KR20100059840A - 열처리에 의한 인자 ｖｉｉ 폴리펩티드 조성물 중의 다이머 함량의 감소 방법 - Google Patents

열처리에 의한 인자 ｖｉｉ 폴리펩티드 조성물 중의 다이머 함량의 감소 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 열처리에 의한 인자 VII 폴리펩티드 조성물 중의 다이머 함량을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

Description

열처리에 의한 인자 ＶＩＩ 폴리펩티드 조성물 중의 다이머 함량의 감소 방법{REDUCTION OF DIMER CONTENT IN FACTOR VII POLYPEPTIDE COMPOSITIONS BY HEAT TREATMENT}
본 발명은 인자 VII 폴리펩티드 조성물, 특히 인자 VII 변이체를 포함하는 조성물 중의 다이머 함량을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
응고 연쇄 단계(clotting cascade)에서 수반되는 인자 VII는 다양한 병적 상태를 치료하기 위한 유용한 치료제인 것으로 입증되었다. 따라서, 균일한 정해진 임상 효능을 나타내는 약학적으로 허용되는 활성화된 인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 조제물에 대한 필요가 증가하고 있다.
인자 VII 폴리펩티드의 상업적 제조의 동안에, 관심있는 폴리펩티드의 다이머 및 올리고머와 같은 응집물의 형성을 피하는 것은 도전이다. 이러한 생성물 관련 불순물은 원하지 않는 것인데 그것들의 잠재적인 항원성 때문이다. 전형적으로, 극단값의 pH와 고온은 생성 중에 응집물/다이머의 형성을 제어하기 위해 피하게 된다.
WO 2007/026020 A1은 인자 VII 또는 인자 VIIa 자동 분해 생성물의 동시 형성을 최소화하면서, 제조 부산물의 인자 VII 또는 인자 VIIa 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 정제하는 방법에 관련된다.
따라서, 인자 VII 폴리펩티드의 제조와 관련하여, 수율의 상당한 손실 없이 인자 VII 폴리펩티드의 다이머(고급 올리고머 포함)의 존재를 감소시키는 제조 공정에 대한 필요가 있다. 이것은 더 안전하고 더 안정한 약물을 가져오고 궁극적으로 더 안전하고 더 안정한 약품을 가져올 것이다.
본 발명은 다이머 (및 고급 올리고머) 함량을 감소시키기 위해 열처리 공정을 적용함으로써 상기한 문제를 해결하였다.
구체적으로, 본 발명은 인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 조성물 중의 다이머 함량을 감소시키는 방법을 제공하며, 이 방법은:
(a) 필요하다면, 상기 조성물의 pH를 4.5-10.0 (5℃에서 측정했을 때)의 범위의 값으로 조절하는 단계;
(b) 조성물을 적어도 5분의 기간동안 20-50℃ 범위의 온도로 가열하는 단계; 그리고
(c) 이어서 조성물을 10℃ 이하의 온도로 냉각하는 단계를 포함한다.
도 1은 37℃에서 120분간 열처리된 V158D/E296V/M298Q-FVII 조성물에서 다이머 함량의 전개를 예시한다. 스케일: 시간 단위는 분.
도 2는 48시간동안 23℃ 또는 37℃에서 가열되거나, 아니면 5-8℃에서 보관된(대조군), 다른 조건은 동일한 세가지 V158D/E296V/M298Q-FVII 조성물 샘플에서 다이머 함량의 전개를 예시한다. 스케일: 시간 단위는 시간.
도 3은 여기 기술된 본 발명의 완결 후 남아있는 HMWP (폴리머 및 올리고머), 모노머 및 염의 양을 예시한다.
도 4는 pH를 9.5로 조절한 후 37℃에서 168시간 동안 열처리한 V158D/E296V/M298Q-FVII 조성물 샘플에서 다이머 함량의 전개를 예시한다. 스케일: 시간 단위는 시간.
상기한 바와 같이, 본 발명은 인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 조성물 중의 다이머 함량을 감소시키는 방법에 관련된다. 가열, pH 변화, 크로마토그라피 재료와의 접촉, 등을 포함하는 조성물의 추가 조작들이 다이머의 재형성을 야기할 수도 있다는 점에서 본 방법은 인자 VII 폴리펩티드의 전체 제조 방법의 최종 단계에서 적용되는 것이 유리하다.
방법은 다음 단계들을 포함하며, 그 중 단계 (a)는 선택적 공정이다:
(a) 필요하다면, 상기 조성물의 pH를 4.5-10.0 (5℃에서 측정했을 때)의 범위의 값으로 조절하는 단계;
(b) 조성물을 적어도 5분의 기간동안 20-50℃ 범위의 온도로 가열하는 단계; 그리고
(c) 이어서 조성물을 10℃ 이하의 온도로 냉각하는 단계.
인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 조성물
여기서 사용한 바, "조성물"이라는 표현은 액체 조성물, 바람직하게는 수성 액체 조성물, 즉 5 % 미만의 비수성 용매를 포함하는 조성물을 의미하는 것을 의도한다. 본 방법에서 사용할 조성물은 인자 VII 폴리펩티드와 또한 다이머 형태의 어떠한 불순물을 포함한다.
용어 "다이머"는 어떠한 인자 VII 폴리펩티드의 진정한 다이머 뿐만 아니라 고급 올리고머 및 응집물(예를 들면, 트리머, 테트라머 등)을 포함하는 것을 의도한다. 어떤 인자 VII 폴리펩티드 변이체는 야생형 인자 VII와 비교하여 증가된 다이머 형성 경향을 갖는 것으로 관찰되었다. 증가된 다이머 형성은 인자 VII 폴리펩티드 변이체가 야생형 인자 VII와 다른 구조, 그리고 결과적으로 다른 성질을 갖는다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 이러한 다른 성질의 예는 그것들이 펼쳐지는 온도, 즉 그것들의 융점이다. 인자 VII 폴리펩티드가 펼쳐질 때, 그것들의 표면은 더 소수성이 되고 그것들은 따라서 다른 펼쳐진 소수성 인자 VII 폴리펩티드와 상호작용하여 이로써 다이머를 형성하는 경향이 있다. 이런 이유로, 본 발명은, 오로지는 아니지만, 특히 이러한 인자 VII 폴리펩티드 변이체의 조성물에 적용가능한 것으로 생각될 수 있다.
본 발명의 방법은 비교적 높은 함량의 다이머를 갖는 조성물, 즉, 미처리 조성물 중(즉, 단계 (b) 전의) 다이머의 함량이 적어도 3%, 예를 들면 적어도 4 %, 예를 들면 적어도 5 %, 예를 들면 적어도 6 %, 예를 들면 적어도 8 %, 또는 적어도 10 %도 되는 조성물에 특히 유용하다.
용어 "인자 VII 폴리펩티드"는 이하에서 더 상세히 기술된다. 예비 관찰을 토대로, 본 발명은 인자 VII 변이체와 같은 비천연 형태의 인자 VII에 특히 적합한데, 이 그룹 안의 폴리펩티드들이 다이머를 형성하는 경향이 높기 때문인 것으로 생각된다. 따라서 한 구체예에서, 본 발명에 따르는 방법에서 사용된 인자 VII 폴리펩티드는 비-야생형 사람 인자 VIIa, 예를 들면 인자 VII 변이체이다.
조성물 중 인자 VIIa 농도는 편리하게는 mg/mL로서 또는 IU/mL로서 표시되고, 1 mg은 보통 43,000-56,000 IU 이상을 나타낸다. 조성물 중 인자 VII 폴리펩티드 농도는 전형적으로 0.01 mg/mL, 또는 적어도 0.1 mg/mL이다. 다른 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 0.1-90 mg/mL; 0.5-80 mg/mL; 1.0-80 mg/mL; 1.5-70 mg/mL; 2-60 mg/mL; 3-50 mg/mL; 또는 5-50 mg/mL의 농도로 조성물에 존재한다.
조성물은 단계 (a) 전에, 그리고 구체적으로 단계 (a)의 적용에 이어서, pH를 명시된 범위 내로, 즉 4.5-10.0 이내로 유지할 수 있는 완충제(단일 완충제 또는 완충제 조합으로 이해됨)를 포함할 수도 있다.
한 구체예에서, 완충제는 MES, PIPES, ACES, BES, TES, HEPES, TRIS, 히스티딘, 이미다졸, 글리신, 글리실글리신, 글리신아미드, 인산, 아세트산(예를 들면 아세트산 나트륨 또는 칼슘), 락트산, 글루타르산, 시트르산, 타르타르산, 말산, 말레산, 및 숙신산의 산 및 염으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 한가지 성분이다. 완충제는 두가지 이상 성분의 혼합물을 포함할 수도 있고, 혼합물은 명시된 범위의 pH 값을 제공할 수 있음을 이해하여야 한다. 예로서 아세트산 및 아세트산 나트륨, 등을 언급할 수 있다.
완충제의 농도는 조성물의 바람직한 pH를 유지하도록 선택된다. 여러가지 구체예에서, 완충제의 농도는 1-100 mM; 1-50 mM; 1-25 mM; 또는 2-20 mM이다.
인자 VII 폴리펩티드는 pH가 올라감에 따라 자동활성화 및 분해(degradation)가 쉽다는 것이 관찰되었다. 반면에, 인자 VII 폴리펩티드는 pH가 감소함에 따라 더욱 다이머로 되고 응집되기 쉽다. 인자 VII 폴리펩티드 조성물의 pH 범위는 이들 두 pH-관련 문제를 해결하는 최상의 타협점을 찾도록 선택된다. 이러한 pH 범위는 화학적 및 따라서 구조적 특성이 서로 다른, 다른 인자 VII 폴리펩티드 간에 다를 것으로 예상될 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 조성물의 pH는 4.5-10의 범위로, 예를 들면 5-10의 범위로; 예를 들면 9-10의 범위로 유지된다. 본 발명의 또 다른 구체에에서, 조성물의 pH는 4.5-9.5의 범위로; 예를 들면 4.5-8.5의 범위로; 예를 들면 4.5-7.5의 범위로; 예를 들면 4.5-6.5의 범위로; 예를 들면 4.5-6.0의 범위로; 예를 들면 5.0-6.5의 범위로; 예를 들면 5.0-6.0의 범위로; 예를 들면 5.2 내지 약 5.9의 범위로 유지된다.
pH 값을 언급할 때, 대략 5℃에서 측정된 값이 적용가능하다.
조성물은 바람직하게는 열처리(단계 (b))의 적용 전에 10℃ 이하, 특히 5℃이하의 온도에서 유지된다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 염화칼슘 또는 아세트산칼슘과 같은 칼슘 또는 마그네슘 염을 포함한다. 칼슘 이온은 인자 VII 폴리펩티드에 결합하며, 인자 VII 폴리펩티드, 특히 그것의 Gla 도메인이 자동 단백질 분해로부터 보호되도록 인자 VII 폴리펩티드의 Gla 도메인의 올바른 접힘에 필요하다. 마그네슘 이온은 칼슘 이온과 같은 방식으로 인자 VII 폴리펩티드를 보호할 수 있을 것으로 예상된다.
조성물은 또한 더 이상의 구성요소, 예를 들면, 용액의 오스몰랄 농도에 기여하는 등장성 개질제를 또한 포함할 수도 있다. 이러한 등장성 개질제는 전형적으로 중성염, 아미노산, 2-5개 아미노산 잔기의 펩티드, 단당류, 이당류, 다당류, 및 당 알콜로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 한가지 개질제를 포함한다. 어떤 바람직한 구체예에서는, 조성물은 이러한 개질제를 두가지 이상 조합하여 포함한다. "중성염(neutral salt)"은 수용액에 용해될 때 산도 아니고 염기도 아닌 염을 의미한다.
한 구체예에서, 적어도 하나의 등장성 개질제는 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 그리고 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 아세트산칼슘, 글루콘산칼슘, 레뷰린산칼슘, 염화마그네슘, 아세트산마그네슘, 글루콘산마그네슘, 레뷰린산마그네슘과 같은 마그네슘염으로 구성되는 군으로부터 선택된 중성염이다.
한 바람직한 구체예에서, 등장성 개질제는 염화칼슘, 아세트산칼슘, 염화마그네슘 및 아세트산마그네슘으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 한가지와 조합하여 염화나트륨을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 등장성 개질제는 염화나트륨, 염화칼슘, 수크로스, 글루코스, 및 만니톨로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 한가지이다.
전형적으로, 등장성 개질제는 적어도 1 mM, 적어도 5 mM, 적어도 10 mM, 적어도 20 mM, 적어도 50 mM, 적어도 100 mM, 적어도 200 mM, 적어도 400 mM, 적어도 800 mM, 적어도 1000 mM, 적어도 1200 mM, 적어도 1500 mM, 적어도 1800 mM, 적어도 2000 mM, 또는 적어도 2200 mM의 농도로 존재한다.
한 일련의 구체예에서, 등장성 개질제는 5-2200 mM, 예를 들면 25-2200 mM, 50-2200 mM, 100-2200 mM, 200-2200 mM, 400-2200 mM, 600-2200 mM, 800-2200 mM, 1000-2200 mM, 1200-2200 mM, 1400-2200 mM, 1600-2200 mM, 1800-2200 mM, 또는 2000-2200 mM; 5-1800 mM, 25-1800 mM, 50-1800 mM, 100-1800 mM, 200-1800 mM, 400-1800 mM, 600-1800 mM, 800-1800 mM, 1000-1800 mM, 1200-1800 mM, 1400-1800 mM, 1600-1800 mM; 5-1500 mM, 25-1400 mM, 50-1500 mM, 100-1500 mM, 200-1500 mM, 400-1500 mM, 600-1500 mM, 800-1500 mM, 1000-1500 mM, 1200-1500 mM; 5-1200 mM, 25-1200 mM, 50-1200 mM, 100-1200 mM, 200-1200 mM, 400-1200 mM, 600-1200 mM, 또는 800-1200 mM의 농도로 존재한다.
종종, 인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 선행하는 정제 단계로부터 얻어진다. 구체적인 관련 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그라피 단계가 단계 (a)에 선행한다. 고 농도의 인자 VII 폴리펩티드 다이머는 이 음이온 교환 단계의 동안에 생성된다. 그러므로, 이 단계를 pH 조절, 가열 및 냉각 단계 전에 하는 것이 특히 유용한데 이들 단계는 함께 나머지 다이머의 수를 감소시킨다.
인자 VII 폴리펩티드
여기서 사용한 바, 용어 "인자 VII 폴리펩티드" 또는 "FVII 폴리펩티드"는 야생형 사람 인자 VIIa의 아미노산 서열 1-406을 포함하는 어떤 단백질(즉, 미국 특허 No. 4,784,950에 개시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드), 그의 변이체, 또한 인자 VII-관련 폴리펩티드, 인자 VII 유도체 및 인자 VII 콘주게이트를 의미한다. 이것은 야생형 사람 인자 VIIa에 비하여 실질적으로 같거나 또는 개선된 생물학적 활성을 나타내는 인자 VII 변이체, 인자 VII 유도체 및 인자 VII 콘주게이트를 포함한다.
용어 "인자 VII"는 미절단(치모겐) 형태의 인자 VII 폴리펩티드, 또한 단백질 분해 처리되어 각각의 생체활성 형태를 수득한 것들을 포함하는 것으로 의도되며, 이것은 인자 VIIa로 칭해지기도 한다. 전형적으로, 인자 VII는 잔기 152와 153 사이에서 절단되어 인자 VIIa, 즉 인자 VII의 활성화된 형태를 수득한다. 이러한 인자 VII의 변이체는 안정성, 인지질 결합, 변경된 특이적 활성, 등을 포함하는, 사람 인자 VII에 관한 다른 성질들을 나타낼 수도 있다.
상기 정의 내의 "인자 VII" 또는 "인자 VIIa"는 또한 개체 별로 존재하고 일어날 수 있는 천연 대립 유전자 변이를 포함한다. 또한, 글리코실화 또는 다른 번역후 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 성질에 따라 달라질 수 있다.
여기서 사용된 바, "야생형 사람 FVIIa"는 미국 특허 No. 4,784,950에 개시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
여기서 사용된 바, "인자 VII-관련 폴리펩티드"는 야생형 인자 VIIa의 활성에 비하여, 인자 VIIa 생물학적 활성이 실질적으로 변형된, 예를 들어서 감소된, 변이체를 포함한 폴리펩티드들을 포함한다. 이들 폴리펩티드는 제한없이, 폴리펩티드의 생체활성을 변형 또는 붕괴하는 특정 아미노산 서열 변경이 도입된, 인자 VII 또는 인자 VIIa를 포함한다.
여기서 사용된 바, 용어 "인자 VII 유도체"는 모 펩티드의 하나 이상의 아미노산이 예를 들어서, 알킬화, 글리코실화, 페길화(PEGylation), 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등에 의해 유전학적으로 및/또는 화학적으로 및/또는 효소학적으로 변형된, 야생형 인자 VIIa에 비하여 실질적으로 같거나 또는 개선된 생물학적 활성을 나타내는 FVII 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 의도된다. 이것은 페길화 사람 인자 VIIa, 시스테인-페길화 사람 인자 VIIa 및 그것의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인자 VII 유도체의 비제한적 예는 WO 03/31464 및 미국 특허 출원 US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557, US 20040132640, WO2007022512, 및 US 20070105755 (Neose Technologies, Inc.)에 개시된 것과 같은 글리코페길화 FVII 유도체; WO 01/04287, 미국 특허 출원 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) 및 WO 02/02764, 미국 특허 출원 20030211094 (University of Minnesota)에 개시된 것과 같은 FVII 콘주게이트를 포함한다.
용어 "개선된 생물학적 활성"은 i) 재조합 야생형 사람 인자 VIIa와 비교하여 실질적으로 같거나 또는 증가된 단백질 분해 활성을 갖는 FVII 폴리펩티드 또는 ii) 재조합 야생형 사람 인자 VIIa와 비교하여 실질적으로 같거나 또는 증가된 TF 결합 활성을 갖는 FVII 폴리펩티드 또는 iii) 재조합 야생형 사람 인자 VIIa와 비교하여 실질적으로 같거나 또는 증가된 혈장 중 반감기를 갖는 FVII 폴리펩티드를 말한다.
용어 "페길화 사람 인자 VIIa"는 사람 인자 VIIa 폴리펩티드에 콘주게이트된 PEG 분자를 갖는 사람 인자 VIIa를 의미한다. PEG 분자는 인자 VIIa 폴리펩티드의 어떤 아미노산 잔기 또는 탄수화물 부분을 포함하는 인자 VIIa 폴리펩티드의 어떤 부분에도 부착될 수 있음을 이해하여야 한다.
용어 "시스테인-페길화 사람 인자 VIIa"는 사람 인자 VIIa에 도입된 시스테인의 술프히드릴 기에 결합된 PEG 분자를 갖는 인자 VIIa를 의미한다.
여기서 사용된 용어 "인자 VII 변이체"는 야생형 인자 VII에 비하여 실질적으로 같거나 또는 더 양호한 생체활성을 나타내거나, 또는 다르게는, 야생형 인자 VII와 비교하여 실질적으로 변형된 또는 감소된 생체활성을 나타내는 FVII 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 의도되고, 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환에 의해 야생형 인자 VII 서열과 다른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
재조합 야생형 사람 인자 VIIa와 비교하여 실질적으로 같거나 또는 증가된 단백질 분해 활성을 갖는 인자 VII 변이체의 비제한적 예들은 S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); 미국 특허 No. 5,580,560에 개시된 것과 같은 증가된 단백질 분해 활성을 나타내는 FVIIa 변이체; 잔기 290과 291 사이 또는 잔기 315와 316 사이에서 단백질 분해 절단된 인자 VIIa(Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48: 501-505, 1995); 인자 VIIa의 산화된 형태(Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); PCT/DK02/00189 (WO 02/077218에 해당)에 개시된 것과 같은 FVII 변이체; 그리고 WO 02/38162 (Scripps Research Institute)에 개시된 것과 같은 증가된 단백질 분해 활성을 나타내는 FVII 변이체; WO 99/20767, 미국 특허 US 6017882 및 US 6747003, 미국 특허 출원 20030100506 (University of Minnesota) 및 WO 00/66753, 미국 특허 출원 US 20010018414, US 2004220106, 및 US 200131005, 미국 특허 US 6762286 및 US 6693075 (University of Minnesota)에 개시된 것과 같은, 변형된 Gla-도메인을 가지며 향상된 멤브레인 결합을 나타내는 FVII 변이체; 그리고 WO 01/58935, 미국 특허 US 6806063, 미국 특허 출원 20030096338 (Maxygen ApS), WO 03/93465 (Maxygen ApS), WO 04/029091 (Maxygen ApS), WO 04/083361 (Maxygen ApS), 및 WO 04/111242 (Maxygen ApS), 또한 WO 04/108763 (Canadian Blood Services)에 개시된 것과 같은 FVII 변이체를 포함한다.
야생형 FVIIa와 비교하여 증가된 생물학적 활성을 갖는 FVII 변이체의 비제한적 예들은 WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, WO 03/027147, WO 04/029090, WO 05/075635, 및 출원 번호 05108713.8 (Novo Nordisk A/S)인 유럽 특허 출원, WO 02/38162 (Scripps Research Institute)에 개시된 것과 같은 FVII 변이체; 및 JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)에 개시된 것과 같은 향상된 활성을 갖는 FVIIa 변이체를 포함한다.
인자 VII의 변이체의 예들은, 제한없이, P1OQ-FVII, K32E-FVII, P10Q/K32E-FVII, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P- FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, 및 S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V- FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-인자 VII, S60A-인자 VII; R152E-인자 VII, S344A-인자 VII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; 그리고 아미노산 서열 233Thr 내지 240Asn에서 치환, 부가 또는 결실을 갖는 FVII; 아미노산 서열 304Arg 내지 329Cys에서 치환, 부가 또는 결실을 갖는 FVII; 및 아미노산 서열 153Ile 내지 223Arg에서 치환, 부가 또는 결실을 갖는 FVII를 포함한다.
따라서, 인자 VII 폴리펩티드에서 치환 변이체는, 제한없이, 위치 P1O, K32, L305, M306, D309, V158, E296, K337, M298, S336, S314, K316, F374, S52, S60, R152, S344, T106, K143, N145, V253, R290, A292, G291, R315, V317에서 치환, 그리고 아미노산 서열 T233 내지 N240 또는 R304 내지 C329, 또는 I153 내지 R223, 또는 이들의 조합에서 치환, 부가 또는 결실, 특히 P1OQ, K32E, L305V, M306D, D309S, L305I, L305T, F374P, V158T, M298Q, V158D, E296V, K337A, M298Q, M298K, S336G, S314E, K316H, K316Q, F374Y, S52A, S60A, R152E, S344A, T106N, K143N, N145T, V253N, R290N, A292T, G291N, R315N, V317T와 같은 변이체, 그리고 아미노산 서열 T233 내지 N240, 또는 R304 내지 C329, 또는 I153 내지 R223, 또는 이들의 조합에서 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
혈액 응고에서 인자 VIIa의 생물학적 활성은 그것이 (i) 조직 인자 (TF)에 결합하고 (ii) 인자 IX 또는 인자 X의 단백질 분해 절단을 촉매작용하여 활성화된 인자 IX 또는 X (각각, 인자 IXa 또는 Xa)를 생성하는 능력으로부터 유도된다.
본 발명의 목적을 위해, 인자 VII 폴리펩티드의 생물학적 활성은 제제가 혈액 응고를 촉진하는 능력을 측정함으로써 정량할 수 있다. 여기 기술된 분석법 4 참조. 이 분석법에서, 생물학적 활성은 대조 샘플에 비한 응고 시간의 감소로서 표시되고 1 단위/mL 인자 VII 활성을 함유하는 모은 사람 혈청 표준과의 비교에 의해 "인자 VII 단위"로 변환시킨다. 대안으로는, 인자 VIIa 생물학적 활성은 (i) 지질 막에 포매된 TF 및 인자 X를 포함하는 시스템에서 인자 VIIa 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드가 활성화된 인자 X (인자 Xa)를 생성하는 능력을 측정하거나(Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924, 1997); (ii) 수성 시스템에서 인자 X 가수분해를 측정하거나("인 비트로 단백질 분해 분석", 이하 분석법 2 참조); (iii) 표면 플라즈몬 공명에 기초한 기기를 사용하여 인자 VIIa 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드의 TF에의 물리적 결합을 측정하거나(Persson, FEBS Letts. 413: 359-363, 1997); (iv) 인자 VIIa 및/또는 인자 VII-관련 폴리펩티드에 의해 합성 기질의 가수분해를 측정하거나("인 비트로 가수분해 분석", 이하 분석법 1 참조); 또는 (v) TF-무관 인 비트로 시스템에서 트롬빈의 발생을 측정(이하 분석법 3 참조)함으로써 정량할 수 있다.
야생형 인자 VIIa에 비하여 실질적으로 같거나 개선된 생물학적 활성을 갖는인자 VII 변이체는, 한가지 이상의 응고 분석(분석법 4), 단백질 분해 분석(분석법 2), 또는 상기한 것과 같은 TF 결합 분석에서 시험했을 때 적어도 약 25%, 바람직하게는 적어도 약 50%, 더 바람직하게는 적어도 약 75% 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 90%의 인자 VIIa 특이적 활성을 나타내는 것들을 포함한다. 야생형 인자 VIIa에 비해 실질적으로 감소된 생물학적 활성을 갖는 인자 VII 변이체는 한가지 이상의 응고 분석(분석법 4), 단백질 분해 분석(분석법 2), 또는 상기한 것과 같은 TF 결합 분석에서 시험했을 때 약 25% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 더 바람직하게는 약 5% 미만 그리고 가장 바람직하게는 약 1% 미만의 야생형 인자 VIIa 특이적 활성을 나타내는 것들이다. 야생형 인자 VII에 비해 실질적으로 변형된 생물학적 활성을 갖는 인자 VII 변이체는, 제한없이, TF-무관 인자 X 단백질 분해 활성을 나타내는 인자 VII 변이체 및 TF에 결합하나 인자 X를 절단하지 않는 것들을 포함한다.
단계 (a) - pH의 조절
제 1의 선택적 단계 (a)에서, 조성물의 pH는, 필요하다면, 4.5-10.0 범위의 값으로 조절된다. 상기한 바와 같이, 이것은 전형적으로 한가지 이상의 완충제의 첨가에 의해 달성된다. 이미 명시된 범위 내의 pH를 갖는 조성물은 - 물론 - pH에 관해서 조절할 필요가 없으나, 예를 들면 어떤 후속 활성화 및 조제 단계들에 비추어 pH를 조절하는 것이 바람직할 수도 있다.
조성물의 pH를 조절하는 단계는 또한 조성물의 희석 또는 농축(예를 들면 용매의 증발)을 포함할 수도 있다.
조성물은 바람직하게는 단계 (a)의 동안에 바람직하게는 10℃ 이하, 특히 5℃ 이하, 더 구체적으로 0℃에 가깝게 유지된다.
단계 (b) - 열처리
열처리는 조성물 내의 다이머의 함량을 감소시키는 방법의 중요한 단계이다.
다이머 함량의 감소가 적어도 합리적인 시간 프레임 내에서, 예를 들면 72 시간 이내에 일어나기 위해서는 가열 온도가 적어도 20℃이어야 함이 발견되었다. 반면에, 50℃ 보다 높은 가열 온도는 인자 VII 폴리펩티드의 변성(이로써 불활성화)의 위험을 일으킬 것으로 생각된다.
원하는 온도로 가열은 조성물을 함유하는 용기를 항온욕, 예를 들면, 오일욕 또는 수욕, 또는 오븐에 넣음으로써 달성될 수 있다. 원하는 온도에 도달하는데 요구되는 시간은 특히 주위 매질에 대한 용기의 열 투과 계수에 의존할 것이다. 원하는 온도에 가능한 한 신속하게 도달되는 것이 바람직하며, 또는 적어도, 20℃의 온도, 또는 경화 온도(set-point) 보다 대략 5℃ 아래의 온도에 가능한 한 신속하게 도달하는 것이 종종 바람직하다.
대안의 구체예에서, 열처리는 플로우-스루 시간이 원하는 열처리 시간에 해당하는 플로우-스루 반응기에서 배치식 또는 연속식으로 행해진다. 많은 실제적인 구체예들이 당업자에게 명백할 것이다.
원하는 온도 및 열처리에 필요한 시간은 예를 들면, 여기에 실시예 2로서 기술된 것과 같은 모델 실시예로 결정될 수 있다. 열처리를 위한 최소 요구시간은 전형적으로 약 5 분, 예를 들면 10 분인 한편, 최대 요구 시간은 원칙적으로 며칠 또는 여러 날, 예를 들면 168 시간일 수 있다. 실용상의 이유로, 처리를 위한 시간은 10분 내지 72시간이 바람직하다.
연장된 열처리는 열처리에 의해 감소되는 타입과 다른 타입의 다이머의 형성을 일으키는 것으로 생각된다. 이 가설은 실시예 2에서의 관찰에 의해 지지되는데, 37℃에서 10 시간보다 긴 시간 동안의 열처리는 실제로 상당한 다이머 (재)형성을 가져온다.
이것은 30-45℃의 열처리를 위해 바람직한 시간은 전형적으로 10-600분이라고 할 수 있다. 20-30℃에서 열처리를 위해 바람직한 시간은 전형적으로 5-72시간이고, 35-50℃에서 열처리를 위해 바람직한 시간은 전형적으로 10-300분이다. 현재 가장 바람직한 구체예에서, 열처리는 약 37℃에서 10-120분간 일어난다.
본 발명의 방법의 최적화는 일정한 온도를 반드시 수반하지는 않는 열처리를 이끌 수 있으나, 20-50℃의 전체적인 온도 범위 내에서 온도의 점진적 또는 단계적 증가 및/또는 온도의 점진적 단계적 감소를 이용하는 것이 유리한 것으로 드러날 수도 있음이 이해되어야 한다.
열처리의 목적은 인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 조성물 중의 다이머의 함량을 감소시키는 것이다. 구체적으로, 전체적인 생산 공정에서 추가의 단계들을 정당화하기 위해 상당한 감소가 예상되어야 한다. 그러므로, 인자 VII 폴리펩티드의 전체 풀(pool)에 대한 %-포인트로서 표시된 상기 조성물 중의 다이머의 수준(여기 기술된 HMWP GPC 방법에 의해 결정됨)이 적어도 1.2의 인자, 예를 들면 적어도 1.5의 인자, 특히 적어도 2의 인자, 또는 적어도 3의 인자로도 감소되는 것이 바람직하다.
다이머의 함량은 5% 미만의 수준으로, 특히 4% 미만의 수준으로, 더 바람직하게는 3% 미만의 수준으로, 또는 2% 미만의 수준으로도 또는 훨씬 더 바람직하게는 1.5% 미만의 수준으로도 감소될 수 있는 것으로 고찰된다.
단계 (c) - 냉각
조성물을 이어서 10℃ 이하, 예를 들면 5℃ 이하의 온도로 냉각한다. 예를 들어서 빙욕(대략 0℃)에서 냉각함으로써 또는 조성물에 얼음을 첨가함으로써 아주 신속하게 냉각을 행하는 것이 유리하다. 대안으로는, 그리고 상기한 바와 같이, 냉각은 플로우-스루 반응기에서 행해질 수도 있다. 신속한 냉각에 의해 다이머가 재형성될 수도 있는 조건(예를 들면 5-15℃의 온도)의 연장된 존재는 회피될 수 있다.
냉각 후, 조성물은 더 이상의 공정 단계를 겪을 수도 있다. 이러한 공정 단계들은 바람직하게는 어떤 상당한 다이머의 재형성을 일으키지 않아야 하는 것이 고려된다. 이것은 바람직한 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드가 단계 (b)의 후속 단계에서 활성화된다고 한다. 즉, 인자 VII 폴리펩티드는 조성물의 냉각 전 또는 후에 활성화된다. 바람직하게는, 인자 VII 폴리펩티드는 가열 단계의 후속 단계에서 활성화되는데 활성화가 가열하는 동안에 제어되기 어려울 수 있기 때문이다.
바람직한 구체예
한 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인자 VII 변이체를 포함하는 조성물 중의 다이머 함량을 감소시키는 방법에 관련되며, 상기 방법은 다음 단계들:
(a) 필요하다면, 상기 조성물의 pH를 5.0-6.5의 범위의 값으로 조절하는 단계;
(b) 조성물을 20-600분의 범위의 기간동안 30-45℃ 범위의 온도로 가열하는 단계; 그리고
(c) 이어서 조성물을 5℃ 이하의 온도로 냉각하는 단계를 포함한다.
바람직한 구체예
제 2의 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인자 VII 변이체를 포함하는 조성물 중의 다이머 함량을 감소시키는 방법에 관련되며, 상기 방법은 다음 단계들:
(a) 필요하다면, 상기 조성물의 pH를 9.0-10.0의 범위의 값으로 조절하는 단계;
(b) 조성물을 20-600분의 범위의 기간동안 30-45℃ 범위의 온도로 가열하는 단계; 그리고
(c) 이어서 조성물을 5℃ 이하의 온도로 냉각하는 단계를 포함한다.
인자 VII 폴리펩티드의 제조 및 정제
본 발명 방법에서 적용가능한 사람 정제된 VIIa는 바람직하게는 예를 들어서 Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986에 기술된 바와 같이, 또는 유럽 특허 No. 0 200 421 (ZymoGenetics, Inc.)에 기술된 바와 같이 DNA 재조합 기술에 의해 만들어진다.
인자 VII는 또한 Broze and Majerus, J.Biol.Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980 및 Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983에 의해 기술된 방법에 의해 제조될 수도 있다. 이들 방법은 검출가능한 양의 다른 혈액 응고 인자 없이 인자 VII를 수득하게 한다. 훨씬 더 정제된 인자 VII 제제는 최종 정제 단계로서 추가의 겔 여과를 포함시킴으로써 얻어질 수 있다. 인자 VII는 다음에 공지의 방법으로, 예를 들면 인자 XIIa, IXa 또는 Xa와 같은 몇가지 다른 혈장 단백질에 의해 활성화된 인자 VIIa로 변환된다. 대안으로는, Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)에 의해 기술된 바와 같이, 인자 VII는 그것을 Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) 등과 같은 이온-교환 크로마토그라피 컬럼을 통과시킴으로써, 또는 용액 중의 자동 활성화에 의해 활성화될 수도 있다. 본 발명의 방법 단계들은 바람직하게는 인자 VII 폴리펩티드의 활성화 직전에 적용된다.
인자 VII-관련 폴리펩티드는 야생형 인자 VII의 변형에 의해 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수도 있다. 야생형 인자 VII와 비교했을 때 변경된 아미노산 서열을 갖는 인자 VII-관련 폴리펩티드는 공지의 수단에 의해, 예를 들면 부위-특이적 돌연변이에 의해 아미노산 코돈을 변경함으로써 아니면 천연 인자 VII를 암호화하는 핵산에서 일부 아미노산 코돈의 제거에 의해 야생형 인자 VII를 암호화하는 핵산 서열을 변경함으로써 제조될 수도 있다.
인자 VIIa 분자의 기능에 중요한 영역들 밖에서 치환이 행해질 수 있으며 여전히 활성 폴리펩티드를 가져온다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 인자 VII 폴리펩티드의 활성에 필수적이고, 따라서 바람직하게는 치환이 되지 않은 아미노산 잔기는 부위-지향 돌연변이 또는 알라닌-주사(scanning) 돌연변이와 같은 당업계에 알려진 과정들에 따라 확인될 수 있다(예를 들면, Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085 참조). 후자의 기술에서, 변이는 분자내 모든 양으로 하전된 잔기에서 도입되고 결과된 돌연변이체 분자는 분자의 활성에 중대한 아미노산 잔기를 확인하기 위해 각각 가교 활성을 응집제에 대해 시험하게 된다. 기질-효소 상호작용의 부위들은 또한 핵자기공명 분석, 결정학 또는 광친화도 라벨링과 같은 기술에 의해 구한 3차원 구조물의 분석에 의해 결정될 수 있다(예를 들면, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64 참조).
한 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 교환하기 위한 핵산 서열로 변이의 도입은 당업계에서 공지된 어떤 방법도 사용하여 부위-지향 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. 특히 유용한 것은 관심있는 삽입물을 갖고 원하는 변이를 함유하는 두개의 합성 프라이머를 갖는 수퍼-코일, 이중-스트랜드 DNA 벡터를 이용하는 과정이다. 각각 벡터의 양쪽 스트랜드에 상보인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Pfu DNA 폴리머라제에 의해 온도 사이클링의 동안에 연장된다. 프라이머의 포함 시에, 어긋매긴 자국들을 함유하는 변이된 플라스미드가 발생된다. 온도 사이클링 후, 생성물을 메틸화 및 반메틸화 DNA에 특이적인 DpnI로 처리하여 모 DNA 템플레이트로 분해하고 변이 함유 합성된 DNA를 선별한다. 예를 들어서 유전자 셔플링 또는 파지 디스플레이 기술과 같은 변이체를 새로 제조, 동정 및 분리하기 위한 다른 과정들도 또한 사용될 수 있다.
세포 기원으로부터 폴리펩티드의 분리는, 제한없이, 밀착성 세포 배양물로부터 원하는 생성물을 함유하는 세포 배양 배지의 제거; 비점착성 세포를 제거하기 위한 원심분리 또는 여과; 등을 포함하는 당업계 공지의 어떤 방법에 의해서도 달성될 수 있다.
선택적으로, 인자 VII 폴리펩티드는 또한 정제될 수 있다. 정제는, 제한없이, 예를 들어서 항-인자 VII 항체 컬럼상에서와 같은 친화도 크로마토그라피(예를 들면, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261: 11097, 1986; 및 Thim et al., Biochem. 27: 7785, 1988 참조); 소수성 상호작용 크로마토그라피; 이온교환 크로마토그라피; 크기배타 크로마토그라피; 전기영동 과정 (예를 들면, 예비 등전 집중 (IEF), 시차 용해도 (예를 들면, 황산암모늄 침전), 또는 추출 등을 포함하는 당업계 공지의 어떤 방법에 의해서도 달성될 수 있다. 일반적으로, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; 및 Protein Purification, J. C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조. 정제 후, 제제는, 바람직하게는 10중량% 미만, 더 바람직하게는 5중량% 미만 그리고 가장 바람직하게는 1중량% 미만의, 숙주 세포로부터 유도된 비-인자 VII 폴리펩티드를 함유한다.
인자 VII 폴리펩티드는 인자 XIIa 또는 트립신 유사 특이성을 갖는 다른 프로테아제, 예를 들면, 인자 IXa, 칼리크레인, 인자 Xa, 및 트롬빈을 사용하여 단백질 분해 절단에 의해 활성화될 수 있다. 예를 들면, Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, 미국 특허 No. 4,456,591; 및 Hedner et al., J. Clin. Invest. 71: 1836 (1983) 참조. 대안으로, 인자 VII 폴리펩티드는 그것을 Mono Q® (Pharmacia) 등과 같은 이온-교환 크로마토그라피 컬럼을 통과시킴으로써, 또는 용액에서 자동 활성화에 의해 활성화될 수도 있다. 본 발명의 방법 단계들은 - 상기한 바와 같이 - 바람직하게는 인자 VII 폴리펩티드의 활성화 직전에 적용된다.
결과된 활성화 인자 VII 폴리펩티드를 그 다음, 당업계에 기술된 바와 같이 조제 및 투여할 수 있다.
다음의 실시예는 발명의 실시를 예시한다. 이들 실시예는 예시 목적으로만 포함되며 본 발명의 청구된 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
방법
다이머 함량의 결정 - HMWP GPC 방법
SE-HPLC, 크기 배타 크로마토그라피 방법을 사용하여 비해리 조건 하에 FVIIa 샘플을 분석하였다. HMWP (고분자량 단백질), 즉, 다이머, 올리고머 및 폴리머 형태의 FVIIa 응집물의 함량을 모노머 표적 생성물 피크에 대한 면적%에 의해 결정하였다.
사용한 컬럼은 Waters Protein Pak 300 SW (7.5 * 300 mm, 컬럼 부피 13.25 mL에 해당함) 또는 유사한 설계 명세의 컬럼이었다. 일반적인 분석 조건은 다음과 같았다:
온도 RT (21-25 ℃); 검출: 215 nm에서 컬럼 출구에서 UV-검출; 유속: 0.5 ml/min 로서 2.25 CV/hr에 해당함.
분석 실행은 다음 조성을 갖는 전개 완충액을 사용하여 수행하였다: 0.2 M 황산암모늄, 5 % 이소프로판올, pH 7.0으로 조절됨.
컬럼 평형화에 이어서 0.5 CV의 전개 완충액을 사용하여, 대략 1 mg FVIIa/ml를 함유하는 FVIIa 샘플을 녹이고 25 밀리리터의 샘플 부피(컬럼 부피에 대해 0.2 %의 샘플 부피에 해당함)를 주입함으로써 분석 농축하였다.
샘플을 어어서 1.5 CV에 대해 용리하였다.
크로마토그램은 도 3에서 예시하는 바와 같이 전형적으로 두개의 주 피크와 두개의 부 피크로 구성된다. 왼쪽에서 보는 바와 같이, HMWP (폴리머 및 다이머/올리고머 피크들)를 나타내는 두개의 부 피크가 관찰된다. 제 1 주 피크는 FVIIa의 단량체를 나타내고 제 2 주 피크는 염 피크를 나타낸다.
실시예 1 - 37℃에서 인자 VIIa 변이체의 열처리
15 mM CaCl2, 30 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0 (5℃에서) 중의 FVIIa 변이체의 1.5 mg/mL 용액을 0.22 마이크론 필터를 통해 700 mL HDPE 병에 여과하였다. pH를 1M HCl 또는 1M NaOH를 사용하여 5.8(5℃에서)로 조절하였다. 병을 온도가 37℃인 수욕에 넣었다. HDPE 병의 온도를 37℃로 올리는 것은 대략 20분이 걸렸다. 용액이 37℃에 도달한 지 45분 후, 병을 얼음에 놓음으로써 반응을 중지시켰다.
초기 다이머 함량은 GPC에 의해 7.3 %인 것으로 결정되었고 열처리 후 2.8 %로 감소되었다. 따라서, 37℃에서 45분간 열처리는 2 보다 큰 인자 만큼 다이머 함량을 감소시키기 위해 충분한 것으로 생각된다.
총 120분간 행해진 유사한 실험에 대해 다이머 함량의 감소의 전개를 도 1에 예시한다. 실험을 빈번한 샘플의 수집에 의해 모니터하였고; 샘플을 -80℃로 급속 냉동하고; 그리고 이어서 분석을 하였다(이하 참조).
비교예 1 - 5-8℃에서 인자 VIIa 변이체의 보관
15 mM CaCl2, 30 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0 (5℃에서) 중의 FVIIa 변이체의 1.5 mg/mL 용액을 0.22 마이크론 필터를 통해 700 mL HDPE 병에 여과하였다. pH를 1M HCl 또는 1M NaOH를 사용하여 5.8(5℃에서)로 조절하였다. 병을 온도가 5-8℃인 수욕에 넣었다. 60분 후, 병을 얼음에 놓음으로써 반응을 중지시켰다.
초기 다이머 함량은 7.7 %이었고 - 처리 후 7.9 %이었다.
실시예 2 - 23℃ 및 37℃에서 인자 VIIa 변이체의 연장된 열처리
본질적으로 실시예 1에서 기술된 대로의 37℃에서의 열처리 실험(pH 5.7)을 총 48시간 동안 행하였고 23℃에서 유사한 실험을 총 48시간 동안 행하였다. 두 실험을 빈번한 샘플 수집에 의해 모니터하였고; 샘플을 -80℃로 급속 냉동하고; 그리고 이어서 분석을 하였다(이하 참조). 두 다른 온도를 이용하는 다이머 함량의 감소의 전개를 도 2에 예시한다. 37℃에서, 다이머 함량의 신속한 하락이 관찰된 한편, 23℃에서 샘플에 대한 다이머 함량의 감소는 더 느렸고 48시간 후 다이머 함량은 가능하게는 그것의 최소치에 도달하지 않았다. 이들 유형의 실험을 사용하여 다른 인자 VII 폴리펩티드에 대해서 및 다른 선택된 온도에서 최적 조건(열처리에 충분한 시간)을 결정할 수 있다.
비교용으로, 샘플(비교예 1과 유사; pH 5.7)을 총 48 시간 동안 5-8℃에서 두었다. 다이머 함량의 약간의 증가가 이 경우에 관찰되었다(도 2 참조; 상부 곡선).
실시예 3 - pH 9.5에서 인자 VIIa 변이체의 연장된 열처리
본질적으로 실시예 1에서 기술한 바와 같이 열처리 시험을 총 168시간 동안 행하였다; 그러나, 초기 pH 조절은 pH 5.8에서 pH 9.5으로 증가되었다. 실험을 빈번한 샘플 수집에 의해 모니터하였고; 샘플을 -80℃로 급속 냉동하고; 그리고 이어서 분석을 하였다. 높아진 pH에서 다이머 함량의 감소의 전개를 도 4에 예시한다. pH 9.5에서, 다이머 함량의 유사한 신속한 하락이 관찰되었고, 이어서 느린 다이머 형성으로 이어졌다.

Claims (8)

  1. 인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 조성물 중의 다이머 함량을 감소시키는 방법으로서,
    (a) 필요하다면, 상기 조성물의 pH를 5.0-10.0 (5℃에서 측정했을 때)의 범위의 값으로 조절하는 단계;
    (b) 조성물을 적어도 5분의 기간동안 20-50℃ 범위의 온도로 가열하는 단계; 그리고
    (c) 이어서 조성물을 10℃ 이하의 온도로 냉각하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 (b)의 온도는 30-45℃ 범위이고 단계 (b)의 가열 기간은 10-600분의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, pH는 단계 (a)에서 5.0-6.5의 값으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 VII 폴리펩티드는 인자 VII 변이체인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 칼슘염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 VII 폴리펩티드의 전체 풀에 대한 %-포인트로서 표시한 상기 조성물 중의 다이머의 수준은 적어도 2의 인자 만큼 감소된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 VII 폴리펩티드는 단계 (b)의 후속 단계에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그라피 단계는 단계(a)에 선행하는 것을 특징으로 하는 방법.


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