 10.9 9.2 현삼 10.5 9.5 9.1
산초나무 12.8 11.0 9.8 협죽도 10.7 9.7 9.0
소리쟁이 17.4 14.2 11.0 형개 10.3 9.0 -
소태나무 11.3 10.1 9.4 홀아비꽃대 9.6 9.1 9.0
쇠비름 17.6 14.7 11.5 환삼덩굴 10.2 9.3 9.0
실시예 4: 11종의 식물체로부터 식물정유(항균성 오일) 제조
여러 문헌을 통하여 각종 식물병원균에 대해 살균효과가 알려져 있는 하기 표 5의 식물체로부터 수증기 증류법(steam distillation)을 실시하여 식물정유를 제조하였다.
식물정유명 식물명(학명)
클로브 버드(Clove bud) Eugenia caryophyllata
피마자오일(Castor oil) Ricinus communis L.
애니시드(Aniseed) Pmpinella anisum
타임(Thyme) Thymus vulgaris
유칼립투스 리프(Eucalyptus leaf) Eucalyptus globulus
패출리 리프(Patchouli leaf) Pogostemon cablin
로즈마리 리프(Rosemary leaf) Rosmarinus officinalis
로즈 제라늄(Rose geranium) Pelargonium rosium
페티그레인(Petitgrain) Citrus aurantium amara
시나몬 바크(Cinnamon bark) Cinnamomum cassia
사사프라스(Sassafras) Sassafras albidum
실험예 3: 식물정유에 대한 항진균 활성 평가
상기에서 준비한 11종 식물정유의 항진균 활성평가를 위하여 감귤 검은점무늬병원균(Diaporthe citri)에 대한 항진균 활성을 평가하였다. 평가방법은 페이퍼 디스크(paper disc)방법에 준하여 각각의 식물정유를 1000ppm/disc, 500ppm/disc, 100ppm/disc 농도로 점적하여 항진균 활성을 평가하고 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
식물정유의 항진균 활성 평가결과 (생육저지환 직경; ㎜)
식물정유명 처리농도(ppm)
1000 500 100
클로브 버드(Clove bud) 19.3 16.5 12.4
피마자오일(Castor oil) 20.9 17.5 13.1
애니시드(Aniseed) 14.6 12.3 10.2
타임(Thyme) 18.7 16.4 12.8
유칼립투스 리프(Eucalyptus leaf) 13.9 11.7 10.6
패출리 리프(Patchouli leaf) 10.8 10.3 9.5
로즈마리 리프(Rosemary leaf) 11.2 9.9 9.3
로즈 제라늄(Rose geranium) 13.6 11.0 9.8
페티그레인(Petitgrain) 14.2 11.8 10.4
시나몬 바크(Cinnamon bark) 14.0 11.6 10.5
사사프라스(Sassafras) 15.7 13.0 10.6
실험예 4: 3가지 유효성분 혼합에 따른 항진균 활성 평가
상기에서 선발된 3가지 유효성분(바실러스 서브틸리스 KB-401, 차나무추출물, 피마자오일)의 살균효과를 보다 효율적으로 증진시키기 위해 각각의 유효성분을 단독으로 사용하는 것과 3가지 유효성분을 일정비율로 혼합하여 사용하는 경우 감귤 검은점무늬병원균에 대한 항진균 활성을 평가하였다. 길항균배양액은 바실러스 서브틸리스 KB-401을 배양하여 포자밀도가 1×109 cfu/㎖ 이상 되도록 첨가하였고, 차나무추출물과 피마자오일은 동일한 비율로 혼합하였다.
3가지 유효성분 혼합에 따른 항진균 활성 비교 (생육저지환 직경; ㎜)
유효성분 처리농도(ppm)
1000 500 100
길항균배양액 21.8 17.5 12.6
차나무추출물 21.7 17.4 12.8
피마자오일 20.9 17.5 13.1
길항균배양액+차나무추출물 23.2 19.1 13.8
길항균배양액+피마자오일 22.9 18.3 14.2
차나무추출물+피마자오일 22.7 18.5 14.0
길항균배양액+차나무추출물+피마자오일 25.4 20.2 16.5
실시예 5: 효력증진제가 더 포함된 살균제 제조
상기 표 7에서 선발된 3가지 유효성분의 살균효과를 증진하기 위한 효력증진제로 부착성증진제, 자외선차단제, 보습제를 첨가하였다.
부착성증진제는 Avicel, CMC, Xanthan Gum, Rosin, Glycerol, Gelatin 등의 점질성 물질을 이용하여 원하는 부위에 적정밀도의 미생물이 확보될 수 있도록 하였다. 각각의 물질을 농도별로 희석액을 제조한 다음 3가지 유효성분과 혼합하고 제품에 대한 물성 및 안정성을 비교한 결과 Gelatin 0.5%에서 물성 및 안정성이 우수한 것으로 나타났다.
자외선차단제는 화장품 및 산업용으로 사용되고 있는 여러 종류의 자외선차단제를 이용하여 유효미생물을 자외선으로부터 효과적으로 차단할 수 있도록 하였다. 후보물질로는 Octyl p-methoxycinnamate, 2-(2-Hydroxy-5-methylphenyl)benzotriazole, 2,4-Dihydroxybenzophenone, Bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)sebacate, Phenyl salicylate, 2-Hydroxy-4-octyloxybenzophenone 등을 이용하였다. 각각의 자외선차단제를 농도별로 처리하여 길항균 포자액과 혼합한 뒤 자외선 차단효과를 비교한 결과 2-Hydroxy-4-octyloxybenzophenone 2.5%이상에서 자외선 차단효과가 뛰어나며 길항균 포자의 발아에도 효과적인 것으로 나타났다.
보습제는 화장품에서 사용되고 있는 독성이 없는 다양한 보습제를 이용하여 목적부위에서 적정한 습도를 유지하며 유효미생물의 포자가 발아될 수 있도록 하였다. 후보물질로는 히아루로닉산(Hyaluronic acid), 소듐 히아루로네이트(Sodium hyaluronate), 소듐 2-피롤리돈-5-카르복시레이트(Sodium 2-pyrrolidone-5-carboxylate), 글리세릴 디말토덱스트린(Glyceryl dimaltodextrin), 포타슘 셀룰로오스 수키네이트(Pottasium cellulose succinate) 등을 이용하였다. 각각의 보습제를 농도별로 처리하여 길항균 포자액과 혼합한 뒤 보습능력을 확인해본 결과 소듐 2-피롤리돈-5-카르복시레이트(Sodium 2-pyrrolidone-5-carboxylate) 0.5%이상에서 포자 발아효과 및 보습능력이 우수한 것으로 나타났다.
실시예 6: 물성조정제 및 안정제가 더 포함된 살비제 제조(제제화용 첨가제 선발)
본 발명의 3가지 유효성분 및 효력증진제의 제제화를 위해서는 유효성분의 안정성 및 보존 안정성이 요구된다.
따라서, 실시예 5에서 선발된 효력증진제와 3가지 유효성분의 혼합물에 물성조정제 및 안정제로서 다양한 비이온 계면활성제를 농도별로 혼합하여 물성변화를 관찰하고 제제화용 첨가제를 선발하였다.
그 결과 물성조정제로서 폴리옥시에틸렌 모노올레이트(Polyoxyethylene monooleate) 2%, 폴리옥시에틸렌 도데실 모노 에테르(Polyoxyethylene dodecyl mono ether) 3%, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol)-400 3%, 에톡시레이트된 캐스터오일(Castor oil, ethoxylated) 2% 이상 혼합하였을 경우 유효성분의 침전, 층분리 등이 없는 것으로 나타났다.
안정제로는 소듐 벤조에이트(Sodium benzoate), 포타슘 소르베이트(Potassium sorbate), 소듐 프로피오네이트(Sodium propionate)를 농도별로 처리한 결과 포타슘 소르베이트(Potassium sorbate) 0.5%를 혼합하였을 때 물성의 변화없이 안정적인 물성을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 7: 최종배합에 따른 살균제 제조
상기에서 선발된 3가지 유효성분과 효력증진제, 물성조정제, 안정제를 이용하여 최종배합에 따른 살균제를 제조하였다. 유효성분인 바실러스 서브틸리스 Kb-401은 1×109 cfu/㎖ 되도록 첨가하였고, 항균성다당류인 차나무추출물은 40%, 항균성 oil인 피마자오일은 40%를 혼합하였다. 효력증진제로 부착성증진제는 Gelatin 0.5%, 자외선차단제는 2-Hydroxy-4-octyloxybenzophenone 2.5%, 보습제는 소듐 2-피롤리돈-5-카르복시레이트(Sodium 2-pyrrolidone-5-carboxylate) 0.5%를 혼합하였다. 물성조정제는 폴리옥시에틸렌 모노올레이트(Polyoxyethylene monooleate) 2%, 폴리옥시에틸렌 도데실 모노 에테르(Polyoxyethylene dodecyl mono ether) 3%, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol)-400 3%, 에톡시레이트된 캐스터오일(Castor oil, ethoxylated) 2%를 혼합하였고, 안정제는 포타슘 소르베이트(Potassium sorbate) 0.5%를 혼합하여 살균제를 제조하였다.
본 발명의 살균제의 포장에서의 살균효과 시험
실험예 5: 서귀포시 강정동 포장시험
실시예 7에서 제조된 살균제를 제주도 서귀포시 강정동 포장에서 감귤 검은점무늬병에 대한 살균효과를 시험하였다. 포장에서의 살균효과 검정은 발병초 14일 간격으로 500배, 1000배 희석하여 4회 경엽처리 하였으며, 대조구로는 디티아논 수화제(dithianon, 1000배)와 비교하였다. 포장관리는 농가 일반 경종법에 준하였고, 시험구는 2주 3반복구를 두고 실시하였으며, 조사방법은 시험구당 전체 과에 대한 발병도를 조사하였다.
시험약제 발 병 도 (%) 유의성
(DMRT)		 방제가
(%)
1반복 2반복 3반복 평균
실시예 7 (500배) 3.7 5.2 3.9 4.3 b 84.5
실시예 7 (1000배) 4.9 6.6 6.4 6.0 b 78.4
디티아논 수화제 (1000배) 1.7 2.3 3.2 2.4 b 91.4
무처리 23.8 29.5 30.2 27.8 a -
CV(%) ----------------------------------------- 18.8 %
상기 표 8에서 보는 바와 같이 실시예 7의 500배에서 84.5%의 방제효과를 보이고 있으며, 1000배에서는 78.4%의 방제효과를 나타내고 있다. 대조약제인 디티아논 수화제와 비교하여 500배에서 6.9%정도 미약하게 나타나지만, 친환경농자재로서 실용성이 있는 방제효과를 보였다.
실험예 6: 서귀포시 남원읍 신례리 포장시험
실시예 7에서 제조된 살균제를 제주도 서귀포시 남원읍 신례리 포장에서 감귤 검은점무늬병에 대한 살균효과를 시험하였다. 포장에서의 살균효과 검정은 발병초 14일 간격으로 500배, 1000배 희석하여 4회 경엽처리 하였으며, 대조구로는 디티아논 수화제(dithianon, 1000배)와 비교하였다. 포장관리는 농가 일반 경종법에 준하였고, 시험구는 2주 3반복구를 두고 실시하였으며, 조사방법은 시험구당 전체 과에 대한 발병도를 조사하였다.
시험약제 발 병 도 (%) 유의성
(DMRT)		 방제가
(%)
1반복 2반복 3반복 평균
실시예 7 (500배) 4.5 3.5 3.1 3.7 b 84.8
실시예 7 (1000배) 6.4 4.8 4.2 5.1 b 79.1
디티아논 수화제 (1000배) 2.3 1.2 1.3 1.6 b 93.4
무처리 26.1 19.6 27.5 24.4 a -
CV(%) ----------------------------------------- 25.6 %
상기 표 9에서 보는 바와 같이 실시예 7의 500배에서 84.8%의 방제효과를 보이고 있으며, 1000배에서는 79.1%의 방제효과를 나타내고 있다. 대조약제인 디티아논 수화제와 비교하여 500배에서 8.6%정도 미약하게 나타나지만, 친환경농자재로서 실용성이 있는 방제효과를 보였다.
실험예 7 : 서귀포시 남원읍 남원리 포장시험
실시예 7에서 제조된 살균제를 제주도 서귀포시 남원읍 남원리 포장에서 감귤 검은점무늬병에 대한 살균효과를 시험하였다. 포장에서의 살균효과 검정은 발병초 14일 간격으로 500배, 1000배 희석하여 4회 경엽처리 하였으며, 대조구로는 디티아논 수화제(dithianon, 1000배)와 비교하였다. 포장관리는 농가 일반 경종법에 준하였고, 시험구는 2주 3반복구를 두고 실시하였으며, 조사방법은 시험구당 전체 과에 대한 발병도를 조사하였다.
시험약제 발 병 도 (%) 유의성
(DMRT)		 방제가
(%)
1반복 2반복 3반복 평균
실시예 7 (500배) 3.1 4.5 4.0 3.9 b 85.5
실시예 7 (1000배) 5.3 5.7 6.2 5.7 b 78.8
디티아논 수화제 (1000배) 1.4 1.8 2.5 1.9 b 92.9
무처리 20.8 29.2 30.7 26.9 a -
CV(%) ----------------------------------------- 28.3 %
상기 표 10에서 보는 바와 같이 실시예 7의 500배에서 85.5%의 방제효과를 보이고 있으며, 1000배에서는 78.8%의 방제효과를 나타내고 있다. 대조약제인 디티아논 수화제와 비교하여 500배에서 7.4%정도 미약하게 나타나지만, 친환경농자재로서 실용성이 있는 방제효과를 보였다.
도 1은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KB-401의 시간에 따른 포자생성율을 나타낸 그래프이다.

Claims (9)

  1. 과수 병해 길항균을 이용한 미생물 살균제에 있어서,
    바실러스 서브틸리스 KB-401(Bacillus subtilis KB-401, KFCC 11388P)을 살균 유효성분으로 하는 과수 병해 방제용 미생물 살균제.
  2. 제1항에 있어서, 과수 병해는 감귤 검은점무늬병(Diaporthe citri)인 것을 특징으로 하는 과수 병해 방제용 미생물 살균제.
  3. 제1항에 있어서, 과수 병해는 배 검은무늬병(Alternaria kikuchiana), 배 검은별무늬병(Venturia nashicola), 사과 검은별무늬병(Venturia inaequalis), 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 잎곰팡이병(Cladosporium fulvum), 고추 탄저병(Colletotrichum coccodes), 토마토 시들음병(Fusarium oxysporum), 감자 시들음병(Fusarium solani), 고추 역병(Phytophthora capsici), 참외 역병(Phytophthora melonis), 토마토 균핵병(Sclerotinia minor), 벼 키다리병(Fusarium moniliforme), 잔디 탄저병(Colletotrichum caudatum), 잔디 피시움 잎마름병(Pythium sp.), 잔디 갈색퍼짐병(Rhizoctonia solani) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 과수 병해 방제용 미생물 살균제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 차나무 추출물 또는 울금 추출물을 살균 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 과수 병해 방제용 미생물 살균제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 마늘, 소리쟁이, 쇠비름, 참소리쟁이, 측백나무, 할미꽃으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 식물 추출물을 살균 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 과수 병해 방제용 미생물 살균제.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피마자오일(Castor oil), 클로브 버드(Clove bud), 타임(Thyme) 중에서 선택된 하나 이상으로부터 추출된 식물성 정유를 살균 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 과수 병해 방제용 미생물 살균제.
  7. 제4항에 있어서, 피마자오일(Castor oil), 클로브 버드(Clove bud), 타 임(Thyme) 중에서 선택된 하나 이상으로부터 추출된 식물성 정유를 살균 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 과수 병해 방제용 미생물 살균제.
  8. 제5항에 있어서, 피마자오일(Castor oil), 클로브 버드(Clove bud), 타임(Thyme) 중에서 선택된 하나 이상으로부터 추출된 식물성 정유를 살균 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 과수 병해 방제용 미생물 살균제.
  9. 제1항 내지 제3중 어느 한 항에 있어서, 미생물의 표면 점착력을 증기시키기 위한 부착성증진제, 미생물의 자외선 파괴를 감소시키기 위한 자외선차단제 또는 미생물의 습도 유지를 위한 보습제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 과수 병해 방제용 미생물 살균제.
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